LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
INDRĖ ŠAKAVIČIENĖ
LIETUVOJE AUGINAMŲ CANNABIS SATIVA L. VEISLIŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS IR PALYGINIMAS
SPEKTROFOTOMETRINIAIS CUPRAC IR FRAP METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc., dr. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
LIETUVOJE AUGINAMŲ CANNABIS SATIVA L. VEISLIŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS IR PALYGINIMAS
SPEKTROFOTOMETRINIAIS CUPRAC IR FRAP METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovė:
Doc. dr. Asta Kubilienė Data
Darbą atliko:
Magistrantė Indrė Šakavičienė Data
TURINYS
SANTRAUKA...5 SUMMARY...6 1. SANTRUMPOS...8 2. ĮVADAS...93. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI...11
4. LITERATŪROS APŽVALGA...12
4.1 Kanapių (Cannabis L.) paplitimas ir morfologiniai požymiai ...12
4.2 Cannabis L. panaudojimas...14
4.3 Cheminė Cannabis sativa L. sudėtis ...14
4.4 Cannabis veikliųjų junginių poveikis žmogaus organizmui...16
4.5 Biologiškai aktyvių junginių iš Cannabis sativa L. ekstrakcijos metodai...18
4.6 Antioksidantų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai...20
4.7 Antioksidacinio poveikio svarba žmogaus organizmui...21
5. TYRIMO METODIKA...22
5.1 Tyrimo objektas...22
5.2 Cannabis sativa L. žaliavos kokybinis įvertinimas...22
5.3 Tyrimo metu naudoti reagentai...22
5.4 Aparatūra...23
5.5 Pluoštinės kanapės ekstraktų ruošimas...23
5.6 Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu...24
5.7 Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu...25
5.8 Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas...26
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...27
6.1 Cannabis sativa L. žaliavos kokybinis įvertinimas...27
6.2 Cannabis L. genties antioksidaciniai tyrimai spektrofotometriniu metodu...28
6.2.1 Antioksidacinio aktyvumo spektrofotometriniu FRAP metodu rezultatų įvertinimas...28
6.2.2 Antioksidacinio aktyvumo spektrofotometriniu CUPRAC metodu rezultatų įvertinimas...32
6.3 Nustatyto antioksidacinio aktyvumo palyginimas FRAP ir CUPRAC metodais ...36
6.4 Rezultatų aptarimas...40
7. IŠVADOS...41
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...42
10. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS...49
SANTRAUKA
Indės Šakavičienės magistro baigiamasis darbas/ darbo vadovas A. Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2018.
Pavadinimas: Lietuvoje auginamų Cannabis sativa L. veislių antioksidacinio aktyvumo nustatymas ir palyginimas spektrofotometriniais FRAP ir CUPRAC metodais.
Darbo tikslas: ištirti ir įvertinti Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) skirtingų veislių antžeminės dalies ekstraktų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniais FRAP ir CUPRAC metaodais.
Darbo uždaviniai: Nustatyti skirtingų pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) veislių žaliavų, auginamų skirtinguose Lietuvos regionuose, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu FRAP metodu; nustatyti skirtingų pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) veislių žaliavų, auginamų skirtinguose Lietuvos regionuose, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu; palyginti FRAP ir CUPRAC metodais nustatytą antioksidacinį aktyvumą skirtingose pluoštinės kanapės veislių žaliavose, augintose skirtinguose Lietuvos regionuose.
Tyrimo metodai: Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniais FRAP ir CUPRAC metodais.
Tyrimo rezultatai: Atlikus antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu FRAP metodu, didžiausios TEAC reikšmės nustatytos: Futura veislėje (0,533 ± 0,025 mg/ml) ir Finola veislėje (0,495 ± 0,006 m g/ml) Rokiškio rajone rinktoje žaliavoje, Felina veislėje (0,505 ± 0,006 mg/ml) Utenos rajone augintų kanapių žaliavoje, Secuieni Jubileu (0,462 ± 0,014 mg/ml) Panevėžio rajone rinktoje žaliavoje. Atlikus antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu, didžiausios TEAC reikšmės nustatytos: Futura veislės žaliavoje (0,574 ± 0,027 mg/ml), auginamoje Anykščių rajone, Felina (0,443 ± 0,016 mg/ml) – Utenos rajone, Finola (0,462 ± 0,036 m g/ml) – Rokiškio rajono žaliavoje, o Secuieni Jubileu (0,342 ± 0,015 mg/ml) – Panevėžio rajone rinktoje žaliavoje. Lyginant FRAP ir CUPRAC metodais gautus rezultatus nustatyta, kad statistiškai reikšmingai didesni (p<0,05) antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekiai nustatyti naudojant spektrofotometrinį FRAP metodą.
Tyrimo išvados: Atlikus skirtinguose Lietuvos regionuose kultivuojamų pluoštinių kanapių skirtingų veislių antioksidacinio aktyvumo tyrimą spektrofotometriniais FRAP ir CUPRAC metodais, statistiškai reikšmingai (p˂0,05) didesni antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekiai nustatyti tyrimui naudojant FRAP reagentą. Lyginant skirtingų Cannabis sativa L. veislių žaliavų antioksidacinį aktyvumą galima teigti, kad didžiausia redukcine geba pasižymi Futura veislės žaliava, o mažiausia – Manoica veislės žaliava.
SUMMARY
Master thesis of Indrė Šakavičienė/ scientific supervisor: doc. Dr. Asta Kubilienė; Lithuanian university of helth sciences Faculty of medicine Department of analytical ant toxicological chemistry. –Kaunas, 2018.
Title: Determination of Cannabis sativa L. Species That are Grown in Lithuania and Their Comparison by Spectrophotometric FRAP and CUPRAC Methods.
Aim of the study: to assess and evaluate antioxidant activity of terrestrial extracts of hemp of different breeds (Cannabis sativa L.) that are grown in Lithuania by spectrophotometric FRAP and CUPRAC methods.
Task of the study: to determine antioxidant activity of raw materials of different breeds of hemp (Cannabis sativa L.) that are grown in different Lithuanian regions by spectrophotometric FRAP method; to determine antioxidant activity of raw materials of different breeds of hemp (Cannabis sativa L.); to compare antioxidant activity of raw materials of different breeds of hemp that are grown in different Lithuanian regions by spectrophotometric FRAP and CUPRAC methods.
Methods of research: antioxidant activity is determined by spectrophotometric FRAP and CUPRAC methods.
Results of research: after carrying out of antioxidant activity by spectrophotometric FRAP method, the highest TEAC values determined in Futura breed (0,533 ± 0,025 mg/ml) and Finola breed (0,495 ± 0,006 m g/ml) in raw materials collected in Rokiškis District, in Felina breed (0,505 ± 0,006 mg/ml) in raw materials collected in Utena District, in Secuieni Jubileu breed (0,462 ± 0,014 mg/ml) in raw materials collected in Panevėžys District. After carrying out of antioxidant activity by CUPRAC method, the highest TEAC values are determined in Futura breed raw material (0,574 ± 0,027 mg/ml) that is grown in Anykščiai District, in Felina breed (0,443 ± 0,016 mg/ml) in Utena District, in Finola breed (0,462 ± 0,036 m g/ml) in Rokiškis District and in Secuieni Jubileu breed (0,342 ± 0,015 mg/ml) in Panevėžys District. Comparing the results received by FRAP and CUPRAC methods it was determined that more statistically higher (p<0,05) quantities of compounds with antioxidant features are determined by using spectrophotometric FRAP method. Conclusions of research: after carrying out of research of antioxidant activity in different breeds of hemp that is grown in different Lithuanian regions by spectrophotometric FRAP and CUPRAC methods, it was determined that more statistically higher (p<0,05) quantities of compounds with antioxidant features are determined by using spectrophotometric FRAP method. Comparing different antioxidant activity of different breeds of Cannabis sativa L., it may be stated that Futura raw material is of the highest redution capacity and Manoica raw material is of the lowest reduction capacity.
PADĖKA
Už pagalbą ir naudingus patarimus rengiant magistro baigiamąjį darbą esu dėkinga darbo vadovei doc. Dr. Astai Kubilienei. Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lekt. Mindaugui Marksai už nuoširdžią pagalbą, patarimus, atliekant tyrimus ir analizuojant turimus duomenis.
1. SANTRUMPOS
ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) CBD – kanabidiolis (angl. cannabidiol)
CBN – kanabinolis (angl. cannabinol)
CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidacinė geba (anglų k. – cupric ion reducing antioxidant capacity)
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) RNS – reaktyviosios azoto formos
ROS – reaktyviosios deguonies formos SN – standartinis nuokrypis
SSN – santykinis standartinis nuokrypis
TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidacinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity)
THC – tetrahidrokanabinolis (angl. tetrahydrocannabinol)
THCA – tetrahidrokanabinolinė rūgštis (angl. tetrahydrocannabinolic acid) TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (angl. 2,4,6-tripyridyl-s-triazine)
2. ĮVADAS
Žmogaus organizme vyksta įvairūs oksidaciniai procesai. Tai yra įprastas medžiagų apykaitos procesas, tačiau ne retai jį sąlygoja ir užteršta aplinka, ultravioletiniai spinduliai, radiacija ar net prasti valgymo įpročiai [14]. Vykstant oksidacijai susiformuoja laisvieji radikalai, kurie greitina organizmo senėjimą ir yra įvairių lėtinių ligų priežastis. Todėl domėjimasis antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčiomis medžiagomis yra labai padidėjęs.
Gamtoje yra daugybė natūralių antioksidantų, besiskiriančių savo sudėtimi, fizinėmis ir cheminėmis savybėmis bei veikimo mechanizmais. Plačiai naudojami sintetiniai antioksidantai gali turėti ir neigiamos įtakos žmogaus sveikatai. Todėl saugumo sumetimais, ieškant natūralių antioksidantų, didžiausias dėmesys skiriamas augalams, kaupiantiems antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčias biologiškai aktyvias medžiagas. Šiuo požiūriu dažniausiai domimasi fenolinius junginius kaupiančiomis augalinėmis žaliavomis, nes moksliniais tyrimais įrodytas šių junginių gebėjimas apsaugoti organizmo ląsteles nuo oksidacinio streso bei sumažinti lėtinių ligų atsiradimo riziką [15]. Tačiau šiomis savybėmis pasižymi ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai – kanabinoidai, terpenai, eteriniai aliejai.
Kanapės yra vieni seniausių kultūrinių augalų pasaulyje. Šis augalas jau nuo seno buvo naudojamas pluošto, kuro bei pašarų gamybai. Pastebėjus kanapių gydomąsias savybes, jos pradėtos vartoti esant įvairiems negalavimams – skausmo malšinimui, apetito gerinimui, vėmimo slopinimui ir kt.[30,79]. Tačiau dėl kanapėse besikaupiančių psichiką veikiančių biologiškai aktyvių junginių – tetrahidrokanabinolio (THC) – kanapių vartojimas daugelyje pasaulio šalių buvo uždraustas.
2014 metų sausio 1 dieną Lietuvoje įsigaliojo įstatymas, leidžiantis auginti pluoštines kanapes, kuriose THC kiekis neviršija 0,2 proc. [10]. Todėl išaugo susidomėjimas ir kitomis biologiškai aktyviomis medžiagomis, kurias kaupia šis augalas, bei jų poveikiu žmogaus organizmui. Moksliniais tyrmais įrodyta, kad Cannabis sativa L. žaliavoje, be kanabinoidų, taip pat kaupiasi fenoliniai junginiai, terpenai bei eteriniai aliejai, kurie pasižymi antioksidacinėmis savybėmis.
Šiuo metu Lietuvoje yra kultivuojamos kelios pluoštinių kanapių veislės – Finola, Felina, Futura, Manoica, Secuieni Jubileu, Virtus Rugo, KC-Dora. Šio tyrimo tikslas – nustatyti šių skirtingų Cannabis sativa L. veislių antioksidacinį aktyvumą spektofotometriniu metodu, naudojant du skirtingus reagentus (FRAP ir CUPRAC) ir palyginti gautus rezultatus.
Darbo rezultatai pristatyti 8-oje tarptautinėje konferencijoje – “Science and practice 2017”, kuri vyko 2017 m. gruodžio 15 dieną Kaune ir 2-oje tarptautinėje mokslinėje-praktinėje
konferencijoje „Pharmaceutical science and practice: problems, achievements, prospects“, vykusioje 2018 m. balandžio 27 dieną Harikove, Ukrainoje.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Ištirti ir įvertinti Lietuvoje kultivuojamų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) skirtingų veislių antžeminės dalies ekstraktų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniais FRAP ir CUPRAC metodais.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti skirtingų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislių žaliavų, auginamų skirtinguose Lietuvos regionuose, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu FRAP metodu.
2. Nustatyti skirtingų pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislių žaliavų, auginamų skirtinguose Lietuvos regionuose, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu.
3. Palyginti FRAP ir CUPRAC metodais nustatytą antioksidacinį aktyvumą skirtingose pluoštinių kanapių veislių žaliavose, augintose skirtinguose Lietuvos regionuose.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1 Kanapių (Cannabis L.) paplitimas ir morfologiniai požymiai
Karalystė: Augalai (Plantae)Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Dilenijažiedžiai (Dilleniidae) Šeima: Kanapiniai (Cannabaceae) Gentis: Kanapė (Cannabis L.) [80]
Kanapės (Cannabis L.) – vienmetis žolinis augalas, priklausantis kanapinių (Cannabaceae) šeimai. Šiai šeimai priskiriamos trys kanapių rūšys: Cannabis sativa – sėjamoji kanapė, Cannabis indica – indinė kanapė ir Cannabis ruderalis – šiukšlyninė kanapė [64].
Sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.) plačiai paplitusi visame pasaulyje – buvo auginama Europoje, Azijoje, Afrikoje ir Amerikoje. Manoma, kad augalas kilęs iš Centrinės Azijos, tačiau tai yra vienas pirmųjų kultivuojamų augalų žmonių istorijoje, todėl tiksli pirminio paplitimo vieta nėra žinoma [64]. Tuo tarpu Cannabis indica kildinama iš Pakistano ir Indijos. Šiuo metu C. sativa dažniausiai kultivuojama Amerikoje, Azijoje ir Afrikoje, o C. ruderalis – Centrinėje Europoje ir Kanadoje.
Kanapės morfologiniai požymiai priklauso nuo rūšies. C. sativa L. yra vienmetis žolinis augalas, augantis iki 1-6 metrų aukščio. Stiebai žali, tuščiaviduriai, stati, išilgai briaunuoti, apaugę plaukeliais. Lapai sudėtiniai, pirštuoti, siauri, pailgi, šviesiai žalios spalvos, kraštai dantyti. Lapai sudaro apie 25 proc. viso augalo masės. Moteriškų augalų stiebai storesni ir trumpesni, lyginant su vyriškais augalais, turi daugiau lapų [60].
Tai dvilyčiai augalai. Vegetacijos metu, kol nepradeda žydėti, vyriškus ir moteriškus augalus atskirti yra sunku. Tačiau vėliau šie augalai skiriasi. Žydėjimo periodas ilgas. Pirmi pražysta moteriški žiedai, o po 2-10 dienų (priklausomai nuo tipo) – vyriški.
Kanapės žiedai rausvi, salsvo vaisių kvapo, sutelkti į šluotelės tipo žiedynus. Moteriški žiedai smulkūs, susitelkę į žiedynus, kurie kaupiasi stiebų viršūnėje ir lapų pažastyse. Žiedą sudaro iš 5 suaugusių lapelių susidaręs žalias apvalkalėlis, kuris apgaubia mezginę. Mezgynėje esanti purka padengta smulkiais žiedadulkių gaudikliais. Nužydėjus moteriški augalai tęsia augimą, tampa stipresni ir didesni. Vyriški žiedai sudaryti iš 5 gelsvai-žalių žiedlapių ir 5 kuokelių su dulkinėmis. Vyriškas augalas išaugina iki 40 gramų žiedadulkių. Nužydėjus vyriški augalai nustoja augti, pageltonuoja ir greitai miršta (1pav.).
1 pav. Moteriški ir vyriški sėjamosios kanapės augalai
Vaisius – šviesiai pilkos-rusvos ar žalsvos spalvos riešutėlis su dviem sėklaskiltėmis. C. indica užauga iki 2 metrų aukščio, lapai tamsiai žali, mėsingi, platūs, trumpi, dantyti. Pumpurai rausvai violetinės spalvos, išsiskiriantys stipriu specifiniu kvapu. Ši kanapių rūšis yra stipriausia, todėl naudojama hašišo ir kitų stipresnių narkotikų gamybai.
Šiuo metu yra žinomos kelios pluoštinių kanapių veislės: Felina, Finola, Futura, USO, Manoica, S. Jubileu, V. Rugo, KC-Dora ir kt. Pagal vegetacijos periodą, pluošto ir sėklų derliaus santykį ir pagal kitus agrobiologinius požymius Rusijos, Baltarusijos, Ukrainos mokslininkai išskiria tris geografinius pluoštinių kanapių tipus (geografines rases) – pietinį, vidutinių platumų ir šiaurinį. Pietinio tipo kanapės yra aukštos, turi daugiau pluošto, mažiau sėklų (tokios, kaip Lietuvoje sėjamos veislės Fedora 17, Felina 32 ir kt.), o šiaurinio tipo – žemesnės, daugiausiai auginamos sėkloms (tokios, kaip veislė Finola). Vidutinių platumų tipą iš Lietuvoje auginamų labiausiai atitinka USO-31 veislės kanapės [9].
Finola yra oficialus Suomiškos veislės pavadinimas, kuris 1998 m. kaip kultivuojama veislė priimta Kanadoje, o 2004 m. – visoje Europoje [19]. Ši veislė ypač pritaikyta sėklų auginimui šiauriniame klimate. Palyginti su kitomis kanapių veislėmis, Finolos veislės augalai yra santykinai žemi (brandaus amžiaus augalas užauga iki 1,5 m), visuose augimo etapuose yra šalčiui atspari (iki -5 ◦C), pasižymi tolerancija sausrai ir ankstyva branda (paprastai per 115 dienų) [19].
Yra duomenų, kad Finola veislės pluoštinių kanapių žaliavoje, esant tam tikroms klimato sąlygoms, gali kauptis didesnis, nei 0,2 proc. THC kiekis [11]. Todėl Lietuvoje kiekvienais metais yra tikrinami šios veislės kanapių mėginiai. Dvejus metus viršijus nustatytą maksimalų THC kiekį žaliavoje, ši rūšis gali būti uždrausta auginti mūsų šalyje.
4.2 Cannabis L. panaudojimas
Kanapės – vienas seniausių augalų žemėje, kuris žinomas ir naudojamas medicininiams tikslams, pluoštui, pašarų gamybai, kurui, kosmetikai daugiau nei 10000 metų. Šiaurės Amerikoje kanapių sėklos buvo naudojamos dažų ir lako pramonėje, importuojamos kaip paukščių maistas [19]. Žmonės kanapių sėklas (tiek neapdorotos, tiek skrudintas ar virtas) ir iš jų gautą aliejų pradėjo vartoti kaip maisto šaltinį ir vaistą daugiau nei prieš 3000 metų [19]. Kanapių pienas, gautas sutrynus kanapių sėklas su vandeniu, yra tradicinis ir labai populiarus gėrimas Pietų Kinijoje. Sėjamoji kanapė dažniausiai naudojama kaip pluošto šaltinis. Tačiau kanapių stiebai turi daug celiuliozės, todėl naudojama popieriaus gamyboje.
Be pluošto ir sėklų, plečiasi ir kitų kanapių produktų panaudojimo galimybės Europoje. Kanapių lapai naudojami arbatoms, žiedynai – alaus ir eterinių aliejų gamybai, kanapių eterinis aliejus gali būti naudojamas aromaterapijai ir augalų apsaugai (veikia kai kurias bakterijas, turi atbaidantį poveikį vabzdžiams). Ekologiškai ūkininkaujantys kanapes vertina už jų savybę palikti laukus be piktžolių kitiems po jų sodinamiems pasėliams. Todėl šie augalai labai svarbūs augalų sėjomainai.
4.3 Cheminė Cannabis sativa L. sudėtis
Cannabis sativa L. sudėtyje yra įvairių klasių cheminių sudedamųjų dalių. Sudedamieji komponentai gali būti suskirstyti į grupes: kanabinoidai, azoto turintys junginiai (aminai, amidai), amino rūgštys, baltymai, cukrai (monosacharidai, disacharidai, polisacharidai), angliavandeniai, paprastosios ir riebiosios rūgštys, terpenai, flavonoidai, flavonoidų glikozidai ir kt. [28,74]. Viso Cannabis žolėje suskaičiuojama daugiau nei 500 cheminių junginių [28]. Maždaug 80 iš šių junginių priklauso terpeno-fenolių klasei ir vadinami fitokanabinoidais [13,36,39] . Pastarieji savo sudėtyje turi 21 C atomą ir lemia unikalias kanapių farmakologines savybes. Tačiau jų kiekis ir sudėtis kanapių augaluose yra labai skirtingas, todėl pagal dominuojančius kanabinoidus ir jų koncentraciją augale Cannabis genties augalai klasifikuojami į 5 chemotipus: narkotines kanapes, vidutinio tipo kanapes, pluoštines kanapes, kanabigerolį kaupiančias kanapes ir ne kanabinoidines kanapes [56]. Kanabinoidų (tetrahidrokanabinolio ir kanabidiolio) koncentracijos chemotipuose nurodytos 1 lentelėje.
1 lentelė. Cannabis L. chemotipai pagal kanabinoidų koncentracijas [55]
Chemotipas THC CBD
Narkotinės kanapės 0,5 – 15 proc. 0,01 – 0,16 proc.
Vidutinio tipo kanapės 0,5 – 5 proc. 0,9 – 7,3 proc.
Pluoštinės kanapės 0,05 – 0,7 proc. 1,0 – 13,6 proc.
Kanabigerolį kaupiančios kanapės < 0,05 proc. < 0,5 proc.
Ne kanabinoidinės kanapės 0 proc. 0 proc.
Kanabinoidai pagal savo cheminę struktūrą skirstomi į 11 grupių [37]. Fitocheminė kanabinoidų klasifikacija pagal labilumą esant tam tikroms išorės sąlygoms, šiuos junginius išskiria į rūgštinius, neutralius ir dirbtinius kanabinoidus [38]. Šviežioje žaliavoje daugiausia vyrauja rūgštiniai kanabinoidai. Pastariesiems priskiriama tetrahidrokanabinolinė rūgštis (THCA), kanabidiolinė rūgštis (CBDA), kanabigerolinė rūgštis (CBGA), kanabichromeninė rūgštis (CBCA). Vykstant dekarboksilinimo procesui, šios rūgštys virsta atitinkamai Δ9 -tetrahidrokanabinoliu (THC), kanabidioliu (CBD), kanabigeroliu (CBG) ir kanabichromenu (CBC) [37]. Schematiška THCA ir CBDA biosintezė ir jų virtimas THC ir CBD pavaizduoti 2 paveiksle.
2 pav. THCA ir CBDA biosintezės bei THC ir CBD susidarymo schema [23]
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad priklausomai nuo kanapių genotipo ir augimvietės temperatūros priklauso kanabinoidų koncentracija augale [62], o THC didžiausia koncentracija nustatoma moteriškų augalų žieduose [35].
Mokslininkai Brenneisen ir ElSohly nustatė, kad, priklausomai nuo kanapių kilmės šalies, priklauso šio augalo cheminė sudėtis [18]. Didžiausi skirtumai pastebėti vertinant terpenų variaciją. Atlikus eterinių aliejų sudėties tyrimą, nustatyta apie 200 terpenoidų: 92 proc. monoterpenų, 7 proc. seksviterpenų ir apie 1 proc. kitų medžiagų (ketonų ir esterių) [66,69]. Dažniausiai vyraujantys monoterpenai yra limonenas, pinenas, mircenas ir linalolas [15], tačiau žaliavos džiovinimo ir saugojimo metu jų kiekiai gerokai sumažėja, todėl santykinai padidėja seksviterpenų (ypač kariofileno) tiek kanapių žaliavoje, tiek ir jų ekstraktuose [70]. Pagrindiniai seksviterpenai, nustatomi Cannabis žaliavoje yra β-kariofilenas, humulenas, β-eudesmolis, kariofileno oksidas, trans-nerolidolis [61]. Terpenoidai yra atsakingi už skirtingų kanapių veislių skirtingą kvapą ir skonį [15].
Cannabis sativa L. žaliavoje nustatoma apie 20 flavonoidų, priklausančių flavonų ir flavonolių poklasiams [15], daugiausia anglikonų arba C-glikozidų ir glikozidų pavidalu [67]. O-glikozidų aglikonai yra apigeninas, liuteolinas, kamferolis, kvercetinas. Taip pat nustatyti unikalūs Cannabis flavonai – kanflavinas A ir kanflavinas B [67].
Sėjamosios kanapės sėklose nustatoma iki 35 proc. aliejaus ir iki 25 proc. baltymų [19]. Kanapių aliejuje gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių (ypač linolo ir α-linoleno rūgščių), tuo tarpu baltymų šaltinį sudaro svarbiausios amino rūgštys [72].
4.4 Cannabis veikliųjų junginių poveikis žmogaus organizmui
Analizuojant Cannabis sukeliamą poveikį žmogaus organizmui pastebėta, kad šis augalas kiekvieną žmogų veikia skirtingai ir tai priklauso ne tik nuo veikliųjų junginių kiekio žaliavoje, tačiau ir nuo žmogaus nuotaikos. Dažniausiai jaučiamas apsvaigimas, palaima, ramybė ar budrumas. Nustatyta, kad vartojant kanapes sukeliami su dozėmis susiję reakcijos, informacijos apdorojimo, suvokimo, judesių koordinacijos ir dėmesio sutrikimai [35]. Dėl to gali padidėti rizikingo elgesio ir jo neigiamų pasekmių tikimybė (pvz., vairavimas apsvaigus arba važiavimas transporto priemone, kurią vairuoja apsvaigęs žmogus, ko pasekoje patenkama į avariją). Nuolatinis kanapių vartojimas blogina kognityvines funkcijas, sukelia trumpalaikės atminties sutrikimus, todėl pablogėja mokymosi įgūdžiai [35].
XIX a. pirmoje pusėje Vakarų medicinoje kanapės pradėtos naudoti terapiniais tikslais – kanapių ekstraktus ir tinktūras gydytojai skyrė kaip skausmą, kosulį, astmą slopinančią ir raminamuoju poveikiu pasižyminčią priemonę [30,79]. Tačiau dėl nepastovaus ir nenuspėjamo individualaus poveikio, dėl pastebėto neigiamo poveikio (nerimo, pažinimo funkcijų blogėjimo) bei
susintetintų naujų ir stabilesnių farmacinių preparatų, tokių kaip aspirinas ir barbitūratai, XX a. viduryje kanapių vartojimas medicininiais tikslais sustojo [78].
Situacija pasikeitė, kai buvo identifikuotas ir išskirtas pagrindinis, psichotropiniu poveikiu pasižymintis junginys – tetrahidrokanabinolis – bei aprašyti kanabinoidiniai receptoriai. Dėka šių atradimų, susidomėjimas kanapėmis sparčiai išaugo ir pradėti atlikinėti įvairūs moksliniai tyrimai, kurių metu nustatyta, kad kanabinoidai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, todėl, ypač nepasižymintys psichoaktyviomis savybėmis, gali būti kliniškai naudingais antioksidantais, siekiant užkirsti kelią ir gydyti su oksidaciniu stresu susijusias ligas [19,38].
Taip pat nustatyta, kad kanabinoidai pasižymi skausmą malšinančiu, raumenis atpalaiduojančiu, imunosupresiniu, priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešalerginiu, neuroprotekciniu poveikiu [16,46,38,22]. Taip pat gali sukelti sedaciją, stimuliuoti apetitą [32]. 2008 m. Brazilijoje atlikus tyrimą su vėžiu sergančiais pacientais, kuriems taikoma chemoterapija sukelia pykinimą ir vėmimą, nustatyta, kad kanapių vartojimas šiuos simptomus gali slopinti [48].
Medicininiams tikslams iš kanapės dažniausiai išgaunami kanabinoidai – tetrahidrokanabinolis (THC), kanabidiolis (CBD) ir kanabinolis (CBN). THC – pagrindinis psichoaktyvus kanabinoidas, turintis analgetines, priešuždegimines, apetitą stimuliuojančias ir antiemetines savybes. Priklausomai nuo kanapių rūšies, THC kiekis gali siekti iki 18 proc. [53]. CBN taip pat turi psichiką veikiančių savybių, tačiau gerokai silpnesnių nei THC. Nustatyta, kad šis kanabinoidas veikia raminančiai. CBD – nepsichotropinis kanabinoidas, pasižymintis anksiolitiniu, antipsichotiniu, priešuždegiminiu, antispazmolitiniu, priešgrybeliniu ir analgeziniu poveikiais [14]. CBN sukelia raminamąjį poveikį, taip pat veikia antibakteriškai ir raumenis atpalaiduojančiai [14].
Tetrahidrokanabinolio pagrindu pagaminti vaistiniai preparatai gali sumažinti skausmą, uždegimą, pagerinti apetitą (tai ypač naudinga AIDS sergantiems ligoniams), sumažinti pykinimą. Tuo tarpu kanabidiolis gali kontroliuoti epilepsijos priepuolius, padėti gydyti psichikos sutrikimus.
Terpenai yra lipofiliniai junginiai, kurie lengvai prasiskverbia pro ląstelių membranas ir praeina kraujo-smegenų barjerą. Terpenoidai sudaro didžiausią augalų cheminių medžiagų grupę [44], paprastai įeina į eterinių aliejų sudėtį ir turi platų biologinio ir farmakologinio poveikio spektrą. Tyrimais įrodyta, kad D-limonenas, kurio gausu ir Citrus eteriniuose aliejuose, pasižymi stipriomis priešvėžinėmis, anksiolitinėmis ir imunostimuliuojančiomis savybėmis [14]. β-mircenas pripažintas paprastojo apynio (lot. Humulus lupulus) stipriausiu priešuždegiminiu, analgetiniu ir anksiolitiniu poveikiu pasižyminčiu komponentu [23]. α-pinenas yra acetilcholinesterazės inhibitorius, todėl gali pagerinti atmintį ir neutralizuoti THC sukeltą atminties deficitą [14]. Linalolas, dažniausiai aptinkamas paprstosios levandos (lot. Lavandula angustifolia) žaliavoje,
pasižymi analgetinėmis, raminamosiomis, priešuždegiminėmis ir prieštraukulinėmis savybėmis [69].
Mokslininkų įrodyta, kad terpenai apsaugo nuo oksidacinio streso esant įvairioms ligoms, įskaitant kepenų, inkstų, neurodegeneracinių ir širdies ir kraujagyslių ligas, vėžį, diabetą ir senėjimo procesus [32].
Fenoliniai junginiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, todėl apsaugo augalus nuo oksidacinio streso [15]. Iš dalies flavonoidai taip pat yra atsakingi už augalų apsaugą nuo žalingų UV spindulių, kenkėjų ir ligų. Atlikus tyrimą su žmonėms nustatyta, kad mitybą papildžius fenoliniais junginiais sumažėja lėtinių ligų, tokių kaip smegenų kraujotakos, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracinių ligų pasireiškimas [15].
Kanapių sudėtyje esantys flavonai ir flavonoliai turi platų biologinio poveikio spektrą, įskaitant terpenų ir kanabinoidų savybes. Jie pasižymi priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis, neuroprotekcinėmis savybėmis [15]. Specifiniai Cannabis flavonai kanflavinas A ir kanflavinas B yra stipriomis priešuždegiminėmis savybėmis pasižymintys junginiai, slopinantys prostaglandiną E2 ir 5-lipoksigenazę [77].
Cannabis sativa L. žaliava kaupia fenolinius junginius (kamferol-3-O-soforozidą, kvercetin-3-O-soforozidą [67]), kurie apsaugo organizmo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio, sumažina širdies ir kraujagyslių, vėžio ir kitų lėtinių ligų atsiradimo riziką [34,41]. Šie junginiai pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu, nes: 1) slopina fermentų, atsakingų už laisvųjų radikalų sintezę, aktyvumą; 2) suriša laisvuosius deguonies (ROS) ir azoto (RNS) radikalus bei 3) sustiprina biomolekulių antioksidacinę apsaugą nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio [25].
Šiuo metu Lietuvos Respublikos Seimas ėmėsi siūlymo įteisinti medikamentus, savo sudėtyje turinčius kanapių. Pateiktos pataisos leistų medicinoje naudoti tokius vaistinius preparatus, jei jų saugumas ir veiksmingumas yra įrodytas moksliniais tyrimais.
4.5 Biologiškai aktyvių junginių iš Cannabis sativa L. ekstrakcijos metodai
Kanabinoidų ekstrakcijai iš augalinės žaliavos tirpikliu gali būti: iš naftos gauti angliavandeniai (toluenas, trimetilpentanas), mažos molekulinės masės alkoholis (etanolis, metanolis), mažos molekulinės masės chlorintas angliavandenilis (chloroformas, dichlormetanas) ar superkritiniai skysčiai [76].
Tirpikliu pasirinkus naftos produktus, išekstrahuotų kanabinoidų kiekis (ypatingai tetrahidrokanabinolio) siekė 88-94 proc. (ekstrahuojant vieną kartą) ir 94-99 proc. (ektrahuojant pakartotinai). Vykdant ekstrakciją su etanoliu ir chloroformu, daugiau kanabinoidų išekstrahuota
kaip tirpiklį naudojant etanolį, tačiau tuo pat metu daugiau išsiekstrahavo ir pigmentų bei kitų balastinių medžiagų, nei ekstrahuojant chloroformu [29].
Kiekybiniam kanabinoidų nustatymui pluoštinės kanapės žaliavoje kaip ekstrahentas naudojamas metanolio ir chloroformo mišinys (9:1 v/v), ekstrahuojant du kartus [36].
Priklausomai nuo ekstrakcijai naudojamo ekstrahento bei temperatūros ir šviesos, priklauso rūgštinių ir neutralių kanabinoidų stabilumas ekstraktuose [48].
Polifenolių ekstrakcijai iš augalinės žaliavos naudojamos įvairios tirpiklių sistemos [58], o ekstrahavimo išeiga priklauso nuo tirpiklio ir ekstrahavimo metodo [31]. Dažniausiai augalinės žaliavos ekstrakcijai naudojamas vanduo arba vandeniniai etanolio, metanolio ir acetono mišiniai. Vis dėlto flavanoidų ekstrakcijoje iš arbatos geresni rezultatai pasiekti ekstrahuojant vandeniniu etanolio tirpalu [65].
Ekstrakcija superkritiniais skysčiais yra efektyvus metodas kanabinoidų ir terpenų ekstrakcijai iš kanapių žiedynų [23,54]. Superkritinis skystis – tai medžiagos būsena, pasiekiama slegiant dujas aukštoje temperatūroje. Superkritiniai skysčiai yra labai geri tirpikliai. Šis skystis gali judėti pro kietąsias daleles, taip pat gali ištirpinti medžiagas, jei lieka skystoje formoje. Terpenų ekstrahavimui iš kanapių žaliavos naudojamas superkritinis CO2, o kanabinoidų – mišinys su etanoliu (10-20 proc. superkritiniame CO2) [23]. Ekstrakcija superkritiniais skysčiais dažniausiai naudojama atskirti Cannabis L. žaliavoje esančius aromatinius junginius (terpenus) nuo farmakologiškai aktyvios frakcijos, kurioje gausu kanabinoidų [23].
Pagrindiniai ekstrakcijos superkritiniais skysčiais privalumai yra tie, kad naudojami nedideli ekstrahento kiekiai, išvengiama toksiškai veikiančių tirpiklių (nes nenaudojami organiniai tirpikliai), galima atlikti žemoje temperatūroje, todėl išsaugomi termiškai labilūs junginiai. Vienas iš šios ekstrakcijos technikos trūkumų – ne visada pasiekiamas pakankamai aukštas efektyvumas, ekstrahavimo sąlygos labai priklauso nuo mėginio matricos. Šiuos trūkumus padeda įveikti ekstrakcija ultragarsu.
Moksliniais tyrimais įrodyta ekstrakcijos ultragarsu nauda biologiškai aktyvių junginių – eterinių aliejų [12], fenolinių junginių [59], polisacharidų [21] – išskyrimui ir nustatymui [42]. Nustatyta, kad ekstrakcija ultragarsu yra efektyvesnė, nes naudojant mažesnį ekstrahento kiekį išekstrahuojami didesni biologiškai aktyvių medžiagų kiekiai. Tai įvyksta todėl, kad pasiekus pakankamą ultragarso intensyvumą tirpale susidaro kavitaciniai mikroburbuliukai, kurių sukelti turbulentiniai srautai pagreitina tirpiklio įsiskverbimą į ląsteles ir aktyvių junginių išlaisvinimą iš ląstelės vidaus į paviršių [61].
Ekstrakcija ultragarsu yra paprastas, nebrangus ir efektyvus ekstrakcijos metodas, galima naudoti visus žinomus tirpiklius, be to, tinkamas ekstrahuoti junginius, kurie gali pakisti aukštos temperatūros poveikyje [42]. Šio metodo pagalba iš augalinių žaliavų išgaunami chemiškai gryni
biologiškai aktyvūs junginiai. Ekstrakcija ultragarsu daugiausia naudojama antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių gavybai [40,22].
4.6 Antioksidantų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai
Suminis antioksidacinis aktyvumas yra sudėtinis rodiklis, kuris apima: 1) ROS/RNS generacijos slopinimą ir gebėjimą juos surišti; 2) redukcinę galią; 3) gebėjimą sujungti pereinamuosius metalus; 4) antioksidacinių fermentų aktyvavimą; 5) oksidacinių fermentų slopinimą [6].
Antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais [49]. Šiais metodais tiriami augaliniai antioksidantai, kurie konkuruojančios ar nekonkuruojančios reakcijos principu inaktyvuoja žinomą oksidantą dviem pagrindiniais būdais: vandenilio atomo perdavimo arba elektronų perdavimo reakcijomis [6].
Spektrofotometrinis absorbcijos pokyčio detekcijos būdas yra vienas paprasčiausių ir greičiausių metodų, naudojamų fenolinių ir kitų, antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių, junginių kiekybiniam nustatymui [73,78]. Daugelį metų bendro fenolinių junginių kiekio augalinėse žaliavose nustatymui plačiai naudoti du – Folin-Denis ir Folin-Ciocalteu – spektrofotometriniai metodai [46,52]. Šiuo metu dažniausiai taikomi elektronų perdavimu pagrįsti antioksidacinio aktyvumo tyrimo metodai yra DPPH radikalų ir ABTS radikalų-katijonų surišimo įvertinimas bei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidacinės galios nustatymas [6].
2000 m. mokslininkas Koleva su kolegomis laisvuosius radikalus surišančių junginių atrankai kompleksiniuose mišiniuose išvystė efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) pokolonėlinį metodą, panaudojant metanolinį DPPH tirpalą [43], o 2001 m. – ABTS tirpalą [44]. Vėliau šie metodai buvo tobulinami: gerinamas jautrumas [2], didinamas reakcijos kilpos vidinis diametras [1], prijungiama masių spektrometrija [53].
Spektrofotometriniu metodu įvertinamas suminis visų žaliavoje esančių aktyvių junginių antioksidacinis aktyvumas [78]. ESC pokolonėliniais metodais įvertinama atskirų junginių antioksidacinės savybės ir jų indėlis į bendrą kompleksinių mišinių antioksidacinį aktyvumą [6].
Nėra vieno universalaus metodo, kuriuo galima tiksliai įvertinti tiriamajame bandinyje esančių junginių suminį antioksidacinį poveikį. Įvairiapusiškam biologiškai aktyvių junginių antioksidaciniam poveikiui ištirti atliekami tyrimai dirbtinėse modelinėse sistemose in vitro su įvairiais oksidantais ir jų taikiniais taikant skirtingus reakcijų mechanizmus [6].
4.7 Antioksidacinio poveikio svarba žmogaus organizmui
Žmogaus organizme nuolat vyksta įvairios cheminės reakcijos, kurių metu susidaro laisvieji radikalai – nestabilios molekulės, kurios atakuoja kitas molekules, prisijungia elektroną ir pažeidžia ląstelės membranos lipidus ir baltymus, fermentus, ląstelės branduolio membraną, DNR [4].
Laisvieji radikalai – deguonies laisvieji radikalai (angl. ROS) bei azoto laisvieji radikalai (angl. RNS) – yra nuolat gaminami žmogaus organizme, o žmogaus antioksidacinė gynybos sistema, sudaryta iš fermentinių (superoksido dismutazė, glutationo peroksidazė, katalazė) ir nefermentinių antioksidantų, neutralizuoja šias aktyvias molekules ir apsaugo ląsteles bei audinius nuo pažeidimo [71].
Laisvieji radikalai žmogui yra būtini energijos tiekimui, detoksikacijai, cheminiams signalams ir imuninei funkcijai [26]. Tačiau padidėjus ROS ir RNS kiekiui organizme sukeliamas oksidacinis stresas – biocheminės pusiausvyros sutrikimas, kurio metu padidėja laisvųjų radikalų gamyba arba sutrinka jų neutralizacija ir dėl to vyksta biomolekulių (baltymų, lipidų, DNR), ląstelių bei audinių pažeidimas [4,75]. Šie pažeidimai susiję su padidėjusia širdies ir kraujagyslių ligų, vėžio ir kitų lėtinių ligų rizika, taip pat yra natūralių žmogaus senėjimo procesų priežastis [75]. Siekiant išvengti oksidacinio streso padarinių, vartojamos antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčios medžiagos. Didžiausias dėmesys skiriamas natūraliems antioksidantams, t.y. augalinėms žaliavoms, kurios kaupia antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčius junginius. Vis dėlto augalinėse žaliavose aptinkamų biologiškai aktyvių junginių antioksidacinio poveikio stiprumas ir veikimo mechanizmai yra skirtingi [6].
Antioksidantai skirstomi į fermentinius ir nefermentinius. Nefermentinių antioksidantų grupę sudaro mineralai (cinkas, selenas), vitaminai (vit. C, vit. E, vit. A, vit. K), antioksidaciniai kofaktoriai (kofermentas Q10) bei augalinėse žaliavose besikaupiantys biologiškai aktyvūs junginiai (karotenoidai, polifenoliai) [71]. Polifenolinių junginių grupei priklausantys flavonoidai (flavonoliai, flavanonai, isoflavonoidai, flavonai, antocianai) pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu ir yra plačiai paplitę augalinėse žaliavose [38,57]. Todėl teigiama, kad augalinės kilmės žaliavų antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo polifenolių kiekio joje [16].
Terpenai yra plačiai paplitę junginiai gamtoje, paprastai įeina į eterinių aliejų sudėtį ir turi platų biologinės ir farmakologinės veiklos spektrą. Mokslininkų įrodyta, kad terpenai apsaugo nuo oksidacinio streso esant įvairioms ligoms, įskaitant kepenų, inkstų, neurodegeneracinių ir širdies ir kraujagyslių ligas, vėžį, diabetą ir senėjimo procesus [32].
5. TYRIMO METODIKA
5.1 Tyrimo objektas
Šio tyrimo objektas –Lietuvoje auginamų skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalys. Augalinė žaliava buvo renkama įvairiuose Lietuvos regionuose 2016 m. liepos – rugpjūčio mėn. (2 lentelė).
2 lentelė. Pluoštinės kanapės rinkimo veislės ir vietovės
Veislė Regionas
Finola Kupiškio raj.,Kadrėnų k.
Finola Rokiškio raj.
Finola Molėtų raj.
Futura 75 Anykščių raj., Viešintų k.
Futura 75 Rokiškio raj., Panemunėlis
Futura75 Šakių raj. Kriūkų k.
Futura75 Kaišiadorių raj.
Felina 32 Panevėžio raj.,Upytės k.
Felina 32 Utenos raj.
Felina 32 Kauno raj.
Secuieni Jubileu Panevėžio raj., Upytės k.
Secuieni Jubileu Molėtų raj.
Virtus Rugo Panevėžio raj., Upytės k.
Monoica Panevėžio raj., Upytės k.
KC Dora Panevėžio raj., Upytės k.
5.2 Cannabis sativa L. žaliavos kokybinis įvertinimas
Sėjamosios kanapės tiriamosios augalinės žaliavos kokybė įvertinta vizualiai ir nustačius drėgmės kiekį. Vizualiai buvo vertinta žiedų, lapų, stiebų ir sėklų spalva. Nuodžiūvio nustatymui naudotas drėgmės analizatorius, esant 103 °C temperatūrai. Tyrimams naudota žaliava, kurios drėgmės kiekis neviršija 15 proc., kaip nustatyta ElSohly M. ir kt. (2013) monografijoje [27].
5.3 Tyrimo metu naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus ir buvo analitinio švarumo.
Metanolis 99% įsigytas iš Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija).
FRAP reagento gamybai: geležies chlorido heksahidratas (FeCl3 X 6H2O), natrio acetatas (NaCH3COO) įsigyti iš Sigma – Aldrich Chemie (Steinheim, Vokietija), ledinė acto rūgštis (99,8%)
– iš Standart (Lenkija), koncentruota druskos rūgštis (konc. HCl) – iš Fluka – Chemie (Buch, Šveicarija), 2,4,6 – tripiridil – s – triazinas (TPTZ) – iš Alfa Aesar (Vokietija). Naudoti standarto trolokso (≥98%) paruošti tirpalai iš Fluka (Buch, Šveicarija). Acetonitrilas įsigytas iš Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija), trifluoracto rūgštis (99,8%) – iš Fluka – Chemie (Buchs, Vokietija).
CUPRAC reagentui sudaryti buvo naudojamas vario (II) chlorido dihidratas, gautas iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe,Vokietija), neokuproinas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Buferinei sistemai sudaryti buvo naudojamas amonio acetatas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (Belgija). Naudotas trolokso (≥98%) referentinis standartas įsigytas iš „FlukaChemika“ (Buchs, Šveicarija).
5.4 Aparatūra
Kanapių augalinės žaliavos susmulkinimui naudotas elektrinis malūnėlis D-47906 Clatronic (Kempen, Vokietija). Susmulkintos augalinės žaliavos ir reagentų svėrimui naudotos elektroninės analitinės svarstyklės Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija).
Mėginių ekstrakcija vykdyta ultragarso bangų vonelėje BioSonic UC100 (Mavajai, JAV). Vandens gryninimui buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistema.
Augalinės žaliavos ekstraktų spektrofotometriniai tyrimai atlikti UV–regimojo spektro dvigubo spindulio spektrofotometru HALO DB-20 UV – vis Dynamica GmbH (Šveicarija). Darbinio tirpalo temperatūros palaikymui naudota termostatinė vonelė Heidolf (Vokietija).
5.5 Pluoštinės kanapės ekstraktų ruošimas
Mokslinės literatūros duomenimis, yra keletas kanapių augalinės žaliavos ekstraktų gamybos būdų [27, 51].
Mkpenie et al. 2012 tyrimo duomenimis, didžiausia antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių medžiagų koncentracija pasiekiama ekstrakciją vykdant 18 valandų metanolyje [51]. Savo tyrimui pasirinkome atlikti ekstrakciją remiantis ElSohly M. ir kt. (2013) monografija dėl trumpesnės ekstrakcijos trukmės.
Ekstraktų ruošimui naudotas 70 proc. metanolio ir trichlormetano mišinys (santykiu 9:1). Išdžiovinta augalinė žaliava mechaniškai susmulkinama elektriniu malūnėliu. Ant aliuminio folijos atsveriama 200 mg susmulkintos žaliavos, suberiama į 10 ml tūrinę kolbutę ir užpilama pusė tūrio
ekstrahento. Kolbutė užkemšama plastikiniu kamščiu ir dedama į ultragarso vonelę 30 minučių. Baigus ekstrakciją ultragarsu, ekstraktas atvėsinamas ir praskiedžiamas ekstrahentu iki tikslaus tūrio. Gautas ekstraktas filtruojamas pro pro Albet 400 (Dublinas, Airija) filtravimo popierių (porų dydis 38-43 µm) į stiklinaitę. Nufiltruotas ekstraktas filtruojamas pro 0,22 µm mikrofiltrą į tamsaus stiklo buteliuką. Buteliukas buvo laikomas šaldytuve iki ekstrakcijos dienos.
5.6 Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Cannabis sativa L. genties augalų ekstraktų antioksidacinė geba buvo vertinama taikant geležies redukcijos antioksidacinės galios (FRAP) metodą.
Darbinio FRAP reagento tirpalo paruošimas:
• 300 mM acetatinio buferio gamyba (tirpalas A): 3,1g natrio acetato suberiama į 1000 ml tūrinę kolbą ir tirpinama 16 ml ledinėje acto rūgštyje. Vėliau gautas tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės. Gauto tirpalo pH turi būti 3,6.
• 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazino) tirpalo druskos rūgštyje gamyba (tirpalas B): į 40 mM druskos rūgšties tirpalą (50ml distiliuoto vandens sumaišoma su 0,1695 ml konc. Druskos rūgšties) suberiama 0,1562g TPTZ miltelių ir ištirpinama.
• 20 mM geležies (III) chlorido tirpalo gamyba (tirpalas C): 0,2703 geležies (III) chlorido heksahidrato ištirpinama 50ml distiliuoto vandens.
• Gauti A, B ir C tirpalai sumaišomi santykiu 10:1:1. Gautas tirpalas laikomas tamsaus stiklo butelyje. Prieš analizę darbinis FRAP tirpalas pašildomas iki 37 °C.
Augalinės žaliavos ekstrakto analizei imama 2 ml paruošto FRAP reagento, sumaišoma su 100 µl ekstrakto. Tirpalo šviesos absorbcija matuojama spektrofotometru esant 593 nm šviesos bangos ilgiui praėjus 30 minučių po mėginio paruošimo. Kiekvienas mėginys analizuotas po 3 kartus.
Gauti duomenys išreikšti trolokso ekvivalentais (TEAC). Antioksidacinis aktyvumas įvertintas pagal Stoškutės tyriamajame darbe sudarytą trolokso kalibracinę kreivę: y= y =235,43x + 0,233; R2 = 0,9953 (3pav.) Trolokso koncentracijos ribos – 0,000078 – 0,025 mg/ml [8].
3 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP redukcinės galios vertinimo metodu [8]
5.7 Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu
Cannabis sativa L. genties augalų ekstraktų antioksidacinė geba buvo vertinama taikant vario redukcijos antioksidacinės galios (CUPRAC, angl. cupric reducing antioxidant capacity) metodą.
CUPRAC reagento paruošimas:
• CuCl2 tirpalo gamyba (tirpalas A): atsveriama 0,17 g CuCl2x2H2O druskos, tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedžiama matavimo kolboje iki 100 ml.
• Neokuproino tirpalo gamyba (tirpalas B): 0,1566 g neokuproino tirpinama 70 proc. metanolyje ir skiedžiama matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
• acetatino buferio (pH=7) gamyba (tirpalas C): atsveriama 0,077 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinama vandenyje ir praskiedžiama vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml. Buferio vandenilio jonų rodiklis patikrinamas pH-metru (pH 7).
• Gauti A, B ir C tirpalai sumaišomi santykiu santykiu 1:1:1. Sumaišytas tirpalas 1 valandą laikomas kambario temperatūroje, saugomas nuo šviesos poveikio.
Augalinės žaliavos ekstrakto analizei į 3 ml kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto CUPRAC reagento tirpalo ir automatinėmis pipetėmis įpilama 10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio. Tirpalo šviesos absorbcija matuojama spektrofotometru esant 450 nm šviesos bangos ilgiui. Kiekvienas mėginys analizuotas po 3 kartus.
Antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TEAC). Antioksidacinis aktyvumas įvertintas pagal E.Skalandžio tyriamajame darbe sudarytą trolokso kalibracinę kreivę: y=0.3899x + 0.0908; R2=0.99 (4 pav.) Trolokso koncentracijos ribos – 0,22 – 1,54 mg/ml [7].
4 pav. Trolokso kalibracinė kreivė CUPRAC redukcinės galios vertinimo metodu [7]
5.8 Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas
Eksperimentiniai duomenys apdoroti naudojant statistinius duomenų analizės paketus SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) ir Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV). Eksperimentai kartoti tris kartus. Duomenys išreikšti vidurkiais ± standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis santykinis nuokrypis (SSN). Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirstinių buvo nustatyti naudojant porinį „Stjudento t” kriterijų ir neparametrinį Wilkoxono kriterijų priklausomoms imtims. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1 Cannabis sativa L. žaliavos kokybinis įvertinimas
Prieš atliekant tyrimą įvertinta tiriamosios žaliavos kokybė. Išdžiovintos žaliavos lapai ir žiedai buvo tamsiai žalios spalvos, stiebai – šviesiai rudi, sėklos – rudos spalvos. Taip pat nustatytas likutinis drėgmės kiekis augalinėje žaliavoje. M. ElSholy ir kt (2013) reglamentuoja, kad išdžiovintoje sėjamųjų kanapių augalinėje žaliavoje drėgmės kiekis neturi viršyti 15 proc. žaliavos masės [27]. Tyrimo metu nustatyta, kad žaliavos mėginiuose nuodžiūvis neviršijo leistinų normų, todėl tinkama tolimesniems tyrimams. Drėgmės matavimo rezultati pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Drėgmės kiekis tiriamosiose sėjamosios kanapės žaliavose
Veislė Regionas Drėgmės kiekis
Finola Kupiškio raj.,Kadrėnų k. 5,37 % ± 0,36%
Finola Rokiškio raj. 5,58 % ± 0,21%
Finola Molėtų raj. 5,85 % ± 0,31%
Futura 75 Anykščių raj., Viešintų k. 5,97 % ± 0,35% Futura 75 Rokiškio raj., Panemunėlis 6,12 % ± 0,19%
Futura75 Šakių raj., Kriūkų k. 5,86 % ± 0,29%
Futura75 Kaišiadorių raj. 5,67 % ± 0,32%
Felina 32 Panevėžio raj.,Upytės k. 5,91 % ± 0,36%
Felina 32 Utenos raj. 6,02 % ± 0,23%
Felina 32 Kauno raj. 5,98 % ± 0,41%
Secuieni Jubileu Panevėžio raj., Upytės k. 6,42 % ± 0,29%
Secuieni Jubileu Molėtų raj. 6,37 % ± 0,36%
Virtus Rugo Panevėžio raj., Upytės k. 6,49 % ± 0,33%
Monoica Panevėžio raj., Upytės k. 6,37 % ± 0,31%
6.2 Cannabis L. genties antioksidaciniai tyrimai spektrofotometriniu metodu
Tyrimo metu kiekybiškai įvertinti ir palyginti skirtingų pluoštinių kanapių veislių (Finola, Futura 75, Felina 32, Secuieni Jubileu, Virtus Rugo, Monoica ir KC Dora) antžeminės dalies metanoliniuose ekstraktuose esančių veikliųjų junginių, pasižyminčių antioksidacinėmis savybėmis, kiekiai. Tyrimas buvo atliekamas spektrofotometriniu metodu, naudojant FRAP ir CUPRAC reagentus. Tyrimai atlikti su 15 ėminių (3 – Finola, 4 – Futura 75, 3 – Felina, 2 – Secuieni Jubileu, 1 – Virtus Rugo, 1 – Monoica, 1 - KC Dora). Šiame skyriuje pateikiami ir analizuojami nustatyto antioksidacinio aktyvumo skirtumai. Įvertinta antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo augimo vietovės. Pluoštinės kanapės genties augalai buvo rinkti Kupiškio, Rokiškio, Molėtų, Anykščių, Šakių, Kaišiadorių, Kauno, Utenos ir Panevėžio rajonuose.Antioksidacinis aktyvumas įvertintas apskaičiavus troloksui ekvivalentiškos antioksidacinės galios (TEAC) reišmes ir sudarius trolokso kalibracinį grafiką. Skirtingose vietovėse rinktų ir skirtingų sėjamosios kanapės veislių antioksidacinio aktyvumo palyginimui sudarytos stulpelinės diagramos.
6.2.1 Antioksidacinio aktyvumo spektrofotometriniu FRAP metodu rezultatų
įvertinimas
Atlikus pluoštinių kanapių Futura 75 veislės antioksidacinio aktyvumo tyrimą FRAP metodu, nustatytos TEAC reikšmės svyravo nuo 0,533 ± 0,025 mg/ml iki 0,237 ± 0,002 mg/ml (5pav.). Didžiausia TEAC reikšmė (0,533 ± 0,025 mg/ml) nustatyta Rokiškio rajone rinktoje žaliavoje. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas Anykščių rajono (0,494 ± 0,003 mg/ml) ir Šakių rajono (0,398 ± 0,003 mg/ml) žaliavose. Mažiausia redukcinė geba (0,237 ± 0,002 mg/ml) nustatyta Kaišiadorių rajono ėminiuose.
5 pav. Antioksidacinis aktyvumas Futura 75 veislės žaliavoje FRAP metodu
Įvertinus pluoštinių kanapių Felina veislės antioksidacinį aktyvumą FRAP metodu, didžiausia redukcine geba (0,505 ± 0,006 mg/ml) pasižymėjo Utenos rajone augintų kanapių žaliava. Mažiausios TEAC reikšmės nustatytos Kauno rajono (0,297 ± 0,012 mg/ml) ir Panevėžio rajono (0,267 ± 0,004 mg/ml) ėminiuose (6 pav.).
6 pav. Antioksidacinis aktyvumas Felina veislės žaliavoje FRAP metodu
Finola veislės antioksidaciniam aktyvumui nustatyti C. sativa mėginiai rinkti Rokiškio, Molėtų ir Kupiškio rajonuose. Didžiausia TEAC reikšmė nustatyta Rokiškio rajono ėminiuose (0,495 ± 0,006 m g/ml), o mažiausia – Kupiškio rajono ėminiuose (0,262 ± 0,003 mg/ml) (7 pav.).
0.533 0.494 0.398 0.237 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Rokiškio raj. Anykščių raj. Šakių raj. Kaišiadorių raj.
TE AC m g/ m l
Futura 75 veislė
0.505 0.297 0.267 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600Utenos raj. Kauno raj. Panevėžio raj.
TEA C m g/ m l
Felina veislė
Molėtų rajone rinkta žaliava pasižymėjo didesniu antioksidaciniu aktyvumu (0,283 ± 0,002 mg/ml), nei Kupiškio rajone, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05).
7 pav. Antioksidacinis aktyvumas Finola veislės žaliavoje FRAP metodu
Secuieni Jubileu veislės mėginiai rinkti Panevėžio ir Molėtų rajonuose. Panevėžio rajono ėminiai pasižymi statistiškai reikšmingai didesne redukcine geba (0,462 ± 0,014 mg/ml) lyginant su Molėtų rajono mėginiuose nustatyta redukcine geba (0,306 ± 0,001 mg/ml).
Virtus Rugo, Manoica ir KC Dora veislių žaliava rinkta tik Panevėžio rajone. Lyginant šias tris veisles, didžiausia TEAC reikšmė nustatyta KC Dora veislės ėminiuose (0,379 ± 0,009 mg/ml). Virtus Rugo ir Monoica veislių mėginiai pasižymėjo mažesniu antioksidaciniu aktyvumu (atitinkamai 0,302 ± 0,014 mg/ml ir 0,270 ± 0,013 mg/ml).
Tarpusavyje palyginti Panevėžio rajone rinktų skirtingų C. sativa veislių rezultatai. Nustatyta, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Secuieni Jubileu veislės žaliava (0,462 ± 0,014 mg/ml), o mažiausiu – Monoica (0,270 ± 0,013 mg/ml) ir Felina (0,267 ± 0,004 mg/ml) veislės žaliavos. Tyrimo rezultatai pateikti 8 paveiksle.
0.495 0.283 0.262 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Rokiškio raj. Molėtų raj. Kupiškio raj.
T E A C m g/ m l
Finola veislė
8 pav. Panevėžio rajone augančių skirtingų C. sativa L. veislių žaliavų antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu
Siekiant įvertinti, kurios C. sativa L. veislės ėminiai pasižymėjo didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, buvo apskaičiuoti visų, tos pačios veislės ėminių, nustatytų TEAC reikšmių vidurkiai. Atlikus skaičiavimus nustatyta, kad didžiausia redukcine geba (0,415±0,008 mg/ml) pasižymėjo Futura veislės žaliava, o mažiausiu – Manoica veislės žaliava (0,252±0,004 mg/ml). Redukcinės gebos dinamika visose C. sativa L. tirtose veislėse pateikta 9 paveiksle.
9 pav. Skirtingų C. Sativa L. veislių žaliavų antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu
0.462 0.379 0.302 0.270 0.267 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500
S.Jubileu KC Dora Virtus Rugo Manoica Felina
TEA C m g/ m l
Panevėžio rajonas
0.415 0.347 0.356 0.384 0.302 0.379 0.270 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450Futura Finola Felina S.Jubileu V Rugo KC-Dora Manoica
TE AC m g/ m l
C. Sativa L. veislės
Vertinant spektrofotometriniu FRAP metodu skirtingų pluoštinių kanapių veislių žaliavose esančių fitocheminių junginių antioksidacinį aktyvumą skirtinguose regionuose, atsižvelgiant į statistinį reikšmingumą (p < 0,05) nustatyta, kad Futura ir Finola veislės žaliavos didžiausia antioksidacine geba pasižymi auginamos Rokiškio rajone, Felina veislės – Utenos rajone, o S.Jubileu veislės – Panevėžio rajone. Mažiausiu antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekiu pasižymi Futura veislės žaliava, auginama Kaišiadorių rajone.
Atlikus visų C. sativa L. tirtų veislių antioksidacinio aktyvumo tyrimą, didžiausias išsibarstymas (0,296 ± 0,008 mg/ml) nustatytas Futura veislės ėminiuose. Nepaisant to, apskaičiavus visų, tos pačios veislės ėminiuose nustatytų TEAC reikšmių vidurkius nustatyta, kad būtent Futura veislės žaliava kaupia daugiausiai fitocheminių junginių, pasižyminčių antioksidaciniu aktyvumu. Mažiausia antioksidacine geba pasižymi Manoica veislės žaliava.
6.2.2 Antioksidacinio aktyvumo spektrofotometriniu CUPRAC metodu
rezultatų įvertinimas
Tirtas ir įvertintas C. sativa L. skirtingų veislių antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu. Žaliavos redukcinė geba matuota tris kartus ir apskaičiuotas vidurkis.
Atlikus Futura 75 veislės antioksidacinio aktyvumo tyrimą CUPRAC metodu, nustatytos TEAC reikšmės svyravo nuo 0,574 ± 0,027 mg/ml iki 0,166 ± 0,013 mg/ml (10 pav.). Didžiausia TEAC reikšmė (0,574 ± 0,027 mg/ml) nustatyta Anykščių rajone rinktoje žaliavoje. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas Rokiškio rajono (0,467 ± 0,004 mg/ml) ir Šakių rajono (0,449 ± 0,007 mg/ml) žaliavose. Mažiausia redukcinė geba (0,166 ± 0,013 mg/ml) nustatyta Kaišiadorių rajono ėminiuose.
10 pav. Antioksidacinis aktyvumas Futura 75 veislės žaliavoje CUPRAC metodu
Felina veislės antioksidaciniam aktyvumui nustatyti C. sativa mėginiai rinkti Kauno, Utenos ir Panevėžio rajonuose. Didžiausia redukcine geba (0,443 ± 0,016 mg/ml) pasižymėjo Utenos rajone augintų kanapių žaliava. Mažiausios TEAC reikšmės nustatytos Kauno rajono (0,201 ± 0,015 mg/ml) ir Panevėžio rajono (0,171 ± 0,002 mg/ml) ėminiuose (11 pav.).
11 pav. Antioksidacinis aktyvumas Felina veislės žaliavoje CUPRAC metodu
Įvertinus pluoštinių kanapių Finola veislės antioksidacinį aktyvumą CUPRAC metodu, didžiausia TEAC reikšmė nustatyta Rokiškio rajono ėminiuose (0,462 ± 0,036 m g/ml), o mažiausia – Molėtų rajono ėminiuose (0,193 ± 0,015 mg/ml) (12 pav.). Kupiškio rajone rinkta žaliava
0.574 0.467 0.449 0.166 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700
Anykščių raj. Rokiškio raj. Šakių raj. Kaišiadorių raj.
T E A C m g/ m l
Futura 75 veislė
0.443 0.201 0.171 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500Utenos raj. Kauno raj. Panevėžio raj.
T E A C m g/ m l
Felina veislė
pasižymėjo didesniu antioksidaciniu aktyvumu (0,210 ± 0,016 mg/ml), nei Molėtų rajone, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyt (p > 0,05).
12 pav. Antioksidacinis aktyvumas Finola veislės žaliavoje CUPRAC metodu
Secuieni Jubileu veislės mėginiai rinkti Panevėžio ir Molėtų rajonuose. Gauti rezultatai atitiko FRAP metodu nustatytą antioksidacinį aktyvumą – Panevėžio rajono ėminiuose nustatyta statistiškai reikšmingai didesnė redukcinė geba (0,342 ± 0,015 mg/ml) lyginant su Molėtų rajono mėginiuose nustatyta redukcine geba (0,160 ± 0,015 mg/ml).
Lyginant Virtus Rugo, Manoica ir KC Dora veislių žaliavų antioksidacinį aktyvumą, didžiausia TEAC reikšmė nustatyta KC Dora veislės ėminiuose (0,276 ± 0,016 mg/ml), o mažiausia – Manoica veislės ėminiuose (0,143 ± 0,016 mg/ml).
Kaip ir atliekant antioksidacinio aktyvumo tyrimą FRAP metodu, palyginome toje pačioje vietoje, Panevėžio rajone, augintų skirtingų C. sativa L. veislių žaliavų redukcinę gebą. Didžiausia TEAC reikšmė nustatyta S. Jubileu veislės ėminiuose (0,342 ± 0,015 mg/ml), o mažiausia – Manoica veislės ėminiuose (0,143 ± 0,016 mg/ml) (13 pav.)
0.462 0.210 0.193 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Rokiškio raj. Kupiškio raj. Molėtų raj.
T E A C m g/ m l
Finola veislė
13 pav. Panevėžio rajone augančių skirtingų C. sativa L. veislių žaliavų antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu
Tyrimo metu palyginome ir visų tirtų C. sativa L. veislių žaliavų antioksidacinį aktyvumą, apskaičiavus tos pačios veislės ėminiuose nustatytų TEAC reikšmių vidurkius spektrofotometriniu CUPRAC metodu. Nustatyta, kad didžiausia redukcine geba pasižymi Futura veislės žaliava (0,414 ± 0,013 mg/ml), o mažiausia – Manoica veislės žaliava (0,143 ± 0,016 mg/ml). Redukcinės gebos dinamika visose C. sativa L. tirtose veislėse pateikta 14 paveiksle.
14 pav. Skirtingų C. Sativa L. veislių žaliavų antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu 0.171 0.342 0.242 0.276 0.143 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400
Felina S.Jubileu V Rugo KC-Dora Manoica
T E A C m g/ m l
Panevėžio rajonas
0.414 0.288 0.272 0.251 0.242 0.276 0.143 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450Futura Finola Felina S.Jubileu V Rugo KC-Dora Manoica
T E A C m g/ m l
C. Sativa L. veislės
Atlikus spektrofotometriniu CUPRAC metodu skirtinguose regionuose auginamų skirtingų pluoštinių kanapių veislių žaliavų antioksidacinio aktyvumo tyrimą, atsižvelgiant į statistinį reikšmingumą (p < 0,05) nustatyta, kad Felina veislės žaliava didžiausia redukcine geba pasižymi auginama Utenos rajone, Finola – Rokiškio rajone, o Futura veislės – Anykščių rajone. Mažiausiu fitocheminių junginių, pasižyminčių antioksidacinėmis savybėmis, kiekiu pasižymi Manoica veislės žaliava, auginama Panevėžio rajone.
Vertinant visų tirtų C. sativa L. veislių žaliavų antioksidacinį aktyvumą, didžiausias išsibarstymas (0,301 ± 0,013 mg/ml), kaip ir atliekant tyrimą FRAP metodu, nustatytas Futura veislės žaliavoje. Tačiau apskaičiavus visų, tos pačios veislės ėminiuose nustatytų TEAC reikšmių vidurkius nustatyta, kad Futura veislės žaliava pasižymi didžiausia antioksidacine geba. Mažiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi Manoica veislės žaliava.
6.3 Nustatyto antioksidacinio aktyvumo palyginimas FRAP ir CUPRAC
metodais
Tyrimo metu atliktas C. saviva L. skirtingų veislių antioksidacinio aktyvumo tyrimas spektrofotometriniu metodu, naudojant du skirtingus reagentus – FRAP ir CUPRAC. Gauti rezultatai palyginti tarpusavyje.
Lyginant FRAP ir CUPRAC metodais nustatytą antioksidacinį aktyvumą Futura veislės žaliavose, Rokiškio ir Kaišiadorių rajonų ėminiuose statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesni antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekiai nustatyti naudojant spektrofotometrinį FRAP metodą. Tuo tarpu Anykščių ir Šakių rajonuose augančiose žaliavose didesni kiekiai nustatyti CUPRAC metodu. (15 pav.)
15 pav. Antioksidacinio aktyvumo palyginimas Futura 75 veislės žaliavoje
Atlikus Felina veislės žaliavų nustatyto antioksidacinio aktyvumo skirtingais spektrofotometriniais metodais palyginimą, statistiškai reikšmingai didesnės (p<0,05) TEAC reikšmės apskaičiuotos naudojant FRAP metodą (16 pav.).
16 pav. Antioksidacinio aktyvumo palyginimas Felina veislės žaliavoje
Atitinkami rezultatai gauti ir palyginus Finola ir S.Jubileu veislės žaliavose, augančiose skirtingose augimvietėse, antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekį – didesnė redukcinė geba nustatyta naudojant spektrofotometrinį FRAP metodą (17 pav. ir 18 pav).
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700
Rokiškio raj. Anykščių raj. Šakių raj. Kaišiadorių raj.
T E A C m g/ m l
Futura 75 veislė
CUPRAC FRAP 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600Utenos raj. Kauno raj. Panevėžio raj.
T E A C m g/ m l
Felina veislė
CUPRAC FRAP
17 pav. Antioksidacinio aktyvumo palyginimas Finola veislės žaliavoje
18 pav. Antioksidacinio aktyvumo palyginimas S.Jubileu veislės žaliavoje
Ištyrus Panevėžio rajone augančių pluoštinių kanapių skirtingų veislių žaliavų antioksidacinį aktyvumą, visų tirtų veislių ėminiuose statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnės TEAC reikšmės nustatytos naudojant spektrofotometrinį FRAP metodą (19 pav.).
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Rokiškio raj. Molėtų raj. Kupiškio raj.
T E A C m g/ m l
Finola veislė
CUPRAC FRAP 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500Panevėžio raj. Molėtų raj.
T E A C m g/ m l
S.Jubileu veislė
CUPRAC FRAP
19 pav. Panevėžio rajone augančių skirtingų C. sativa L. veislių antioksidacinio aktyvumo palyginimas FRAP ir CUPRAC metodais
Lyginant skirtingų C. sativa L. veislių žaliavose esančių antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių kiekius, visų veislių ėminiuose, išskyrus Futura, statistiškai reikšmingai didesni (p<0,05) kiekiai nustatyti naudojant spektrofotometrinį FRAP metodą (20 pav.). Futura veislės žaliavoje nustatyta TEAC reikšmė FRAP metodu atitiko CUPRAC metodu nustatytai TEAC reikšmei – atitinkamai 0,415 ± 0,008 mg/ml ir 0,414 ± 0,013 mg/ml.
20 pav. Skirtingų C. sativa L. veislių žaliavų antioksidacinio aktyvumo palyginimas
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500
Felina S.Jubileu V Rugo KC-Dora Manoica
T E A C m g/ m l
Panevėžio rajonas
CUPRAC FRAP 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450Futura Finola Felina S.Jubileu V Rugo KC-Dora Manoica
TEA C m g/ m l
C. Sativa L. veislės
CUPRAC FRAP
6.4 Rezultatų aptarimas
2015 metais atliktas tyrimas, siekiant įvertinti pluoštinės kanapės Finola veislės skirtingų augalo dalių (žiedų, lapų ir stiebų) žaliavų, augančių Anykščių, Kupiškio ir Telšių rajonuose, antioksidacinį aktyvumą. Tyrimai atlikti taikant spektrofotometrinį FRAP metodą. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausia redukcine geba pasižymi C. sativa L. žiedai, rinkti Anykščių rajone [5].
Šio tyrimo metu atliktas geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidacinės galios nustatymas skirtingose C. sativa L. veislės žaliavose, auginamose skirtinguose Lietuvos regionuose. Tyrimui atlikti buvo pasirinkta spektrofotometrinė analizė, nes tai yra paprastas, patikimas, gana greitai atliekamas metodas, be to, jam būdingas didelis atrankumas [3]. Gauti rezultatai parodė, kad statistiškai reikšmingai (p˂0,05) didesnė redukcinė galia nustatoma žaliavą analizuojant spektrofotometriniu FRAP metodu.
Atlikus skirtingų C. sativa L. veislių žaliavų, auginamų skirtinguose Lietuvos rajonuose, antioksidacinio aktyvumo tyrimą, galima teigti, kad didžiausia redukcine geba pasižymi Futura veislės žaliava, auginama Anykščių rajone, o mažiausia – Manoica veislės žaliava, auginama Panevėžio rajone.
