FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
JULIJA JAKUBAVIČIŪTĖ
DAUGIANARĖS EMULSIJOS SU KININIŲ ARBATMEDŽIŲ
(CAMELLIA SINENSIS L. KUNTZE) LAPŲ EKSTRAKTU TECHNOLOGIJA
IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Giedrė Kasparavičienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOSIR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
DAUGIANARĖS EMULSIJOS SU KININIŲ ARBATMEDŽIŲ
(CAMELLIA SINENSIS L. KUNTZE) LAPŲ EKSTRAKTU TECHNOLOGIJA
IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Giedrė Kasparavičienė Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė Julija Jakubavičiūtė Data KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Emulsijos ir jų tipai ... 10
1.1.1. Daugianarių emulsijų privalumai ir trūkumai ... 11
1. 2. Daugianarių v/a/v emulsijų gamybos metodai ... 11
1. 3. Šaltos gamybos metodo svarba ... 13
1.4. Emulsijų stabilumo problemos ... 14
1.5. Reikalavimai pusiau kietų odos preparatų kokybei ... 16
1.6. Fenolinių junginių įtaka emulsijų stabilumui ... 16
1.7. Skvarba į odą ... 17
1.8. Daugianarių emulsijų gamyboje naudotos medžiagos ... 17
1.8.1. Vynuogių (Vitis vinifera L.) kauliukų aliejus ... 17
1.8.2. Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L. Kuntze) lapų ekstraktas ... 19
1.8.3. Nejonogeniniai emulsikliai ... 20
1.8.4. Kitos ... 20
1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Tyrime naudotos medžiagos ir įranga ... 23
2.2.1. Daugianarių emulsijų gamyboje ir tyrimuose naudotos medžiagos: ... 23
2.2.2. Daugianarių emulsijų gamyboje ir tyrimuose naudota įranga: ... 23
2.3.1. Daugianarių emulsijų gamyba dviejų etapų emulsinimo metodu ... 24
2.3.2. Ekstrakto tirpalo gamyba ... 24
2.3.3. Kinetinio stabilumo tyrimas ... 25
2.3.4. Šaldymo-šildymo ciklų testas ... 25
2.3.5. pH reikšmės nustatymas ... 25
2.3.6. Dinaminės klampos nustatymas ... 25
2.3.7. Tekstūros analizė ... 25
2.3.8. Mikroskopinė analizė ... 26
2.3.9. Ekstrakto junginių nustatymas emulsijoje ... 26
2.3.10. Stabilumo tyrimai ... 27
2.3.11. Statistinė analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Stabilios vidinės emulsijos v/a sudėties sudarymas ... 28
3.2. Daugianarės emulsijos v/a/v sudėties sudarymas ... 29
3.3. Šviežiai pagamintų v/a/v emulsijų savybių analizė ... 30
3.4. Kininio arbatmedžio ekstrakto tirpalo gaminimas ir įterpimas į v/a/v emulsiją. ... 31
3.5. Šviežiai pagamintų v/a/v emulsijų su C. sinensis ekstraktu emulsijų savybių analizė . 32 3.6. Emulsijų stabilumo tyrimas ilgalaikio laikymo sąlygomis ... 33
3.7. Emulsijų stabilumo tyrimas pagreitinto sendinimo sąlygomis ... 40
3.8. Ekstrakto junginių emulsijoje nustatymas ... 48
4. IŠVADOS ... 50
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 52
SANTRAUKA
J. Jakubavičiūtės magistro baigiamasis darbas „Daugianarės emulsijos su kinininių arbatmedžių (Camellia sinensis L. Kuntze) lapų ekstraktu technologija ir kokybės vertinimas“. Mokslinė vadovė doc. dr. G. Kasparavičienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos Fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. Kaunas, 2019.
Tyrimo tikslas: pagaminti daugianarę emulsiją su kininių arbatmedžių lapų ekstraktu ir
įvertinti jos kokybę. Tyrimo uždaviniai: Sudaryti stabilią daugianarę emulsiją, parenkant bazines sudėtines medžiagas ir technologiją; nustatyti sudėtinių medžiagų įtaką dispersinės sistemos lašelių dydžiui; nustatyti sudėtinių medžiagų įtaką pusiau kietos sistemos tekstūrai; nustatyti kininių arbatmedžių lapų ekstrakto kokybinius ir kiekybinius rodiklius ir stabilumą pusiau kietame produkte; nustatyti daugianarės emulsijos kokybės rodiklius: stabilumą, pH, emulsinės sistemos lašelių dydį, tekstūrą. Darbo objektas: daugianarė emulsija su vynuogių kauliukų aliejumi ir kininio arbatmedžio lapų ekstraktu. Tyrimo metodai: kinetinio stabilumo tyrimas; vertinti kokybės rodikliai: dinaminė klampa, pH reikšmė, tekstūros analizė, mikroskopavimas, lašų dydžio matavimas; naudojant spektrofotometriją ir ESC atpažinti fenoliniai junginiai ir kofeinas, bei nustatyti jų kiekiai. Rezultatai: emulsijų sudėtys modeliuojamos keičiant vandens, aliejaus, emulsiklių ir natrio karboksimetilceliuliozės kiekius. Sumodeliuotos 2 sudėtys, pagamintos dar 2 analogiškos su kininių arbatmedžių ekstraktu, vertintas šių 4 emulsijų stabilumas. Išvados: 1) Vynuogių kauliukų aliejus pasirinktas remiantis moksline literatūra, o remiantis eksperimentais, nustatyta, jog stabiliausia daugianarė emulsija buvo sudaryta iš 59,24% vandens, 23% vynuogių kauliukų aliejaus, 7% tvino 80, 7% spano 80, 2% glicerolio, 1,6% natrio karboksimetilceliuliozės ir 0,16% Camelia sinensis ekstrakto; fazės tarpusavyje sumaišomos, kai jų temperatūra 20-25°C. 2) Nustatyta, jog glicerolis didina vandens ir aliejaus lašų santykį, mažina aliejaus ir vandens lašus (p<0,05), o kininių arbatmedžių lapų ekstraktas mažina vandens ir aliejaus lašų santykį (p<0,05). 3) Nustatyta, jog glicerolis lemia didesnį tvirtumą ir šlytį (p<0,05), o kininių arbatmedžių lapų ekstraktas su pakoreguotu tvino 80 kiekiu - didesnį konsistencijos parametrą (ir mažesnį pokytį), didesnį lipnumo parametrą bei klampos indeksą (p<0,05). 4) Fenolinių junginių ir kofeino kiekis emulsijose nepakito reikšmingai (p>0,05). 5) 8 savaites tiriant pagamintas emulsijas nustatyta, kad visos emulsijos išliko kinetiškai stabilios, tačiau statistiškai reikšmingai (p<0,05) pakito visų jų dinaminė klampa, šlytis, tvirtumas, daugumai emulsijų pakito: pH reikšmė, deformacijos jėga, konsistencija, lipnumas, klampos indeksas, lašų dydžiai bei jų santykiai (p<0,05). Praktinės rekomendacijos būsimiems magistrantams: 1) Emulsijų gamybai ir jų tirpalams (pH reikšmės tyrimui) naudoti vienodo pH vandenį. Taip bus suvienodinamos pradinio pH sąlygos. 2) Norint sumažinti fenolinių junginių ir makromolekulių (pvz., tvino 80) sąveiką, reikia paruoštą tirpalą kuo greičiau sumaišyti su aliejine faze.
SUMMARY
J. Jakubavičiūtė Master thesis „Technology and quality assessment of multiple w/o/w emulsion with Tea tree (Camellia sinensis L. Kuntze) leaf extract. Supervisor doc. dr. G. Kasparavičienė; Lithuanian University of Health Sciences, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. Kaunas, 2019.
Aim of the research: To develop a cold technology for multiple w/o/w emulsion with tea
tree extract and assess its quality. Tasks of the research: Choose compounds and technology to form a stable multiple emulsion; Determine the effect of compounds on size of dispersed system droplets; Determine the effect of compounds on texture of the emulsion; Assess the qualitative and quantitative parameters and stability of tea tree leaf extract in semi-solid formulation; Assess qualitative indicators of multiple emulsion: stability, pH, droplet size, texture. Object of the research: Multiple emulsion with grape seed oil and tea tree leaf extract. Research methods: Assessing kinetic stability, dynamic viscosity, pH value, texture analyses, using microscope to determine droplet size, using spectrophotometry and HPLC to identify and determine amounts of total phenolic content and caffeine. Results: Multiple emulsion compositions were designed by changing the amounts of water, oil, emulsifiers and sodium carboximethylcellulose. 2 compositions with the same 2 but containing extract (4 in total) were tested for stability. Conclusions: 1) Choice of grape seed oil was based on scientific literature, the experiments showed, that the most stable composition consisted of 59,24% water, 23% grape seed oil, 7% Tween 80, 7% Span 80, 2% glycerol, 1,6% Sodium carboximethylcellulose and 0,16% tea tree leaf extract; separate phases were mixed together at 20-25°C. 2) Addition of glycerol results in higher droplet ratio, smaller water and oil droplets (p<0,05), addition of tea tree extract results in smaller droplet ratio (p<0,05). 3) Addition of glycerol results in higher firmness and work of shear (p<0,05), addition of tea tree extract with adjusted emulsifier results in higher consistency (and smaller change), higher cohesiveness and index of viscosity (p<0,05). 4) The amount of total phenolic content and caffeine did not change significantly during 8 weeks of storage (p>0,05). 5) During 8 weeks of storage all of the tested emulsions stayed kinetically stable, but statistically significantly (p<0,05) changed their dynamic viscosity, work of shear, firmness, for most of the emulsions also changed pH, deformation force, consistency, cohesiveness, index of viscosity, droplet size and their ratio (p<0,05). Practical recommendations for future students: 1) To unify conditions for measuring pH, the pH of water must be determined each time before preparing emulsion or assessing its pH, to make sure that it is the same. 2) In order to minimize interaction between polyphenols and macromolecules (i.e. Tween 80), prepared solution must be mixed with oil phase as soon as possible.
SANTRUMPOS
a/a Aliejus aliejuje
a/v Aliejus-vandenyje
a/v/a Aliejus-vandenyje-aliejuje aps/min Apsisukimai per minutę
EGCG Epigalokatechingalatas
ESC Efektyvioji skysčių chromatografija
pH Vandenilio jonų (H+ ) koncentracijos tirpale matas
UV Ultravioletiniai
v/a Vanduo-aliejuje
ĮVADAS
Puskiečiai preparatai, naudojami vietiškai tepant ant odos, yra labai populiarūs dėl patogaus jų vartojimo ir efektyvaus poveikio. Dėl to kuriant naujas formuluotes aktualu parinkti ingredientus su biologiškai aktyviais junginiais, kurie spręstų esamas sveikatos problemas ar veiktų prevenciškai. Taip pat svarbu pritaikyti tinkamas technologijas, kad gamybos metu būtų patiriami kuo mažesni nuostoliai, o numatomas poveikis nesusilpnėtų.
Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L. Kuntze) lapų ekstraktas pasižymi gausiu fenolinių junginių kiekiu, dėl kurių, vartojant vietiškai ant odos, stebimas moksliniais tyrimais nustatytas antioksidantinis, žaizdų gijimą skatinantis, odos senėjimą stabdantis ir nuo saulės neigiamo poveikio (ultravioletinių (UV) spindulių) apsaugantis poveikis [1,2].
Vynuogių (Vitis vinifera L.) kauliukų aliejaus poveikis odai nėra tiek plačiai ištirtas ir taip gausiai aprašytas, kaip C. sinensis ekstraktas, tačiau mokslinėje literatūroje yra tyrimų, kuriuose aprašyta, kad dėl fenolinių junginių, linolo rūgšties ir įvairių vitamino E formų šis aliejus pasižymi antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antimikrobiniu, žaizdų gijimą skatinančiu ir odą drėkinančiu poveikiu [3,4].
Daugianarės emulsijos yra paprastai vartojamos apsaugoti vartotoją nuo nemalonaus junginių kvapo ar skonio, taip pat apsaugoti oksidacijai ir hidrolizei jautrius junginius nuo išorės poveikio [5,6], tačiau jos negali būti naudojamos kaip termolabilių junginių nešiklis, nes dažniausiai jos yra gaminamos aukštesnėje nei kambario temperatūroje [6–9].
Dėl šių priežasčių buvo nuspręsta emulsijų gamybai naudoti vynuogių kauliukų aliejų ir kininių arbatmedžių lapų ekstraktą bei išvystyti technologiją emulsijoms gaminti šaltuoju būdu taip kiek įmanoma labiau saugant termolabilius junginius nuo šilumos poveikio. Šio tyrimo tikslas – pagaminti daugianarę emulsiją su kininių arbatmedžių lapų ekstraktu ir įvertinti jos kokybę.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Pagaminti daugianarę emulsiją su kininių arbatmedžių lapų ekstraktu ir įvertinti jos kokybę.
Darbo uždaviniai:
1. Sudaryti stabilią daugianarę emulsiją, parenkant bazines sudėtines medžiagas ir technologiją. 2. Nustatyti sudėtinių medžiagų įtaką dispersinės sistemos lašelių dydžiui.
3. Nustatyti sudėtinių medžiagų įtaką pusiau kietos sistemos tekstūrai.
4. Nustatyti kininių arbatmedžių lapų ekstrakto kokybinius ir kiekybinius rodiklius bei stabilumą pusiau kietame produkte.
5. Nustatyti daugianarės emulsijos kokybės rodiklius: stabilumą, pH, emulsinės sistemos lašelių dydį, tekstūrą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Emulsijos ir jų tipai
Emulsija – tai daugianarė (heterogeninė) skysta arba pusiau kieta sistema, sudaryta iš dviejų nesimaišančių skysčių, kurių vieno lašeliai, disperguoti kitame, lašelius stabilizuojant emulsikliu [5,10–12]. Pagal technologijos pobūdį emulsijos yra skirstomos į paprastas ir daugianares arba sudėtines [5].
Paprastos emulsijos klasifikuojamos pagal savo sudėtį: aliejus vandenyje (a/v), vanduo aliejuje (v/a) ir aliejus aliejuje (a/a) [5,10,13] - arba pagal naudojamą emulsiklį [10]. Emulsiklis ir jo pasirinkimas yra labai svarbūs siekiant sukurti stabilią emulsinę sistemą, nes savaime nesimaišantys skysčiai (polinis ir nepolinis) yra linkę išsisluoksniuoti [10]. Pagrindinių paprastų emulsijų tipų sandara pavaizduota paveikslėlyje (Pav. 1.1).
Pav. 1. 1. Emulsijos tipų pavaizdavimas. Čia: gelsva spalva žymi aliejinę fazę, balta - vandeninę.
Daugianarės (sudėtinės) emulsijos yra sudėtingesnės - tai kompleksinės polidispersinės sistemos, kuriose vienu metu egzistuoja a/v ir v/a emulsijos [5,6,9,14]. Šios taip pat yra kelių rūšių, iš kurių pagrindinės - vanduo-aliejuje-vandenyje ir aliejus-vandenyje-aliejuje. Labiausiai paplitusią pirmo tipo daugianarę emulsiją sudaro maži vidinės vandeninės fazės lašeliai, įterpti į aliejinę fazę, kuri disperguota išorinėje vandeninėje fazėje [5,14,15]. Antro tipo emulsijas sudaro aliejiniai lašai disperguoti vandeniniame tirpale, kuris disperguotas išorinėje aliejinėje fazėje [5]. Disperguotų lašelių dydis gali būti tarp 0,1-100µm [6]. Daugianarių emulsijų tipų sandara pavaizduota paveikslėlyje (Pav. 1.2).
Pav. 1. 2. Daugianarės emulsijos tipų pavaizdavimas. Čia: gelsva spalva žymi aliejinę fazę, balta - vandeninę.
1.1.1. Daugianarių emulsijų privalumai ir trūkumai
Remiantis tyrimų apžvalgomis ir įvairiais moksliniais tyrimais, daugianarės emulsijos turi keletą svarbių privalumų:
1) maskuoja nemalonų medžiagų kvapą ir skonį [5–7];
2) galima jas naudoti kaip prailginto atpalaidavimo vaisto formą [5,6];
3) būtinosios maistinės medžiagos (pvz., riebalai ir vitaminai) gali būti skiriamos pacientams sterilių intraveninių emulsijų pavidalu [5,6];
4) apsaugomi oksidacijai ir hidrolizei jautrūs junginiai [5,6,14];
5) intraveninės kontrastinių medžiagų emulsijos gali būti naudojamos pagalbai diagnostikoje [5];
6) galima plačiai pritaikyti gaminat išoriškai vartojamus produktus: losjonus, kremus, linimentus [5,7];
7) sudėtinės emulsijos vartojimas padidina skvarbą pro virškinamojo trakto gleivines ir odą [5,6].
Nepaisant šių privalumų, daugianarių emulsijų pritaikymas yra labai ribojimas jų kompleksinės struktūros (sudėtinga pagaminti, trumpas tinkamumo vartoti laikas) ir termodinaminio nestabilumo [5–7,14].
1. 2. Daugianarių v/a/v emulsijų gamybos metodai
Daugianarės v/a/v emulsijos yra gaminamos trimis būdais: 1. dviejų žingsnių emulsinimas;
2. fazių inversija (vieno žingsnio emulsinimas); 3. membraninis emulsinimas.
Dviejų žingsnių emulsinimo technologija
Gaminant emulsijas pagal šį metodą, iš pradžių pagaminama pirminė (vidinė) emulsija v/a, o tada ji sumaišoma su išorine vandenine faze ir susidaro v/a/v emulsija [5–7,14]. Maišymas dažniausiai atliekamas su rotorine maišykle arba aukšto slėgio vožtuviniu homogenizatoriumi [5,7]. Maišyklė taip pat gali būti propelerinė [14]. Pirmojo maišymo metu naudojamas aukštesnis slėgis arba didesnis apsisukimų per minutę skaičius, kad susidarytų mažesni lašeliai. Galutinės emulsijos formavimo metu maišoma ne taip intensyviai, jog nebūtų pažeisti vidinės vandeninės fazės lašeliai [5,7,14]. Supaprastinta šios technologijos schema pavaizduota paveikslėlyje (Pav.1.3).
Pav. 1. 3. Daugianarės emulsijos gamybos dviejų etapų emulsinimo schema.
Čia: I - pirmas etapas II - antras etapas
a - vidinė vandeninė fazė; b - aliejinė fazė;
c - suformuota vidinė emulsija; d - išorinė vandeninė fazė;
e - suformuota daugianarė v/a/v emulsija.
Fazių inversijos (vieno žingsnio emulsinimo) technologija
Gaminant emulsijas pagal šį metodą, į nepolinę fazę su lipofiliniu emulsikliu (arba jų mišiniu) mažais kiekiais (pvz. 5ml/min) pilamas vandeninis hidrofilinio emulsiklio (arba jų mišinio) tirpalas [5,6,16]. Emulsijos dedamosioms fazėms pasiekus tinkamą santykį, susiformuoja daugianarė emulsija [5,6,16,17]. Emulsija susiformuoja dėl HLB (hidrofilinio - lipofilinio balanso) ir paviršiaus įtempimo pokyčių [9]. Naudojant amfolitinius emulsiklius, pvz., PED-b-PS diblok-co-polimerus, emulsiklis iš anksto sumaišomas su nepoline faze, ir tada palengva įmaišoma polinė fazė [9,17]. Maišymo greitis, trukmė ir temperatūra gali skirtis, priklausomai nuo naudojamų medžiagų ir pasirinktos konkrečios metodikos [5,6,16,17]. Supaprastinta šios technologijos schema pavaizduota paveikslėlyje (Pav. 1.4).
Pav. 1. 4. Daugianarės emulsijos gamybos inversijos metodu schema.
I
II
a b c c d e maišymas maišymas b c a maišymasČia: a - vandeninė fazė; b - aliejinė fazė;
c - suformuota daugianarė v/a/v emulsija.
Membraninio emulsinimo technologija
Gaminant emulsijas pagal šį metodą, kaip ir dviejų žingsnių elmulsifikavimo metu, iš pradžių pagaminama pirminė v/a emulsija. Tada ši emulsija, naudojant slėgį, yra išstumiama į išorinę fazę per porėtą stiklo membraną. Šiuo būdu pagamintų emulsijų lašeliai yra vienodo dydžio, nes visos poros yra vienodo (pasirinkto) dydžio [5,6]. Panašiu principu („dozuojant“ lašelius), emulsijas galima gaminti ne per membranas, o su kontroliuoto jungtinio tiekimo prietaisais. Šie gali būti T-jungties, bendro tiekimo ir hidrodinaminės tėkmės principų [9]. Šiuo būdu dažniausiai gaminamos mikroemulsijos (mikroskysčiai) [9]. Tokio prietaiso T-jungties veikimo principas pavaizduotas paveikslėlyje (Pav. 1.5).
Pav. 1. 5. Daugianarės emulsijos gamybos naudojant kontroliuoto jungtinio tiekimo T-jungties prietaisą schema [9].
Čia: a - įtekanti aliejinė fazė;
b - įtekanti vidinė vandeninė fazė; c - T-jungtis;
d - suformuota vidinė v/a emulsija; e - įtekanti išorinė vandeninė fazė;
f - suformuota daugianarė v/a/v emulsija [9].
1. 3. Šaltos gamybos metodo svarba
Aliejai, sudėtyje turintys daug nesočiųjų riebalų rūgščių (pvz., vynuogių kauliukų, sezamo sėklų, vaistinės ožragės sėklų), yra labai jautrūs oksidacijai [18]. Viena iš oksidacijos rūšių - autooksidacija, paprastai vyksta aliejus ar iš jų pagamintus produktus laikant ilgesnį laiką įprastomis sąlygomis arba per trumpesnį laiką kaitinant [18,19]. Antioksidantinių junginių buvimas šiuose
a b c d e f g
aliejuose lėtina autooksidacijos procesą, todėl aliejuose esančios biologiškai aktyvios medžiagos ilgiau išlieka nepakitusios [18]. Antioksidacinio poveikio junginiai pasižymi ne itin geru terminiu stabilumu, dalis jų pakaitinti yra linkę hidrolizuotis, pvz.: galokatechinas, katechinas, epikatechinas [20]. Kiti aliejai, kurie ilgesnį laiką pakaitinus (100˚C) yra linkę oksiduotis - alyvuogių, saulėgražų, sojų ir kukurūzų aliejai [19].
Fenoliniai junginiai (ypač katechinai), esantys kininio arbatmedžio ekstrakte yra dalinai atsparūs temperatūrai, tačiau ne visiškai, nes pakaitinus (≥70˚C), sumažėja jų kiekis tiriamame produkte [21]. Taip pat jų kiekis mažėja emulsijose, ilgesnį laiką laikant kambario (25±2˚C) ar aukštesnėje temperatūroje [22].
Kita junginių grupė (nenaudojama šiame tyrime), jautri temperatūriniams pokyčiams - eteriniai aliejai [23,24]. Juose kylant aplinkos temperatūrai didėja autooksidacijos bei molekulių vidinės struktūros kitimo greitis. Kuri temperatūra optimali šiems lakiems junginiams, o kuri skatina oksidaciją, priklauso nuo eterinio aliejaus ir jo sudėties [23,24].
Emulsijos gaminimas kambario temperatūroje yra taikytas; literatūroje yra tyrimų, kuriuose antras emulsinimo etapas arba v/a/v emulsijos gaminimas inversijos būdu vykdomas nešildant sudedamųjų dalių [5,7]. Vasiljevic et al. (2009 m.) šaltuoju dviejų etapų emulsinimo metodu gamino daugianares emulsijas su cetildimetikono kopolioliu, tačiau stabilumą vertino tik po 30 dienų [25]. Tokių tyrimų nėra daug, todėl būtų naudinga išvystyti technologiją, pagal kurią būtų galima pagaminti daugianares v/a/v emulsijas, jų ingredientus apsaugant nuo terminio poveikio.
1.4. Emulsijų stabilumo problemos
Emulsijos, kadangi sudarytos iš tarpusavyje nesimaišančių skysčių, savaime yra nestabilios sistemos. Šį nestabilumą lemia išoriniai bei vidiniai veiksniai, tokia kaip gravitacija, pH reikšmės pokytis, HLB, emulsiklių prigimtis ir kiti. Pagrindiniai nestabilumo mechanizmai (Pav. 2.6.) yra šie:
1. Kremėjimas (A) arba sedimentacija (B) - išorinių jėgų (gravitacijos arba centrifugavimo) sukeltas emulsijos išsisluoksniavimas. Emulsijos sudedamieji skysčiai išsisluoksniuoja pagal tankį - nusėda sunkesnis, o viršuje lieka lengvesnis skystis. Jei dispersinė fazė lengvesnė už dispersinę terpę, įvyksta kremėjimas, o jei sunkesnė - sedimentacija [10,26].
2. Flokuliacija (C) - dispersinės fazės lašeliai, nekeisdami savo dydžio, agreguojasi dėl Van der Vaalso jėgų. Flokuliacija atsiranda, kai nepakanka atstūmimo jėgos tarp lašelių (osmotinis slėgis išorėje yra didesnis nei tarp lašelių) [10,26].
3. Koalescencija (D) - dviejų ar daugiau disperguotų lašelių susijungimas dėl suplonėjusio arba pratrūkusio terpės sluoksnio tarp jų [10,26].
4. Disproporcionavimas (E) - atsiranda dėl riboto skysčių tirpumo. Kuo mažesni dispersinės fazės lašeliai, tuo jie geriau tirpsta dispersinėje terpėje. Po ta tikro laiko maži lašeliai tarsi išnyksta, o jų molekulės difunduoja prie didesnių lašų ir šie palengva didėja [10,26].
5. Fazių inversija (F) - procesas, kurio metu dispersinė terpė tampa dispersine faze, o tuo pat metu buvusi dispersinė fazė - dispersine terpe (a/v emulsija taps v/a arba atvirkščiai) [10,26].
Pav. 1. 7. Schematizuoti daugianarės v/a/v emulsijos nestabilumo modeliai [27].
Daugianarėse v/a/v emulsijose be jau paminėtų nestabilumų dažnai pasitaiko šie: išorinių lašų koalescencija, vidinių lašų koalescencija ir bendra vidinių-išorinių lašų koalescencija (Pav. 1.7) [5,14,27]. Išorinių lašų koalescencija (A) prilygsta paprastos emulsijos, o vidinių lašų jungimasis (B) nepakeičia išorinių lašų sąsajos. Bendros vidinių-išorinių lašų koalescencijos (C) metu dalis vidinės fazės v1 pereina į išorinę. Taip pat v/a/v emulsijose pasireiškia vidinių lašų mažėjimas arba didėjimas
(D), priklausomai nuo skysčio judėjimo krypties (per aliejaus fazę). Šis judėjimas priklauso nuo osmosinio slėgio skirtumų tarp abiejų vandeninių fazių [27]. Nuo bet kurio iš šių mechanizmų pasireiškimo priklauso vienas pagrindinių emulsijų stabilumo parametrų - išeiga. Išeiga - tai procentalinė vidinės vandeninės fazės v1 dalis, likusi disperguota aliejinėje fazėje po antros emulsifikacijos stadijos [27,28].
1.5. Reikalavimai pusiau kietų odos preparatų kokybei
Kiekvienas kosmetinis ar vaistinis pusiau kietas odos preparatas, skirtas Europos sąjungos rinkai, turi būti pagamintas laikantis Geros gamybos praktikos (GGP) gairių reikalavimų [29]. Taip pat šie preparatai turi būti:
1. Stabilūs ilgą laiką [29];
2. Neturintys mikrobiologinio užterštumo ir nesudarantys sąlygų mikroorganizmams daugintis [29,30]; Leistini kiekiai: bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis < 102/ml (g), bendras mieliagrybių kiekis < 101
/ml (g), Staphylococcus aureus ir Pseudomonas aeruginosa 1-ame grame arba mililitre mėginio neturi būti iš viso [30];
3. Turintys tinkamas reologines savybes [29,30]; 4. Atliekantys savo funkciją [29];
5. Dermatologiškai saugūs (nedirgina odos, nesukelia alergijų) [29].
1.6. Fenolinių junginių įtaka emulsijų stabilumui
Fenoliniai junginiai yra natūralių, sintetinių ir pusiau sintetinių junginių klasė, turinti daug fenolinių pakaitų [13]. Fenoliniai junginiai gan prastai tirpsta vandenyje (išskyrus epigalokatechingalatą), bet puikiai - organiniuose tirpikliuose, jie yra nestabilūs šviesos ir tam tikro pH poveikyje [13]. Kadangi vandeniniai polifenolių tirpalai yra nestabilūs dėl mažo tirpumo ir polinkio kristi į nuosėdas, tirpumo padidinimui gali būti naudojami surfaktantai, tokie kaip polioksietilensorbitano monolauratas arba blokuojantys kopolimerai [12].
Fenolinių junginių įterpimas į emulsinę sistemą gali paveikti jos reologines savybes ir stabilumą, labiausiai tai pasireiškia sumažėjusia klampa [12]. Nėra pilnai ištirta, kodėl taip vyksta, bet manoma, kad dėl polifenolių sąveikos su emulsiklių makromolekulėmis (susiformuoja grįžtamieji nekovalentiniai ryšiai (vandenilinės, jungtys, hidrofobinės jungtys, van der Vaalso jėgos) arba negrįžtamieji kovalentiniai ryšiai) [12]. Buvo pastebėta, kad polifenoliai turi šiek tiek paviršiui aktyvių savybių - a/v emulsijoje: galo r., katechinas ir kvercetinas mažina paviršiaus įtempimą, todėl kinta
aliejaus lašų dydis. Jei įdėtas tik katechinas, susiformuoja didesni aliejaus lašai, o jei tik kvercetinas - mažesni [12].
1.7. Skvarba į odą
Siekiant sukurti efektyvų odos produktą, jis turi veikti kaip nešiklis ir prasiskverbti pro viršutinį (raginį) odos sluoksnį Stratum Corneum bei atpalaiduoti veikliąsias medžiagas gilesniuose odos sluoksniuose (epidermyje ar dermoje), tačiau neturi pasiekti kraujotakos [12]. Veikliosios medžiagos atpalaidavimas ir skvarba priklauso nuo molekulės savybių, tokių kaip molekulinė masė, lipofiliškumas/hidrofiliškumas ir nešiklio formuluotės. Sukurtos formuluotės turi būti fiziškai, chemiškai ir mikrobiologiškai stabilios, kad būtų užtikrintas kuo geresnis veikliosios medžiagos stabilumas ir gera pernaša į tikslinius odos sluoksnius [12].
Kitų mokslininkų atlikti tyrimai rodo, kad labiau poliniai junginiai (katechinas, resveratrolis, kurkuminas) sunkiau pereina raginį odos sluoksnį, nei mažiau poliniai (kvercetinas), kurie kaupiasi gilesniuose epidermio sluoksniuose [12]. Tačiau yra tyrimų, kuriais įrodyta, jog resveratrolis pasiekia net dermą ir receptorių skystį [8]. Greičiausiai ir didžiausiais kiekiais iš emulsijos atsipalaiduoja prokatechuinė rūgštis, katechinas ir epigalokatechingalatas, tačiau pastarojo tik nedideli kiekiai pereina odos barjerą (tikriausiai dėl dermalinės esterazės sukeltos hidrolizės) [8]. Gerai į odą patenka ne tik polifenoliniai, tačiau ir kiti junginiai, tokie, kaip kofeinas [31,32].
Emulsinės sistemos sudėtis taip pat daro įtaką fenolinių junginių atpalaidavimui joje. Didesnis vandens kiekis palengvina fenolinių junginių judėjimą pačioje emulsijoje ir skatina odos raginio sluoksnio lipidinių plokštelinių struktūrų persidėstymą, todėl pagreitėja transdermalinė pernaša [8,12]. Ši pernaša taip pat pagreitėja esant mažesnei santykinei oro drėgmei [33].
1.8. Daugianarių emulsijų gamyboje naudotos medžiagos
1.8.1. Vynuogių (Vitis vinifera L.) kauliukų aliejus Sudėtis
Vynuogių kauliukų aliejaus sudėtis priklauso nuo vynuogių porūšio, augimo aplinkos ir kultivavimo veiksnių bei pasiektos brandos laipsnio [3,34]. Aliejuje esančius junginius galima išskirti į dvi grupes: hidrofilinės ir lipofilinės medžiagos. Pirmajai grupei priklauso fenoliniai junginiai (flavonoidai, carotenoidai, fenolinės rūgštys, taninai, stilbenai), antrosios grupės, ir viso aliejaus, didžiąją dalį sudaro sudaro poli-nesoti riebalų rūgštis linolo r. taip pat dalis tiek mono-nesočios oleino rūgšties bei šiek tiek sočiųjų riebalų rūgščių, fitosterolių (β-sitosterolis, sitostanolis ir kiti) [3,4,18,34,35].
Šiame aliejuje taip pat yra kiekvienam aliejaus tipui savitos sudėties ir kiekio vitaminas E (tokoferoliai ir tokotrienoliai). Skirtingų porūšių aliejuose randami α-,β-,γ- ir δ-tokoferoliai, iš kurių α- -tokoferolis pasižymi stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis [3,4,35]. Daugiau nei tokoferolių, aliejuose yra γ- ir α- tokotrienolių (nesočiosios vitamino E formos) [3].
Poveikis odai
Oda yra laikoma didžiausiu žmogaus kūno organu, turėdama 1,5-2,0 m2
paviršiaus plotą [2]. Pagrindinė jos funkcija – organizmo apsauga, sudarant barjerą nuo žalingo ekologinių ir toksikologinių veiksnių poveikio [2]. Oda yra išorinė organų sistema, leidžianti tiesioginę farmakologinę sąveiką su vietinio vartojimo produktais [2]. Gera absorbcija ir dideliu efektyvumu vartojant vietiškai, pasižymi antioksidantinio poveikio junginiai. Jie papildo natūralią odos endogeninę antioksidantinę sistemą [12].
Fenoliniai junginiai (galo r., katechinas, proantocianidinai ir kiti), esantys vynuogių kauliukų aliejuje, pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu [3]. Šis poveikis siejamas su laisvųjų radikalų, ypač hidroksil- radikalo, surišimu ir metalų chelacija. Tai silpnina oksidacinį stresą ir mažina mažo tankio lipoproteinų kiekį, todėl mažėja daliai ligų būdingi uždegiminiai procesai [3]. Fenoliniai junginiai kartu su fitosteroliais dar slopina arachidono rūgšties išsiskyrimą, dėl to taip pat mažėja uždegimas [3,18].
Šis aliejus pasižymi antimikrobinėmis (baktericidinėmis) savybėmis prieš Escherihia coli ir Salmonella enteridis bakterijas [3,18,36]. Dėl antimikrobinio, antioksidantinio bei drėkinančio poveikio vietiškai naudojamas vynuogių kauliukų aliejus skatina greitesnį ir tolygesnį žaizdų gijimą [4,18,36].
Yra atlikta tyrimų, kuriuose nustatytas vynuogių kauliukų aliejuje esančių proantocianidinų priešvėžinis poveikis, kai pasireiškia citotoksinis poveikis vėžinėms ląstelėms, nepažeidžiant sveikų ląstelių. Tačiau naudingesnis onkologinių ligų gydyme šis aliejus būtų kaip nanonešiklis [3].
Aliejuje esanti linolo rūgštis stiprina odos ląstelių membranas, skatina ląstelių regeneraciją ir geriną bendrą odos būklę [4]. Dėl šio ir kitų junginių aliejus lengvai įsigeria į odą, nepalieka riebalinių dėmių, mažina trans-epiderminį vandens praradimą [4]. Linolo ir oleino rūgštys taip pat turi ir antioksidantinį poveikį, dėl kurio skatinamas greitesnis žaizdų gijimas [36].
Vynuogių kauliukų aliejaus funkcija šiame tyrime - aliejinė fazė ir biologiškai aktyvių junginių turinti medžiaga.
1.8.2. Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L. Kuntze) lapų ekstraktas Sudėtis
Kininio arbatmedžio ekstrakte gausu polifenolinių katechinų (iki 30% sausos lapo masės), kitų flavonoidų, metilksantinų (kofeino, teobromino), amino rūgščių ir kvino (quinic) rūgšties esterių [1,2,37–40]. Priklausomai nuo kultivavimo laiko lapuose, yra skirtingi kiekiai įvairių kemferolio glikozidų (pvz. 3-O-ramnozil-(1-6)-galaktozidas, 3-O-galaktozidas, kumaroilheksozidas), katechinų (epikatechinas (EC), galokatechingalatas (GCG), (-)epikatechingalatas (ECG), epigalokatechingalatas (EGCG), galokatechinas (GC)) [1,12,37,39,40]. Iš kvino rūgšties esterių, taip pat atsižvelgiant į kultivavimo laiką, lapuose yra skirtingi kiekiai 4/5-O-(E)-kafeilkvino r., 3/4/5-O-(E)-kumaroilkvino r., myricetino 3-O-heksozidas) [37]. Dar šiuose lapuose yra flavonų - rutino, viteksino ir kvercetin-O-heksozido [12,37].
Lapų sudėtis taip pat priklauso ir nuo augalo amžiaus - jaunuose lapuose yra daugiau antioksidantiniu poveikiu pasižyminčių junginių nei senuose [2,40], o geografiniai regionai bei klimato sąlygos (temperatūra, kritulių ir saulės kiekis) irgi turi įtakos junginių įvairovei ir kiekiui [2,38]. Dar vienas veiksnys, nuo kurio priklauso ekstrakto sudėtis - kininio arbatmedžio „klasė“: aukštesnės kokybės augalo lapuose yra mažiau polisacharidų, o žemesnės kokybės - daugiau [33].
Poveikis odai
Dėl gausaus flavonolių kiekio, kininio arbatmedžio ekstraktas lengvina saulės ultravioletinių spindulių sukeltas nepageidaujamas odos reakcijas, tokias kaip odos pažaida, eritema ir lipidų peroksidacija [1,2,8,13,33]. Fenolinių junginių vartojimas ant odos sumažina ciklobutano pirimidino dimerų formavimasį odoje (dermoje ir epidermyje), o išankstinis pavartojimas prieš saulės poveikį nulemia lengvesnius nudegimo atvejus ir lėtesnį odos fotosenėjimą [1,2]. Ekstraktas taip pat mažina jau esančių odos pažaidų (šviesos poveikio, eritemų, telangiektazijų) buvimą, gerina gijimą [2]. Ekstrakte esantys junginiai gerina chirurginių žaizdų gijimą (žaizdos sugyja greičiau, lieka mažesnis randas) [41]. Kininio arbatmedžio ekstrakto vietinis vartojimas sumažina UV spindulių sukeltą karcinogenezę, slopindamas cheminių auglio sukėlėjų ir promoterių aktyvumą bei žymiai sumažina šių spindulių iššauktą visuotinę DNR hipometiliaciją [2]. Prieš vėžinį poveikį stiprina ekstrakte esantis kofeinas [32]. Svarbiausi junginiai, atliekantys šią funkciją - EGCG ir kiti fenoliniai junginiai, dėl to itin svarbu užtikrinti jų buvimą ekstrakte ir galutiniame produkte [2].
Dar vienas, ne mažiau svarbus, fenolinių junginių poveikis odai - kolagenazės ir elastazės slopinimas. Šie fermentai skatina odos baltymų, atsakingų už odos tvirtumą ir elastingumą (kolageno bei elastino) skilimą. Didelis laisvųjų radikalų odoje kiekis skatina šių fermentų aktyvumo padidėjimą, dėl to radikalų surišimas sumažina fermentų poveikį [8,12,13,33].
Kininio arbatmedžio ekstraktas pasižymi ne tik antioksidantiniu poveikiu. Yra nustatyta, kad ekstrakto buvimas pusiau kietoje kosmetinėje formuluotėje didina drėgmės kiekį odoje. Manoma, kad vitaminai, baltymai ir polisacharidai, esantys ekstrakte, skatina vandens sulaikymą ne tik viršutiniame odos ląstelių sluoksnyje, bet ir gilesniuose [33,42].
Kininio arbatmedžio lapų ekstrakto funkcija šiame tyrime - veiklioji medžiaga.
1.8.3. Nejonogeniniai emulsikliai
Tvinas 80 (Polioksietilen(20)-sorbitano monooleatas)
Tvinas 80, kitaip dar žinomas kaip polisorbatas 80, yra nejonogeninis emulsiklis. Taip pat jis gali būti naudojamas kaip disperguojanti, tirpinanti, plastifikuojanti ar suspenduojanti medžiaga, emolientas. Empirinė formulė - C64H124O26. Šis junginys, lyginant su kitais polisorbatais, yra dažniausiai naudojama paviršinio aktyvumo medžiaga parenteriniuose produktuose. Tai parodo šio junginio saugumą ir patikimumą [43].
Polisorbatas kambario temperatūroje (25±2°C) yra geltonas aliejingas skystis, turintis jam būdingą specifinį kvapą. HLB reikšmė - 15,0. Šis junginys ir kiti polisorbatai slopina parabenų priešmikrobinį poveikį, todėl nerekomenduojama jų naudoti kartu. Leistini kiekiai polisorbatą 80 naudojant kaip emolientą arba emulsiklį: 1 –15% [43].
Tvino 80 funkcija šiame tyrime – hidrofilinis emulsiklis.
Spanas 80 (Sorbitano monooleatas)
Spanas 80, kitaip dar žinomas kaip sorbitano oleatas, kaip ir polisorbatas 80 yra nejonogeninis emulsiklis, disperguojanti, tirpinanti, plastifikuojanti ar suspenduojanti medžiaga. Empirinė formulė - C24H44O6. Sorbitano oleatas kambario temperatūroje (25±2°C) yra geltonas klampus skystis, turintis jam būdingą specifinį kvapą. HLB reikšmė - 4,3. Leistini kiekiai sorbitano esterį naudojant kaip emulsiklį: 1-10% [43].
Spano 80 funkcija šiame tyrime – lipofilinis emulsiklis.
1.8.4. Kitos
Vitaminas E
Vitaminu E, riebaluose tirpiu vitaminu, vadinamos aštuonios molekulės - 4 tokoferoliai (α-,β-,γ-,δ-) ir 4 tokotrienoliai (α-,β-(α-,β-,γ-,δ-) [44–46]. Iš šių junginių α-tokoferolis aktyviausiai saugo ląstelių mebranas nuo laisvųjų radikalų sukeltos peroksidacijos [44,47]. Vitamino E veikimo mechanizmas molekuliniame lygmenyje: mažinama MMP-1 (matrikso metalo proteinazės) transkripcija ir slopinamas tiamino dimerų formavimasis, todėl slopinami kolageno skilimo ir mutagenezės procesai [45,46]. Oksiduotas vitamino E formas galima redukuoti naudojant l-askorbo rūštį (vitaminą C) [44– 46]. Dėl to dažnai šie du vitaminai naudojami kartu.
Yra įrodymų, jog vietinis vitamino E vartojimas ant odos gali mažinti UV spindulių sukeltas eritema ir edemas bei jų atsiradimą ir gali padidinti raginio epidermio sluoksnio vandens surišimo gebą [44,45,47]. Naudojant formuluotes, sudėtyje turinčias 0,2% tokoferolio, reikšmingai padidėja vitamino E kiekis raginiame sluoksnyje [46]. Šis vitaminas naudojamas pusiau kietose farmacinėse formuluotėse ne tik kaip veiklioji odą veikianti medžiaga, bet ir kaip pačio preparato apsauga – saugo nuo žalingo UV poveikio. Poveikis daug stipresnis, jei naudojamas kartu su vitaminais A arba C [44].
α-tokoferilacetato (sintetinio Vitamino E) funkcija šiame tyrime – veiklioji medžiaga ir antioksidantas stabilizatorius.
2-Fenoksietanolis
Fenoksietanolis yra priešmikrobinis konservantas, naudojamas kosmetiniuose ir vietinio vartojimo farmaciniuose gaminiuose. Pats fenoksietanolis yra bespalvis, šiek tiek klampus skystis, jo empirinė formulė C8H10O2. Įprastos jo kiekio normos produkte 0,5-1,0%. Skirtingomis koncentracijomis šis konservantas efektyviai apsaugo nuo Aspergillus niger, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ir Staphylococcus aureus mikrobų [43].
2-Fenoksietanolio funkcija šiame tyrime – konservantas.
Natrio karboksimetilceliuliozė
Na-KMC molekulė (Pav.1.8.) yra iš β-D-gliukozės sudarytas polimeras, kurio laisvos hidroksi- grupės yra dalinai pakeistos karboksimetil- grupėmis [48].
Pav. 1. 8. Natrio karboksimetilceliuliozės bendrinė cheminė formulė [48].
Čia: n - polimerizacijos laipsnis;
x - laisvų hidroksilo grupių skaičius (x=1,50-2,80); y - pakeistų hidroksilo grupių skaičius (y=0,20-1,50);
x+y=3,0, nes kiekvienas gliukozės monomeras turi 3 laisvas -OH grupes. Na-KMC funkcinės savybės (aktualios šiam tyrimui):
1. vandeninių sistemų reologinių savybių (klampos, tekstūros, konsistencijos) koregavimas [43,48];
2. geras tirpumas įvairios temperatūros vandenyje (0-100˚C) [43,48]; 3. geras šaldymo-atšildymo stabilumas (kristalizacijos kontrolė) [48]; 4. plėvelė formuojančios savybės (barjerinė funkcija) [48];
5. didelis efektyvumas esant mažiems kiekiams (nuo 0,015-0,5%) [43,48]; 6. nekeičia produkto skonio, kvapo, spalvos [43,48];
Na-KCM funkcija šiame tyrime - tirštiklis, stabilizatorius.
1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Šia apžvalga buvo nustatyta, kad daugianarės emulsijos, pasižyminčios gera skvarba per odą ir gleivines, apsauginiu poveikiu oksidacijai bei hidrolizei jautriems junginiams, yra gaminamos dvejų arba vieno etapo bei membraninio emulsinimo būdais, iš kurių labiausiai naudojamas yra pirmasis metodas. Šio ir kitų gaminimo metodų metu emulsijos paprastai būna šildomos, dėl to sudėtinga į jas įterpti termolabilių arba lakių junginių, pvz., eterinių aliejų arba į autooksidaciją linkusių fenolinių junginių. Dažniausios emulsinių sistemų nestabilumo problemos - kremėjimas, koalescencija, disproporcionavimas, fazių inversija.
Vitis vinifera kauliukų aliejuje ir Camelia sinensis lapų ekstrakte yra fenolinių junginių; emulsijose galima saveika tarp šių junginių ir emulsiklių makromolekulių. Atlikti moksliniai tyrimai nustatė, jog giliausiai į odą prasiskverbia kvercetinas, o paviršutiniuose sluoksniuose lieka katechinas ir EGCG.
Emulsijų gamybai pasirinktas būtent V. vinifera kauliukų aliejus, nes dėl jame esančių fenolinių junginių, linolo r. ir skirtingų vitamino E formų, šis aliejus pasižymi stipriu antioksidaciniu, priešuždegiminiu, baktericidiniu, ląstelių regeneraciją ir žaizdų gijimą skatinančiu bei drėgmę odoje sulaikančiu poveikiu. C. sinensis lapų ekstrakte esantys fenoliniai junginiai ir kofeinas taip pat lemia stiprų antioksidacinį, žaizdų gijimą skatinantį ir drėgmę odoje sulaikantį poveikį, tačiau papildomai šis ekstraktas dar pasižymi UV spindulių sukeltos karcinogenezės mažinimu, kolagenazės ir elastazės slopinimu bei apsauga nuo odos fotosenėjimo.
Atlikus mokslinės literatūros analizę buvo nuspręsta išvystyti technologiją, kuri leistų daugianarės emulsijos fazes sumaišyti nešildant - taip apsaugant temperatūrai jautrius junginius nuo neigiamo poveikio.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Daugianarė emulsija su vynuogių kauliukų aliejumi ir kininio arbatmedžio lapų ekstraktu.
2.2. Tyrime naudotos medžiagos ir įranga
2.2.1. Daugianarių emulsijų gamyboje ir tyrimuose naudotos medžiagos:
1. Išgrynintas vanduo (Ph. Eur.01/2008:0008, LSMU laboratorija); 2. Vynuogių kauliukų aliejus (ASBOil, Lietuva);
3. Glicerolis (Ph. Eur. 01/2008:0496, Carl Roth GmbH & Co, Vokietija);
4. Polioksietilen(20)-sorbitano monooleatas „Tween 80“ (S.L. Scharlab, Ispanija); 5. Sorbitano monooleatas „Span 80“ (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
6. Natrio karboksimetilceliuliozė (Ph. Eur. 01/2008:0472, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
7. DL-α tokoferilacetatas (Vitaminas E) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); 8. 2-Fenoksietanolis (Ph. Eur. 01/2008:0781, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); 9. Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis) lapų ekstraktas (Kinija);
10. Junginių kokybinėje ir kiekybinėje analizėje naudotos medžiagos: Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 0,1% trifluoracto rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 99,8% acetonitrilas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).
2.2.2. Daugianarių emulsijų gamyboje ir tyrimuose naudota įranga:
1. Analitinės svarstyklės „Axis AD510“ (Axis, Lenkija);
2. Magnetinė maišyklė su kaitinimo elementu „IDL MSH-20A“ (Windaus Labortechnik GmbH & Co, Vokietija);
3. Termometras ‚,LCD Digital Portable Multi – Thermometer“ (Kinija); 4. Elektrinė maišyklė „ IKA EuroStar 200 digital“ („IKA – Works“,Vokietija); 5. Homogenizatorius „IKA T18 D“ („IKA – Works“,Vokietija);
6. Centrifuga „Sigma 3-18KS“ (Sigma®, Vokietija); rotorius 12131 7. pH-metras „WinLab“ (Windaus Labortechnik GmbH & Co, Vokietija);
8. Tekstūros analizatorius „TA.XT.plus“(Stable Micro Systems Ltd,Godalming,Surrey,JK); 9. Viskozimetras „Fungilab alpha“ (S.A. Fungilab, Italija);
10. Mikroskopas Motic® (Motic China Group Co.,Ltd.,Kinija)
11. Mikroskopinė kamera „Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0“ („Meyer instrument INC“; JAV); 12. Šaldytuvas su šaldikliu „Liebherr“ (Liebherr group, Vokietija);
13. Klimatinė spinta „Climacell MMM-Group“ (Medcenter Einrichtugen GmbH, Čekija) 14. Filtravimo popierius „Albet DP 400 125“ (S.L. Filalbet, Ispanija);
15. Ultragarso vonelė „Bandelin DT156HB“ (BANDELIN electronic GmbH & Co., Vokietija) 16. Spektrofotometras „Shimadzu UV-1800“ (Shimadzu corp., Japonija).
17. Chromatografas „Waters® e2695“ su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters®, JAV).
2.3. Tyrimo metodai
2.3.1. Daugianarių emulsijų gamyba dviejų etapų emulsinimo metodu
Gaminimo metodika parinkta apžvelgus literatūros šaltinius, tačiau tai nėra konkretaus tyrimo metodikos atkartojimas. Optimali mėginių sudėtis nustatyta eksperimentiniu būdu. Gaminama masės metodu.
1) Vidinė emulsija v/a - pasirinktas vandens (gryno arba su gliceroliu ir/ar hidrofiliniu emulsikliu) kiekis sumaišomas su aliejine faze (aliejus su lipofiliniu emulsikliu) su elektrine maišykle 1400 aps/min 10min. Jei į vidinę vandeninę fazę dedamas emulsiklis ir/ar glicerolis, mišinys iš pradžių pašildomas, iki kol tirpalas taps vienalytis, o tada atvėsinamas iki kambario temperatūros ir tik tada maišomas su aliejine faze.
2) Daugianarės emulsijos gamyba sudaryta iš dviejų žingsnių:
2.1) Išorinės vandeninės fazės gamyba - į išgrynintą vandenį dedamas hidrofilinis emulsiklis. Ant viršaus užbarstomas pasirinktas Na-KMC kiekis, palaukiama, kol išbrinks. Tada šildoma iki 60-70˚C, maišoma kol atvėsta, prieš pabaigą įlašinamas konservantas (jei naudojamas).
2.2) Galutinio produkto gamyba - vidinė emulsija v/a supilama į atvėsusią (<30˚C) išorinę fazę ir 4 min maišoma su elektrine maišykle 1000 aps/min 4min. Tada įlašinamas vitaminas E ir maišoma dar 1 min tuo pačiu greičiu.
2.3.2. Ekstrakto tirpalo gamyba
Ekstrakto tirpalas gaminamas sausą ekstraktą tirpinant distiliuotame vandenyje. Gamybai naudotas didžiausios galimos koncentracijos tirpalas, atsižvelgiant į tirpumą. 1g (tikslus svėrinys) sauso ekstrakto tirpinamas 10ml išgryninto vandens, vis įpilant po 10ml vandens papildomai, kol ekstraktas visiškai ištirpsta ir nelieka nuosėdų.
2.3.3. Kinetinio stabilumo tyrimas
Į tris 2 ml tūrio uždaromus mėgintuvėlius įdedamas vienodas kiekvienos tiriamos emulsijos kiekis. Vidinės emulsijos (v/a) buvo vertinamas centrifugoje 5 minutes sukant 3000 aps/min greičiu, esant 23±2˚C temperatūrai. Tada stabilios emulsijos dar kartą tiriamos 5 minutes sukant 10000 aps/min greičiu. Daugianarės emulsijos tiriamos tik esant 3000 aps/min greičiui 5 minutes. Ieškomas nestabilumo požymis - atsiskyrusios fazės.
2.3.4. Šaldymo-šildymo ciklų testas
Į tris 2 ml tūrio uždaromus mėgintuvėlius įdedamas vienodas kiekvienos šviežiai pagamintos emulsijos kiekis. Mėginiai parai patalpinami į šaldiklį (-18˚C). Po to parą laikomi kambario temperatūroje. Po šios paros atliekamas pagreitintos koalescencijos testas - centrifugavimas 5 minutes esant 3000 aps/min greičiui. Emulsinės sistemos stabilumas vertinamas vizualiai pagal fazių atsiskyrimą. Mėgintuvėliai su stabilia (neišsisluoksniavusia) emulsija vėl dedami šaldyti. Ciklas kartojamas, kol pasireiškia mėginių nestabilumas, o jei nepasireiškia - ne daugiau 5 kartų.
2.3.5. pH reikšmės nustatymas
Norint nustatyti daugianarių emulsijų pH reikšmes, kiekvieno tyrimo metu paruošiamas 5 proc. koncentracijos tiriamasis tirpalas, tiriamą emulsiją sumaišant su išgrynintu vandeniu. Gautas tirpalas filtruojamas pro filtravimo popierių ir matuojama pH reikšmė. Prieš kiekvieną matavimą pH-metro elektrodai nuplaunami išgrynintuoju vandeniu. Kiekviena pagaminta emulsija kiekvieną kartą buvo matuojama po 3 kartus. Rezultatai pateikiami išvedus aritmetinį vidurkį ir su standartiniu nuokrypiu.
2.3.6. Dinaminės klampos nustatymas
Vienodas 20 ml tiriamųjų bandinių kiekis buvo matuojamas laboratorinėje stiklinėlėje (2,5 cm skersmens ir 6,5 cm aukščio). Klampa buvo matuojama rotacinius klampomačiu esant 60 aps/min suklio greičiui. Daugianarės emulsijos klampos matavimui pasirinktas L4 suklys. Tyrimo metu mėginių temperatūra 23±2˚C. Kiekvienas mėginys matuotas 3 kartus, iš rezultatų išvestas aritmetinis vidurkis, apskaičiuotas standartinis nuokrypis.
2.3.7. Tekstūros analizė
Tekstūra tirta dviem metodais: tepumo ir grįžtamojo išstūmimo. 1) Tepumo testas:
Naudojant kompiuterinę programą „Exponent“ buvo išmatuojami tekstūros parametrai: deformacijos jėga (maksimali jėga) ir šlytis (plotas po kreive). Matavimui naudotas kūgio formos
HDP/SR zondas. Parinkti parametrai: 15 mm gylis, 3,0 mm/s greitis. Kiekvienas bandymas kartotas 3 kartus, apskaičiuotas vidurkis ir standartinis nuokrypis.
2) Grįžtamojo išstūmimo testas:
Naudojant kompiuterinę programą „Exponent“ buvo išmatuojami šie tekstūros parametrai: tvirtumas (maksimali jėga), konsistencija (plotas po kreive), lipnumas (maksimali neigiama jėga) ir klampos indeksas (plotas virš neigiamos kreivės). Parinkti parametrai: 15 mm išstūmimo gylis, testo atlikimo greitis - 2,0 mm/s. Kiekvienas bandymas kartotas 3 kartus, apskaičiuotas vidurkis ir standartinis nuokrypis.
2.3.8. Mikroskopinė analizė
Siekiant nustatyti daugianarių emulsijų stabilumą pagal lašelių skersmenį ir jo pokytį, buvo vertinamas emulsinių lašelių dydis. Preparatas paruošiamas ant objektinio stiklelio paskleidžiant labai ploną emulsijos sluoksnį ir gerai prispaudžiant dengiamuoju stikleliu. Naudotas 100x didinamasis lęšis (mėginys padidinamas 1000 kartų). Lašelių dydžio analizė buvo atliekama naudojant elektroninį mikroskopą „Motic®“, mikroskopinę kamerą „Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0“ ir kompiuterinę programą ‚,Motic Images Plus 2.0‘‘ pamatuojant 20 vyraujančių emulsinių lašelių (aliejaus ir vandens) skersmenis vienodame matavimo plote. Rezultatai pateikiami išvedus aritmetinį vidurkį su standartiniu nuokrypiu.
2.3.9. Ekstrakto junginių nustatymas emulsijoje
Junginiai, lemiantys emulsijos farmakologinį aktyvumą – polifenoliai ir metilksantinai (kofeinas), dėl to buvo nuspręsta bendrą fenolių kiekį tirti naudojant spektrofotometriją, o kofeino kiekį - efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC). Abiems tyrimams gamintas 10% emulsijos tirpalas, ją sumaišant su distiliuotu vandeniu, naudojant ultragarsą (23±2˚C). Maišoma 30 min, tada centrifuguojama 14000 aps/min 5 minutes (23±2˚C), nusiurbiamas atsiskyręs skaidrėjantis emulsijos tirpalo sluoksnis ir šis vėl centrifuguojamas tomis pačiomis sąlygomis, kol atsiskiria beveik skaidrus skystis. Atskirtastirpalas filtruojamas pro mikrofiltrą (porų dydis 0,45µm).
1) Spektrofotometrinis bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Šis nustatymas atliekamas naudojant standartinį Folin-Ciocalteu reagentą vertinant pagal GRE mg/ml (galo rūgšties ekvivalento miligramai grame). Atliekama reakcija: 2,5 ml skiesto (1:10) Folin-Ciocalteu reagento tirpalo sumaišoma su 0,5 ml paruošto tiriamo tirpalo ir 2 ml 7,5% natrio karbonato tirpalo. Atsiradusi mėlynai žalia spalva įrodo fenolinių junginių buvimą tirpale. Paruošti mėginiai buvo matuojami po 30 min, 765 nm bangos ilgyje. Kiekvienas tiriamas mėginys tirtas 3 kartus, rezultatai pateikiami išvedus aritmetinį vidurkį su standartiniu nuokrypiu.
Naudota kolonėlė: ACE C 18 (ilgis 250 mm, skersmuo 4,6 mm, porų dydis 5 µm). Injekcijos tūris - 10 µl, mobiliosios fazės greitis - 1,23 ml/min, temperatūra tyrimo metu - 25˚C. Tyrimo metu naudota gradientinė mobiliosios fazės sistema, sudaryta iš tirpalų A (0,1% trifluoracto rūgštis) ir B (99,8% acetonitrilas). Kofeinas identifikuotas pagal standarto sulaikymo laiką ir UV absorbcijos atitikimą 270 nm bangos ilgyje. Eliuentų tėkmės gradientas parodyta lentelėje (Lentelė 2.1).
Lentelė 2. 1. Eliuentų gradiento kitimas tyrimo metu.
Laikas, min
2 35 40 45 46
A (0,1% trifluoracto r.), % 100,0 70,0 10,0 10,0 100,0 B (99,8% acetonitrilas), % 0,0 30,0 90,0 90,0 0,0
Rezultatai apdoroti naudojant programinę įrangą „Empower 3 Chromatography Data Software“ (Waters®
, JAV).
2.3.10. Stabilumo tyrimai
Stabilumo tyrimai buvo atliekami po 2, 4 ir 8 savaičių nuo daugianarių emulsijų pagaminimo. Stabilumo tyrimų metu buvo vertinama, kaip kito emulsijų išvaizda, tekstūra, pH reikšmės ir dinaminė klampa, mėginius laikant kambario 25±2˚C temperatūroje ir pagreitinto sendinimo klimatinėje spintoje (40±2˚C, santykinė drėgmė 75±5%). Gauti rezultatai buvo lyginami su eksperimento pradžioje pagamintų emulsijų tyrimų rezultatais.
2.3.11. Statistinė analizė
Tyrimų metu gauti duomenys buvo apdoroti su Microsoft® Office Excel 2007 programa. Su šia
programa išvesti aritmetiniai vidurkiai, apskaičiuota standartinė paklaida. Statistinio reikšmingumo nustatymui pasirinktas duomenų analizės metodas - porinis Stjudento t kriterijus. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, jei p < 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Stabilios vidinės emulsijos v/a sudėties sudarymas
Vidinės emulsijos buvo gaminamos pagal 2.3.1 skyriuje aprašytą daugianarės emulsijos gamybą. Sudėtinių dalių santykis buvo renkamas eksperimentiškai. Stabiliomis laikytos tos emulsijos, kurios neišsisluoksniavo centrifuguojant (skyrius 2.3.3). Emulsijų sudėtis ir centrifugavimo rezultatai pateikti lentelėje (Lentelė 3.1).
Lentelė 3. 1. Vidinės emulsijos sudėtis (%) ir centrifugavimo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - fazės atsiskyrė.
Emulsijos v/a nr.
Išgrynintas vanduo
Tvinas 80 Glicerolis Aliejus Spanas 80 3000 aps/min 5min 10000 aps/min 5min V1 33,3 0 0 55,6 11,1 + - V2 33,3 0 0 44,5 22,2 - - V3 33,3 0 0 50,0 16,7 + - V4 33,3 0 0 51,1 15,6 + - V5 33,3 0 0 53,4 13,3 + - V6 33,3 0 0 56,4 10,2 + - V7 22,2 0 11,1 51,1 15,6 - - V8 33,1 0,2 0 51,1 15,6 + - V9 28,9 0 4,4 51,1 15,6 + - V10 28,7 0,2 4,4 51,1 15,6 + - V11 31,6 5,3 0 48,4 14,7 + + V12 27,4 5,3 4,2 48,4 14,7 + + V13 28,3 2,2 4,3 50,0 15,2 + + V14 32,6 2,2 0 50,0 15,2 + +
Emulsijos V6, V9, V10, V11, V12 papildomai dar buvo homogenizuotos IKA T18 D homogenizatoriumi 3min, tačiau rezultatai nepasikeitė, dėl to buvo nuspręsta šio žingsnio atsisakyti. Stabiliausios emulsijos (V11, V12, V13, V14) pakartotinai buvo patikrintos po 8 sav. Emulsijos V11 ir V12 buvo tirščiausios, tačiau net be centrifugavimo paviršiuje matėsi keli atsiskyrusios fazės lašai. Emulsijos V13 ir V14 išliko nepakitusios ir atlaikė centrifugavimą, dėl to tolimesni tyrimai vykdyti su jomis.
3.2. Daugianarės emulsijos v/a/v sudėties sudarymas
Daugianarės emulsijos gamintos pagal 2.3.1. skyriuje aprašytą daugianarės emulsijos gamybą. Sudėtinių dalių santykis buvo renkamas eksperimentiškai. Vidinė emulsija su išorine faze maišoma apytiksliai santykiu 9:11. Stabiliomis laikytos tos emulsijos, kurios neišsisluoksniavo centrifuguojant (skyrius 2.3.3). Emulsijų sudėtis ir centrifugavimo rezultatai pateikti lentelėje (Lentelė 3.2).
Lentelė 3. 2. Daugianarės emulsijos sudėtis (%) ir centrifugavimo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - fazės atsiskyrė. Emulsijos v/a/v nr. Išgr. vanduo Tvinas 80
Glicerolis Aliejus Spanas 80 Išgr. vanduo Tvinas 80 Na-KMC 3000 aps/min 5min D1 15 1 0 23 7 49 5 0 - D2 13 1 2 23 7 49 5 0 - D3 15 1 0 23 7 47,4 5 1,6 + D4 13 1 2 23 7 47,4 5 1,6 + D5 15 1 0 23 7 46,8 5 2,2 + D6 13 1 2 23 7 46,8 5 2,2 +
Kadangi emulsijos D1 ir D2 buvo kinetiškai nestabilios ir labai skystos (grietinėlės konsistencijos), buvo nuspręsta į emulsiją įdėti tirštiklio-stabilizatoriaus - Na-KMC (natrio karboksimetilceliuliozės). Buvo pagaminti 3 % (emulsijos D3, D4) ir 4% (emulsijos D5, D6) Na-KMC išorinės fazės tirpalai.
Šių keturių sudėčių emulsijos liko stabilios po centrifugavimo. Dėl to su jomis atliktas šaldymo-šildymo ciklų testas pagal 2.3.4. skyriuje aprašytą metodiką. Tyrimo rezultatai pateikti lentelėje (Lentelė 3.3).
Emulsijos v/a/v nr. Ciklo Nr.
1 2 3 4 5
D3 - - - - -
D4 + + + + +
D5 - - - - -
D6 + - - - -
Lentelė 3. 3. Šaldymo-šildymo ciklų testo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - emulsija išsisluoksniavo
Šaldymo-šildymo ciklų testas parodė, kad stabiliausia yra emulsija D4, sudėtyje turinti 2% glicerolio ir 1,6% Na-KMC. Nestabiliausios buvo D3 ir D5 emulsijos, sudėtyje neturinčios glicerolio. Tai parodė, kad glicerolis stiprina Na-KMC kristalizacijos kontrolės savybes.
Pakartotinai gaminant emulsijas paaiškėjo, kad emulsijas D5 ir D6 sudėtinga pagaminti, nes išorinei fazei atvėsus (<30˚C), ši sunkiai susimaišo su vidine emulsija. Dėl to buvo nuspręsta tyrimus tęsti su emulsijomis D3 ir D4.
3.3. Šviežiai pagamintų v/a/v emulsijų savybių analizė
Pagamintos daugianarės emulsijos tą pačia dieną buvo tiriamos pagal 2.3. skyriuje aprašytas metodikas. Įvertinti rodikliai - kinetinis stabilumas (2.3.3) - aprašytas ankstesniame skyriuje, dinaminė klampa (2.3.6), deformacijos jėga (2.3.7), šlytis (2.3.7), tvirtumas (2.3.7), konsistencija (2.3.7), lipnumas (2.3.7), klampos indeksas (2.3.7), pH reikšmė (2.3.5) ir lašelių dydis (2.3.8). Tyrimų rezultatų aritmetiniai vidurkiai su standartiniu nuokrypiu pateikti lentelėje (Lentelė 3.4):
Lentelė 3. 4. Šviežiai pagamintų emulsijų rodikliai. * - statistiškai reikšmingas skirtumas emulsijas lyginant tarpusavyje.
Parametras D3 D4
Dinaminė klampa, Pa·s 3,58 ± 0,02 3,63 ± 0,05
Deformacijos jėga, g 21,98* ± 0,34 29,27* ± 1,56 Šlytis, g·s 8,78* ± 0,22 14,15* ± 0,98 Tvirtumas, g 37,03 ± 0,42 37,6 ± 0,50 Konsistencija, g·s 269,86 ± 0,51 269,35 ± 2,52 Lipnumas, g -21,37* ± 0,40 -20,03* ± 0,20 Klampos indeksas, g·s -122,65 ± 5,25 -138,11 ± 5,97 pH reikšmė 6,06* ± 0,02 5,93* ± 0,01
Aliejaus lašelis (išorinis), µm 5,3* ± 0,0,77 5,0* ± 0,94
Vandens lašelis (vidinis), µm 3,1* ± 0,60 2,6* ± 0,80
Vidinio/išorinio santykis 0,58* ± 0,08 0,50* ± 0,08
Atlikti tyrimai parodė, jog emulsija, sudėtyje turinti glicerolio (D4) pasižymėjo statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesne deformacijos jėga ir didesne šlytimi. Taip pat ši emulsija pasižymėjo statistiškai reikšmingai mažesniu lipnumu ir lašelių (vandens ir aliejaus) dydžiu, žemesne pH reikšme. Emulsija be glicerolio (D3) pasižymėjo mažesne klampa, mažesniu tvirtumu ir klampos indeksu bei aukštesniu konsistencijos rodikliu, tačiau šie skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05).
3.4. Kininio arbatmedžio ekstrakto tirpalo gaminimas ir įterpimas į v/a/v emulsiją.
Kininio arbatmedžio ekstrakto tirpalas gamintas pagal 2.3.2. skyriuje aprašytą metodiką. Gautas rezultatas - 1g ekstrakto ištirpo 60-yje gramų išgrynintojo vandens. Gauto tirpalo koncentracija - 1,6%. Kadangi šio tirpalo negalima šildyti, glicerolis ir emulsiklis tvinas 80 buvo sumaišomi su nedideliu kiekiu išgryninto vandens, atvėsinami, tik tada sumaišomi su ekstrakto tirpalu ir toliau gaminama emulsija. Emulsijų v/a/v su ekstraktu sudėtis ir centrifugavimo rezultatai nurodyti lentelėje (Lentelė 3.5).
Lentelė 3. 5. Daugianarių emulsijų su kininio arbatmedžio ekstraktu sudėtis (%) ir centrifugavimo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - fazės atsiskyrė.
Emulsi jos v/a/v nr. Ekstrak-to 1,6% tirpalas Išgr. vand. Tvinas 80 Glice-rolis Alie -jus Spanas 80 Išgr. vand. Tvinas 80 Na-KMC 3000 aps /min 5min D3E 10 5 1 0 23 7 47,4 5 1,6 + D3E2 10 5 2 0 23 7 46,4 5 1,6 + D4E2 10 3 2 2 23 7 46,4 5 1,6 +
Emulsija D3E išliko stabili po centrifugavimo, tačiau buvo labai skystos konsistencijos, akivaizdžiai skystesnė, nei emulsija D3 (be ekstrakto). Tikėtina, kad taip atsitiko dėl polifenolių sąveikos su makromolekulėmis [12]. Dėl to buvo nuspręsta padvigubinti emulsiklio kiekį vidinėje emulsijoje. Kad sudėtis skirtųsi tik vienu kintamuoju (gliceroliu), buvo nuspręsta emulsiją su gliceroliu iš karto gaminti su 2% tvino 80 (vidinėje vandeninėje fazėje). Abi šios emulsijos (D3E2 ir D4E2) išliko stabilios po centrifugavimo.
Atlikus šaldymo-šildymo ciklų testą (Lentelė 3.6) paaiškėjo, kad ekstraktas neturėjo įtakos temperatūrinio jautrumo pokyčiui - emulsija, sudėtyje turinti glicerolio (D4E2) išliko stabili visus 5 ciklus.
Lentelė 3. 6. Šaldymo-šildymo ciklų testo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - emulsija išsisluoksniavo.
Emulsijos v/a/v nr. Ciklo Nr.
1 2 3 4 5
D3E - - - - -
D3E2 - - - - -
3.5. Šviežiai pagamintų v/a/v emulsijų su C. sinensis ekstraktu emulsijų savybių
analizė
Pagamintos daugianarės emulsijos su kininio arbatmedžio ekstraktu tą pačia dieną buvo tiriamos pagal 2.3. skyriuje aprašytas metodikas. Įvertinti rodikliai - kinetinis stabilumas (2.3.3), dinaminė klampa (2.3.6), deformacijos jėga (2.3.7), šlytis (2.3.7), tvirtumas (2.3.7), konsistencija (2.3.7), lipnumas (2.3.7), klampos indeksas (2.3.7), pH (2.3.5) lašelių dydis (2.3.8), ekstrakto kiekis emulsijoje (3.3.9) - rezultatai aprašomi 3.8. skyriuje.
Emulsija D3E buvo per skysta, kad ta pačia metodika būtų galima nustatyti jėgą, reikalingą mėginiui deformuoti, tvirtumą, konsistenciją, lipnumą ir klampos indeksą, dėl to šie tyrimai nebuvo atliekami. Šioje emulsijoje buvo tiriama tik dinaminė klampa, pH ir lašelių dydis bei jų santykis. Tyrimų rezultatų aritmetiniai vidurkiai su standartiniais nuokrypiais pateikti lentelėje (Lentelė 3.7).
Lentelė 3. 7. Šviežiai pagamintų emulsijų su kininio arbatmedžio ekstraktu rodikliai. * - statistiškai reikšmingas skirtumas emulsijas lyginant tarpusavyje. ** statistiškai reikšmingas skirtumas emulsiją lyginant su atitinkamos sudėties be
ekstrakto.
Parametrai D3E D3E2 D4E2
Dinaminė klampa, Pa·s 2,41* ** ± 0,10 3,78* ± 0,06 5,02* ** ± 0,02
Deformacijos jėga, g - 23,66* ± 1,87 32,63* ± 0,79 Šlytis, g·s - 9,94* ± 1,15 15,77* ± 0,40 Tvirtumas, g - 37,15* ± 0,48 41,93* ** ± 0,0,51 Konsistencija, g·s - 273,54* **± 0,91 306,80 * **± 0,94 Lipnumas, g - -22,02* ** ± 0,24 -27,85 * ** ± 0,70 Klampos indeksas, g·s - -131,83* ** ± 2,82 -169,79* ** ± 0,92 pH reikšmė 5,86** ± 0,02 5,88* **± 0,01 5,64* ** ± 0,01
Aliejaus lašelis (išorinis),
µm 5,9* ** ± 0,84 6,3* ± 0,88 5,4* ** ± 1,25
Vandens lašelis (vidinis),
µm 2,9 ± 0,55 3,3 ± 0,73 3,3** ± 0,95
Vidinio/išorinio santykis 0,49** ± 0,05 0,52* ** ± 0,08 0,60* ** ± 0,10
Atlikti tyrimai parodė, kad emulsija, sudėtyje turinti glicerolio (D4E2), pasižymėjo statistiškai reikšmingai (p<0,05) mažiausiu pH. Tarp D3E ir D3E2 emulsijų pH nebuvo reikšmingo skirtumo. D4E2 taip pat pasižymėjo statistiškai reikšmingai didesne dinamine klampa, deformacijos jėga, šlytimi, tvirtumu, konsistencija, lipnumu, klampos indeksu bei vidinio/išorinio lašelių santykiu. Ekstrakto įdėjimas į emulsiją (D3E) pasireiškė statistiškai reikšmingai (p<0,05) mažesne dinamine klampa bei didesniais aliejaus lašeliais ir vidinio/išorinio lašų santykio mažėjimu.
3.6. Emulsijų stabilumo tyrimas ilgalaikio laikymo sąlygomis
Emulsijos D3, D4, D3E, D3E2 ir D4E2 pagamintos stabilumo vertinimui, sudėtyje turėjo 0,3% Vitamino E ir 0,7% konservanto 2-fenoksietanolio. Šios emulsijos buvo laikomos spintoje laboratorijoje, apsaugotos nuo tiesioginių saulės spindulių, 25±2˚C temperatūroje.
Centrifugavimo testas stabilumo tyrimo metu
Norint įvertinti daugianarių emulsijų kinetinį stabilumą, atliktas pagreitintos koalescencijos testas pagal 2.3.3. skyriuje aprašytą metodiką. Rezultatai pateikti lentelėje (Lentelė 3.8). Visos 5 emulsijos išliko kinetiškai stabilios visų matavimų metų.
Lentelė 3. 8. Centrifugavimo rezultatai. „+“ - emulsija stabili, „-“ - emulsija išsisluoksniavo. Mėginys D3 D4 D3E DE2 D4E2
Šviežias + + + + +
Po 2 sav. + + + + +
Po 4 sav. + + + + +
Po 8 sav. + + + + +
Dinaminės klampos analizė
Dinaminė emulsijų klampa buvo matuojama pagal 2.3.6. skyriuje aprašytą metodiką. Rezultatų aritmetiniai vidurkiai su standartiniais nuokrypiais pateikiami diagramoje (Pav. 3.1).
Pav. 3. 1. Dinaminės klampos pokytis. 0 - statistiškai reikšmingas (p<0,05) pokytis nuo paskutinio matavimo; * - statistiškai reikšmingas (p<0,05) pokytis per 8 savaites.
Per 8 savaites kiekvienoje tiriamoje emulsijoje įvyko statistiškai reikšmingi (p<0,05) pokyčiai. Labiausiai pakito D3E2 emulsijos klampa - padidėjo 33,6% (nuo 3,78±0,06 Pa·s iki 5,13±0,01 Pa·s). Šiek tiek mažiau (35,7%) padidėjo kitos emulsijos su ekstraktu ir be glicerolio D3E
0 1 2 3 4 5 6
D3* D4* D3E* D3E2* D4E2*
K
lam
pa,
Pa·s
Dinaminės klampos pokyčio priklausomybė nuo
laikymo trukmės
0 sav. 2 sav. 4 sav. 8 sav. 0 0 0 0 0 0 0klampa - nuo 2,41±0,10 Pa·s iki 3,22±0,01 Pa·s. 15,5% Padidėjo D4E2 klampa (nuo 5,02±0,02 Pa·s iki 5,80±0,01 Pa·s). Emulsijų be ekstrakto (D3 ir D4) klampa sumažėjo - atitinkamai 14,3% ir 11,7% (nuo 3,58±0,02 Pa·s iki 3,16± 0,08 Pa·s ir nuo 3,63±0,05 Pa·s iki 3,11±0,08 Pa·s). Tyrimų rezultatai rodo, kad glicerolis emulsijoje be ekstrakto spartina klampos mažėjimą, o emulsijoje su ekstraktu - lėtina klampos didėjimą. Ekstrakto įterpimas skatina klampos didėjimą.
pH reikšmės matavimas
Daugianarių emulsijų pH reikšmė buvo tiriama pagal 2.3.5. skyriuje aprašytą metodiką. Beveik visų emulsijų pH reikšmės sumažėjo [49,50]. Tyrimo rezultatai (Pav. 3.2) parodė, kad mažiausiai (0,4%) pasikeitė D4E2 pH reikšmė (nuo 5,64±0,01 iki 5,66±0,05). Ryškiausi pokyčiai buvo D3E (8,3%) ir D3E2 (6,9%) emulsijose (atitinkamai nuo 5,86±0,02 iki 5,38±0,03 ir nuo 5,88±0,01 iki 5,48±0,01). D3 ir D4 emulsijų pH reikšmės sumažėjo reikšmingai, tačiau ne tiek daug kaip pastarųjų, atitinkamai nuo 6,06±0,02 iki 5,78±0,02 (pokytis 4,5%) ir nuo 5,93±0,03 iki 5,78±0,02 (pokytis 2,5%). Šie rezultatai parodo, kad glicerolis mažina pradinę emulsijos pH reikšmę, tačiau pokytis per laiko tarpą yra mažesnis, nei emulsijose be glicerolio. Ekstrakto įterpimas į emulsiją mažina jos pradinę pH reikšmę ir didina šio rodiklio nestabilumą, spartesnį pokytį.
Pav. 3. 2. pH reikšmės pokytis. 0 - statistiškai reikšmingas (p<0,05) pokytis nuo paskutinio matavimo; * - statistiškai reikšmingas (p<0,05) pokytis per 8 savaites.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5
D3* D4* D3E* D3E2* D4E2
pH
