MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
VAIDA GALDIKAITĖ
FLAVONOIDŲ KIEKIO IR LAISVŲJŲ RADIKALŲ SURIŠIMO
GEBOS ĮVAIRAVIMO TYRIMAS OŽKAROŽĖS (EPILOBIUM SPP.)
ŽOLĖS MĖGINIUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas doc., dr. Valdas Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
FLAVONOIDŲ KIEKIO IR LAISVŲJŲ RADIKALŲ SURIŠIMO
GEBOS ĮVAIRAVIMO TYRIMAS OŽKAROŽĖS (EPILOBIUM SPP.)
ŽOLĖS MĖGINIUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc., dr. Valdas Jakštas
Recenzentas Darbą atliko
prof., habil. dr. Valdimaras Janulis Magistrantė Vaida Galdikaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Epilobium spp. genties apibūdinimas ... 11
1.2. Epilobium spp. morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 11
1.3. Epilobium spp. kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos ... 12
1.4. Epilobium spp. genties augalų farmakologinis poveikis... 13
1.5. Bendra flavonoidų apžvalga ... 16
1.6. Flavonoidų cheminė struktūra ir klasifikacija ... 16
1.7. Flavonoidų reikšmė augaliniame pasaulyje ... 17
1.8. Flavonoidų medicininė reikšmė... 18
1.9. Flavonoidų nustatymo metodai ... 20
1.10. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23 2.1. Tyrimų objektas ... 23 2.2. Naudoti reagentai... 23 2.3. Naudota aparatūra... 24 2.4. Tyrimų metodai ... 24 2.5. Metodikų validacija ... 27
2.6. Duomenų statistinis vertinimas ... 32
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
3.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas... 33
3.2. Kiekybinis flavonoidų tyrimas Epilobium spp. žolėje ... 34
3.2.1. Spektrofotometrinis metodas ... 34
3.2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas... 39
3.3. Spektrofotometrinio ir chromatografinio metodo palyginimas, nustatant flavonoidų kiekį Epilobium spp. žolės mėginiuose ... 42
3.5. Flavonoidų suminio kiekio ir antioksidantinio aktyvumo koreliacinių ryšių įvertinimas
Epilobium spp. žolės mėginiuose ... 51
IŠVADOS ... 52 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 54
SANTRAUKA
V. Galdikaitė. magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc., dr. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Flavonoidų kiekio ir laisvųjų radikalų surišimo gebos įvairavimo tyrimas ožkarožės (Epilobium spp.) žolės mėginiuose.
Raktiniai žodžiai: Epilobium, ožkarožė, flavonoidai, hiperozidas, miricitrinas, izokvercitrinas, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, antioksidantinis aktyvumas, DFPH.
Tyrimo objektas ir metodai: Epilobium spp. genties augalų žolės žaliavų tyrimas. Flavonoidai nustatyti spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais, laisvųjų radikalų surišimo geba – spektrofotometrijos metodu, naudojant DFPH testą.
Darbo tikslas: nustatyti Lietuvoje rinktų ožkarožės (Epilobium spp.) žolės mėginių flavonoidų kiekybinę sudėtį bei antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: įvertinti flavonoidų suminį kiekį bei jo įvairavimą ožkarožės genties augalų žolės mėginiuose; efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti flavonoidus, būdingus ožkarožės genties augalams; euklidiniu atstumu pagrįstu dendrograminiu modeliu nustatyti ožkarožės genties žaliavų mėginius, pasižyminčius reikšmingais flavonoidų kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo skirtumais; įvertinti ožkarožės genties augalų žolės mėginių antioksidantinį aktyvumą bei jo įvairavimą; įvertinti laikymo sąlygų įtaką ožkarožės žolės etanolinių ekstraktų kiekybinei sudėčiai bei antioksidantiniam aktyvumui.
Išvados: Didžiausias suminis flavonoidų kiekis nustatytas E. angustifolium mėginiuose, rinktuose Gulbinuose, Vilniaus r., ir sudarė 2,71±0,04 proc. Visuose tirtuose ožkarožių mėginiuose nustatyti 3 flavonoidai: hiperozidas, miricitrinas ir izokvercitrinas, kurie gali būti taikomi kaip ožkarožės genties žaliavų kokybiniai žymenys. E. hirsutum bandiniai, rinkti Ceikiniuose, Ignalinos r., ir E. angustifolium ėminiai, rinkti Gulbinuose, Vilniaus r., pasižymi didžiausiais žaliavos kiekybinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo skirtumais. Didžiausia antioksidacine galia pasižymi E.
angustifolium ėminiai, rinkti Gulbinuose, Vilniaus r., ir sudarė 585,76±4,74 µmol/g. Laikant ožkarožės
žolės ištraukas 6 mėn., jose esantis flavonoidų kiekis sumažėja. Didžiausias flavonoidų kiekis randamas ištraukose, laikytose kambario temperatūros aplinkoje tamsoje. Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymi ožkarožės žolės ekstraktai, laikyti 3 mėn. šaldytuve.
SUMMARY
Title: Study on variation of the flavonoid content and free radical binding ability in grass samples of willow herb (Epilobium spp.).
Key words: Epilobium, willow herb, flavonoids, hyperoside, myricitrin, isoquercitrin, high performance liquid chromatography, spectrophotometry, antioxidant activity, DPPH.
Object and methods: phytochemical analysis of willow herb genus plants. Flavonoids determined by spectrophotometry and high performance liquid chromatography, free radical binding ability determined by spectrophotometric method using DPPH test.
Aim: to determine quantitative composition of flavonoids and antioxidant activity in the willow herb (Epilobium spp.) grass samples, collected in Lithuania.
Objective: to evaluate the total flavonoid content and its variation in the willow herb grass samples; to determine flavonoids specific to the Epilobium spp. genus plants by using high performance liquid chromatography; to assess willow herb grass samples characterized in significant differences of quantitative composition of flavonoids and antioxidant activity by dendrogram model based on euclidean distance; to estimate antioxidant activity and its variation in the willow herb grass samples; to assess the storage conditions on quantitative composition and antioxidant activity of ethanolic willow herb extracts.
Results: The highest total flavonoid content (2,71±0,04%) was determined in E.
angustifolium samples, collected in Gulbinai, Vilnius district. Three flavonoids were assessed in the
analyzed samples: hyperoside, myricitrin and isoquercitrin, that can be used as quantitative markers of the raw materials. E. hirsutum collected in Ceikiniai, Ignalina district and E. angustifolium collected in Gulbinai, Vilnius district are characterized by the highest differences in quantitative composition and antioxidant activity. The highest antioxidant capacity (585,76±4,74 µmol/g) was determined in E.
angustifolium samples collected in Gulbinai, Vilnius district. The content of flavonoids in the willow
herb grass extracts decreases while keeping them for 6 months. The highest amount of flavonoids is found in the extracts stored at room temperature in the dark environment. The highest antioxidant activity of the willow herb grass extracts is characterized while keeping them in a fridge for 3 months.
SANTRUMPOS
1321N1 astrocitomos ląstelės
ABTS 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) ACN acetonitrilas
AKF angiotenziną konvertuojantis fermentas AngII angiotenzinas II
APN aminopeptidazė N
CL chemiliuminescencija
COX ciklooksigenazė (angl. cyclooxygenase)
CUPRAC vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (angl. cupric ion reducing antioxidant capacity)
DFPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas DNR deoksiribonukleorūgštis
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
FRAP trivalentės geležies jonų redukcijos jėga (angl. ferric reducing antioxidant power) GPH gerybinė prostatos hiperplazija
HAT vandenilio atomo pernešimas (angl. hydrogen atom transfer)
HMEC pieno liaukų epitelio ląstelės (angl. human mammary epithelial cells) HSV-1 Herpes simplex virusas 1
IR infraraudonoji spinduliuotė LNCaP prostatos vėžio ląstelės
mėn. mėnesiai
MTL mažo tankio lipoproteinai
n imties tūris
NADPH nikotinamido adenino dinukleotido fosfato redukuota forma (angl. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form)
NEP neutrali endopeptidazė
ORAC deguonies radikalų absorbcinė geba (angl. oxygen radical absorbance capacity) PCL fotochemiliuminescencija (angl. photochemiluminescence)
proc. procentai
PZ-HPV-7 prostatos epitelio ląstelės R2 regresijos koeficientas
TEAC trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity) TFA trifluoracto rūgštis
TOSC bendra oksidantų skaidymo geba (angl. total oxidant scavenging capacity) TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazinas
TRAP bendras radikalų gaudyklės parametras (angl. total radical-trapping antioxidant parameter)
UV ultravioletinė spinduliuotė
UV-Vis ultravioletinės ir regimosios šviesos spinduliuotė (angl. ultraviolet-visible light) ŽIV žmogaus imunodeficito virusas
ĮVADAS
Ožkarožė (Epilobium spp.) – tai daugiametis žolinis augalas, priklausantis nakvišinių (Onagraceae) šeimai. Jos panaudojimas gerybinės prostatos hiperplazijos gydymui siejamas su antiandrogeninėmis, antioksidacinėmis, uždegimą slopinančiomis, ląstelių proliferaciją mažinančiomis savybėmis bei gebėjimu inhibuoti ligos patogenezėje dalyvaujančius fermentus 5-α-reduktazę ir aromatazę.
Lietuvoje Epilobium spp. genties augalai yra plačiai paplitę. Morfologiškai jie yra panašūs ir atskirti vieną rūšį nuo kitos sudėtinga. Tačiau fitochemine sudėtimi rūšys skiriasi, todėl chemotaksonominių markerių, ypač flavonoidų, nustatymas, turi didelę reikšmę rūšių identifikavimui ir žaliavos kokybės vertinimui.
Epilobium spp. genties augalų tyrimai patvirtina vartojimo farmacijoje tikslingumą, tačiau
šios genties augalų fitocheminė sudėtis mažai ištirta. Kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas augalinėse žaliavose yra reikšmingas galimam biologinio aktyvumo įvairavimo įvertinimui. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas atskleidžia tiriamų vaistinių augalinių žaliavų potencialą vartoti jas kaip papildomos terapijos elementą oksidacinio streso sukeltų susirgimų, lėtinių infekcinių ir neinfekcinių ligų bei onkologinių susirgimų metu.
Epilobium spp. genties augalų gebėjimas surišti laisvuosius radikalus siejamas su augaluose
esančiais flavonoidais. Todėl tikslinga nustatyti ne tik ožkarožės antioksidacinę galią, bet ir suminį flavonoidų kiekį bei jų pasiskirstymą skirtingose augalo rūšyse. Išsiaiškinus flavonoidų kiekio ir laisvųjų radikalų surišimo gebos įvairavimą skirtingose ožkarožės rūšyse, būtų galima spręsti apie konkrečios augalo rūšies panaudojimą vaistinių preparatų gamyboje.
Darbo naujumas. Pirmą kartą nustatytas flavonoidų kiekis E. ciliatum žaliavoje bei pirmą kartą nustatytas E. ciliatum ir E. palustre antioksidantinis aktyvumas. Pirmą kartą flavonoidų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas nustatytas Lietuvos augavietėse rinktuose ožkarožės (Epilobium spp.) mėginiuose.
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti Lietuvoje rinktų ožkarožės (Epilobium spp.) žolės mėginių flavonoidų kiekybinę sudėtį bei antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti flavonoidų suminį kiekį bei jo įvairavimą ožkarožės genties augalų žolės mėginiuose. 2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti flavonoidus, būdingus ožkarožės
genties augalams.
3. Euklidiniu atstumu pagrįstu dendrograminiu modeliu nustatyti ožkarožės genties žaliavų mėginius, pasižyminčius reikšmingais flavonoidų kiekybinės sudėties skirtumais.
4. Įvertinti ožkarožės genties augalų žolės mėginių antioksidantinį aktyvumą bei jo įvairavimą. 5. Euklidiniu atstumu pagrįstu dendrograminiu modeliu nustatyti ožkarožės genties žaliavų
mėginius, pasižyminčius reikšmingais antioksidantinio aktyvumo skirtumais.
6. Įvertinti laikymo sąlygų įtaką ožkarožės žolės etanolinių ekstraktų kiekybinei sudėčiai bei antioksidantiniam aktyvumui.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Epilobium spp. genties apibūdinimas
Ožkarožės (Epilobium spp.) gentis priklauso nakvišinių (Onagraceae) šeimai. Epilobium spp. gentis yra plačiai paplitusi visame pasaulyje. Ją sudaro daugiau nei 200 rūšių, iš kurių Europoje auga 26. Labiausiai paplitę genties augalai yra E. angustifolium L., E. hirsutum L. ir E. parviflorum Schreb [7, 42, 65, 75].
Lotyniškas ožkarožės genties pavadinimas Epilobium yra kilęs iš graikiškų žodžių epi (ant) ir
lobium (ankštis), nes augalo žiedai yra išsidėstę ant ilgos, plonos, į ankštį panašios sėklų dėžutės [7].
Angliškas šios genties pavadinimas fireweed (fire – gaisras, weed – piktžolė) atskleidžia, kad šie augalai yra vieni pirmųjų, kurie išauga gaisro nualintoje vietoje [76].
Gentis suskirstyta į smulkiažiedžius (E. parviflorum, E. montanum L., E. roseum Schreb.) ir stambiažiedžius (E. angustifolium, E. hirsutum) augalus [39]. Atskirti vieną rūšį nuo kitos sudėtinga, nes šie augalai tarpusavyje labai panašūs ir jiems būdinga dažna tarprūšinė hibridizacija [39, 42].
1.2. Epilobium spp. morfologiniai požymiai ir paplitimas
Ožkarožė – daugiametis, 50-150 cm aukščio žolinis augalas (1 pav.). Šakniastiebis storas, šliaužiantis. Stiebas status arba kylantis, apvalus arba nežymiai briaunotas, plikas arba apaugęs pasišiaušusiais ar prigulusiais plaukeliais. Lapai pražanginiai, lancetiški, lygiakraščiai arba su liaukiniais danteliais, smailūs, bekočiai ar su mažais koteliais, 1-12 cm ilgio, 0,5-3,5 cm pločio. Jų viršutinė pusė tamsiai žalia, plika, apatinė – melsvai žalia, su ryškiomis gyslomis. Žiedai 4-30 mm skersmens, tamsiai ar šviesiai purpuriniai, raudoni, rausvi arba beveik balti, netaisyklingi, susitelkę į gana ilgas, 10-45 cm ilgio, viršūnines kekes. Žiedynai sudaryti iš 80-120 žiedų. Taurėlapiai 4, pagrinde suaugę. Vainiklapiai 4 (5), pagrinde nusmailėję į nagelį. Kuokeliai 8, išsilenkę žemyn. Dulkinės 8, kuriose esti mėlynai žalios ar geltonos žiedadulkės. Piestelė viena. Purka buožiška ar rutuliška, kryžmiškai suskilusi į 4 dalis. Vaisius – 4-9 cm ilgio, ankštaros pavidalo, suskylanti į 4 dalis daugiasėklė plaukuota dėžutė. Sėklos smulkios, pailgos, su baltais skristukais [37, 38, 45, 47, 62, 64, 72].
1 pav. Epilobium spp. genties augalai, jų žiedai ir vaisiai su sėklomis
Šie augalai yra protandriniai. Kadangi pirmiausia prasiskleidžia žiedyno apačioje esantys žiedai, o tik po to viršutiniai, moteriški žiedai visuomet yra žiedyno apačioje, o vyriški – viršuje [62, 63]. Augalai žydi 3-5 savaites, o atskiri žiedai būna prasiskleidę 4-5 dienas [12]. Vienu metu būna prasiskleidę 4-16 žiedų [62].
Auga miškuose, pamiškėse, kirtimuose, degimvietėse, skynimuose, krūmuose, pakelėse, ant geležinkelio sankasų, smėlio duobėse, sausuose durpynuose, šlaituose, apleistuose karjeruose, pelkėtose pakrantėse. Augalas dažnas, paplitęs visoje Lietuvoje, bet dažniausiai sutinkamas pietinėje ir rytinėje šalies dalyje. Žydi birželio – rugsėjo mėn., sėklos sunoksta rugpjūčio – spalio mėn. Vaistinė žaliava – visos augalo dalys [23, 38, 60, 64].
1.3. Epilobium spp. kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos
Epilobium spp. genties augaluose nustatyti flavonoliai ir jų glikozidai: miricetinas,
miricitrinas (miricetino-3-O-β-D-ramnozidas), izomiricitrinas (miricetino-3-O-β-D-gliukopiranozidas), miricetino-3-O-β-D-gliukuronopiranozidas, miricetino-3-O-β-D-gliukuronidas, kvercetinas, kvercitrinas (kvercetino-3-O-β-D-ramnozidas), kvercetino-3-O-β-D-gliukuronidas, izokvercitrinas (β-D-gliukozidas), hiperozidas (β-D-galaktozidas), kvercetino-3-O-(6''-galoil)-galaktozidas, kvercetino-3-O-(2''-galoil)-gliukozidas, rutinas (kvercetino-3-O-rutinozidas),
guaiaverinas (kvercetino-3-O-a-L-arabinozidas), ramnetinas (7-metoksi-kvercetinas), izoramnetinas (3-metil-kvercetinas), izoramnetino-3-gliukozidas, kemferolis, kemferolio-3-O-(6''-p-kumaroil)-gliukozidas; flavonai ir jų glikozidai: luteolinas, cinarozidas (luteolino-7-gliukozidas), apigetrinas (apigenino-7-gliukozidas); elagotaninai: oenoteinas A, oenoteinas B; fenolkarboninės rūgštys: elago, galo, kavos, chlorogeno rūgštys; fitosteroliai: β-sitosterolis ir jo esteriai; alkaloidai, triterpeninės
rūgštys, riebiosios rūgštys, polisacharidai, pektinai, gleivės, askorbo rūgštis [2, 4, 7, 18, 28, 34, 39, 40, 46, 54, 65, 69, 71, 75, 76].
Epilobium spp. genties augaluose pagrindiniai komponentai yra oenoteinas B,
gliukuronidas bei miricetino-3-O-ramnozidas. Kvercetino glikozidai, ypač kvercetino-3-O-gliukuronidas, dominuoja E. angustifolium augaluose, tuo tarpu kitose Epilobium spp. rūšyse pagrindiniai flavonoidai yra miricetino glikozidai [39].
1.4. Epilobium spp. genties augalų farmakologinis poveikis
Epilobium spp. genties rūšių žaliavos pasižymi įvairialypiu biologiniu aktyvumu ir gali būti
naudojamos vaistų gamybai. Ožkarožės ekstraktai pasižymi priešuždegiminiu, antiseptiniu [6, 8, 9], antioksidaciniu [68], priešgrybeliniu [43], antimikrobiniu [11], antiproliferaciniu, imunomoduliaciniu, antiandrogeniniu [65], analgetiniu [44], raminančiu [56], diuretiniu [49], burnos gleivinę sutraukiančiu ir minkštinančiu veikimu [2].
Ožkarožės skausmą malšinantis veikimas panašus į lizino acetilsalicilato sukeliamą analgezinį poveikį [71]. Tai patvirtina ir F. Pourmorad et al. (2007) atlikti tyrimai, kuriuose įrodytas E. hirsutum metanolinių ekstraktų antinociceptinis veikimas.
Eksperimentinėse studijose su sveikomis, testosteronu stimuliuojamomis, kastruotomis vyriškos lyties žiurkėmis pastebėta, kad vartojant vandeninį E. angustifolium ekstraktą per os, sukeliamas antrinių lytinių organų augimas [40, 76].
Taip pat nustatytas antiproliferacinis poveikis prostatos epitelio (PZ-HPV-7), prostatos vėžio (LNCaP), astrocitomos (1321N1) ir pieno liaukų epitelio (HMEC) ląstelėms [6, 8, 9].
E. angustifolium dėl savo minkštinančių, sutraukiančių savybių naudojama Rusijoje. Taipogi
ji vartojama kaip arbatos pakaitalas. Ispanijoje E. hirsutum populiari dėl savo estrogeninių savybių. Taip pat ji naudojama gydyti prostatos adenomą. Šveicarijoje ir Austrijoje E. fleischeri Hochst., E.
roseum, E. parviflorum, E. montanum ir E. lanceolatum Sebast. & Mauri naudojamos su gerybine
prostatos hiperplazija (GPH) susijusioms šlapinimosi problemoms gydyti [18].
Liaudies medicinoje Epilobium spp. genties augalai naudojami gydyti gerybinę prostatos hiperplaziją ir su tuo susijusias šlapinimosi problemas [41], prostatos uždegimą [5, 76], adenomą ir karcinomą, šlapimo pūslės, inkstų [46], virškinamojo trakto ligas [6, 65], gleivinės pažeidimus, tokius kaip burnos opos [39]. Taip pat ožkarožė gerina žaizdų, odos skaudulių ir patinimų gijimą [39].
Amerikos indėnai E. angustifolium augalą naudojo kraujavimui iš tiesiosios žarnos stabdyti, kinai – menstruaciniams sutrikimams lengvinti [40].
Ožkarožės panaudojimas gerybinės prostatos hiperplazijos gydymui. Tiriant E.
angustifolium etanolinių ekstraktų aktyvumą prieš žmogaus prostatos epitelio ląsteles (PZ-HPV-7)
nustatyta, kad augalas pasižymi ląstelių proliferaciją stabdančiu poveikiu. Šis tyrimas patvirtina
Epilobium spp. genties augalų naudojimą GPH gydyme. Antiproliferacinis E. angustifolium etanolinių
ekstraktų poveikis prieš prostatos epitelio ląsteles siejamas su įvairiais augale esančiais junginiais, veikiančiais skirtingais biocheminiais mechanizmais. Yra keletas hipotezių, galinčių paaiškinti šių ląstelių augimą stabdantį poveikį. Pirma, Epilobium spp. ekstraktai gali trukdyti 5-α-reduktazės ir aromatazės, kurios dalyvauja prostatos hiperplazijos vystimesi, veikimui [76]. Tyrimuose su E.
parviflorum ir E. capense Buchinger ex Hochst. nustatyta, kad Epilobium spp. genties augaluose
esantys oenoteinas A ir B bei kemferolis, kvercetinas ir miricetinas pasižymi aromatazę slopinančiu poveikiu. Taip pat nustatyta, kad oenoteinas A ir B pasižymi ir 5α-reduktazę slopinančiu poveikiu ir šis poveikis didesnis už GPH gydyti vartojamo vaisto finasterido gebėjimą inhibuoti minėtą fermentą [18, 46, 76]. Antra, įrodyta, kad kai kurie flavonoidai gali stabdyti įvairių hormonams jautrių ir nejautrių ląstelių augimą. Todėl manoma, kad ožkarožės ekstraktuose esantys flavonoidai gali tiesiogiai inhibuoti PZ-HPV-7 ląstelių proliferaciją. Trečia, kai kurie flavonoidai pasižymi reikšmingu steroidiniu veikimu. Todėl antiproliferacinis poveikis gali būti siejamas su Epilobium spp. kaupiamų flavonoidų estrogeniniu veikimu. Galiausiai, antioksidantai gali modifikuoti prostatos vėžio ląstelių proliferaciją keisdami greitai besidauginančių ląstelių apoptozę [76]. Atlikti tyrimai parodė, kad
Epilobium spp. genties augalai pasižymi antioksidaciniu poveikiu, kuris siejamas su augaluose
esančiais flavonoidais [4, 28, 31, 32, 67].
Atliktos studijos parodė, kad ožkarožė pasižymi stipriu angiotenziną konvertuojantį fermentą (AKF), neutralią endopeptidazę (NEP) ir aminopeptidazę N (APN) inhibuojančiu poveikiu. AKF, NEP ir APN yra cinko metalopeptidazės, kurios išsidėsčiusios išorinėje įvairių ląstelių membranoje. Jos atlieka svarbų vaidmenį įvairių žmogaus nervų, kardiovaskulinės, uždegiminės ir imuninės sistemų reguliacinių peptidų metabolizme. AKF verčia angiotenziną I į angiotenziną II (AngII). Sergant gerybine prostatos hiperplazija, AKF ir AngII kiekis žymiai padidėja. Atlikti tyrimai parodė, kad AngII stiprina simpatinės nervų sistemos impulso perdavimą žiurkės prostatos ląstelėse, todėl gali stimuliuoti ląstelių proliferaciją [41]. NEP ekspresijos pokyčiai yra susiję su prostatos vėžio progresavimu. Manoma, kad APN ekspresija yra svarbi prostatos vėžio pasireiškimui ir vėžinių ląstelių metastazėms. Nustatyta, kad iš visų ožkarožės kaupiamų biologiškai aktyvių medžiagų oenoteinas B stipriausiai slopina metalopeptidazes NEP ir ACE. Tyrimai parodė, kad NEP ir ACE slopinančiu poveikiu pasižymi ir ožkarožėje esantys flavonoidai [40]. Nustatyta, jog kvercetino-3-glikozidai, ypač kvercetino-3-gliukuronidas bei kvercetino-3-(6''-galoil)-galaktozidas šiuo poveikiu pasižymėjo stipriau negu miricetino ar kemferolio glikozidai. Manoma, kad flavonoidai kartu su oenoteinu B pasižymi sinergistiniu poveikiu [8].
Priešuždegiminis poveikis. Epilobium spp. genties augaluose esantys flavonoidai ir sitosterolio derivatai geba slopinti prostaglandinų biosintezę ir edemos susidarymą. A. Hiermann et al. (1986) atlikti tyrimai parodė, kad E. parviflorum ir E. angustifolium vandeniniai ekstraktai, slopindami ciklooksigenazes (COX-1 ir COX-2), sumažina prostaglandinų I2, E2 ir D2 išsiskyrimą. Iš E. angustifolium išskirtas miricetino-3-gliukuronidas prostaglandinų biosintezę slopina taip pat efektyviai
kaip ir priešuždegiminis vaistas indometacinas ir dešimt kartų stipriau mažina edemos susidarymą [31, 32, 34, 67].
Atlikti tyrimai su E. angustifolium, E. hirsutum ir E. parviflorum vandeninėmis ištraukomis parodė, kad minėtosios ožkarožės rūšys slopina hialuronidazės ir lipooksigenazės aktyvumą. Ši savybė gali būti siejama su ožkarožės naudojimu gydant žaizdas. Be to, šių rūšių ištraukos slopino mieloperoksidazės atsipalaidavimą iš neutrofilų ir šis aktyvumas buvo panašus kaip ir indometacino [39].
Imunomoduliacinis poveikis. Tyrimai parodė, kad vienas iš pagrindinių biologiškai aktyvių junginių Epilobium spp. gentyje - oenoteinas B - gali aktyvuoti daugelį fagocitų funkcijų, tokių kaip NADPH oksidazės aktyvumą, chemotaksį ar citokinų gamybą. Dėl gebėjimo moduliuoti įgimtos imuninės sistemos funkcijas, manoma, kad ožkarožės ekstraktų savybę skatinti žaizdų gijimą ir stabdyti auglių augimą didžiąja dalimi lemia makrofagų funkcijos moduliavimas [65].
Antimikrobinis poveikis. Tiriant ožkarožės antimikrobinį aktyvumą nustatyta, jog augalo ekstraktai veikia Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus sanguis, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas pyocyanea, Escherichia coli, Micrococcus luteus bakterijų, Candida krusei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida lusitaniae, Saccharomyces cerivisiae, Cryptococcus neoformans
mieliagrybių ir Microsporum canis, Microsporum gypseum, Tricophyton rubrum, Tricophyton
mentagrophytes, Rhizopus spp. grybelių augimą ir šis poveikis daugeliu atvejų yra baktericidinis [7,
78]. Šie atlikti tyrimai įrodo ožkarožės naudojimo, gydant grybelinę odos ligą tinea capitis [73], egzemą, psoriazę, seborėją ir kitas odos ligas, pagrįstumą [7].
S. Ivancheva et al. (1992) atlikti tyrimai atskleidė E. hirsutum savybę slopinti gripo viruso reprodukciją. Taip pat nustatyta, kad Epilobium spp. genties augaluose kaupiamas elagotaninas oenoteinas B slopina Herpes simplex virusą HSV-1 ir žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) replikaciją [18].
Poveikis virškinamajam traktui. F. Vitali et al. (2006) atlikti tyrimai parodė, kad Epilobium spp. genties augalai pasižymi antidiarėjiniu, virškinamojo trakto judrumą ir sekreciją mažinančiu poveikiu. Šie poveikiai siejami su augalo kaupiamais flavonoidais, ypač miricetino-3-O-β-D-gliukuronidu, kurie pasižymi priešopiniu, antispazminiu, žarnyno motoriką, sekreciją ir viduriavimą
mažinančiu veikimu. Taipogi ožkarožės gebėjimas mažinti viduriavimą siejamas su augalo antimikrobiniu aktyvumu, kuomet diarėja esti infekcinio pobūdžio.
1.5. Bendra flavonoidų apžvalga
Flavonoidai yra viena iš didžiausių augalinių fenolinių junginių grupių. Jie gali egzistuoti tiek laisvoje, tiek glikozidinėje formoje. Lyginant su glikozidais, aglikonai pasižymi didesniu biologiniu aktyvumu. Žinoma daugiau kaip 6000 šių junginių, iš kurių beveik 500 yra aglikonų pavidale. Flavonoidai plačiai paplitę gamtoje. Jų gausu vaisiuose, daržovėse, grūduose, riešutuose, alyvuogių aliejuje, propolyje, meduje, arbatoje ir vyne. Dažniausiai sutinkami aukštesniuosiuose augaluose, kur jie randami ląstelės sultyse. Jie naudojami kaip chemotaksonominiai markeriai ir jų gausu
Polygonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbelliferae ir Compositae šeimų augaluose [14, 16, 20, 50,
52].
1.6. Flavonoidų cheminė struktūra ir klasifikacija
Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai, kurių pagrindą sudaro flavanas (2-fenil-benzo-γ-pirono žiedas) (2 pav.). Jų struktūroje yra du benzeno žiedai (A ir B), kurie tarpusavyje sujungti heterocikliniu pirano arba pirono žiedu. Fenilo grupė būna antroje pirono žiedo padėtyje, išskyrus izoflavonoidus, kuriuose fenilo grupė esti 3 pirono žiedo padėtyje, ir neoflavonoidus, kur fenilo grupė prisijungusi 4 padėtyje. Daugiausia flavonoidai būna O-glikozidų pavidalo. Prie aglikono dažniausiai būna prisijungusi gliukozė, bet taip pat gali būti ir gliukoramnozė, galaktozė, arabinozė ir ramnozė. Jos dažniausiai būna prisijungusios β-jungtimi prie aglikono hidroksigrupės [16, 25, 50].
Pagal tai ar C žiedo 4 padėtyje yra oksigrupė, ar yra dvigubas ryšys tarp 2 ir 3 anglies atomo, ar 3 padėtyje yra prijungta hidroksigrupė ir priklausomai nuo hidroksigrupių įvairavimo B žiede, flavonoidai skirstomi į flavonus (luteolinas, apigeninas), flavonolius (kemferolis, miricetinas, kvercetinas), flavononus (naringinas, pinocembrinas), flavononolius (dihidrofisetinas, dihidrokvercetinas), flavan-3-olius (katechinas, epigalokatechinas), leukoantocianidinus (leukocianidinas), antocianus (pelargonidinas), chalkonus (likochalkonas A ir C), auronus (auronas), izoflavonoidus (6,8-diprenilgenisteinas, soforaizoflavonas A), neoflavonoidus ir biflavonoidus (ginkgetinas) [16, 50].
Flavonoidai gali būti klasifikuojami ir pagal biosintezės kilmę. Chalkonai, flavononai, katechinai ir leukoantocianidinai priskiriami pirmajai grupei, nes jie yra ir tarpiniai, ir galutiniai biosintezės produktai. Antrajai grupei priskiriami tik galutiniai biosintezės produktai. Šiai grupei priklauso antocianai, flavonai ir flavonoliai [16].
1.7. Flavonoidų reikšmė augaliniame pasaulyje
Flavonoidai labai svarbūs augalams. Jie atlieka antioksidantų, fermentų inhibitorių, pigmentų ir šviesos ekranų vaidmenį [50]. Taipogi jie susiję su augalų jautrumu šviesai, energijos pernešimu, augimu, kvėpavimu, fotosinteze, morfogeneze, lytine determinacija, apsauginėmis reakcijomis [16].
Flavonoidai nudažo augalų žiedus įvairiomis spalvomis. Tai lemia antociano, flavono ir metalo katijono buvimas. Antocianas delfinidinas nulemia rausvai violetinę ir mėlyną žiedų spalvą, cianidinas – rausvai raudoną, pelargonidinas – rožinę ir oranžinę, o malvidinas – rausvai violetinę ir violetinę žiedų spalvą. Dažniausiai augaluose vyrauja delfinidinas. Mėlyna spalva labiau privilioja bites apdulkintojas. Kai kurių augalų šeimų, kur yra labiau išsivystęs angiospermas, žiedams nėra būdingi mėlyni žiedai. Tokiuose žieduose vyraujantis antocianas yra ne delfinidinas, o cianidinas ir todėl jų spalva yra raudona [24]. Be to, antocianai nudažo ne tik žiedus, bet spalvą suteikia ir vaisiams [25]. Yra flavonoidų, kurie būdami bespalviai, dėl savo sudėtyje esančių chromoforų sugeba absorbuoti UV šviesą ir taip pritraukti apdulkintojus [26].
Flavonoidai suteikia vaisiams skonį. Pavyzdžiui, flavanonas naringinas lemia greipfruto vaisiaus kartų, sutraukiantį skonį. Tuo tarpu naringino dihidrochalkonas, kurio struktūroje nėra piranono žiedo, pasižymi stipriu saldžiu skoniu ir yra net tūkstantį kartų saldesnis už valgomąjį cukrų [26].
Flavonoidai apsaugo augalus nuo UV-B spindulių. Flavonoidų pigmentų daugiausiai yra žaliuose lapuose. Jie veikia kaip UV filtrai ir taip apsaugo fotosintetinančius audinius nuo pažeidimo. Nustatyta, kad šiuo poveikiu pasižymi cianidino, kvercetino, kemferolio, luteolino glikozidai [24, 25].
Flavonoidai taipogi saugo augalus nuo įvairių mikroorganizmų. Už priešgrybelinį poveikį atsakingi izoflavonoidai, flavonai ir flavononai. Priešvirusiniu poveikiu pasižymi flavonoliai ir auronai [16, 24].
Flavonoidai, kartu su kitais polifenoliais, saugo augalus nuo vabzdžių ir žolėdžių žinduolių. Šiuo poveikiu pasižymi flavonai, flavonoliai, izoflavonai [24, 25].
1.8. Flavonoidų medicininė reikšmė
Medicinoje flavonoidus kaupiantys augalai vartojami kraujavimui stabdyti, kraujo spaudimui mažinti, širdies, kepenų, šlapimo takų ligoms, nerviniams susirgimams, virškinamojo trakto sutrikimams, alergijai ir kitoms ligoms gydyti [38].
Flavonoidai pasižymi hipoglikeminiu [20, 48], antialerginiu [70], skrandžio gleivinę saugančiu [20], diuretiniu [22], antispazminiu [27], kardioprotekciniu [25, 77], antiproliferaciniu [66], antidiarėjiniu [14], estrogeniniu [15], analgetiniu [53], antimaliariniu [24] poveikiu.
Antioksidantinis poveikis. Labiausiai flavonoidai žinomi kaip antioksidantai. Manoma, kad flavonai ir katechinai stipriausiai saugo žmogaus organizmą nuo reaktyvių deguonies formų, tokių kaip superoksido anijonai, hidroksilo ar peroksido radikalai, vandenilio peroksidas, hipochlorito rūgštis. Flavonoidai žmogaus organizmą nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio gali apsaugoti keliais būdais. Vienas iš jų – tiesiogiai surišti laisvuosius radikalus. Flavonoidai, reaguodami su laisvaisiais radikalais, stabilizuoja reaktyvias deguonies formas. Buvo nustatyta, kad antioksidantinį flavonoidų veikimą daugiausiai lemia katecholo grupės buvimas B žiede, hidroksilo grupės buvimas 3 padėtyje, karbonilo grupės prisijungimas 4 padėtyje ir dvigubas ryšys tarp 2 ir 3 anglies atomo. Surišdami laisvuosius radikalus, flavonoidai gali stabdyti mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, todėl manoma, kad jie gali būti naudojami gydyti aterosklerozę, vėžį ir įvairias širdies ligas [24, 26].
Hepatoprotektinis poveikis. Kai kurie flavonoidai gali saugoti kepenų ląsteles. Jų veikimo mechanizmas nėra visiškai aiškus, tačiau manoma, kad jie apsaugo kepenų ląsteles mažindami toksinių peptidų praėjimą pro ląstelės membraną [26]. Taip pat flavonoidai vartojami gydyti kepenų ligas, susijusias su padidėjusiu kraujagyslių pralaidumu ir kapiliarų trapumu [50].
Aterosklerozę mažinantis poveikis. Dėl savo antioksidacinių savybių, flavonoidai turi didelę įtaką kraujagyslių sistemai. Deguonies radikalai gali oksiduoti MTL, kurie pažeidžia endotelį ir sukelia
aterosklerozę. Todėl flavonoidai, veikdami kaip antioksidantai, stabdo MTL oksidaciją. Tyrimai parodė, kad flavonoidai mažina koronarinės širdies ligos susirgimo tikimybę. Taip pat atlikti tyrimai atskleidė, kad flavonoidai mažina cholesterolio kiekį kraujo plazmoje [24, 52].
Priešuždegiminis poveikis. Įrodyta, kad flavonoidai inhibuoja uždegimo mediatorius ciklooksigenazę ir lipooksigenazę, taip mažindami uždegimo metabolitų formavimąsi. Taipogi flavonoidai stabdo eikosanoidų, tokių kaip prostaglandinų, dalyvaujančių imunologiniame atsake, biosintezę. Be to, flavonoidai inhibuoja tirozino kinazes ir taip stabdo nekontroliuojamą ląstelių augimą ir proliferaciją. Taip pat flavonoidai inhibuoja neutrofilų degranuliaciją ir taip tiesiogiai mažina arachidono rūgšties susidarymą [52].
Priešvėžinis poveikis. Šis poveikis siejamas su flavonoidų antioksidaciniu veikimu. Reaktyvios deguonies formos gali pažeisti DNR ir taip sąlygoti ląstelių mutacijų atsiradimą. Flavonoidai, veikdami kaip antioksidantai, stabdo kancerogenezę. Taip pat manoma, kad flavonoidai stabdo nekontroliuojamą angiogenezę – naujų kraujagyslių formavimąsi, kuriomis piktybinis navikas aprūpina save krauju [51, 52].
Trombų formavimąsi mažinantis poveikis. Flavonoidų savybė mažinti trombocitų agregaciją siejama su jų geba surišti laisvuosius radikalus, inhibuoti ciklooksigenazę ir lipooksigenazę bei stabdyti tromboksano A2 susidarymą. Tyrimai parodė, kad flavonoidai prisitvirtina prie trombocitų
membranų, tokiu būdu kaupiasi ir laikui bėgant sukelia stipresnį antitrombozinį poveikį [52].
Osteoporozės išsivystymo tikimybę mažinantis poveikis. Manoma, kad flavonoidai didina kaulų mineralinį tankį ir taip užkerta kelią osteoporozės išsivystymui [52].
Priešvirusinis poveikis. Tyrimai atskleidė, jog flavonoidai turi poveikį Herpes simplex virusui, kvėpavimo sincitiniam virusui, paragripo virusui, poliovirusui ir adenovirusui. Taip pat manoma, kad flavonoidai gali stabdyti ŽIV viruso replikaciją. Kai kurie flavonoidai stabdo viruso replikaciją ląstelėje, kiti slopina virusų infekcines savybes. Daroma prielaida, kad priešvirusinį poveikį apsprendžia flavonoidų aglikonai ir hidroksilo grupės buvimas 3 padėtyje. Manoma, kad flavonoidai, vartojami kartu su kitais priešvirusiniais vaistais, pasižymi sinergistiniu poveikiu [16, 50, 52].
Priešgrybelinis poveikis. Šis poveikis siejamas su flavonoidų geba inhibuoti sporų augimą. Buvo nustatyta, kad flavonoidai pasižymi poveikiu prieš Candida albicans, Aspergillus flavus,
Aspergillus tamarii, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum ir Penicillium italicum
[16].
Antibakterinis poveikis. Buvo nustatyta, kad flavonoidai pasižymi poveikiu prieš
Staphylococcus albus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas
aeruginosa, Proteusmirabilis, Klebsiellapneumoniae, Enterobacteraerogenes ir Enterobactercloacae.
poveikis siejamas su keletu mechanizmų: vieni flavonoidai stabdo nukleorūgščių sintezę, kiti – sutrikdo citoplazminės membranos funkciją, treti – inhibuoja energijos metabolizmą [16].
1.9. Flavonoidų nustatymo metodai
Kokybiniam flavonoidų nustatymui gali būti naudojama UV spektroskopija, IR spektroskopija, masių spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija. Kiekybiniam flavonoidų nustatymui naudojama UV-Vis spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė [1].
Spektrofotometrija. Kiekvienas flavonoidų aglikonas savo sudėtyje turi bent vieną aromatinį žiedą, kuris aborbuoja UV šviesą. Flavonoidų spektras susideda iš dviejų absorbcijos maksimumų. Pirmąjį maksimumą, kuris randamas 240-285 nm bangos ilgių srityje, nulemia A žiedas, o antrąjį, kuris randamas 300-550 nm bangos ilgių srityje, nulemia pakaitai ir C žiedo konjugacija [61]. Šis metodas leidžia nustatyti suminį flavonoidų kiekį augale [79]. Flavonoidų sąveika su įvairiais reagentais sukelia absorbcijos spektro poslinkį. Tokiais reagentais gali būti šarminis dietilenglikolio reagentas, magnis ir vandenilio chlorido rūgštis, 1-nitrozo-2-naftolio ir azoto rūgštis [10].
Efektyvioji skysčių chromatografija. Tai pirmo pasirinkimo metodas tiek kokybiniam, tiek kiekybiniam flavonoidų nustatymui. Dažniausiai atliekama atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C8 ar C18 kolonėles. Gradientiniam eliuavimui naudojamos dviejų tirpiklių sistemos:
acetonitrilo-vandens arba metanolio-vandens mišiniai. Kartais naudojami ir kiti tirpikliai, tokie kaip tetrahidrofuranas, izopropanolis, n-propanolis. Pridedama ir rūgščių, kurios slopina fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją ir taip leidžia gauti ryškesnes smailes. Efektyvioji skysčių chromatografija dažniausiai atliekama kambario temperatūros aplinkoje, tačiau temperatūra gali būti ir 40°C, kuomet norima sutrumpinti analizės laiką [1, 61].
Kapiliarinė elektroforezė. Šis metodas užtikrina aukštą atskyrimo veiksmingumą ir trumpą analizės laiką. Yra keletas kapiliarinės elektroforezės metodų, tačiau paprasčiausias ir labiausiai universalus yra kapiliarinė zonų elektroforezė. Atskyrimas pagrįstas krūvio/dydžio santykio skirtumu, o analitės migruoja į atskiras zonas skirtingais greičiais. Anijonų ir katijonų atskyrimas galimas elektroforezinės migracijos ir elektroosmosinio srauto dėka [1]. Dažniausiai naudojamas fosfatinis ar boratinis buferis, 50-100 µm diametro kapiliarai, 10-30 kV įtampa, 10-50 nl injekcijos tūris ir ultravioletiniai, fluorescenciniai, masių spektrometriniai arba elektrocheminiai detektoriai [61].
1.10. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo
metodai
Laisvieji radikalai – tai molekulės, turinčios neporinį elektroną išorinėje orbitoje. Jie yra nestabilūs ir labai reaktyvūs. Laisvieji deguonies radikalai yra superoksido anijonas (O2-), hidroksilo
(˙OH), peroksilo (RO2˙), alkoksilo (RO˙) ir hidroperoksilo (HO2˙) radikalai. Azoto laisvieji radikalai
yra azoto oksido (˙NO) ir azoto dioksido (˙NO2) radikalai. Šie laisvieji radikalai gali būti paversti į
reaktyvias deguonies ir azoto formas, tokias kaip vandenilio peroksidas (H2O2), hipochloro rūgštis
(HOCl), hipobromo rūgštis (HOBr) ir peroksinitritas (ONOO-) [21].
Reaktyvios deguonies ir azoto formos yra normalaus ląstelių metabolizmo produktai ir jų nedideli kiekiai yra naudingi organizmui. Tačiau jos gali būti ne tik naudingos gyvoms sistemoms, bet ir kenksmingos. Dideli jų kiekiai gali pažeisti ląstelių lipidus, baltymus ir DNR ir taip slopinti jų normalias funkcijas. Todėl laisvieji radikalai gali sąlygoti įvairių ligų išsivystymą, o taip pat ir senėjimo procesą [74].
Nustatyta, kad laisvieji radikalai gali sukelti įvairias širdies-kraujagyslių sistemos ligas, tokias kaip aterosklerozė, išemija, stazinis širdies nepakankamumas, miokardo infarktas, koronarinė širdies liga, arterinė hipertenzija, insultas; neurodegeneracines ligas, tokias kaip Alzhaimerio, Hantingtono, Parkinsono liga, depresija, amiotrofinė lateralinė sklerozė; odos ligas, tokias kaip melanoma, psoriazė, alergija, atopinis dermatitas, dilgėlinė, eritema; o taip pat jie gali lemti ir vėžio, inkstų funkcijos sutrikimo, astmos, lėtinės obstrukcinės plaučių ligos, reumatoidinio artrito, su amžiumi susijusios geltonosios dėmės degeneracijos, kataraktos bei diabeto išsivystymą [17, 55, 59].
Organizmas, norėdamas apsisaugoti nuo laisvųjų radikalų sukeliamo žalingo poveikio, gamina endogeninius antioksidantus – medžiagas, galinčias stabilizuoti arba deaktyvuoti laisvuosius radikalus. Kovoti su oksidaciniu stresu padeda ir egzogeniniai antioksidantai, kurie gaunami kartu su maistu ar papildais. Antioksidantai kovoja su oksidaciniu stresu, nutraukdami grandininę laisvųjų radikalų susidarymo reakciją. Kai radikalas atpalaiduoja arba prisijungia laisvą elektroną, susidaro kitas radikalas. Šis radikalas elgiasi taip pat kaip ir pirmasis. Vyksta grandininė reakcija, kuri nutraukiama prisijungus laisvą elektroną turinčiam antioksidantui [55].
Antioksidantai skirstomi į fermentinius ir nefermentinius antioksidantus. Fermentiniams antioksidantams priskiriama superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė ir glutationo reduktazė. Nefermentiniai antioksidantai dar skirstomi į metabolinius, kuriems priklauso tokie endogeniniai antioksidantai kaip lipoidinė rūgštis, glutationas, L-argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, transferinas, ir maistingųjų medžiagų antioksidantus, kuriems
priskiriamos egzogeninės, organizme negaminamos medžiagos, tokios kaip vitaminai E ir C, karotinoidai, selenas, manganas, cinkas, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys bei flavonoidai [55].
Antioksidantai gali neutralizuoti laisvuosius radikalus dviem mechanizmais: atiduodami vandenilio atomą arba prisijungdami laisvą elektroną. Pagal tai, antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai skirstomi į dvi grupes:
1) metodai, paremti vandenilio atomo atidavimu (HAT); 2) metodai, paremti laisvo elektrono prisijungimu (SET).
HAT metodais matuojamas antioksidanto (AH) gebėjimas atiduoti vandenilio atomą laisvajam radikalui (X˙). Minėtas procesas vyksta pagal šią lygtį:
X˙ + AH → HX + A˙
Prie HAT grupės priskiriama deguonies radikalų absorbcinės gebos (ORAC) metodas, kuriuo nustatomas antioksidanto gebėjimas inhibuoti peroksilo radikalų sukeltą oksidaciją; bendro radikalų gaudyklės parametro (TRAP) nustatymo metodas, kuriuo matuojama antioksidanto geba įsiterpti į peroksilo radikalų reakciją su taikiniu; bendros oksidantų skaidymo gebos (TOSC) metodas, kuris leidžia įvertinti antioksidantų absorbcijos gebą prieš hidroksilo radikalus, peroksilo radikalus ir peroksinitritą; chemiliuminescencinis (CL) metodas, kuris yra TRAP metodo modifikacija, ir kuris paremtas cheminių reakcijų sukeltu laisvųjų radikalų švytėjimu; fotochemiliuminescencinis (PCL) metodas, kuriuo nustatomas fotosensibilizatoriaus optinio sužadinimo sukelto superoksido anijono radikalų atsiradimo dydis; β-karotino blukinimo testas, kuriuo įvertinamas antioksidanto gebėjimas mažinti karotino blukimą, vykstantį dėl peroksilo radikalų; mažo tankio lipoproteinų oksidacijos testas, kuriuo nustatomas antioksidanto gebėjimas slopinti minėtąjį procesą.
SET metodais nustatomas antioksidanto gebėjimas prisijungti nesuporuotą laisvojo radikalo elektroną. Procesas vyksta pagal šią lygtį:
X˙ + AH → X- + AH˙+
Prie SET grupės priskiriama trivalentės geležies jonų redukcijos jėgos (FRAP) nustatymo metodas, kuriuo įvertinama geležies 2,4,6-tripiridil-s-triazino (TPTZ) redukcija iki spalvoto junginio, ir vario jonų redukcijos antioksidantinės gebos (CUPRAC) testas, kuriuo nustatoma dvivalenčio vario jono redukcija iki vienvalenčio jono.
Taip pat išskiriami metodai, apimantys tiek HAT, tiek SET mechanizmus, kuriems priklauso Trolokso ekvivalento antioksidantinės gebos (TEAC), arba kitaip ABTS metodas, kuriuo nustatomas antioksidanto gebėjimas blukinti 2,2´-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalo (ABTS˙+) spalvą, ir DFPH metodas, kuriuo įvertinamas antioksidanto gebėjimas blukinti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalo (DFPH˙) spalvą [58].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų objektas
Buvo tirtos 8 ožkarožės rūšių žaliavos: E. angustifolium L., E. ciliatum Raf., E. hirsutum L.,
E. montanum L., E. palustre L., E. parviflorum Schreb., E. roseum Schreb., E. tetragonum L. Epilobium spp. mėginiai surinkti Botanikos instituto mokslo darbuotojų iš įvairiuose Lietuvos
regionuose esančių natūralių augaviečių 2010 m.: E. angustifolium mėginiai rinkti Buzaraistyje, Vilniaus r. sav., Ceikiniuose, Ignalinos r. sav., Gulbinuose, Vilniaus r. sav., Ignalinoje, Ignalinos r. sav. ir Nidoje, Neringos sav.; E. hirsutum bandiniai rinkti Ceikiniuose, Ignalinos r. sav., Juodagalviuose, Ignalinos r. sav., Juodkrantėje, Neringos sav., Krikonyse, Ignalinos r. sav. ir Mielagėnuose, Ignalinos r. sav.; E. ciliatum pavyzdžiai rinkti Žygmantiškėje, Ignalinos r. sav.; E. palustre – Ilgininkuose, Varėnos r. sav.; E. parviflorum – Laukininkėliuose, Varėnos r. sav.; E. roseum – Kaukinėje, Kaišiadorių r. sav.;
E. montanum ir E. tetragonum ėminiai rinkti Paneriuose, Trakų r. sav. Tirta žaliava – žolė, surinkta
žydėjimo metu.
2.2. Naudoti reagentai
Naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai yra analitinio švarumo. Etanolis 96,3 proc. V/V įsigytas iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva), aliuminio chlorido heksahidratas iš „Mecobenzon“ (Copenhagen, Danija), acto rūgštis iš „Fluka“ (Seelze, Vokietija), heksametilentetraminas iš „Lachema“ (Neratovice, Čekija), trifluoracto rūgštis iš „Merck“ (Hohenbrunn, Vokietija), acetonitrilas ir DFPH iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Steinheim, Vokietija), Trolox iš “Acros organics” (New Jersey, JAV), miricitrinas iš „ChromaDex“ (Santa Ana, JAV), rutinas, hiperozidas ir izokvercitrinas iš „Roth“ (Karlsruhe, Vokietija). Naudotas išgrynintas dejonizuotas vanduo, ruošiamas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
2.3. Naudota aparatūra
Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Bio Sonic UC-300“ (JAV).
Flavonoidų kiekis, perskaičiuotas rutinu, ir ekstraktų antioksidantinis aktyvumas nustatytas naudojant spektrofotometrą „Unicam Helios ALPHA, UV/Vis“ (Unicam, Analitical Technology INC, Cambridge, Didžioji Britanija).
Flavonoidų analizei ESC metodu naudota chromatografinė sistema „Waters 2695“ su dviem detektoriais: „Perkin-Elmer LC-95 UV/Visible“ (Waltham, JAV), kuris naudotas flavonoidų kiekybiniam nustatymui, ir „Waters 996 PDA“ (Waters, Milford, JAV), kuris naudotas junginių spektriniam – chromatografiniam identifikavimui. Kolonėlė ACE C18 5 μm, 4,6×250 mm (Waters,
Milford, JAV), prieškolonėlė ACE C18 5 μm (Waters, Milford, JAV), termostatas (Waters, Milford,
JAV). Chromatografinis skirstymas valdytas, chromatogramos registruotos ir duomenys apdoroti naudojantis programa „Empower 2 Chromatography Data Software“ (Waters, Milford, JAV).
2.4. Tyrimų metodai
Tiriamojo pavyzdžio paruošimas. Vaistinė augalinė žaliava susmulkinama elektrine smulkintuve. 0,2500 g (0,0001 g tikslumu) orasausės žaliavos dedama į 25 ml talpos kolbutę, užpilama 80 proc. V/V etanoliu iki žymės, šildoma ultragarso vonelėje 60 min. ir filtruojama pro popieriaus filtrą, o po to per membraninį 0,22 µm porų dydžio filtrą („Roth“, Karlsruhe, Vokietija).
Spektrofotometrinis suminio flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis, atitinkantis rutino kiekį, nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgšties aplinkoje. Tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis palygintas su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos dydžiu.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml ekstrakto, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Praėjus 30 min. įpilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės. Absorbcijos dydis matuojamas 10 mm storio kiuvetėje esant bangos ilgiui 407 nm.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml ekstrakto, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir kolbutės turinį praskiedus išgrynintuoju vandeniu iki žymės.
Etaloninio rutino tirpalo tiriamasis ir palyginamasis tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, vietoje ekstrakto naudojant etaloninio rutino tirpalą. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,0125 g bevandenio rutino tirpinant 70 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos kolbutėje.
Flavonoidų kiekis žaliavoje, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais (X), apskaičiuojamas naudojantis formule:
X = 25 100 R VAŽ VAŽ VAŽ R D m D V m , čia:
mR – rutino standarto masė, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti, g;
VVAŽ – ekstrakto tūris, ml;
DVAŽ – ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis;
mVAŽ – žaliavos masė, sunaudota ekstraktui ruošti, g;
DR – etaloninio rutino tirpalo tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.
Flavonoidų kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Analičių išplovimas atliktas naudojant dviejų eliuentų sistemą. Eliucijos gradiento komponentas A – 0,05 proc. trifluoracto rūgšties (TFA) vandeninis tirpalas, komponentas B – acetonitrilas (ACN). Taikytas tiesinis gradiento kitimas. Eliucijos gradientas pateikiamas 1 lentelėje. Naudotas eliuavimo greitis – 1,2 ml/min., injekcijos tūris – 10 μl, termostato temperatūra – 25°C. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analičių bei etaloninių junginių eliucijos trukmės sutapimą prie 360 nm bangos ilgio ir lyginant diodų matricos detektoriumi gautų analičių ir etaloninių junginių UV absorbcijos spektrus 200-600 nm srityje. Kiekybinis flavonoidų nustatymas atliktas išorinio standarto metodu, naudojant kalibracines kreives.
1 lentelė. Judrių fazių gradiento kitimas chromatografinio skirstymo metu
Laikas, min Komponentas A, proc. V/V Komponentas B, proc. V/V
0 → 4 86 14 4 → 19 86 14 19 → 21 75 25 21 → 22 50 50 22 → 23 30 70 23 → 25 30 70 25 86 14
Spektrofotometrinis antioksidantinio aktyvumo nustatymas. Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas ekstrakto tiriamąjį tirpalą veikiant DFPH tirpalu.
Ekstrakto tiriamasis tirpalas ruošiamas paimant tokį ekstrakto tūrį, kurio 1 ml būtų apie 0,01 mg flavonoidų, perskaičiuotų rutinu, ir praskiedžiant iki 1 ml.
0,1 ml ekstrakto tiriamojo tirpalo sumaišoma kiuvetėje su 2,4 ml standartizuotu (ABS=0,8) DFPH tirpalu 80 proc. V/V etanolyje. Spektrofotometru matuojamas mėginio šviesos absorbcijos sumažėjimas prie 523 nm bangos ilgio, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 2 val.).
Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas pagal Trolokso kalibracinės kreivės lygtį: y = -0,0009x + 0,7528; R2 = 0,9973
čia:
x – Trolokso standartinių tirpalų koncentracija, μmol/l; y – absorbcijos dydis.
TEAC reikšmė (X) (µmol/g) apskaičiuojama pagal formulę:
X=
1000 0009 , 0 25 7528 , 0 m V A , čia:A – mėginio šviesos absorbcijos dydis;
V – tiriamajam tirpalui ruošti paimtas ekstrakto tūris, ml; m – ekstraktui ruošti sunaudotas žaliavos kiekis, g.
Laikymo sąlygų įtakos flavonoidų kiekiui ir antioksidantiniam aktyvumui tyrimas. Ožkarožės žolės ekstraktų pavyzdžiai buvo laikomi nevienodomis sąlygomis: vienas pavyzdys buvo laikomas šaldytuve, kitas laikomas kambario temperatūros aplinkoje tamsoje, o trečias – kambario temperatūros aplinkoje šviesoje. Mėginiai sandariai uždaryti, užparafinuoti. Suminis flavonoidų kiekis buvo nustatytas iškart ekstrahavus veikliąsias medžiagas ir po 6 mėn., o antioksidacinė galia įvertinta iškart po ekstrakcijos, po 3 mėn. bei 6 mėn.
Pastaba. Laikymo sąlygų įtaka E. ciliatum mėginio, laikyto kambario temperatūros aplinkoje
šviesoje 6 mėn., flavonoidų kiekiui ir antioksidantiniam aktyvumui nevertinta dėl mėginio tūrio pokyčių.
2.5. Metodikų validacija
Spektrofotometrinio tyrimo metodikos validacija. Flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų tinkamumo pagrindimui buvo pasirinkti šie validacijos parametrai: specifiškumas, glaudumas ir tiesiškumas.
Flavonoidų kiekio nustatymo metodo specifiškumą pagrindžia flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Šios reakcijos metu susidaro stabilūs kompleksai tarp aliuminio chlorido ir C-4 keto bei C-3 ar C-5 hidroksilo grupių, esančių flavonolių struktūroje [13].
Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodo specifiškumą patvirtina DFPH radikalo sąveika su ekstraktu. DFPH radikalas turi laisvą elektroną ir pasižymi ryškiai violetine spalva ties 517 nm bangos ilgiu. Kuomet DFPH radikalas sąveikauja su antioksidantu, jis gauna papildomą elektroną ir praranda savo spalvą. Šie absorbcijos pokyčiai ir yra išmatuojami [3].
Rezultatų glaudumas įvertintas tiriant pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą bei apskaičiuojant variacijos koeficientą. Metodų pakartojamumas suminiam flavonoidų kiekiui ir antioksidacinei galiai buvo apskaičiuotas iš šešių tą pačią dieną atliktų analizių rezultatų, o tarpinis preciziškumas – iš dvi dienas iš eilės atliktų bandinio analizių. Gauti duomenys pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Flavonoidų kiekio ir antioksidacinės galios pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo variacijos koeficientai
Variacijos koeficientas, proc. Metodas
Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas
Flavonoidų kiekis 1,55 6,41
Antioksidantinis aktyvumas 4,89 7,36
Iš gautų rezultatų matyti, kad metodų pakartojamumo variacijos koeficientai neviršija rekomenduojamų 5 proc., o tarpinio preciziškumo variacijos koeficientai – 10 proc. ribos, vadinasi spektrofotometrinių metodų glaudumas atitinka keliamus reikalavimus ir metodai yra tinkami flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimui.
Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodikos tiesiškumas vertintas pagal kalibracinės kreivės charakteristikas. Kalibracija atlikta naudojant etaloninio junginio tirpalus. Trolokso kalibracinė kreivė (3 pav.) gauta skiedžiant pradinį 2,5 mmol/l Trolokso tirpalą 80 proc. V/V etanolyje. Paruošti šešių skirtingų koncentracijų tirpalai, kurių koncentracijų ribos – 0-500 µmol/l. Analizė atlikta tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir nustatant mėginių antioksidacinę galią, vietoje ekstrakto tiriamojo tirpalo naudojant Trolokso standartinius tirpalus.
y = -0,0009x + 0,7528 R2 = 0,9973 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 100 200 300 400 500 600
Trolokso standartinių tirpalų koncentracija, µmol/l
A b s o rb c ij o s d y d is
3 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
Iš gautos kalibracijos kreivės matyti, kad absorbcijos dydžio priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Gradavimo kreivė yra patikima ir gali būti naudojama mėginių antioksidantinio aktyvumo nustatymui, nes regresijos koeficiento R2reikšmė yra artima 1, kas rodo didelę tiesinę priklausomybę.
Flavonoidų kiekio nustatymo metodikos tiesiškumą pagrindžia literatūros šaltinis, kuriame pateiktas rutino kalibracinės kreivės regresijos koeficientas yra 0,9933, o jo aglikono kvercetino – 0,9985 [36].
Chromatografinio tyrimo metodikos validacija. Flavonoidų kiekio nustatymo metodo įteisinimui buvo pasirinkti šie validacijos parametrai: specifiškumas, glaudumas ir tiesiškumas.
Metodo specifiškumui įrodyti kiekvienai smailei chromatogramoje buvo registruojami UV absorbcijos spektrai penkiose smailės vietose (5 pav.). Smailių identifikavimas atliktas palyginant juos su standartų UV absorbcijos spektrais (4 pav.).
4 pav. Standartų absorbcijos spektrai
5 pav. E. hirsutum L. mėginio, rinkto Krikonyse, chromatograma ir analites atitinkantys absorbcijos spektrai
Iš pateiktos chromatogramos matyti, kad mėginio komponentų ir standartų tirpalų spektrai sutampa. Tai įrodo chromatografinio metodo specifiškumą.
Rezultatų glaudumas vertintas pagal standartų kalibracinių kreivių tiesių santykinius standartinius nuokrypius, kurie apskaičiuojami pagal šią formulę:
%RSD(E)= 100
_
Y E
čia:
%RSD(E) – tiesės santykinis standartinis nuokrypis, proc.; E – standartinė klaida:
Ȳ – atsako vidurkis.
Šis kriterijus nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau turėtų būti kuo mažesnis. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Standartų kalibracinių kreivių tiesių santykiniai standartiniai nuokrypiai
Standartas %RSD(E)
Miricitrinas 5,25
Hiperozidas 4,57
Izokvercitrinas 2,54
Tiesiškumui įrodyti sudarytos hiperozido (6 pav.), miricitrino (7 pav.) ir izokvercitrino kalibracinės kreivės (8 pav.), kurios gautos ruošiant penkis analitei tapataus etalono skiedimus. Etaloniniai tirpalai paruošti apytikrėse analičių kiekiui bandinių ekstraktuose koncentracijų ribose. Standartų tirpalų koncentracijų ribos, sulaikymo trukmės, kalibracinių kreivių tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Analičių standartų tirpalų koncentracijų ribos, sulaikymo trukmės, tiesinės regresijos lygtys bei regresijos koeficientai
Analitės standartas Etaloninių tirpalų koncentracijų ribos, ng/10 µl Sulaikymo trukmė, min Kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtis Regresijos koeficientas (R2) Hiperozidas 3,0-96,0 14,749 Y=2,16·103x+5,43·102 0,998648 Izokvercitrinas 6,8-108,9 14,949 Y=1,79·103x-7,58·102 0,999509 Miricitrinas 6,9-110,0 14,089 Y=1,88·103x-3,10·103 0,998032
6 pav. Hiperozido kalibracinė kreivė
8 pav. Izokvercitrino kalibracinė kreivė
Iš gautų kalibracijos kreivių matyti, kad smailių ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Gradavimo kreivės yra patikimos ir gali būti naudojamos mėginių flavonoidų kiekio nustatymui, nes koreliacijos koeficiento R2 reikšmės yra artimos 1, kas rodo didelę tiesinę priklausomybę.
2.6. Duomenų statistinis vertinimas
Statistinis duomenų įvertinimas atliktas „MS Excel 2003“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys statistiškai įvertinti, apskaičiuojant eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį ir standartinę klaidą. Vidurkiai palyginti pritaikius ranginius kriterijus priklausomoms imtims. Koreliacinių ryšių stiprumui nustatyti taikytas Spirmeno koreliacijos koeficientas. Dendrograma pritaikyta skirtingose augavietėse rinktų pavyzdžių ir skirtingų augalo rūšių palyginimui ir grupavimui.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Ekstrakcijos trukmės įtaka. Ekstrakcijos trukmei įvertinti buvo analizuoti 90 proc. V/V etanoliniai bandiniai. Maceracija vykdyta ultragarso vonelėje. Bandiniai ekstrahuoti skirtingais laiko intervalais: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 min. Didžiausia flavonoidų išeiga (2,13±0,03 proc.) nustatyta vykdant ekstrakciją 60 min. Ilginant ekstrakcijos laiką, flavonoidų išeiga mažėja (9 pav.).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Ekstrakcijos laikas, min.
F la v o n o id ų k ie k is , p ro c .
9 pav. Suminis flavonoidų kiekis ožkarožės (Epilobium spp.) žolėje, ekstrakciją vykdant skirtingais laiko intervalais (n=3)
Tirpiklio koncentracijos įtaka. Veikliųjų medžiagų ekstrakcijai iš žaliavos tirpikliu buvo pasirinktas etanolis. Etanolio koncentracijos įtakai įvertinti preliminariai buvo pasirinktas 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ir 96,3 proc. V/V koncentracijos etanolis. Taipogi buvo atlikta ekstrakcija tirpikliu naudojant vandenį. Ekstrakcija buvo vykdoma ultragarso vonelėje 60 min. Nustatyta, kad 80 proc. V/V etanolis užtikrina didžiausią suminio flavonoidų kiekio išeigą (1,83±0,01 proc.), o mažiausias kiekis (0,69±0,02 proc.) gautas ekstrahentu naudojant vandenį (10 pav.).
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Vanduo Etanolis 30 proc. Etanolis 40 proc. Etanolis 50 proc. Etanolis 60 proc. Etanolis 70 proc. Etanolis 80 proc. Etanolis 90 proc. Etanolis 96,3 proc. Ekstrahentas F la v o n o id ų k ie k is , p ro c .
10 pav. Suminis flavonoidų kiekis ožkarožės (Epilobium spp.) žolėje, ekstrakcijai naudojant vandenį ir skirtingos koncentracijos etanolį (n=3)
Nustatytos optimaliausios Epilobium spp. žolės ėminiuose esančių flavonoidų ekstrakcijos sąlygos. Geriausia ekstrakcijos išgava nustatyta vykdant maceraciją ultragarso vonelėje 60 min., ekstrahentu naudojant 80 proc. V/V etanolį ir imant žaliavos ir ekstrahento santykį 1:100.
3.2. Kiekybinis flavonoidų tyrimas Epilobium spp. žolėje
3.2.1. Spektrofotometrinis metodas
Atlikti flavonoidų kiekinės sudėties tyrimai ožkarožės žolės bandiniuose spektrofotometriniu metodu. Rezultatai pateikti 11 paveiksle. Didžiausias flavonoidų kiekis (2,71±0,04 proc.) nustatytas E.
angustifolium žolėje, rinktoje Gulbinuose. Mažiausias flavonoidų kiekis (1,33±0,02 proc.) buvo
sukauptas E. hirsutum žolėje, rinktoje Ceikiniuose. E. hirsutum bandiniuose, surinktuose Krikonyse, esti toks pats flavonoidų kiekis kaip ir E. palustre bandiniuose (2,35±0,01 proc.). Taipogi vienodu flavonoidų kiekiu (1,75±0,01 proc.) pasižymi E. angustifolium ėminiai, auginti Nidoje, su E. ciliatum pavyzdžiais.
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 E. a ngus tifol ium Gul bina i E. a ngu stifo lium Buz arai stis E. h irsut um Juo dkra ntė E. h irsut um Krik ony s E. p alus tre E. tet rago num E. m onta num E. a ngus tifol ium Cei kiniai E. h irsut um Mie lagė nai E. ro seum E. a ngus tifol ium Igna lina E. p arvi floru m E. c iliatu m E. a ngu stifo lium Nida E. h irsut um J uoda galvi ai E. h irsut um Cei kini ai F la v o n o id ų k ie k is , p ro c .
11 pav. Suminis flavonoidų kiekis įvairių rūšių ožkarožės (Epilobium spp.) žolėje, surinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)
Lyginant E. angustifolium žolės ėminius iš skirtingų regionų, suminis flavonoidų kiekis svyruoja nuo 1,75±0,01 proc. iki 2,71±0,04 proc. Didžiausias flavonoidų kiekis aptiktas Gulbinuose rinktuose bandiniuose, o mažiausias – Nidoje ( 12 pav.).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 E. angustifolium Gulbinai E. angustif olium Buzaraistis E. angustif olium Ceikiniai E. angustifolium Ignalina E. angustif olium Nida F la v o no idų k ie k is , p ro c .
12 pav. Suminis flavonoidų kiekis E. angustifolium L. žolėje, surinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)
Vertinant E. hirsutum žolės bandinius, rinktus skirtingose vietovėse, didžiausiu flavonoidų kiekiu (2,43±0,03 proc.) pasižymi ėminys, rinktas Juodkrantėje, o mažiausiu (1,33±0,02 proc.) – rinktas Ceikiniuose (13 pav.).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 E. hirsutum Juodkrantė E. hirsutum Krikonys E. hirsutum Mielagėnai E. hirsutum Juodagalviai E. hirsutum Ceikiniai F la v o n o id ų k ie k is , p roc .
13 pav. Suminis flavonoidų kiekis E. hirsutum L. žolėje, surinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)
E. angustifolium ir E. hirsutum bandinius, rinktus skirtinguose regionuose, vertinant kaip tos
pačios augalo rūšies pavyzdžius ir išvedus jų flavonoidų kiekio vidurkius, didžiausiu flavonoidų kiekiu (2,35±0,01 proc.) pasižymi E. palustre ėminys, o mažiausiu (1,75±0,01 proc.) – E. ciliatum (14 pav.).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 E. p alus tre E. tet ragon um E. m ontanu m E. a ngus tifol ium E. h irsut um E. ro seum E. p arvi florum E. c iliat um F la v o n o id ų k ie k is , p ro c .
14 pav. Suminis flavonoidų kiekis įvairių rūšių ožkarožės (Epilobium spp.) žolėje (n=3)
Apibendrinant gautus tyrimų rezultatus galima teigti, kad didžiausiu flavonoidų kiekiu (2,71±0,04 proc.) pasižymi E. angustifolium rūšis, rinkta Gulbinuose, o mažiausiu (1,33±0,02 proc.) –
E. hirsutum rūšis, rinkta Ceikiniuose. Gauti duomenys rodo, kad skirtinguose Lietuvos regionuose
rinktų tos pačios rūšies Epilobium spp. genties augalų bandiniuose esantis flavonoidų kiekis skiriasi. Šiam skirtumui įtakos gali turėti geografiniai, klimatiniai faktoriai.
Lyginant gautus rezultatus su kitais atliktais tyrimais matyti, kad jie skiriasi nuo literatūroje minimų. M. Tămaş et al. (2009) tyrimai parodė, kad flavonoidų kiekis ožkarožės rūšyse mažėja tokia tvarka: E. hirsutum ir E. montanum kaupia vienodą kiekį flavonoidų, kiek mažiau jų randama E.
