KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Marius Žemaitis
Sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų ypatumai
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2000-2005 metais Kauno medicinos universitete
Mokslinis vadovas:
Doc. dr. Kęstutis Malakauskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
DAŽNIAUSIAI VARTOTOS SANTRUMPOS
A – adeninas
APC1A – žarnų adenomatozinės polipozės 1A (angl. adenomatous polyposis coli 1A) genas
APC1B – žarnų adenomatozinės polipozės 1B (angl. adenomatous polyposis coli 1B) genas
aps./min. – apsisukimai per minutę bp – bazių pora
C – citozinas
CEA – karcinoembrioninis antigenas CYFRA 21-1 – citokeratino 19 fragmentas CpG – citozino ir guanino
DAPK – apoptozę skatinančios baltymų kinazės (angl. death associated protein kinase) genas
DNR – deoksiribonukleorūgštis (dezoksiribonukleorūgštis) Ecad – epitelinio kadherino (angl. E-cadherin) genas
EGFR – epidermio augimo veiksnio receptorius (angl. epidermal growth factor receptor) FHIT – lūžių histidino triadų (angl. fragile histidine triad) genas
G – guaninas
K-RAS – Kirsten pelių sarkomos viruso (angl. Kirsten rat sarcoma) onkogeno ląstelinis homologas
MgCl2 – magnio chloridas
MGMT – O6-metilguanino-DNR-metiltransferazės (angl. O6 -methylguanine-DNA-methyltransferase) genas
mRNR – informacinė ribonukleorūgštis (angl. messenger ribonucleoacid)
NNK – 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanonas (angl. 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone)
NS – nereikšminga statistiškai NSE – neuronui specifinė enolazė NSG – naviką slopinantys genai
NSPV – nesmulkialąstelinis plaučių vėžys p – chromosomos trumpasis petys
p16INK4a – baltymo p16INK4a genas p53 – baltymo p53 genas
PGR – polimerazės grandininė reakcija PI – pasikliautinasis intervalas
q – chromosomos ilgasis petys r – koreliacijos koeficientas
RARβ – retinoinės rūgšties receptoriaus β (angl. retinoic acid receptor β) genas
RASSF1A – ras sąveikos domeną turinčių baltymų 1A šeimos (angl. RAS association domain family 1A) genas
SN – standartinis nuokrypis SR – santykinė rizika ŠS – šansų santykis T – timinas
TURINYS
1. Įvadas……….. 1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai……….. 1.2. Darbo naujumas……….. 1.3. Mokslinė ir praktinė reikšmė………..
7 8 9 9 2. Literatūros apžvalga……….. 2.1. Epigenetinės pažaidos………..……….…….. 2.1.1. DNR metilinimas ir genų raiškos reguliacija ……….. 2.1.2. DNR metilinimo tyrimo metodai………. 2.1.3. DNR metilinimas ir kancerogenezė………. 2.1.4. Tirtų naviką slopinančių genų charakteristikos ir metilinimas
įvairiuose biologiniuose mėginiuose……… 2.1.5. Naviką slopinančių genų metilinimo ir klinikinių charakteristikų sąsajos……….……. 2.1.6. Epigenetinių pažaidų predikcinė ir prognostinė vertė……….. 2.2. Genetinės pažaidos……….. 2.3. Proteominiai naviko žymenys……….
10 10 10 14 15 21 30 34 36 39 3. Medžiaga ir tyrimo metodai………
3.1. Tiriamasis kontingentas………….………. 3.2. Tyrimo metodika………. 42 42 46 4. Rezultatai………...………...
4.1. Epigenetinių ir genetinių pažaidų dažnis bei proteominių naviko žymenų raiška.………... 4.1.1. Metilintų naviką slopinančių genų dažnis……… 4.1.2. Genų K-RAS, p53 ir EGFR mutacijų dažnis……… 4.1.3. Proteominių naviko žymenų koncentracija……….. 4.2. Epigenetinių ir genetinių pažaidų dažnio bei proteominių naviko žymenų raiškos sąsajos……….. 4.3. Epigenetinių ir genetinių pažaidų dažnio bei proteominių naviko žymenų raiškos ir klinikinių charakteristikų sąsajos... 4.3.1. Metilintų naviką slopinančių genų dažnio ir klinikinių charakteristikų sąsajos………. 4.3.2. Genų mutacijų dažnio ir klinikinių charakteristikų sąsajos……….
69 69 69 77 80 81 85 85 105
4.3.3. Proteominių naviko žymenų raiškos ir klinikinių charakteristikų sąsajos……….. 4.4. Epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų
predikcinė ir prognostinė vertė……… 4.4.1. Predikcinė vertė……… 4.4.2. Prognostinė vertė………. 107 111 111 114 5. Rezultatų aptarimas………... 126 6. Išvados………. 149 7. Rekomendacijos………. 151 8. Literatūros sąrašas……… 152 9. Publikacijos……… 188 10. Priedai………... 190
1. ĮVADAS
Plaučių vėžys – viena labiausiai paplitusių ir didžiausią mirtingumą sukeliančių onkologinių ligų pasaulyje ir Lietuvoje. Kasmet pasaulyje diagnozuojama per 1 milijonas naujų plaučių vėžio atvejų [270, 277]. Lietuvos Vėžio registro duomenimis Lietuvoje 2004 metais plaučių vėžys diagnozuotas 1299 vyrams ir 261 moteriai; tais metais nuo plaučių vėžio mirė 1179 vyrai ir 216 moterų [212].
Nepaisant naujausių diagnostikos metodų, dažnai nustatomas vėlyvų stadijų plaučių vėžys. Plaučių vėžio patikra, besiremianti skreplių citologija ir radiologiniais tyrimais, bei prevencija chemopreparatais nesumažino mirtingumo nuo plaučių vėžio. Po operacijos priklausomai nuo ligos stadijos penkerius metus išgyvena tik 67-23 proc., esant išplitusiam vėžiui – tik keli procentai nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu sergančių ligonių [242]. Išplitusio plaučių vėžio standartinio gydymo (chemoterapija, spindulinis gydymas) efektyvumas yra ribotas ir daugelio nuomone – pasiekęs galimybių ribas. Todėl plaučių vėžio diagnostika, prevencija ir gydymas išlieka viena opiausių onkologijos problemų, skatinanti intensyvią patikimų plaučių vėžio diagnostinių, predikcinių ir prognostinių žymenų, besiremiančių molekulinės biologijos ir genetikos tyrimų žiniomis, paiešką ir diegimą į klinikinę praktiką.
Plaučių vėžio genezė – tai ilgalaikis daugiastadijinis procesas, kurio metu ląstelėje pamažu kaupiasi genetinės ir epigenetinės pažaidos [320]. Dėl jų sutrinka reguliacinių baltymų, koduojamų pagrindinių vėžio genų grupių – onkogenų ir naviką slopinančių genų – raiška ar funkcijos. Tai sąlygoja ląstelių piktybėjimą, fenotipinį plaučių vėžio pasireiškimą ir kliniškai nustatomo plaučių vėžio atsiradimą. Ilgą laiką buvo manoma, kad genetinės pažaidos yra plaučių vėžio genezės pagrindas [138]. Tik 20 amžiaus pabaigoje įvertinta epigenetinių pažaidų svarba plaučių vėžio genezei [15].
Deoksiribonukleorūgšties metilinimas genų promotorių srityje yra viena pagrindinių epigenetinių pažaidų, lemiančių naviką slopinančių genų inaktyvinimą be struktūrinių šių genų pokyčių. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad naviką slopinančių genų metilinimas yra vienas dažniausių ir ankstyviausių plaučių vėžio genezės procesų, nustatomas net fenotipiškai normaliose ląstelėse. Atliktos negausios klinikinės studijos parodė, kad epigenetinių pažaidų nustatymas kraujo serume galėtų tapti plaučių vėžio atsiradimo rizikos įvertinimo ir ankstyvos neinvazinės diagnostikos metodu. Deoksiribonukleorūgšties metilinimas, priešingai nei genetinės pažaidos, yra grįžtamas procesas, todėl epigenetinių pažaidų tyrinėjimas svarbus
Plaučių vėžiu sergančių ligonių amžiaus, rūkymo įpročių bei lyties sąlygoti hormoniniai skirtumai gali turėti įtakos skirtingoms genetinėms ir epigenetinėms pažaidoms. Šios pažaidos gali lemti skirtingas plaučių vėžio morfologines, išplitimo ir biologinio agresyvumo, jautrumo ar atsparumo taikomam gydymui bei prognostines charakteristikas.
Plaučių vėžio genezėje dalyvauja ne vienas genas, o tarp savęs sąveikauja daugelis reguliacinių genų. Todėl svarbu kompleksiškai įvertinti genetines ir epigenetines pažaidas, dalyvaujančias įvairiuose plaučių vėžio patogenetiniuose keliuose, atsižvelgiant į kiekvienos pažaidos reikšmę plaučių vėžio genezei.
1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas
Darbo tikslas – įvertinti sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų raiškos ypatumus.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu metilintų naviką slopinančių genų DAPK, MGMT, p16INK4a, p14ARF, RARβ, RASSF1A, FHIT, Ecad, APC1A, APC1B dažnį kraujo serume, navikiniame ir nenavikiniame plaučių audinyje, genų K-RAS, p53 ir EGFR mutacijų dažnį navikiniame ir nenavikiniame plaučių audinyje bei proteominių naviko žymenų CYFRA 21-1, CEA ir NSE raišką kraujo serume.
2. Įvertinti sąsajas tarp tirtų epigenetinių ir genetinių pažaidų dažnio bei proteominių naviko žymenų raiškos įvairiuose biologiniuose mėginiuose.
3. Įvertinti sąsajas tarp tirtų epigenetinių ir genetinių pažaidų dažnio, proteominių naviko žymenų raiškos ir sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu klinikinių charakteristikų.
4. Nustatyti tirtų epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų predikcinę ir prognostinę vertę.
1.2. Darbo naujumas
Šiame darbe nagrinėjama nauja viena sparčiausiai pastaraisiais metais mokslo pasaulyje besiplėtojančių plaučių vėžio molekulinės biologijos sričių – epigenetika bei pastarųjų dvejų metų plaučių vėžio molekulinės biologijos, susietos su biologine terapija, pasaulinė aktualija – epidermio augimo veiksnio receptoriaus geno pažaidų reikšmė sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu. Šio tyrimo metu kompleksiškai analizuojamas platus molekulinių žymenų spektras įvairiuose nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu sergančiųjų biologiniuose mėginiuose. Genetinių ir epigenetinių pažaidų nustatymui taikyti šiuolaikiniai pasaulinius standartus atitinkantys tyrimo metodai – modifikuota dviejų etapų metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija, hibridizacijos zondų metodas analizuojant deoksiribonukleorūgšties lydymosi kreivę LightCycler aparatu ir sekvenavimas. Kai kurių naviką slopinančių genų metilinimas kraujo serume tirtas pirmą kartą. Darbe kompleksiškai įvertintos molekulinių žymenų sąsajos su sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu klinikinėmis charakteristikomis.
1.3. Mokslinė ir praktinė reikšmė
Mokslinė reikšmė. Atliktas kompleksinis tyrimas, nustatęs plataus spektro epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų raiškos ypatumus sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu įvairiuose biologiniuose mėginiuose. Tyrimas leidžia giliau suvokti plaučių vėžio genezę ir biologiją, kompleksiškai įvertinti molekulinių vėžio žymenų dažnį ir jų sąsajas su fenotipinėmis nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu sergančiųjų charakteristikomis.
Praktinė reikšmė. Kompleksinis epigenetinių ir genetinių pažaidų bei proteominių naviko žymenų įvertinimas įvairiuose sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu biologiniuose mėginiuose padės nustatyti ir pritaikyti klinikinėje praktikoje nesmulkialąstelinio plaučių vėžio diagnostinius, predikcinius ir prognostinius molekulinius vėžio žymenis.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Epigenetinės pažaidos
2.1.1. Deoksiribonukleorūgšties metilinimas ir genų raiškos reguliacija
Epigenetinės pažaidos – tai ląstelės genetinėje medžiagoje deoksiribonukleorūgštyje (DNR) ir chromatine paveldimi pokyčiai, dėl kurių sutrinka genų raiškos reguliacija. Epigenetinės pažaidos, skirtingai nuo genetinių, nesukelia DNR nukleotidų sekos pokyčių – mutacijų, delecijų ir kitų [70].
Viena pagrindinių epigenetinių pažaidų – pakitęs DNR metilinimas. DNR metilinimas – tai poreplikacinis cheminis DNR modifikavimas. DNR metilinimo metu metilo grupė (-CH3) kovalentiškai prijungiama prie citozino (C) anglies molekulės 5 pozicijoje ir susidaro metilintas citozinas, arba metilcitozinas, kai kurių autorių dar vadinamas „penktąja baze“ [62]. Reakcija katalizuojama vieno ar kelių fermentų – DNR metiltransferazių. Metilo grupių donoru ląstelėje esti adenozilmetioninas, kuris per metilinimo reakciją virsta S-adenozilhomocisteinu.
CpG salos
Žmonių ir žinduolių ląstelėse dažniausiai metilinamas citozinas, einantis prieš guaniną (G), taip vadinamuosiuose citozino ir guanino dinukleotiduose arba CpG dinukleotiduose [34]. Žinduolių ląstelėse tik 3-5 proc. viso citozino yra metilinta [83]. Per evoliuciją CpG dinukleotidai buvo šalinami iš eukariotų genomo, todėl šie dinukleotidai randami daug rečiau nei galima būtų tikėtis teoriškai [249]. Tai aiškinama tuo, kad spontaninio deamininimo metu metilcitozinas, esantis CpG dinukleotiduose, virsta timinu. Šią pažaidą timino DNR glikozilazė šalina labai neefektyviai. O uracilo DNR glikozilazė efektyviai ištaiso nemetilinto citozino virtimą uracilu. Dėl to metilintas citozinas CpG dinukleotiduose mutuoja į timiną TpG dinukleotiduose, o nemetilintas citozinas, virtęs uracilu, vėl paverčiamas citozinu ir taip palaikomas CpG dinukleotidų kiekis [214]. Dėl metilinimo proceso CpG dinukleotido virtimas TpG dinukleotidu lemia dažniausią žmonių genetinio polimorfizmo tipą [298]. Per evoliuciją nepašalintuose CpG dinukleotiduose randamas didelis metilinto citozino dažnis. Tačiau buvo pastebėta, kad CpG dinukleotidai nėra tolygiai pasiskirstę žmogaus genome. 98 proc. genomo vienas CpG dinukleotidas sutinkamas kas 80 kitų dinukleotidų. Tuo tarpu
Sankaupose CpG dinukleotidų kiekis toks, kokio tikėtasi teoriškai. Šios DNR sekos buvo pavadintos CpG salomis. CpG salose CpG dinukleotidai nustatomi penkis kartus dažniau palyginti su CpG dinukleotidų kiekiu visame genome, ir jose citozinas yra apsaugotas nuo metilinimo. Apie 60 proc. žmogaus genų, dalyvaujančių svarbiuose ląstelės procesuose, turi minėtas CpG salas. Dažnai šios salos yra susijusios su šių genų 5’ galo reguliacinėmis sritimis – promotoriais ir (ar) pirmu egzonu [10]. Todėl manoma, kad nemetilintų CpG dinukleotidų skaičiaus išlaikymas reguliacinėse geno srityse yra svarbus šių genų raiškos procesui. Genomo sekvenavimo tyrimais nustatyta, kad žmogaus genome yra 29000 CpG salų. Jose yra daugiau kaip 19 milijonų CpG dinukleotidų [200, 381].
CpG saloms apibūdinti buvo pasiūlyti keli apibrėžimai. CpG salos – tai trumpos (apie 200 bazių porų (bp) ilgio) DNR sritys. Šiose DNR srityse daugiau kaip 50 proc. visų bazių sudaro citozinas ir guaninas (o visame genome citozino ir guanino kiekis tesiekia 40 proc.). Jų faktinis, palyginti su teoriniu, CpG dinukleotidų dažnio santykis lygus 0,6 arba yra didesnis [104, 110]. Siekiant atmesti pasikartojančias DNR sekas ir palikti tik unikalias, susijusias su genais CpG salas, vėliau buvo pasiūlytas griežtesnis CpG salų apibrėžimas. Tai – DNR sritys ilgesnės kaip 500 bp, kuriose daugiau kaip 55 proc. visų bazių sudaro citozinas ir guaninas. Jų faktinis, palyginti su teoriniu, CpG dinukleotidų dažnio santykis lygus 0,65 arba yra didesnis [348].
DNR metilinimo reikšmė
Pirmą kartą metilintas citozinas buvo paminėtas ir išskirtas dar praėjusio amžiaus pradžioje, tačiau ilgą laiką jo biologinė reikšmė buvo neaiški [15]. Šiuo metu yra žinoma, kad DNR metilinimas yra normalus procesas vykstantis įvairiuose organizmuose – nuo bakterijų iki žmogaus. Manoma, kad bakterijose DNR metilinimas yra apsauginis mechanizmas nuo svetimos DNR įsiterpimo [62]. Žinduolių organizmui DNR metilinimas ypač svarbus pradiniuose organizmo vystymosi etapuose. Po apvaisinimo embriogenezės metu vyksta griežtai kontroliuojami DNR metilinimo pokyčiai. Per pirmuosius zigotos dalijimusis vyksta genomo demetilinimas, o po implantacijos prasideda de novo metilinimas, kuris tęsiasi iki audinių susiformavimo. Manyta, kad susiformavus organizmui ryškesnių DNR metilinimo pokyčių ląstelėse nebevyksta [6, 313]. Tačiau pastaruoju metu diskutuojama dėl amžiaus įtakos DNR metilinimui [107, 161]. Be to, vis daugiau duomenų rodo, kad DNR metilinimo pobūdis keičiasi sergant įvairiomis ligomis, tarp jų ir vėžiu [62, 66].
DNR metilinimas taip pat dalyvauja genų imprintinge [72] ir genų, esančių moterų X chromosomoje inaktyvinime [141]. Normaliose ląstelėse tai yra du išimtiniai atvejai, kai genų
nuo vieno alelio. Ne mažiau svarbi DNR metilinimo funkcija yra parazitinių ir kartotinų DNR sekų, pvz., retrotranspozonų, ilgų išsklaidytų branduolio elementų (angl. long interspersed nuclear elements –LINEs arba L1), Alu sekų, endogeninių retrovirusų, slopinimas [155, 228, 394].
DNR metiltransferazės
Vienas svarbesnių epigenetikos mokslo laimėjimų buvo DNR metiltransferazių, kurios katalizuoja citozino metilinimą, atradimas. 1988 metais nustatytas pirmasis DNR metiltransferazės genas, kurio koduojamas produktas, DNR metiltransferazė 1, ilgą laiką buvo vienintelė žinoma DNR metiltransferazė tarp žinduolių [32]. Šiuo metu yra žinomas dviejų tipų DNR metilinimas – palaikomasis (angl. maintenance methylation) ir de novo metilinimas. Palaikomasis metilinimas apibūdinamas kaip procesas, kurio metu pusiau metilinta DNR virsta visiškai metilinta DNR arba kaip naujai sintezuotos dukterinės nemetilintos DNR grandinės metilinimas, metilinimo profilį nukopijuojant nuo motininės DNR grandinės. De novo metilinimas – DNR metilinimas, kai abi DNR grandinės yra nemetilintos. Manoma, kad DNR metiltransferazė 1 užtikrina DNR metilinimo palaikymą ląstelės ciklo S fazės metu ir yra nuo 5 iki 30 kartų aktyvesnė pusiau metilintos (angl. hemimethylated) palyginti su nemetilintos (angl. nonmethylated) DNR atžvilgiu [347]. Tačiau yra duomenų, kad DNR metiltransferazė 1 gali lemti ir de novo DNR metilinimą in vitro ir in vivo [233, 382]. „Nokautuotų“ (angl. knockout) pelių homozigotinė DNR metiltransferazės 1 geno delecija lemia šių pelių embrionų žūtį [210]. Vėlesni eksperimentai parodė, kad embrioninės kamieninės ląstelės, neturinčios DNR metiltransferazės 1, vis dėlto išlaiko nedidelį DNR metilinimo lygį. Kartu šiose ląstelėse nustatomas metiltransferazės aktyvumas [207]. Remiantis šiais duomenimis vėlesnių tyrimų metu buvo nustatyta DNR metiltransferazė 2, DNR metiltransferazė 3a ir 3b. Šiuo metu DNR metiltransferazės 2 funkcija ir biologinė reikšmė neaiški, kadangi atliekant eksperimentinius tyrimus in vitro nenustatytas DNR metiltransferazės 2 metiltransferazinis aktyvumas. Be to, embrioninės kamieninės ląstelės, neturinčios DNR metiltransferazės 2, išlaikė normalų DNR metilinimo pobūdį [260]. Nors atliekant eksperimentus in vitro DNR metiltransferazė 3a ir 3b lygiai tiek pat metilina nemetilintas ir pusiau metilintas DNR sekas [259], šių metiltransferazių genų delecija lemia eksperimentinių pelių ar jų embrionų ankstyvą žūtį [258]. Šie tyrimai įrodo, kad DNR metiltransferazių 3a ir 3b viena pagrindinių funkcijų organizme – de novo DNR metilinimas.
(pasyvus demetilinimas) [406], gali lemti DNR demetilinimą tam tikrais etapais, pvz., pradėjus vystytis embrionui, senėjant ir sergant kai kuriomis ligomis.
DNR metilinimas ir genų raiškos reguliacija
Pirmieji tyrimai, nagrinėję DNR metilinimo reikšmę genų raiškos reguliacijai, paskelbti praėjusio amžiaus septintajame dešimtmetyje, nustatė tiesioginį priklausomumą tarp bendro metilcitozino kiekio sumažėjimo genome (DNR hipometilinimo) ir genų raiškos [147]. Papildomi duomenys patvirtinantys šią hipotezę gauti atlikus eksperimentinius tyrimus su DNR metiltrasferazių inhibitoriais, citozino analogais 5-azacitidinu ir 5-aza-2-deoksicitidinu. Pirmieji eksperimentai atlikti su pelių embriono ląstelėmis, kurios paveiktos 5-azacitidinu, diferencijavosi į raumenų ląsteles, adipocitus ir chondrocitus [346]. Šie pokyčiai buvo susiję su DNR hipometilinimu [169]. Klasikiniai pavyzdžiai, kaip genų promotorių DNR metilinimas dalyvauja šių genų raiškos slopinime, yra genų imprintingas ir X chromosomos inaktyvinimas. Todėl neatsitiktinai pirmą kartą geno raiškos indukcija DNR metiltransferazės inhibitoriumi 5-azacitidinu buvo įrodyta ištyrus inaktyvintos X chromosomos genus [240]. Tyrimuose in vitro metilinus genus ir juos perkėlus į pelių ląsteles, buvo nustatytas šių genų raiškos slopinimas [328, 336]. Tai rodo, kad genų promotorių CpG salų metilinimas slopina genų raišką.
Mokslinė literatūra aprašo mechanizmus, kuriais DNR metilinimas, gali slopinti genų raišką:
1. Tiesioginis mechanizmas. DNR metilinimas blokuoja specifiškų tam tikroms DNR sekoms transkripcijos veiksnių (AP-2, c-Myc/Myn, CREB, E2F, NFkB) prisijungimą prie geno promotoriaus metilintos DNR [58, 280, 355].
2. Netiesioginis mechanizmas, kai dalyvauja su metilcitozinu sąveikaujantys baltymai (angl. methylcytosine-binding proteins ir methylcytosine-binding domain proteins), pvz., MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, Kaiso. Šie baltymai nėra specifiški DNR sekoms, tačiau pasirinktinai jungiasi su metilinta DNR. Be to, baltymai sudaro kompleksus su histonų deacetilazėmis HDAC1, HDAC2 ir įvairiais transkripcijos korepresoriais [282, 392]. Žinduolių ląstelėse DNR ir histonai sudaro nukleosomas. Nukleosoma – tai 146 bp ilgio DNR, apsisukusi apie baltymų oktamerus, sudarytus iš histonų H2A, H2B, H3 ir H4 molekulių. Histonų deacetilazės deacetilina histonų lizino liekanas ir palengvina sąveiką tarp gretimų histonų. Taip formuojasi transkripciškai neaktyvus kondensuotas chromatinas [12]. Tačiau yra duomenų, kad su metilcitozinu besijungiantys baltymai MeCP2 ir MBD2 gali
MeCP1 prisijungti prie DNR ir slopinti transkripciją reikia 12 metilintų CpG dinukleotidų, o MeCP2 užtenka tik vieno metilinto CpG dinukleotido [35, 246].
Sąveika tarp minėtų baltymų ir histono deacetilazių leidžia daryti prielaidą, kad DNR metilinimas ir chromatino struktūros pokyčiai yra glaudžiai susiję procesai. Pastaruoju metu daugėja įrodymų, kad histonų modifikavimas, arba „histonų kodas“ (angl. histone code), dalyvauja chromatino struktūros bei kondensacijos ir kartu genų veiklos reguliacijoje [167]. Lieka atviras tyrinėjimams klausimas: „Kas svarbiau ir kas įvyksta pirmiau genų veiklos reguliacijoje – DNR metilinimas ar histonų modifikavimas?“ Šiuo metu vyrauja nuomonė, kad šių procesų seka priklauso ir nuo ląstelių tipo, ir nuo geno, ir nuo ląstelėje vykstančio proceso. Literatūroje nurodoma, kad DNR metilinimas gali būti pagrindinis mechanizmas, slopinantis genų raišką. Eksperimentinių tyrimų duomenys įrodo, kad histono deacetilazių inhibitoriai neatnaujina metilintų genų raiškos. Tačiau šiuos genus pirma paveikus mažomis 5-azacitidino dozėmis, genai demetilinami ir atnaujinama jų raiška [47, 341]. Tačiau naujausi tyrimai parodė, kad histonų modifikavimas ir geno veiklos slopinimas gali įvykti anksčiau nei geno promotoriaus metilinimas [339, 343].
2.1.2. DNR metilinimo tyrimo metodai
Šiuo metu egzistuoja daugybė kokybinių ir kiekybinių DNR metilinimo tyrimo metodų. Pradiniais metodais buvo nustatomas bendras metilcitozino kiekis genome, o šiuolaikiniais metodais daugiau tyrinėjamas specifinių DNR sekų metilinimas. Pagrindiniai DNR metilinimo tyrimo metodai [100, 294]:
1. Bendro metilcitozino kiekio genome nustatymo metodai:
1.1. Efektyviosios chromatografijos metodai (efektyvioji skysčių chromatografija, efektyviosios skysčių chromatografijos ir masės spektrometrijos derinys, efektyvioji kapiliarinė elektroforezė), pagrįsti DNR chemine hidrolize iki bazių, jų frakcionavimu ir kiekybiškai įvertinamu metilcitozino kiekiu [101, 290].
1.2. Fermentiniai-cheminiai metodai: metilo grupių akceptoriaus analizė (angl. Methyl-acceptor assay), besiremianti tričiu žymėtos metilo grupės perkėlimu ant nemetilinto citozino CpG dinukleotiduose naudojant bakterijų DNR metiltransferazę [409], bei fluorescencinis DNR žymėjimas chloroacetaldehidu, pagrįstas chloroacetaldehido kiekybine reakcija sudaryti fluorescencinius etenocitozino ir etenoadenino aduktus [254].
1.3. In situ hibridizacijos metodas, panaudojant metilcitozinui specifinius polikloninius ar monokloninius antikūnus [2, 238].
2. Specifinių DNR sekų metilinimo tyrimo metodai:
2.1. Nebisulfitiniai metodai, panaudojant metilinimui jautrias ir nejautrias restrikcijos endonukleazes, kurios kerpa DNR tam tikroje vietoje priklausomai nuo DNR metilinimo būklės [197, 229].
2.2. Bisulfitinio modifikavimo metodai. Denatūravus DNR, natrio bisulfitas paverčia nemetilintą citoziną uracilu, o metilintas citozinas lieka nepakitęs. Taip atsiranda skirtingos DNR sekos, priklausomai nuo metilinimo būklės [103]. Yra daugybė metodų, kuriais toliau gali būti nustatoma, ar natrio bisulfitu modifikuotos DNR specifinės sekos yra metilintos ar nemetilintos. Tai sekvenavimas [295], kombinuota bisulfitinio modifikavimo ir restrikcijos analizė, (angl. Combined bisulfite restriction analysis - COBRA) [412], metilinimui jautri vieno nukleotido ilginimo reakcija (angl. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension) [124], metilinimui jautri DNR grandinės konformacijos analizė (angl. Methylation-sensitive single-strand conformation analysis) [77]. Tačiau plačiausiai šiuo metu taikomas metodas – metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija (PGR) [145] ir jos modifikacijos. Po DNR modifikavimo natrio bisulfitu metilinta DNR seka skiriasi nuo nemetilintos „laukinės“ (angl. wild type) DNR sekos. Šiuos pokyčius atpažįsta specifiniai pradmenys (angl. primers). Rezultatai dokumentuojami atlikus elektroforezę gelyje. Yra keletas šio metodo modifikacijų: „pusiau lizdinė“ (angl. seminested) [176], „lizdinė“ (angl. nested) dviejų etapų [263], metilinimui jautrios PGR ir in situ hibridizacijos [253] ar efektyviosios skysčių chromatografijos derinys [22], kiekybinis MethyLight metodas [369].
3. Genominiai tyrimo metodai [239].
2.1.3. DNR metilinimas ir kancerogenezė
Žinduolių ląstelės ypač sparčiai dalijasi. Žinant, kad vienos ląstelės dalijimasis trunka apie 24 valandas, tai 1 kg ląstelių svoris būtų pasiektas per 40 dienų. Tačiau normalios ląstelės turi tam tikrus genus – naviką slopinančius genus (NSG), kurie kontroliuoja ląstelės gyvenimo ciklą. NSG ypatybė – juos inaktyvina pažaidos abiejuose aleliuose. Taip sumažinama
metais A. G. Knudson paskelbė „dviejų smūgių“ kancerogenezės teoriją. Ši teorija teigia, kad NSG inaktyvinti gali tik abiejų genų kopijų pažaidos – „pirmas ir antras smūgis“ [190, 191]. Ilgą laiką buvo manyta, kad tik genetinės pažaidos (mutacijos, delecijos, heterozigotiškumo praradimas ir kt.) gali sąlygoti abiejų NSG kopijų pažeidimą. Tačiau daugėjant duomenų, kad dėl epigenetinių pažaidų NSG yra tiek pat dažnai ar net dažniau inaktyvinti kaip ir dėl genetinių pažaidų, prieita išvados, kad vieno ar abiejų geno kopijų pažeidimas gali būti sąlygojamas alternatyvaus genetiniams pokyčiams mechanizmo – DNR metilinimo NSG promotoriaus srityje. Dabar vyrauja nuomonė, kad didžiausias žmogaus vėžio rizikos veiksnys yra NSG inaktyvinimas [128]. Todėl DNR metilinimo pokyčiai, lemiantys NSG inaktyvinimą, pastaraisiais metais yra gausių mokslinių tyrinėjimų objektas.
DNR metilinimo sukeltas NSG inaktyvinimas gali skatinti genetinių pažaidų kaupimąsi. Nuo ciklinų priklausomų kinazių (angl. cyclin-dependent kinases – CDK) inhibitoriaus geno p16INK4a promotoriaus metilinimas yra ankstyvas plaučių vėžio genezės procesas [27]. Slopinant šio geno raišką nebestabdoma ląstelės ciklo progresija ir ląstelėse gali kauptis genetinės pažaidos [407]. Panašiu mechanizmu aiškinama ir DNR reparacijos bei ksenobiotikų detoksikacijos fermentų genų – gliutationo S-transferazės P1 geno (angl. glutathione S-transferase P1 - GSTP1), O6-metilguanino-DNR-metiltransferazės geno (angl. O6-methylguanine-DNA-methyltransferase - MGMT), arba „klaidingo suporavimo ištaisymo“ (angl. mismatch repair) geno hMLH1 – epigenetinio inaktyvinimo įtaka genetinėms pažaidoms, kai atsiradusios DNR pažaidos neištaisomos ir kaupiasi ląstelėje. [396]. Be to, ir metilcitozinas dėl spontaninio deamininimo dažniau, palyginti su kitomis bazėmis, mutuoja į timiną. Toks bazių pasikeitimas DNR sekoje vadinamas transcizija [60]. Nors metilcitozino deamininimas tik 2 kartus dažnesnis negu nemetilinto citozino, metilcitozino mutacijos nustatytos iki 40 kartų dažniau negu nemetilinto citozino. [322]. Manoma, kad tai priklauso nuo efektyvesnės uracilo, palyginti su timinu, reparacijos [316]. Nustatyta, kad metilinti CpG dinukleotidai yra egzogeninių cheminių kancerogenų taikiniai, lemiantys DNR pažeidimo „karštuosius taškus“ [73].
Daugiau nei prieš 15 metų buvo pastebėta, kad vėžinėse ląstelėse yra įvykę DNR metilinimo pokyčiai, kurie skiriasi nuo normalių ląstelių DNR metilinimo pobūdžio.
Vėžinėse ląstelėse gali būti trys procesai, susiję su DNR metilinimo pokyčiais [15]:
1. Bendro metilcitozino kiekio sumažėjimas genome – genomo hipometilinimas (angl. genome-wide hypomethylation).
3. DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas.
Šie procesai vėžinėje ląstelėje gali vykti kartu, dominuojant genomo hipometilinimui. Tačiau dar nėra aišku, ar genomo hipometilinimas ir genų promotorių metilinimas yra vieno proceso atskiros dalys, ar tai atskiri nesusiję procesai. Žinant, kad šie procesai vyksta skirtingose DNR vietose, manoma, jog minėti procesai tarp savęs nesusiję. Yra duomenų, kad CpG salų metilinimas gali įvykti ankščiau nei genomo hipometilinimas [98].
Genomo hipometilinimas
Jau seniai pastebėta, kad vėžinių ląstelių DNR yra mažiau metilinta nei normalių ląstelių DNR. Nustatyta, kad normalių ląstelių bendras metilcitozino kiekis sudaro 3 proc. ir daugiau, o vėžinių ląstelių – tik 1,2 proc. [75]. Kiti šaltiniai nurodo, kad žmogaus įvairių navikų ląstelėse metilcitozino kiekis yra sumažėjęs 10–20 proc., palyginti su normaliomis ląstelėmis. Be to, metilcitozino kiekis mažėja lyginant gerybinius, piktybinius navikus ir metastazes [82, 109]. Mokslininkai diskutuoja dėl kelių hipotezių apie hipometilinimo įtaką kancerogenezei. Tai onkogenų aktyvinimas [68], parazitinių genomo elementų, pvz., retrovirusų ir retrotranspozonų, aktyvinimas [232, 241, 288] ir chromosomų nestabilumas [80, 319]. Papildomi duomenys apie hipometilinimo įtaką kancerogenezei gauti atlikus eksperimentinius ir epidemiologinius tyrimus, kuriais nustatytas neigiamas ryšys tarp folatų, kaip metilo grupių donoro, kiekio maiste ir navikų vystymosi [121, 278]. Onkogenas MAGE plaučių vėžio atveju galėtų būti vienas hipometilinimo įtakos onkogenams aktyvinti pavyzdžių. Onkogeno MAGE raiška nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSPV) atveju nustatoma nuo 70 iki 85 proc. Tai koreliuoja su geno promotoriaus hipometilinimu dėl galimai viso genomo hipometilinimo, kuris nustatomas nuo 75 iki 80 proc. atvejų [163]. Tačiau šiuo metu nėra aiški geno MAGE funkcija ir neaišku, ar šio geno aktyvinimą galima laikyti onkogeno aktyvinimo dėl hipometilinimo įtakos pavyzdžiu.
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad koduojančių geno sričių, kurios daugiausia būna metilintos, hipometilinimas menkai koreliuoja su genų raiškos reguliacija. O reguliacinės geno sritys (geno promotoriai) normaliomis sąlygomis yra nemetilintos ir neveikiamos hipometilinimo proceso. Manoma, kad tuo gali būti paaiškinamas silpnas ryšys tarp DNR hipometilinimo ir genų raiškos aktyvinimo [68].
Plaučių vėžio atveju nė viena iš išvardytų hipotezių dar nėra įrodyta, tačiau manoma, jog hipometilinimas gali būti plaučių vėžio biologiniu žymeniu [408].
Genų promotorių CpG salų metilinimas
gali vykti panašūs procesai. S. B. Baylin su bendraautoriais pirmieji praėjusio amžiaus aštuntąjį dešimtmetį tai patvirtino, nustatydami metilintą kalcitonino geno promotorių 11 chromosomos trumpajame petyje (q) solidiniais navikais ir leukemijomis sergantiems ligoniams [14, 16]. Kalcitonino geno reikšmė kancerogenezei abejotina, tačiau buvo rasta ir daugiau metilintų CpG salų 11q chromosomoje, kurioje yra daugelis NSG [216]. Tuo metu prieita išvados, kad 11q chromosomoje yra genų promotorių CpG salų metilinimo „karštieji taškai“, ir DNR metilinimas gali būti vienas esminių NSG inaktyvinimo mechanizmų navikuose [67]. F. Antequera su bendraautoriais (1990 m.) nustatė, kad daugelis CpG salų yra metilintos imortalizuotose žmogaus ir pelių ląstelėse [11]. Jie iškėlė hipotezę, kad DNR metilinimas gali sąlygoti šių ląstelių imortalizuotą fenotipą slopindamas normalią ląstelės diferenciaciją ir (ar) augimą reguliuojančių genų veiklą. Šis procesas buvo pavadintas „su metilinimu susijęs genų inaktyvinimas“ [10]. Tačiau iki devintojo praėjusio amžiaus dešimtmečio tiesioginių tyrimų, patvirtinančių minėtas hipotezes, nebuvo. Pirmasis klasikinis NSG, kurio promotoriuje 1991 metais rasta metilinta DNR, buvo retinoblastomos (Rb) genas [307]. 1993 metais atliekant eksperimentus in vitro buvo įrodyta, kad Rb geno promotoriaus metilinimas blokuoja transkripcijos veiksnių sąlygojamą promotoriaus aktyvinimą [257]. Tačiau visiškai aiškus ryšys tarp geno promotoriaus metilinimo ir geno raiškos slopinimo buvo įrodytas ištyrus kitą klasikinį NSG – von Hippel-Lindau (VHL) geną, būdingą inkstų vėžiui [146]. Remiantis VHL geno tyrimais, buvo apibrėžti klasikiniai teiginiai, apibūdinantys NSG inaktyvinimo ir šių genų promotorių DNR metilinimo ryšį [146]:
1. Pažeidžiami NSG.
2. Metilinta genų promotorių DNR nustatoma tik navikiniame audinyje, tačiau ne atitinkamame sveikame audinyje.
3. Navikuose, kuriuose nustatytas metilintas genas, nerandama atitinkamo geno alelio koduojančios srities mutacijos.
4. Nenustatoma metilinto geno raiška informacinės ribonukleorūgšties (mRNR) lygyje. 5. Metilintų genų raišką galima atnaujinti paveikus juos demetilinančiais preparatais. 6. Geno promotoriaus metilinimas lemia ekvivalentišką mutacijai pažeisto geno veiklos
slopinimą.
Normaliose (nevėžinėse) ląstelėse genų promotorių CpG salų DNR yra nemetilinta, o histonų molekulės – acetilintos. Tai sąlygoja transkripciškai aktyvią nekondensuoto chromatino struktūrą, transkripcijos veiksnių (pirminio transkripcijos veiksnio, histono acetiltrasferazių, transkripcijos koaktyvatorių) prieinamumą prie nemetilintos DNR ir aktyvią
Nemetilintas genų promotorių CpG salas iš abiejų pusių supa metilinti CpG dinukleotidai, susiję su anksčiau minėtų baltymų ir histono deacetilazių kompleksais, kompaktiška nukleosomų sandara, deacetilintais histonais. Normalios ląstelės tarp šių sričių turi barjerą, neleidžiantį plisti metilinimui į geno promotoriaus sritį. Iki šiol nėra visiškai aiškūs šio barjero molekuliniai mechanizmai, tačiau manoma, kad egzistuoja lokalūs veiksniai, apsaugantys genų promotorių CpG salas nuo metilinimo. Prie tokių veiksnių priskiriamos transkripcijos veiksnių, pvz., specifinio baltymo 1 (angl. specific protein 1 - Sp-1), ir CTCCC sujungiančio veiksnio (angl. CTCCC binding factor – CTCF) prisijungimo prie DNR sritys [41, 46, 219], taip pat kai kurie baltymai (pvz., histonas H1e) [311, 413]. Keletas autorių nurodo, kad barjerui palaikyti taip pat svarbi aktyvi transkripcija, aktyvus demetilinimas, replikacijos laikas, lokali chromatino struktūra [56]. Manoma, kad vėžinėse ląstelėse yra apeinamas šis apsauginis barjeras ir metilinimas plinta į geno promotoriaus sritį. Nors molekuliniai mechanizmai nėra aiškūs, galvojama, kad tai gali vykti dėl DNR metiltransferazės aktyvumo padidėjimo arba minėtų transkripcijos veiksnių ir baltymų pokyčių [46, 382].
DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas
T. L. Kautiainen ir P. A. Jones (1986 m.) pirmieji nustatė, kad pelių ir žmogaus navikinėse ląstelėse DNR metiltransferazės aktyvumas yra daug kartų didesnis nei normaliose ląstelėse. Tai buvo netikėtas atradimas, nes tose pačiose navikinėse ląstelėse kartu buvo nustatytas genomo hipometilinimas. Autoriai padarė prielaidą, kad padidėjęs DNR metiltrasferazių aktyvumas sąlygoja DNR metilinimą „karštuose taškuose“ [175]. Kai kurie mokslininkai genomo hipometilinimo ir padidėjusio DNR metiltransferazės aktyvumo derinį aiškino neefektyviu palaikomuoju DNR metilinimu esant chromatino pokyčiams. Šie pokyčiai blokuoja DNR metiltransferazės prisijungimą prie DNR, kartu grįžtamuoju ryšiu stimuliuojamas DNR metiltransferazės aktyvumas. Tokia hipotezė rėmėsi tyrimais, analizavusiais kepenų kancerogenezę folatų trūkumo sąlygomis [278]. Kiti autoriai nurodo, kad vėžinėse ląstelėse priešingai pasyviam demetilinimui dėl nepakankamo palaikomojo metilinimo gali egzistuoti aktyvūs demetilinimo procesai [342]. Taigi, genomo hipometilinimo ir padidėjusio DNR metiltransferazės aktyvumo derinys dar nepaaiškintas.
Po kelių metų pirmieji duomenys apie padidėjusį DNR metiltransferazės aktyvumą vėžinėse ląstelėse buvo patvirtinti kitų mokslininkų tyrimais, kuriuose įvairių tipų navikinėse ląstelėse nustatytas didesnis DNR metiltransferazės mRNR kiekis palyginti su nenavikinių ląstelių kultūromis [84]. T. Matsumura su bendraautoriais ir vėliau P. M. Vertino su kolegomis nustatė, kad fibroblastams senėjant vyksta DNR hipometilinimas ir mažėja DNR
fibroblastų senėjimo, pailgėja ląstelių gyvenimo trukmė, kai kurie fibroblastai išvengia krizės ir tampa imortalizuotais. Šiuose SV40 virusu užkrėstuose fibroblastuose, palyginti su normaliais fibroblastais, nenustatytas DNR metiltransferazės geno aktyvumo sumažėjimas [226, 227, 383]. S. B. Belinsky su bendraautoriais nustatė, kad paveikus eksperimentines peles tabako dūmuose esančiu kancerogenu 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanonu (angl. 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone) (NNK)), pelių plaučių II tipo pneumocituose, iš kurių formuojasi plaučių adenokarcinoma, DNR metiltransferazės aktyvumas padidėjo tris kartus [26]. Du kartus padidėjusi DNR metiltransferazės 1 geno raiška sukelia NIH3T3 ląstelių linijų vėžinę transformaciją [409]. Tai rodo, kad DNR metiltransferazės aktyvumo padidėjimas yra ankstyvas kancerogenezės procesas. DNR metiltransferazės taip pat susijusios su vėžio plėtotės procesu. Daugelis mokslininkų, tyrinėdami storžarnės vėžio genezės ir plėtotės procesus, nustatė, kad DNR metiltransferazės kiekis didėja pradedant nuo storžarnės normalios gleivinės, toliau – adenomos ir baigiant storžarnės vėžiu [84, 159].
Nors iškelta įvairių hipotezių, pasisakančių už geno RAS kontroliuojamo atsako [218] ar navikinių ląstelių didesnio proliferavimo [205] įtaką, kol kas nėra žinomi veiksniai, lemiantys padidėjusį DNR metiltransferazės aktyvumą vėžio genezės ir plėtotės procese.
Manoma, kad padidėjęs DNR metiltransferazės aktyvumas tiesiogiai dalyvauja kancerogenezės procese, sukeldamas NSG inaktyvinimą dėl šių genų promotorių metilinimo. Atliekant tyrimus su SV40 virusu užkrėstais fibroblastais, pastebėta, kad fibroblastuose ne tik nemažėja DNR metiltransferazės aktyvumas, bet vyksta „jautrių“ metilinimui CpG salų de novo metilinimas, kai DNR metiltransferazės aktyvumas padidėja daugiau kaip devynis kartus. Šių pokyčių daugėja laikui bėgant [382]. Klasikiniai eksperimentiniai tyrimai, kuriuose nustatytas ryšys tarp DNR metiltranferazės aktyvumo ir NSG promotorių metilinimo, buvo atlikti Jaenisch laboratorijoje. Eksperimentinėms pelėms, kurios turėjo žarnų adenomatozinės polipozės (angl. Adenomatous polyposis coli – APC) geno ir DNR metiltransferazės geno heterozigotines mutacijas, nustatyta 50 proc. mažiau adenomų 6 mėnesius po gimimo ir visiškai nerasta papildomai skiriant 5-azadeoksicitidiną [198]. Iš pradžių manyta, kad mažesnis DNR metiltransferazės aktyvumas lemia mažesnį DNR mutacijų dėl metilcitozino virtimo timinu skaičių. Vėliau prieita išvados, kad eksperimentinėms pelėms mažiau adenomų susiformavo dėl mažesnio NSG inaktyvinimo [198]. Vėlesni tyrimai su pelėmis nustatė, kad DNR metiltransferazės aktyvumo, kartu ir DNR metilinimo bei histonų deacetilinimo mažinimas užkerta kelią tabako dūmuose esančio
DNR metiltransferazės aktyvumo ir kancerogenezės ryšį, tačiau problema ir toliau lieka mokslinių diskusijų objektu, nes vėlesniuose tyrimuose pastebėta, kad tyrinėtoms pelėms dažniau atsiranda limfomų [112].
2.1.4. Tirtų naviką slopinančių genų charakteristikos ir metilinimas įvairuose biologiniuose mėginiuose
Genai p16INK4a ir p14ARF. 9p21 chromosomos INK4a/ARF lokusas alternatyvaus splaisingo ir rėmelio skaitymo būdu koduoja skirtingus baltymus – p16INK4a ir p14ARF. Geno p16INK4a koduojamas baltymas, nuo ciklinų priklausomų kinazių 4 ir 6 inhibitorius, yra pagrindinis ląstelės ciklo reguliatorius, dalyvaujantis p16INK4a/ciklinoD1/Cdk 4 ir 6/Rb ląstelės ciklo reguliacijoje. p16INK4a baltymas blokuoja Rb baltymo fosforilinimą, transkripcijos veiksnio E2F aktyvinimą, ir taip stabdo ląstelės ciklą G1 fazėje [324]. Genas p16INK4a yra inaktyvintas daugelio navikų atveju [303]. Neaktyvus genas p16INK4a nustatytas pusės NSPV sergančių ligonių navike [194]. Vien genetiniais pokyčiais (homozigotinėmis delecijomis ar mutacijomis, kurios sudaro tik apie 20 proc. atvejų) nebuvo galima paaiškinti žymiai didesnio geno p16INK4a inaktyvinimo ligonių, sergančių NSPV, navike [69]. Pastaraisiais metais, atradus dažną geno p16INK4a promotoriaus metilinimą esant įvairiems navikams, taip pat ir plaučių vėžiui, eksperimentiniais tyrimais buvo įrodyta, kad geno p16INK4a metilinimas yra alternatyvus genetinėms pažaidoms mechanizmas šio geno veiklai slopinti [174].
Geno p14ARF genetinių ir epigenetinių pažaidų biologinė reikšmė šiuo metu išlieka diskusijų objektu. Tyrimais nustatyta, kad geno p14ARF koduojamas baltymas dalyvauja p14ARF/MDM2 (angl. murine double minute 2) /p53 patogenetiniame viduląsteliniame signalo perdavimo kelyje. p14ARF baltymas blokuoja p53 ubikvitino ligazės MDM2 aktyvumą ir lėtina baltymo p53 proteolizę [414]. Baltymas p53, kartu su kitais reguliaciniais baltymais, aktyvina DNR pažaidų kontrolės mechanizmą. Geno p14ARF raiškos pokyčiai NSPV sergančių ligonių navike gali būti alternatyvus geno p53 mutacijoms mechanizmas, lemiantis geno p53 raiškos pokyčius ir turintis įtakos ligonių gyvenimo trukmei [395]. Nustatyta kad geno p14ARF promotoriaus metilinimas susijęs su baltymo MDM2 viduląsteline lokalizacija [86]. Nors geno p14ARF raiškos pokyčiai nustatyti iki 41 proc. NSPV sergančių ligonių navike [389], tačiau dar nerasta geno p14ARF 1β egzono delecijų. Todėl manoma, kad geno p14ARF promotoriaus metilinimas yra svarbus šio geno veiklos slopinimo mechanizmas, nors studijų,
Genas FHIT. Heterozigotiškumo praradimas 3p chromosomoje yra vienas dažniausių ir ankstyviausių procesų plaučių vėžio genezėje. Tai rodo, kad šioje srityje yra NSG [402]. Ieškant šių NSG, 1996 metais 3p14.2 chromosomos FRA3B srityje, vienoje lūžiausių genomo vietų, buvo rastas NSG – lūžių histidino triadų (angl. fragile histidine triad – FHIT) genas [256]. Šios DNR srities heterozigotiškumo praradimas ir mRNR kiekio pokyčiai, tačiau ne geno mutacijos, dažnai nustatomos NSPV sergančių ligonių navike [335]. Geno FHIT „nokautuotoms“ pelėms atsiranda spontaninių įvairių lokalizacijų navikų [105]. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad adenoviruso vektoriumi pernešus geną FHIT, paveikiami ląstelės ciklo ir apoptozės kontrolės mechanizmai ir slopinamas plaučių navikinių ląstelių dauginimasis in vitro bei in vivo. Tačiau geno FHIT indukuotas apoptozės mechanizmas skiriasi nuo genų p53 ar Rb sąlygotos apoptozės [168, 302]. Tai įrodo, kad genas FHIT priklauso NSG grupei. Tik pastaraisiais metais nustatyta, kad geno FHIT raiškos slopinimas yra dažnas reiškinys NSPV sergančių ligonių navike [117]. Didžiausią įtaką šiam slopinimui daro geno promotoriaus metilinimas [136, 376]. Paveikus in vitro navikines ląsteles demetilinančiu preparatu 5-aza-2-deoksicitidinu, geno FHIT raiška atnaujinama [416]. Genas FHIT yra neseniai atrastas NSG, kurio reikšmė plaučių vėžio genezei nėra visiškai aiški.
Genas RASSF1A. 2000 metais 3p21.3 chromosomoje rastas kitas NSG – su ras sąveikos domeną turinčių baltymų 1A šeimos (angl. RAS association domain family 1A – RASSF1A) genas, kuris turi su ras sąveikos domeną ir yra homologiškas ras viduląstelinio signalo perdavimo kelio efektoriui Nore1 (angl. Ras-effector Nore1) [65]. Tyrimais nustatyta, kad geno RASSF1A raiškos slopinimas yra dažnas reiškinys NSPV sergančių ligonių navike. Jį dažniausiai sąlygoja geno RASSF1A promotoriaus metilinimas. Geno RASSF1A mutacijos labai retos [44, 65]. Geno RASSF1A raiška atnaujinama paveikus ląsteles in vitro demetilinančiu preparatu 5-aza-2-deoksicitidinu. Genas RASSF1A laikomas NSG genu, kadangi atliktuose eksperimentiniuose tyrimuose slopina navikinių ląstelių augimą [44, 65, 85]. Nors RASSF1A baltymo molekuliniai veikimo mechanizmai, slopinantys naviką, nėra aiškūs, manoma, jog RASSF1A baltymas netiesiogiai dalyvauja ras signalo perdavimo kelyje sąveikaudamas su Nore [261], slopina genominį nestabilumą sąveikaudamas su mikrotubulėmis [390] ar dalyvauja apoptozės procesuose [312]. Genas RASSF1A yra kitas 3p chromosomoje neseniai atrastas NSG, pastaraisiais metais ypač plačiai tyrinėjamas.
Genas RARβ. Retinoinės rūgšties receptoriaus ß (angl. retinoic acid receptor ß – RARβ) genas, rastas 3p14 chromosomoje, koduoja branduolio retinoinės rūgšties receptorių β. Šio
receptoriaus ligandai yra vitamino A analogai – retinoidai, dalyvaujantys plaučių vystymosi ir diferenciacijos procesuose [230]. Jų stoka didina plaučių vėžio atsiradimo riziką [234]. Nustatyta, kad genas RARβ slopina navikų formavimąsi eksperimentiniuose pelių modeliuose in vivo [31], o in vitro slopina žmogaus plaučių vėžio ląstelių dauginimąsi bei skatina šių ląstelių apoptozę [211, 366]. Retinoidai gali būti naudingi plaučių vėžio prevencijai, darydami įtaką geno RARβ raiškos pokyčiams [178, 187]. Nors geno RARβ raiškos slopinimas dažnai randamas tiriant plaučių vėžio ląstelių linijas bei pirminį plaučių vėžį [116, 276], šio geno mutacijų nenustatyta [116]. A. K. Virmani su bendraautoriais (2000 m.) nustatė, kad geno RARβ promotoriaus metilinimas yra vienas pagrindinių mechanizmų, sąlygojančių šio geno veiklos slopinimą [385]. Genas RARβ vėl pasidaro veiklus paveikus vėžines ląsteles in vitro demetilinančiu preparatu 5-aza-2-deoksicitidinu [385].
Genas DAPK. Apoptozę skatinančios baltymų kinazės (angl. death associated protein kinase – DAPK) genas, koduoja nuo Ca2+ ir kalmodulino priklausančią serino ir treonino kinazę. Jis atrastas 1995 metais, ieškant genų, sąlygojančių programuotą ląstelių mirtį – apoptozę [71]. Apoptozės mechanizmas – svarbus naviką slopinantis veiksnys. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad genas DAPK yra NSG, dalyvaujantis kancerogenezės ir vėžio plėtotės procesuose [33]. Genas DAPK yra svarbus ankstyvajai kancerogenezei, nes koduojamas baltymas skatina onkogeninių signalų sukeltą apoptozę [292] Be to, jis slopina navikinių ląstelių metastazavimą vėžio plėtotės metu [154]. Kaip ir kitų NSG atvejais, geno DAPK raiškos slopinimą dažnai sukelia šio geno promotoriaus metilinimas, kuris veikiamas demetilinančių preparatų yra pašalinamas [361].
Genas MGMT. O6-metilguanino-DNR-metiltransferazės (angl. O6 -methylguanine-DNA-methyltransferase – MGMT) genas, atrastas 1988 metais [354]. Jis koduoja DNR reparacijos baltymą O6-alkilguanino DNR alkiltransferazę, kuris pašalina mutageniškus alkilo aduktus DNR O6 guanino ar O4 timino ir taip apsaugo normalias ląsteles nuo egzogeninių kancerogenų, o navikines ląsteles – nuo antinavikinių vaistų poveikio [118]. Geno MGMT raiška būna sumažėjusi kai kuriuose navikuose, taip pat ir plaučių, palyginus su normaliais audiniais [55]. Nustatyta, kad geno MGMT raiškos slopinimas siejasi su K-RAS onkogeno mutacijomis virškinamojo trakto adenomose ar piktybiniuose navikuose [93, 206] ir geno p53 mutacijomis NSPV [405]. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad aktyvi geno MGMT raiška sumažina NKK indukuotą plaučių navikų atsiradimą transgeninėms pelėms, sąlygodama DNR reparaciją ir sumažindama onkogeno K-RAS mutacijas [215]. Šie duomenys rodo geno MGMT reikšmę kancerogenezei. Geno MGMT raiškos pokyčiai lemia gliomų
MGMT promotoriaus metilinimas slopina geno raišką esant įvairiems navikams, taip pat ir plaučių vėžiui [89, 398].
Genas APC. 5q21 chromosomos žarnų adenomatozinės polipozės (angl. adenomatous polyposis coli – APC) geno pažaidų vaidmuo plačiausiai išnagrinėtas storosios žarnos vėžio genezėje. Manoma, kad geno APC pažaidos dalyvauja kancerogenezėje įvairiais aspektais: 1) dalyvaudamos Wnt (angl. wingless-type) -β-katenino viduląsteliniame signalo perdavimo kelyje slopina β-katenino degradaciją ir sąlygoja jo susikaupimą branduolyje; tai sukelia adhezijos ir viduląstelinio signalo perdavimo kelių pokyčius; 2) paveikus mikrotubules ir aktiną F, sutrikdo ląstelių migraciją; 3) sukelia genetinį nestabilumą ir sutrikdo ląstelės dalijimąsi [172, 247]. Esant NSPV heterozigotiškumo netekimas nustatomas apie 40 proc. [59], β-katenino raiškos slopinimas – 37 proc. [173]. Tai leidžia manyti, kad genas APC padeda atsirasti ne tik storosios žarnos, bet ir plaučių vėžiui. Nors geno APC mutacijos nustatytos 40 proc. eksperimentinių žiurkių, kurioms N-nitrozobi(2-hidroksipropil)aminu buvo sukeltas plaučių navikas [375], NSPV sergančių ligonių navike šio geno mutacijų nerasta [59] arba nustatytos tik 3–5 proc. atvejų [255]. Ieškant kitų mechanizmų nustatyta, kad geno APC veiklos slopinimas esant NSPV gali būti sąlygojamas šio geno promotoriaus metilinimo, ir tai yra grįžtamas procesas veikiant navikines ląsteles demetilinančiais preparatais [386]. Be to, genas APC turi du promotorius – 1A ir 1B, – kurie inicijuoja transkripciją nuo skirtingų egzonų [149]. M. Esteller su bendraautoriais, tirdamas NSPV, nenustatė APC geno 1A promotoriaus metilinimo [92]. Remiantis kitų autorių, kurie dažniausiai taikė kiekybinius tyrimo metodus, duomenimis, metilintas šio geno promotorius rastas daugumos NSPV sergančių ligonių navike [38, 139, 378, 386]. Tikriausiai geno APC veiklos slopinimą lemia tik šio geno 1A, kaip ir genų RASSF, promotoriaus metilinimas [65], nes geno APC 1B promotoriaus metilinimo nerasta ne tik sergant plaučių, bet ir krūties, skrandžio bei storosios žarnos vėžiu [92, 374, 386]. Geno APC promotoriaus metilinimo ir jo raiškos slopinimo padariniai plaučių vėžio genezei dar nėra visiškai išaiškinti [386].
Genas Ecad (CHD1). E-kadherino (angl. E-cadherin – Ecad (CHD1)), arba epitelinis kadherino, genas, esantis 16q22.1 chromosomoje, koduoja vieną iš kadherinų šeimos transmembraninių glikoproteinų. Šie glikoproteinai dalyvauja kadherino ir katenino formuojamame epitelinių ląstelių sąveikos komplekse, taip pat ir Wnt-β-katenino viduląstelinio signalo perdavimo kelyje. Kadherino ir katenino komplekso raiškos slopinimas susijęs su ląstelių dediferenciacija, padidėjusiu navikinių ląstelių invazyvumu ir metastazavimu [42, 399]. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad, pernešus geną Ecad,
navikinės ląstelės praranda invazyvumą [275], o neutralizavus Ecad glikoproteiną antikūnais, normalios ląstelės įgyja invazinių savybių [387]. Be to, atliekant eksperimentinius tyrimus su krūties ir prostatos vėžio ląstelėmis, nustatyta, kad genas Ecad metilinamas vykstant navikinių ląstelių metastazavimui. Tačiau formuojantis metastazėms geno Ecad promotorius tampa nemetilintas. Tai rodo grįžtamą ir dinaminį metilinimo proceso pobūdį [126]. Remiantis atliktais tyrimais, genas Ecad yra priskiriamas NSG grupei. Geno Ecad raiškos slopinimas nustatytas iki 81 proc. NSPV atvejų ir koreliuoja su blogesne naviko diferenciacija [173], didesniu pirminiu naviku ir metastazių buvimu sritiniuose limfmazgiuose. Tai atspindi plaučių vėžio invaziškumą ir metastazavimą [325]. Geno Ecad mutacijos nustatytos tiriant skrandžio, krūties vėžį ir sarkomą, tačiau sergant kitais navikais yra labai retas reiškinys. Todėl, kaip ir kitų NSG atvejais, ieškota alternatyvių geno raiškos slopinimo mechanizmų [337]. 1995 metais pirmą kartą nustatytas geno Ecad promotoriaus metilinimas buvo susietas su šio geno raiškos slopinimu tiriant vėžio ląstelių linijas [157]. Vėlesni tyrimai parodė, kad geno Ecad promotoriaus metilinimas esant įvairiems navikams yra dažnas reiškinys [337]. Tačiau tyrimų, nagrinėjusių šio geno metilinimą sergant plaučių vėžiu, nėra daug [152, 225, 418].
NSG metilinimas nenavikiniame plaučių audinyje. Dauguma iki šiol atliktų tyrimų nagrinėjo ir nustatė molekulines pažaidas plaučių vėžiu sergančių ligonių navike. Tačiau nedaug žinoma apie molekulinius procesus, kurie vyksta morfologiškai normaliame ar ikinavikiškai pakitusiame bronchų epitelyje bei plaučių audinyje iki invazyvaus plaučių vėžio atsiradimo, taip pat apie šių procesų seką ir svarbą [54, 320, 404]. Morfologiniai pokyčiai, kurie vyksta iki invazyvaus plokščialąstelinio plaučių vėžio, yra hiperplazija, metaplazija, displazija ir carcinoma in situ. Manoma, kad atipinė adenomatozinė hiperplazija yra adenokarcinomos ikinavikinė būklė [57]. Tiridami molekulinius pokyčius sergančiųjų plaučių vėžiu arba nesergančių asmenų morfologiškai normalioje ar ikinavikiškai pakitusioje bronchų gleivinėje ar nenavikiniame plaučių audinyje daugelis mokslininkų apsiribojo genetinių pažaidų paieška. Plaučių vėžiu sergančiųjų morfologiškai nenavikiniame ar ikinavikiškai pakitusiame bronchų epitelyje heterozigotiškumo praradimas nustatomas iki 70 proc. ligonių [268, 401, 402], mikrosatelitų pažaidos – iki 35 proc., o navikiniame plaučių audinyje jos nustatomos 40 proc. ligonių [269]. Genų K-RAS mutacijos bei p53 pažaidos taip pat buvo rastos plaučių vėžiu sergančiųjų ikinavikiniuose bronchų gleivinės ir plaučių audinio mėginiuose [189, 201, 334] bei histologiškai normaliuose naviko rezekciniuose kraštuose [166]. Nesergančių plaučių vėžiu rūkančių ar metusių rūkyti asmenų bronchų epitelyje labai
mikrosatelitų pažaidos, genų raiškos slopinimas ir net p53 geno mutacijos, nors kol kas tai nagrinėta tik keliuose tyrimuose. Niekada nerūkiusių asmenų bronchų epitelyje tokių pakitimų nerasta [102, 223, 371, 403].
Nurodoma, kad genetinės pažaidos nenavikiniame ar ikinavikiniame bronchų epitelyje arba plaučių audinyje gali sietis su „lauko kancerizacijos“ (angl. field cancerization) fenomenu dėl tabako dūmuose esančių kancerogenų poveikio. Pirmasis terminą „lauko kancerizacija“ pavartojo D. P. Slaughter su bendraautoriais (1953 m.) [329]. O. Auerbach su bendraautoriais (1962 m.), ištyręs autopsinę medžiagą, „lauko kancerizacijos“ terminą vartojo aprašydamas daugiažidininius ikinavikinius morfologinius pokyčius rūkančiųjų ar metusių rūkyti bronchų epitelyje [13]. Nuo to laiko „lauko kancerizacijos“ terminu apibūdinami dėl kancerogenų poveikio atsiradę įvairių organų daugybiniai morfologiškai normalių ar ikinavikiškai pakitusių audinių plotai, kuriose nustatomos genetinės pažaidos.
„Lauko kancerizacija“ yra neatsiejama daugiastadijinio kancerogenezės proceso dalis ir svarbi klinikinei plaučių vėžio eigai, nes siejama su vėžio recidyvu [37]. Molekulinių pokyčių seka plaučių vėžio genezėje iki šiol nėra aiški. Tačiau manoma, kad kancerogenezės procesas praeina daugelį etapų ir plaučių vėžys atsiranda susikaupus ląstelėje nuo 10 iki 20 genetinių pažaidų [235]. Nors „lauko kancerizacijos“ fenomenas aprašytas tiriant įvairių organų navikus [61, 99, 170, 281, 301], tačiau tyrimų, tiesiogiai nagrinėjusių šiuos pokyčius plaučių vėžio genezėje, nėra daug ir juose daugiausiai apsiribota genetinių pažaidų paieška [102, 223, 269, 403].
Atliekant pradinius tyrimus, metilintų genų NSPV sergančių ligonių nenavikiniame plaučių audinyje nenustatyta arba nustatyta tik retais atvejais [44, 89, 386, 418]. S. Zöchbauer-Müller su bendraautoriais (2001 m.), ištyrusi NSPV sergančiųjų navikinį ir nenavikinį plaučių audinį, nustatė, kad nenavikiniame plaučių audinyje metilintų genų RARβ, audinių inhibitoriaus metaloproteinazės 3, DAPK ir p14ARF dažnis nenavikiniame plaučių audinyje svyravo nuo 5 iki 14 proc., o metilintų genų p16INK4a, MGMT, Ecad ar GSTP1 nerasta. Kadangi daugumoje atvejų nenavikiniame audinyje buvo metilinti kiti genai nei navikiniame plaučių audinyje, autoriai priėjo prie išvados, kad nenavikinio plaučių audinio epigenetinės pažaidos atspindi ikinavikinius pokyčius [418]. Vėlesni tyrimai parodė, kad NSG metilinimas NSPV sergančiųjų nenavikiniame plaučių audinyje yra žymiai dažnesnis procesas nei manyta anksčiau [38, 39, 81, 152, 352, 376]. M. Guo su bendraautoriais (2004 m.), ištyręs genus p16INK4a, MGMT, DAPK, RASSF1A, ciklooksigenazės 2, RARβ, nustatė, kad šių genų
metilinimas histologiškai normaliame rezekciniame plaučių vėžio krašte 85 proc. atitinka šių genų metilinimą pirminiame plaučių navike [133].
Tad, nors kaupėsi vis daugiau duomenų apie NSG metilinimą NSPV sergančių ligonių nenavikiniame plaučių audinyje, daugelyje studijų nagrinėtas tik pavienių genų metilinimas ir plačiau neanalizuotas NSG metilinimas nenavikiniame plaučių audinyje.
Vertinant NSG metilinimo reikšmę plaučių vėžio genezei svarbūs duomenys gauti tiriant padidintos rizikos asmenų (rūkančiųjų ar metusių rūkyti) skreplius, bronchų nuobrūžas, bronchoalveolinį lavažą. Tiriant nesergančių plaučių vėžiu, tačiau rūkančių asmenų, skreplius metilintas genas p16INK4a nustatytas nuo 19 iki 35 proc., metilintas genas MGMT – nuo 14 iki 16 proc., metilintas genas DAPK – 24 proc., metilintas genas RASSF1A – 3 proc. atvejų [27, 28, 176, 263]. Bent vienas iš tirtų genų DAPK, p16INK4a ir GSTP1 buvo metilintas 32 proc. nesergančių plaučių vėžiu, tačiau metusių rūkyti asmenų bronchų nuobrūžose [331]. Bent vienas iš tirtų genų RARβ, H-kadherino, p16INK4a ir RASSF1A buvo metilintas 48 proc. nesergančių plaučių vėžiu, tačiau intensyviai rūkančių asmenų skrepliuose, bronchų nuobrūžose ar bronchoalveoliniame lavaže [417].
Nors tyrimų, nagrinėjusių NSG metilinimą padidintos rizikos susirgti plaučių vėžiu asmenų skrepliuose, bronchų nuobrūžose ar bronchoalveoliniame lavaže yra nemažai, publikuotos tik kelios studijos, nagrinėjusios NSG metilinimą nesergančių plaučių vėžiu asmenų plaučių audinyje. Šių studijų rezultatai prieštaringi. Jei vieni autoriai nerado metilinto geno MGMT ar nustatė metilintą geną APC tik 20 proc. šių asmenų plaučių audinyje [38, 39], tai kiti autoriai nurodo, kad metilinti genai, dalyvaujantys plaučių vėžio genezėje, gali būti nustatomi net iki 100 proc. nesergančių plaučių vėžiu asmenų operacijos ar autopsijos metu rezekuotame plaučių audinyje [373, 393].
Mokslininkai daro prielaidas, kad tai gali lemti tabako dūmuose esančių kancerogenų žalojantis poveikis bronchų epiteliui ir plaučių audiniui [38, 373, 404]. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad tabako dūmuose esančio kancerogeno NNK sukeltuose pelių ir žiurkių ikinavikiniuose adenokarcinomos pakitimuose dažnai nustatomi metilinti genai p16INK4a ir DAPK [27, 286]. Metilinto geno p16INK4a dažnis didėja progresuojant plokščialąstelinio plaučių vėžio ikinavikiniams pakitimams (17 proc. esant hiperplazijai, 24 proc. – metaplazijai ir 50 proc. – carcinomai in situ) [27]. Tačiau tiriant žmogaus plaučių nenavikinį audinį ryšys tarp NSG metilinimo ir rūkymo ne visada nustatomas [38].
NSG metilinimo nenavikiniuose mėginiuose biologinė ir klinikinė reikšmė iki šiol nėra visiškai aiški. Tačiau sukaupti duomenys rodo, kad tai svarbus procesas, nes metilinti NSG
dažnai nustatomi ne tik nesergančių plaučių vėžiu asmenų plaučių audinyje, tačiau ir nenavikiniame skrandžio, žarnų bei krūtų audinyje [148, 161, 171]. Įdomu pažymėti, kad genų APC, RARβ ir RASSF1A metilinimas nesergančių vėžiu moterų nenavikiniame krūtų audinyje siejasi su tokių moterų padidėjusia rizika susirgti krūtų vėžiu. Autoriai nurodo, kad tai gali būti susiję su “lauko kancerizacijos” fenomenu [209]. Prie panašios išvados, kad epigenetinės pažaidos gali atspindėti ir plaučių vėžio atsiradimo riziką, priėjo ir W. A. Palmisano su bendraautoriais. Jis nurodo, kad epigenetinių pažaidų dažnis skrepliuose yra artimas plaučių vėžio atsiradimo populiacijoje dažniui, juo labiau kad metilinti genai gali būti nustatyti net 3 metais anksčiau nei kliniškai diagnozuotas plaučių vėžys [263].
NSG metilinimas kraujo serume. Ligonių, sergančių įvairiais piktybiniais navikais, taip pat ir plaučių vėžiu, kraujyje cirkuliuoja ne tik vėžinės ląstelės [5], bet ir laisva ekstraląstelinė DNR [345]. Ekstraląstelinė DNR kraujo serume pirmą kartą nustatyta P. Mandel ir P. Metais (1948 m.), keliais metais anksčiau nei J. Watson su F. A. Crick (1953 m.) paskelbė savo garsųjį darbą apie dvigrandę DNR struktūrą [51]. P. Mandel ir P. Metais darbas buvo užmirštas keliems dešimtmečiams, kol šeštąjį praėjusio amžiaus dešimtmetį DNR buvo nustatyta sistemine raudonąja vilklige sergančių ligonių kraujo serume [351]. Vėlesni darbai parodė, kad DNR randama kraujo serume arba plazmoje ir sergant kitomis ligomis (reumatoidiniu artritu, glomerulonefritu, pankreatitu, cholelitiaze, uždegiminėmis žarnų ligomis, opalige, hepatitu, ezofagitu) ir net sveikų asmenų kraujo serume arba plazmoje [9]. Tyrinėjimai atsinaujino, kai S. A. Leon su bendraautoriais (1972 m.) nustatė, kad vėžiu sergančiųjų kraujo serume DNR cirkuliuoja žymiai daugiau nei nesergančiųjų [208]. Vėlesni tyrimai patvirtino, kad plaučių vėžiu sergančių ligonių kraujo plazmoje DNR koncentracija net aštuonis kartus didesnė, palyginti su sveikais, tačiau rūkančiais asmenimis [332].
Tuo metu buvo neįmanoma nustatyti kraujo serume ar plazmoje laisvai cirkuliuojančios ekstraląstelinės DNR kilmės dėl tyrimų ribotų galimybių [51]. 1989 metais pasirodė pirmieji pranešimai, kad kraujyje cirkuliuojanti ekstraląstelinė DNR turi kai kurių pirminio naviko savybių [338]. Tačiau tik 1994–1996 metais, radus specifines onkogenų mutacijas bei mikrosatelitų pažaidas įvairiais piktybiniais navikais (taip pat ir plaučių) sergančių ligonių kraujo serume ar plazmoje, galutinai buvo įrodyta, kad bent jau dauguma ekstraląstelinės DNR, cirkuliuojančios kraujo serume ar plazmoje, yra atsilaisvinusi iš pirminio naviko apoptozinių ar nekrozinių ląstelių [53, 327]. F. Andriani su bendraautoriais (2004 m.), ištyrę daug genetinių žymenų plaučių vėžiu sergančių ligonių kraujo plazmoje, patvirtino, kad kraujo plazmos DNR pažaidos yra būdingos plaučių vėžiui [8]. Kiti autoriai nurodo, kad
kraujo plazmos DNR pažaidos dažniau randamos plaučių vėžiu sergantiems ligoniams nei sergantiems kitomis plaučių ligomis [177].
Naujausi tyrimai parodė, kad DNR koncentracija ir genetinės bei epigenetinės DNR pažaidos plaučių ir kitais piktybiniais navikais sergančių ligonių kraujo serume ar plazmoje siejasi su ligos progresavimu, prognoze ir atsaku į taikomą gydymą [97, 113, 188, 333].
M. Esteller su bendraautoriais (1999 m.) pirmą kartą nustatė metilintus NSG NSPV sergančių ligonių kraujo serume [91]. Nuo to laiko mokslinėje literatūroje paskelbti tik keleto tyrėjų, nagrinėjusių pavienių genų metilinimą NSPV sergančių ligonių kraujo serume ar plazmoje, rezultatai [7, 23, 106, 289, 378]. NSG metilinimas kraujo serume yra dažnas reiškinys sergant NSPV. Remiantis įvairiais autoriais, skirtingi NSG nustatyti nuo 13,6 iki 73,3 proc. NSPV sergančių ligonių kraujo serume ar plazmoje [7, 23, 91, 289, 378], nors pastarųjų metų studijos rado mažesnį (nuo 6,6 iki 18,7 proc.) metilintų NSG dažnį kraujo serume [106].
Plaučių vėžiui diagnozuoti svarbus ne tik bendras metilintų genų dažnis ligonių kraujo serume, bet ir pažaidų atitikimas pirminio naviko pažaidoms. Šią temą nagrinėjo tik keletas tyrėjų. Gauti rezultatai prieštaringi. Pirmosios studijos kraujo serume ar plazmoje rado nuo 55 proc. iki 87,7 proc. metilintų genų, kai metilinti genai buvo pirminiame navike ir nerado metilintų genų kraujo serume ar plazmoje, jei pastarieji buvo nemetilinti pirminiame navike [7, 23, 91]. Kiti autoriai rado statistiškai reikšmingą ryšį tarp metilintų genų serume ir pirminiame navike [289]. Tačiau naujausios studijos pateikia duomenis, kad kai kurių metilintų NSG dažnis kraujo serume siekia tik 10–20 proc., kai atitinkami genai metilinti pirminiame navike. Be to, buvo rasti metilinti genai kraujo serume, nors pirminiame plaučių navike šie genai buvo nemetilinti [106].
Atliekant pradinius tyrimus plaučių vėžiu nesergančių asmenų, bet įtrauktų į rizikos grupes, kraujo serume ar plazmoje, panašiai kaip ir nenavikiniame plaučių audinyje, metilintų genų nenustatyta [23, 378]. Naujausi tyrimai parodė, kad metilinti genai gali būti randami nenavikinėmis plaučių ligomis sergančių asmenų kraujo serume taip pat dažnai, kaip ir plaučių vėžiu sergančių ligonių [106]. Kiti autoriai nurodo, kad metilinti genai DAPK, Ecad, MGMT ir p16INK4a nustatyti plaučių vėžiu sergančiųjų ir nesergančių vėžiu rūkančių asmenų kraujo limfocituose atitinkamai 4 ir 41 proc., 22 ir 41 proc., 18 ir 17 proc. bei 8 ir 5 proc. Bent vienas metilintas genas yra nustatomas 64 proc. rūkančių asmenų kraujo limfocituose [304].
Tad, kraujo serume cirkuliuojančios ekstraląstelinės DNR tyrimas, ieškant NSG epigenetinių pažaidų ir šių pažaidų reikšmės plaučių vėžio genezei, yra nauja ir perspektyvi
2.1.5. Naviką slopinančių genų metilinimo ir klinikinių charakteristikų sąsajos
Lytis. Jungtinėse Amerikos Valstijose moterų plaučių vėžys, aplenkęs krūtų vėžį, tapo dažniausia mirties priežastimi tarp onkologinių ligų. Kai kurių tyrimų duomenimis moterims nustatoma didesnė rizika susirgti plaučių vėžiu, dažniau randama adenokarcinoma. Plaučių vėžiu sergančių moterų, palyginti su vyrais, gyvenimas ilgesnis [271]. Mokslinė literatūra pateikia vis daugiau įrodymų, kad moterų plaučių vėžys biologiškai, kliniškai ir prognostiškai skiriasi nuo vyrų plaučių vėžio. Diskutuojama, kad tai gali lemti vyrų ir moterų genetiniai, molekuliniai bei hormoniniai skirtumai [271].
Prieštaringi rezultatai skelbiami dėl plaučių vėžiu sergančių vyrų ir moterų NSG metilinimo skirtumų. Jei vieni autoriai nustatė metilintų NSG dažnio skirtumų vyrų ir moterų navikiniame plaučių audinyje [52, 418], tai kiti tokių skirtumų nerado [358]. Tik trys studijos analizavo ir pateikė duomenis, kad nerado sąsajų tarp NSG metilinimo NSPV sergančių ligonių kraujo serume ir lyties [106, 289, 378]. Tyrimai, kurie nustatė metilintus NSG plaučių vėžiu sergančių ligonių nenavikiniame plaučių audinyje, nevertino genų metilinimo ir lyties ryšio [38, 152, 418].
Įdomius duomenis paskelbė C. Fuke ir bendraautoriai (2004 m.). Jis nustatė reikšmingai didesnį metilcitozino kiekį vyrų, o ne moterų periferinio kraujo leukocituose [107]. Tai buvo nelaukti rezultatai, žinant, kad moterų vienoje iš X chromosomų esantys genai yra metilinimo inaktyvinti. Dėl to moterų leukocituose turėtų būti daugiau metilcitozino.
Tad, lyties skirtumų sąlygojamų veiksnių įtaka ir biologinė reikšmė NSG metilinimo procesui šiuo metu dar nėra visiškai aiški.
Amžius. Atlikus pirmuosius tyrimus manyta, kad NSG promotorių metilinimas yra tik vėžiui būdingas procesas [15]. Tačiau pastaruoju metu radus metilintus NSG nenavikiniame audinyje, mokslo literatūroje vis dažniau diskutuojama apie su amžiumi susijusį bent dalies NSG audiniui ir genui būdingą metilinimą [297]. C. Fuke su bendraautoriais nustatė, kad su amžiumi periferinio kraujo leukocituose bendras metilcitozino kiekis mažėja [107]. Tačiau kiti autoriai nurodo, kad nuo amžiaus priklausomi metilinimo pokyčiai CpG salose nėra dažnas reiškinys [367]. Nuo amžiaus priklausomas CpG salų metilinimas buvo rastas tiriant virškinamąjį traktą (skrandį, žarnyną), ir tik genuose, kurie siejosi su nuo amžiaus priklausomu A tipo (angl. age related) metilinimu, ir, priešingai, nerasta genuose, besisiejančiuose su nuo vėžio priklausomu C tipo (angl. cancer related) metilinimu [161, 171, 362].
