KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Darijus Skaudickas
Rausvažiedės ežiuolės Echinacea purpurea (L.)Moench
antiandrogeninių savybių eksperimentiniai tyrimai
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Darijus Skaudickas
Rausvažiedės ežiuolės Echinacea purpurea (L.)Moench
antiandrogeninių savybių eksperimentiniai tyrimai
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Darbą 2004-2005 m. rėmė Lietuvos valstybinis mokslo ir studijų fondas
Mokslinio darbo vadovas:
prof.habil.dr. Anatolijus Kondrotas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina-07 B)
Moksliniai konsultantai:
dr. Ona Ragažinskienė (Kauno Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija 09-B)
TURINYS
1.ĮVADAS 6
1.1. Darbo aktualumas 6
1.2. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė 7
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 9
3.LITERATŪROS APŽVALGA 10
3.1. Rausvažiedės ežiuolės, kaip vaistinio augalo charakteristika 10 3.2. Rausvažiedės ežiuolės biologiškai aktyvios medžiagos bei jų veikimo mechanizmai 10 3.3. Priešuždegiminis ir imunostimuliuojantis rausvažiedės ežiuolės preparatų veikimas 13 3.4. Antiandrogeninis rausvažiedės ežiuolės biologiškai aktyvių medžiagų veikimas 15 3.5. Gerybinės prostatos hiperplazijos patogenezės patofiziologiniai mechanizmai 16 3.6. Urogenitalinės sistemos reprodukcinė funkcija 19
3.6.1. Hormoninė spermatogenezės reguliacija 20
3.6.2. Antsėklidžio įtaka spermatogenezei 20
3.7. Gerybinės prostatos hiperplazijos diagnostika 21
3.8. Konservatyvus gerybinės prostatos hiperplazijos gydymas 24
3.9. Chirurginis gerybinės prostatos hiperplazijos gydymas 27
4. TIRIAMOJI MEDŽIAGA IR METODAI 29
4.1. Rausvažiedės ežiuolės ekstrakto gamybos schema 29
4.2. Histologinių preparatų paruošimas 31
4.2.1. Tiriamosios medžiagos įliejimo į parafiną metodika 31
4.2.2. Tiriamosios medžiagos pjaustymo metodika 32
4.2.3. Histologinių preparatų dažymo metodika 33
4.3. Kiti tyrimų metodai 34
4.3.1. Prostatos dydžio bei masės tyrimas 34
4.3.3. Antsėklidžio tyrimai 41
4.3.4. Žiurkių patinų kastracija 43
4.3.5. Eksperimentinis gerybinės prostatos hiperplazijos modelis 44
4.3.6. Statistinė duomenų analizė 38
5. REZULTATAI 46
5.1. Rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikis žiurkių prostatai 46 5.2. Rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikis žiurkių patinėlių spermatogenezei 51 5.3. Rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikis eksperimentinei gerybinei žiurkių prostatos hiperplazijai 58 6. REZULTATŲ APTARIMAS 68
6.1. Ežiuolės ekstrakto įtaka žiurkių patinėlių prostatai 68 6.2. Ežiuolės ekstrakto įtaka žiurkių sėklidei ir anstėklidžiui 69
6.3. Ežiuolės ekstrakto įtaka eksperimentinei gerybinei žiurkių prostatos hiperplazijai 71 7. IŠVADOS 76 8. PUBLIKACIJOS 77 9. LITERATŪROS SĄRAŠAS 10. PADĖKOS 78 92
SANTRUMPOS
ABP - androgenus sujungiantis baltymas ΑTNF – naviko nekrozės faktorius
DHT - dehidrotestosteronas
FSH – folikulą stimuliuojantis hormonas GPH – gerybinė prostatos hiperplazija IFN – interferonas
IL – interleukinas
KMUK – Kauno medicinos universiteto klinikos LH – liuteinizuojantis hormonas
AŠTS – apatinių šlapimo takų simptomai Mts – metastazės
NK – natūralus T limfocitas - žudikas
PHA - T limfocitų mitogenas-fitohemagliutininas. P/KS - prostatos masės*100/kūno masės santykis
PS – polisacharidai
PSA – prostatos specifinis antigenas PSI – polisacharidas I PSII – polisacharidas II T - testosteronas TCD8 – T limfocitas- slopintojas TGF-β - augimo faktoriaus Th – T limfocitas- pagalbininkas
TNF – navikų nekrozės faktorius
TPSS – tarptautinė prostatos simptomų skalė TUR – transuretrinė rezekcija
1. ĮVADAS
1.1. Darbo aktualumas
Pastaraisiais metais vis daugiau vyrų skundžiasi šlapinimosi sutrikimais, kurių
dažniausiai atsiranda dėl prostatos patologijos [37,59,2]. Gerybine prostatos hiperplazija (GPH) serga vis jaunesnio amžiaus vyrai, kurie skundžiasi įvairaus pobūdžio bei intensyvumo šlapinimosi sutrikimais. Tai dažna vyrų patologija, be to gyvenimo būdas ir mityba lemia ligų, tarp jų tame tarpe ir gerybinės prostatos hiperplazijos pasireiškimą [106,103,23].
GPH klinikiniai simptomai ne vien šlapinimosi sutrikimai, nes su amžiumi kinta androgenų ir estrogenų pusiausvyra vyro organizme, silpnėja libido. C.M. Porth išskiria dvi senėjimo teorijas, kurios aiškina biologinius pakitimus, atsirandančius su amžiumi: Pirmoji – genetiškai programuotų pakitimų teorija, kuri teigia, kad su amžiumi atsirandantys pokyčiai genetiškai užprogramuoti; antroji – stochastinė teorija, kuri aiškina, kad pokyčiai priklauso nuo individualių organizmo savybių. Žinoma neuroendokrininė senėjimo teorija. Ji apima tris pagrindines šio sudėtingo proceso dalis: 1) pagreitėjusį hormonų nykimą 2) sumažėjusią hormonų sintezę ir sekreciją 3) sumažėjusį audinių-taikinių receptorių jautrumą hormonams [45].
Gerybinės prostatos hiperplazijos diagnostikos ir gydymo būdai nuolat tobulėja ir kinta. GPH gydymas – paciento gyvenimo kokybės ir būklės gerinimas, apatinių šlapimo takų sukeliamų varginančių simptomų mažinimas. Pasaulyje sukaupta didelė GPH chirurginio gydymo patirtis, tačiau šiuo būdu gydomų pacientų nuolat mažėja. Medikamentiniam gydymui teikiamas vis didesnis dėmesys, tai buvo pabrėžta ir tarptautinėje Poltavos konferencijoje, įvykusioje 2004m. [65,50]. Gana dažnas pooperacinių komplikacijų skaičius, ypač jaunesniems pacientams, skatina ieškoti naujų konservatyvaus gydymo metodų [65,75]. Išsamios urodinaminių tyrimų studijos atskleidžia įvairaus laipsnio šlapinimosi sutrikimus bei padeda pasiekti optimalią šlapinimosi sutrikimų korekciją [30,1]. Dažniau taikomas konservatyvaus gydymo būdas skatina medikus ieškoti naujų preparatų, tarp jų fitopreparatų, kurie pasižymėtų politerapiniu veikimo, būtų augaliniai ir vyresnio amžiaus vyrams būtų galima riboti cheminių medikamentų vartojimą. Vyresnio amžiaus žmonėms lėtėja medžiagų apykaita, o kartu kinta ir imuninis atsakas [106]. Vis daugiau vyresnio amžiaus žmonių serga širdies ir kraujagyslių sistemos, onkologinėmis ligomis. Vyresni vyrai dažniau serga GPH
ir alerginėmis ligomis. Išsivysčius gerybinei prostatos hiperplazijai ir susidarius urostazei, susidaro sąlygos infekcijos sukeltoms komplikacijoms, o vyresnių vyrų imunitetas ir taip yra silpnesnis. Kinta periferinio kraujo leukocitų formulė, vyrauja limfopenija, neutrofilija, mažėja IL-1, IL-2 ir γ interferono gamyba, silpnėja jų funkcija. Todėl, gydant GPH, būtina aktyvinti imuninę sistemą, o tam reikalingi imunostimuliatoriai [4].
Genų inžinerijos būdu pagaminti arba sintetiniai imunostimuliatoriai yra brangūs be to gali sukelti pašalinių reiškinių: galvos svaigimą, odos reakciją, leukopeniją, agranuliocitozę. To išvengti galima vartojant fitoimunostimuliatorius – rausvažiedės ežiuolės preparatus [11,47,62].
Savo sudėtyje turinti polisacharidų, fitosterolių, fenolinių kavos rūgšties junginių kt. rausvažiedė ežiuolė pasižymi daugialypiu imunostimuliuojančiu, priešuždegiminiu, priešvirusiniu, priešvėžiniu, radioprotekciniu veikimu [31,78,102,107]. Kadangi ežiuolė savo sudėtyje turi daug veikliųjų medžiagų, tikslingai tiriamas galimas ežiuolės antiandrogeninis poveikis [100,15,56,128,62,104,105]. Fitopreparatai, pagaminti iš rausvažiedės ežiuolės plačiai vartojami JAV ir Europoje [47]. Vertinant GPH patogenezės, komplikacijų atsiradimo priežastis, gydymo taktikos tendencijas, svarbu tirti kompleksinį antiandrogeninį rausvažiedės ežiuolės preparatų poveikį GPH.
1.2. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Pastaraisias metais urologinėmis ligomis serga vis daugiau jaunesnių žmonių, todėl ieškoma efektyvesnių preparatų ir gydymo metodų, kurie stabdytų ligos progresavimą bei pagerintų gyvenimo kokybę. Dažni stresai, aplinkos užterštumas, nevisavertė mityba – visa tai veikia imuninę sistemą ir sąlygoja organizmo apsigynimo ir adaptacinių reakcijų pokyčius bei sutrikimus. Tai sudaro sąlygas atsirasti onkologinėms, autoimuninėms, virusinėms, proliferacinėms ligoms (pvz: aterosklerozė, sąnarių ligos, GPH ir kt) [111,3,101,46]. Dėl šių priežasčių būtina ieškoti naujų preparatų bei tirti naujas fitopreparatų vartojimo galimybes. Vienas tokių preparatų yra rausvažiedė ežiuolė. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad rausvažiedės ežiuolės (Echinacea purpurea) preparatų vartojimo indikacijos nuolat plečiasi [10]. Ežiuolės sudėtyje yra dar ne visiškai ištirtų augalo veikliųjų medžiagų ( pvz: lektinai, fitosteroliai, alkilamidai), kurių gydomasis poveikis gali būti platesnis. Požeminėje augalo dalyje, ypač šaknyse, yra daugiau veikliųjų medžiagų, kurios gali turėti poveikį prostatai [96,138,62,25,11]. Šį teiginį
patvirtina ir tai, kad, pavyzdžiui, urtica – dilgėlės šaknyse yra daugiau veikliųjų medžiagų, pasižyminčių antiandrogeninėmis savybėmis lyginant su antžemine šio augalo dalimi, tačiau imunostimuliuojančių savybių ji neturi.
Atlikta daug klinikinių tyrinėjimų siekiant nustatyti ežiuolės imunostimuliuojantį, priešuždegimį, priešvirusinį, priešvėžinį poveikį [36]. Tačiau mokslinių tyrinėjimų, skirtų ištirti ežiuolės veikliųjų medžiagų poveikį prostatos hiperplazijai, nėra.
Sergant GPH, dėl šlapimo stazės šlapimo pūslėje, labai padidėja apatinių šlapimo takų infekcijos tikimybė. Todėl gydant GPH kartu su simptomatiką mažinančiais preparatais skiriama ir prešuždegiminių vaistų. Ežiuolės priešuždegiminis poveikis įrodytas klinikiniais tyrimais, o antiandrogeninis – ne [51,40]. Kodėl pacientui nevartoti vieno, politerapinio preparato, saugaus augalinės kilmės, vietoje kelių?
Iki šiol diskutuojama, kuriems pacientams indikuotinas konservatyvus GPH gydymas, o kuriems – ne. Visame pasaulyje vykdomos multicentrinės studijos, kuriomis siekiama rasti optimaliausius GPH konservatyvaus gydymo būdus [35,137,58]. Deja galima pastebėti, kad stokojama nuoseklios GPH gydymo taktikos, kol kas nėra visuotinio mokslinio ir klinikinio konservatyvaus GPH gydymo apibendrinimo [35,137,58,119].
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti rausvažiedės ežiuolės ekstrakto antiandrogeninį poveikį
eksperimentinių žiurkių prostatai bei įvertinti ežiuolės ekstrakto vartojimo trukmės įtaką žiurkių prostatai, spermatogenezei ir nustatyti tiriamojo preparato poveikį eksperimentinei gerybinei prostatos hiperplazijai.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikį žiurkių patinėlių prostatų dydžiui
bei nustatyti preparato įtaką prostatų struktūros pokyčiams ir funkcijai.
2. Ištirti rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikį žiurkių patinėlių sėklidės ir
antsėklidės dydžiui, struktūros pokyčiams ir spermatogenezei.
3. Ištirti rausvažiedės ežiuolės ekstrakto poveikį žiurkių patinėlių prostatos dydžiui
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Vaistingojo augalo – rausvažiedės ežiuolės charakteristika
Rausvažiedė ežiuolė yra daugiametis žolinis astrinių (Asteraceae) šeimos
augalas, kurio tėvynė – Šiaurės Amerika. Auginimo technologijos ir vaistinės žaliavos kokybės tyrimai atlikti Vokietijoje, Vengrijoje, Suomijoje, Ukrainoje [17,81,87]. Nuo 1991m. tokie tyrinėjimai darbai atliekami ir Lietuvoje, VDU Kauno botanikos sode [94,95]. Ištyrus šių augalų fenologiją, biologinį produktyvumą bei vaistinės žaliavos kokybę, nustatyta, kad Lietuvoje rausvažiedė ežiuolė visiškai subręsta [94,95]. Tikėtina, kad augaliniai preparatai, pagaminti iš žaliavos, kuri išauginta tame krašte ir kurio gyventojai vartoja ją, turėtų būti geriau pasisavinami.
Rausvažiedei ežiuolei skiriamas didelis dėmesys. Tarptautinėse konferencijose JAV, Ukrainoje buvo pristatyti šio augalo gydomųjų savybių tyrimai [78,85,132]. Paskutinėje, įvykusioje 2003m., tarptautinėje Poltavos konferencijoje buvo plačiai aptarti šio augalo introdukcijos, fitochemijos, fitofarmakologijos, medicininiai ežiuolės vartojimo aspektai. Nauja buvo tai, kad tyrėjai rekomendavo šį augalą įtraukti į taip vadinamųjų funkcinių maisto papildų sudėtį.
Rausvažiedės ežiuolės preparatų vartojimas dažniausiai pagrįstas nespecifiniu imunomoduliaciniu veikimu, kuris per trumpą laiką (iki 3 savaičių) imunodeficitinių būklių metu stimuliuoja nespecifinio imuniteto ląstelinius ir humoralinius veiksnius [54]. Mokslinėje literatūroje neaptikta literatūros šaltinių, kur būtų nagrinėtas kompleksinis, tarp jų ir antiandrogeninis rausvažiedės ežiuolės preparatų veikimas.
3.2. Rausvažiedės ežiuolės biologiškai aktyvios medžiagos bei jų veikimo mechanizmai
Sergant gerybine prostatos hiperplazija metu padidėjusi prostata apsunkina
šlapinimosi tėkmę, sąlygodama šlapimo sąstovį šlapimo pūslėje. Tokia urostazė sudaro palankias sąlygas šlapimo infekcijai. Dažniausiai pacientai yra vyresnio amžiaus, dėl gl.thymus involiucijos jų imuninis atsakas būna sumažėjęs, ypač ląstelinis. Tai būdinga ir taip vadinamajam vietiniam arba urogenitalinės sistemos gleivinių imunitetui. Gleivinėje mažėja T citotoksiškų, T pagalbininkų limfocitų, NK ląstelių, kurios išsidėsto tarp
epiteliocitų [67,68]. Dėl to imunoprofilaktikai svarbios rausvažiedės ežiuolės sudėtinės dalys, skatinančios T limfocitų (fagocitų) aktyvumą.
Įvairių ežiuolės rūšių biologiškai aktyvios medžiagos išsamiai aptartos Bauer R. (1999) moksliniuose darbuose.
Jos klasifikuojamos taip:
1. Polisacharidai: neutrali frakcija - fukogalaktksilogliukanai (10-25 KD), metilogliukyronarabinoksilanas (35 KD); rūgšti frakcija – ramnoarabinogalaktanas (75-450 LD).
2. Flavonoidai: 6-kvercetino rudozidas-ramnogliukozidas, malonino derivatas-ciadinas.
3. Fitosteroliai: β-sitosterolis, kampesterolis, stigmasterolis.
4. Kofeino rūgšties konjugatai: chinino chorogeninės rūgšties eteriai, cinarinas, tartariniai eteriai-kaftorinė rūgštis, cikorinė rūgštis.
5. Glikozidai: verbaskozidas, echinakozidas. 6. Ežiuolės alkilamidai - 20 junginių.
7. Ketoalkenai ir alkinai-echinalonas
8. Eteriniai aliejai: borneolis, borneolio acetatas, germakreno pentadekadienas, farnezinas, kariofilenas.
9. Lektinai
Tiriant ežiuolės preparatų imunoprofilaktinio vartojimo indikacijas, verta paminėti, kad šiame augale yra biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių antibakteriniu veikimu. V.Jurkštienė (1998), L.V. Gorchen (2003), tirdami rausvažiedės ežiuolės ekstrakto bakteriostatines savybes, nustatė, kad jos veikia labiausiai prieš staphylococcus aureus, esherichia coli mikrobus. Antibakterinės ežiuolės savybės sietinos su echinakozidu, kurio veikimas prilygsta penicilinui. D.Schar (1999) nurodo, kad kavos rūgšties derivatai taip pat slopina staphylococcus aureus, e.coli, pseudomonas aeruginosa. Šių ežiuolės ekstraktų standartizacija taip pat atliekama pagal kavos rūgšties derivatus-cikorinę rūgštį [94]. Yra duomenų, kad echinacea rūšies augalų ekstraktai pasižymi priešgrybelinėmis (candida shehata, c. albicans,c. statulytica, c. tropicalis), prieš pirmuoninėmis (trichomonas vaginalis), priešvėžinėmis savybėmis [107,17,136,126,16,108]. Paskutiniais metais JAV net 63 proc. sergančiųjų onkologinėmis ligomis vartoja fitoprepeparatus, iš jų ežiuolės [107]. Reikia pažymėti, kad gydomasis ekstraktų - ištraukų poveikis yra didesnis, nei atskirų rausvažiedės ežiuolės sudėtinių dalių [13].
Nagrinėjant bendrus nespecifinius antibakterinio veikimo klausimus tenka priminti komplemento aktyvinimo kelius: pirmąjį – klasikinį veikiant antigeno- antikūno kompleksui; antrąjį – alternatyvųjį arba properdino. Ežiuolės sudėtyje esantys polisacharidai ypač inulinas padidina properdino koncentraciją kraujyje, kartu intensyviau aktyvinamas komplemento C36 komponentas. Toliau komplemento sistema
aktyvinama kaskadiniu principu iki C8, C9, kurie pasižymi opsonizavimu, liziniu,
makrofagus aktyvinančiu veikimu. Naujausi tyrimai parodė, kad egzistuoja ir trečias komplemento aktyvinimo kelias. Jam būtini glikoproteinai-lektinai, galintys prisijungti manozės disacharidą, kurie kartu su patogenu aktyvina C2 ir C4 komplemento
komponentus išskyrus C1. Pastarieji aktyvina C3, stimuliuoja opsonizaciją ir fagocitozę.
C3 dar aktyvina kaskadą C5-C6-C7-C8-C9 ir sukelia membranų lizę. Taip pašalinamas
patogenas-mikrobas (1 pav.). Rausvažiedės ežiuolės ekstraktai pasižymi hemagliutinacinėmis savybėmis, tačiau agliutinuoja žmogaus III Rh+kraujo grupės ir pelių eritrocitus [54].
1 pav. Komplemento aktyvinimo keliai
Šie duomenys parodė, kad ežiuolės, ypač antžeminės augalo dalies, sudėtinės dalys turi lektinų, kaip ir III kraujo grupės eritrocitų išorinės membranos antigeninės molekulės, kurios susijusios su manoze. Šiuos duomenis papildo ir kitų mokslininkų
pateikti analogiškų tyrimų duomenys [66]. Kitos galimos labiau specifinės lektinų imunostimuliuojančios savybės aptariamos toliau.
Tiriant rausvažiedės ežiuolės sudėtinių medžiagų, esančių ištraukose, biologinį veikimą – flavonoidai, perskaičiavus į kvercetiną, sudaro 0,38-0,48 proc. [61]. Rausvažiedės ežiuolės flavonoidai pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis, nes stabilizuoja kapiliarų sienelės pralaidumą, slopindami laisvųjų radikalų ir kai kurių fermentų (hialuronidazės) veikimą. Šis veikimas susijęs su luteolino, kamferolio, kvercetino, apigenino, izorhamnetino veikimu. Luteolinas, kamferolis pasižymi antihistamininiu veikimu, o kvercetinas – priešalerginiu.
Ežiuolės ištraukose randami eteriniai aliejai – tai borneolis, bornilacetatas, pentadeka-8-en 2-on, kariofilen, vanilinas, 1,8Z – pentadekadienas tiesiogiai veikia antimikrobiškai, antivirusiniai, priešuždegimiškai ir pasižymi priešvėžiniu veikimu [118]. Atlikus eksperimentus su laboratoriniais gyvūnais, kuriems yra išsivysčiusi leukemija P-388 ir sarkoma, nustatyta, kad 1,8Z – pentadekadienas inhibuoja navikines ląsteles [12].
Kita grupė biologiškai aktyvių medžiagų yra alkilamidai. Pagrindiniai šios grupės atstovai - echinaceinas ir izobutilamidai [12,92]. Jie pasižymi priešuždegiminiu veikimu, aktyvina makrofagus, stimuliuoja fagocitozę. Izobutilamidas komplekse su ciklodekstrinu pasižymi ne tik imunostimuliuojančiomis savybėmis, bet šie junginiai įeina į preparatų, vartojamų GPH gydyti, sudėtį [12,92,118,92].
Rausvažiedės ežiuolės ekstraktuose randama augalinių sterolių. Tai β-sitosterolis, kampesterolis, β-sitosterolis -3-β-D-gliukozidas, stigmasterolis [70,5,22].. Šių medžiagų veikimo mechanizmas dar tyrinėjamas.
3.3. Priešuždegiminis ir imunostimuliuojantis rausvažiedės ežiuolės preparatų veikimas
Imunostimuliuojančios, priešuždegiminės rausvažiedės ežiuolės sudėtinių medžiagų savybės daugiausiai priklauso nuo augale esančių polisacharidų, glikoproteinų, kavos rūgščių eterių, vandenyje tirpių alkilamidų veikimo. Ankščiau šios grupės medžiagoms apibūdinti vartotas nespecifinių fitoimunostimuliatorių terminas, tačiau kiti autoriai jas vadina imunokoreaguojančiomis, imunostimuliuojančiomis, imunoterapinėmis, imunomoduliuojančiomis ir imunotropinėmis [36].
Imunotropinių arba imunomoduliatorių vartojimas indikuotinas tik po to, kai įvertinama organizmo imuninės sistemos būklė. E.Moncevičiūtė-Eringienė 1994m.
pasiūlė imuninės sistemos būklę klasifikuoti įvertinant amžių, natūralius antikūnus ir leukocitus. Ji išskyrė normalią, stimuliuotą (ikislenkstinę), stimuliuotą, stimuliuotą su deficitu ir nuslopintą imuninės sistemos būkles. Šis tyrimas tik iš dalies susijęs su fitoimunostimuliatorių veikimu, todėl imuninės sistemos būklių įvertinimo išsamiau nenagrinėjome.
Vandeniniuose rausvažiedės ežiuolės ekstraktuose imunostimuliuojančiomis savybėmis pasižymi polisacharidai (PSI ir PSII). Jie stimuliuoja fagocitozę in vivo ir in vitro, makrofagai intensyviau sekretuoja αTNF, 2βIFNs [12]. Kiti polisacharidai: inulinas, lektinai, krakmolas, celiuliozė taip pat gali stimuliuoti imuninę sistemą. Rausvažiedės ežiuolės šaknų ekstraktuose randamas didesnis kiekis inulino, kuris aktyvina ir komplemento sistemą.
Polisacharidų izoliuota frakcija – B echinacinas taip pat lemia rausvažiedės ežiuolės priešuždegiminį veikimą ir susijęs su mikrobų hialuronidazės slopinimu, kuri, keisdama mukopolisacharidų polimerizaciją, didina tarpląstelinių tarpų pralaidumą ir taip slopina infekcijos išplitimą. Polisacharidai: fukogalaktoksilogliukanas, α-arabinogalaktanas skatina makrofagus, kurie intensyviau sekretuoja 1-IL, β-interferoną. Atskiri rauvažiedės ežiuolės ekstraktuose randami polisacharidai aktyvina įvairias imuninės sistemos grandis, todėl jų suminis veikimas yra efektyvesnis, nei atskirų frakcijų.
Oligosacharido ir baltymo-glikoproteino junginys arba lektinas dar vadinamas T limfocitų mitogenu-fitohemagliutininu (PHA). Rausvažiedės ežiuolės lektinai taip pat pasižymi pasirinktinėmis eritrocitus agliutinuojančiomis savybėmis. Preparatai pagaminti iš rausvažiedės ežiuolės šaknų efektyviau skatina T limfocitus periferiniame kraujyje eksperimento sąlygomis [52]. Fitolektinai pasižymi polikloniniu aktyvinimu ir veikia per T limfocitų TCR, CD3 receptorius. Rausvažiedės ežiuolės šaknų ekstraktai in vivo ir in
vitro eksperimento sąlygomis skatina Th (T limfocitų pagalbininkus), kurie stimuliuoja B
limfocitus gaminti antikūnus. Tiriant pacientus, sirgusius viršutinių kvėpavimo takų ligomis, rausvažiedė ežiuolė taip pat skatino limfocitų gamybą, TCD3, BCD19, CD4, TCD8,
CD4/CD8 indeksą periferiniame kraujyje ir pagreitino pasveikimą (Jurkštienė, 2000).
Galima teigti, kad limfocitų gamybą stimuliuojantis ežiuolės sudedamųjų dalių veikimas pageidautinas gydant ligonius, sergančius GPH. Tiriant kitus nespecifinio imuniteto veiksnių stimuliavimo mechanizmus, svarbūs yra fagocitozės aktyvavimo procesai. Rausvažiedės ežiuolės preparatai skatina fagocitozę in vitro ir in vivo. Tai nustatyta tiriant fagocitozės aktyvumą ir nustatant fagocitozės indeksą [26,121,102,86,90].
Šiame skirsnyje aptartos rausvažiedės ežiuolės imunostimuliuojančios, priešuždegiminės savybės, tačiau tai priklauso nuo augalo preparatų vartojimo dozės ir vartojimo trukmės [32,29]. Imunostimuliuojančios augalo savybės net ir po imunosupresijos pasireiškia preparatą vartojant 21-25 dienas, vėliau gali išryškėti neigiama imunomoduliacija.
3.4. Antiandrogeninis rausvažiedės ežiuolės biologiškai aktyvių medžiagų veikimas
Dėl įvairialypio naudingo poveikio organizmui rausvažiedė ežiuolė pradedama vadinti „visagaliu“ vaistiniu augalu. Rausvažiedė ežiuolė savo sudėtyje turi daugybę farmakologiškai ir biologiškai aktyvių medžiagų, mokslininkai skiria didelį dėmesį šio augalo sudėtinių dalių tyrinėjimui. Be imunostimuliuojančio, priešvirusinio, antigrybelinio, antibakterinio, priešvėžinio veikimų ežiuolė pasižymi ir antiandrogeniniu poveikiu. Dėl savo, kaip vaistinio augalo, veiksmingumo ir saugumo rausvažiedės ežiuolės ekstrakta, vis dažniau pasirenkami klinicistų.
Antiandrogeninis rausvažiedės ežiuolės poveikis daugiausiai priklauso nuo joje esančių fitosterolių. Šio augalo šaknys turi daugiau gydomųjų savybių negu antžeminė dalis [96]. Lipofilinė ežiuolės frakcija, kuriai priklauso fitosteroliai, gydomųjų savybių turi daugiau negu hidrofilinės frakcijos [121,12]. Augalo β-sitosterolio cheminė struktūra panaši į cholesterolio, tačiau veikimo mechanizmas skirtingas. Skirtinga rezorbcija žarnyne, taip pat jų metabolinis ciklas. Jie pasižymi konkurentiškumu [18,124]. Daugelio klinikinių ir mokslinių tyrimų apžvalgose β-sitosterolis, kaip ir stigmasterolis, kampesterolis rezorbuodamiesi virškinamajame trakte konkuruoja su cholesterolio rezorbcija. Vartojant fitosterolių mažėja mažo tankio lipopreoteinų ir bendras cholesterolio kiekis kraujyje, paraleliai slopinama testosterono biosintezė iš cholesterolio [79,124]. Paminėtina, kad tokios medžiagos kaip flovanoidai, glikozidai, polisacharidai, proteinai mažina gliukozės koncentraciją kraujyje. Β-sitosterolis, β-retinolis, saponinas, mevinolinas tai hipocholestereminiai junginiai, o heparinai, statinai, grybelinės proteazės pasižymi antitromboliziniu poveikiu [124]. Iš jų stipriausiu cholesterino sintezę slopinančiu veikimu pasižymi β-sitosterolis [24].
Naujausi klinikiniai, dvigubai akli randomizuoti moksliniai tyrimai su ežiuolės ekstraktais rodo tendenciją, kad šis augalas bus vis plačiau vartojamas medicinoje [70,79,128,100]. Eksperimentinių tyrimų duomenimis pažymima, kad ežiuolės preparatai mažina dehidrotestosterono kiekį kraujyje, kinta reprodukcinė organų funkcija ir masė
[79,100]. Dabar didelis dėmesys skiriamas onkourologijai. Fitosteroliai slopina pelių PC-3 prostatos karcinomos ląstelių augimą. Grupėje su fitosteroliais žiurkių prostatų naviko dydis ir sritinių limfmazgių metastazių skaičius bei jų dydis, statistiškai reišmingai koreliuoja su β-sitosterolio ir kampesterolio naudojimu. Šioje studijoje vartojimo metu nustatyta, kad fitosteroliai slopina karcinogenezę bei metastazavimą, inhibuodami PC-3 ląstelių augimą ir proliferaciją (in vivo ir in vitro) [6].
Vis daugiau vyrų, be to, jaunesnio amžiaus serga GPH ir prostatos karcinoma, todėl tikslinga tirti ir ieškoti naujų, saugių bei veiksmingų medikamentų, pasižyminčių politerapinėmis savybėmis. Dėl to šiam tyrimui pasirinktas vienas pasaulyje populiariausių fitopreparatų – ežiuolė. Dėl augalo sudėtinių dalių antiandrogeninio, priešvėžinio veikimo siekiama nuodugniau ištirti pranašumus ir palyginti juos su kitais fitopreparatais bei rekomenduoti naujus gydymo metodus.
3.5. Gerybinės prostatos hiperplazijos patogenezės patofiziologiniai mechanizmai
Audinių diferenciacija, fiziologija, funkcija ir prostatos audinių vešėjimas priklauso nuo androgeninės stimuliacijos. Pagrindinės androgenus gaminančios liaukos yra sėklidės, kuriose Leydigo ląstelės išskiria androgenus. Testosteronas yra lytinių hormonų pirmtakas, jo sintezei reikalingas cholesterolis. Testosterono biosintezės etapas sėklidėse, kaip ir antinkščiuose, yra pregnenolono susidarymas. Vėliau testosterono biosintezė iš pregnenolono vyksta dviem keliais: progesteroniniu (Δ4) ir
dehidroepiandrosteroniniu (Δ5).(2 pav.).
Pagrindinis testosterono metabolitas yra dehidrotestosterono (DHT) aktyvi hormono forma, kurio sintezė reguliuojama fermento 5-alfareduktazės. Suaugusių vyrų kraujo plazmoje DHT yra 10 kartų mažiau nei testosterono. Daugelio žinduolių, tarp jų ir žmogaus, kraujo plazmoje yra β-globulino (lytinius hormonus sujungiantis globulinas), kuris labai giminingas su testosteronu, o pagrindinė jo funkcija - laisvojo testosterono koncentracijos reguliavimas kraujo plazmoje.
Tik nedidelė testosterono dalis aromatizuojama iki estradiolio (1-5 proc.). Eksperimentiniai modeliai su gyvūnais parodė, kad estrogenai dalyvauja GPH patogenezėje, nors estrogenų įtaka prostatos vešėjimui dar nepakankamai ištirta [33]. Žinomos mažiausiai dvi estrogenų receptorių formos: α-receptoriai - prostatos stromos ląstelėse, β-receptoriai – epitelinėse ląstelėse [131]. Eksperimentais su šunimis nustatyta, kad estrogenai ir androgenai veikia sinergistiškai ir sukelia eksperimentinę GPH. Estrogenai įjautrina androgenams jautrius receptorius [8,69]. Serumo ir intraprostatinis estrogenų kiekis vyrams su amžiumi didėja. Eksperimentinių studijų su aromatazės inhibitoriais duomenimis, mažėjant intraprostatiniam estrogenų kiekiui, mažėja ir stromos kiekis GPH modelyje. Pataruoju metu estrogenų reikšmė GPH vystymuisi nepakankamai įrodyta palyginus su androgenais [71].
Kita gana svarbi GPH etiologinių veiksnių grupė yra augimo faktoriai. Iki šiol išsamiausiai paaiškinanti GPH patogenezę yra Tenniswood'o hipotezė (Tenniswood 1986). Remiantis ja, prostatos vystymasis priklauso nuo androgenų, kurie aktyvuoja stromą. Stromoje sintezuojamas epitelio vešėjimą aktyvuojantis augimo faktorius, o aktyvuojamas epitelis gamina stromos vešėjimą skatinantį augimo faktorių. Taip susidaro uždaras aktyvacijos ratas tarp stromos ir epitelio. GPH pradeda vystytis dėl to, kad mažėja šio stromos vešėjimą stabdančio faktoriaus gamyba arba dėl to, kad sumažėja stromos jautrumas slopinančio pobūdžio signalams iš epitelio. Dėl to gali prasidėti šio uždaro rato tarp stromos ir epitelio reaktyvacija, susijusi su augimo mechanizmų reaktyvacija (3 pav.).
3 pav. Sąveika tarp stromos ir epitelio (Teniswoodo hipotezė). KAF – keratocitų augimo
faktorius, EAF – epidermio augimo faktorius, TAFβ – transformuojantys augimo faktoriai
Moduliuodamas augimo faktorių pokyčius, dehidrotestosteronas turi įtakos genams, susijusiems su ląstelių proliferacija ir apoptoze. Aktyvių ląstelių mirtis vyksta natūraliai, prostatos latakų proksimaliniuose segmentuose esant normaliai plazmos testosterono koncentracijai. Androgenai slopina ląstelių mirtį prostatoje [14].
Dehidrotestosteronas tiesiogiai skatina ląstelių diferenciaciją, todėl GPH yra proliferacinių, diferenciacinių, apoptozinių procesų, kurie veikiami DHT ir yra tarpusavio sąveikos sutrikimo pasekmė. Vis dėl to lemiantys veiksniai GPH vystytis yra amžius ir sėklidžių androgenų poveikis.
3.6. Urogenitalinės sistemos reprodukcinė funkcija
Spermatogenezė tai hormoninių, parakrininių ir autokrininių mechanizmų
kompleksas, kuris reguliuoja lytinių ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją [76]. Sėklidėse esančių sėklinių vamzdelių Sertoli ląstelės palaiko germinacinių ląstelių vystymąsi. Sertoli ląstelės vaidina svarbų vaidmenį spermatogenezės reguliacijoje. Jų ryšys su germinacinėmis ląstelėmis palaiko parakrininę kamieninių ląstelių reguliaciją. Kiekviena
individuali Sertoli ląstelė kontaktuoja su penkiomis kaimyninėmis šio tipo ląstelėmis ir su 47 šalia esančiomis germinacinėmis ląstelėmis visų vystymosi stadijų metu. Individualios ląstelės galimybė kontaktuoti su 50 kaimyninių ląstelių rodo svarbią šių ląstelių sąveiką. Sertoli ląstelės gauna mitybą ir signalus iš aplinkinių ląstelių kraujotakos, tada perneša reikalingas maistines medžiagas kamieninėms ląstelėms, kartu su parakrinine reguliacija kontroliuoja jų vystymąsi. Šios ląstelės tai pat dalyvauja fagocitozėje ir pinocitozėje šalinant žuvusias ląsteles. Yra duomenų, kad Sertoli ląstelės riboja germinacinių ląstelių kiekį ir gamina faktorių FasL, kuris tiesiogiai potencijuoja kamieninių ląstelių žūtį [43,44,110]. Taip grindžiama ląstelių apoptozė kartu su grįžtamuoju signalu Sertoli ląstelėms. Tačiau tiksli kamieninių ląstelių apoptozė nėra visiškai aiški, nes manoma, kad įtakos gali turėti tyrinėjamų faktorių, tokių kaip, SCF/c-kit sistema, Fas/fas ligandų sistema, Bcl-2 šeiminiai proteinai ir kaulų morfogenetiniai protein-8a ar 8b, kurie turi įtakos germinacinių ląstelių apoptozei [28,76].
Intersticinis audinys tarp kapiliarų endotelio ir elastingų sėklinių vamzdelių jungčių, maitina Leidigo ląsteles, o šios gamina pagrindinį vyrišką lytinį hormoną testosteroną [73]. Žinduolių spematogenezė vyksta sėklinių vamzdelių viduje, iš kur spermatozoidai keliauja į sėklidės tinklą ir juda į antsėklidį. Procesas, kai spermatogonijos virsta spermatozoidais, vadinamas spermatogenezė. Šiame sudėtingame procese spermatogoninės ląstelės patiria mitozinį du spermatocitų mejozinius dalijimusis, intensyvų morfologinį spermatidžių remodeliavimąsi ir subrendusių spermatozoidų patekimą į sėklinius latakus. Spermatogoninė stadija trunka – 8 dienas, mejozė tęsiasi 13 dienų, o spermiogenezė - 14 dienų [77]. Pavyzdžiui, žiurkės organizme visas spermatogenezės vystymosi procesas nuo kamieninės ląstelės iki spermatozoido subrendimo trunka apie 35 dienas, panašiai kaip ir žmogaus, todėl urogenitalinės sistemos eksperimentams tinka pasirinkti žiurkių patinus.
3.6.1. Hormoninė spermatogenezės reguliacija
Normali spermatogenezė neįmanoma be darniai funkcionuojančios hipotalamo-hipofizės sistemos. Du pagrindiniai gonadotropinai tai liuteinizuojantis (LH) ir folikulą stimuliuojantis (FSH) hormonai reikalingi spermatogenezei. LH netiesiogiai reguliuoja spermatogenezę, stimuliuodamas testosterono T gamybą Leidigo ląstelėse. Didelė vietinė testosterono koncentracija Leidigo ląstelėse susijungia su Sertoli ląstelių
intraceliuliniais receptoriais bei peritubulinėmis mioidinėmis ląstelėmis ir reguliuoja spermatogenezę. Neseniai atliktiems moksliniams tyrimams buvo pasirinktos dvi eksperimentinės žiurkių grupės. Pirma - simultaniškai sukeltas LH receptorių nepakankamumas, antra - su LHR vyrų inaktyvuota receptorių mutacija tam pačiam nustatytam fenotipui. Mutuotų žiurkių spermatidžių stadijos spermatogenezė mutuotoms žiurkėms buvo sustabdyta ir Leidigo ląstelių kiekis labai sumažėdavo [53,98].
Folikulą stimuliuojančio hormono (FSH) svarba spermatogenezei tampa vis svarbesnė. Tyrimai parodė, kad vyrams, kuriems buvo inaktyvuotas FSH receptorių geno mutacija, spermatogenezės stadijos metu spermos kiekis sumažėjo, taip pat ir sumažėjo sėklidės masė. Be to, FSH β-subvieneto nepakankamumas pelėms visiškai sustabdo spermatogenezę. Šių pelių sėklidės tapo mažesnės, taip pat sumažėjo Sertoli ir germinacinių ląstelių kiekis. Nustatyta, kad hipogonadotropinėms pelėms dirbtinai sukelti FSH ir LH kiekiai buvo nenustatomi, o spermatogenezė gali būti inicijuojama testosteronu, tačiau šiuo atveju spermos kiekis esti minimalus.
FSH vaidina svarbų vaidmenį spermatogenezės patogenezėje dar ir todėl, kad šis hormonas kontroliuoja spermos kiekį, stimuliuodamas Sertoli ląstelių proliferaciją prenataliniu ir postnataliniu periodais bei moduliuoja Sertolio ląstelių produktus, pvz:, androgenus sujungiančio baltymo (ABP), transferino, testibumino, interleukino-1, inhibino, augimo faktoriaus (TGF-β), poliaminų, laktatų kiekius įvairiais spermatogenezės vystymosi etapais [77,109].
3.6.2. Antsėklidžio įtaka spermatogenezei
Antsėklidžio ir jo latakų įtaka spermatogenezei taip pat svarbi. Nors spermos transporto, jos brendimo ir saugyklos prielipe mechanizmai nėra visiškai aiškūs, tačiau skysčio, homogenato sekrecija į prielipo spindį ir jos svarba spermatogenezei įrodyta [43]. Studijos su gyvūnais parodė, kad antsėklidžio (epididymis) funkcijos priklauso nuo androgenų [43,44,133,134,135,110]. Bilateralinė kastracija ne tik sumažina prielipo androgenams priklausančių proteinų kiekį, bet sumažina ir prielipo masę bei “sukelia sąmyšį” histologinėje kontrolėje. Prielipas užtikrina spermatozoidų judėjimą ir jų vaisingumą. Pagrindiniai antsėklidžio funkciją reguliuojantys hormonai yra dehidrotestosteronas ir 5α-androstan-3αβ-diolis, tiek žmonių tiek gyvūnų yra antsėklidžio homogenate. Studijos su laboratoriniais gyvūnais parodė, kad antsėklidžio sekreto
biocheminė sudėtis skiriasi nuo kraujo serumo. Be to, proteinų kiekiai ir osmoliariškumas skirtingose prielipo vietose kinta skirtingai [135,110]. Šie duomenys rodo, kad visos sistemos ir jungiančios grandys, valdomos neurohumoraliniu keliu, lemia kokybišką spermatogenezę ir vaisingumą. Dėl šių priežasčių intensyviai tyrinėjama ligų, tarp jų ir GPH įtaka spermatogenezei bei ieškoma naujų patofiziologinių bei patomorfologinių poveikio mechanizmų.
3.7. Gerybinės prostatos hiperplazijos diagnostika
Gerybinė prostatos hiperplazija ir jos progresavimas priklauso nuo įvairių tarpusavyje susijusių veiksnių: ląstelių tarpusavio sąveikos, neuroendokrininių faktorių, aplinkos bei paveldimumo [45]. Tačiau GPH lemiantys veiksniai yra amžius ir sėklidžių androgenų poveikis. Epidemiologiniais tyrinėjimais įrodyti klinikiniai GPH progresavimo simptomai. Labai svarbu nustatyti, ar dažnai atsiranda ūminis šlapimo susilaikymas, ar kinta šlapimo srovė, progresuoja simptomatika. Naujausi klinikiniai tyrimai rodo, kad GPH progresuojanti liga, tačiau kiekvienam sergančiajam pasireiškia skirtingai. Silpnėjanti šlapimo srovė, liekamojo šlapimo kiekio šlapimo pūslėje didėjimas, maudžiančio pobūdžio skausmai pilvo apatinėje dalyje rodo greitą ligos progresavimą. Tai sudaro palankias sąlygas šlapimo takų infekcijoms, ūminiam šlapimo susilaikymui, šlapimo pūslės raumens dekompensacijai. Tačiau apatinių šlapimo takų simptomų (AŠTS) stiprėjimas yra vienas svarbiausių, rodančių ligos progresavimą [99].
Obstrukcijai nustatyti atliekami tyrimai, kuriais remiantis būtų galima numatyti stebėsenos arba optimalaus gydymo taktiką. GPH simptomų atsiradimas yra pagrindinė paciento kreipimosi į gydytoją priežastis. Norint susisteminti GPH sukeliamus simptomus, jai parengta daug klausimynų, kuriuos naudojant galima standartizuoti šlapinimosi sutrikimus. Boyarsky 1977m. pateikė devynių klausimų klausimyną, kurį naudojant galima įvertinti tiek obstrukcinius, tiek iritacinius apatinių šlapimo takų simptomus. Tačiau šį klausimyną pildydavo gydytojas todėl klausimynas nebuvo pakankamai objektyvus ir patikimas. P.O. Medsen ir P.Iversen 1983m. parengė kitą klausimyną, kuris buvo labiau specifinis. Jame nebuvo klausimų, kuriais remiantis būtų galima įvertinti dažną šlapinimąsi ir šlapimo susilaikymą. Vėliau Maine Medical Assessment Programe (MMAP) 1988m, Beier-Holgerson 1990m, Bardsley 1992m, Veterans Affairs 1993m, siūlė, pritaikė naujus klausimynus, kurie dėl subjektyvių ir objektyvių priežasčių urologų nenaudojami. Tačiau poreikis, kad paciento būklės
įvertinimas būtų standartizuotas juridiškai visuotinai, paskatino visas pasaulio urologų draugijas teikti naujus pasiūlymus. Ir 1992 m. JAV urologų asociacijai M.J.Barry ir kt. pasiūlė Amerikos urologų prostatos simptomų indeksą (AUA-SI), kurio pagrindu parengta tarptautinė prostatos simptomų skalė (TPSS). Į šią skalę įtrauktas naujas klausimas apie paciento gyvenimo kokybę [9,10]. Šis klausimynas patvirtintas PSO ir plačiai naudojamas. Klausimyno skalę sudaro septyni klausimai ir svarbiausias gyvenimo kokybės klausimas. Balų sistema aiškinama taip: 0-7 balai – lengvas sutrikimas; 8-18 – vidutinis; 19-35 – sunkus sutrikimas. Gyvenimo kokybės skalė padeda gydytojui sužinoti paciento požiūrį į savo būklę ir sieti ją su apatinių šlapimo takų simptomais. Paciento požiūris gyvenimo eigoje gali kisti priklausomai nuo simptomų pokyčių bei paciento adaptacijos, todėl naudojant šią skalę įmanoma kiekybiškai įvertinti šlapinimosi sutrikimų subjektyvųjį aspektą. Jeigu pradinio tyrimo metu gyvenimo kokybės kriterijus diagnostikai nėra labai svarbus, tai periodinis jo vertinimas vėliau, kai vartojami vaistai, tampa reikšmingu gydymo efektyvumo vertinimo kriterijumi [60].
Progresuojant GPH, vienas dažniausių simptomų yra šlapimo srovės susilpnėjimas. Šlapinimosi greitis susijęs su prostatos spaudimu į šlaplės proksimalinę dalį, priklauso ir nuo šlapimo pūslės kaklelio, prostatos bei šlaplės lygiųjų raumenų kontraktiliškumo. Norint nustatyti minėtų jėgų poveikį šlapimo srovei, atliekamas urodinaminis tyrimas [74]. Šis tyrimas laikomas pačiu objektyviausiu vertinant apatinių šlapimo takų obstrukciją, bet jis yra invazinis, brangus ir ilgai atliekamas. Reikia paminėti, kad šis tyrimas yra atliekamas Kauno medicinos universiteto klinikose.
Labiausiai paplitęs laisvos šlapimo srovės nustatymo tyrimas, tačiau šio tyrimo išvados negali būti vertinamos vienareikšmiškai, nes neatspindi galimos obstrukcijos kilmės. Ir gydymo veiksmingumas nuspėjant gydymo rezultatus įvairių autorių duomenimis, vertinant tik srovės greitį, abejotinas. Dabar šis tyrimas yra vienas dažniausiai rekomenduojamų atlikti diagnostinių tyrimų diagnozuojant GPH. Tarp gydytojų ir toliau nėra vieningos nuomonės dėl Qmax – maksimalios šlapimo srovės
parametro dydžio koreliacijos su apatinių šlapimo takų obstrukcija. S.Madersbacher (1996), ir kt. duomenimis pateikia, kad kai Qmax <5 ml/s, obstrukcija randama apie 85
proc. pacientų, kai Qmax5-10 ml/s, obstrukcija nustatoma tik 60 proc., o kai 10-15 ml/s –
obstrukcija diagnozuojama tik 45 proc. pacientų. Kitų autorių duomenys panašūs, taigi galima daryti išvadą, kad nėra stiprios koreliacijos tarp Qmax ir obstrukcijos. Olmsted
studija rodo, kad Qmax tiesiogiai priklauso nuo tiriamojo amžiaus. Vyresniems negu 70
kaip 80 metų vyrų, kurių Qmax tarp 10 ir 15 ml/s, obstrukcija urodinamiškai nebuvo
nustatyta [125]. Tokie statistiškai nereikšmingi duomenys tarp srovės greičio, obstrukcijos dydžio ir amžiaus, neleidžia numatyti gydymo rezultatų, todėl papildomai įtraukiami kiti diagnostikos kriterijai, kuriais remiamnti galima lengviau diagnozuoti GPH [88].
Kitas diagnostikai svarbus parametras yra prostatos dydis. Tai svarbus rizikos faktorius vertinant GPH simptomų ryškumą bei galimą šlapimo susilaikymą. Vyrams, kuriems prostatos tūris didesnis kaip 30 ml, tikimybė susirgti ūmininiu šlapimo susilaikymu yra tris kartus didesnė. Visgi obstrukcijos dydis tiesiogiai su prostatos dydžiu nekoreliuoja, nes esant ir nedidelio tūrio prostatai simptomatika gali būti ryški, o srovės greitis gali būti mažas [52].
Prostata vertinama pirštu čiuopiant liauką per išeinamą angą ir tai yra tinkamas būdas prostatos konsistencijai ir simetriškumui įvertinti. Jos tūris nustatomas ultragarsiniu tyrimu (transabdominaliniu, transrektiniu būdu), arba atliekant kompiuterinę tomografiją ir magnetinių branduolių rezonanso tyrimą. Atliekant ultragarsinį prostatos tyrimą per pilvo sieną, tiksliai sunku išmatuoti liaukos zonas, tačiau šiuo būdu pakankamai tiksliai išmatuojamas bendras prostatos tūris. Pasirinkus transrektinį ištyrimą, galima tiksliau įvertinti prostatos zonas. Prostatos tūrio matavimui dažniausiai taikoma elipsės formulė (0,523 x skersinis diametras2 x priekinis-užpakalinis diametras) [130].
Liekamojo šlapimo kiekio nustatymas įtraukiamas į rekomenduojamų diagnostinių tyrimų sąrašą. Šio tyrimo duomenys gali rodyti obstrukcijos dydį, tačiau tikslios obstrukcijos priežasties nustatyti negalima. Dabar vis daugiau klinikinių tyrimų rodo, kad liekamojo šlapimo kiekis nekoreliuoja su TPSS simptomų skale, prostatos dydžiu bei šlapinimosi greičiu, todėl įtarus infravezikinę obstrukciją, rekomenduojama atlikti urodinaminį ištyrimą [129].
GPH galima tirti naudojant biocheminį žymenį PSA, 33-kDa serino proteazę. Padidėjusi prostatos specifinio antigeno koncentracija kraujyje dažniausiai susijusi su prostatos vėžiu, tačiau esant didelėms prostatoms šis rodmuo gali taip pat padidėti. Sergantiesiems prostatos vėžiu PSA didėjimas susijęs su vietinių audinių destrukcija, o sergant GPH PSA didėja dėl padidėjusios prostatos epitelio masės. Nustatyta koreliacija tarp PSA dydžio, prostatos masės ir paciento amžiaus [84]. Šis tyrimas yra patognostinis prostatos karcinomai, todėl prevencijai PSA rodiklio nustatymas yra rekomenduotinas
vyrams sulaukusiems 45 metų. Tačiau tik prostatos biopsijos duomenys patvirtina galutinę prostatos karcinomos diagnozę.
Visų minėtų ir rekomenduojamų atlikti tyrimų pakaktų GPH diagnozuoti, tačiau tam trukdo atskirų žmonių individualumas. Vieniems vyrams ultragarsinio tyrimo metu nustatoma didelė prostata, daug liekamojo šlapimo, tačiau TPSS skalės įverčių balų suma minimali [106]. Ir atvirkščiai, daug simptomų nerodo GPH intensyvumo ir progresavimo. Tik įvertinus paciento diagnostinių tyrimų duomenų visumą, įsiklausius į paciento gyvenimo kokybės vertinimą, pritaikius gydymą, galime pagerinti ligonio savijautą ir tinkamai jį gydyti.
3.8. Gerybinės prostatos hiperplazijos konservatyvus gydymas
Planuojant pacientų sergančių GPH konservatyvų gydymą, reikia įvertinti, kokią infravezikinės obstrukcijos etiopatogenezinę bei apatinių šlapimo takų simptomų atsiradimo grandį galima sėkmingiausiai paveikti norint gauti pageidaujamą gydymo poveikį.
Dabar susiklosčiusios tokios konservatyvaus gydymo kryptys: • Ligonio stebėjimo – laukimo taktika
• α1 – adrenoreceptorių blokatorių vartojimas
• 5α1 – reduktazės inhibitorių vartojimas
• fitopreparatų vartojimas
Paciento stebėjimo taktika gali būti pasirinkta, kai TPSS balų suma mažesnė už 7 arba kai balų suma 8-19 ir nenustatyta infravezikinės obstrukcijos, taip pat kai Qmax
>15ml/sek. Simptomų progresavimas skirtingas, o kai kada simptomai regresuoja savaime. Be to pacientui pateikiamos maitinimosi, režimo ir kitos rekomendacijos, kurių prisilaikant dažnai pasiekiama apatinių šlapimo takų simptomų pagerėjimo. Atlikus tyrimus, nustatyta, kad negydant trejus metus 66 proc. ligonių šlapinimosi sutrikimai išlieka nepakitę, 12 proc.- pagerėjo, 22 proc.- pablogėjo [103]. Diskutuojama, kaip dažnai reikia ligonius konsultuoti nustačius GPH. Ligoniams rekomenduojama kas 3-6 mėn. apsilankyti pas urologą, atlikti PSA tyrimą. Esant galimybei užpildyti TPSS klausimyną. Prieš parenkant laukimo-stebėjimo taktiką, reikėtų prisiminti GPH rizikos faktorius: paciento amžių, susilpnėjusią šlapimo srovę, simptomatiką, PSA pradinį kiekį, padidėjusią priešinę liauką. Pacientams, kuriems yra didesnė GPH progresavimo rizika, geriau būtų siūlyti medikamentinį ar chirurginį gydymą.
Medikamentinis gydymas sumažina apatinių šlapimo takų obstrukciją bei slopina nepageidaujamus simptomus. α1-adrenoreceptorių antagonistai atpalaiduoja
prostatos, šlaplės ir šlapimo pūslės kaklelio lygiuosius raumenis, o 5-alfareduktazės inhibitoriai mažina prostatos dydį.
α – adrenoreceptoriai skirstomi į keturis potipius: α1A, B, D, L. Pagrindiniai α
adrenoblokatoriai: alfuzosinas, terazosinas, doxazosinas, tamsulozinas. Adrenoreceptorių randama įvairiuose organuose, ne tik šlapimo takuose, ypač kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse. Literatūros duomenimis, α1-L adrenoreceptoriai turi didesnį afinitetą
noradrenalinui, tačiau dominuojantys receptoriai yra α1A potipio. Afla adrenoblokatorių
selektyvumas α1 adrenoreceptorių potipiams dar nenustatytas. Žinoma, kad labiau
selektyvus yra tamsulozinas α1A adrenoreceptoriams. Pastebėta, kad šie preparatai
vienodai veikia tiek dideles, tiek ir mažesnes prostatas. Nustatyta, kad, vartojant α
1-adrenoblokatorius mažėja ūminio šlapimo susilaikymo rizika bei chirurginio gydymo būtinybė. Gydomasis poveikis pasireiškia gana greitai, jis priklauso nuo ligos simptomatikos ir obstrukcijos dydžio. Dažniausiai pasitaikantys šios vaistų grupės šalutiniai reiškiniai: burnos džiūvimas, astenija, galvos svaigimas, refleksinė tachikardija, ortostatinė hipotenzija. Siekiant išvengti nepageidaujamų šalutinių reakcijų bei adaptuoti pacientą prie konservatyvaus gydymo šios grupės vaistais, gydymo kursas pradedamas minimaliomis dozėmis, o vėliau dozės didinamos, kol pasiekiama klinikinio poveikio.
Dehidrotestosteronas pagrindinis androgenas, lemiantis GPH vystymąsi. Fermentas 5α reduktazė (2 tipo izofermentas) skatina testosterono virtimą aktyviu intraląsteliniu DHT. Šio fermento slopinimas gali sumažinti DHT kiekį prostatoje ir taip sukelti prostatos hipeplazijos liaukinio epitelio regresiją, kartu mažinti infravezikinės obstrukcijos statinį komponentą. Gydymo poveikio reikia laukti 3-6 mėnesius. Gydymo eigoje kinta TPSS balų suma, prostatos tūris sumažėja 19-30 proc, šlapimo srovės greitis padidėja vidutiniškai 1,3-2,6 ml/sek. Kuo didesnė prostata tuo reikšmingesnis gydymo veiksmingumas. Tai sąlygoja, kad mažesnėje priešinėje liaukoje dominuoja stromos elementai, didesnėje - liaukinė hiperplazija. Pagrindinis šios grupės preparatas – finasteridas. Atlikus 10 klinikinių studijų metaanalizę pastebėta, kad finasteridas reikšmingai mažina simptomatiką bei gerina šlapimo srovės greitį, kuris didėja dėl prostatos tūrio mažėjimo. Šis preparatas mažina PSA kiekį. Po 6-12 mėn. gydymo. PSA kiekis sumažėja iki 50proc. Šalutiniai reiškiniai neryškūs: sumažėja ejakuliato kiekis, gali sumažėti lytinis potraukis, ginekomastija, odos bėrimas, lūpų tinimas. Neseniai sukurtas
antras šios grupės preparatas – dutasteridas, kuris veikia abu 5-alfareduktazės tipus. Jo veiksmingumas įrodomas klinikinių studijų.
GPH patogenezėje svarbus vaidmuo tenka ne tik androgenams, bet ir estrogenams. Dalis androgenų, veikiami fermento aromatazės, virsta estrogenais. Jie palaiko prostatos stromos išvešėjimą, taip pat įjautrina ir didina androgenams jautrių receptorių kiekį, t.y. veikia sinergistiškai. Meparticinas – preparatas, kuris pašalina estrogenus iš organizmo. Patekęs į žarnyną, negrįžtamai susijungia su estrogenais, blokuoja jų reabsorbciją ir mažina estrogenų kiekį kraujyje. Šio preparato šalutiniai reiškiniai: pykinimas, viduriavimas.
Dabar didelis dėmesys skiriamas vaisto veiksmingumui, saugumui, kainai. Didėjant medikamentinio gydymo svarbai, chirurginių gydymo metodų taikymas gydant GPH, retėja. Tai susiję su tuo, kad ši patologija vis dažniau pasitaiko jaunesnio amžiaus vyrams, o komplikacijų skaičius auga. Tai skatina gydytojus vis dažniau rinktis konservatyvų gydymą, išskyrus tuos atvejus, kaip pats pacientas nori, kad būtų daroma operacija arba tam yra absoliučios indikacijos.
Fitopreparatų grupė yra svarbi konservatyviai gydant GPH. Jie rekomenduojami esant nedidelio ir vidutinio sunkumo TPSS simptomams, kaip adjuvantinė terapija gydant α1 adrenoblokatoriais, kai GPH komplikuota prostatitu.
Fizpatrick ir Lynch (1995) apžvelgė visą fitoterapijos susijusios su GPH gydymu, literatūrą. Plačiausiai vartojami: pigeum africanum, serenoe repens, cucuibita pepo, urtica, rausvažiedės ežiuolės preparatai. Tikslus fitopreparatų veikimo patomechanizmas vis dar neištirtas. Todėl atliekami intensyvūs eksperimentiniai moksliniai tyrinėjimai, ištirti fitopreparatų poveikį GPH. Vokietijoje ir JAV ši grupė vaistų užima didelę dalį tarp GPH gydymui skirtų preparatų. Fitopreparatų veikimo mechanizmai įvairūs: antiandrogeninis, antiestrogeninis, lytinį hormoną prijungiančio globulino kiekio mažinimas, augimo faktorių inhibicija, prostaglandinų ir leukotrienų sintezės slopinimas. Naujausių tyrimų analizės duomenimis, primygtinai rekomenduojama atlikti ir tęsti multicentrines randomizuotas, dvigubai aklus placebo kontroliuojamus tyrimus.
Nuolat tikslingai tiriama ir ieškoma naujų fitopreparatų indikacijų, nes, vartojant pvz:, rausvažiedės ežiuolės preparatus, galima sustiprinti nusilpusią vyresnių vyrų imuninę sistemą sumažinti apatinių šlapimo takų sukeliamus varginančius simptomus, apsaugoti nuo uroinfekcijos bei atitolinti aterosklerozės komplikacijas.
3.9. Gerybinės prostatos hiperplazijos chirurginis gydymas
Organizmo atsakas į konservatyvų gydymą yra mažesnis negu į chirurginį.
Tiek subjektyvūs, tiek objektyvūs simptomai reikšmingai regresuoja po bet kurio chirurginio gydymo. Tačiau dėl operacinių ir pooperacinių komplikacijų chirurginiai metodai vis mažiau taikomi [27,55]. Kryptingai ieškoma saugių ir veiksmingų preparatų, kurie atitolintų chirurginio gydymo būtinumą.
Šiame skirsnyje apžvelgiami minimaliai invazinio ir invazinio GPH gydymo metodai bei rezultatai. Minimaliai invaziniai metodai pasirenkami dėl mažesnio kraujavimo tikimybės, trumpesnio lovadienių skaičiaus. Atviros operacijos pasižymi ilgesniu lovadienių skaičiumi,didesne operacine trauma organizmui, didėjančiu pooperacinių komplikacijų skaičiumi (šlapimo takų infekcija, kraujavimas, šlaplės stenozė, tromboembolijos ir miokardo infarkto didesne rizika) [55,42].
Atviros operacijos skirtos GPH gydyti skirstomos į transvezikines ir retropubines, kurias ištobulino T. Hryntschack ir T. Millin. Naujausios mokslinės studijos parodė, kad atvira operacija pagerina šlapimo srovės greitį, bet simptomatika regresuoja praščiau, palyginus su reiškiniais po minimaliai invazyvių operacijų. Atvirų operacijų daroma vis mažiau, nes retrogradinė ejakuliacija, šlapimo takų infekcijos yra dažnesnės po šių operacijų. Rekomenduojama rinktis šį operacijų tipą kai prostatos tūris viršija 50 ml.
Pirmasis transuretrinės rezekcijos metodiką aprašė R. M. Nesbit dar 1943m. Tačiau vėliau prasidėjo gana nesėkmingas šių operacijų pooperacinių komplikacijų periodas. Ir tik paskutinius 20-30 metų jos gana sėkmingos gydant GPH. Šių operacijų pasirinkimą lėmė trumpa hospitalizavimo trukmė, geri funkciniai rezultatai.
Labiausiai paciento būklei įtakos turi ankstyvos komplikacijos - nukraujavimas ir TUR sindromas. Dažniausios vėlyvos komplikacijos: dalinis šlapimo nelaikymas (2 proc.), šlaplės susiaurėjimas nuo 0,5 iki 7 proc., šlapimo pūslės kaklelio sklerozė (3 proc.), erekcijos sutrikimai iki 80-90 proc. apklaustųjų, retrogradinė ejakuliacija nuo 5 iki 90 proc. Atlikus penkerių metų retrospektyviąją analizę, kur lyginta atvirų operacijų ir prostatos TUR komplikacijos, nustatyta, kad po atvirų operacijų didesnis mirštamumas, dažnesni miokardo infarkto, plautinės arterijos trombozės, pooperacinių komplikacijų epizidai [55].Pacientams, kuriems atliktos adenomektomijos, dažniau skundžiasi streso inkontinencijos reiškiniais [55]. Nepaisant neigiamų chirurginio metodo ypatybių,, transuretrinė prostatos rezekcija, kaip chirurginis būdas, pasirenkamas beveik 90 proc.
urologų. Tačiau įvertinant pooperacines komplikacijas, reikia atkreipti dėmesį į tikslingą diagnostiką ir pasirenkamą GPH gydymo būdą.
Kitas, tačiau nedažnas endoskopinio gydymo būdas yra transuretrinė prostatos incizija. Jis nedažnai naudojamas, nes šį gydymo būdą rekomenduojama pasirinkti, kai prostatos tūris apie yra apie 20ml, o esant tokio dydžio prostatai medikamentiniam gydymui yra daugiau indikacijų. Šios operacijos privalumai panašūs kaip ir kitų minimaliai invazyvių operacijų, tai trumpa hospitalizavimo trukmė, mažesni erekcijos sutrikimai bei mažesnis retrogradinės ejakuliacijos dažnis. Dėl gana mažo invazyvumo prostatai ši operacija gali būti kartojama 8-30 proc. pacientų.
Dabar pasaulyje paplitusios operacijos lazeriu. Tarpusavyje jos skiriasi nevienodu temperatūros režimu. Pagrindinis veikimo mechanizmas - audinių išgarinimas. Pagrindinis šio metodo trūkumas - gana dažnos šlapimo takų infekcijos, nes kateteris šlapimo pūslėje paliekamas iki 20 dienų. Šios operacijos efektyvumas panašus kaip ir transuretrinės prostatos rezekcijos.
Intersticinė koaguliacija lazeriu, kontaktinis išgarinimas lazeriu – šios lazeriu gydymo metodikos neturi didesnio privalumo palyginus su prostatos transuretriniu būdu ir didesnis šlapimo susilaikymo ir šlapimo takų infekcijos pavojus. Gana dažna retrogradinė ejakuliacija - 70 proc., uretros susiaurėjimai - 10 proc. [80,112].
GPH gydyti taikoma transuretrinė mikrobangų termoterapija (TUMT – transurethral microwave thermotherapy). Mikrobangomis generuojama energija paverčiama 40-44oC temperatūra, kuri sukelia audinių nekrozę. Visgi didelis pooperacinių komplikacijų skaičius, kelios būtinos procedūros, kateterio šlapimo pūslėje laikymas 5-25 dienas riboja šio būdo pasirinkimą.
Transuretrinis prostatos pašalinimas radijo bangomis (TUNA) – transurethral needle ablation). Prostatos abliacija specialiomis adatomis vyksta pasiekus 80 –100o C temperatūrą. Šis būdas pakankamai efektyvus, tačiau reikšmingo šlapimo srovės pagerėjimo nesukelia. Retrogradinės ejakuliacijos ir erekcijos sutrikimų atvejų nenustatyta. Daugumos minimaliai invazinių metodų funkciniai pooperaciniai rezultatai panašūs į transuretrinės prostatos rezekcijos [80]. Tačiau pasirenkant chirurginį gydymo būdą, visuomet svarbu įvertinti paciento skundus, jo gyvenimo kokybę ir įtarus infravezikinę obstrukciją, rekomenduoti urodinaminį ištyrimą [114].
4. TIRIAMOJI MEDŽIAGA IR METODAI
4.1. Rausvažiedės ežiuolės ekstrakto gamybos schema
Tiriamas preparatas pagamintas iš Kauno Vytauto Didžiojo universiteto Botanikos sode introdukuoto (perkeltas iš kitų geografinių regionų į naujas ekologines sąlygas) augalo rausvažiedės ežiuolės – Echinacea purpurea L.Moench. Vaistinė žaliava surenkama baigiantis augalo vegetacijai. Antežeminė vaistinės žaliavos dalis surenkama augalui nužydėjus, o šaknys – 3-4 - aisias augalo metais. Tyrimai atlikti bendradarbiaujant su Kauno VDU Botanikos sodo Vaistingųjų augalų laboratorija. Rausvažiedės ežiuolės (Echinacea purpurea L. Moench) ekstraktas pagamintas uždaros akcinės bendrovės “Valentis” Kauno skyriaus laboratorijoje, iš požeminės augalo dalies, kurioje yra daugiau antiandrogeniniu veikimu pasižyminčių veikliųjų medžiagų [12,122]. Rausvažiedės ežiuolės šaknų ekstrakto (1:1) gamybai naudojamas perkoliacijos metodas, turintis baigiamąjį ciklą. Žaliava dalijama į kelias lygias dalis. Iš vieno perkoliatoriaus surinkta ištrauka vartojama žaliavai ekstrahuoti kitame perkoliatoriuje. Gamyba vykdoma keturiuose cilindro formos perkoliatoriuose.
Brinkimas, paleidimo ciklas, perkoliacija
Penki kilogramai ežiuolės šaknų susmulkinama, suberiama į indą, užpilama ekvivelentiniu kiekiu ekstrahento – 5 litrais 50 proc etanolio.(V/V), gerai sumaišomas, kad tolygiai sudrėktų ir paliekama 6 val. brinkti. Kitos žaliavos dalys brinkinamos ekvivelentiniu kiekiu ištraukos iš ankstesnės dalies.
Išbrinkinta žaliava perkeliama į perkoliatorių, gerai suspaudžiama, kad žaliavos masėje susidarančios oro ertmės netrukdytų normaliai ekstrakcijai. Vėliau pilama ekstrahento tol kol susidaro gamybos reglamente numatyto storio veidrodiškas sluoksnis (2-3 cm.). Tam sunaudojama 20 litrų etanolio 50 proc (V/V). Perkoliatorius uždengiamas ir paliekamas ne mažiau kaip 24 valandoms.
Kitą dieną 5 kg. išbrinkintos žaliavos sudedama į antrąjį perkoliatorių. Ištrauka iš pirmo perkoliatoriaus perstumiama į antrąjį, o į pirmąjį perkoliatorių vėl pilama švaraus etanolio ekstrahento 50 proc. 20 litrų. Pirmame ir antrame perkoliatoriuose sudaromas skysčio veidrodis (2-3 cm.). Perkoliatoriai uždengiami ir paliekami ne mažiau kaip 24 valandoms.
Po dienos ištraukos vėl perstumiaimos: iš pirmos į antrą, iš antros į trečią. Švaraus 20 litrų ekstrahento – etanolio 50 proc. pilama tik į pirmąjį perkoliatorių. 5kg
išbrinkintos žaliavos sudedama į trečiąjį perkoliatorių. Sudaromas skysčio veidrodis 2-3 cm. Perkoliatoriai uždengiami ir paliekami ne mažiau kaip 24 val. Kitą dieną 5 kg sudrėkintos žaliavos sudedama į ketvirtąjį perkoliatorių. Perstumiamos ištraukos iš pirmojo į antrąjį, iš antrojo į trečiąjį, iš trečiojo į ketvirtąjį, o švaraus etanolio 50 proc. 20 litrų (V/V) ekstrahento – pilama tik į pirmąjį perkoliatorių. Visi keturi perkoliatoriai pripildomi, kad susidarytų skysčio veidrodis. Paleidimo ciklo pabaigoje perkoliatoriai uždengiami ir vėl paliekami ne mažiau kaip 24 valandoms.
Gaunamas ekstraktas. Iš ketvirtojo perkoliatoriaus nupilama toks skysto ekstrakto tūris, kiek žaliavos masės dalių buvo tame perkoliatoriuje. Nupilama 5 litrai ežiuolės šaknų ekstrakto.
Pirmame perkoliatoriuje esati išspausta žaliava (gamybos atliekos) išimama ir į perkoliatorių pridedama 5 kg šviežios išbrinkintos žaliavos.
Ištraukos perstumiamos: iš trečiojo į ketvirtąjį ir iš antrojo į trečiąjį perkoliatorių. Iš pirmojo perkoliatoriaus visa jame esanti jau mažos koncentracijos ištrauka perkeliama į antrąjį perkoliatorių, iš ketvirtojo perkoliatoriaus – į pridėtą šviežios žaliavos pirmąjį perkoliatorių. Tuomet 13 litrų šviežio ekstrahento pilama į antrąjį perkoliatorių. Visuose keturiuose perkoliatoriose sudaromas skysčio veidrodis 2-3 cm.
Kitą dieną iš pirmojo perkoliatoriaus nupilama 5 litrai ežiuolių ekstrakto, tokį tūrį skysto ekstrakto, kiek svorio dalių buvo pridėta augalinės žaliavos (į visus perkoliatorius dedamas vienodas kiekis). Po to vyksta įprastas visos sistemos ištraukų perstūmimas. Švarus ekstrahentas pilamas į trečiąjį perkoliatorių.
Antrajame perkoliatoriuje išspausta žaliava išimama ir į perkoliatorių pridedama 5 kg naujos išbrinkintos augalinės žaliavos. Visuose perkoliatoriuose sudaromas 2-3 cm skysčio veidrodis. Tokia nenutrūkstama gamyba, kiekvieną dieną pridedant po 5 kg žaliavos ir surenkant 5 litrus ežiuolių ekstrakto, tęsiasi, kol išgaunamas reikiamas kiekis ekstrakto.
Ežiuolių ekstrakto valymas
Ištrauka, surinkta į talpyklę, vežama į patalpą nusistovėti. Patalpos temperatūra +2-80C.Ištrauka laikoma ne mažiau aštuonių parų.
Kontrolės taškai: patalpos temperatūra, nusistovėjimo trukmė. Ekstrakto Dekantavimas, filtravimas
Nusistovėjęs ežiuolių ekstraktas vežamas į patalpą, kurioje temperatūra +15-250C ir išlaikomas 24 valandas. Po to ekstraktas dekantuojamas nutraukus skaidrią tirpalo dalį.
Dekantuotas ekstraktas filtruojamas per FibraFix plokšteles AF9-20-50, pagamintas iš celiuliozės ir kizelguro pluošto. Iki atidavimo gautas ekstraktas laikomas ne aukštesnėje kaip +250C temperatūroje, santykinė drėgmė 60±5 proc.
Viename mililitre šaknų ekstrakto yra 90 mg sausų medžiagų. Produkto kontrolė atliekama pagal specifikacijos reikalavimus.
4.2. Histologinių preparatų paruošimas
4.2.1 Tiriamosios medžiagos įliejimo į parafiną metodika
Pašalinus tiriamąjį objektą (sėklidę, antsėklidį, prostatą), jis nedelsiant fiksuojamas buferiniame formaldehido 10 proc. tirpale. Vėliau histologiniai preparatai paruošiami vertinimui.
Preparatų įliejimui į parafiną reikalinga: Įranga:
• Audinių blokų orientavimo ir įliejimo įrenginys • Šaldomoji plokštelė
Reagentai:
• Etilo alkoholis 96 proc. • Etilo alkoholis 80 proc. • Etilo alkoholis 60 proc. • Ksilolas
• Histoplastas
Preparatų įliejimo tvarka:
• Formalinas 10 proc. – preparatas plaunamas tekančiu vandeniu 1 val. • Etilo alkoholis 60 proc. – 2 val.
• Etilo alkoholis 80 proc. – 2 val. • Etilo alkoholis 96 proc. – 3 val. • Etilo alkoholis 96 proc. – 16 val. • Ksilolas I – 2val.
• Ksilolas II – 2 val.
• Histoplastas I – 600C - 1.5 val.
• Histoplastas II – 600C- 1.5 val.
Nuosekliai vykdant šiuos etapus preparatas įliejamas į parafino blokelius. Vėliau blokeliai pjaustomi mikrotomu.
4.2.2. Tiriamosios medžiagos pjaustymo metodika
Parafininiai blokai pjaustomi rotaciniu mikrotomu.
Įranga:
• Rotacinis mikrotomas • Vonelė
• Kaitinimo plokštelė
Norint efektyviai ir tiksliai padaryti mėginio pjūvius, būtina laikytis šių reikalavimų:
• Visuomet naudoti aštrų peilį
• Peilio priekinė ir vidinė dalys visuomet turi būti švarios. • Kruopščiai nuvalyti parafino vaško liekanas
• Tiksliai patalpinti parafininį bliką spaustuvėje • Nustatyti pjūvio storį mikronais (µ).
• Šiai tiriamajai medžiagai paprastai pasirenkamas 3-4µ pjūvio storis. • Blokelio paviršių nulyginti iki pasirinkto pjūvio gylio.
• Kokybiški pjūviai perkeliami į 460 temperatūros vonelę.
• Po to pjūviai užtraukiami ant objektinio stiklelio.
• Objektinis stiklelis padedamas ant kaitinimo plokštelės, kurios temperatūra 50 0 C
ir fiksuojama 30 min.
4.2.3. Histologinių preparatų dažymo metodika
Histologinių preparatų dažymui naudota hematoksilino+eozino dažymo
metodika. Tam reikalingi reagentai, tirpalai.
Reagentai: • Ksilolas
• Izopropilo alkoholis 98 proc. • Etilo alkoholis 96 proc. • Hematoksilino dažai • Eozino1 proc dažai. • Polistirolas
Tirpalai:
• Eozino dažai (eozino dažų 1 gr., distiliuotas vanduo – 100 ml.).
• Hematoksilino dažai (vandeninio hepatoksilino 1 proc – 100 ml., hematoksilino miltelių – 1 gr., distiliuotas vanduo – 100 ml.).
• Vandeninio kalio alūno 5 proc (amoniakinio) – 75 ml. (kalio alūno (amoniakinio – 3.750 gr., distiliuotas vanduo – 75 ml.).
• Lingolio skiedinio (jodi puri – 1 ml., kali jodidi – 2 ml, distiliuoto vandens – 100 ml.
• Koncentruota acto rūgštis – 8 ml. • Glicerinas – 50 ml.
Preparatų dažymo eiga:
• Ksilole laikoma 10 min.
• Etilo alkoholyje 96 proc. laikoma 5 min. • Etilo alkoholyje 96 proc. II laikoma 5 min. • Vandeniu plaunama 1-2 min.
• Hematoksilino dažuose laikoma 10 min. • Plaunama vandeniu 10 min.
• Eozino dažuose laikoma 10 min. • Plaunama vandeniu 1-2 min.
• Etilo alkoholyje I 96 proc. laikoma 5 min. • Etilo alkoholyje II 96 proc. laikoma 5 min. • Ksilole laikoma 5 min.
Nudažytas histologinis preparatas džiovinamas ir mikroskopuojamas. Preparatai analizuoti “Olympus BX-51” tipo mikroskopu, didinimas 10x40. Iš kiekvieno pašalinto organo po šešis histologinius pjūvius. Histologiniai vaizdai fotografuoti “Olympus” (C506) skaitmenine kamera. Įvertinti ir išanalizuoti preparatų morfologinių struktūrų pokyčiai. Mąstelis nustatytas okuliarmikrometru. Matavimo atkarpa - 20µm.
4.3. Kiti tyrimų metodai
4.3.1. Prostatos dydžio ir jos masės tyrimas
Tyrimo objektu pasirinkti Wistar linijos žiurkių patinai [115,116]. Tyrimai su eksperimentiniais gyvūnais atlikti vadovaujantis Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos leidimu Nr.0076. Tyrimui buvo pasirinkti subrendę 3-4 mėn. 250-350 gr žiurkių patinai, kurie buvo auginti Kauno medicinos universiteto vivariume. Vivariumo laboratorijoje buvo palaikoma 22-230C temperatūra ir 12 val. šviesos ir tamsos ciklas. Eksperimentiniai gyvūnai buvo maitinami jiems įprastu maistu ir girdyti vandeniu.
Intaktinė (natūralių prostatų) gyvūnų grupė suskaidyta į 3 grupes: pirma yra kontrolinė (prieš eksperimentus); antra - žiurkėms kartu su įprastu dienos maisto racionu keturias savaites buvo duodama ežiuolės ekstrakto 50 mg/kg [49,38]; trečia žiurkių grupė buvo girdoma ežiuolės ekstraktu aštuonias savaites. Žiurkių prostatų tyrimo schema pateikta pirmoje lentelėje.
1 lentelė. Žiurkių prostatų tyrimo schema
Kontrolinė grupė n=6
Kūno masė Prostatos masė
Kūno masės ir prostatos masės procentinis dydis Histologiniai tyrimai TIRTA Po 4 savaičių ežiuolės ekstrakto vartojimo n=6
Kūno masė Prostatos masė
Kūno masės ir prostatos masės procentis dydis Histologiniai tyrimai TIRTA Po 8 savaičių ežiuolės ekstrakto vartojimo n=6
Kūno masė Prostatos masė
Kūno masės ir prostatos masės procentinis dydis Histologiniai tyrimai TIRTA
Kitoje eksperimentinės prostatos hiperplazijos grupėje išskirtos 5 grupės. Pirma grupė – intaktinė, antros grupės žiurkėms atlikta kastracija, trečios – sukelta gerybinė prostatos hiperplazija, ketvirtos grupės žiurkėms, sukėlus GPH, duota ežiuolės ekstrakto keturias savaites, penktos, sukėlus GPH – ežiuolės ekstraktas duotas aštuonias savaites [89]. Klinikinė eksperimentinių gyvūnų mirtis buvo sukeliama intramuskuliariai perdozavus fenobarbitalio tirpalo 1mg/kg. [113]. Po to jiems atlikta cervikalinė dislokacija, vėliau kiekvienas gyvūnas pasveriamas. Eksperimentinės gerybinės prostatos hiperplazijos tyrimo schemos patektos antroje ir trečioje lentelėse.
Vėliau gyvūnams buvo atliekama 2-3 cm ilgio apatinė laporotomija, atpreparuojami prevezikiniai audiniai, dislokuojamos sėklinės pūslelės. Jeigu prostatos skiltys buvo blogai matomos, šlapimo pūslė pripildoma 2-3 ml izotoninio tirpalo. Tokiu atveju prostatos skilčių atidalijimas nuo šlapimo pūslės kaklelio bei struktūrų matymo ribos pagerėdavo. Šlapimo pūslė ir prostata pašalinama viename konglomerate tam, kad atskiras struktūras būtų galima izoliuotai atpreparuoti.
Gyvūnų kūnų ir organų masės buvo sveriamos elektroninėmis svarstyklėmis. Po to apskaičiuojama, kokią procentinę viso kūno masės dalį sudaro organo masė. Apskaičiuotas organo masės ir kūno masės santykinis dydis (PKS), pagal formulę (1) [117,89]:
PKS ═ Om /Km x100,
Kur: PKS – (organo masės ir kūno masės santykinis dydis (proc.)), Om – organo masė
(gr.), - Km – kūno masė (gr.).
Pašalinus organus, juos užpylėme buferiniu formaldehido 10 proc. tirpalu. Vėliau paruošiami histologiniai preparatai ir atliekama jų histologinė jų analizė.
Eksperimentinėje prostatos hiperplazijos grupėje prostatų dydžiai buvo matuojami atlikus transabdominalinės echoskopijos metodu ir apskaičiuojami pagal elipsės formulę (2) [130].
(0,523 x skersinis diametras2 x priekinis-užpakalinis diametras)
Echoskopinio tyrimo metu trumpalaikė narkozė buvo palaikoma narkotanu (inhaliacinis narkotikas – halothanum) naudojant kalibruotą garintuvą. Prieš atliekant echoskopinį tyrimą, žiurkės patinų hipogastrinė sritis nuskutama ir per kaniulę šlapimo pūslė pripildoma izotoninio skysčio.
