BROMAZEPAMO, KLORAZEPATO IR NIMESULIDO MIŠINIO TYRIMAS INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

VILIUS KAVALIAUSKIS

BROMAZEPAMO, KLORAZEPATO IR NIMESULIDO MIŠINIO

TYRIMAS INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Andrejus Ževžikovas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data:

BROMAZEPAMO, KLORAZEPATO IR NIMESULIDO MIŠINIO

TYRIMAS INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Recenzentas Doc. dr. Andrejus Ževžikovas

Data: Data: Darbą atliko Magistrantas Vilius Kavaliauskis Data: Kaunas, 2014

Santrumpos ... 7

Sąvokos ... 8

1. ĮVADAS ... 9

2. TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 10

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

3.1. Tiriamosios vaistinės medžiagos ... 11

3.1.1. Bromazepamas ... 11 3.1.2. Klorazepatas ... 11 3.1.3. Nimesulidas ... 12 3.2. Vaistų metabolizmas ... 12 3.2.1. Bromazepamo metabolizmas ... 12 3.2.2. Klorazepato metabolizmas ... 13 3.2.3. Nimesulido metabolizmas ... 13

3.3. Vaistų toksiškumas ir šalutinis poveikis ... 13

3.3.1. Bromazepamas ... 13 3.3.2. Klorazepatas ... 14 3.3.3. Nimesulidas ... 14 3.4. Fizikinės savybės ... 15 3.4.1. Bromazepamas ... 15 3.4.2. Klorazepatas ... 15 3.4.3. Nimesulidas ... 16

3.5. Bromazepamo, klorazepato ir nimesulido tyrimo metodai ... 17

3.5.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 17

3.5.1.1. Benzodiazepinų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 18

3.5.1.2. Nimesulido analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 18

3.5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 18

3.5.2.1. Bromazepamas ... 19

3.5.2.2. Klorazepatas ... 19

3.5.2.3. Nimesulidas ... 19

4. TYRIMO OBJEKTAI IR METODIKOS ... 20

4.1.1. Kraujas ... 20

4.2. Metodikos ... 20

4.2.1. Plazmos mėginio paruošimas ... 20

4.2.2. Plonasluoksnė chromatografija ... 21

4.2.3. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 22

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 23

5.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 23

5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 30

5.3. Rezultatų apibendrinimas ... 34 6. IŠVADOS ... 35 7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 36 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37 9. PRIEDAI ... 41

BROMAZEPAMO, KLORAZEPATO IR NIMESULIDO MIŠINIO TYRIMAS

INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS

V. Kavaliauskio magistro baigiamasis darbas / mokslinis vadovas doc. dr. Andrejus Ževžikovas. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Analizinės ir

toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2014.

Tyrimo tikslas: Optimizuoti instrumentinės analizės metodus (plonasluoksnė chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija) bromazepamo, klorazepato ir nimesulido mišinio išskirstymui ir komponentų identifikavimui.

Tyrimo metu iškelti uždaviniai: optimizuoti bromazepamo, klorazepato, nimesulido mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą plonasluoksnės chromatografijos metodu; optimizuoti plonasluoksnės chromatografijos metodą kiekybiniam bromazepamo, klorazepato ir nimesulido nustatymui; optimizuoti bromazepamo, klorazepato, nimesulido mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, sukurtą metodiką pritaikyti kraujo plazmos mėginio tyrimui.

Darbo metu taikytos plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos.

Rezultatai: sukurtos dvi plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemos (sistema „G“ – etilacetatas : acetonas : etanolis (85 : 15 : 10, v/v/v), sistema „I“ – etilacetatas : etanolis (85 : 15, v/v), kuriose tiriamo vaistinių preparatų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) komponentai atsiskiria, o jų dėmės nepersidengia ir netrukdo viena kitos identifikavimui. Sistemos „G“ ir „I“ naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer ir programinę įrangą VideoScan, pritaikytos kiekybiniam mišinio (bromazepamas, kolrazepatas, nimesulidas) komponentų nustatymui. Sukurta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika vaistų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) išskirstymui ir komponentų identifikavimui. Taip pat sukurtas plazmos mėginio paruošimo metodas, leidžiantis pakankamai išvalyti mėginį nuo balastinių medžiagų ir tirti jį taikant naują ESC metodiką.

Išvados: sukurtos plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemos, kuriose tiriamo vaistų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) komponentai atsiskiria, o jų dėmės nepersidengia ir netrukdo viena kitos kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui; sukurta ESC sistema, vaistų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) išskirstymui ir komponentų identifikavimui, kurią galima taikyti plazmos mėginių analizei.

Summary

Instrumental analysis of Bromazepam, Clorazepate and Nimesulide mixture

Vilius Kavaliauskis. Master's thesis/Scientific supervisor doc.dr. Andrejus Ževžikovas. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and

Toxicological Chemistry Departament. Kaunas, 2014.

The aim of this work was to optimize instrumental analysis methods designed for separation and identification of bromazepam, clorazepate and nimesulide from their mixture samples.

In order to achieve our goal we have set ourselves these tasks – to optimize thin-layer chromatography method for separation and identification of bromazepam, clorazepate, nimesulide mixture components; to optimize the thin-layer chromatographic method for the quantitative determination of bromazepam, clorazepate and nimesulide; to optimize separation and identification of components from bromazepam, clorazepate, nimesulide mixture using high-performance liquid chromatography method and to adapt and develop methodology design for plasma sample analysis. The analysis was performed using HPLC and TLC methods.

The results for the test sample of bromazepam, clorazepate and nimesulide mixture components separation by thin layer chromatography analysis two new solvent systems were created – system G - ethyl acetate: acetone : ethanol (85 : 15 : 10, v / v / v) and system I - ethyl acetate : ethanol (85 : 15, v / v), using which components separate completely, therefore identification can be performed. Using the imaging device CAMAG TLC Visualizer and software VideoScan G and I systems were adapted for quantitative mixture of bromazepam, clorazepate and nimesulide components identification. HPLC method was developed for drug mixture components separation and identification. Also plasma sample preparation method was developed, allowing to clear the sample from the ballast material and examine it with newly developed HPLC methodology.

In conclusion for complete separation of drugs mixture two new thin-layer chromatography solvent systems were developed. Using these systems qualitative and quantitative measurement can be performed. New HPLC methodology for drug mixture of nimesulide, clorazepate and bromazepam separation and identification were created, which can also be used for analysis of plasma samples.

GASRA – gama amino sviesto rūgšties A tipo receptorius;

GASR – gama amino sviesto rūgštis;

NVNU – nesteroidinis vaistas nuo uždegimo; COX1 – ciklooksigenazė 1;

COX2 – ciklooksigenazė 2; CYP – citochromas P450;

IUPAC – tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga; VVKT – valstybinė vaistų kontrolės tarnyba;

PC – plonasluoksnė chromatografija; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; UV – ultravioletinė šviesa;

Rt – sulaikymo laikas kolonėlėje; Rf – sulaikymo rodiklis

Sąvokos

Ciklooksigenazė – fermentas dar žinomas prostaglandinų - endoperoksidų sintetazės vardu, jis dalyvauja biologinių mediatorių prostanoidų (prostaglandinai, prostaciklinai, tromboksanas) sintezėje. Fermento blokavimas mažina uždegimą ir skausmą.

Gradientinis eliuavimas – eliuavimo rėžimas, kai chromatografavimo eigoje kinta eliuento, tekančio per kolonėlę, sudėtis.

Polifarmacija – kelių vaistinių preparatų vartojimas vienu metu, dažniausiai pasitaiko tarp vyresnio amžiaus pacientų.

Visose visuomenės amžiaus grupėse, didėjant įvairių susirgimų skaičiui, vis dažniau susidaro sąlygos polifarmacijos reiškinio plitimui, kai vartojami keli (du ir daugiau) vaistiniai preparatai vienu metu. Polifarmacijos atsiradimą lemia nesuvartotų vaistų kaupimasis pacientų namuose (savigydos tikimybė), lankymasis pas kelių sričių gydytojus vienu metu, gydytojų ir vaistininkų aplaidumas išrašant bei išduodant vaistus. Kartu vartojant nesuderinamus vaistinius preparatus arba jais piktnaudžiaujant, gali pasireikšti vaistų tarpusavio sąveikos, sukeliančios apsinuodijimą ir kitas organizmo reakcijas. Tiriant apsinuodijimo atvejus taikomi įvairūs instrumentinės analizės metodai, pvz.: efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija. Dažniausiai analizės metodai optimizuojami panašios struktūros vaistų mišinių analizei, todėl sudėtinga juos pritaikyti tiriant mišinius, sudarytus iš skirtingos struktūros junginių.

Atlikus literatūros analizę, nerasta instrumentinės analizės metodikų, pritaikytų benzodiazepinų ir nesteroidinių vaistų nuo uždegimo mišinio tyrimui. Analizės metodikų stoka lėmė tyrimo objektų pasirinkimą. Darbui buvo pasirinkti trys vaistinės medžiagos: bromazepamas, klorazepatas ir nimesulidas. Bromazepamas ir klorazepatas – benzodiazepino dariniai, pasižymintys anksiolitiniu, prieštraukuliniu, sedaciniu veikimu. Nimesulidas – sulfoanilino tipo nesteroidinis vaistas nuo uždegimo, pasižymintis selektyvumu ciklooksigenazei 2.

Darbo metu buvo siekiama optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodikas bromazepamo, klorazepato ir nimesulido mišinio komponentų išskirstymui ir identifikavimui.

2. TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Optimizuoti instrumentinės analizės metodus (plonasluoksnė chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija) bromazepamo, klorazepato ir nimesulido mišinio išskirstymui ir komponentų identifikavimui.

Uždaviniai:

1. Optimizuoti bromazepamo, klorazepato, nimesulido mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą plonasluoksnės chromatografijos metodu.

2. Optimizuoti plonasluoksnės chromatografijos metodą kiekybiniam bromazepamo, klorazepato ir nimesulido nustatymui.

3. Optimizuoti bromazepamo, klorazepato, nimesulido mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, sukurtą metodiką pritaikyti kraujo plazmos mėginio tyrimui.

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Tiriamosios vaistinės medžiagos

3.1.1. Bromazepamas

Bromazepamas yra tipinis benzodiazepinų grupės vaistas, kurio pusinės eliminacijos laikas 12-20 valandų. Jis veikia anksiolitiškai, hipnotiškai, pasižymi sedaciniu bei traukulius slopinančiu poveikiu. Bromazepamo veikimo mechanizmas pagrįstas gama amino sviesto rūgšties (GASR) ir gama amino sviesto rūgšties A receptorių (GASRA) susijungimo gerinimu. Vaistas jungiasi prie Cl

-jonų kanalo ir GASRA receptoriaus komplekso alosterinio centro, sukeldamas konformacinius

pokyčius, dėl kurių pagerėja GASR susijungimas su receptoriumi (1).

Bromazepamo terapinis taikymas: nerimas, įtampa ir kiti su nerimo sindromu susiję somatiniai ar psichiniai negalavimai, premedikacija prieš chirurgines procedūras (1). Taip pat vaistas vartojamas kaip pagalbinė priemonė gydant nerimą ar sujaudinimą, susijusius su psichikos sutrikimais (nuotaikos sutrikimai, šizofrenija) (2). Bromazepamas vartojant per os absorbuojamas gerai, maksimali vaisto koncentracija (~ 140 ng/ml) kraujo plazmoje pasiekiama per 2 val. Biologinis prieinamumas yra 60 %. Pasiskirstymo tūris 50 litrų. Kraujyje 70 % bromazepamo jungiasi su plazmos baltymais. Po vienkartinės dozės suvartojimo per 72 val. su šlapimu pašalinama 70 % bromazepamo (apie 2 % nepakitusio, 27 % 3-hidroksibromazepamo gliukuronido, 40 % 2-amino-5-bromo-3-hidroksibromazepamo gliukuronido ir mažiau nei 1 % 2-(2-amino-5-bromo-benzoil piridino)) (2).

3.1.2. Klorazepatas

Klorazepatas yra benzodiazepino darinys, pasižymintis anksiolitiniu, prieštraukuliniu, sedaciniu, miorelaksuojančiu veikimu. Jis skiriamas nerimo šalinimui, kaip papildoma priemonė židininių traukulių metu (epilepsijos metu), alkoholinės abstinencijos gydymui. Vaistas gali didinti savižudiškų minčių ir elgesio atsiradimo tikimybę, todėl pacientai, vartojantys trankseną, turi būti stebimi (1).

Po vienkartinės dozės suvartotos per os, maksimali koncentracija (~ 1 mg/l) plazmoje pasiekiama per 1 valandą. Per 24 val apie 10 % vienkartinės dozės pašalinama su šlapimu, daugiausiai oksazepano gliukuronido pavidalu, taip pat maži kiekiai nepakitusio klorazepato ir konjuguoto desmetildiazepamo. Esant mažesniam negu 4 pH vaistas iškart dekarboksilinamas ir virsta aktyviu

metabolitu desmetildiazepamu (nordazepamu), todėl pavartojus per os, vaistas absorbuojamas aktyvaus metabolito forma (3).

3.1.3. Nimesulidas

Nimesulidas yra sulfoanilino tipo nesteroidinis vaistas nuo uždegimo (NVNU), turintis nitroaromatinę grupę (4). Vaistas selektyviai blokuoja ciklooksigenazę 2 (COX2), o ciklooksigenazę 1 (COX1) blokuoja labai silpnai, selektyvumas COX2 nuo 1,3 iki 2500 kartų didesnis nei COX1 (5). Nimesulidas plačiai vartojamas gydant įvairias uždegimines ligas, jis tai pat pasižymi skausmą malšinančiu poveikiu (4). Retais atvejais vaistas sukelia sunkius funkcinius kepenų pažeidimus (6).

Vartojamas per os nimesulidas absorbuojamas gerai. Maksimali koncentracija 3 - 4 mg/l kraujo plazmoje po vienkartinės dozės suvartojimo pasiekiama po 2 val, o 50 % maksimalios koncentracijos pasiekiama jau po 30 min. Farmakologinis vaisto poveikis pasireiškia dar nepasiekus maksimalios koncentracijos (po 30 - 60 min nuo vienkartinės dozės suvartojimo). Patekęs į kraują nimesulidas jungiasi su kraujo plazmos albuminu, o laisvo vaisto kraujo plazmoje aptinkama mažiau negu 1%. Nimesulido pusinės eliminacijos laikas yra ~ 4 val. Vartojant per os nepakitusio nimesulido su išmatomis ir šlapimu pašalinama mažai. Nustatyta, kad su šlapimu pašalinama 50,5 - 62,5 %, o su išmatomis 29,2 - 36,2 % nepakitusio vaisto ir jo metabolitų (5).

3.2. Vaistų metabolizmas

3.2.1. Bromazepamo metabolizmas

Žmogaus organizme bromazepamo metabolizmas vyksta kepenyse, o pagrindinis metabolizmo kelias – oksidacinis biotransformavimas. Pagrindinis aktyvus metabolitas yra 3-hidroksibromazepamas. Spėjama, kad kepenų fermentų citochromų P450 (CYP) 3A4 šeima, dalyvaujanti daugelio benzodiazepinų metabolizme, daro nedidelę įtaką bromazepamo metabolizmui. Labiausiai tikėtina, kad bromazepamo metabolizme svarbūs fermentai yra CYP 1A2 ir CYP 2C6 (7).

Kartu vartojami vaistai, blokuojantys CYP 1A2 arba CYP 2C6 fermentus, kepenyse slopina bromazepamo metabolizmą, pvz.: antihistamininis vaistas cimetidinas gali pailginti bromazepamo pusinės eliminacijos periodą, nes blokuoja CYP 2C6 (7).

3.2.2. Klorazepato metabolizmas

Desmetildiazepamas (aktyvus klorazepato metabolitas) kepenyse hidroksilinamas fermento CYP 2C19 ir verčiamas į oksazepamą, kuris nepakitęs gali patekti į kraują arba konjuguojamas su gliukurono rūgštimi, konjugatas pašalinamas su šlapimu (8).

3.2.3. Nimesulido metabolizmas

Nimesulidas kepenyse aktyviai metabolizuojamas. Jau žinoma 16 vaisto metabolitų ir trys pagrindiniai biotransformacijos keliai: molekulės skilimas eterinės jungties vietoje, NO2 grupės

redukcija į NH2 ir fenoksi-žiedo hidroksilinimas. Kiti metabolitai susidaro vykstant pirminių

metabolitų hidroksilinimo ir redukcijos reakcijoms, taip pat amino grupės acetilinimo metu ir vykstant hidroksilintų metabolitų konjugacijai su gliukurono rūgštimi arba sulfatu (9).

Spėjama, kad citochromo P450 fermentas CYP 1A2 gali būti atsakingas už nimesulido hidroksilinimą iki 4-hydroksinimesulido, tačiau manoma, kad fermentai CYP 2C9 ir CYP 2C19 yra susiję su kitomis nimesulido hidroksilinimo reakcijomis (10).

3.3. Vaistų toksiškumas ir šalutinis poveikis

3.3.1. Bromazepamas

Toksinis bromazepamo poveikis organizmui nenustatytas, o retai pasireiškiančių ekstrapiramidinių sutrikimų priežastys nėra tiksliai žinomos. Bromazepamo perdozavimas retai turi rimtų pasėkmių, tačiau jo metu gali dingti refleksai, pasireikšti apnėja, hipotenzija, širdies veiklos ir kvėpavimo slopinimas bei koma. Bromazepamo sukelta koma trunka kelias valandas, bet gali trukti ilgiau, pasireiškus ciklinei komai, ypač, pagyvenusiems pacientams (2). Literatūroje aprašomi keli atvejai, kai pacientai atsigavo po apsinuodijimo bromazepamu, nors jų suvartotas vaisto kiekis keliasdešimt kartų viršijo vidutinę vienkartinę dozę (3 mg) (11, 12).

3.3.2. Klorazepatas

Pagrindinis klorazepato perdozavimo požymis yra gilus miegas, kartais pereinantis į komą. Nestipriai apsinuodijus atsiranda letargija ir šiek tiek pritemsta sąmonė. Sunkiausiu atveju pasireiškia ataksija, hipotonija, hipotenzija, kvėpavimo slopinimas, labai retai ištinka mirtis (13). Toksinis poveikis įvairioms žmogaus organų sistemoms mokslinėje literatūroje neminimas.

3.3.3. Nimesulidas

Laboratorinių gyvūnų modelių tyrimai rodo, kad nimesulidas lyginant su kitais NVNU daug rečiau sukelia skrandžio opas. Tyrimų rezultatai patvirtinti tiriant žmones endoskopiškai (14).

Kepenų funkcijos sutrikimai pasitaiko retai (1-5 atvejai iš 100 000 pacientų) ir kinta nuo laikino besimptomio kepenų fermentų kiekio padidėjimo iki sunkių kepenų funkcijos sutrikimų ir kepenų pažeidimų. Nimesulidas taip pat siejamas su ūminio hepatito atsiradimu ir žaibišku kepenų nepakankamumu. Tikslus molekulinis hepatotoksiškumo mechanizmas nėra žinomas (14).

Atlikus 40 klinikinių tyrimų, kuriuose dalyvavo 4815 pacientų, buvo užfiksuoti 28 lengvi atvejai, susiję su širdies sutrikimais ir vienas kraujagyslių sistemos sutrikimo atvejis (flebitas). Hipertenzija, edema, palpitacija ir tachikardija buvo dažniausiai pasitaikantys sutrikimai. Nimesulidas nesukelia tiesioginio citotoksinio poveikio kepenų ląstelėms, tačiau pažeidimų tikimybė padidėja, jei kartu vartojamas paracetamolis ar kiti hepatotoksiškai veikiantys vaistai (14).

Perdozavus nimesulido atsiranda NVNU perdozavimo simptomai: letargija, mieguistumas, pykinimas, vėmimas, skausmas epigastriumo srityje. Šie simptomai išnyksta taikant palaikomąsias priemones. Gali atsirasti kraujavimas iš virškinimo trakto. Retais atvejais gali padidėti kraujospūdis, atsirasti ūminis inkstų nepakankamumas, atsirasti kvėpavimo slopinimas ir koma (15).

3.4.1. Bromazepamas

Balti ar gelsvi kristaliniai milteliai, praktiškai netirpūs vandenyje, labai mažai tirpūs etanolyje ir dichlormetane. pKa 2,9. Lydymosi temperatūra 237 – 238,5 0C, lydydamasis skyla. Absorbcijos

maksimumas ultravioletinės šviesos spektre esant 233 nm šviesos bangos ilgiui. Cheminis pavadinimas pagal Tarptautinę teorinės ir taikomosios chemijos sąjungą (angl. International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)): 7-Bromo-5-pyridin-2-yl-1,3-dihydro-1,4-benzodiazepin-2-onas. Vaistas žinomas šiais sinonimais: Compendium, Creosedin, Durazanil, Lectopam, Lexomil, Lexotan, Lexotanil, Normoc (3). Lietuvoje Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) duomenimis registruoti preparatai: Bromazepam Lannacher, Lexotanil.

3.4.2. Klorazepatas

1 pav.Bromazepamo cheminė formulė

2 pav. Klorazepato kalio druskos cheminė

Balti ar beveik balti milteliai, gerai tirpūs vandenyje, labai mažai tirpūs etanolyje, praktiškai netirpūs eteryje ir chloroforme. Vandeniniuose tirpaluose virsta į kalio druską. pKa 3,5. Absorbcijos

maksimumas ultravioletinės šviesos spektre esant 237 nm šviesos bangos ilgiui. Cheminis pavadinimas pagal IUPAC: 7-Chloro-2,3-dihydro-2-oxo-5-phenyl-1H-1,4-benzodiazepin-3-karboksilinė rūgštis. Vaistas žinomas šiais sinonimais: Belseren, Clorazecaps, Clorazetabs, Dorken, Gen-Xene, Medipax, Mendon, Nansius, Novo-Clopate, Transene, Tranxen(e), Tranxilen(e), Tranxilium (3). VVKT duomenimis Lietuvoje registruotas vienas vaistinis preparatas Tranxene.

3.4.3. Nimesulidas

Geltoni kristaliniai milteliai, praktiškai netirpūs vandenyje (0.014 mg/ml), lengvai tirpūs acetone, mažai tirpūs etanolyje (3.320 mg/ml), tirpus metanolyje (8.812 mg/ml). pKa 6,4-6,8.

Absorbcijos maksimumas ultravioletinės šviesos spektre esant 299 nm šviesos bangos ilgiui. Cheminis pavadinimas pagal IUPAC: N-(4-Nitro-2-fenoxyfenyl)metansulfonamidas (16). Vaistas žinomas šiais sinonimais: Sulide, Nimalox, Mesulid, Coxtal, Sintalgin, Eskaflam, Octaprin, Nimside, Nilsid ir kiti. VVKT duomenimis Lietuvoje registruoti preparatai: APONIL, Nimesil.

3.5.1. Plonasluoksnė chromatografija

Plonasluoksnė chromatografija (PC) yra vienas iš paprasčiausių ir plačiausiai naudojamų analizės metodų. Šis metodas priskiriamas plokštuminei chromatografijai. Metodo esmė: tirpiklis arba tirpiklių mišinys (judri fazė) kyla plonu sorbento (stacionari fazė) sluoksniu ir neša tiriamąją medžiagą. Tyrimo metu naudojamos pramoniniu būdu pagamintos stiklinės arba aliumininės plokštelės, padengtos tolygiu sorbento sluoksniu. Pramoninės gamybos plokštelės pranašesnės už rankiniu būdu paruoštas plokšteles tuo, kad gamintojas garantuoja sorbento dalelių dydžio vienodumą ir sluoksnio storio tolygumą. Analizuojamos medžiagos tirpalo (tirpiklis lakus) lašas uždedamas 1-2 cm atstumu nuo chromatografinės plokštelės krašto („starto linija“), kuris patalpinamas į tirpiklių sistemą. Chromatografavimo procesas vykdomas uždaroje, tirpiklių sistemos garais prisotintoje, kameroje. Proceso trukmė priklauso nuo pasirinktos tirpiklių sistemos ir jos poslinkio „starto linijos“ atžvilgiu. Kuo tirpiklių sistemos poslinkis didesnis, tuo chromatografavimo laikas ilgesnis. Po chromatografavimo plokštelė džiovinama ir ryškinama. Ryškinimas paremtas tiriamųjų medžiagų savybėmis: spalvinės reakcijos, ultravioletinės šviesos absorbcija arba fluorescencija joje. Jei tiriamosios medžiagos yra spalvotos, ryškinimas gali būti netaikomas. Ryškinimo metu ant plokštelės išryškėja dėmės, kurios parodo tiriamosios medžiagos poslinkį pradinės padėties atžvilgiu ir leidžia nustatyti pagrindinį kokybinį PC parametrą - Rf.

Rf reikšmės visada patenka į ribas tarp 0 ir 1. Kiekvienos medžiagos Rf reikšmė priklauso nuo

pačios medžiagos savybių, pasirinkto sorbento, tirpiklių sistemos (tūrio, sudėties) ir kameros įsotinimo tirpiklių sistemos garais. Analizuojant įvairių medžiagų mišinius svarbu pasirinkti optimalius chromatografinės sistemos parametrus, kurie užtikrintų, kad skirtingi mišinio komponentai neturės identiškų arba labai artimų Rf reikšmių.

Plonasluoksnės chromatografijos metodus galima pritaikyti ir kiekybinei analizei. Šiuo metu greičiausiai atliekamas densitometrinis medžiagų kiekio nustatymas.

3.5.1.1. Benzodiazepinų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu

Literatūroje dažniausiai pateikiamos PC metodikos benzodiazepinų mišinio analizei, nes jos pritaikomos ir pavienių benzodiazepino darinių identifikavimui. Bromazepamas ir klorazepatas priklauso šiai junginių grupei, todėl jų analizei tinka benzodiazepinų mišinio analizės metodai.

Analizuojant benzodiazepinų mišinius PC metodu, galima naudoti stacionarios fazės plokšteles, dengtas įvairiais sorbentais: silikageliu 60 RP 18F254s (17), silikageliu G UV254 (18), silikageliu GF254 (19), aliuminio oksidu 60 F254 (20) ir kt.

Tirpiklių sistemose dažnai naudojami: etilacetatas (18, 20, 21), etanolis (20), metanolis (18, 19, 21), chloroformas (18,19), acetonas (18,19,21), heksanas (17, 21), heptanas (20) ir kt.

3.5.1.2. Nimesulido analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu

Taikant PC nimesulido analizei, naudojamos chromatografinės plokštelės, padengtos silikageliu 60 F254 (22-24). Tirpiklių sistemose naudojami šie tirpikliai: cikloheksanas (23, 25), toluenas (22, 24), etilacetatas (23, 25), acetonas(22, 24), metanolis (22, 23), amoniakas (22) ir kt.

3.5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – skysčių chromatografijos rūšis. Chromatografinis išskirstymas atliekamas mėginio tirpalą leidžiant per sorbentu (stacionari fazė) užpildytą kolonėlę. Mėginio komponentai yra nevienodai giminingi sorbentui, todėl jie iš kolonėlės išplaunami skirtingu laiku (labiau giminingi išplaunami vėliausiai). Išplautą medžiagą fiksuoja detektorius, o chromatogramoje ji vaizduojama smailės pavidalu. Atliekant medžiagų analizę ESC metodu galima naudoti įvairius detektorius: UV–VIS detektorius (reaguoja į šviesą absorbuojančias funkcines grupes); fotodiodų matricos detektorius (geba vienu metu fiksuoti šviesos absorbciją esant skirtingam bangos ilgiui); fluorescencinis detektorius (skirtas florescuojančių junginių nustatymui); masių spektroskopijos detektorius (elektrinių laukų pagalba molekulės suskaldomos ir atpažystamos pagal susidariusių fragmentų kiekius) ir kiti. Medžiagos sulaikymo laikas kolonėlėje priklauso nuo medžiagos savybių, sorbento, kolonėlės ilgio, eliuento, eliuavimo sąlygų, kolonėlės temperatūros.

3.5.2.1. Bromazepamas

Analizuojant vaistų pavyzdžius, į kurių sudėtį įeina bromazepamas, naudojamos įvairios ESC metodikos. Moksliniuose straipsniuose minimos šios kolonėlės ir tirpiklių sistemos: kolonėlė C18 (250 x 4.6 mm, 3 µm) temperatūra 50 °C, judri fazė sudaryta iš acetonitrilo, metanolio ir amonio acetato (0,05 M), santykiu 25 : 45 : 30, 35 % amoniako tirpalas iki pH=9 (26); kolonėlės ChromolithTM Performance RP-8 (100 x 4.6 mm) ir ChromolithTM Performance RP-18 (100 x 4.6 mm), judri fazė sudaryta iš 19 % acetonitrilo, 81 % vandeninio fosfatinio buferio (0,07 M) ir 0,4 % trietilamino, pH=7,4 (27); kolonėlė Genesis C18 (100 × 2.1 mm, 4 µm), judri fazė sudaryta iš dietileterio ir heksano, santykiu 80 : 20 (28); kolonėlė Inertsil C8 (250 × 4 mm, 5 μm), judri fazė sudaryta iš amonio acetato, metanolio (0,05 M) ir acetonitrilo, santykiu 35 : 55 : 10 (29) ir kt. Medžiagų nustatymui naudojamas diodų matricos detektorius.

3.5.2.2. Klorazepatas

Klorazepato analizėje taikomos kolonėlės ir tirpiklių sistemos: kolonėlė Supelcosil LC8 DB (250 × 4.6mm, 5µm), judri fazė sudaryta iš metanolio ir skruzdžių rūgšties (0,1 M), santykiu 67 : 33, pH=2,16 (30); kolonėlė Kromasil C8 (150 × 4.6 mm, 5 µm), judri fazė sudaryta iš metanolio, acetonitrilo ir amonio acetato, gradientinis eliuavimas (31); kolonėlė Chromolith™ Performance (RP-18e 100 × 4.6 mm), judri fazė sudaryta iš fosfatinio buferio (0,32 M, pH=2,1) ir acetonitrilo, santykiu 70 : 30 (32) ir kt. Iš kolonėlės išplautas medžiagas fiksuoja diodų matricos detektorius.

3.5.2.3. Nimesulidas

Nimesulido anlizėje ESC metodu taikomos kolonėlės ir tirpiklių sistemos: Purospher® STAR RP-18 (250 × 4.6mm, 5µm), judri fazė buferis sudarytas iš citrinų rūgšties (0,1 M) ir dinatriohidrofosfato, santykiu 44,25 : 55,75 (33); HiQ Sil C18 HS (250 × 4.6mm), judri fazė iš metanolio ir vandens santykiu 70 : 30 (34); Chromolith®, Merck (500 × 4.6 mm), judri fazė sudaryta iš acetonitrilo ir fosfatinio buferio (pH=7, 10 mM), santykiu 34 : 66 (35). Visais atvejais nimesulido detekcijai naudotas diodų matricos detektorius.

4. TYRIMO OBJEKTAI IR METODIKOS

4.1. Tyrimo objektai

4.1.1. Kraujas

Eksperimentai atlikti su kraujo plazma (Bioetikos centro pritarimas Nr. BEC-FF-933, 1 priedas). Kraujo mėginiai (be jokių donoro indentifikavimo ženklų) gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Kraujo centro. Kraujo plazma iš gautų mėginių išskirta centrifugavimo būdu. Skirtingų mėginių kraujo plazma sumaišyta viename inde ir saugota šaldytuve +4 temperatūroje.

4.2. Metodikos

4.2.1. Plazmos mėginio paruošimas

Kraujo mėginiai 5 min centrifuguojami 5000 apsisukimų per minutę greičiu. Centrifugavimo metu kraujo forminiai elementai nusėda mėgintuvėlių dugne, o plazma nusistovi viršutinėje mėgintuvėlių dalyje. Plazmos sluoksnis surenkamas į bendrą švarų indą (tyrimui surenkama tik skaidri, nuo šviesiai gelsvos iki švelnaus gintarinio atspalvio, plazma).

Nagrinėtuose literatūros šaltiniuose nurodoma, kad maksimalios laisvų (prie plazmos baltymų neprisijungusių) vaistinių preparatų koncentracijos kraujo plazmoje po vienkartinės arba dienos dozės suvartojimo yra: nimesulido 3-4 mg/l, klorazepato 1mg/l, bromazepamo 140 ng/ml (0,14 mg/l). Literatūroje taip pat nurodoma, kad 97 % klorazepato ir 70 % bromazepamo rišasi su plazmoje esančiais baltymais. Atsižvelgiant į laisvų ir susijungusių su plazmos baltymais medžiagų kiekius, paruošti metanoliniai vaistinių medžiagų tirpalai: bromazepamo 8 µg/ml (B), klorazepato 150 µg/ml (K), nimesulido 50 µg/ml (N).

Ruošiant plazmos mėginį 1,5 ml talpos mėgintuvėlyje švelnia azoto srove iki sauso likučio išdžiovinama 20 µl B, 27 µl K ir 20 µl N tirpalų. Gautas sausas likutis tirpinamas 250 µl kraujo plazmos maišant vibracine maišykle. Paruoštas vaistinių preparatų tirpalas plazmoje laikomas 30 min kambario temperatūroje. Analogiškai paruošiamas „tuščias“ plazmos mėginys be vaistinių medžiagų. Po 30 minučių plazmos mėginiai užšaldomi -8 °C temperatūroje (šaldoma 30 min). Atšildyti mėginiai

baltymų.

Ekstrakcija iš plazmos vykdoma organiniu tirpikliu (dietiliu eteriu). Ant paruoštų plazmos mėginių (250 µl) užpilama po 1,25 ml dietilio eterio (plazmos ir ekstrahento santykis 1 : 5). Ekstrahuojama 1 min maišant vibracine maišykle. Atlikus ekstrakciją mėgintuvėliai centrifuguojami 10 min 4000 apsisukimų per minutę greičiu. Centrifugavimo metu plazma ir kitos dalelės nusėda mėgintuvėlių dugne, o dietilio eterio sluoksnis lieka paviršiuje. Po centrifugavimo organinio tirpiklio sluoksnis atsargiai atskiriamas į švarius indus ir išgarinamas azoto srove iki sauso likučio. Sausas likutis maišant ištirpinamas 1,5 ml metanolio ir laikomas kambario temperatūroje 30 min. Tirpinimo metu iškrenta baltos nuosėdos, kurios atsiranda dėl metanolio savybės nusodinti baltymus. Baltyminių nuosėdų atsiradimas yra naudingas procesas, kurio metu mėginiai išvalomi nuo balastinių medžiagų (plazmos baltymų). Iškritusios nuosėdos atskiriamos tirpalus filtruojant pro membraninį filtrą Rotilabo® - siringe filter, kurio skersmuo 13 mm, porų dydis 0,22 µm. Šitaip paruošti ir išvalyti plazmos mėginiai naudojami atliekant analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4.2.2. Plonasluoksnė chromatografija

Prieš atliekant tyrimą buvo būtina pasirinkti tinkamą metodiką ir ją adaptuoti savo tiriamoms medžiagoms. Analizuotoje literatūroje tarp dažniausiai naudojamų tirpiklių, taikomų nimesulido, bromazepamo ir klorazepato analizei plonasluoksnės chromatografijos metodu, buvo šie organiniai tirpikliai: acetonas, chloroformas, metanolis, etilacetatas. Taip pat dažnai tirpiklių sistemose naudojamas koncentruotas amonio hidroksido tirpalas. Metodikos kūrimo ir optimizavimo metu buvo išbandytos keturios literatūroje rastos ir penkios modifikuotos tirpiklių sistemos. Literatūroje (18, 19) rastos tirpiklių sistemos: „A“ – metanolis : koncentruotas amonio hidroksido tirpalas (100 : 1,5, v/v), „B“ – chloroformas : metanolis (90 : 10, v/v), „C“ – chloroformas : acetonas (80 : 20, v/v), „D“ – etilacetatas : metanolis : koncentruotas amonio hidroksido tirpalas (85 : 10 : 5, v/v/v). Modifikuotos tirpiklių sistemos: „E“ – chloroformas : etanolis (90 : 10, v/v), „F“ – chloroformas : acetonas : koncentruotas amonio hidroksido tirpalas (50 : 45 : 5, v/v/v), „G“ – etilacetatas : acetonas : etanolis (85 : 15 : 10, v/v/v), „H“ – etilacetatas : acetonas (85 : 15, v/v), „I“ – etilacetatas : etanolis (85 : 15, v/v).

Nejudri fazė - aliuminio plokštelė, dengta silikageliu F60254, sorbento sluoksnio storis 0,2

mm. Tiriamieji mišiniai ir standartinių medžiagų tirpalai ant plokštelės užnešti naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją CAMAG Linomat 5, kuris mėginius užneša suformuodamas brūkšnelio

pavidalo dėmę. „Starto linija“ 1,5 cm nuo plokštelės apačios, kildinama 10 cm (tirpiklių sistemos poslinkis „starto linijos“ atžvilgiu). Chromatografija atlikta CAMAG Twin Trough Chamber 20 x 20cm chromatografavimo kameroje. Tirpiklių sistemos tūris 50 ml. Kameros prisotinimui tirpiklių sistemos garais ir garų koncentracijos vienodumo užtikrinimui, kameroje įstatomas filtrinio popieriaus lakštas, kurio viena briauna patalpinama į tirpiklių sistemą. Chromatografavimo metu chromatografinė plokštelė atremiama į priešingą kameros sieną nei tirpiklių mišiniu prisotintas filtrinio popieriaus lakštas. Po chromatografavimo išdžiovintos plokštelės apšviečiamos 254 nm bangos ilgio ultravioletine (UV) šviesa, o tiriamuosiuose mišiniuose esančių vaistinių mėdžiagų dėmių Rf reikšmės

nustatomos naudojant visualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer ir programinę įrangą VideoScan. Programa VideoScan leidžia analizuojamą chromatogramą suskirstyti į atskirus takelius kurie palengvina analizės procesą.

4.2.3. Efektyvioji skysčių chromatografija

Norint atlikti vaistų mišinio tyrimą, reikėjo pasirinkti metodiką, tinkančią visiems mišinio komponentams. Metodika buvo pasirinkta išnagrinėjus literatūros šaltinius (26-35), kuriuose buvo aprašyta bromazepamo, klorazepato ir nimesulido analizė ESC metodu. Literatūros šaltiniuose rasta, kad visų trijų mišinio komponentų analizei dažnai naudojamos C18 tipo kolonėlės su spektrofotometrine detekcija. Visiems trims junginiams naudojamos 250 x 4,6 mm kolonėlės, kurių sorbento dalelelių dydis 5 µm. Tarp mobilios fazės komponentų dažnai minimi acetonitrilas ir fosfatiniai buferiai.

Tyrimui buvo pasirinkta kolonėlė ACE (C18) 250 x 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5µm. Analizei naudotas chromatografas Waters2695 su diodu matricos detektoriumi Waters996. Tiriamojo tirpalo injekcijos tūris 10 µl. Eliuavimas – gradientinis, gradiento tėkmės greitis 1 ml per minutę. Eliuentas A – 0,1 % trifluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas. Gradiento kitimas nurodytas pirmoje lentelėje (1 lentelė).

1 lentelė. Gradiento kitimas

Eliuentų procentinis santykis laiko momentu

A – 0,1 % trifluoracto rūgštis B – acetonitrilas

0 – 5 min 95 % 5 %

5 -25 min 10 % 90 %

25 – 28 min 10 % 90 %

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

5.1. Plonasluoksnė chromatografija

Atlikus PC tirpiklių sistemų tyrimus, nustatyta, kad dėl dėmių susiliejimo ir nevisiško atsiskyrimo, anksčiau minėtos sistemos „A“, „B“, „C“ ir „D“ tiriamo mišinio analizei netinka. Buvo nuspręsta modifikuoti literatūroje rastas sistemas, pakeičiant tirpiklių santykius, metanolį keičiant etanoliu arba atsisakant koncentruoto amonio hidroksido tirpalo. Modifikuotų tirpiklių sistemų tyrimai parodė, jog geriausiai tiriamųjų medžiagų mišinys išsiskirstė sistemose „G“ ir „I“. Bromazepamo, klorazepato ir nimesulido Rf reikšmių modifikuotose sistemose palyginimas (2 lentelė).

2 lentelė. Preparatų Rf reikšmės modifikuotose sistemose, tiriant jų mišinius

Tirpiklių sistema Preparatų Rf reikšmės

Bromazepamas Klorazepatas Nimesulidas

„E“ 0,68 0,79 0,97

„F“ 0,76 0,83 0,04

„G“ 0,53 0,60 0,68

„H“ 0,49 0,88 0,96

„I“ 0,51 0,62 0,71

Sistemos E, F ir H atmestos kaip netinkamos dėl dėmių ištęstumo. Netinkamos sistemos pavyzdys (4 pav.).

4 pav. Bromazepamo (B), klorazepato (T) ir nimesulido (N)

Tyrimo metu naudoti bromazepamo, klorazepato ir nimesulido standartų metanoliniai tirpalai ir jų mišinys. Standartiniai tirpalai gauti ištirpinus tiriamąsias vaistines medžiagas metanolyje, tirpalų koncentracijos: bromazepamo (0,4 mg/ml), klorazepato (0,3 mg/ml) ir nimesulido (0,5 mg/ml). Sumaišius 200 µl bromazepamo, 540 µl klorazepato ir 200 µl nimesulido tirpalų buvo paruoštas tirpalų mišinys. Gauta 940 µl tirpalo, kuriame galutinė medžiagų koncentracija tokia: bromazepamo 0,0752 µg/µl, klorazepato 0,1522 µg/µl ir nimesulido 0,1064 µg/µl. Praskiedus gautą vaistinių medžiagų mišinį penkis kartus, gautas tirpalas, kuriame medžiagų koncentracijos: bromazepamo 0,0145 µg/µl, klorazepato 0,0304 µg/µl ir nimesulido 0,0213 µg/µl. Abu standartų mišiniai naudoti kalibracinių grafikų sudarymui. Standartinių medžiagų ir jų mišinio chromatogramos sistemoje „G“ (5 pav.) ir sistemoje „I“ (6 pav.).

5 pav. Standartų ir standartų mišinio chromatograma sistemoje „G“, 1 takelis –

bromazepamas Rf 0,533; 2 takelis – klorazepatas Rf 0,615; 3 takelis – nimesulidas Rf 0,705; 4

6 pav. Standartų ir standartų mišinio chromatograma sistemoje „I“, 1 takelis–

bromazepamas Rf 0,469; 2 takelis – klorazepatas Rf 0,572; 3 takelis – nimesulidas Rf 0,681; 4

takelis – standartų mišinys (bromazepamo Rf 0,509; klorazepato Rf 0,604; nimesulido Rf 0,702).

Gautas Chromatogramas apšvietus 254 nm bangos ilgio UV šviesa gauti takelių šviesos sugerties profiliai.. Standartų ir standartų mišinio takelių šviesos sugerties profilių palyginimas (7 ir 8 pav.).

7 pav. Šviesos sugerties profiliai sistemoje „G“ plokštelė apšvietus 254 nm UV šviesa. Juoda – bromazepamas, žalia – klorazepatas, mėlyna – nimesulidas, raudona – medžiagų mišinys.

Atlikus dešimt pakartojimų, buvo nustatytos vidutinės bromazepamo, klorazepato ir nimesulido Rf reikšmės sistemose „G“ ir „I“, tiriant šių medžiagų mišinį. Statistiniai duomenys pateikti

3 ir 4 lentelėse.

3 lentelė. Statistiniai duomenys sistemoje „G“ atlikus 10 pakartojimų su tiriamųjų

medžiagų mišiniu. SN – standartinis nuokrypis, SSN – santykinis standartinis nuokrypis.

Sistema „G“ Rf vidurkis Rf SN Rf SSN, %

Bromazepamas 0,531 0,010 1,81

Klorazepatas 0,603 0,010 1,70

Nimesulidas 0,695 0,009 1,29

8 pav.Šviesos sugerties profiliai sistemoje „I“ plokštelė apšvietus 254 nm UV šviesa.

Sistema ,,I“ Rf

vidurkis Rf SN Rf SSN, %

Bromazepamas 0,516 0,007 1,37

Klorazepatas 0,618 0,008 1,28

Nimesulidas 0,720 0,007 1,01

Siekiant įvertinti sistemos tinkamumą kiekybiniam tiriamųjų medžiagų nustatymui, buvo sudaryti šviesos sugerties smailės aukščio (kuo didesnis medžiagos kiekis dėmėje, tuo aukštesnė smailė) priklausomybės nuo medžiagos kiekio dėmėje kalibraciniai grafikai sistemoje „G“ (9, 10 11 pav.) ir sistemoje „I“ (12, 13, 14 pav.). Medžiagų kiekiai dėmėse apskaičiuoti remiantis standartų mišinio koncentracijomis tirpale ir ant plokštelės užnešto tirpalo tūriu. Sudarant bromazepamo, klorazepato ir nimesulido kiekio kalibracinius grafikus pasirinktose sistemose, buvo įvertintas mažiausias medžiagų kiekis, kurį galima aptikti taikant pasirinktą metodiką (5 lentelė).

10 pav. Klorazepato kalibracinė kreivė sistemoje „G“.

11 pav. Nimesulido kalibracinė kreivė sistemoje „G“

13 pav. Klorazepato kalibracinė kreivė sistemoje „I“.

14 pav. Nimesulido kalibracinė kreivė sistemoje „I“.

5 lentelė. Mažiausias aptinkamas medžiagos kiekis PC sistemoje.

Medžiaga Mažiausias aptinkamas medžiagos kiekis, µg

„G“ „I“

Bromzepamas 0,1826 0,1826

Klorazepatas 0,0301 0,0902

5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija

Atlikus literatūros analizę nuspręsta, kad tiriamų medžiagų atskyrimui geriausiai tinka anksčiau minėta kolonėlė ACE (C18) 250 x 4,6 mm, kurios sorbento dalelių dydis 5µm. Bromazepamo, klorazepato ir nimesulido chromatogramos buvo gautos naudojant kelias tirpiklių sistemas (eliuentas), skirtingomis chromatografavimo sąlygomis. Pasirinkta tinkamiausia tirpiklių sistema, sudaryta iš acetonitrilo ir trifluoracto rūgšties (0,1 %), chromatografavimo metu taikytas gradientinis eliuavimas (gradiento kitimas pateiktas 1 lentelėje). Atskirų medžiagų chromatogramos pasirinktomis sąlygomis matomos 15, 16 ir 17 pav. Smailių UV spektrų maksimumai, buvo identiški arba labai artimi nurodytiems literatūroje (3, 16). Medžiagų mišinio chromatogramoje sulaikymo laikai atitiko pavienių chromatogramų sulaikymo laikus (Rt): bromazepamas – 16,657 min; klorazepatas – 17,317 min; nimesulidas – 22,532 min.

16 pav. Klorazepato chromatograma.

Optimizavus chromatografijos sąlygas medžiagų standartų mišiniui (mišinys gautas sumaišius 20 µl bromazepamo (8 µg/ml), 27 µl klorazepato (150 µg/ml), 20 µl nimesulido (50 µg/ml) ir praskiedus metanoliu iki 1,5 ml), nuspręsta metodą pritaikyti mėginių, gautų iš kraujo plazmos, analizei. Kraujo plazmoje buvo ištirpinti metodikoje nurodyti kiekiai tiriamųjų medžiagų ir paruoštas kraujo plazmos mėginys pagal aprašytą metodiką. Siekiant nustatyti ar pakanka pasirinkto plazmos mėginio valymo metodo, atlikta tuščio (be tiriamųjų medžiagų) plazmos mėginio chromatograma (18 pav.).

Tuščio plazmos mėginio chromatogramoje ties 15 min matoma smailė netrukdo tiriamojo medžiagų mišinio komponentų nustatymui, nes jų sulaikymo vietoje papildomų smailių nėra. Plazmos mėginio chromatograma be bromazepamo, klorazepato ir nimesulido leidžia teigti, kad pasirinktas mėginio valymo būdas užtikrina pakankamą mėginio švarumą. Plazmos mėginio su tiriamosiomis medžiagomis chromatograma 19 pav.

Siekiant įvertinti pasirinktos ESC sistemos stabilumą, buvo atliktos kelios tiriamųjų medžiagų mišinio plazmoje chromatogramos. Vienos dienos ir kelių dienų chromatogramų rezultatai matomi 6 lentelėje.

statistinę duomenų apdorojimo programą.

19 pav. Bromazepamo, klorazepato ir nimesulido mišinio plazmoje chromatograma.

6 lentelė. ESC sistemos stabilumas

Bromazepamas Klorazepatas Nimesulidas

Vienos dienos Rt vidurkis (5 pakart.), min 15,657 17,335 22,544

Vienos dienos Rt SN 0,005 0,006 0,004

Vienos dienos Rt SSN, % 0,03 0,04 0,02

Kelių dienų Rt vidurkis (10 pakart), min 15,664 17,341 22,543

Kelių dienų Rt SN 0,007 0,008 0,004

5.3. Rezultatų apibendrinimas

Apžvelgus mokslinę literatūrą, panašių tyrimų (analizuojančių bezodiazepinų ir NVNU mišinį) ir jų rezultatų nerasta, todėl nėra galimybės gautus rezultatus palyginti su kitų autorių darbais. Toliau pateiktas sukurtų PC sistemų „G“ ir „I“ palyginimas ir ESC metodo apibendrinimas.

Darbo metu vaistinių medžiagų mišinio analizei buvo optimizuotos efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodikos. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika buvo išbandyta tiriant ekstraktus, gautus iš kraujo plazmos, kurioje buvo ištirpintas bromazepamo, klorazepato ir nimesulido mišinys. Optimizavus plonasluoksnės chromatografijos metodikas, buvo sukurtos dvi tirpiklių sistemos tiriamo vaistų mišinio analizei. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos – pritaikytos kiekybiniam mišinio komponentų nustatymui.

Bromazepamo, klorazepato ir nimesulido Rf reikšmės sistemoje „G“ – etilacetatas : acetonas :

etanolis (85 : 15 : 10, v/v/v) ir „I“ – etilacetatas : etanolis (85 : 15, v/v) reikšmingai nesiskiria, tačiau abi sistemos turi pranašumų viena kitos atžvilgiu. Tirpiklių sistemoje „I“ tiriamųjų medžiagų Rf

santykiniai standartiniai nuokrypiai (išreikšti procentais) yra mažesni, nei sistemoje „G“, taigi galima teigti, kad sistemoje „I“ gaunamos tikslesnės Rf reikšmės.

Lyginant sistemų jautrumą, tirpiklių sistema „G“ leidžia nustatyti mažesnius bromazepamo ir nimesulido kiekius (atitinkamai 0,0301 µg ir 0,0426 µg), nei aptinkami naudojant tirpiklių sistemą „I“ (bromazepamo – 0,0902 µg, klorazepato – 0,1277 µg).

Pasirinktos ESC sąlygos leidžia atskirti ir identifikuoti bromazepamą, klorazepatą ir nimesulidą jų mišinyje. Metodika (kolonėlė ACE (C18) 250 x 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5µm, eliuentas A – 0,1 % trifluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas, eliuavimo rėžimas – gradientinis (1 lentelė)) gali būti taikoma tiriamųjų medžiagų kokybiniam nustatymui įvairiose vaistų formose ir žmogaus kraujo plazmoje.

1. Sukurtos dvi plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemos (sistema „G“ – etilacetatas : acetonas : etanolis (85 : 15 : 10, v/v/v), sistema „I“ – etilacetatas : etanolis (85 : 15, v/v), kuriose tiriamo vaistinių preparatų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) komponentai atsiskiria, o jų dėmės nepersidengia ir netrukdo viena kitos identifikavimui. 2. Plonasluoksnės chromatografijos sistemos „G“ ir „I“ naudojant vizualizavimo prietaisą

CAMAG TLC Visualizer ir programinę įrangą VideoScan, pritaikytos kiekybiniam mišinio (bromazepamas, kolrazepatas, nimesulidas) komponentų nustatymui.

3. Sukurta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika (kolonėlė ACE (C18) 250 x 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5µm, eliuentas A – 0,1 % trifluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas, eliuavimo rėžimas – gradientinis (1 lentelė)), vaistų mišinio (nimesulidas, klorazepatas, bromazepamas) išskirstymui ir komponentų identifikavimui. Taip pat įrodyta, kad pasirinktas plazmos mėginio paruošimo metodas leidžia pakankamai išvalyti mėginį nuo balastinių medžiagų ir tirti jį taikant naują ESC metodiką.

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis PC metodika chromatografavimas atliekamas tirpiklių sistemos garais prisotintoje kameroje. Tyrimų pradžioje buvo naudojamos plokščiadugnės chromatografavimo kameros be filtrinio popieriaus lakšto kameros įsotinimui tirpiklių garais, todėl buvo sunku užtikrinti garų tankio vienodumą visoje kameroje. Vėliau chromatografavimui buvo naudojama CAMAG Twin Trough Chamber 20 x 20 cm kamerą. CAMAG Twin Trough Chamber (20 pav.) kamera nuo paprastos plokščiadugnės kameros skiriasi vidine dugno struktūra, kuri sudaryta iš dviejų lygiagrečių griovelių į kuriuos supilamas tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), o vėliau patalpinamas įsotinimui skirtas filtrinio popieriaus lakštas ir chromatografinė plokštelė. Twin Trough tipo kamera ir filtrinis popierius užtikrina optimalų kameros įsotinimą tirpiklių sistemos garais.

Empiriškai nustatyta, kad tiksliausi rezultatai gaunami, kai kameros įsotinimas tirpiklių sistemos garais vykdomas mažiausiai 30 min. Į kamerą patalpinant chromatografavimo plokštelę, ją reikia įdėti taip, kad ji dėl savo pačios svorio neišlinktų, nesukeltų tirpiklio bangavimo, silikagelio sluoksnis būtų atgręžtas į filtrą. Banguodamas tirpiklis gali nuplauti tiriamąsias medžiagas nuo plokštelės. Plokštelės išlinkimas daro įtaką tiriamųjų medžiagų poslinkiui, medžiagos gali būti nunešamos i šoną, todėl sudėtinga išmatuoti jų poslinkį „starto linijos“ atžvilgiu. Siekiant gauti geriausius rezultatus patartina naudoti storesnes aliuminio arba stiklo pagrindo plokšteles, kurios neišlinksta.

(1) Stolerman IP editor. Encyclopedia of Psychopharmacology. : Springer‐ Verlag Berlin Heidelberg; 2010.

(2) Valstybinė vasitų kontrolės tarnyba. Bromazepam Lanacher. Available at:

http://extranet.vvkt.lt/paieska/details.php?id=13988&thislanguage=lang_lt. Accessed 03 01, 2014.

(3) Watts J, Moffat AC, Osselton MD, Widdop B editors. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 4th ed.: Pharmaceutical Press; 2011.

(4) Bennett A. Nimesulide: a well-established cyclooxygenase-2 inhibitor with many other pharmacological properties relevant to inflammatory diseases. In: Vane JR, Botting RM, editors. Therapeutic roles of selective COX-2 inhibitors London: William Harvey; 2001. p. 524–540.

(5) Bernareggi A. Clinical pharmacokinetics and metabolism of nimesulide. InflammoPharmacology 2001 05/01;9(1-2):81-89.

(6) Boelsterli UA. Mechanisms of NSAID-induced hepatotoxicity: focus on nimesulide. Drug Saf 2002;25(9).

(7) Oda M, Kotegawa T, Tsutsumi K, Ohtani Y, Kuwatani K, Nakano S. The effect of itraconazole on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of bromazepam in healthy volunteers. Eur J Clin

Pharmacol 2003 11/01;59(8-9):615-619.

(8) Patsalos PN, Bourgeois BFD. Diazepam. The Epilepsy Prescriber’s Guide to Antiepileptic Drugs New York: Cambridge University Press; 2010. p. 49-58.

(9) Macpherson D, Best SA, Gedik L, Hewson AT, Rainsford KD, Parisi S. The Biotransformation and Pharmacokinetics of 14C-Nimesulide in Humans Following a Single Dose Oral Administration. Drug Metab Toxicol ;4(1):2013 12 15.

(10) Metabolism. In: Rainsford KD, editor. Nimesulide – Actions and Uses Switzerland: Birkhäuser Verlag; 2005. p. 82-87.

(11) Michaud K, Romain N, Giroud C, Brandt C, Mangin P. Hypothermia and undressing associated with non-fatal bromazepam intoxication. Forensic Sci Int 2001 12/27;124(2–3):112-114.

(12) Lakhal K, Pallancher SF, Mathieu-Daude JF, Harry PF, Capdevila X. Protracted deep coma after bromazepam poisoning. Clin Pharmacol Ther 2010;48(1):79-83.

(13) Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba. Tranxene. Available at:

http://extranet.vvkt.lt/paieska/details.php?id=11340&thislanguage=lang_lt. Accessed 01 20, 2014.

(14) Adverse reactions and their mechanisms from nimesulide. In: Rainsford KD, editor. Nimesulide – Actions and Uses Switzerland: Birkhäuser Verlag; 2005. p. 315-389.

(15) Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba. Aponil. Available at:

http://extranet.vvkt.lt/paieska/details.php?id=14410&thislanguage=lang_lt. Accessed 01 20, 2014.

(16) Rainsford KD editor. Nimesulide – Actions and Uses. Switzerland: Birkhäuser Verlag; 2005.

(17) Medić-Šarić M, Strapač M, Bojić M. Optimization of mobile phases for the TLC separation of benzodiazpins. Abstract book: 29th International Symposium on Chromatography and the 18th International Symposium on Separation Science 2012:201.

(18) Thangadurai S, Dhanalakshmi A, Kannan MVS. Separation and Detection of certain Benzodiazepines by Thin-Layer Chromatography . Malaysian Journal of Forensic Sciences 2013;4(1):47-53.

(19) Identification and Analysis of Barbiturates and Benzodiazepines under International Control. New York,: United Nations; 2012.

(20) Bojić M, Zadro M, Šarić D, Debeljak Ž. APPLICATION OF NUMERICAL TAXONOMY IN THE INVESTIGATION OF BENZODIAZEPINES. Livro de Resumos do SIMCRO 2010:201.

(21) Hancu G, Enikı Fülöp, Rusu A, Mircia E, Gyéresi Á. THIN LAYER CHROMATOGRAPHIC SEPARATION OF BENZODIAZEPINE DERIVATES . Analele UniversităŃii din Bucureşti – Chimie 2011;20(2):181 – 188.

(22) Dhaneshwar SR, Suryan AL, Bhusari VK, Rasal KS. Validated HPTLC method for Nimesulide and Dicyclomine Hydrochloride in formulation. Journal of Pharmacy Research 2011 07;4(7):2288-2290.

(23) Charde, M., Kundu, R., Ghante, M., Chakole,R. SIMULTANEOUS ESTIAMATION OF

2012;2(2).

(24) Miljkovi B, Brzakovi B, Kovacevi I, Agbaba D, Pokrajac M. Quantitative analysis of nimesulide in plasma by thin-layer chromatography: Application to pharmacokinetic studies in man. Journal of planar chromatography, modern TLC 2003 06/01;16(3):211-213.

(25) Patravale VB, D'Souza S, Narkar Y. HPTLC determination of nimesulide from pharmaceutical dosage forms. J Pharm Biomed Anal 2001 6;25(3–4):685-688.

(26) al-Hawasli H, al-Khayat MA, al-Mardini MA. Development of a validated HPLC method for the separation and analysis of a Bromazepam, Medazepam and Midazolam mixture. Journal of

Pharmaceutical Analysis 2012 12;2(6):484-491.

(27) Podilsky G, Berger‐ Gryllaki M, Testa B, Pannatier A. Development and Validation of an HPLC Method for the Simultaneous Monitoring of Bromazepam and Omeprazole. Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies 2008;31(6):878-890.

(28) Laurito TL, Mendes GD, Santagada V, Caliendo G, de Moraes MEA, De Nucci G. Bromazepam determination in human plasma by high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry: a highly sensitive and specific tool for bioequivalence studies. Journal of Mass

Spectrometry 2004;39(2):168-176.

(29) Samanidou VF, Pechlivanidou AP, Papadoyannis IN. Development of a validated HPLC method for the determination of four 1,4-benzodiazepines in human biological fluids. Journal of Separation Science 2007;30(5):679-687.

(30) Ashour S, Kattan N. New Method for Determination of Dipotassium Clorazepate in Capsule Formulations by High Performance Liquid Chromatography . R J of Aleppo Univ 2012;82.

(31) Uddin MN, Samanidou VF, Papadoyannis IN. HPLC Method for Simultaneous Determination of 1,4-Benzodiazepines and Tricyclic Antidepressants in Pharmaceutical Formulations and Saliva—A Useful Tool in Medicinal Chemistry. J Liq Chromatogr Rel Technol 2009 04/28;

2014/04;32(10):1475-1504.

(32) Bugey A, Staub C. Rapid analysis of benzodiazepines in whole blood by high-performance liquid chromatography: use of a monolithic column. J Pharm Biomed Anal 2004 5/28;35(3):555-562.

(33) Hanif M, Shoaib MH, Yousuf RI, Khan A, Anwer S, Rasul A, et al. Reverse phase high

performance liquid chromatographic (HPLC) method for nimesulide tablets dosage form prepared for in vivo in vitro correlation (IVIVC) studies. African Journal of Pharmacy and Pharmacology

2011;5(20):2342-2348.

(34) Dhaneshwar SR, Salunkhe JV, Bhusari VK. VALIDATED HPLC METHOD FOR SIMULTANEOUS QUANTITATION OF LEVOCETIRIZINE HYDROCHLORIDE AND NIMESULIDE IN BULK DRUG AND FORMULATION . Pharmacie Globale 2011;2(02).

(35) Tzanavaras PD, Themelis DG. Validated high-throughput HPLC assay for nimesulide using a short monolithic column. J Pharm Biomed Anal 2007 3/12;43(4):1483-1487.