LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
JOVITA TATOL
PUSKIEČIO PREPARATO SU IMBIERO (ZINGIBER OFFICINALE R.)
EKSTRAKTU TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc.dr. Saulė Velţienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas dr. prof. Vitalis Briedis Data
PUSKIEČIO PREPARATO SU IMBIERO (ZINGIBER OFFICINALE R.)
EKSTRAKTU TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Saulė Velţienė Data
Recenzentas
Doc. dr. Rūta Marksienė Data Darbą atliko Magistrantė Jovita Tatol Data KAUNAS, 2017
TURINYS
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1. Tikrojo imbiero bendra charakteristika ... 12
1.2. Augalo cheminė sudėtis ... 13
1.3. Tikrojo imbiero biologinis aktyvumas ... 14
1.3.1. Tikrojo imbiero poveikis odai ... 17
1.4. Odos struktūra ir skvarba pro odą ... 18
1.5. Tikrojo imbiero preparatai ... 19
1.6. Tikrojo imbiero ekstraktai ... 19
1.7. Ekstrakcijos metodai ... 20
1.7.1. Ekstrakcija ultragarsu ... 20
1.7.2. Ekstrakcija purtyklėje ... 21
1.7.3. Ekstrakcija naudojant magnetinę maišyklę ... 21
1.8. Gingerolių ir šogaolių analizės metodai ... 21
1.9. Puskietės vaisto formos - tepalai ... 22
1.10. Modeliuojamo emulsinio tepalo (v/a) pagalbinių medţiagų savybės ... 23
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 25
2.1. Tyrimų objektas ... 25
2.2. Tyrime naudojamos medţiagos ... 25
2.3. Tyrime naudojama įranga ... 25
2.4. Tyrimo eigos planas ... 26
2.5. Imbiero skystųjų ekstraktų gamyba ... 27
2.5.1. Ţaliavos paruošimas ... 27
2.5.2. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 28
2.5.3. Ekstrakcijos proceso parinkimas dinaminės maceracijos ultragarsinėje vonelėje būdu 28 2.6. Imbiero tirštojo ekstrakto gamyba ... 28
2.7.1. Imbiero ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu ... 29
2.7.2. Imbiero ekstraktų veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu ... 29
2.7.3. Imbiero ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu ... 30
2.8. Pusiau kietų preparatų (tepalų) modeliavimas ir gamyba ... 30
2.8.1. Absorbcinio pagrindo gamyba ... 30
2.8.2. Tepalo su skystuoju imbiero ekstraktu gamyba ... 31
2.8.3. Tepalo su tirštuoju imbiero ekstraktu gamyba ... 31
2.9. Pusiau kietų preparatų su imbiero ekstraktų kokybės vertinimas ... 32
2.9.1. pH reikšmės nustatymas ... 32
2.9.2. Centrifugavimo testas ... 32
2.9.3. Klampos nustatymas ... 32
2.9.4. Tekstūros analizė ... 32
2.9.5. Tepalų mikroskopinis tyrimas ... 33
2.9.6. Emulsinio tepalo tipo nustatymas ... 33
2.9.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 33
2.9.8. Stabilumo tyrimai ... 33
2.9.9. Statistinė analizė ... 34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
3.1. Tikrojo imbiero skystųjų ekstraktų gamybos sąlygų parinkimas ir kokybės vertinimas ... 35
3.2. Tikrojo imbiero tirštojo ekstrakto gamyba ir kokybės vertinimas ... 40
3.3. Puskiečių vaisto formų su imbiero ekstraktu modeliavimas ... 40
3.4. Emulsinių tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu tipo nustatymas ... 43
3.5. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu pH nustatymas ... 43
3.6. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu klampos nustatymas ... 44
3.7. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu tekstūros analizė ... 45
3.8. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 47
3.9. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero vienalytiškumo vertinimas ... 48
3.10. Tepalų su skystuoju ir tirštuoju imbiero ekstraktu stabilumo tyrimai ... 51
3.10.1. Centrifugavimo testas stabilumo tyrimų metu ... 52
3.10.2. Klampos pokyčiai stabilumo tyrimų metu ... 52
3.10.3. pH reikšmių pokyčiai stabilumo tyrimų metu... 53
3.10.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas stabilumo tyrimų metu ... 55
IŠVADOS ... 57
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 58
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 59
SANTRAUKA
J. Tatol magistro baigiamasis darbas ,,Puskiečio preparato su imbiero (Zingiber officinale R.) ekstraktu technologija ir kokybės vertinimas“/ mokslinio darbo vadovė doc. dr. S. Velţienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. -Kaunas, 2017.
Tyrimo tikslas: sumodeliuoti puskietes vaisto formas su skystuoju bei tirštuoju tikrojo imbiero ekstraktu ir įvertinti jų kokybę.
Uţdaviniai: Apţvelgti mokslinėje literatūroje nurodomą tikrojo imbiero šakniastiebių biologinį aktyvumą ir įvertinti pritaikymo galimybes puskiečių vaisto formų modeliavime. Parinkti ekstrakcijos būdą, etanolio koncentraciją ir ekstrakcijos laiką, vertinant suminį fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu bei biologiškai aktyvių junginių kiekį - efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Pagaminti stabilius puskiečius preparatus su skystuoju ir tirštuoju tikrojo imbiero ekstraktu bei įvertinti jų kokybę centrifuguojant, tiriant tekstūrą, vienalytiškumą, nustatant klampą, pH reikšmes ir antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti puskiečių preparatų stabilumą laikymo metu.
Tyrimo metodai: imbiero ekstraktų kokybė įvertinta spektrofotometriniu metodu nustatant fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą DPPH radikalų inaktyvinimo metodu. Imbiero ekstraktuose esančių biologiškai aktyvių medţiagų (6-gingerolio ir 6-šogaolio) kiekis nustatomas ESC metodu. Imbiero puskiečių preparatų kokybė įvertinta matuojant pH reikšmę, klampą, mikroskopuojant nustatomas vienalytiškumas, atliekamas centrifugavimas, tekstūros analizė, antioksidacinis aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu.
Tyrimo objektas: puskiečiai odos preparatai su skystuoju arba tirštuoju imbiero ekstraktu.
Tyrimo rezultatai ir išvados: daugiausiai fenolinių junginių (1,809 ± 0.01 GREmg/ml) išekstrahuota ultragarsu, ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį ir ekstrakciją vykdant 60 min. ESC metodu nustatyta, jog 6-gingerolio kiekis (820±3,51 µg/ml) imbiero ekstrakte didesnis nei 6-šogaolio (163±2,65 µg/ml).
Sumodeliuoti emulsiniai v/a tepalai atitiko fiziologinius odos pH reikšmės parametrus, tepumo savybės gerėjo, didėjant ekstrakto koncentracijai juose, o priimtinesne tekstūra, bet didesne klampa pasiţymėjo tepalai su tokiu pačiu kiekiu skystojo imbiero ekstrakto nei tirštojo. Puskiečių preparatų emulsinių lašelių dydis didėjo, didėjant ekstrakto koncentracijai tepale. Atlikus stabilumo tyrimus, kokybės parametrai maţiausiai kinta ir preparatai išlieka stabilūs, kai tepalo sudėtyje yra 25 proc. skystojo arba 10 proc. tirštojo imbiero ekstrakto. Antioksidacinis aktyvumas labai stipriai koreliuoja (r=0,99) su tepalo sudėtyje esančia imbiero ekstrakto koncentracija. Antioksidacinio aktyvumo rezultatai po 3 mėn. kito statistiškai reikšmingai (p<0,05).
SUMMARY
J. Tatol„s Master„s thesis ,,Technology and quality evaluation of topical semisolid dosage forms with Zingiber officinale R. extract“/ scientific supervisor doc. Dr. S. Velţienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Drug Technology and Social Pharmacy. – Kaunas.
Aim: to make semi-solid dosage forms using liquid and semi-solid ginger extract, and to assess its quality.
Objectives: To review scientific literature about ginger rhizome bioactivity, and to assess its utility in making semi-solid formulations. To determine extraction technique, ethanol concentration, and extraction time, by assessing number of phenolic compounds, and antioxidant activity using spectrophotometric analysis. The number of active compounds was assessed using chromatography method. To create stable semi-solid products with liquid and semi-solid ginger extract, and to assess their quality by centrifugation, examining the texture, smoothness, assessing viscosity, pH means, and antioxidant activity. To assess semisolid product stability.
Methods used: ginger extract quality was tested using spectrophotometric analysis by determining the number of phenolic compounds, and assessing antioxidant activity by DPPH free radical scavenging method. The concentration of the 6-gingerol and 6-shogaol in ginger extracts was measured using the HPLC method. The quality of semi-solid dosage form was assessed by measuring pH, viscosity. The microscope was used to determine smoothness. Centrifugation, texture analysis and antioxidant activity determination took place as well.
Objective: topical semi-solid dosage forms with liquid or semi-solid ginger extract.
Results and discussion: the most phenolic compounds (1,809 ± 0.01 GAEmg/ml) were extracted using ultrasound, where the extractant was 70 per cent ethanol, and the extraction was 60 min. long. By using the HPLC method, it was found that the amount of 6-gingerol (820±3,51 µg/ml) in ginger extract is greater than 6-shogaol (163±2,65 µg/ml). The ointment that was formed in the process matched the required pH skin parameters. The ease of spread was improving as the concentration of the extract was increasing. The products that were marked by more favourable texture yet higher viscosity were the products that had the same amount of liquid extract but not the semi-solid extract. The size of the emulsion drops of ointment were increasing as the extract concentration was increasing in a product. As shown by the stability analysis, the quality parameters change the least and the products remain stable when the product contains 25 per cent liquid or 10 per cent semi-solid ginger extract. The antioxidant activity has a strong correlation (r=0,99) with the ginger extract concentration in the product. The results of antioxidant activity testing after three months have changed statistically significant (p<0,05).
PADĖKA
Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos bei Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros darbuotojams.
Norėčiau padėkoti savo darbo vadovei, doc. dr. Saulei Velţienei, uţ konsultacijas ir palaikymą rengiant farmacijos magistro darbą. Uţ pagalbą ir patarimus dėkoju doc. dr. Zenonai Kalvėnienei, doc.dr. Giedrei Kasparavičienei ir lektoriui Mindaugui Marksai.
SANTRUMPOS
% - procentai
˚C – temperatūra Celcijaus laipsniais µM - mikromoliai
a/v – aliejus vandenyje
AA - antioksidacinis aktyvumas
aps./min – apsisukimų skaičius per minutę CNS – centrinė nervų sistema
COX - ciklooksigenazė Da – daltonai
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija g·s – gramai per sekundę
GRE - galo rūgšties ekvivalentas IL - interleukinai
mėn. – mėnesiai
mgGRE/ml – miligramai mililitre išreikšti pagal galo rūgšties ekvivalentą NF-κB –transkripcijos branduolio faktorius kapa
nm - nanometrai
NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo p – statistinio reikšmingumo lygmuo
Pa·s – paskalis per sekundę pav. – paveikslas
pH – vandenilio jonų ( H+) koncentracijos tirpale matas Ph. Eur. – Europos farmakopėja
ROS – reaktyvios deguonies formos UVB – ultravioletiniai B spinduliai v/a – vanduo aliejuje
val. - valandos ʎ - bangos ilgis
ĮVADAS
Su raumenų, sąnarių skausmu ar patempimu susiduria kiekvienas. Nemalonūs pojūčiai gali atsirasti po sporto, dėl nepatogios darbo pozicijos, keliaujant ar kasdieninės veiklos metu, netaisyklingai atliekant judesius, taip pat esant traumai arba sergant reumatinėmis ligomis. Tai nulemia raumenų fermentų padidėjimą kraujotakoje, uţdegimą ir struktūrinę raumens bei minkštųjų audinių paţaidą. Šie procesai maţina pacientų judėjimo galimybes ir jėgą paţeistose vietose [1], todėl tokiu atveju pacientai linkę vartoti preparatus maţinančius skausmą ir uţdegimą per os arba vietiškai [2]. Tačiau dėl sintetinių vaistų sukeliamų nepageidaujamų reakcijų, nepakankamo ar neefektyvaus gydomojo poveikio ţmonės imasi ieškoti natūralių gydymo būdų ir išbando augalų teikiamas gydomąsias savybes. Padidėjęs pacientų susidomėjimas alternatyviąja medicina taip pat skatina mokslininkus atlikti daugiau tyrimų, kurie suteiktų patikimos informacijos apie augalinių preparatų vartojimą [3].
Tikrojo imbiero (Zingiber officinale R.) šakniastiebiai ţinomi kaip prieskoniai maistui gardinti ir daugybę šimtmečių naudojami Kinijoje bei Indijoje dėl daugybės gydomųjų savybių. Šiuo metu didelis susidomėjimas imbieru atsiranda dėl jo teigiamo poveikio gydant reumatines ir raumenų ligas [4]. Imbiero ekstrakto sudėtyje esantys fenoliniai junginiai - gingeroliai, šogaoliai bei kitos biologiškai aktyvios medţiagos suteikia jam antioksidacines ir uţdegimą slopinančias savybes - maţina uţdegimo mediatorių, tokių kaip ciklooksigenazė, citokinai, chemokinai išsiskyrimą bei slopina 5-lipoksigenazės metabolinius kelius [5].
Apţvelgus mokslinę literatūrą randama nemaţai duomenų apie gydomąsias imbiero savybes
per os vartojant skystus ekstraktus ar kapsules [6,7], ant odos - pleistrų ar kompresų pavidalu [8,9].
Tačiau nėra daug duomenų apie puskiečius preparatus vartojamus ant odos, į kuriuos būtų įterptas imbiero ekstraktas, todėl aktualu juos sumodeliuoti.
Pasirinkus atitinkamą nešiklį, vietiškai vartojami imbiero ekstraktai gali tapti efektyvia priemone galinčia pagreitinti raumenų funkcijos atsistatymą, sumaţinti raumenų nuovargį, skausmą ir uţdegimą. Sumodeliuotas preparatas turi būti ne tik veiksmingas, bet ir saugus, estetiškai priimtinas pacientui, todėl būtina įvertinti sumodeliuotų puskiečių preparatų kokybę. Tam tikslui pirmiausiai parenkamos tinkamiausios imbiero ekstrakcijos sąlygos, vertinant fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą, o šiomis sąlygomis pagaminti ekstraktai skirtingomis koncentracijomis įterpiami į puskiečių preparatų sudėtį.
Baigiamojo darbo tikslas - sumodeliuoti puskietes vaisto formas su skystuoju bei tirštuoju tikrojo imbiero ekstraktu ir įvertinti jų kokybę.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Tyrimo objektas:
veiklioji medţiaga - skystasis ir tirštasis tikrojo imbiero ekstraktas; vaisto forma - puskiečiai preparatai su imbiero ekstraktu.
Darbo tikslas: sumodeliuoti puskietes vaisto formas su skystuoju bei tirštuoju tikrojo imbiero ekstraktu ir įvertinti jų kokybę.
Uţdaviniai:
1. Apţvelgti mokslinėje literatūroje nurodomą tikrojo imbiero šakniastiebių biologinį aktyvumą ir įvertinti pritaikymo galimybes puskiečių vaisto formų modeliavime.
2. Parinkti ekstrakcijos būdą, etanolio koncentraciją ir ekstrakcijos laiką, vertinant suminį fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu bei biologiškai aktyvių junginių kiekį - efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3. Pagaminti stabilius puskiečius preparatus su skystuoju ir tirštuoju tikrojo imbiero ekstraktu bei įvertinti jų kokybę centrifuguojant, tiriant tekstūrą, vienalytiškumą, nustatant klampą, pH reikšmes ir antioksidacinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1.
Tikrojo imbiero bendra charakteristika
Tikrasis imbieras (Zingiber officinale Roscoe) – tai daugiametis ţolinis augalas, priklausantis imbierinių (Zingiberaceae) šeimai, kurio kilmė siejama su pietų Kinija ir Indija. Imbiero šakniastiebis pasiţymi išskirtiniu aromatiniu ir aitriu skoniu bei kvapu. Daugiau nei 2500 metų imbieras naudojamas Indijoje ir Kinijoje kaip prieskonis maistui bei kaip augalinis vaistas gydyti įvairius sveikatos sutrikimus [10,11]. Imbieras plačiai naudojamas Ajurvedos ir tradicinėje medicinoje [12]. Europoje augalas dėl savo gydomųjų savybių buvo pradėtas naudoti nuo IX amţiaus [13].
Tikrojo imbiero šakniastiebis plokščias, šakotas, iš kurio pirmaisiais metais išauga apie 60-90 cm aukščio stiebas. Augalas turi siaurus, lygiakraščius, lancetiškos formos 15-30 cm ilgio praţanginius lapus, kuriuos kasmet numeta. Imbieras ţydi smulkiais baltais arba geltonais ţiedais su roţiniais dryţeliais, kurie susitelkia stiebų viršūnėse [14,15]. Augalas pavaizduotas 1 paveiksle. Tikrasis imbieras laukinėje aplinkoje neauga, jis kultivuojamas drėgnose ir šiltuose kraštuose, tokie kaip Indija, Kinija, pietryčių Azija, Nigerija, Australija ir Jamaika [16].
1 pav. Zingiber officinale (Tikrasis imbieras) [17]
Imbieras nuo seno auginamas skirtinguose ţemynuose, todėl yra išvesta ir keletas skirtingų veislių. Europos farmakopėjos reikalavimus atitinka imbieras, kurio kilmės šalis yra Indija ir kitaip jis vadinamas Jamaica ginger, Bengal-ginger ir Cochin Ginger [18].
Literatūroje randami įvairūs imbiero pavadinimo sinonimai: Amomum Zingiber, Gan Jiang,
Uţsienio literatūroje naudojami tokie bendriniai augalo pavadinimai kaip black ginger, bordia,
chayenne ginger, cochin ginger, Jamaica ginger [13].
Naudojama vaistinė augalinė ţaliava – švieţi arba išdţiovinti imbiero šakniastiebiai [15,19]. Europos farmakopėjoje (Ph. Eur. 01/2011:1522) nurodoma tikrojo imbiero ţaliava – išdţiovinti pilni arba supjaustyti šakniastiebiai, nuo kurių visiškai arba dalinai pašalinta ţievė. Šakniastiebyje randama ne maţiau nei 15 ml/kg eterinio aliejaus, nustatant garų distiliacijos aparatu pagal Europos farmakopėjoje aprašyta metodą (Ph. Eur. 2.8.12).
1.2.
Augalo cheminė sudėtis
Cheminė analizė rodo, jog tikrojo imbiero sudėtyje aptikta daugiau nei 400 medţiagų [20]. Imbierą sudaro dvi grupės cheminių junginių, vieni jų yra lakūs, kiti – ne.
Tikrojo imbiero šakniastiebyje randama 1-3 proc. eterinių aliejų, kurių pagrindiniai komponentai yra monoterpenai (β-felandrenas, (+)-kamfenas, cineolis, geraniolis, kurkumenas, citralis, terpineolis, borneolis) ir seskviterpenai (α-zingiberonas (30-70 proc.), β-seskvifelandrenas (15-20 proc.), β-bizabolenas, kurkuminas, farnezenas). Dauguma šių junginių ir suteikia imbierui būdingą kvapą [20,21].
Aitrus imbiero skonis yra sąlygojamas nelakių homologinių fenolinių junginių, tokių kaip gingeroliai (23-25 proc.) ir šogaoliai (18-25 proc.) - jų randama didesniais kiekiais nei kitų junginių, ir jie pasiţymi plačiu farmakologinio poveikio spektru [22]. Gingerolius sudaro eilė homologinių junginių (3-6, 8-, 10-, ir 12-gingerolis) su įvairaus ilgio nešakotomis alkilinėmis grandinėmis, turintys šoninę grandinę su 7-10, 12, 14 ar 16 anglies atomų. Gingeroliai yra fenoliniai ketonai, iš kurių daţniausiai aptinkamas 6-gingerolis (5-hidroksi-1-(4hidroksi-32-metoksifenill)-3-dekanonas) [21]. Tuo tarpu šogaoliai taip pat yra homologiniai junginiai, susidarę iš gingerolių, kur tarp C-5 ir C-4 anglies atomų, ilgo laikymo metu, apdorojant termiškai arba esant rūgštinei terpei, įvyksta dehidratacija [23]. Pagrindinių junginių – 6-šogaolio ir 6-gingerolio struktūros pavyzdţiai pateikiami 2 paveiksle.
Gingeroliai yra termolabilūs junginiai. Termolabilumą lemia β-hidroksi- keto- funkcinė grupė junginių struktūroje, todėl esant aukštai temperatūrai arba rūgštinėms sąlygoms, gingeroliai dehidratuoja. Analizuojant 6-gingerolio stabilumą ir virsmą į 6-šogaolį nustatyta, kad 6-gingerolis santykinai stabilus pH svyruojant nuo 1 iki 7 ir esant 37˚C temperatūrai. Tačiau junginys labiau linkęs skilti esant aukštesnei nei 60˚C temperatūrai bei esant maţesnei nei 4 pH reikšmei. Atliekant in vitro tyrimą nustatyta, kad esant 37˚C temperatūrai ir rūgštinėms sąlygoms, dehidratuotas produktas - šogaolis beveik pilnai vėl grįţta į gingerolio formą [23].
Šogaoliai yra aitresni negu gingeroliai, todėl dţiovintas imbieras yra daug aitresnis nei švieţias. Įrodyta, kad 6-šogaolio biologinis aktyvumas yra didesnis nei 6-gingerolio [24]. 6- šogaolio lipofilinės savybės yra didesnės negu 6-gingerolio, taip yra dėl hidroksilinės grupės praradimo gingeroliui dehidratuojant ir virstant šogaoliu. Šis lipofiliškumo skirtumas gali turėti reikšmės analizuojant bioprienamumo ir farmakokinetines savybes in vivo [23].
Tikrojo imbiero sudėtyje randama ir kitų gingerolių ir šogaolių kilmės junginių, tokių kaip 6-paradolis, zingeronas, 1-dehidrogingerdionas, 6-gingerdionas ir 10- gingerdionas, 4-gingerdiolis, 6- gingerdiolis ir 8- gingerdiolis, ir diarilheptanoidai [20].
Be anksčiau minėtų medţiagų imbiero šakniastiebyje dar aptinkama aminorūgščių, skaidulinių medţiagų, baltymų, fitosterolių, vitaminų (nikotino r., vitamino A) bei mineralų [20].
Tikrojo imbiero šakniastiebio sudėtyje esančios medţiagos gali kisti priklausomai nuo augalo augimvietės ir nuo to, ar ţaliava yra švieţia, ar dţiovinta [21]. Augalo cheminės sudėties kitimams taip pat įtaką daro laikymo temperatūra ir trukmė - imbieras laikomas kambario temperatūroje (15-25˚C) 3 mėnesius praranda iki 20 proc. veikliųjų junginių, tuo pačiu maţėja ir 6-gingerolio kiekis. Jeigu nėra sąlygų laikyti imbierą vėsesnėje aplinkoje, patariama kuo greičiau vykdyti ekstrakciją. Geriausiai imbiero sudėtyje esantys junginiai išsaugomi laikant šakniastiebius ţemoje temperatūroje (5˚C) [25].
Moksliniuose straipsniuose, kuriuose analizuojami imbiero ekstraktai daţnai naudojamas terminas - oleorezinas. Tai pusiau skystos konsistencijos ekstraktas sudarytas iš fenolinių junginių, tokių kaip gingeroliai, šogaoliai, zingeronas ir iš eterinių aliejų [26]. Oleorezinas išgaunamas iš imbiero vykdant ekstrakciją organiniais tirpikliais, daţniausiai etanoliu arba acetonu, kurie yra vėliau nugarinami. Oleorezinas įprastai naudojamas maisto pramonėje [27].
1.3.
Tikrojo imbiero biologinis aktyvumas
Didelis kiekis atliktų farmakologinių tyrimų rodo, jog dţiovintas ar švieţias imbieras, jo ekstraktai ir atskiros sudedamosios medţiagos pasiţymi terapiniu veikimu tiek in vivo, tiek in vitro tyrimuose.
Tikrasis imbieras nuo seno naudojamas tradicinėje medicinoje, kur jis ţinomas kaip vaistas skiriamas gydyti įvairius virškinimo sutrikimus, tokius kaip pasunkėjęs virškinimas, vidurių uţkietėjimas, apetito nebuvimas, pykinimas ar pilvo spazmai [28]. Remiantis senaisiais kinų ir indų tekstais, imbieras taip pat buvo naudojamas peršalimo, reumato ligoms gydyti, o Ajurvedos medicinoje – nutukimui, sutrikusiam kraujavimui po kūdikio gimimo, lėtinėms odos ligoms gydyti [18].
Didţioji dalis publikacijų nurodo, kad maksimali rekomenduojama paros dozė yra 4 g imbiero. Teigiama, kad įvairiose formose vartojant imbierą, suaugusieji gali per os suvartoti nuo 1 iki 5 g, padalinus į maţesnes dalis. Dėl imbiero vartojimo vaikams jaunesniems nei 18 metų patikimų duomenų nepateikiama [13].
Viename iš tyrimų dvigubai akluoju būdu buvo tiriamas imbiero ekstrakto poveikis slopinant pykinimą ir vėmimą pacientams, kuriems atliekama chemoterapija. 744 tiriamieji buvo suskirstyti į 4 grupes ir atitinkamai vartojo 0,5 g, 1,0 g, 1,5 g kapsules su išgrynintu skystuoju imbiero ekstraktu arba placebo kapsules tik su alyvuogių aliejumi. Buvo nustatyta, kad visos imbiero dozės buvo veiksmingos maţinant pykinimą chemoterapijos dieną, o stipriausias poveikis nustatytas vartojant 0,5 g ir 1,0 g imbiero kapsules [29]. Tyrimuose su pelėmis nustatytas ir gastroprotekcinis poveikis, sumaţinant
Helicobacter pylori sukeltą ţalą. Tiriamieji vartojo po 100 mg/kg standartizuoto imbiero ekstrakto bei
tyrimo pabaigoje nustatyta, jog reikšmingai sumaţėjo lėtinis ir ūminis gleivinės uţdegimas bei skrandţio epitelinių ląstelių erozija [30].
Gingeroliai, šogaoliai, zingeronas ir zingiberinas pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu. Šios medţiagos didina fermentų - superoksidazės dismutazės, katalazės ir glutationo peroksidazės koncentraciją audiniuose, kurie svarbūs apsaugant nuo oksidacinio streso, nes turi savybę surišti laisvuosius radikalus [31]. Atlikta nemaţai tyrimų įrodančių imbiero antioksidacinį aktyvumą, susijusį su tam tikrų ligų prevencija, pavyzdţiui, diabetinės kardiomiopatijos ar neurodegeneracinių ligų [32,33]. Nustatytas kardioprotekcinis poveikis taip pat siejamas su antioksidacinėmis imbiero savybėmis bei serumo apolipoproteinų, leptino, katepsino G ir homocisteino lygio padidėjimu. Tyrime su ţiurkėmis sergančioms diabetu, kasdien 6 mėnesius buvo duodama 50 mg imbiero ekstrakto ir nustatyta, kad ekstraktas pastebimai sumaţina struktūrines širdies anomalijas lyginant su placebo grupe [32].
Jau 1982-aisiais atlikti pirmieji tyrimai įrodantys imbiero šakniastiebio priešuţdegiminį poveikį [21]. Tikrasis imbieras maţina uţdegimą slopindamas prostaglandinų sintezę per COX-1 ir COX-2 slopinimą, stabdo leukotrienų biosintezę inhibuojant 5-lipoksigenazę ir reguliuoja priešuţdegiminių citokinų (IL-4 ir IL-10) koncentraciją bei slopina NF-κB aktyvaciją. Dvigubas slopinimas - tiek COX, tiek 5-lipoksigenazės yra pagrindinis skirtumas tarp imbiero priešuţdegiminio veikimo mechanizmo ir NVNU mechanizmo [5,34,35]. Manoma, jog imbiero vartojimas gali sumaţinti artritinį sąnarių skausmą, kadangi artritu sergančių pacientų sinoviniame skystyje yra
padidėjusi prostaglandinų koncentracija. Tyrime su ţiurkėmis nustatyta, kad vandeninis imbiero ekstraktas (50 ir 500 mg/kg dozėmis) reikšmingai slopina prostaglandinų PGE2 sintezę, todėl teigiama, jog imbieras gali būti naudojamas kaip priešuţdegiminė medţiaga ir tuo pačiu maţinti skausmą [36].
Dalis atliktų tyrimų rodo, jog imbieras turi ir priešvėţinį poveikį. Yra duomenų, kad 6-šogaolis pasiţymi aktyvumu prieš krūties vėţį, slopindamas ląstelių metastazes [37]. 6-gingerolis tyrimuose in vivo ir in vitro slopina mieloidinės leukemijos ląstelių linijų proliferaciją, skatina vėţinių ląstelių apoptozę ir tuo pačiu neveikia normalių periferinių kraujo ląstelių. Leukemijos ląstelių ţūtis inicijuojama reaktyvių deguonies formų ir aktyvuojant mikroRNR (miR-27b) ekspresiją [38].
Atlikti moksliniai tyrimai rodo, kad gingeroliai ir šogaoliai gali būti potenciali trombocitų agregaciją slopinantį poveikį turinti medţiaga. Buvo tiriama dvidešimties imbiero sudėtyje esančių medţiagų geba slopinti arachidoninės rūgšties sukeltą trombocitų aktyvaciją visame ţmogaus organizmo kraujyje. 8-gingerolio, 6-šogaolio, 8-parodolio ir gingerolio analogų antitrombocitinis aktyvumas, vertinant pagal IC(50) (koncentracija reikalinga sumaţinti sukeltą trombocitų agregaciją 50 proc.), svyravo nuo 3 iki 7 µM, tuo tarpu tomis pačiomis sąlygomis IC(50) aspirinui buvo 20±11 µM. COX-1 slopinančiu poveikiu labiau pasiţymėjo 8-paradolis negu gingerolio analogai. Gauti rezultatai rodo, jog tirtos imbiero veikliosios medţiagos turi didesnį antitrombocitinį poveikį nei aspirinas [39].
Imbieras pasiţymi ir skausmą malšinančiomis savybėmis - moterims kas 6 val. vartojusioms imbiero kapsules, kuriose buvo 250 mg imbiero ekstrakto, palengvėjo dismenorėjos skausmai, o nustatytas analgetinis efektyvumas panašus kaip ir vartojant mefenamo rūgšties 250 mg kapsules kas 8 val. [40]. Augalo analgetinis poveikis pasiţymėjo ir maţinant osteoartrito sukeltus kelių sąnarių skausmus bei sąstingį. Viena tiriamųjų grupė vartojo imbiero ekstrakto 250 mg kapsules, o kita – placebo. Po 6 savaičių buvo vertinamas pacientų jaučiamas skausmas einant ar stovint, sąnarių sustingimas, būklė atliekant kasdieninius ruošos darbus. Pagal skausmo vertinimo skalę VAS, reikšmingas (p<0,05) analgetinis poveikis nustatytas imbierą vartojusiųjų grupėje lyginant su placebo. Sąnarių sąstingis rytais taip pat buvo maţesnis imbierą vartojusiųjų grupėje [6].
Nustatyta, kad imbiero ekstrakto poveikis malšinant reumatinių ligų sukeltus simptomus pasireiškia per ciklooksigenazės-2 ir 5-lipoksigenzės metabolinių kelių slopinimą, taip pat skatinant priešuţdegiminių citokinų tokių kaip IL-4 ir IL-10 gamybą [41]. Be to, gingeroliai turi panašumų su kapsaicinu, kadangi veikia kaip agonistai kapsaicino aktyvuojamiems vaniloidininiams receptoriams. 6-gingerolis kaip ir kapsaicinas skatina cholino išsiskyrimą [42].
Moksliniai tyrimai rodo, kad 6-dehidrogingerdionas, 10-gingerolis, 6-šogaolis ir 6-gingerolis gali slopinti antibiotikams atsparias bakterijas, pavyzdţiui, Acinetobacter baumannii, o deriniuose su tetraciklinu gali keisti atsparumą antibiotikui. Buvo nustatyta minimali Ac. Baumanii slopinanti
ekstrakto koncentracija (angl. MIC), kuri svyravo nuo 132 iki 347 µM, o didţiausias antibakterinis aktyvumas buvo 6-dehidrogingerdiono [43].
Atliktuose tyrimuose pastebimas reikšmingas imbiero ekstrakto antibakterinis poveikis naudojant jį odontologiniams tikslams, kur tiriamas ekstraktų aktyvumas prieš dantų ėduonį sukeliančias bakterijas - Streptococcus mutans ir S. sanguinis in vitro. Imbiero ekstrakto MIC prieš S.
mutans nustatyta 0,02 mg/ml, o S. sanguinis - 0,3 mg/ml [44].
Izoliuotos iš imbiero medţiagos, t.y. 6, 8, 10 – gingeroliai ir 6 – gingerdiolis pasiţymi priešgrybeliniu poveikiu, viename iš atliktų tyrimų jų aktyvumas prieš ţmogaus patogenus pasireiškė esant maţiau nei 1 mg/ml koncentracijoms. Iš visų tirtų grybelių rūšių, Microsporum gypseum buvo jautriausias imbiero junginių slopinančiajam poveikiui, o maţiausia MLC (minimali letalinė koncentracija) buvo 10-gingerolio (316 µg/ml) [45].
1.3.1. Tikrojo imbiero poveikis odai
Naudojant tikrąjį imbierą dermatologijoje yra įrodymų, jog jis gali būti naudingas gydant ţaizdas, uţdegimą, odos vėţį ir lėtinant senėjimo procesus. Kadangi navikų formavimasis yra susijęs su oksidaciniu ir uţdegiminiu stresu, todėl junginys, kuris demonstruoja priešuţdegiminį ir antioksidacinį poveikį gali veikti ir kaip priešvėţinė medţiaga [46].
Nigam ir kt. (2009) atliktas tyrimas su ţmogaus epidermio vėţinėmis A431 ląstelėmis patvirtina, kad 6-gingerolis slopina odos vėţinių ląstelių augimą, didindamas reaktyvių deguonies formų (angl. ROS) atsiradimą. ROS padidėjimas lemia sumaţėjusį mitochondrijų membranų potencialą, kas toliau sukelia apoptozę. Tyrimą atlikę mokslininkai teigia, jog 6-gingerolis gali būti efektyviai pritaikomas gydant odos vėţį [47].
Tyrime su ţiurkėmis 21 dieną buvo stebimas ţaizdų gijimą skatinantis poveikis, kurį sukelia išoriškai vartojamas 3 proc. imbiero ir 10 proc. kurkumino ekstrakto mišinys bei atskiri augalų ekstraktai. Vėliau dar 15 dienų oda buvo gydoma naudojant ,,Temovate“ kortikosteroidinį kremą kartu su augaliniais ekstraktais. Tyrimas atskleidė, jog prieš kortikosteroidų gydymą paskyrus gydymą kurkumino ir imbiero ekstrakto mišiniu, ţaizdų gijimas pagerėja ir didėja kolageno gamyba. Viso tyrimo eigoje odos sudirginimo poţymių nepastebėta [48].
Remiantis atliktais tyrimais, nustatyta, kad imbiero ekstraktas vartojamas per os, gali malšinti skausmą ir kontroliuoti osteoartrito sukeliamus sąnarių pakitimus. Tačiau nustatyta ir tai, jog didelės dozės ekstrakto daţnai sukelia virškinamojo trakto sutrikimus, todėl nuspręsta patikrinti tikrojo imbiero poveikį vartojant išoriškai ant odos, kadangi tai gali padėti išvengti galimo nepageidaujamo poveikio. Dvi grupės tiriamųjų kasdien (iki 24 savaičių) naudojo imbiero miltelių kompresus arba
standartizuotus imbiero pleistrus. Išanalizavus tiriamiesiems pateiktus artrito būklės klausimynų atsakymus, buvo nustatytas būklės pagerėjimas ir skausmo sumaţėjimas, todėl teigiama, jog išorinis imbiero naudojimas turi potencialą palengvinti simptomus susijusius su lėtiniu osteoartritu [8].
Viename iš tyrimų vandeninis imbiero ekstraktas buvo naudojamas tiriant priešuţdegiminį jo poveikį su ţmogaus keratinocitų HaCaT ir pelės C57BL/6 ląstelių linijomis, kurios buvo paţeistos ultravioletinių (UV) spindulių B. Nustatyta, kad ekstraktas ir atskiri junginiai – gingerolis ir šogaolis efektyviai slopina citokinų gamybą UVB spinduliuotės paţeistose ląstelėse ir gali veikti kaip priešuţdegiminė medţiaga apsauganti odą nuo UVB spindulių sukelto paţeidimo [49].
1.4.
Odos struktūra ir skvarba pro odą
Oda - didţiausias kūno organas, kuris skirstomas į tris svarbiausius sluoksnius: epidermis – viršutinysis sluoksnis, kurį dengia raginis sluoksnis (lot. stratum corneum), veikiantis kaip barjeras; derma (tikroji oda) – storiausias odos sluoksnis, išsidėstęs ţemiau epidermio, jame yra išsidėstę plaukų svogūnėliai, prakaito ir riebalinės liaukos; hipoderma – giliausiai esantis audinys, kuriame yra nervai, kraujagyslės, o tarpai uţpildyti riebalais.
Ant odos vartojami preparatai veikia odą arba skverbiasi į gilesnius odos sluoksnius. Viršutinis odos sluoksnis stratum corneum atlieka odos barjero funkciją ir todėl ne visos medţiagos gali jį praeiti. Pralaidumui gerinti tam tikrais atvejais gali būti naudojami cheminiai ir fizikiniai metodai arba skvarbą gerinančios medţiagos. Vanduo ir odos drėkinimas gali būti paprasčiausias ir efektyviausias skvarbos skatintojas. Drėkinant raginį sluoksnį, didėja medţiagų prasiskverbimas pro odą. Įprastai šiame sluoksnyje yra 5-10 proc. vandens, kurį galima padidinti tinkamai pritaikytais nešikliais iki 50 proc.. Etanolis yra geriausiai ištirtas skvarbos skatintojas, galintis ekstrahuoti odos lipidus bei proteinus ir šitokiu būdu padidinti raginio sluoksnio poringumą ir pralaidumą [50].
Oda trukdo prasiskverbti tiek ţalingiems junginiams, tiek gydomiesiems. Puskiečiame preparate skvarbumą lemią du svarbūs veiksniai. Vienas jų – specialių skvarbą skatinančių medţiagų panaudojimas, kitas – pačios veikliosios medţiagos fiziko-cheminės savybės. Veikliosios medţiagos molekulės turi būti kuo maţesnės, tuomet medţiaga lengviau prasiskverbia [51]. Efektyviausiai pro odą prasiskverbia medţiagos, kurių molekulinė masė <500 Da, o tam kad medţiaga praeitų stratum
corneum ir galėtų skverbtis toliau į epidermį, ji turi turėti hidrofobinių ir hidrofilinių savybių [52].
Susidomėjimą plačiau ištirti imbiero sudėtyje esančių biologiškai aktyvių medţiagų (gingerolių ir šogaolių) poveikį odai didiną tai, jog šie junginiai turi tinkamas fiziko-chemines savybes pernašai per odą. 6-gingerolis ir jo dariniai yra maţos molekulinės masės molekulės (maţiau nei 300 Da), be to junginiai vidutiniškai gerai tirpsta tiek aliejuje, tiek vandenyje, o jų pasiskirstymo
vanduo-oktanolis koeficiento logaritmas (log P) svyruoja 2,5-3,8 ribose. 8-gingerolis, 10-gingerolis bei jų dariniai yra labiau lipofiliniai (log P svyruoja apie 3,5-4,9) ir jų molekulės yra šiek tiek didesnės nei 300 Da [9].
1.5.
Tikrojo imbiero preparatai
Tikrojo imbiero vaistinių preparatų registruotų Lietuvoje nėra daug. Vienas jų - ,,Avioplant“ kietosios kapsulės, skirtos supimo ligos simptomų maţinimui, kuriuose veiklioji medţiaga yra imbierų šakniastiebių milteliai (250 mg). Kitas preparatas ,,Original Groer Bittner Balsam“ geriamasis tirpalas, kur 1 ml gėrimo yra 0,015 mg imbiero šakniastiebių. Taip pat registruoti ir homeopatiniai lašai ,,Akutur“ skirti papildomam lengvo apatinių šlapimo takų uţdegimo pagalbiniam gydymui [53].
Be vaistinių preparatų Lietuvoje galima įsigyti ir maisto papildų, kurių sudėtyje yra imbiero šakniastiebio miltelių, skirtų palaikyti virškinamojo trakto veiklą, slopinti pykinimą, stiprinti imunitetą bei tonizuoti organizmą.
Kitose Europos šalyse taip pat galima įsigyti per os vartojamų vaistinių preparatų, kurių sudėtyje yra imbiero šakniastiebio miltelių, visi jie skirti galvos svaigimo, pykinimo ar vėmimo maţinimui keliaujant (sergant kinetozės liga). Didţiojoje Britanijoje malto imbiero tabletės naudojamos kaip vaistai nuo vidurių pūtimo [18].
1.6.
Tikrojo imbiero ekstraktai
Ekstraktai – tai skystos, tirštos ar sausos fizikinės būklės koncentruotos ištraukos iš augalinės ţaliavos. Pagal Europos farmakopėją, gaminant sausuosius ir tirštuosius ekstraktus, tirpiklis yra visiškai arba dalinai išgarinamas. Ekstraktų kokybei įvertinti jiems atliekami sauso likučio, santykinio tankio nustatymo ir tirpiklių likučių testai [54]. Ekstrakcijos tikslas – atskirti farmakologiškai aktyvius komponentus (tirpius) nuo netirpių liekanų, naudojant selektyvius tirpiklius. Dalis pagamintų ekstraktų gali būti iš karto naudojami (tinktūrų, skystųjų ekstraktų pavidalu), o kiti turi būti toliau apdorojami ir panaudojami kitų vaistų formų gamybai [55].
Fenolinių junginių yra didelė įvairovė ir tarpusavyje jie skiriasi struktūra ir fiziko-cheminėmis savybėmis, todėl atrasti vieną universalų ekstrakcijos metodą yra sudėtinga. Taigi, turi būti optimizuojami įvairūs procesą lemiantys parametrai, kurie padėtų išvengti didelių nuostolių ir padidintų fenolinių junginių išeigą. Ekstrakcijos efektyvumą gali nulemti naudojamas metodas, tirpiklis, jo koncentracija, terpės pH, temperatūra, augalinės ţaliavos dalelių dydis ir forma [56].
Ekstrakcijos veiksmingumui turi įtaką vaistinės ţaliavos paruošimas, todėl būtina tikslingai pasirinkti, ar ţaliavą naudoti švieţią, ar dţiovintą. Jei pasirenkama ţaliavą dţiovinti, pereinama prie dţiovinimo metodo parinkimo, jis gali būti vykdomas patalpoje ar lauke, naudojant mikrobangas, dţiovyklėje arba liofilizuojant. Svarbus ekstrakcijos išeigą lemiantis veiksnys – ţaliavos smulkumas, kadangi dalelių dydţio maţėjimas didina sąlytį tarp ţaliavos ir ekstrahento [55].
Tikrojo imbiero sudėtyje esančių fenolinių junginių ekstrakcijai daţniausiai naudojami tirpikliai yra vanduo, etanolis, metanolis, acetonas [56]. Nustatyta, kad etanolinio imbiero ekstrakto antioksidacinis aktyvumas didesnis negu vandeninio ekstrakto [57]. Kitas tyrimas taip pat rodo, kad ekstrakciją atliekant refliuksiniu metodu ir maceruojant su etanoliu, metanoliu ir acetonu, geriausias ekstrakcijos tirpiklis - etanolis, kurį naudojant išgaunamas ne tik didţiausias AA, bet ir fenolinių junginių, tarp jų ir 6-gingerolio kiekis. Daugiausiai fenolinių junginių buvo gauta maceravimo metodu [58].
Tinkamas metodo pasirinkimas norint išgauti kuo didesnį fenolinių junginių kiekį iš augalinės ţaliavos taip pat labai svarbus. Įprastai šiam tikslui naudojami tokie metodai kaip refliuksinis, maceracija, Soksleto, ekstrakcija purtykle ar magnetine maišykle. Tačiau yra sukurta ir modernesnių metodų, tokių kaip superkritinių skysčių ekstrakcija, suspaustų skysčių ekstrakcija, maceracija naudojant ultragarsą ir ekstrakcija mikrobangomis [59]. Maceracija ir Soksleto ekstrakcija laikomi tradiciniais metodais ir daţniausiai naudojami nedideliuose tyrimuose, tuo tarpu daugiau privalumų turi modernūs metodai, leidţiantys gauti didesnę išeigą ir sumaţinti gamybos išlaidas [55].
Fenoliniai junginiai, tarp jų 6-gingerolis ir 6-šogaolis tradiciškai išskiriami iš ţaliavos taikant refliuksinį metodą arba Soksleto ekstrakciją [60]. Visgi ilga ekstrakcijos trukmė esant aukštai temperatūrai gali nulemti termolabilaus 6-gingerolio degradaciją, dėl jo struktūroje esančios β-hidroksi- keto- grupės [23]. Tiriant fenolinių junginių kiekio ekstrakte priklausomybę nuo laiko (20-60 min.) nustatyta, kad optimaliausias laikas yra 60 min. Ilgesnė ekstrakcijos trukmė leidţia ilgiau trukti sąveikai tarp tirpiklio (etanolio) ir ţaliavos, ir tai sąlygoja didesnę ekstrahuojamų junginių išeigą. Tačiau ilgiau ekstrahuojant gali padidėti fenolinių junginių oksidacijos tikimybė [56].
1.7.
Ekstrakcijos metodai
1.7.1. Ekstrakcija ultragarsu
Ekstrakcija ultragarsu vyksta sklindant nuo 20 kHz iki 2000 kHz daţnio bangoms, tai padidina ląstelės sienelės pralaidumą, suirimą ir sukelia kavitaciją. Ultragarso privalumas tas, jog
didesnė ekstrakcijos išeiga gali būti pasiekta naudojant ţemesnes temperatūras ir trumpesnį laiką [61], bei maţiausiai paţeidţiami termolabilūs junginiai [62]. Ultragarsinis metodas yra efektyvus ir vienas iš daţniausiai naudojamų ekstrahuojant fenolinius junginius [63]. Trūkumas tas, jog nėra aišku, kaip ultragarsinė energija gali paveikti ekstrahuojamas iš vaistinių augalų medţiagas, nes gali formuotis laisvieji radikalai ir šitaip nepageidaujamai pakeisti vaistinės medţiagos molekules [64].
1.7.2. Ekstrakcija purtyklėje
Purtyklės gali būti skirtingų rūšių priklausomai nuo judėjimo pobūdţio, t.y. slankiojančios, orbitalinės, svyruojančios ir besisukančios. Ekstrakcijos purtyklėje metu vyksta pastovus tam tikros krypties ir daţnio augalinės ţaliavos ir ekstrakcijos tirpiklio mechaninis maišymas [65].
1.7.3. Ekstrakcija naudojant magnetinę maišyklę
Magnetinėje maišyklėje skysčiai bei ţaliava vienu metu gali būti šildomi ir maišomi viduje esančiu magnetu, kurio dydis gali būti keičiamas bei kurį veikią kitas magnetas įtaisytas maišyklės pagrinde. Kaitinimas yra vienas iš privalumų, leidţiantis vykti ne tik mechaniniam, bet ir konvekciniam ekstrahuojamų medţiagų judėjimui, tai leidţia sutrumpinti ekstrakcijos laiką, tačiau gali suardyti termolabilius junginius. Šildymo ir maišymo proceso intensyvumas gali būti kontroliuojamas. Magnetinės maišyklės privalumas tas, jog maišymas gali būti palaikomas ilgą laiko tarpą ir jis visada yra pastovus [65,66].
1.8.
Gingerolių ir šogaolių analizės metodai
Remiantis literatūra, daţniausi fenolinių junginių nustatymo metodai yra efektyvioji skysčių chromatografija, ir kapiliarinė elektroforezė suderinta su ultravioletine (UV), elektrochemine ar masių spektrometrijos (MS) detekcija [67].
Gingerolių bei šogaolių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui daţnai pritaikomas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas [68–70]. ESC metodas imbiero sudėtyje esančioms medţiagoms analizuoti gali būti derinamas kartu su MS, plonasluoksne chromatografija, kapiliarine elektroforeze ar branduoliniu magnetiniu rezonansu [71]. Skysčių chromatografija/MS naudojama gana daţnai analizuojant imbiero mėginius, tačiau santykinai ilgos gingerolio kilmės
junginių šoninės grandinės, maţas lakumas ir junginių termolabilumas apsunkina jų detekciją šiuo metodu [72].
Didelis kiekis analizės metodų, suteikia galimybę pasirinkti tinkamiausią metodą tikrojo imbiero ekstrakto veikliųjų junginių analizei, atsiţvelgiant į turimus išteklius ir tyrimo tikslus.
1.9.
Puskietės vaisto formos - tepalai
Puskiečiai odos preparatai priklausomai nuo gamybos būdo, konsistencijos, technologinių savybių ir sudėties, skirstomi į kelias kategorijas: tepalai, kremai, geliai, pastos, šutekliai ir vaistiniai pleistrai [73]. Puskiečiai preparatai sudaryti iš pagrindo, kuriame ištirpinta arba disperguota viena ar daugiau veikliųjų medţiagų. Pagrindas ne tik suteikia reikiamą masę bei konsistenciją, tačiau ir daro įtaką vaisto bioprieinamumui, skatina veikliosios medţiagos skvarbą pro odą ir daro įtaka jos tirpumui ir pasiskirstymui [74].
Yra skirtingos tepalų klasifikacijos, tačiau vertinant technologiją svarbiausia atkreipti dėmesį į dispersinę sistemą. Pagal tai, tepalai skirstomi į homogeninius ir heterogeninius. Homogeniniai tepalai pagaminami sulydant sudedamąsias medţiagas arba vaistines medţiagas ištirpinant pagrinde. Heterogeniniai tepalai gali būti suspensiniai, emulsiniai arba daugiafaziai. Suspensiniuose tepaluose yra netirpių kietųjų medţiagų, o emulsiniai tepalai savo sudėtyje turi vandens ir emulsiklių.
Emulsiniai tepalų gamybai naudojami difiliniai pagrindai, kurie skirstomi į dvi grupes, t.y. absorbcinius (hidrofilinius ir lipofilinius) bei emulsinius (v/a ir a/v tipo). Į absorbcinius pagrindus įterpiami emulsikliai (pvz. vilnų riebalai (lanolinas), vilnų alkoholiai, sorbitano esteriai, monogliceridai ar riebiųjų rūgščių alkoholiai ir kt.), kurie emulguoja vandeninius tirpalus ir leidţia suformuoti v/a emulsijas. Emulsiniai pagrindai patys jau yra v/a emulsijos ir savo sudėtyje turi vandens, todėl vaistines medţiagas galima įterpti ir į hidrofilinę, ir į hidrofobinę fazę [73,75].
Priemonėms lipofiliniu pagrindu, pavyzdţiui, tepalams ar v/a emulsijoms, daţniau teikiama pirmenybė esant sausai odai. v/a emulsiniai tepalai daţnai naudojami kaip emolientai, kur vandeninė fazė drėkina odą, o aliejinė sukuria uţtvarą, kuri apsaugo nuo vandens praradimo ir nuo aplinkos veiksnių sukeliamo ţalingo poveikio (drėgmės, oro, saulės spindulių, infekcijos). Be to odos drėgmės padidėjimas lemia geresnę vaistinės medţiagos absorbciją. Tepalai jautrią odą dirgina maţiau negu vandens pagrindu pagamintos vaisto formos. Visgi minusas yra tas, jog tepalai palieka riebumo jausmą ant odos [74,76].
Vaistinės medţiagos išsiskyrusios iš vaisto formos gali veikti trimis būdais. Vienas jų – veikimas ant odos paviršiaus, gydant odos sutrikimus tokius kaip aknė, psoriazė. Antrasis - veiklioji medţiaga gali skverbtis po oda ir veikti vietiškai gilesnius audinius, raumenis ar sąnarius. Tokiam
poveikiui pasiekti reikalinga poodinė absorbcija ir didesnės koncentracijos nei sisteminiam vartojimui. Bei trečiasis būdas kuomet medţiagos gali skverbtis pro odą bei sukelti sisteminį poveikį [74].
Į pusiau kietą vaisto formą įterpiant veikliąją medţiagą reikia apsvarstyti, ar ji pasieks poveikio vietą. Dėl to į nuskausminamąjį poveikį turinčius preparatus veikliosios medţiagos įterpiama daugiau, siekiant didesnės koncentracijos skausmo vietoje bei stipresnio ir greitesnio nuskausminimo. Kadangi odos raginis sluoksnis sudaro barjerą ir apsunkina medţiagų prasiskverbimą į poveikio vietą, reikia įvertinti pusiau kietos vaisto formos sudėtį (ar joje yra specialių skvarbumą skatinančių medţiagų) ir veikliosios medţiagos fiziko-chemines savybes, kadangi kuo maţesne molekulė, tuo lengviau ji prasiskverbs [77].
1.10.
Modeliuojamo emulsinio tepalo (v/a) pagalbinių medţiagų savybės
Pagalbinės medţiagos į pusiau kietas vaisto formas daţniausiai dedamos tam, kad būtų kontroliuojama absorbcija, klampumas, pagerinamas stabilumas, organoleptines savybes bei padidinamas preparato tūris [74]. Toliau nurodytos pagalbinių medţiagų, naudotų modeliuojant pusiau kietas vaisto formas, savybės.
Bevandenis lanolinas (avies vilnų riebalai) – vaškinės struktūros, savotiško kvapo medţiaga, kuri lydosi esant 36-42˚C temperatūrai. Lengvai lydosi su hidrofobinėmis medţiagomis bei sudaro V-A emulsijas. Lanolinas gali absorbuoti iki 30 proc. vandens. Trūkumas - lanolinas gali sukelti alergines reakcijas [73].
Etanolis – geriausiai ištirtas skvarbos skatintojas. Daţnai naudojamas transderminiuose preparatuose ir pleistruose. Etanolis gali veikti kaip tirpiklis ir tirpinti vaistinę medţiagą esančią preparate. Alkoholis gali ekstrahuoti lipidus ir proteinus, šitaip didindamas raginio sluoksnio poriškumą [50]. Trūkumas – gali dirginti odą, sukelti kontaktinį dermatitą, reguliariai vartojant nedidelės koncentracijos etanolio ar jo metabolitų gali patekti į kraujotaką [78].
Baltasis bičių vaškas – baltos granulės, gautos chemiškai išbalinus geltonąjį bičių vašką, kuris išgaunamas iš bičių korių. Bičių vaškas daro kremus ir tepalus klampesniais, stabilizuoja v/a emulsijas. Lydymosi temperatūra 61-65°C. Medţiaga laikoma saugia ir netoksiška, tačiau kartais gali pasitaikyti padidėjusio jautrumo reakcijų [79].
Pipirmėčių eterinis aliejus – išgautas iš pipirinės mėtos (Mentha piperita L.) garų distiliacijos būdu. Tai bespalvis arba blankiai gelsvas skystis turintis specifinį kvapą ir skonį, sukeliantį šalčio pojūtį. Aliejus gerai tirpus etanolyje. Pagrindinė sudedamoji dalis – ciklinis terpenas mentolis (33.0-55.0 proc.) [80]. Jis sąveikauja su šalčiui jautriais TRPM8 receptoriais odoje, kurie atsakingi uţ
vėsinamojo poveikio jutimą [81]. Farmacijoje mentolis naudojamas kaip antiseptinė, vėsumo jausmą sukelianti ir nieţėjimą maţinanti medţiaga [82].
Glicerolis – skaidrus, bespalvis, klampus, higroskopiškas skystis. Gaminant dermatologinius preparatus naudojamas kaip tirpiklis ar kotirpiklis kremuose ir emulsijose. Glicerolis drėkina raginį odos sluoksnį, didina elastingumą, apsaugo nuo išorės dirgiklių ir gerina ţaizdų gijimą. Yra duomenų, jog glicerolis gali veikti antimikrobiškai [79,83].
Cetostearilo alkoholis - kietos agregatinės būsenos, granulių pavidalo cetilo ir stearilo alkoholių mišinys. Farmaciniuose puskiečiuose preparatuose naudojamas kaip emulsiklis, sudarantis tiek v/a, tiek a/v emulsijas, bei kaip klampą didinti medţiaga. Cetostearilo alkoholio lydymosi temperatūra 49-56˚C [79].
Fenoksietanolis – bespalvis, šiek tiek klampus, malonaus kvapo skystis. Tai yra antimikrobinis konservantas naudojamas kosmetikoje ir išoriškai naudojamuose vaistiniuose preparatuose. Pagal Europos kosmetikos nuostatus (76/768/EEC), maksimali leistina fenoksietanolio koncentracija yra 1,0 proc. Trūkumai: grynas fenoksietanolis gali dirginti odą ir akis, o ilgalaikis vartojimas gali sukelti toksinį poveikį CNS [79].
Baltasis vazelinas – balta, minkšta, beveik permatoma klampi masė. Vazelinas yra bekvapis, beskonis, išlydytas silpnai fluorescuoja. Gaunamas iš geltonojo vazelino, jį išvalius. Netirpus vandenyje, etanolyje, tirpus benzine, chloroforme, maišosi su riebalų aliejais. Lydymosi temperatūra 30-50˚C. Gali absorbuoti iki 50 proc. vandens. Blogai nusiplauna nuo odos. Kosmetiniuose ir gydomuosiuose išoriniuose preparatuose naudojamas kaip pagrindas. Baltasis vazelinas sukelia maţiau padidėjusio jautrumo reakcijų nei geltonasis vazelinas [54,73,79].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1.
Tyrimų objektas
Veiklioji medţiaga (skystasis ir tirštasis tikrojo imbiero etanolinis ekstraktas). Dţiovinti stambiai susmulkinti imbiero šakniastiebiai buvo įsigyti iš UAB ,,Švenčionių vaistaţolių“ fabriko, 2015 m. Ţaliavos kilmės šalis – Kinija.
Vaisto forma - puskiečiai preparatai su imbiero ekstraktu.
2.2.
Tyrime naudojamos medţiagos
Baltasis vazelinas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); Etanolis 96,6% (AB „Stumbras“, Lietuva);
Išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2008:0008, LSMU laboratorija);
Pipirmėčių eterinis aliejus (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsrūjė, Vokietija Bevandenis lanolinas (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsrūjė, Vokietija) Baltasis bičių vaškas (,,Sigma – Aldrich”, Vokietija);
Cetostearilo alkoholis (,,Sigma – Aldrich”, Vokietija); Fenoksietanolis (,,Sigma – Aldrich”, Vokietija) Glicerolis (,,Sigma-Aldrich”, Vokietija);
Folin-Ciocalteu„s reagentas (,,Sigma-Aldrich”, Steinheim, Vokietija) Natrio karbonatas, Na2CO3 (,,Sigma-Aldrich”, Saint Luisas, JAV DPPH• reagentas („Sigma-Aldrich“, Vokietija);
Fenolinių junginių standartai („Sigma-Aldrich“, Vokietija);
2.3.
Tyrime naudojama įranga
Svarstyklės (Kern EMB 200-3, KERN & Sohn GmbH, Vokietija); Viskozimetras („ALPHA SERIES“ FUNGILAB, S.A., Ispanija); Centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija);
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga (MSH-20A, Witeg, Vokietija); UV spektrofotometras (Shimadzu UV-1800 Spectrophotometer, JAV)
pH-metras (inoLab® pH/ION 7320, Vokietija)
Mikroskopas Motic® (Motic China Group Co., Ltd., Kinija);
Tekstūros analizatorius TA.XT.plus (Stable Micro Systems Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė);
Chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV) Ultragarsinė vonelė(Bandelin Sonorex Digitec, Vokietija); Rotacinė purtyklė (Laboratory shaker 358S, Elpin type, Lenkija) Rotacinis garintuvas (Heidolph Hei-VAP Platinum 2, Vokietija) Vandens vonelė (J.P. Selecta, Ispanija);
Laboratorinis malūnėlis (D-47906 Clatronic, Kempen, Vokietija)
2.4.
Tyrimo eigos planas
3 pav. Tyrimo eigos planas
Vadovaujantis šiuo planu buvo atliekamas darbas. Visą darbo eigą galima suskirstyti į tris etapus: pirmasis – imbiero ekstraktų kokybės tyrimas ir gamybos sąlygų parinkimas, antrasis – tepalo pagrindo ir puskiečių preparatų modeliavimas bei ekstraktų gamyba, ir trečiasis – pagaminto pusiau kieto preparato su imbiero ekstraktu kokybinė analizė.
2.5.
Imbiero skystųjų ekstraktų gamyba
2.5.1. Ţaliavos paruošimas
Imbiero šakniastiebiai susmulkinami laboratoriniu malūnėliu, paruošta ţaliava sijojama per 125 mikrometrų sietą.
2.5.2. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrakcija atliekama dinaminės maceracijos būdais:
I metodas. Ekstrakcija magnetinės maišyklės pagalba. Ţaliavos ir ekstrahento santykis 1:10.
50 ml etanolio (96%) supilama į ekstrahavimo indą ir statoma ant magnetinės maišyklės. Kai tirpiklio temperatūra pasiekia 40˚C, į jį suberiama 5 g susmulkintos ţaliavos. Ekstrakcija vykdoma 60 min. palaikant 45±2˚C temperatūrą.
II metodas. Ekstrakcija orbitalinėje purtyklėje. Ţaliavos ir ekstrahento santykis 1:10. Į kolbą
su 50 ml etanolio (96%) įberiama 5 g susmulkintos ţaliavos ir pritvirtinama purtyklėje, kurioje purtymas trunka 60 min. kambario temperatūroje (15-25˚C).
III metodas. Ekstrakcija naudojant ultragarsą. Naudojama ultragarso vonelė, kurios ultragarso
stipris 168 W, daţnis 40 KHz. 5 g imbiero miltelių uţpilama 50 ml etanolio (96%) bei ekstrahuojama ultragarso poveikyje 60 min. palaikant 45±2˚C temperatūrą, papildomai pripilant šalto vandens.
Gauti ekstraktai atvėsinami ir filtruojami pro membraninį 0,22 μm filtrą. Ekstraktai tiriami ESC metodu, UV spektrofotometro pagalba nustatomas suminis fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas.
2.5.3. Ekstrakcijos proceso parinkimas dinaminės maceracijos ultragarsinėje
vonelėje būdu
Šio proceso metu vertinami du kintamieji : ekstrahento (etanolio) skirtingų koncentracijų tirpalai (55%, 70% arba 96%) ir ekstrakcijos ultragarsu trukmė (15; 30; 45; 60; 120 min.). Gauti ekstraktai atvėsinami ir filtruojami pro membraninį 0,22 μm filtrą. Ekstraktai tiriami ESC metodu, taip pat UV spektrofotometro pagalba nustatomas suminis fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas.
2.6.
Imbiero tirštojo ekstrakto gamyba
Tirštojo ekstrakto gamybai naudojamas skystasis ekstraktas, pagamintas naudojant parinktas ekstrakcijos sąlygas, kurioms esant išekstrahuojama didţiausias kiekis veikliųjų junginių kiekis. Gautas gelsvai rudos spalvos, specifinio aitraus kvapo skystasis ekstraktas garinamas iki tirštos konsistencijos rotaciniame garintuve naudojant vakuumą ir palaikant 40±2˚C temperatūrą [84]. Pagamintas tirštasis imbiero ekstraktas laikomas šaldytuve tamsaus stiklo buteliuke.
2.7.
Tikrojo imbiero ekstraktų kokybės tyrimas
2.7.1. Imbiero ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis pagamintuose skystuosiuose ir tirštuosiuose ekstraktuose nustatomas spektrofotometriškai, atliekant reakciją su Folin – Ciocalteu reagentu ir matuojant absorbciją UV spektrofotometru (Shimadzu UV-1800), bangos ilgiui esant 765 nm. Lyginamasis tirpalas – vanduo.
Reakcijai atlikti į 10 ml mėgintuvėlį įpilama 1 ml praskiesto imbiero ekstrakto (skystojo ekstrakto praskiedimas 1:20; tirštojo ekstrakto – 1:200) ir 5 ml Folin – Ciocalteu (1:10) reagento. Mėginys kelis kartus supurtomas ir paliekamas pastovėti kelias minutes. Į tą patį mėgintuvėlį pilama 4 ml 7,5 % natrio karbonato vandeninio tirpalo. Kolbutė uţkemšama ir tirpalai laikomi 30 min. kambario temperatūroje (15-25˚C), kol įvyks reakcija. Tuomet spektrofotometru matuojama absorbcija ir suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas miligramais mililitre imbiero ekstrakto pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę (mgGRE/ml). Tyrimai kartoti tris kartus, rezultatai pateikti išvedus vidurkį [85].
2.7.2. Imbiero ekstraktų veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios
skysčių chromatografijos analizės metodu
6-šogaolio ir 6-gingerolio analizei naudojamas Waters 2695 chromatografas su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA. Duomenims apdoroti bei analizei atlikti naudota programinė įranga: Empower2.
Visi analizei paruošti mėginiai filtruojami pro nailoninius membraninius švirkštų filtrus, kurių porų dydis - 0,22 μm. Veikliesiems junginiams išskirstyti naudota 250x4,6mm 5μm ACE C18 kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Scotland). Mobilioji fazė sudaryta iš acetonitrilo (tirpiklis B) ir vandens (tirpiklis A). Injekcijos tūris 10 μL; tėkmės greitis 1,0 ml/min; analizės trukmė 43 min.; kolonėlės temperatūra 25oC, fenolinių junginių detekcija mėginiuose atliekama esant 225 nm šviesos bangos ilgiui. Eliuento gradiento sudėties kitimas vyko tokia seka:0 min. 45% B, 8 min. 50% B, 17 min. 65% B, 32 min. 100% B, 43 min. 45% B.
Kiekybiniam veikliųjų junginių įvertinimui buvo taikytas kalibracinio grafiko sudarymo metodas. 6-gingerolio kalibracinis grafikas sudarytas iš 9 taškų, koncentracijos ribos 0,000883-0,226 mg/ml, o 6-šogaolio grafikas sudarytas iš 6 taškų ir koncentracijos ribos buvo 0,0125-0,4 mg/ml.
Įvertinus tiesiškumą nustatyta, kad kalibraciniai grafikai tenkina validacinius parametrus, nes abiejų junginių tiesiškumas buvo ne maţesnis kaip - R2
=0,9999.
2.7.3. Imbiero ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvojo
radikalo surišimo metodu
Antioksidacinis aktyvumas įvertinamas pamatavus, kiek procentų stabilaus 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalo gali neutralizuoti fenoliniai junginiai. Laisvajam radikalui antioksidantas atiduoda vandenilio atomą arba elektroną ir taip stabilizuoja laisvuosius radikalus, paversdamas neaktyviais.
Metodas buvo taikomas nustatinėjant skystųjų ir tirštojo ekstrakto antioksidacinį aktyvumą. Skystasis ekstraktas tyrime skiestas nebuvo, o tirštasis ekstraktas skiestas santykiu 1:20.
DPPH 0,1mM radikalinio tirpalo paruošimas: į 250 ml matavimo kolbą įberiama 10 mg DPPH radikalo ir tirpinama etanolyje, jo pripilant iki ţymės. Paruoštas tirpalas sumaišomas ir patikrinama gauto tirpalo absorbcija (~ 1,000). DPPH radikalinis tirpalas saugomas tamsoje [86].
Ruošiant tiriamąjį tirpalą į kiuvetę pilama 2,9 ml paruošto DPPH reagento ir 0,1 ml tiriamojo skystojo ekstrakto / praskiesto tirštojo ekstrakto tirpalo. Kiuvetės laikomos 30 min. tamsoje. Matuojama absorbcija spektrofotometru esant 518 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas - 96,6 % etanolis. Tyrimai kartoti tris kartus, rezultatai pateikti išvedus vidurkį.
Antioksidacinis aktyvumas įvertinamas inaktyvuoto DPPH radikalo kiekio procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐃𝐏𝐏𝐇 𝐢𝐧𝐚𝐤𝐭𝐲𝐯. 𝐩𝐫𝐨𝐜. =𝑨𝒐 − 𝑨𝒕
𝑨𝒐 × 𝟏𝟎𝟎
A o – tuščio bandinio absorbcija, gryno DPPH optinis tankis (t = 0 min.) A x – tiriamojo bandinio absorbcija (t = 30 min.)
2.8.
Pusiau kietų preparatų (tepalų) modeliavimas ir gamyba
2.8.1. Absorbcinio pagrindo gamyba
Tepalo pagrindo sudėtis pagaminta remiantis Jyothi et al. (2014) tyrimu. Absorbcinis pagrindas, sudarytas iš vazelino, bevandenio lanolino, baltojo bičių vaško ir cetostearilo alkoholio,
gaminamas sulydymo būdu porceliano lėkštelėje ant vandens vonios. Temperatūrų maţėjimo tvarka dedamos ir paeiliui maišant sulydomos sudedamosios dalys. Sudedamųjų medţiagų lydymosi temperatūros ir jų procentinės koncentracijos pagrinde pateiktos 1 lentelėje. Išlydytas pagrindas perkeliamas į plastmasinę talpyklę ir maišomas kol visiškai atvės [87].
1 lentelė. Pagrindo sudedamųjų medžiagų lydymosi temperatūros ir jų procentinės koncentracijos Medţiaga Lydymosi temperatūra, ˚C Koncentracija, %
Baltasis bičių vaškas 61-65 5
Cetostearilo alkoholis 49-56 5
Vazelinas 30-50 85
Bevandenis lanolinas 36-42 5
2.8.2. Tepalo su skystuoju imbiero ekstraktu gamyba
Tepalai gaminami pagal mokslinėje literatūroje nurodytus technologinius gamybos aspektus [73,88]. Gaminant tepalus, anksčiau pagamintas pagrindas atsveriamas ir sudedamas į grūstuvę, kur piestele sumaišomas su skystuoju imbiero ekstraktu, kurio koncentracija tepale svyruoja nuo 5 proc. iki 25 proc. Į sudėtis papildomai įterpiama antimikrobinio konservanto – fenoksietanolio, kuris sumaišomas kartu su ekstraktu. Tepalai maišomi kol vandeninė fazė susigeria į pagrindą ir susidaro vienalytė masė, prieš pabaigą įlašinamas pipirmėčių eterinis aliejus.
2.8.3. Tepalo su tirštuoju imbiero ekstraktu gamyba
Šių tepalų gamybai naudojamas pagamintas absorbcinis pagrindas, kaip ir tepalams su skystuoju ekstraktu. Tirštojo ekstrakto įterpiama nuo 5 proc. iki 15 proc., prieš tai jį sumaišius lygiomis dalimis su etanolio-vandens-glicerolio mišiniu (1:6:3) [73]. Į sudėtis papildomai įterpiama antimikrobinio konservanto – fenoksietanolio, kuris sumaišomas kartu su ekstraktu. Tepalai maišomi kol vandeninė fazė susigeria į pagrindą ir susidaro vienalytė masė, prieš pabaigą įlašinant pipirmėčių eterinio aliejaus.
2.9.
Pusiau kietų preparatų su imbiero ekstraktų kokybės vertinimas
2.9.1. pH reikšmės nustatymas
Pusiau kietų preparatų pH reikšmė nustatyta pH-metru. Tyrimui atlikti gaminami puskiečių vaistų formų 5 proc. tirpalai. Atsveriama 2,5 g tiriamojo tepalo ir šildant ištirpinamas 50 ml distiliuoto vandens. Gautas tirpalas filtruojamas į stiklinėlę pro popierinį filtrą. Filtratas atvėsinamas iki kambario temperatūros (15-25˚C) ir matuojama jo pH reikšmė. Matavimai atliekami tris kartus, rezultatai pateikiami išvedus vidurkį [89].
2.9.2. Centrifugavimo testas
Centrifugavimas atliekamas norint nustatyti dispersinių sistemų stabilumą. 5 ml talpos mėgintuvėliai uţpildomi vienodais (2,0±0,02 g) tiriamųjų preparatų kiekiais. Pasirenkamas rotorius, apsisukimų skaičius 3000 aps./min., centrifugavimo trukmė 10 min., temperatūra 23˚C. Matavimai atliekami tris kartus, taikant tokias pačias sąlygas. Vizualiai vertinamas fazių išsiskyrimas.
2.9.3. Klampos nustatymas
Tepalų su skystuoju bei tirštuoju imbiero ekstraktu dinaminės klampos nustatymas atliekamas viskozimetru „Alpha Series“. Kambario temperatūros (15-25˚C) tiriamasis tepalas patalpinamas į 50 ml indą. Naudojamas L4 suklys, apsisukimų skaičius per minutę 0,3, tyrimo trukmė 9 min. Matavimai atliekami tris kartus, rezultatai pateikiami išvedus gautų duomenų aritmetinį vidurkį.
2.9.4. Tekstūros analizė
Tepalų su skirtingais kiekiais imbiero ekstrakto tekstūros analizė atliekama naudojantis aparatu TA.XT.plus. Matavimui naudojamas organinio stiklo kūgio formos zondas tiksliai savo forma priderintas prie vienodo dydţio ir talpos indelių, pritvirtintų prie tekstūros analizatoriaus plokštumos – platformos. Į indelius tolygiai, be oro tarpų patalpinami bandomieji mėginiai.
Matavimai atliekami esant 15-25˚C kambario temperatūrai. Naudojant kompiuterinę programą, nustatomi reikiami parametrai ir pradedamas testas: zondas 12 mm leidţiasi ţemyn į
tiriamąjį mėginį 2,0 mm/s greičiu ir paskui pakyla į viršų. Tuo tarpu kompiuterinėje programoje automatiškai brėţiamas grafikas bei apskaičiuojama mėginių šlytis (g·sek) ir jėga (g), kuri reikalinga mėginiui deformuoti suspaudimo metu. Tyrimai atliekami 3 kartus.
2.9.5. Tepalų mikroskopinis tyrimas
Pagamintų emulsinių tepalų vienalytiškumas buvo vertinamas optiniu mikroskopu Motic® BA310 LTd. su integruota kamera ir naudojant kompiuterinę programą Motic® Images Plus. Skirtingi tepalų pavyzdţiai labai plonu sluoksniu uţdedami ant objektinio stiklelio ir prispaudţiami dengiamuoju stikleliu. Apţiūrima padidinus 100 kartų. Mikroskopinio stebėjimo metu daromos tiriamųjų preparatų nuotraukos.
2.9.6. Emulsinio tepalo tipo nustatymas
Emulsijos tipas nustatomas įvertinant maišymąsi su vandeniu arba aliejumi. Ant objektinio stiklelio dedamas lašas tepalo ir šalia lašinama po lašą vandens arba aliejaus. Palenkus stiklelį stebima, su kuriuo lašu susilieja tepalas. Jei aliejaus lašas pasklinda ir susimaišo su tepalu, tai bus v/a tipo emulsinis tepalas, jei ne - a/v tipo emulsija [73].
2.9.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Tiriamųjų tepalų bandiniai paruošti juos skiedţiant su etanoliu santykiu 5:50 ir maišant magnetine maišykle 1 val. Gautas tirpalas filtruojamas pro bepelenį filtrą ir toliau atliekama ta pati procedūra kaip aprašyta 2.7.3. skyriuje.
2.9.8. Stabilumo tyrimai
Stabilumo tyrimai atliekami siekiant įvertinti, kaip kinta vaistinės medţiagos arba vaistinio preparato kokybė laikymo metu ir pagal tai numatyti preparato galiojimo laiką bei tinkamiausias laikymo sąlygas. Kokybės pokyčiams įtaką gali daryti įvairios aplinkos sąlygos, tokios kaip temperatūra, drėgmė ar šviesa. Laikymo metu atsiradę išvaizdos (spalvos, sluoksniavimosi), kvapo,
skonio ar fizikinių savybių (pvz. klampos) pokyčiai ar veikliosios medţiagos kiekio pokyčiai gali rodyti, jog preparatas yra nestabilus.
Vertinant pagaminti tepalų kokybę, jie laikomi sandariai uţdarytose talpyklėse kambario temperatūroje (15-25˚C). Tiriamųjų mėginių kokybė vertinama po 1, 2 ir 3 mėn. Tikrinami kokybės rodikliai: organoleptinės savybės, klampa, pH, tekstūra, antioksidacinis aktyvumas [90].
2.9.9. Statistinė analizė
Atliekami kokybės testai kartojami tris kartus (n=3). Gauti duomenys apdoroti naudojant
Microsoft® Office Excel 2010 programą. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant statistinę
analizę (ANOVA), o atskiroms grupėms palyginti taikytas Tukey kriterijus. Vidurkiai pateikti su vidutinėmis kvadratinėmis paklaidomis, skirtumai tarp vidurkių patikimi, jei p<0,05.
