KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS Alina Smalinskienė KADMIO IR CINKO JONŲ BEI PURPURINĖS EŽIUOLĖS ECHINACEA PURPUREA (L.) MOENCH POVEIKIO PELĖMS ĮVERTINIMAS

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Alina Smalinskienė

KADMIO IR CINKO JONŲ BEI PURPURINĖS EŽIUOLĖS

ECHINACEA PURPUREA (L.) MOENCH POVEIKIO PELĖMS

ĮVERTINIMAS

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, biologija (01B)

Disertacija rengta 2001 – 2005 metais Kauno medicinos universitete.

Mokslinis vadovas:

Doc. Dr. Olegas Abdrachmanovas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Konsultantė:

Prof. Habil. Dr. Vaiva Lesauskaitė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07B)

TURINYS

1. SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS ... 5

2. ĮVADAS ... 6

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

4.1. Kadmio kaupimas gamtoje ir jo poveikis organizmui ... 11

4.2. Kadmio ir cinko tarpusavio sąveika organizme ... 14

4.2.1. Kadmio ir cinko tarpusavio sąveikos toksikokinetika ... 16

4.2.2. Kadmio ir cinko tarpusavio sąveika pasiskirstymo ir kaupimosi metu ... 17

4.3. Purpurinės ežiuolės ir jos sudedamųjų dalių biologinės ir farmakologinės savybės ... 18

4.3.1. Purpurinės ežiuolės poveikis organizmui ... 20

4.4. Ląstelių apoptozė ... 21

4.4.1. Molekuliniai apoptozės mechanizmai ... 21

4.4.2.Pagrindiniai žinduolių ląstelių apoptozę sukeliantys mechanizmai.. ……….. 23

4.4.3. Ląstelės energijos ištekliai ir apoptozė ... 26

5. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODIKOS ... 28

5.1. Tyrimo objektas ... 28

5.2. Metalų druskų tirpalų ir purpurinės ežiuolės ištraukos skyrimas pelėms ... 28

5.2.1. Metalų druskų tirpalų ir purpurinės ežiuolės ištraukos tirpalų švirkštimas ... 28

5.2.2. Kadmio druskos ir purpurinės ežiuolės ištraukos tirpalų girdymas ... 29

5.3. Tyrimų metodai ... 29

5.3.1. Metalų koncentracijos nustatymas ... 29

5.3.2. Mitozinių ląstelių nustatymas ... 30

5.3.3. Apoptozinių ląstelių nustatymas ... 31

5.3.4. DNR išskyrimas ir elektroforezė ... 33

5.3.5. Aspartato aminotransferazės ir alanino aminotransferazės nustymas ... 34

5.3.6. Purpurinės ežiuolės žolės ištraukos paruošimas ... 34

5.3.6. Statistinė analizė ... 35

6. REZULTATAI ... 35

6.1. Ūmi pelių intoksikacija kadmiu ir apsauginis cinko poveikis po vienkartinių injekcijų į pelių pilvo ertmę ... 36

6.1.1. Vienkartinio 0,5 LD50 kadmio jonų (Cd2+ 1,6 mg/kg kūno masės) poveikio pelėms per parą įvertinimas: koncentracijos kitimas organuose ir kraujyje bei kepenų ląstelių mitozės

ir apoptozės indeksas ... 36

6.1.2. Cinko jonų apsauginio poveikio pelėms paros laikotarpiu, esant ūmiai intraperitoninei intoksikacijai kadmio jonais (0,5 LD50) įvertinimas: koncentracijos kitimas organuose ir kraujyje bei kepenų ląstelių mitozės ir apoptozės indeksas ... 39

6.2. Lėtinio kadmio ir cinko jonų bei purpurinės ežiuolės poveikio tyrimas ……….. 45

6.2.1.Kadmio koncentracija pelių kraujyje ir organuose, morfologiniai pokyčiai kepenyse bei kepenų ląstelių mitozė ir apoptozė po daugkartinio intraperitoninio kadmio chlorido sušvirkštimo (0,16 mg Cd2+/1kg kūno masės) ……… 45

6.2.2.Kadmio ir cinko jonų tarpusavio sąveikos įvertinimas praėjus 6 savaitėms po daugkartinio intraperitoninio kadmio chlorido ir cinko sulfato sušvirkštimo ……… 48

6.2.3.Ilgalaikis intraperitoninis kadmio jonų ir purpurinės ežiuolės poveikis ... 54

6.3. Lėtinis kadmio ir purpurinės ežiuolės poveikis per os ………... 57

6.3.1. Lėtinis kadmio jonų poveikis pelėms, jas girdant 25 ir 250 CdCl2 mg/l tirpalais ……. 57

6.3.2. Lėtinis purpurinės ežiuolės poveikis pelėms, per os paveiktoms kadmiu ………. 60

7. REZULTATŲ APTARIMAS ... 65

8. IŠVADOS ... 71

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 72

1. SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS

AIF – apoptozę aktyvinantis faktorius ALT – alanino aminotransferazė

Apaf – apoptozės proteazes aktyvinantis faktorius Asp – aspartatas (aminorūgštis)

AST – aspartato aminotransferazė ATF – adenozintrifosfatas

Bp – bazių pora

BSA – galvijų serumo albuminas EDTA – etilendiamintetraacetato rūgštis

FADD – su Fas–asocijuotas mirties domeno pritaikymo baltymas FB – fosfatinis buferis

IARC – Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra α–IFN – alfa interferonas

IL–1 – interleukinas β–INF – beta interferonas

i.p. – intraperitonealinis (į pilvo ertmę) įvedimo būdas

LD50 – minimali dozė, nuo kurios žūva 50% eksperimentinių gyvūnų Mt – metalotioneinas

NBT/BCIP – chromogeninis substratas NNF-α – alfa navikų nekrozės faktorius PE – purpurinė ežiuolė

2. ĮVADAS

Darbo aktualumas

Pastaraisiais dešimtmečiais, padidėjus aplinkos užterštumui, ypatingo susidomėjimo sulaukia ir vis didesnę svarbą įgauna įvairių teršalų poveikio biologinėms sistemoms tyrimai. Užsienio šalyse taršos šaltinių ir jų įtakos sveikatai tyrinėjimai vykdomi labai intensyviai. Ypač didelis dėmesys skiriamas geocheminiams bei antropogeniniams veiksniams, turintiems įtakos piktybinių auglių, širdies ir kraujagyslių, kvėpavimo organų ir skrandžio ligų išsivystymui (Smith ir kt., 1999). Akivaizdžiai įrodyta, kad aplinkos užterštumas sunkiaisiais metalais (ypač kadmiu, švinu, gyvsidabriu) neigiamai veikia gyventojų sveikatą. Kadmis (Cd) – aplinkoje paplitęs, labai toksiškas gyviesiems organizmams, taigi ir žmogui, elementas. Todėl daugelyje užsienio medicininių ir biologinių mokslo centrų didelis dėmesys skiriamas šio mikroelemento poveikio žmogaus ir gyvūnų organų bei ląstelių gyvybinėms funkcijoms tyrinėti. Įrodytas Cd toksinis poveikis žmogui ir gyvūnams: jis sutrikdo ląstelių biocheminių sistemų veiklą. Daugelyje darbų įvairiausi tiek viso organizmo, tiek ir vienos ląstelės funkcijų sutrikimai siejami su padidėjusia šio metalo koncentracija. Žinoma, kad tirpios Cd druskos kaupiasi organizme ir toksiškai veikia kepenis, smegenis, inkstus, plaučius, širdį, sėklides, centrinę nervų sistemą (Grosicki, 1999). Ilgalaikis buvimas aplinkoje, kurioje Cd kiekis yra padidėjęs, žmonėms gali sukelti plaučių jungiamojo audinio irimą (Chambers ir kt., 1994), žiurkėms – plaučių auglių atsiradimą (McKenna ir kt., 1998). Šio metalo druskos in vitro gali sukelti DNR skilimą, kuris yra vienas pagrindinių apoptozės požymių (Ishido ir kt., 1998). Įrodyta, kad Cd lėtina upinių vėžių embriogenezę (Reddy ir kt., 1997). Apsinuodijimas Cd sukelia inkstų funkcijos sutrikimus tiek žmonėms, tiek ir eksperimentiniams gyvūnams (Goering ir kt., 1993).

Apie Cd poveikį įvairioms gyvų organizmų biologinėms sistemoms žinoma labai daug, tačiau šio metalo toksiškumo mechanizmai mažai tyrinėti.

Pastaraisiais metais ypač susidomėta ir plačiai tiriama Cd bei būtinų organizmui elementų (pvz., cinko, vario, geležies, seleno, kalcio) kompleksinis poveikis (Abdula ir Chmielnicka, 1990; Goyer, 1995a, 1997; Hayter, 1980; Ninomiya ir kt., 1993; Grosicki ir Domanska, 1997; Brzoska ir Moniuszko-Jakoniuk, 1998; Peraza ir kt., 1998; Tandon ir kt., 1994).

Cinko (Zn) svarba organizmui seniai žinoma, tačiau tik per pastaruosius tris dešimtmečius plačiai ištirtos ir nustatytos organizmo funkcijos bei metabolizmo sutrikimai,

esant Zn trūkumui. Šis mikroelementas svarbus ląstelės augimui, vystymuisi ir funkcionavimui (Bray ir Bettger, 1990; Nishi, 1996; Okano, 1996). Esminė jo funkcija -fermentų, dalyvaujančių replikacijos, transkripcijos ir transliacijos procesuose, aktyvinimas. Zn yra daugiau nei 300 metalofermentų kofaktorius ir svarbus fermentų, dalyvaujančių DNR ir RNR biosintezėje ir reparacijoje, aktyvinimui. Veikdamas daugelio fermentų aktyvumą, Zn reguliuoja bendrą organizmo metabolizmą (Sunderman ir Barber, 1988; Bray ir Bettger, 1990; Lohmann ir Beyerrsmann, 1993; Troung-Tran ir kt., 2000; Sprietsma, 1999).

Cd kaupimasis priklauso nuo organizme esančių būtinųjų mikroelementų, taip pat ir Zn kiekio. Atlikta nemažai mokslinių tyrimų, įrodančių Cd ir Zn bendrą savybę – gebėjimą jungtis prie metalotioneinų (Mt). Cd ir Zn indukuoja Mt sintezę įvairiuose audiniuose, ypač žarnyne, kepenyse ir inkstuose (Sharma ir kt., 1991; Liu ir kt., 1992, 1994; Prasad ir Nath, 1995; Brzoska ir kt., 2000). Cd maždaug aštuonis kartus labiau nei Zn padidina Mt koncentraciją kepenyse (Eaton ir kt., 1980). Nustatyta, kad Mt reguliuoja būtinųjų ir žalingų mikroelementų absorbciją, metabolizmą, homeostazę ir kaupimąsi (WHO, 1992; Chang ir Huang, 1996; Kelly ir kt., 1996, Peraza ir kt., 1998). Įvairių tyrėjų duomenimis, susidarant metalo-Mt junginiui, sumažinamas sunkiųjų metalų, pvz., Cd ir Hg, toksinis poveikis (Goering ir Klaassen, 1984a; Squibb ir Fowler, 1984; Elinder ir kt., 1987; Liu ir kt., 1992,1994; Klaassen ir kt., 1999).

Atlikus įvairių regionų gyventojų, kurių maiste yra padidėjęs Cd kiekis, tyrimus įrodyta, jog Cd turi įtakos Zn absorbcijai (WHO, 1992; Schrey ir kt., 2000). Cd absorbcija gali padidėti žmonėms, kurių organizme trūksta Zn. Taigi papildomas Zn vartojimas sumažintų žalingą Cd poveikį.

Esant intoksikacijai sunkiaisiais metalais (Pb, Cd, Hg), augalinės kilmės biologiškai veiklūs junginiai (pvz., polisacharidai, lipopolisacharidai, glikoproteinai – lektinai, polifenoliai, flavonoidai, karotinoidai) atlieka didžiulį apsauginį vaidmenį. Šie junginiai pasižymi antioksidacinėmis, antimutageninėmis, antikancerogeninėmis savybėmis. Dauguma jų aktyvina imunitetą – organizmo sugebėjimą apsisaugoti nuo genetiškai svetimų veiksnių. Vienas dažniausiai vartojamų augalų imunostimuliatorių – Purpurinė ežiuolė (Echinacea purpurea L. Moench). Jos sudėtyje esantys polisacharidai, glikoproteinai – lektinai, cikorinė rūgštis ir jos alkilamidai yra nespecifiniai imuninės sistemos stimuliatoriai. Ežiuolės žolės ir šaknų ekstraktai aktyvina fagocitozę, stimuliuoja makrofagų baktericidinį ir metabolinį aktyvumą, taip pat didina bendrą blužnies masę. Vartojami per os ir injekciniai vaistų preparatai, paruošti iš ežiuolės. Žinoma, kad purpurinė ežiuolė

vartojama norint sumažinti radiacinį poveikį, kuris organizme indukuoja laisvųjų radikalų susidarymą, trikdantį fermentinės antioksidacinės sistemos veiklą, keičiantį vitaminų A ir E metabolitų kiekį kraujo plazmoje, blužnyje ir čiobrialiaukėje (Gomes ir kt., 2004). Ežiuolė, aktyvindama organizmo imuninės sistemos vieną ar kitą grandį, skatina imunoglobulinų bei interferonų išsiskyrimą (Abdullah, 2000). Šios baltyminės kilmės medžiagos, sudarydamos kompleksus su sunkiaisiais metalais, natūraliai juos inaktyvuoja, tuo pačiu sumažindamos organizmo intoksikacijos pavojų.

Iki šiol nėra visapusiškai ištirti Cd žalingo poveikio organizmui mechanizmai. Tai ypač aktuali tyrinėjimų sritis, kuriai ir ateityje bus skiriama daug dėmesio. Nors ir vykdomi aplinkos ekologiniai monitoringai, tačiau Cd ir Zn sąveikos tyrimų Lietuvoje atlikta labai mažai, o Purpurinės ežiuolės poveikis, esant Cd toksiškumui, nėra tirtas.

Darbo naujumas

Šis darbas pagilina žinias apie ūmaus ir lėtinio Cd poveikio organizmui mechanizmus ir pasekmes. Atlikti kompleksiniai tyrimai parodo ne tik kadmio kaupimosi kraujyje ir organuose dinamiką, bet ir atskleidžia vieno iš labiausiai Cd pažeidžiamų organų, t.y. kepenų, morfologinius pokyčius bei jo įtaką kepenų ląstelių mitozės ir apoptozės procesų aktyvumui. Atlikti Cd ir Zn kompleksinio poveikio tyrimai rodo, kad Zn jonai efektyviai keičia Cd jonų kaupimąsi kraujyje ir organuose bei mažina žalingą šio toksinio mikroelemento poveikį kepenų regeneracijai ir programuotos ląstelių žūties aktyvumui. Dėl Cd poveikio padidėjęs kepenų ląstelių mitozinis aktyvumas sąlygoja ląstelių proliferaciją ir malignizaciją. Šių procesų slopinimas padėtų sumažinti dėl Cd poveikio išsivystančius piktybinius procesus. Šiame darbe įrodyta, kad svarbu nustatyti ne tik absorbuotą toksinių metalų kiekį, bet ir šių elementų metabolizmą organizme bei dėl jų poveikio atsirandančius morfologinius pakitimus, mitozinį bei apoptozinį ląstelių aktyvumą kepenyse. Ištirtas purpurinės ežiuolės - augalo imunomoduliatoriaus – poveikis organizmui, paveiktam sunkiaisiais metalais.

Praktinė darbo nauda. Žmonėms, esantiems padidinto Cd poveikio rizikos grupėse,

Zn ir purpurinės ežiuolės preparatų vartojimas sumažintų Cd toksinį poveikį. Tai neabejotinai svarbu vykdant įvairių lėtinių ligų profilaktiką.

Mūsų darbe atskleisti nauji aplinkos veiksnių įtakos žmogaus sveikatai dėsningumai labai svarbūs tolimesniems bei išsamesniems sunkiųjų metalų jonų žalingo poveikio organizmui molekulinių mechanizmų tyrimams. Gauti tyrimų rezultatai apie toksinį kadmio jonų ir apsauginį cinko jonų bei purpurinės ežiuolės preparatų poveikį organizmui yra

sudėtinė Kauno medicinos universiteto Biomedicininių mokslų tyrimų instituto mokslo darbų programos “Gyvensenos ir aplinkos veiksnių įtakos sveikatos tyrimai” dalis.

Sukaupti duomenys gali būti panaudoti studentų mokymui. Darbo rezultatai buvo skelbti moksliniuose straipsniuose, pristatyti Lietuvos ir tarptautinėse konferencijose.

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI: Darbo tikslas:

Įvertinti kadmio ir cinko jonų bei purpurinės ežiuolės (Echinacea purpurea (L.) Moench) poveikį organizmui, naudojant eksperimentinį pelių modelį.

Uždaviniai:

1. Įvertinti kadmio pasiskirstymą laboratorinių pelių organuose po vienkartinio ir lėtinio (intraperitoninio ir per os) poveikio.

2. Nustatyti galimus kepenų morfologinius pokyčius bei mitozės ir apoptozės procesų aktyvumą po įvairios trukmės ir dozės kadmio jonų poveikio.

3. Nustatyti, kaip cinko jonai veikia kadmio kaupimąsi, kepenų ląstelių mitozinį ir apoptozinį aktyvumą pelių, paveiktų kadmiu, organizme.

4. Įvertinti purpurinės ežiuolės įtaką kadmio pasiskirstymui organuose bei kepenų ląstelių mitozės ir apoptozės procesams po lėtinio (intraperitoninio ir per os) kadmio jonų poveikio.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4. 1. Kadmio paplitimas gamtoje ir jo poveikis organizmui

Aplinkoje nėra nišos, kurioje nebūtų metalų – ilgiausiai išliekančių elementų natūraliuose ar žmogaus sukurtuose šaltiniuose (Goyer, 1995b). Cd plačiai gamtoje paplitęs elementas, naudojamas įvairiose pramonės srityse (ATSDR, 1989). Dėl antropogeninių veiksnių Cd 3 kartus dažniau patenka į aplinką nei iš natūralių šaltinių. Europoje didžiausias kadmio kiekis į aplinką patenka iš plieno lydymo gamyklų (34 tonos per metus) ir deginant įvairias atliekas (31 tona per metus) (Авцын ir kt., 1998). Atokiau nuo pramonės įmonių, neužterštose vietose, kadmio koncentracija ore yra 0,1-1 ng/m3_, miestuose - 1-50 ng/m3, o pramoninėse zonose - 1-100 ng/m3 (WHO; 1987). Kvėpavimo takuose rezorbuojasi apie 25-50% į juos patekusio metalo.

Kadmio yra maisto sudėtyje, vandenyje ir ypač daug tabako lapuose. Su maistu į žmogaus organizmą per parą vidutiniškai patenka 10-25 µg kadmio. Papildomai kadmio gauna rūkoriai. Nustatyta, kad surūkantys 20 cigarečių per parą jo gauna nuo 2 iki 4 µg (Friberg ir kt., 1986). Europoje rūkomose cigaretėse yra 1-2 µg Cd/g tabako (WHO, 1987; Elinder ir kt., 1994). Į organizmą šis elementas patenka per kvėpavimo ar virškinimo sistemas. Nepriklausomai nuo kadmio cheminių junginių formų, patenkančių į organizmą, jo poveikis yra panašus. Kadmio junginių toksiškumas priklauso nuo jų tipo, tirpumo, taip pat nuo medžiagoje esančių kitų biologiškai aktyvių elementų kiekio (Nomiyama, 1986). JAV Aplinkos apsaugos agentūros Toksinių medžiagų ir ligų registre (The Agency for Toxic Substances and Disease Registry and the U.S. Environmental Protection Agency in 1997) „20 svarbiausių pagrindinių pavojingų medžiagų sąrašas“ Cd užima septintąją vietą” (Fay ir Mumtaz, 1996).

Per pastaruosius 35 metus labai padidėjo dėmesys Cd - toksiniam cheminiam elementui ir eilės cheminių elementų antimetabolitui. Apie Cd poveikį įvairioms organizmų biologinėms sistemoms žinoma labai daug, tačiau jo toksiškumo mechanizmai kol kas nėra iki galo išaiškinti. Daugelyje mokslinių darbų nagrinėjami tiek viso organizmo, tiek vienos ląstelės funkcijų sutrikimai, esant padidėjusiai šio metalo koncentracijai (WHO, 1992; Jarup ir kt., 1998; Staessen ir kt., 1999; Zalups ir Koropatnick, 2000). Susidomėjimas kadmiu padidėjo atradus mažos molekulinės masės baltymą metalotioneiną, kuris koncentruoja padidintą šio metalo kiekį organizme (Webb ir Cain, 1982).

Cd apykaitos pagrindiniai ypatumai:

2. Labai lėtas išskyrimas iš organizmo ( pusperiodis 15 - 30 metų); 3. Pagrinde kaupiasi kepenyse ir inkstuose;

4. Intensyvi sąveika su kitais dvivalenčiais metalais tiek patekimo į organizmą, tiek ir procesų, vykstančių audiniuose, metu.

Cd pasiskirsto visame organizme, tačiau apie pusę patekusio į organizmą šio elemento kiekio randama kepenyse ir inkstuose (Grosicki, 1999; Cikrt ir kt., 1990; WHO, 1992; Bem ir kt., 1993; Orlowski ir kt., 1996; Jarup ir kt., 1998). Pavojingiausia Cd savybė ta, kad jis kaupiasi visą gyvenimą. Kadmio biologinis išsiskyrimo pusperiodis iš kepenų - 10 metų, o iš inkstų dar šiek tiek ilgesnis. Didžioji dalis šio elemento išsiskiria su šlapimu, kuriame rasta jo koncentracija stipriai priklauso nuo organizme esančio kadmio kiekio. Daugelyje tyrimų įrodyta, kad kadmio ekskrecija su šlapimu normoje sudaro maždaug 1 -2 µg per dieną (Hallenbeck, 1984). Žmonėms, esantiems padidintokadmio poveikio zonoje, ekskrecijos lygis inkstuose padidėja ir gali siekti kelis šimtus mikrogramų per dieną (10 - 15 µg/g kreatinino) (Friberg ir kt., 1974).

Dabartinėje aplinkoje gyvenantis žmogus negali išvengti žalingų aplinkos veiksnių, kurių poveikyje gali sutrikti ląstelių funkcijos ir ilgainiui išsivystyti įvairių organų veiklos nepakankamumas. Jau daugiau kaip prieš 100 metų buvo žinoma, kad Cd organizme gali sukelti sudėtingus pakitimus, tačiau tik 1938 metais pirmą kartą paskelbtas straipsnis apie jo toksiškumą. 1952 metais buvo aptiktos didelės Cd koncentracijos žmogaus ir gyvūnų inkstuose. 1960 metais Japonijoje, Tojamos prefektūroje, kurioje aplinka buvo užteršta kadmiu, nustatytas endeminis itai-itai susirgimas (Авцын ir kt., 1998). Tai ypač sunkus lėtinio apsinuodijimo kadmiu atvejis. Sergant šia liga deformuojasi skeletas, skauda kojų raumenis, juosmens sritį, o eisena tampa panaši į anties. Be to, dažniau lūžta kaulai, sutrinka inkstų ir skydliaukės funkcija, atsiranda pakitimai virškinamajame trakte, išsivysto hipochrominė anemija, kraujyje sumažėja geležies, kalcio ir neorganinio fosforo, o šarminės fosfatazės kiekis padidėja (Hallenbeck, 1984).

Įvairūs tyrimai rodo, kad Cd yra kancerogeniškas tiek žmonėms, tiek ir gyvūnams (Glaser ir kt., 1980, Waalkes ir kt., 1989, 1992; Waalkes ir Rehm, 1992; WHO, 1992; Beyersmann, 1994).. Cd sukelia plaučių, inkstų, prostatos ir sėklidžių vėžį pelėms ir žiurkėms (Waalkes ir kt., 1992). Pavyzdžiui, po Cd injekcijų į pelių odą išsivystė piktybinė sarkoma (Abshire ir kt., 1996a). Neseniai atliktoje epidemiologinėje studijoje buvo ištirti 78 asmenys, dirbantys aplinkoje, užterštoje kadmiu, švinu ir kobaltu. Nustatyta koreliacija tarp Cd koncentracijos ore ir Cd kraujyje, esant DNR pažeidoms (pavieniai DNR vijos trūkiai kraujo mononuklearinėse ląstelėse) (Hengstler ir kt., 2003). Remdamasi įvairių tyrimų

duomenimis, Tarptautinė vėžio tyrimo agentūra (the International Agency for Research on Cancer (IARC) Cd priskiria I kancerogenų kategorijai (IARC, 1993).

Eksperimentiniai tyrimai su gyvūnais parodė, kad mažas kadmio kiekis geriamajame vandenyje padidino jų arterinį kraujo spaudimą (Nordberg, 1993). Dėl Cd poveikio keičiasi riebalų sudėtis ir padidėja lipidų peroksidacija (Gill, 1989). Didelė Cd koncentracija ore (> 1 mg/m3 ) gali sukelti plaučių edemą bei ūmų cheminio poveikio pneumonitą - tai gali būti mirties priežastis (WHO, 1987; Commission of the European Communities, 1978; Friberg L, 1974; Seidal ir kt., 1993; Yates ir Goldman, 1990). Ilgametis (daugiau nei 20 metų) darbas aplinkoje, kurioje šio metalo koncentracija siekia 20 ng/m3, gali būti lėtinių obstrukcinių plaučių ligų priežastimi (WHO, 1987; Commission of the European Communities, 1978).

Cd gali aktyvuoti onkogenus ar genus, susietus su ląstelių proliferacija, pvz., myc, c-jun ar c-fos tiek in vivo, tiek in vitro (Abshire ir kt., 1996b; Zheng ir kt., 1996; Joseph ir kt., 2002; Hechtenberg ir kt., 1996; Spruill ir kt., 2002). Ši aktyvacija gali žymiai sustiprinti ląstelių proliferaciją populiacijoje ir padidinti ląstelių su DNR pažaidomis kiekį. Taigi, spartėja tokių chemiškai pažeistų ląstelių kolonijų išplitimas. Zn sugebėjimas užblokuoti Cd sukeltą c-myc, c-jun genų stiprų pasireškimą (Abshire ir kt., 1996b) gali būti siejamas su jo sugebėjimu blokuoti Cd indukuotą auglio formavimąsi kai kuriuose audiniuose (Waalkes, 2000; Waalkes ir Misra, 1996). Nustatyta, jog transliacijos elongacijos faktoriai I ir III, kurie ląstelėse yra pagrindiniai transliacijos mechanizmo komponentai, veikia kaip nuo kadmio priklausantys onkogenai, kurie yra ypatingai išreikšti Cd transformuotose BALC/c-3T3 ląstelėse (Joseph ir kt., 2002). Cd taip pat gali sukelti signalinių takų perreguliavimą, todėl padidėja mitogenezė, pvz., su AP-1 ir MAP-kinazėmis (Huang ir kt., 2001). Nustatyta, jog dėl Cd poveikio slopinima pažeistos DNR reparacija (Hart ir kt., 1998; Hartwing, 2002), t.y. padidėja ląstelių su pažeista DNR populiacija, praleidžiamas ląstelių dalijomosi ciklas. Hart ir kt.(1998) tyrė ilgą laiką Cd veiktas plaučių alveolių ląsteles, kuriose matėsi sumažėjęs DNR atstatymas. Taigi Cd gali sustiprinti ląstelių proliferaciją net keliais įvairiais mechnizmais. Tai gali padėti nustatyti genetines klaidas, kurios dėl Cd poveikio tampa nebeištaisomos. Sustiprėjus proliferacijai nevyksta apoptozė, todėl kaupiasi genetinės klaidos.

4. 2. Kadmio ir cinko tarpusavio sąveika organizme

Pastaraisiais metais labai domimasi ir plačiai tiriamas toksiškų bei būtinųjų metalų kompleksinis poveikis organizmui (Abdula ir Chmielnicka, 1990; Goyer, 1995b; 1997). Tiriama sąveika tarp būtinų (Zn, Cu, Fe, Se, Ca) ir toksiškų organizmui elementų, kuriems priskiriamas ir Cd (Hayter, 1980; Ninomiya ir kt., 1993; Grosicki ir Domanska, 1997; Brzoska ir Moniuszko-Jakoniuk, 1998; Peraza ir kt., 1998; Tandon ir kt., 1994).

Zn svarba organizmui žinoma jau seniai, tačiau tik per pastaruosius 30 metų plačiai ištirtos ir nustatytos organizmo funkcijos bei metabolizmo sutrikimai, esant Zn deficitui. Šis elementas svarbus ląstelės augimui, vystymuisi ir funkcionavimui (Bray ir Bettger, 1990; Nishi, 1996; Okano, 1996). Svarbiausia šio bioelemento funkcija yra fermentų, dalyvaujančių replikacijos, transkripcijos ir transliacijos procesuose, aktyvinimas. Jis yra daugiau nei 300 metalofermentų kofaktorius ir svarbus aktyvinimui fermentų, dalyvaujančių DNR ir RNR biosintezėje ir reparacijoje. Veikdamas daugelio fermentų

aktyvumą, Zn reguliuoja bendrą organizmo metabolizmą (Sunderman ir Barber, 1988; Bray ir Bettger, 1990; Lohmann ir Beyerrsmann, 1993; Troung-Tran ir kt., 2000; Sprietsma, 1999).

Pagrindinė Cd toksiškumo savybė - neigiama įtaka ląstelių fermentinėms sistemoms. Dėl šio poveikio metalofermentuose ir giminingose biologinėse struktūrose, turinčiose –SH grupes, t.y. baltymuose, fermentuose ir nukleino rūgštyse, Cd2+ pakeičia kitų metalų jonus (svarbiausi iš jų Zn2+, Cu2+, Ca2+). Dėl Cd sutrinka sąveika su būtinaisiais mikro- ir makroelementais, ypač su Ca, Zn, Cu, Fe ir Se (Waalkes ir kt., 1992; Beyersmann, 1994; Grosicki ir Domanska, 1997; Brzoska ir Moniuszko-Jakoniuk, 1998; Peraza ir kt., 1998). Ši sąveika tarp bioelementų ir Cd gali vykti absorbcijos, pasiskirstymo ir šalinimo iš organizmo etapuose ir veikti būtinųjų metalų biologines funkcijas.

Hill ir Matrone (1970) pirmieji pastebėjo, kad biologiškai svarbi sąveika gali atsirasti tarp būtinų ir toksiškų metalų su panašiomis fizinėmis ir cheminėmis savybėmis. Cd randamas Zn rūdose, kurios yra pagrindinis Cd gavybos šaltinis. Kadmis ir cinkas cheminiu požiūriu yra panašūs, nes abu priklauso ll B pereinamųjų metalų grupei. Jų atomuose visiškai užpildyti vidiniai elektronų d palygmenys ir išoriniuose palygmenyse yra po du s elektronus. Zn2+ jone dešimt 3d orbitalių yra visiškai užpildytos, o Cd2+ jone atitinkamai užpildytos 4d orbitalės. Abu elementai turi pastovų valentingumą II. Buvo išskirti vienvalenčio Cd junginiai, bet jie trumpalaikiai ir nepatvarūs (Waalkes ir kt., 1992). Dvivalentis Zn, skirtingai nuo Cd, patvarus ir nedalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose. Cd laikomas “minkštu” metalu, nes jis labiau linkęs sudaryti kovalentinius ryšius su ligandais – elektronų donorais, o Zn laikomas “vidutiniškai minkštu” metalu (Jacobson ir Turner, 1980).

Biologinėse sistemose Cd ir Zn yra prijungti prie makromolekulių, pirmiausiai prie sieros, deguonies ir azoto, ir lengvai sąveikauja su S-, O- ir N- donorais. Jie sujungti pirmiausiai su baltymais - albuminu kraujyje ir metalotioneinu bei kitais baltymais audiniuose. Nors abu metalai turi didelį afiniškumą biologinėms struktūroms (baltymams, fermentams), turinčioms –SH grupes, Cd giminingumas S- ligandams taip pat kaip ir N- donorams yra didesnis nei Zn (Jacobson ir Turner, 1980; Jones ir Cherian, 1990). Taigi Cd2+ ir Zn2+ jonai gali konkuruoti dėl vietos įvairiose ląstelėse, sudarydami jose junginius, o Cd gali pakeisti Zn daugelyje biologinių procesų (Gachot ir Poujeol, 1992; Gachot ir kt., 1994; Endo ir kt., 1996, 1997). Taip metalai, priklausomai nuo jų kiekių, gali turėti įtakos vienas kito orientacijai ir veikimui.

Atlikta nemažai mokslinių darbų, kurių tyrimų rezultatai parodo, kad tarpusavio sąveiką tarp Cd ir Zn organizme lemia didelis abiejų panašumas jungtis prie Mt ir jų gebėjimas indukuoti sintezę. Cd ir Zn gali indukuoti Mt sintezę įvairiuose audiniuose, ypač žarnyno, kepenų ir inkstų (Sharma ir kt., 1991; Liu ir kt., 1992, 1994; Prasad ir Nath, 1995; Brzoska ir kt., 2000). Cd maždaug aštuonis kartus stipriau nei Zn padidina Mt koncentraciją kepenyse (Eaton ir kt., 1980). Mt yra mažos molekulinės masės, metalus prijungiantis baltymas, kuris pirmiausiai nustatytas kaip Cd, vėliau - Zn bei Cu prijungiantis baltymas. Nustatyta, kad Mt reguliuoja būtinųjų ir žalingų mikroelementų absorbciją, metabolizmą, homeostazę ir kaupimąsi (WHO, 1992; Chang ir Huang, 1996; Kelly ir kt., 1996, Peraza ir kt., 1998). Daug autorių nurodo, kad susidarant metalo-Mt junginiui, sumažinamas sunkiųjų metalų, t.y. Cd ir Hg, toksinis poveikis (Goering ir Klaassen, 1984b; Squibb ir Fowler, 1984; Elinder ir kt., 1987; Liu ir kt., 1992 ,1994; Klaassen ir kt., 1999). Tačiau svarbiausia Mt funkcija yra laisvų metalų Zn2+ ir Cu2+ jonų išlaikymas ląstelėse. Mt svarbus homeostazės stabilizavimui ir Zn2+ (bei Cu2+ ) jonų kaupimui organizme. Mt taip pat yra svarbus bei Zn donoras nuo Zn priklausančiuose biologiniuose procesuose. Zn atsargos gali būti panaudotos esant jo deficitui, atpalaiduojant šį metalą organizme, kadangi Zn reikia įvairiems ląstelėje vykstantiems procesams (Whanger ir Ridlington, 1982; Petering ir kt., 1984; Kelly ir kt., 1996). Manoma, kad esant dideliam Zn kiekiui, Mt žarnyne suriša Zn ir taip apsaugo tolesnę jo absorbciją. Dėl labai didelio afiniškumo Mt, Cd išstumia Zn iš šio baltymo molekulių susijungimo vietų su cisteinu. Didėjanti laisvų Zn2+ jonų koncentracija gali toliau indukuoti naujų Mt molekulių sintezę (Jacobson ir Turner, 1980; Petering irkt., 1984; Elinder ir kt., 1987; Funk ir kt., 1987; Chang ir Huang, 1996). Pakeisdamas Zn, Cd trukdo Zn absorbciją, pasiskirstymą audiniuose ir pernešimą į ląsteles ar į viduląstelines struktūras bei gali slopinti šio mikroelemento aktyvumą įvairiuose lygiuose. Cd sutrikdo nuo Zn priklausančius metabolinius procesus; DNR, RNR baltymų biosintezę. (Sunderman ir Barber, 1988).

4. 2. 1. Kadmio – cinko tarpusavio sąveikos toksikokinetika

Cd absorbuojamas plonosiose žarnose pagal tokį patį mechanizmą kaip ir būtinieji elementai, t.y. Ca, Fe, Cu ir Zn, (Andersen ir kt., 1994; Fairweather-Tait, 1995; Brzoska ir Moniuszko-Jakoniuk, 1998). Cd-Zn tarpusavio sąveika absorbcijos plonąjame žarnyne metu ypač priklauso nuo abiejų metalų afiniškumo su žarnų Mt ir gebėjimu sintetinti šį baltymą (Min ir kt., 1991; Ohta ir Cherian, 1991; Andersen ir kt., 1994; Elsenhans ir kt.,

1994). Svarbu tai, kad Cd, viena vertus, trukdo absorbuoti Zn, o antra vertus - didesnis Zn kiekis turi įtakos Cd absorbcijai. Yra eksperimentinių darbų, kuriuose nustatyta, kad net mažas Cd kiekis gali inhibuoti Zn absorbciją (Coppen-Jaeger ir Wilhelm, 1989). Mažas Zn kiekis maiste yra papildomas veiksnys, didinantis Cd absorbciją ir sulaikymą (Fox ir kt., 1984; Panemangalore, 1993). Yra ir prieštaraujančių darbų, kuriuose (Ohta ir Cherian, 1995) teigia, kad Zn deficitas, atsiradęs dėl šio elemento nepakankamo kiekio maiste, neturi įtakos žiurkių žarnyne eančiam Cd kiekiui. Didesnio Zn kiekio indukuota Mt sintezė reikšminga Cd absorbcijai ir jo patekimui į organizmą (Min ir kt., 1991). Neradome darbų, kuriuose būtų Cd – Zn tarpusavio sąveika absorbcijos metu tirta žmonėms. Tačiau daugelyje darbų nustatyta, kad tiriant tam tikrų regionų gyventojus Cd kiekis patenkantis su maistu, turi įtakos Zn absorbcijai (WHO, 1992; Schrey ir kt., 2000). Taigi, žmonės, kurių organizme trūksta Zn, yra ypač pažeidžiami Cd, todėl papildomo Zn vartojimas bent iš dalies gali apsaugoti nuo Cd absorbcijos.

4. 2. 2. Kadmio ir cinko tarpusavio sąveika orientacijos, pasiskirstymo ir kaupimosi metu

Cd kaupiasi organizme priklausomai nuo jame esančio būtinųjų elementų, tarp jų ir Zn kiekio. Žmogaus organizme esančio pusė kadmio kiekio kaupiasi inkstuose ir kepenyse (Cikrt ir kt., 1990; WHO, 1992; Bem ir kt., 1993; Orlowski ir kt., 1996; Jarup ir kt., 1998). Kadangi Cd pakeičia Zn homeostazę, padidėja Zn kiekis inkstuose ir/arba kepenyse, bet sumažėja kituose audiniuose (pavyzdžiui kauluose). Didelę teigiamą koreliaciją tarp Cd ir Zn koncentracijų kepenyse ir inkstuose nustatė Oishi ir kt. (2000). Cd indukuotas Zn sulaikymas kepenyse ir/arba inkstuose priklauso nuo Cd kaupimosi ir Mt indukcijos šiuose organuose (Bonner, 1980; Sharma ir kt., 1991; Tandon ir kt., 1994; Brzoska ir kt., 2000). Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis Mt pirmiausiai prijungia Zn (Zn-Mt) arba Zn ir Cu (Zn,Cu-Mt). Pakeitimas Zn, esančio Mt junginyje Cd, ir vėlesnė šio baltymo naujų molekulių sintezė pakeičia Zn pasiskirstymą organizme. Inkstuose esantis Cd, Zn ir Cu Mt molekulių kiekio santykis priklauso nuo Cd ir Mt koncentracijos. Kai Cd kiekis inkstuose mažas, Zn yra vyraujantis metalas Mt (70-90%), tuo tarpu, esant didelei Cd koncentracijai, vyraujantis metalas, prisijungiantis prie šio baltymo, yra Cd (Elinder ir kt., 1987). Waalkes (1986) nustatė, kad žiurkėms su maistu duodant palyginti mažą papildomą Zn kiekį (7 mg Zn/kg), kartu duodant nuo 12,5 iki 200 mg Cd/kg 8 savaites, žymiai padidėja Cd kiekis kepenyse ir inkstuose. Mažas Zn kiekis gali ne tik padidinti Cd kaupimąsi įvairiuose eksperimentinių gyvūnų vidaus organuose, ypač inkstuose ir kepenyse (Fox ir kt., 1984;

Waalkes, 1986; Sato ir Nagai, 1989; Panemangalore, 1993; Ohta ir Cherian, 1995), bet ir jį paskirstyti pažeistų audinių citozolio baltymuose (Panemangalore, 1993).

Yra keletas darbų, kuriuose žmonėms tirta Cd, Zn ir Mt tarpusavio sąveika (Blanusa ir kt., 1985; Bem ir kt., 1993; Torra ir kt., 1995; Orlowski ir Piotrowski, 1998). Žmonių, neturėjusių profesinio kontakto su Cd, taip pat susiejant Cd su rūkymu, autopsijos tyrimai parodo, kad Zn koncentracija inkstų žievėje ir kepenyse didėja, didėjant Cd koncentracijai (Blanusa ir kt., 1985; Bem ir kt., 1993; Torra ir kt., 1995).

4. 3. Purpurinės ežiuolės biologinės savybės ir sudedamųjų dalių farmakologinės savybės

2 pav. Purpurinė ežiuolė (Echinacea purpurea L. Moench)

Vaistažoles žmonės vartoja labai seniai, tačiau jų biologinis poveikis nėra visiškai žinomas. Viena iš plačiai vartojamų vaistažolių - purpurinė ežiuolė – liaudies medicinoje vartojama nuo gilios senovės. Šiaurės Amerikos indėnai indėnai žinojo ir vartojo šį augalą. Juo gydė nudegimus, malšino galvos, dantų skausmus, skrandžio negalavimus, peršalus vartojo nuo kosulio, gydė juo gonorėją. Kaip priešnuodį vartojo įkandus gyvatei (Bauer,

1996; Bauer ir kt., 1988; Bauer ir Wagner, 1990; Ragažinskienė, 1999) Purpurinė ežiuolė turi daug gydomųjų savybių, bet svarbiausia – stiprina imuninę sistemą (Abdullah, 2000; Grimm ir Muller, 1999; Mоисеева ir Беликов, 1992; Зузук ir kt., 1998). Ekstraktų, ištraukų, sulčių gydomas poveikis yra didesnis nei atskirų purpurinės ežiuolės sudėtinių medžiagų (Bauer, 1996; Belogortseva ir kt., 1998a; Самородов ir kt., 1996).

Purpurinėje ežiuolėje kaupiasi ir labiausiai tiriami polisacharidai (Abidov, 1999; Bukovsky ir kt., 1995; Dorsch, 1996), kurie stimuliuoja imuninę sistemą (Abdullah, 2000; Bauer, 1996; Bauer ir kt., 1988; Bauer ir Wagner, 1990; Дубинская, 1998; Egert ir Beuscher, 1992; Gunning ir Steele, 1999; Mоисеева Г.Ф., Беликов, 1992). Augalo sudėtyje esantys fruktanai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu (Bauer, 1996; Dorsch, 1996; Самородов ir kt., 1996). Iš purpurinės ežiuolės išskirta polisacharidų frakcija - echinacinas B skatina audinių regeneraciją, pasižymi priešuždegiminiu veikimu. Tas poveikis galimas dėl hialuronidazės slopinimo, kurią sintezuoja mikroorganizmai (Bauer ir kt., 1988; Mоисеева Г.Ф., Беликов, 1992; Садова ir kt, 1998). Purpurinės ežiuolės sudėtyje esantys polisacharidai stimuliuoja atskiras imuninio atsako grandis. (Абрамычева ir kt., 1998; Bauer, 1996; Bauer ir Wagner, 1990; Henneicke–von Zepelin ir kt., 1999; Luettig ir kt., 1989; Mоисеева Г.Ф., Беликов, 1992). Todėl šį augalą galima laikyti kompleksiniu imunostimuliatoriumi.

Augalo sudėtyje nustatyti fenoliniai junginiai pasižymi įvairiu farmakologiniu veikimu. Jiems būdingas priešuždegiminis, priešalerginis, priešvėžinis, spazmolitinis ir antioksidacinis poveikis (Bauer, 1996; Bauer ir kt., 1988; Bauer ir Wagner, 1990; Самородов ir kt., 1996).

Purpurinės ežiuolės sudėtyje randama rauginių medžiagų (Самородов ir kt., 1996). Augale ištirti kavos rūgšties junginiai su angliavandeniais, chino ir vyno rūgštimis (Belogortseva ir kt., 1998b; Burger ir kt., 1997, Facino ir kt., 1995; Lucinda, 1998).

Ežiuolės šaknyse buvo rasti baltymai, turintys subalansuotą amino rūgščių kiekį. Identifikuoti glikoproteinai – lektinai, in vitro nustatytas jų imuninis aktyvumas (Barbosa-Cisneros, 1997; Bauer ir Wagner, 1990; Поспелов, 1998; Самородов ir kt., 1996). Jie stimuliuoja B ląsteles, skatina makrofagus išskirti IL-1, TNF-α, α- IFN ir β-INF (Bauer, 1996; Belogortseva ir kt., 1998b; Burger, 1997; Sartorelli, 2000).

Purpurinės ežiuolės sudėtyje rasti alkaloidai (Bauer, 1996; Bauer ir kt., 1988), saponinai, augalo lapuose provitaminas A, šaknyse ir žieduose vitaminas C, kurio 100 g masės yra 230 mg. Vitaminas C svarbus gamtinis antioksidantas, veikiantis T limfocitus, stimuliuojantis tiek leukocitų, tiek makrofagų fagocitozę (Bauer ir Wagner, 1990;

Whiteside ir Herberman, 1994).Augalo sudėtyje rasti eteriniai aliejai (Bauer ir kt., 1988; Gocan ir kt., 1996; Самородов ir kt., 1996), alkilamidai (Bauer ir kt., 1988; Belogortseva ir kt., 1998a; Muller-Jakic, 1993; Perry ir kt., 2000), nedidelis kiekis smalų, mikro ir makroelementai: kalis, magnis, chloras, aliuminis, fluoras, geležis (Bauer, 1996; Zink ir Chaffin, 1998).

4. 3. 1. Purpurinės ežiuolės poveikis organizmui

Preparatai, pagaminti iš purpurinės ežiuolės, pasižymi imunostimuliuojančiu, priešuždegiminiu, priešvirusiniu, priešvėžiniu, radioprotekciniu bei skatinančiu audinių regeneraciją poveikiu (Abdullah, 2000; Bauer ir Wagner, 1990; Sun, 1999).

Svarbiausia imuninės sistemos funkcija – apsaugoti organizmą nuo infekcijos, vėžio išsivystymo. Purpurinės ežiuolės imunostimuliuojantis poveikis pasireiškia nespecifinio imuniteto veiksnių skatinimu bei ląstelinio ir humoralinio imuniteto stimuliavimu (Abbas ir kt., 1997; Abdullah, 2000; Bauer, 1996; Tamošiūnas, 1991).

Pagrindiniai ežiuolės komponentai blokuoja virusų receptorius ląstelių paviršiuje, taip pat slopina hialuronidazę. Nespecifinis poveikis virusams pasireiškia citotoksišku virusų infekuotų ląstelių sunaikinimu ir interferono atlaisvinimu, taip skatinama tarpląstelinių baltymų sintezė ir blokuojama viruso RNR transkripcija. Purpurinės ežiuolės preparatai efektyvūs prieš gripo, herpeso, stomatito virusus (Abdullah, 2000; Roesler ir kt., 1991). Iš purpurinės ežiuolės išskirtų poliacetileno junginių priešgrybelinį ir bakteriostatinį poveikį aprašė Schutte ir kt. (1994). Priešvėžinis purpurinės ežiuolės poveikis pasireiškia: stimuliuojami makrofagai; skatinama TNF gamyba. Augalo preparatai stabilizuoja leukocitų skaičių navikinių ligų atvejais (Самородов ir kt., 1996; Stempel, 1989). Purpurinės ežiuolės komponentai slopina uždegimą artrito atveju. Pasižymi hialuroninę rūgštį atstatančiu veikimu, stimuliuoja fibroblastus. Beje, jie neturi pašalinio poveikio, kaip steroidai. Purpurinės ežiuolės poveikis primena švelnų kortizolio veikimą (Masi ir Chatterton, 2000; Самородов ir kt., 1996; Wagner, 1999).

Purpurinės ežiuolės preparatai naudojami norint sumažinti radiacinį poveikį. Jonizuojanti radiacija organizme indukuoja laisvųjų radikalų susidarymą, dėl to sutrinka fermentinės oksidacinės sistemos, sumažėja riebaluose tirpių vitaminų A ir E, metabolitų kiekis kraujo plazmoje, blužnyje ir čiobreliaukėje. Gydant purpurinės ežiuolės preparatais po apšvitinimo, nustatytas teigiamas poveikis organizmo antioksidacinėms sistemoms (Геруш ir Мещишен, 1998; Paranick ir kt., 1993).

Purpurinės ežiuolės preparatai vartojami gripo, viršutinių kvėpavimo takų kataro, urogenitalinės infekcijos, nudegimų, lėtinio bronchito, gripo, gingivito, parodontozės, laringito, tracheito, kandidozės, herpeso, psoriozės gydymui (Gunning ir Steele, 1999; Khaitov ir kt., 2000; Melchart ir kt., 1998; Schimmer ir kt., 1994). Maisto priedų, konservantų, sintetinių preparatų vartojimas sukelia alergines reakcijas. Nepaisant chemijos mokslo laimėjimų, augalinės kilmės preparatai yra dėmesio centre kaip natūrali priemonė, sauganti žmogaus sveikatą.

Patariama naudoti purpurinės ežiuolės homeopatinius preparatus, kuriems būdingas imunostimuliuojantis poveikis. Jie efektyvūs gydant vidaus organų uždegiminius procesus, esant psichiniam ir fiziniam išsekimui (Bauer, 1996; Schutte, 1994; Sun ir kt., 1999). Vartojant purpurinės ežiuolės preparatus rekomenduojamom dozėm, jie netoksiški. Nustatyta LD50 2500 mg/kg (Bauer ir kt., 1988; Самородов ir kt., 1996). Tačiau, jei preparatai vartojami daugiau negu 8 savaites, gali pasireikšti toksinis poveikis kepenims. Hepatotoksiškai veikia pirolizidino alkaloidai (tusilaginas ir izotusilaginas).

4. 4. Ląstelių apoptozė

Apoptozė arba programuota ląstelių mirtis yra fiziologinis genetiškai reguliuojamas ląstelių pašalinimo procesas, reikalingas audinių homeostazei palaikyti. Nustatyta, kad sutrikus apoptozei, gali pasireikšti įvairios ligos. Sumažėjus ląstelių apoptozei atsiranda autoimuninės ligos (Kerr ir kt., 1972), navikai (Martin ir Schwartz, 1997), o apoptozei didėjant, pradeda ryškėti neurodegeneracinės (Deigner ir kt., 2000; Martin ir Vallette, 2000; Passer ir kt., 1999; Srinivasan ir kt., 2000), širdies ir kraujagyslių sistemos (Narula ir kt., 1996; Yaoita ir kt., 2000) bei kitos ligos. Daugelio šių ir kitų ligų gydymas galėtų būti grindžiamas apoptozės aktyvinimu arba slopinimu. Taigi, racionalių gydymo metodų paieškos skatina toliau tyrinėti molekulinį apoptozės mechanizmą.

4. 4. 1. Molekuliniai apotozės mechanizmai

Tiriant audinius šviesiniu ir elektroniniu mikroskopais, rasti tam tikri apoptozinių ląstelių, t.y. ląstelių, žūstančių apoptozės būdu, morfologiniai pokyčiai: ląstelė susitraukia, jos branduolio chromatinas sutankėja, vėliau ląstelė suskyla į membrana dengtus

nepažeista, todėl vidinis turinys (citoplazma) neišsilieja ir nesukelia uždegimo, būdingo ląstelei mirštant dėl nekrozės (Majno ir kt., 1995).

3 pav. Apoptozės schema: pasikeičia ląstelės forma, ji suskyla į atskirus fragmentus, kuriuos fagocituoja makrofagai

Apoptozinius kūnus fagocituoja gretimos ląstelės bei makrofagai, taigi jie išnyksta be pėdsako. Dar prieš atsirandant morfologiniams ląstelės apoptozės požymiams, joje pradeda vykti biocheminiai pokyčiai, sukeliantys apoptozės procesą. Apoptozės eiga dažniausia skirstoma į tris fazes:

1. “Iniciacijos” fazė, kurios metu ląstelėje kaupiasi efektorių molekulės. Besikaupiančių efektorių rūšis priklauso nuo apoptozę sukeliančių signalų, kurie gali būti įvairūs: hormonai ir į juos panašūs augimo faktoriai (Kajstura ir kt., 1997), aktyviojo deguonies formos (Gotlieb ir kt., 1994), neuromediatoriai (Communal ir kt., 1998), hipoksija (Long ir kt., 1997). Dėl apoptozę sukeliančių signalų įvairovės, apoptozės efektoriai gana skirtingi. Manoma, kad iniciacijos fazė yra grįžtamoji, nes nutraukus signalą apoptozė neprasideda.

2. “Apsisprendimo” fazė. Šios fazės metu apoptozės efektoriai aktyvina procesus, dėl kurių citoplazmoje atsiranda baltymų, galinčių pažeisti branduolį. Antroji fazė yra negrįžtamoji. Biocheminiai pokyčiai, nulemiantys negrįžtamumą, prasideda keletą valandų anksčiau, negu atsiranda morfologinių pokyčių (Messam ir kt., 1998).

3.”Ląstelės sunaikinimo” fazė. Jos metu išryškėja morfologiniai apoptozės požymiai: chromatinas sutankėja, DNR sutrūksta, branduolys suskyla į tam tikras dalis, vadinamas apoptoziniais kūnais, kuriuos fagocituoja kitos ląstelės. Pagal morfologinius branduolio

pokyčius nustatyta, kad in vivo ląstelės apoptozė trunka nuo 6 iki 24 val., šis laikas priklauso nuo ląstelės tipo (Gavrieli ir kt., 1992).

Pagrindinės „mirties programos“ vykdytojos yra kaspazės, kurias trumpai būtų galima apibūdinti kaip aspartatui (Asp) specifinės cisteino proteazės (Hirata ir kt., 1998). Tai reiškia, kad kaspazės yra proteazės, turinčios cisteino aktyviajame centre ir ardančios baltymuose esančias peptidines jungtis, kurias sudaro aspartato karboksilo grupė. Veikiant kaspazėms, t. y. joms ardant baltymus, atsiranda ląstelių strukūros pokyčių, būdingų apoptozei. Jau nustatyta, kad eukariotų ląstelėse yra 14 skirtingų kaspazių. Jos yra žymimos skaičiais. Kaspazės yra konstitutyvieji fermentai, t. y. fermentai, kurių kiekis ląstelėje pastovus visą jos gyvavimo laikotarpį. Kaspazės sintetinamos kaip neaktyviosios prokaspazės. Jos suaktyvinamos, kai jas apardo kiti fermentai, arba vykstant autokatalizei (Martin ir Green, 1995). Kaspazės prokaspazės, kurias aktyvina kiti fermentai ir baltymai, pvz., serino proteazė granzimas B arba Fas/adaptorinių baltymų kompleksas yra vadinamos viršūninėmis kaspazėmis. Manoma, kad kaspazės 5, 8 ir 9 yra viršūninės, kurios, ardydamos kitas prokaspazes, jas aktyvina (Hirata ir kt., 1998; Martin ir Green, 1995; Slee ir kt., 1999). Taip susidaro kaspazių aktyvinimo kaskada, stiprinanti apoptozinio signalo perdavimą į mitochondrijas, branduolį ir kitas ląstelių struktūras. Veikiant kaspazių kaskadai, aktyvinamos efektorinės kaspazės, kurios skaido ląstelės baltymus - tai kaspazės 3, 6 ir 7 (Hirata ir kt., 1998). Veikiant kaspazėms, ląstelėje vyksta pokyčiai, kurie laikomi svarbiausiais apoptozės požymiais:

1. DNR sutrūkinėja į fragmentus, turinčius 180,200 bazių porų (bp). Tokio dyžio fragmentai susidaro skylant DNR tarp nukleosomų (Eneri ir kt., 1998).

2. Branduolys susitraukia, susiraukšlėja ir pumpuruojasi. Šie požymiai atsiranda, kaspazei suardžius branduolio laminą (Rao ir kt., 1996; Takashi ir kt., 1996). 3. Ląsteles forma pradeda kisti kai kaspazės ima ardyti citoskeleto baltymus, tarp jų fodriną ir gelsoliną (Kothakota ir kt., 1997; Martin ir Green, 1995).

4. 4. 2. Pagrindiniai žinduolių ląstelių apoptozę sukeliantys mechanizmai

Kaip jau minėta, ląstelės apoptozė prasideda suaktyvinus viršūnines kaspazes. Žinomi du jų aktyvinimo būdai. Aktyvinimui vykstant pirmuoju būdu, svarbiausias vaidmuo tenka ląstelių žūties receptoriams, vykstant antruoju būdu - kai kurių genų ekspresijos pokyčiams ir mitochondrijų membranų laidumo padidėjimui. Šie būdai susiję: abiejuose procesuose dalyvauja baltymas Bid.

Nustatyta, kad įvairių audinių, tarp jų ir širdies raumens, ląstelių membranoje yra naviko nekrozės faktoriaus (NNF) receptorių, kurie dalyvauja perduodant ląstelei mirties signalą. Šie receptoriai buvo pavadinti ląstelių žūties receptoriais. Po ligando (tai gali būti NNF šeimos citokinai) prisijungimo receptoriaus molekulės polimerizuojasi. Receptorių viduląstelinė sritis prijungia vadinamąsias FADD (Fas-associate death domain protein) adaptorines molekules. Šis kompleksas pritraukia ir sukaupia prokaspazės 8 molekules. Padidėjus šių molekulių koncentracijai, jos pradeda skaidyti viena kitą ir taip aktyvuojasi, susidaro kaspazė 8, kuri vėliau aktyvina efektorines kaspazes (pvz., kaspazę 3) (Hengartner, 2000). Nustatyta, kad žmogaus audinių ląstelės, pvz., lygiųjų raumenų, nuolat gamina ląstelių žūties receptorius, jų ligandus ir viduląstelinius adaptorinius baltymus. Įrodyta, kad fiziologinėmis sąlygomis citokinai, tarp jų ir NNF, gali aktyvinti ląstelių žūties receptorių ekspresiją (Geng ir kt., 1997; Hoffman ir kt., 1998). Visų jų ekspresijos padidėjimas gali sukelti apoptozę (Sata ir kt., 1998; Schaub ir kt., 1998). Jei ląstelės citoplazmoje apoptozę skatinančių baltymų kiekis yra pakankamai didelis, pvz., prokaspazės 8, tai apoptozė gali vykti ir nedalyvaujant citochromui c (Hengartner, 2000), tačiau daugelyje audinių prokaspazės 8 ekspresija yra nepakankama, todėl veikia ir mitochondrinis apoptozės būdas. Iš mitochondrijų atsipalaidavęs citochromas c citoplazmoje susijungia su apoptozės proteazes aktyvinančiu faktoriumi (Apaf) ir prokaspaze 9, sudarydami apoptosomą, kurioje prokaspazė 9 virsta aktyvia kaspaze 9 (Hengartner, 2000). Kaspazė 9 aktyvina kitas kaspazes ir taip prasideda apoptozė. Nustatyta, kad iš mitochondrijų gali atsipalaiduoti ne vien tik citochromas c, bet ir apoptozę indukuojantis faktorius (AIF), kuris dar vadinamas nuo kaspazių nepriklausomu ląstelių žūties efektoriumi. Atsipalaidavęs iš mitochondrijų, AIF patenka į ląstelės branduolį ir sukelia chromatino kondensaciją bei DNR skilimą į stambius 50 kbp dydžio fragmentus (Lorenzo ir kt., 1999).

Sveikų ląstelių mitochondrijų išorinė membrana yra laidi junginiams, kurių molekulinė masė mažesnė už 1,5 kDa. Vidinė mitochondrijų membrana yra laidi tik jonams ir mažos molekulinės masės junginiams. O apoptozę aktyvinančių mitochondrinių baltymų masė siekia net 50 kDa. Iki šiol nežinoma, kaip šie baltymai atsipalaiduoja iš mitochondrijų. Manoma, kad priežastis yra padidėjęs nespecifinis mitochondrijų membranų laidumas (Green ir Reed, 1998). Šį laidumą didina įvairūs veiksniai, kuriuos galima suskirstyti i du tipus: 1) veiksnius, susidarančius citozolyje, suaktyvinus viršūnines kaspazes; 2) veiksnius, keičiančius apoptozę reguliuojančių baltymų ekspresiją arba aktyvumą. Ląstelėje yra baltymų, skatinančių arba slopinančių apoptozę. Dauguma jų yra koduojami Bcl-2 šeimos genu, todėl ir vadinami Bcl-2 šeimos baltymais. Dalis Bcl-2 šeimos baltymų slopina

apoptozę, todėl jie gali būti vadinami antiapoptoziniais baltymais (Green ir Reed, 1998). Kaip šie baltymai slopina apoptozę, kol kas neištirta. Apoptozę sukeliančiam signalui stiprinti labai svarbus baltymas Bid. Citoplazmoje esantis Bid baltymas yra neaktyvus tol, kol jo nepaveikia kaspazė 8. Paveiktas Bid baltymas įsiterpia į mitochondrijos membraną ir padidina jos nespecifinį laidumą (Garland ir Halestrap, 1997). Taip per ląstelių žūties receptorius indukuotą apoptozės programą gali sustiprinti iš mitochondrijų atsipalaidavę baltymai. Kitas svarbus ir medicinos literaturoje dažnai minimas proapoptozinis baltymas yra p53. Nurodoma, kad pažeidus branduolio DNR baltymas p53 yra fosforilinamas, t.y. padidėja jo stabilumas. Šis stabilus p53 baltymas gali padidinti tiek ląstelių žūties receptorių ekspresiją, tiek ir kito proapoptozinio baltymo Bax koncentraciją bei sumažinti Bcl-2 kiekį (Martin ir Green, 1995). Visi šie procesai gali sukelti apoptozę ir sunaikinti pažeistą ląstelę (4 pav.).

DNR pažaida

ET pažaida

Mitochondrijų

pažaida

DNR pažaida

ET pažaida

Mitochondrijų

pažaida

4. 4. 3. Ląstelės energijos ištekliai ir apoptozė

Nustatyta, kad apoptozės pradžia visada susijusi su ryškiais ląsteles medžiagų apykaitos sutrikimais. Labiausiai nukenčia energijos, t. y. adenozintrifosfato (ATF), kaupimasis. Tai nenuostabu, nes apoptozės metu pažeidžiamos ląsteles jėgainės - mitochondrijos . Joms netekus citochromo c bei padidėjus membranų pralaidumui, mažiau pagaminama ATF. Energijos išteklių sumažėjimas gali būti ne tik apoptozės pasekmė, bet ir jos priežastis. Nustatyta, kad išemijos ir dėl jos atsirandančios reperfuzijos metu sumažėja ATF kiekis ląstelėje. Todėl proapoptozinis baltymas Bax įsiterpia į išorinę mitochondrijų membraną ir sudaro kanalą, laidų citochromui c, AIF ir mitochondrijų kaspazėms (Saikumar ir kt., 1998). Beveik išnykus ATF ištekliams, apoptozės eiga nutrūksta ir prasideda ląstelės nekrozė (Eguchi ir Shimizu, 1997; Taimor ir kt., 1999). Manoma, kad nekrozė vyksta nutrūkus kaspazių kaskadai, kuriai reikia ATF (Saikumar ir kt., 1998). ATF taip pat aktyvina Apaf-1, kuris, dalyvaujant citochromui c, prokaspazę 9 paverčia aktyvia kaspaze 9. Suaktyvėjus antiapoptozinių baltymų ekspresijai (pvz., Bcl-2), apoptozė sustoja net tuo atveju, jei energijos pakanka (Garland ir Halestrap, 1997). Taip sustabdžius apoptozę, suaktyvėja tie mechanizmai, kurie nedalyvaujant kaspazėms pažeidžia ląstelę, todėl ji žūsta nuo nekrozės (Green ir Reed, 1998). Taigi ląstelės žūties pobūdis priklauso nuo ATF išteklių ląstelėje. Kokie procesai yra jautriausi šiuo atveju, kol kas dar nenustatyta.

Cd sukelia apoptozę (Kondoh ir kt., 2002), kurios eiga žinoma ir apibūdinama kaip mitochondrijos funkcijos sutrikimas, citochromo c atpalaidavimas į citoplazmą, prokaspazės -9 aktyvavimas į kaspazę -9 ir specifinių ląstelės baltymų hidrolizė. Kadmis gali sukelti ir nekrozę, ir apoptozę (Kondoh ir kt., 2002). Priešingas programuotos ląstelių žūties, kai vyksta grandininiai procesai yra toksinių medžiagų sukeltas ekstensyvus metabolizmo sutrikimas - ląstelių nekrozė. Daugelis toksinių medžiagų gali sukelti ir apoptozę ir nekrozę (Raffray ir Cohen, 1997). Esminis apoptozės ir nekrozės skirtumas yra ląstelės žūties sukeliami padariniai. Apoptozės būdu žūstančias ląsteles fagocitai suvirškina greičiau nei nekrotizuotas, kurių turinys pasklinda tarp ląstelių ir sukelia uždegiminį procesą (5. pav.).

5 pav. Ląstelės sunaikinimo dėl apoptozės (1-6) ir dėl nekrozės (7-8) skirtumai. Normali ląstelė (1); apoptozės metu ląstelės turinys ir jos branduolys sutankėja (2); ląstelė subyra į apoptozės kūnelius (3); apoptozės kūnelius fagocituoja makrofagas (4); fagosomos, kuriose virškinamos apoptozės kūnelių liekanos (5, 6); nekrozės metu ląstelė brinksta, pažeidžiama plazminė jos membrana (7); ląstelės turinys patenka į tarpląstelinę erdvę (8).

Skirtingai nuo apoptozės, nekrozės būdu šalinamos ne pavienės ląstelės, o jų grupės, esančios audinio pažeidimo ar uždegimo srityje. Abi ląstelių mirties formos skiriasi morfologiškai. Nekrozės metu ląstelė didėja, išsipučia, plazminė membrana suyra, o ląstelės turinys patenka į tarpląstelinę erdvę. Todėl nekrozė sukelia uždegiminį procesą. Nustatyta tendencija, kad maži toksinių medžiagų kiekiai sukelia apoptozę, tuo tarpu vėliau bei veikiant didesniems šių medžiagų kiekiams išsivysto nekrozė (Raffray ir Cohen, 1997).

5. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODIKOS 5.1. Tyrimo objektas

Eksperimentus atlikome su nelinijinėmis augančiomis baltomis pelėmis, sveriančiomis 10 – 20 g. Moksliniai tyrimai atlikti laikantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) bei lydimųjų teisės aktų – Lietuvos Respublikos valstybinės veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymų “Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų” (Žin., 1999, Nr. 49-1590) ir “Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams” (Žin., 1999, Nr. 49-1591). Eksperimentai atlikti pagal Europos etikos komiteto darbui su laboratoriniais gyvūnais nustatytus reikalavimus; Lietuvos LAS Etikos komiteto leidimas Nr. 0028, 2001 04 02. Eksperimentams panaudotos 280 pelių.

Eksperimentai atlikti bendradarbiaujant su Kauno medicinos universiteto Biomedicininių tyrimų instituto Patochemijos laboratorija.

5.2. Metalų druskų tirpalų ir purpurinės ežiuolės ištraukos skyrimas pelėms 5.2.1. Metalų druskų ir purpurinės ežiuolės ištraukos tirpalų švirkštimas

Metalų druskų (CdCl2 ir ZnSO4) ir purpurinės ežiuolės ištraukos tirpalus į pelių pilvo ertmę (i.p.) švirkštėme naudojantis trimis schemomis.

Pirmoje serijoje į pelių (n=75) pilvo ertmę vieną kartą sušvirkštėme druskų tirpalus,

paruoštus dejonizuotame vandenyje:

1. 0,5 LD50 Cd2+(atitinkantį Cd2+ 1,6 mg/kg kūno masės), 2. 0,3 LD50 Zn2+ (atitinkantį Zn2+ 3,12 mg/kg kūno masės), 3. 0,3 LD50 Zn2+ ir 0,5 LD50 Cd2+.

Kontrolinėms pelėms i.p. švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį. Pelės dekapituotos praėjus 2, 8 ir 24 valandoms po injekcijos.

Antroje serijoje į pelių (n=36) pilvo ertmę 6 savaites (tris kartus per savaitę)

švirkštėme druskų tirpalus, paruoštus dejonizuotame vandenyje: 1. 0,05 LD50 Cd2+ (atitinkantį Cd2+ 0,16 mg/kg kūno masės), 2. 0,05 LD50 Zn2+ (atitinkantį Zn2+ 0,535 mg/kg kūno masės), 3. 0,05 LD50 Zn2+ ir 0,05 LD50 Cd2+.

Kontrolinėms pelėms i.p. pagal tą pačią schemą švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

Kiekvieną savaitę peles svėrėme. Po 6 savaičių pelės buvo dekapituotos.

Trečioje serijoje į pelių (n=57) pilvo ertmę 6 savaites (tris kartus per savaitę)

švirkštėme kadmio druskos ir dviejų skirtingų koncentracijų PE tirpalus, paruoštus dejonizuotame vandenyje:

1. 0,05 LD50 Cd2+ (atitinkantį Cd2+ 0,16 mg/kg kūno masės), 2. 0,05 LD50 PE (atitinkantį PE ištraukos 0,125 g/kg kūno masės), 3. 0,1 LD50 PE (atitinkantį PE ištraukos 0,25 g/kg kūno masės), 4. 0,05 LD50 Cd2+ ir 0,05 LD50 PE,

5. 0,05 LD50 Cd2+ ir 0,1 LD50 PE.

Kontrolinėms pelėms i.p. pagal tą pačią schemą švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

Kiekvieną savaitę peles svėrėme. Po 6 savaičių pelės buvo dekapituotos.

5. 2. 2. Kadmio druskos ir purpurinės ežiuolės ištraukos tirpalų girdymas pelėms

Eksperimentai buvo atlikti pagal schemą: peles (n=47) 8 savaites girdėme dviejų skirtingų CdCl2 koncentracijų, PE tirpalais arba jų kombinuotais tirpalais, paruoštais dejonizuotame vandenyje:

1. Cd2+ 25 mg/l tirpalas, kurį gerdama viena pelė per parą su dejonizuotu vandeniu gauna 0,025 mg Cd2+.

2. Cd2+ _{250 mg/l tirpalas, kurį gerdama viena pelė per parą su dejonizuotu vandeniu} gauna 0,25 mg Cd2+_.

3. PE ekstrakto 3,5 ml/l tirpalas, kurį gerdama viena pelė per parą su dejonizuotu vandeniu gauna 0,006 – 0,008 ml PE ekstrakto.

4. Cd2+ 25 mg/l ir PE ekstrakto 3,5 ml/l kombinuotas tirpalas. 5. Cd2+ 250 mg/l ir PE ekstrakto 3,5 ml/l kombinuotas tirpalas. 6. Kontrolinės grupės peles girdėme dejonizuotu vandeniu.

5. 3. Tyrimų metodai

5. 3. 1. Metalų koncentracijos nustatymas

Cd ir Zn koncentracija nustatyta kraujyje ir organuose (kepenyse, inkstuose, blužnyje, širdyje ir skeleto raumenyse). Norint išvengti kontaminacinės taršos, visi laboratoriniai indai ir mėgintuvėliai buvo chemiškai išvalyti nuo bet kokių metalų taršos ir patikrinti.

Pelių kraują surinkome į heparinizuotus (heparinas, “Biochemie”, Biochemie GmbH, Vokietija) plastmasinius minisorbcinius mėgintuvėlius. Organų gabalėliai buvo pasveriami, užpilami 0,125 M NaOH tirpalu ir tirpinami 90°C temperatūroje 24 valandas. Po to buvo užpilti vienodu bidistiliuoto vandens tūriu ir homogenizuojami ultragarsu kavitaciniame režime. Cd koncentracija nustatyta ir PE ekstrakte. Paruošti tirpalai buvo analizuojami atominės absorbcinės spektroskopijos tiesioginiu priedų metodu, naudojant Perkin-Elmer Zeeman/3030 spektrofotometrinę sistemą ir elektrotermografitinę HGA-600 krosnį (Schlemmer, 1989) Analizės tikslumas vertintas Zeeman/3030 sistemos statistiniais skaičiavimais, o patikimumas – vidiniais kokybės kontrolės standartais.

5. 3. 2. Mitozinių ląstelių nustatymas

Patohistologinius pelių organų tyrimus atlikau KMU Kardiologijos instituto Kardialinės patologijos laboratorijoje, konsultuojant prof. habil. dr. Vaivai Lesauskaitei.

Histologiniam tyrimui kepenų gabaliukai fiksuoti 10 proc. neutralaus buferinio formalino tirpale 2 paras. Po fiksacijos medžiaga plaunama 24 val. tekančiu vandeniu, po to 3 paras dehidratuojama 96 proc. etanolyje. Organų gabaliukai iš spirito perkeliami į absoliutaus etanolio ir chloroformo mišinį santykiu 1:1 ir laikomi termostate 2,5 val. Po to po 2,5 val. 2 kartus plaunami grynu chloroformu. Per šį laiką gabalėliai praskaidrėja. Medžiaga perkeliama į parafino ir chloroformo mišinį santykiu 1:1 ir laikoma termostate 24 val. 38°C temperatūroje kad iš gabalėlių pasišalintų chloroformas. Po to medžiaga gerai nusausinama, užliejama parafino porcija ir 2 val. laikoma termostate 58°C temperatūroje. Procedūrą kartojama dar 2 kartus ir gabaliukai užliejami šiltu parafinu specialiose metalinėse formelėse 58°C temperatūroje. Po to dedama į vakuumą ir laikoma 30 min., kol iš parafino pasišalins oro burbuliukai. Išėmus iš vakuumo dedama į vandens vonią ir laikoma tol, kol parafinas sustingsta. Iš parafininių blokų mikrotomu pjaunami 4 – 5 µ storio pjūviai, kurie dedami ant objektinio stikliuko ir džiovinami.

Paruošti dažymui pjūveliai deparafinuojami dviejose porcijose ksilolo po 10 min. kiekviename. Po to perkeliami į 96 proc. ir 70 proc. etanolį, kur kiekviename stikliukus su pjūveliais laikėme po 2 min. Po šios procedūros pjūviai plaunami 1 - 2 min. distiliuotame vandenyje ir merkiami 10 min. į hematoksiliną. Šie baziniai dažai nudažo branduolius mėlynai. Dažai nuplaunami distiliuotu vandeniu, kelioms sekundėms stikliukai pamerkiami į HCl kad paraustų, vėl nuplaunami ir pamerkiami į šiltą vandentiekio vandenį 30 min. Kad

išsiplautų šarmai, stikliukai 5 min. merkiami į distiliuotą vandenį, o iš jo 1-2 min. perkeliami į eozino tirpalą. Nuplovus dažus, stikliukai kelioms sekundėms merkiami į karboksilolo, po to 3 min. į ksilolo tirpalus. Ant išimtų iš ksilolo objektinių stikliukų su pjūviais, užlašinami keli lašai Kanados balzamo ir uždengiami dengiamaisiais stikleliais.

Histologiniai preparatai tirti šviesos mikroskopu, padidinimas ×40. Atsitiktinai parinkus 10 regėjimo laukų skaičiuotos mitotinės ląstelės (6 pav.). Regėjimo laukai buvo fotografuojami skaitmenine kamera Olympus Digital Camera DP – 11. Regėjimo lauko plotas – 0,04 mm2.

6 pav. Histologinis kontrolinės grupės pelės kepenų preparatas. Pelei į pilvo ertmę leistas fiziologinis tirpalas. Rodykle pažymėtos mitozinės kepenų ląstelės. (Hematoksilinas ir eozinas, originalus padidinimas ×40).

5. 3. 3. Apoptozinių ląstelių nustatymas

Eksperimentinių pelių kepenys nedelsiant fiksuojamos 37° C temperatūroje 10 proc. neutraliu buferiniu formalinu ir įliejamos į parafiną. Penkių mikrometrų (µm) storio kepenų audinio pjūviai buvo naudojami apoptozei tirti.

Formalinu fiksuotų ir įlietų į parafiną audinių pjūviai deparafinuojami ir rehidratuojami naudojant ksilolą ir įvairių koncentracijų etanolio tirpalus. Po to preparatai 5 min. laikomi fosfatinio buferio (FB) tirpale (NaH2PO4, Na2HPO4 ir NaCl), o vėliau - 15 min.

inkubuojami kambario temparatūroje proteinazės K tirpale (20 µg/ml, Roche), po to du kartus plaunami FB tirpalu.

TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, AP) reakcija. Ši reakcija buvo atliekama naudojant pjūvius, paveiktus proteinaze K (kaip aprašyta anksčiau). Šie preparatai buvo inkubuojami TUNEL reakcijos tirpale, kuriame buvo terminalinė deoksinukleotidilo transferazė (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT). Šio tirpalo buvo užlašinama ant histologinio stiklelio su kepenų preparatu ir, uždengus dengiamuoju stikleliu, 1 val. laikoma drėkinimo kameroje esant 37°C temperatūrai. Po to preparatai tris kartus praplaunami FB tirpalu ir, užlašinus ant pjūvio 1 mM levamisolio substrato, inkubuojami 30 min. 37°C temperatūroje. Tris kartus praplovus FB tirpalu preparatuose esančios apoptozinės ląstelės vizualizuojamos chromogeniniu substratu (NBT/BCIP) ir inkubuojant kambario temperatūroje 10 min. Po to praplaunama distiliuotu vandeniu ir dažoma eozinu.

Teigiama kontrolė: kepenų pjūviai 15 – 25° C temperatūroje 10 min. inkubuojami dezoksiribonukleazės (DNR nukleazės) turinčiame tirpale (3000 V/ml 50 mM Tris – HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 1 mg/ml BSA) DNR nukleaze suskaldytai DNR aptikti buvo atliekama TUNEL reakcija ir tolesnė darbo eiga buvo tokia pati kaip su tiriamaisiais preparatais.

Neigiama kontrolė: kepenų pjūviai paruošti kaip anksčiau minėti preparatai (deparafinuoti, rehidratuoti, permeabilizuoti ir praplauti FB tirpalu), inkubuojami su nepilnos sudėties TUNEL reakcijos mišiniu neturinčiu TdT. Tolesnė darbo eiga tokia pati kaip su tiriamaisiais pjūviais.

Apoptozė vertinta šviesiniu mikroskopu. Apoptozinėmis buvo laikomos ląstelės, kurių branduoliai TUNEL reakcijos metu įgavo tamsiai violetinę/juodą spalvą ir chromatinas tapo piknotiškas.

C B

A

7 pav. Pelių kepenų ląstelių apoptozės tyrimas: A. TUNEL teigiamos kontrolės kepenų ląstelės (jų branduoliai nusidažė tamsiai), B. TUNEL neigiamos kontrolės kepenų ląstelės, C. Rodykle pažymėta kontrolinės pelių grupės apoptozinė kepenų ląstelė (originalus padidinimas ×40).

5. 3. 4. DNR išskyrimas ir elektroforezė

DNR išskyrimas. Eksperimentinių pelių kepenys fiksuojamos 37°C temperatūroje 10 proc. Neutraliu buferiniu formalinu ir įliejamos į parafiną. DNR išskirti buvo naudojami 5 µm storio kepenų audinio pjūviai. Į sterilų 1,5 ml Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį idedama 40 – 50 pjūvių, kurie užpilami 600 µl 25 mM Tris-HCl buferio (pH – 8,0), kuriame buvo 25 mM EDTA ir 50 mM NaCl ir 200 µg/ml proteinazės K. 24 val. inkubuojama 55°C temperatūroje. Po to 98°C temperatūroje 9 min. inaktyvuojama proteinazė K. Po to mišinys 15 min. centrifuguojamas 5.000 apsisukimų/min. greičiu. Po to tirpalas, esantis po parafinu, bet virš nuosėdų, perpilamas į naują Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį ir pridėjus tokį pat tūrį chloroformo ir sumaišius vorteksu, palikti 5 min. pastovėti. Po to centrifuguoti 15 min. 5.000 apsisukimų/min. greičiu. Viršutinę dalį atsargiai pipete supilti į naują Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį ir pridėti tokį pat tūrį chloroformo. Vėl centrifuguoti ir po to vėl viršutinę dalį atsargiai pipete supilti į naują Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį ir pridėti tokį pat tūrį chloroformo. Viršutinę dalį atsargiai pipete supilti į naują Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį ir pridėjus tokį pat tūrį izopropanolio 60 min. palaikyti – 20°C temperatūroje. Vėl 15 min. centrifuguoti. Po to atsargiai nupilti viršutinę dalį ir nuosėdas plauti 70 proc. Etanoliu. Vėl 5 min. centrifuguoti. Po to nupilti etanolį, nusausinti Eppendorf centrifuginį mėgintuvėlį ir nuosėdas išdžiovinti kambario temperatūroje. Vėliau jas ištirpinti distiliuotame vandenyje.

8 pav. DNR elektroforezė: 1.- MW – molekulinės masės žymuo (GeneRuler 100 bp DNA Ladder plus). 2. – DNR išskirta iš pelės užkrūčio liaukos. 3. – DNR išskirta iš pelės, per os 8 savaites paveiktos CdCl2, kepenų. 4. DNR išskirta iš pelės, 8 savaites girdytos purpurinės ežiuolės ekstraktu. 3 ir 4 juostoje DNR išskirta iš kepenų audinio mėginio, kur nustatytos TUNEL plius kepenų ląstelės. Abiem atvejais nėra apoptrozei būdingų 120 – 200 bp dydžio DNR fragmentų.

DNR elektroforezė. Elektroforezei naudotas 1,5 proc. Agarozės gelis elektrodiniame buferyje E (0,04 M Tris-acetato, pH – 8, 0,002 M EDTA). Pavyzdžiai užnešimui buvo paruošti buferyje E, į kurį papildomai dar buvo pridėta 2 proc. Bromfenolio mėlio, 20 proc. Sacharozės, 10 mM EDTA. Elektroforezė vykdyta 1,5 val. esant pastoviai 100 mA elektros srovei. DNR elektroforetinės juostos vizualizuotos UV šviesoje, nudažius gelį 0,05 proc. Etidžio bromido tirpale 40 min. DNR dydžio vertinimui naudotos fermento 1 kilobazės DNR standartų mišinys, kurį sudarė nuo 0,5 iki 10 kilobazių DNR fragmentai (Straus, 1990) (8 pav.).

5. 3. 5. Aspartato aminotransferazės ir alanino aminotransferazės nustatymas

Aspartato aminotransferazės (AST) ir alanino aminotransferazės (ALT) nustatėme pelių kraujo serume. Analizę atlikome Instrumentation Laboratory Company analizatoriumi Monarch.

5. 3. 6. Purpurinės ežiuolės žolės ištraukos paruošimas

Vaistinė žaliava renkama augalo žydėjimo metu. Žolė (0,3 kg) susmulkinama iki 1 mm dydžio dalelių ir užpilama 3 l ekstrahento (40 proc. Etilo alkoholio, žaliavos ir ekstrahento santykis 1:10). Ekstrakcija vykdoma 24 valandas kambario temperatūroje. Pirmosios ištraukos išeiga – 2,2 l. Antrosios ir trečiosios ekstrakcijos atliktos analogiškomis sąlygomis, užpylus ektrahento kiekį lygų nupiltajam (pirmosios ištraukos gauta 2,2 l,

antrosios – 2,2 l, trečiosios – 2,2 l). Gautos žolės supilamos į vieną indą ir vykdoma ekstrahento distiliacija vakuumo – rotaciniame aparate. Žolės ištrauka koncentruojama iki 150 ml vandeninio likučio. Koncentruotas ekstraktas valomas nuo balastinių medžiagų tris kartus po 100 ml trichlormetanu dalomajame piltuve, kuris po to distiliuojamas vakumo – rotaciniame aparate (pašalinamos trichlormetano liekanos). Gaunama 150 ml žolės preparato, kurio 1 ml yra 90 sausų medžiagų.

Ežiuolių žolės ekstraktas pagamintas Kauno akcinėje bendrovėje “Bakteriniai preparatai”.

5. 4. Statistinė analizė

Kadmio ir cinko koncentracijos geometrinių vidurkių palyginimui taikytas Stjudento t kriterijus su Bonferroni pataisa. Skirtumo tarp mitozinių ir apoptozinių ląstelių skaičiaus, įvairiose grupėse įvertinimui taikyti neparametriniai Kruskal-Wallis ir Mann-Whitney kriterijai. Duomenų statistinėje analizėje naudotų kriterijų reikšmingumo lygmuo p=0,05.

13 REZULTATAI

6.1. Ūmi pelių intoksikacija kadmiu ir apsauginis cinko poveikis po vienkartinių injekcijų į pelių pilvo ertmę

6.1.1. Vienkartinio 0,5 LD50 kadmio jonų (Cd2+ 1,6 mg/kg kūno masės) poveikio

pelėms per parą įvertinimas: koncentracijos kitimas organuose ir kraujyje bei kepenų ląstelių mitozės ir apoptozės indeksas

Kadmio koncentracijos kitimas pelių kraujyje ir organuose paros laikotarpiu po vienkartinių Cd2+ (0,5 LD50) injekcijų į pelių pilvo ertmę pateiktas 9 ir 10 pav. Kontrolinės grupės pelėms pagal tą pačią schemą buvo leidžiamas fiziologinis tirpalas.

0.02 22.29 5.84 4,64 0.00 16,16 15.17 14,96 0.07 5.51 6,84 7,93 0 5 10 15 20 25 C d ko n cen tr acij a µ g /g kr au ju i µ g /d L

Kraujas Kepenys Inkstai

Kontrolė po 2val. po 8val. po 24val.

- p<0,05, lyginant su grupėmis po 2, 8 ir 24 val. - p<0,05, lyginant su grupėmis po 8 ir 24 val.

9 pav. Kadmio koncentracija pelių kraujyje, kepenyse ir inkstuose per 24 valandas po vienkartinio kadmio chlorido (Cd2+ 1,6 mg/kg kūno masės) sušvirkštimo.

0.00 0.33 1,19 1,36 0.00 0.30 2,23 1,40 0.00 0,05 0,16 0,20 0 2 4 6 8 10 C d ko n cen tr acij a µ g /g

Širdis Blužnis Raumuo

Kontrolė po 2val. po 8val. po 24val.

- p<0,05, lyginant grupėmis po 2, 8 ir 24 val. - p<0,05 , lyginant grupėmis po 8 ir 24 val.

10 pav. Kadmio koncentracija pelių širdyje, blužnyje ir skeleto raumenyse per 24 valandas po vienkartinio kadmio chlorido (Cd2+ 1,6 mg/kg kūno masės) sušvirkštimo.