MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS RESVERATROLIO STABILIZAVIMUI IR JŲ KOKYBĖS VERTINIMAS

DARBAS ATLIKTAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Mikroemulsijų pritaikymas resveratrolio stabilizavimui ir jų kokybės vertinimas“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-06 Roberta Šalčiūtė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-06 Roberta Šalčiūtė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-08 lekt. dr. Vaida Kurapkienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-12 prof. dr. Vitalis Briedis

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

ROBERTA ŠALČIŪTĖ

MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS RESVERATROLIO STABILIZAVIMUI IR JŲ KOKYBĖS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Lekt. dr. Vaida Kurapkienė

KAUNAS, 2020

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS RESVERATROLIO STABILIZAVIMUI IR JŲ KOKYBĖS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas

Data

Darbo vadovas

Lekt. dr. Vaida Kurapkienė Data

Darbą atliko Magistrantė Roberta Šalčiūtė Data

KAUNAS, 2020

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Mikroemulsijos ir jų panaudojimo galimybės ... 11

1.1.1. Mikroemulsijos ir jų pritaikymas šviesai jautrių medžiagų stabilizavimui ... 11

1.1.2. Mikroemulsijų klasifikavimas ... 12

1.1.3. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai ... 13

1.2. Mikroemulsijų gamyba ir kokybė vertinimas ... 14

1.2.1. Mikroemulsijų gamybos būdai ... 14

1.2.2. Mikroemulsijų gamybai naudojami komponentai ... 15

1.2.3. Mikroemulsijų kokybės vertinimas ... 18

1.3. Resveratrolis ir jo panaudojimo galimybės ... 19

1.3.1. Resveratrolio biologinis poveikis ... 19

1.3.2. Resveratrolio panaudojimą ribojantys veiksniai ... 20

1.3.3. Mikroemulsijos su resveratroliu ... 21

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1. Tyrimo objektas: ... 23

2.2. Reagentai ir medžiagos ... 23

2.3. Naudota įranga ... 23

2.4. Tyrimo metodai ir metodika ... 24

2.4.1. Resveratrolio tirpumo nustatymas ... 24

2.4.2. Mikroemulsijų gamyba ... 24

2.4.3. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas ... 24

2.4.4. Mikroemulsijų su resveratroliu gamyba ... 25

2.4.5. Mikroemulsijų kokybinių parametrų nustatymas ir vertinimas ... 25

2.4.6. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo nustatymas ... 25

2.4.7. Resveratrolio fotostabilumo mikroemulsijose vertinimas ... 25

2.3.8. Statistinis duomenų vertinimas ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Resveratrolio tirpumo mikroemulsijos komponentuose nustatymas ... 27

3.2. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas ir vertinimas ... 28

3.3. Mikroemulsijų optimizavimas ir kokybės vertinimas ... 30

3.4. Mikroemulsijų su resveratroliu kokybės vertinimas ... 37

3.5. Mikroemulsijų ir mikroemulsijų su resveratroliu fotostabilumo vertinimas ... 40

4. IŠVADOS ... 45

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47

7. MAGISTRO DARBO TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 53

8. PRIEDAI ... 56

SANTRAUKA

R. Šalčiūtės magistro baigiamasis darbas ,,Mikroemulsijų pritaikymas resveratrolio stabilizavimui ir jų kokybės vertinimas“/ mokslinis vadovas lekt. dr. Vaida Kurapkienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: Sumodeliuoti mikroemulsijas, pritaikyti jas resveratrolio stabilizavimui ir įvertinti jų kokybę.

Tyrimo objektas: sumodeliuotos mikroemulsijos be veikliosios medžiagos ir mikroemulsijos su resveratroliu.

Darbo uždaviniai: Parinkti pagalbines medžiagas mikroemulsijų modeliavimui; sumodeliuoti mikroemulsijas, pritaikant eksperimentinį planavimą, ir įvertinti jų kokybę; pritaikyti atrinktas mikroemulsijas resveratrolio įterpimui ir įvertinti sumodeliuotų sistemų kokybinius parametrus; įvertinti resveratrolio fotostabilumą sumodeliuotose mikroemulsijose.

Metodai: Pritaikant titravimo aliejine faze metodą, sumodeliuotos pseudotrinarės fazių diagramos.

Eksperimentiniam planavimui ir optimalių sudėčių atrankai naudotas D-optimalaus dizaino modelis.

Mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas įvertinti dinaminės šviesos sklaidos metodu. Klampa, pH, elektrinis laidis nustatyti fizikiniais-cheminiais analizės metodais. Fotostabilumo tyrimai atlikti sumodeliuotas sistemas veikiant UVB spinduliuote.

Rezultatai: pritaikius eksperimentinį planavimą ir atlikus gautų sudėčių optimizavimą, atrinktos penkios mikroemulsijos su kosurfaktantu etanoliu ir keturios mikroemulsijos su kosurfaktantu poligliceril-6-izostearatu. Mikroemulsijų be resveratrolio vidutinis dalelių dydis buvo nuo 42,36 iki 83,41 nm, PDI – nuo 0,252 iki 0,407, pH vyravo nuo 4,72 iki 7,18, klampa – nuo 28,6 iki 62,2 mPa·s, elektrinis laidis – nuo 4,7 iki 149,98 µS/cm. Įterpus 1 proc. resveratrolio, mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis padidėjo 13,50 – 26,94 proc. o įterpus 2 proc. resveratrolio – 38,54 – 88,30 proc. Po resveratrolio įterpimo visose mikroemulsijose nustatyti homogeniškumo pokyčiai. Kiti mikroemulsijų kokybės parametrai statistiškai reikšmingai nepasikeitė (p < 0,05). Fotostabilumo tyrimo metu nustatyta lėtesnė resveratrolio izomerizacija visose tirtose mikroemulsijose. Didžiausias resveratrolio atsparumas UVB apšvitai nustatytas mikroemulsijoje, sudarytoje iš 60,0 proc. kaprilo/kaproilo makrogolio glicerido/etanolio mišinio (santykis 7:1), 33,4 proc. išgryninto vandens ir 6,60 proc. aliejinės fazės.

Išvados: Eksperimentinio planavimo metu sumodeliuotos ir atrinktos mikroemulsijos pasižymėjo termodinaminiu stabilumu ir atitiko joms keliamus kokybės reikalavimus. Į mikroemulsijas įterpus 1 ir 2 proc. resveratrolio, nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) jų vidutinio dalelių dydžio padidėjimas bei homogeniškumo pokyčiai. Fotostabilumo tyrimo rezultatai įrodė, kad mikroemulsijos padidina resveratrolio atsparumą UVB apšvitai ir išlieka stabilios tyrimo metu.

SUMMARY

R. Šalčiūtė‘s final thesis for master’s degree ,,Application and quality evaluation of microemulsions for stabilisation of resveratrol”/ scientific supervisor lect. dr. Vaida Kurapkienė. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.

Aim of the study: to modelate and apply microemulsions for resveratrol stabilisation and evaluate their quality.

Object of the study: modelled microemulsions without active substance and microemulsions with resveratrol.

Main tasks: to select components for microemulsions modelation, to modelate microemulsions using experimental planning and evaluate their quality parameters, to apply microemulsions for resveratrol incorporation and evaluate quality parameters of modelated systems, to evaluate photostability of resveratrol in modelated microemulsions.

Methods: pseudoternary phase diagrams were constructed using oil titration method. D-optimal design was used for experimental planning and selection of optimal compositions. Mean droplet size and polidispersity index were evaluated using dynamic light scattering method. Viscosity, pH and conductivity were evaluated using physical-chemical methods of analysis. UVB radiation was used for photostability research of modelated systems.

Results: five microemulsions with co-surfactant ethanol and four microemulsions with co-surfactant polyglyceril-6-isostearate were selected after experimental planning and optimisation. Mean droplet size of microemulsions without resveratrol varied between 43.36 and 83.41 nm, PDI values were in the range of 0.252–0.407, pH values were from 4.72 to 7.18, viscosity values were from 28.6 to 62.2 mPa·s, conductivity values were from 4.7 to 149.98 µS/cm. Mean droplet size increased by 13.50 – 26.95 % and 38.54 – 88.30 % after 1 % and 2 % resveratrol incorporation into microemulsions, respectively.

Homogeneity changes were determined after resveratrol incorporation in all selected microemulsions.

Statistically significant change of other quality parameters was not determined (p < 0.05). Photostability study showed that isomerization of resveratrol was slower in all selected microemulsions. The best resveratrol resistance to isomerization caused by UVB irradiation was in microemulsion whose composition is: 60.0 % of capryl/caproyl macrogol glyceride/ethanol mixture (weight ratio 7:1), 33.4 % of aqeous phase and 6.6 % of oily phase.

Conclusions: modelled and selected microemulsions were thermodynamically stable ant comply the requirements of the quality parameters. Statistically significant changes of mean droplet size (p < 0.05) and changes of homogeneity were determined when 1 and 2 % of resveratrol were incorporated into microemulsions. Photostability study results showed that microemulsions increase resveratrol resistance to UVB irradiation and remained stable during study.

PADĖKA

Už palaikymą, nuolatinę pagalbą ir suteiktas žinias, rengiant magistro baigiamąjį darbą ir mokslines publikacijas, noriu padėkoti savo darbo vadovei lekt. dr. Vaidai Kurapkienei. Dėkoju lekt. dr.

Modestui Žiliui už pasiūlytas idėjas bei suteiktą pagalbą rengiant šį mokslinį tiriamajį darbą. Taip pat noriu padėkoti visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui už suteiktus materialinius išteklius ir pagalbą.

SANTRUMPOS

a/v ME– aliejus-vandenyje tipo mikroemulsija v/a ME– vanduo/aliejuje tipo mikroemulsija HLB – lipofilinis – hidrofilinis balansas ME – mikroemulsija

ME-RES – mikroemulsija su resveratroliu IPM – izopropilo miristatas

PGI – poligliceril-6-izostearatas

KKMG – kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridas ET – etanolis

S – surfaktantas KoS – kosurfaktantas

UV – ultravioletinė spinduliuotė

UVB – ultravioletinė spinduliuotė, skleidžianti 290 – 320 nm bangos ilgio spindulius ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

ĮVADAS

Kuriant vietinio arba transderminio poveikio preparatus, susiduriama su veikliųjų medžiagų nestabilumo šviesos poveikyje problema. Atsižvelgdami į tai, kad šviesa gali paveikti veikliosios medžiagos stabilumą, mokslininkai ieško inovatyvių farmacinių formų, kurios pasižymėtų geba stabilizuoti į jas įterpiamas vaistines medžiagas [71].

Tiriamajame darbe buvo pasirinkta modelinė vaistinė medžiaga – resveratrolis, kuri pasižymi jautrumu UV spinduliuotei. Šiam polifenoliniui junginiui būdingas antioksidacinis, priešvėžinis, priešuždegiminis bei antimikrobinis poveikis [64, 72, 83]. Resveratrolio panaudojimą medicinoje riboja prastas biologinis pasisavinimas, kurį sukelia nepakankamas junginio tirpumas, prasta skvarba per biologines membranas, nestabilumas veikiant šviesai arba aukštai temperatūrai ar esant didesniams nei 6,8 pH [38, 84]. Resveratrolio bei kitų vaistinių medžiagų (pavyzdžiui, kvercetino, itrakonazolo), pasižyminčių panašiomis savybėmis (prastu tirpumu, nestabilumu šviesoje), biologinis pasisavinimas gali būti padidinamas parenkant tinkamus nešiklius, pavyzdžiui, mikroemulsijas [70].

Mikroemulsijos yra skaidrios dispersinės sistemos, kurioms būdingas termodinaminis stabilumas, dispersinės fazės dalelių dydis iki 100 nm, o polidispersiškumo indeksas iki 0,400. Šios dispersinės sistemos sudarytos iš lipofilinės ir hidrofilinės fazių bei surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio [15, 18]. Gaminant mikroemulsijas yra labai svarbu parinkti tinkamus komponentus, kad sumodeliuotos dispersinės sistemos būtų stabilios, saugios bei efektyvios jas naudojant. Mikroemulsijos yra laikomos tinkama farmacine forma, dėl šių privalumų: palyginti nesudėtingos gamybos, gebėjimo tirpinti tiek lipofilines, tiek hidrofilines medžiagas bei pernešti ir gerinti jų skvarbą pro biologines membranas, taip padidinant vaistinių medžiagų biologinį pasisavinimą [15]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad mikroemulsijos pasižymi gebėjimu apsaugoti vaistines medžiagas nuo šviesos sukeliamos izomerizacijos arba degradacijos, todėl gali būti pritaikomos šviesai jautrių medžiagų stabilizavimui [42, 70].

Tiriamajame darbe mikroemulsijų sudėčių atrankai buvo pritaikytas eksperimentinis planavimas. Optimizavimo metu buvo atrinktos optimalios mikroemulsijų sudėtys, kurios atitiko mikroemulsijų kokybei keliamus reikalavimus. Sumodeliuotos mikroemulsijos pritaikytos skirtingos koncentracijos (1 ir 2 proc.) veikliosios medžiagos − resveratrolio įterpimui. Fotostabilumo tyrimų metu buvo įvertinta sumodeliuotų mikroemulsijų geba sulėtinti resveratrolio izomerizaciją veikiant UVB spinduliuotei. Šio darbo tikslas buvo sumodeliuoti mikroemulsijas, pritaikyti jas resveratrolio stabilizavimui ir įvertinti jų kokybę.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Sumodeliuoti mikroemulsijas, pritaikyti jas resveratrolio stabilizavimui ir įvertinti jų kokybę.

Uždaviniai:

1. Parinkti pagalbines medžiagas mikroemulsijų modeliavimui.

2. Sumodeliuoti mikroemulsijas, pritaikant eksperimentinį planavimą, ir įvertinti jų kokybę.

3. Pritaikyti atrinktas mikroemulsijas resveratrolio įterpimui ir įvertinti sumodeliuotų sistemų kokybinius parametrus.

4. Įvertinti resveratrolio fotostabilumą sumodeliuotose mikroemulsijose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Mikroemulsijos ir jų panaudojimo galimybės

1.1.1. Mikroemulsijos ir jų pritaikymas šviesai jautrių medžiagų stabilizavimui

Mikroemulsija yra skaidri, termodinamiškai stabili, optiškai izotropinė dispersinė sistema, kurios vidutinis dalelių dydis (VDD) svyruoja nuo 10 iki 100 nm. Mikroemulsijos dažniausiai yra sudarytos iš lipofilinės ir hidrofilinės fazių ir surfaktanto bei kosurfaktanto mišinio [15, 18].

Mikroemulsijos įprastai susidaro spontaniškai be papildomos išorinės energijos, esant optimaliam sudedamųjų komponentų santykiui, priešingai nei emulsijos, kurioms susiformuoti reikalinga energija [2, 15]. Mokslininkai teigia, kad iki šiol žinomos trys mikroemulsijų formavimosi teorijos. Pirmoji teorija vadinama sąsajos (angl. interfacial) arba dvigubos plėvelės teorija. Ja aiškinama, kad mikroemulsija susidaro, kai surfaktantas ir kosurfaktantas sudaro plėvelę tarp vandeninės ir aliejinės fazių lietimosi ribos ir susiformuoja aliejaus lašeliai. Mokslininkai teigia, kad remiantis šia teorija, mikroemulsijų formavimasis priklauso nuo surfaktanto hidrofobinės ir hidrofilinės dalių sąveikos su kitais sistemos komponentais. Pavyzdžiui, jei surfaktanto hidrofobinės grupės yra didesnės už hidrofilines grupes, tai hidrofobinės grupės formuoja didesnę paviršiaus įtemptį ir susidaro vanduo/aliejuje tipo mikroemulsijos [39, 49, 69]. Antroji mikroemulsijų formavimosi terorija – tirpinimo (angl. solubilisation), kuria aiškinama, kad iš micelinės sistemos susidaro mikroemulsija, pamažu didėjant micelėms. Šioje teorijoje mikroemulsijų formavimasis yra paremtas pseudotrinarių fazių diagramų sudarymu [69]. Trečioji – termodinaminė teorija (angl. thermodynamic), kuria teigiama, kad tarp dviejų nesimaišančių skysčių, t.y. vandens ir aliejaus, paviršiaus įtemptis sumažėja iki nulio, spontaniškai susiformuoja dispersinė sistema ir susidariusi neigiama energija lemia sistemos termodinaminį stabilumą [39, 49, 69].

Vienas iš pagrindinių mikroemulsijų kaip dispersinių sistemų kokybės rodiklių yra dispersinės fazės VDD. Mikroemulsijų VDD yra mažesnis nei kitų emulsinių sistemų, pavyzdžiui, makroemulsijų.

Mikroemulsijų lašeliai dažniausiai yra sferinės formos. Jie yra sudaryti iš aliejaus ar vandens, priklausomai nuo mikroemulsijos tipo bei surfaktanto/kosurfaktanto paviršinės plėvelės [45].

Literatūroje teigiama, kad lašelių dydis gali priklausyti nuo surfaktanto molekulių tankio lašelių paviršinėje plėvelėje [15]. Kuo standesnė surfaktanto plėvelė lašelių paviršiuje, tuo lašeliai yra mažesni [15]. Mikroemulsijos laikomos skaidriomis sistemomis, nes mikroemulsijų lašelių dydis yra apie 25 procentus mažesnis už regimosios šviesos bangos ilgį [5].

Mikroemulsijos dažniausiai kuriamos kaip nešikliai, padidinantys vaistinių medžiagų biologinį pasisavinimą ir galintys pernešti vaistines medžiagas į veikimo vietą įvairiais keliais: transderminiu,

derminiu, vietiniu, per burną (per os), intranazaliniu, intraokuliniu, parenteraliniu [18, 51]. Dažniausiai vaistinių medžiagų biologinis pasisavinimas pagerinamas, nes mikroemulsijos padidina veikliųjų junginių tirpumą, geba apsaugoti juos nuo oksidacijos, degradacijos, hidrolizės, šviesos sukeltos izomerizacijos [37].

Kuriant farmacines formas susiduriama su junginių nestabilumo šviesos poveikyje problema, ypač jei jos skirtos vartoti vietiškai arba transderminiu būdu. Šviesa gali paveikti tiek veikliają medžiagą, tiek patį produktą, kuriame yra veiklioji medžiaga. Dėl šių priežasčių, didėja mokslininkų susidomėjimas inovatyvių farmacinių formų, kurios apsaugotų vaistines medžiagas nuo šviesos neigiamo poveikio, kūrimu [71]. Įrodyta, kad mikroemulsijos, pasižyminčios fiziniu ir cheminiu stabilumu, gali apsaugoti vaistines medžiagas nuo aplinkos veiksnių, pavyzdžiui, šviesos [70]. Svarbu, kad pagaminus mikroemulsijas, jų tinkamumas šviesai jautrių medžiagų stabilizavimui būtų įrodytas fotostabilumo, biofarmaciniais ar kitais testais [70].

Mokslininkų Vincetini F. ir kitų atliktame tyrime buvo tiriama kaip mikroemulsija apsaugo antioksidantą kvercetiną nuo skilimo šviesos poveikyje. Tyrime kaip šviesos šaltinis buvo naudoti UV spinduliai. Nustatyta, kad mikroemulsijose kvercetino koncentracija statistiškai reikšmingai nepasikeitė, lyginant su metanoliniu kvercetino tirpalu ir mikroemulsijomis su kvercetinu, kurios nebuvo paveiktos UV spinduliais [74]. Kitas pavyzdys, Tiwari N. ir kitų atliktas tyrimas, kuriame mikroemulsijos su eteriniais aliejais buvo pritaikomos šviesai jautrios medžiagos – itrakonazolo apsaugojimui nuo šviesos sukeltos izomerizacijos. Nustatyta, kad mokslininkų sukurtos mikroemulsijos su cinamono, gvazdikėlių, eugenolio, raudonėlio eteriniais aliejais apsaugo itrakonazolą nuo skilimo UV spindulių poveikyje, lyginant su intrakonazolo tirpalu, kuriame junginys visiškai suskilo per 24 valandas [70].

Apibendrinus mokslinėje literatūroje pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad mikroemulsijos gali būti pritaikomos šviesai jautrių medžiagų stabilizavimui. Įrodyta, jog mikrostruktūriniai nešikliai − mikroemulsijos, gali ne tik padidinti junginių biologinį pasisavinimą, bet ir pagerinti jų farmakokinetines charakteristikas, pavyzdžiui, prailginti vaistinio junginio pusinės eliminacijos laiką [13].

1.1.2. Mikroemulsijų klasifikavimas

Priklausomai nuo mikrostruktūros, mikroemulsijos pagal Winsor gali būti keturių tipų: I, II, III ir IV. I ir II tipo mikroemulsijos yra dvifazės. I tipo mikroemulsijoje nano dydžio aliejaus lašeliai yra pasiskirstę vandenyje, o II tipo mikroemulsijoje atvirkščiai – vandens lašeliai yra pasiskirstę aliejuje. III tipo mikroemulsija – trifazė biištisinė, kurioje yra beveik lygus vandeninės ir aliejinės fazės kiekis. Gali egzistuoti ir IV tipo mikroemulsija, kuri yra monofazė. Mikroemulsijos gali būti skirstomos ir į tris

grupes pagal jų mikrostruktūrą: aliejus/vandenyje tipo (a/v), vanduo/aliejuje tipo (v/a) ir biištisines, priklausomai nuo vyraujančios dispersinės fazės [15, 37, 69]. A/v tipo mikroemulsijose surfaktaktanto ir kosurfaktanto lipofilinės dalys yra nukreiptos į lašelių vidų. V/a tipo mikroemulsijose atvirkščiai – surfaktantų ir kosurfaktantų molekulių lipofilinės dalys nukreiptos į lašelių išorę. Biištisinėse mikroemulsijose komponentai pasiskirstę sluoksniais, tarp kurių yra surfaktanto ir kosurfaktanto molekulių plėvelė [15]. Mikroemulsijų tipai pavaizduoti 1 paveiksle.

1 pav. a) a/v mikroemulsija, b) v/a mikroemulsija, c) biištisinė mikroemulsija

Mikroemulsijų tipas/mikrostruktūra gali lengvai keistis, priklauso nuo temperatūros, surfaktanto prigimties bei jo kiekio [15, 37]. Taip pat veikliųjų junginių tirpumo pagerinimo efektyvumas priklauso nuo mikroemulsijos mikrostruktūros. Gaminant mikroemulsijas reikia atsižvelgti į tai, kad ištirpusios vaistinės medžiagos gali turėti įtakos skirtingų mikrostruktūrų susidarymui.

Lipofilinių medžiagų biologinį pasisavinimą labiau padidina a/v tipo mikroemulsijos, o hidrofilinių – v/a tipo mikroemulsijos [18, 51].

1.1.3. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai

Kuriant mikroemulsijas kaip veikliųjų medžiagų nešiklius, labai svarbu žinoti jų privalumus ir trūkumus [2, 15, 29, 33, 53, 63].

Privalumai:

1) Mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios. Pagamintas mikroemulsijas galima laikyti ilgą laiką, priešingai nei emulsijas, kurios yra mažiau stabilios.

2) Mikroemulsijoms nebūdingas fazių atsiskyrimas, priešingai nei emulsijoms.

3) Mikroemulsijos, padidina vaistinių medžiagų stabilumą dėl mažo dispersinės fazės lašelių dydžio.

4) Mikroemulsijos pagerina vaistinių medžiagų tirpumą, jų skvarbą pro organizmo audinius, apsaugo jas nuo hidrolizės, oksidacijos, degradacijos ir taip padidina jų biologinį pasisavinimą.

5) Mikroemulsijos gali apsaugoti lakius vaistinius junginius nuo išgaravimo.

a b c

6) Įterpus vaistinę medžiagą į mikroemulsiją, galima prailginti jos atpalaidavimą, reguliuoti farmakokinetines savybes.

7) Mikroemulsijos gali būti pritaikomos ir hidrofilinių, ir lipofilinių vaistinių medžiagų pernašai.

8) Mikroemulsijų gamyba pigesnė, dėl mažesnių energijos sąnaudų, lyginant su nanoemulsijomis ir kitomis farmacinėmis formomis.

Trūkumai:

1) Mikroemulsijose naudojami didesni surfaktanto ir kosurfaktanto kiekiai, nei gaminant emulsijas ar nanoemulsijas, todėl (ypač naudojant joninius surfaktantus) gali pasireikšti toksiškumas odai, mikroemulsijas naudojant vietiškai ir transderminiu būdu.

2) Daugelis mikroemulsijų gamyboje naudojamų surfaktantų yra ribojami vartojamui per burną, todėl tenka ieškoti alternatyvių medžiagų gamybai. Kai kurie aliejinės fazės komponentai taip pat nėra tinkami vartojimui per burną.

3) Mikroemulsijos netinkamos vaistinių medžiagų (pavyzdžiui, mineralinių), kurios netirpsta nei hidrofilinėje, nei lipofilinėje terpėje, pernašai. Įterpus tokias medžiagas į mikroemulsiją, gali susidaryti suspensija.

Literatūros analizė parodė, kad siekiant sukurti saugius ir efektyvius mikrostruktūrinius vaistinių medžiagų nešiklius, svarbu išmanyti jų privalumus ir trūkumus. Mikroemulsijos turi daugiau privalumų, nei trūkumų. Pagrindiniai privalumai yra: gebėjimas padidinti vaistinių medžiagų biologinį pasisavinimą, modifikuoti jų farmakokinetiką bei apsaugoti nuo neigiamų aplinkos veiksnių (pavyzdžiui, šviesos). Pagrindinis trūkumas, kad mikroemulsijų gamyboje dažniausiai naudojami dideli surfaktanto kiekiai, dėl ko gali pasireikšti toksinis mikroemulsijų poveikis biologinėms membranoms.

1.2. Mikroemulsijų gamyba ir kokybė vertinimas

1.2.1. Mikroemulsijų gamybos būdai

Mikroemulsijos dažniausiai gaminamos dviem metodais:

1) Fazių titravimo metodu. Taikant šį metodą vaistinė medžiaga ištirpinama aliejuje. šis aliejinis tirpalas maišant homogenizuojamas įdėjus nustatytą kiekį surfaktanto ir kosurfaktanto. Tada, nuolat maišant ant magnetinės maišyklės, pilamas vanduo. Gamyba gali būti vykdoma veikliąją medžiagą pirmiausiai ištirpinant surfaktanto/kosurfaktanto mišinyje. Reikia atsižvelgti į veikliosios medžiagos tirpumą gamyboje naudojamose medžiagose. Gaminant mikroemulsijas šiuo būdu, dažniausiai kartu yra formuojamos ir pseudotrinarių fazių diagramos, kuriomis

remiantis galima lengvai nustatyti mikroemulsijų formavimosi ribas, parinkti komponentų kiekius [36, 69].

2) Fazių inversijos metodu. Taikant šį metodą iš a/v tipo mikroemulsijos, gaunama v/a tipo mikroemulsija, pridedant dispersinės fazės perteklių ar pakeliant temperatūrą. Proceso metu naudojamas nejoninis surfaktantas. Šis metodas pagrįstas fizikiniais dispersinės fazės lašelių pokyčiais. Metodas taikomas rečiau už titravimo lipofiline faze metodą [36, 69].

Nors mikroemulsijos formuojasi spontaniškai esant tinkamam komponentų santykiui, mikroemulsijų formavimąsi gali pagreitinti maišymas ant magnetinės maišyklės ar šildymas [50].

Mikroemulsijų gamyba fazių titravimo metodu yra vykdoma dažniau nei fazių inversijos metodu. Fazių titravimo metodu galima pagaminti tiek a/v tipo, tiek v/a tipo mikroemulsijas.

1.2.2. Mikroemulsijų gamybai naudojami komponentai

Hidrofilinė fazė:

Dažniausiai kaip hidrofilinė fazė mikroemulsijų gamyboje naudojamas vanduo. Jis turi būti dejonizuotas, išgrynintas ar distiliuotas. Į vandeninę fazę gali būti dedami konservantai, jei gaminamą preparatą ruošiamasi laikyti ilgą laiką. Esant poreikiui, gamyboje gali būti naudojami buferiniai tirpalai, kurių pH įprastai yra nuo 7 iki 9, pavyzdžiui, fosfatiniai ar boratiniai tirpalai [63].

Lipofilinė fazė:

Formuojant mikroemulsijas, svarbu parinkti tinkamą lipofilinę fazę, nes ji turi įtakos kitų komponentų, t.y. surfaktanto ir kosurfaktanto, parinkimui bei vaistinės medžiagos skvarbai pro organizmo audinius [25]. Lipofilinė fazė turi būti pasirenkama ir pagal planuojamą įterpti vaistinę medžiagą. Jeigu mikroemulsija bus naudojama kaip lipofilinės medžiagos nešiklis, svarbu patikrinti šios medžiagos tirpumą skirtinguose aliejuose ir gamybai pasirinkti tą, kuriame veikliosios medžiagos ištirpsta daugiausiai [5, 69].

Lipofilinę fazę sudarantys aliejai dažnai klasifikuojami į ilgos, vidutinės ar trumpos grandinės trigliceridus [27]. Pirmenybė mikroemulsijų gamyboje teikiama vidutinės grandinės trigliceridams, dėl mažesnio dvigubų jungčių skaičiaus nei ilgos grandinės trigliceriduose. Dėl mažesnio dvigubų jungčių kiekio sumažėja tikimybė vykti oksidacijai, ilgėja mikroemulsijų tinkamumo vartoti laikas [27].

Lipofilinė fazė padeda joje ištirpusioms vaistinėms medžiagoms skverbtis pro audinių lipidinį barjerą [5]. Didesnė skvarba pro audinius pasiekiama, jei mikroemulsijų gamyboje naudojami trumpos ar vidutinės grandinės angliavandeniliai, mažesnė – jei ilgos grandinės angliavadeniliai. Nesočiosios ir sočiosios riebiosios rūgštys yra daugiausiai ištirtos ir pasižymi skvarbą pro odą gerinančiomis

savybėmis. Jeigu su nesočiosiomis ir sočiosiomis riebiosiomis rūgštimis pagaminti preparatai vartojami vietiškai, šios rūgštys lengvai pripildo tarpus tarp odos raginio sluoksnio (stratum cornemum) ląstelių.

Dažniausiai mikroemulsijų gamyboje naudojamos riebiosios rūgštys [5, 69]:

 Riebiosios sočiosios rūgštys: laurino rūgštis, miristo rūgštis, kaprilo rūgštis.

 Riebiosios nesočiosios rūgštys: oleino rūgštis, linoleino rūgštis, linolino rūgštis.

 Riebiųjų sočiųjų ir nesočiųjų rūgščių esteriai: lauro, miristo, oleino rūgščių metilo, etilo, propilo, izopropilo esteriai. Vienas iš populiariausių esterių naudojamų mikroemulsijų gamyboje yra izopropilo miristatas. Dėl hidrofobinės prigimties šis junginys gali pakeisti audinių struktūrą taip pagerinant veikliųjų junginių skvarbą. Pavyzdžiui, lyginant su metilo lauratu ir izopropilo lanolatu, izopropilo miristatas pasižymi geresnėmis skvarbą gerinančiomis savybėmis. Svarbu, kad naudojant šį junginį vaistiniuose preparatuose, jis nesukelia reikšmingų pH pokyčių [52, 81]

Aliejai taip pat gali būti klasifikuojami į natūralius, pusiau sintetinius ir sintetinius [27]. Šiuo metu mikroemulsijų gamyboje plačiausiai naudojami pusiau sintetiniai ir natūralūs aliejai, kuriuos geriausiai derinti su nejoniniais surfaktantais [77]. Nors siekiama, kad natūralūs aliejais būtų kuo plačiau pritaikomi gamyboje, tačiau jų panaudojimą riboja tai, kad jie yra mažiau stabilesni nei pusiau sintetiniai aliejai, galintys turėti ir surfaktanto savybių [5].

Surfaktantas:

Surfaktantas – paviršinio aktyvumo medžiaga, kuri mikroemulsijose sumažina paviršiaus įtemptį ir padeda formuotis dispersinei fazei. Renkantis surfaktantą, svarbu atsižvelgti į jo hidrofilinį – lipofilinį balansą (HLB). Jei HLB reikšmė < 12, surfaktantas formuoja v/a tipo mikroemulsiją, jei HLB reikšmė > 12 − formuojama a/v tipo mikroemulsinė sistema. Surfaktantai, kurių hidrofilinis – lipofilinis balansas labai didelis, veikia kaip kosurfaktantai. Renkantis surfaktantą, svarbu atsižvelgti į tai, kad ilginant surfaktanto anglies atomų grandinę, didėja toksiškumas žmogaus organizmui [5, 17, 69].

Dauguma mikroemulsijų formuojamos naudojant nejoninius surfaktantus, nes jie pasižymi sąlyginai mažu toksiškumu [15]. Mikroemulsijų gamyboje gali būti naudojami ir katijoniai, anijoniniai, zviterioniniai surfaktantai, tačiau jie pasižymi dideliu toksiškumu žmogaus organizmui, todėl naudojami rečiau. Iš nejoninių surfaktantų pastaruosius kelerius metus dažniausiai naudojami: Tween 20®, Tween 40®, Tween 60®, Tween 80®, kremoforas (makrogolglicerolio ricinoleatas − ricinos aliejaus darinys), Transcutol® (dietilenglikolio monoetilo eteris), Labrasol® (kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridas) [15, 69]. Labrasol® ypač plačiai naudojamas mokslininkų. Šis surfaktantas nesukelia toksiškų reakcijų, vartojant su juo pagamintą preparatą ant odos, jei parenkamas tinkamas surfaktanto procentinis kiekis mikroemulsijoje [5]. Taip pat mokslininkai tiria natūralių surfaktantų, pasižyminčių dar mažesniu toksiškumu, pritaikymą. Dažniausiai naudojamas natūralus surfaktantas − lecitinas [15, 69].

Sharma A., Garg T. ir kitų mokslininkų atliktas tyrimas įrodo, kad galima naudoti modifikuotus surfaktantus, kuriuose propileno oksido ar polietileno oksido grupės įterpiamos tarp surfaktanto hidrofilinės galvutės ir hidrofobinės uodegos. Tada surfaktantas pasižymi ypač stipriomis paviršiaus įtempimą sumažinančiomis ir vaistinių medžiagų tirpumą gerinančiomis savybėmis [63]. Svarbu, kad trumpesnės anglies grandinės surfaktantai formuoja didesnius lašelius v/a tipo mikroemulsijose ir gali lemti lašelių tarpusavio sąveikas, kurios pablogina mikroemulsijų stabilumą. Dėl šios priežasties geriau yra rinktis ilgesnės anglies grandinės surfaktantus [15].

Surfaktantai gali būti klasifikuojami į hidrofilinius ir lipofilinius. Dažniausiai mikroemulsijoms gaminti naudojami hidrofiliniai surfaktantai. Lipofiliniai surfaktantai naudojami rečiau, dažniausiai gaminant a/v tipo mikroemulsijas [27].

Formuojant mikroemulsijas, svarbu parinkti tinkamą surfaktakto santykinį kiekį su kitais komponentais. Didelės surfaktanto koncentracijos, ypač vartojant per burną ir intraveniškai, gali sukelti hemolizę ar histopatologinius pakitimus žmogaus organizme [28]. Vartojant mikroemuslijas su dideliu surfaktanto kiekiu (didesniu nei 70 proc.) vietiškai arba transderminiu būdu, gali pasireikšti toksiškumas odai [83].

Kosurfaktantas:

Kosurfaktantai – junginiai, kurie padeda formuoti mikroemulsiją [69]. Kosurfaktanto molekulės adsorbuojasi aliejaus vandens sąlyčio paviršiuje, įsiterpia tarp surfaktanto molekulių ir didina dispersinės fazės stabilumą bei lašelių tvirtumą [8]. Kosurfaktantai gali būti natūralūs ir sintetiniai.

Natūralių kosurfaktantų pavyzdžiai: lecitinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilglicerolis. Sintetinių kosurfaktantų pavyzdžiai: etanolis, izopropanolis, propanolis, transkutolis, propilenglikolis, poligliceril- 6-izostearatas (Plurol® Isostearique) [53, 63].

Mokslinės literatūros analizė parodė, kad kaip kosurfaktantai dažniausiai naudojami trumpos ir vidutinės grandinės alkoholiai [27, 53]. Naudojant trumpos grandinės alkoholius, pavyzdžiui, etanolį, galima padidinti prastai tirpių vaistinių medžiagų tirpumą ir mikroemulsijų formavimosi sritį pseudotrinarėje fazių diagramoje [34]. Priklausomai nuo pasirinkto kosurfaktanto, gali būti suformuojamas mažesnis ar didesnis mikroemulsijų susidarymo plotas. Derinant kelis kosurfaktantus, tai pat gali didėti pseudotrinarių fazių diagramoje užimama mikromemulsijų susidarymo zona [44].

Egzistuoja didelis kiekis aliejų, surfaktantų ir kosurfaktantų, kurie galėtų būti naudojami mikroemulsijų gamyboje, tačiau jų panaudojimą riboja galimas toksiškumas žmogaus organizmui arba nežinomas veikimo mechanizmas [5]. Nuo mikroemulsijų gamyboje naudojamų komponentų gali priklausyti, koks kiekis vaistinių medžiagų bus atpalaiduojamas ir kokiu dažniu [18]. Tinkamų komponentų ir jų kiekio parinkimas yra kritiškai svarbus norint suformuoti saugias naudoti, stabilias

dispersines sistemas, kurių lašelių dydis ir homogeniškumas atitiktų mikroemulsijoms keliamus reikalavimus.

1.2.3. Mikroemulsijų kokybės vertinimas

Modeliuojant mikroemulsijas, svarbu įvertinti jų kokybę. Įprastai, vertinant mikroemulsijas, taikomi fizikiniai-cheminiai ar instrumentiniai analizės metodai.

 Mikroemulsijų vertinimas vizualiai. Mikroemulsijos įvertinamos vizualiai pirminiame kokybės vertinimo etape. Svarbu įvertinti pagamintų dispersinių sistemų skaidrumą, homogeniškumą (fazių atsiskyrimo nebuvimą) [7]. Nustačius neatitikimus reikalavimams, tokios dispersinės sistemos nėra laikomos mikroemulsijomis.

 Termodinaminio stabilumo vertinimas. Termodinaminis stabilumas dažniausiai įvertinamas vykdant šildymo-šaldymo (angl. heating-cooling) ir užšaldymo-atšildymo (angl. freeze-thaw) testus [43]. Mikroemulsijomis galima vadinti tas dispersines sistemas, kurios įvertinamos kaip termodinamiškai stabilios – t.y. joms nebūdingas fazių atsiskyrimas esant temperatūros pokyčiams [15].

 Mikroemulsijų VDD ir polidispersiškumo indekso (PDI) nustatymas. Kuriant mikroemulsijas labai svarbu nustatyti dispersinės fazės VDD ir PDI. PDI parodo sistemos homogeniškumą [55]. Remiantis VDD ir PDI duomenimis, galima įvertinti mikroemulsijų stabilumą, prognozuoti dispersinės sistemos gebėjimą skverbtis pro biologines membranas ar pernešti vaistines medžiagas į veikimo vietą [27]. Dažniausiai VDD ir PDI nustatymui naudojami dinaminės šviesos sklaidos ar mikroskopiniai metodai [1]. Dinaminės šviesos sklaidos metodas dar vadinamas fotonų koreliacijos spektroskopija. Taikant šį metodą yra analizuojami krentančios lazerio šviesos intensyvumo svyravimai. Šie svyravimai atsiranda, šviesai praeinant pro daleles, kurioms būdingas Brauno judėjimas. Mikroskopiniai analizės metodai yra taikomi rečiau nei dinaminės šviesos sklaidos metodas. Taikant mikroskopinį metodą, yra padaromos aukštos kokybės mikrostruktūrinių sistemų nuotraukos, pagal kurias vertinamos mikroemulsijos.

Dažniausiai naudojami aukštos rezoliucijos transmisijos elektronų mikroskopai [50]. Metodai turi ir panašumų: abiejų metu galima įvertinti tiriamų dispersinių sistemų VDD ir PDI.

 pH, klampos, reologinių savybių ir elektrinio laidumo nustatymas. Svarbu nustatyti mikroemulsijų pH vertę, nes nuo pH gali priklausyti mikroemulsijos stabilumas. pH gali sąlygoti ir įterpiamos vaistinės medžiagos stabilumą. Jeigu pH nėra optimalus įterpiamai modelinei medžiagai, pastaroji gali prarasti terapinį aktyvumą (dėl skilimo, izomerizacijos) [48].

Reologinės mikroemulsijų savybės priklauso nuo mikroemulsijos tipo ir ją sudarančių komponentų procentinio santykio bei nuo tarpusavio sąveikos tarp komponentų, naudojamų gamyboje. Didžiausią įtaką reologinėms savybėms daro aliejinės fazės ir surfaktanto prigimtis bei kiekis. Pavyzdžiui, mažėjant surfaktanto/kosurfaktanto kiekiui, didėja įtemptis tarp aliejinės ir vandeninės fazių ir klampa gali padidėti [50]. Klampos nustatymas yra atliekamas viskozimetrais. Remiantis klampos rezultatais, galima prognozuoti kaip vaistinės medžiagos bus atpalaiduojamos iš mikroemulsinių sistemų [50].

Elektrinio laidžio matavimai atliekami naudojant konduktometrus. Remiantis elektrinio laidžio verte, galima nustatyti mikroemulsijos tipą, struktūrą bei komponentų įtaką mikroemulsijos tipo pasikeitimams [73]. Jeigu elektrinis laidis yra didelis, tai parodo, kad mikroemulsijos dispersinę fazę sudaro vanduo, o jei laidis mažas – dispersinę fazę sudaro aliejus.

Laidžio matavimas gali leisti nustatyti sistemos pokyčius stabilumo tyrimų metu [48, 50, 73] .

 Kiti kokybės vertinimo testai:

Mikroemulsijų tipo nustatymas dažymo metodu. Naudojami dažai: vandenyje tirpus dažas metileno mėlynasis ir aliejinėje fazėje tirpus dažas – Sudan III. Pagal atitinkamą dažų pasiskirstymą dispersinėje terpėje ir dispersinėje fazėje, sprendžiama apie mikroemulsijos tipą.

Pavyzdžiui, jei Sudan III dažas nudažo lašelius, vertinama, kad mikroemulsija yra a/v tipo [61].

Zeta potencialo nustatymo testas atliekamas dinaminės šviesos sklaidos metodu. Zeta potencialas parodo lašelių paviršiaus krūvį. Pavyzdžiui, jei lašelių paviršiui būdingas silpnai neigiamas krūvis, galima prognozuoti, kad dispersinės fazės lašelių agregacija nevyks, mikroemulsija bus stabili. [50].

1.3. Resveratrolis ir jo panaudojimo galimybės

1.3.1. Resveratrolio biologinis poveikis

Resveratrolis (3,4',5-trihidroksi-trans-stilbenas) – tai polifenolinis junginys, kurio molekulinė masė 228,25 g/mol, log _/ = 3,32, lydymosi temperatūra − 254 °C. Resveratrolio molekulinė masė nedidelė, todėl junginys kaupiasi daugiau nei septyniasdešimties rūšių augaluose kaip medžiaga, apsauganti nuo mikroorganizmų, grybelinių infekcijų [6, 60, 64]. Resveratrolis randamas tamsiosiose uoguose (vynuogėse, spanguolėse, serbentuose, mėlynėse, braškėse, avietėse), slyvose, žemės riešutuose, pistacijose. Junginio gausu ir iš raudonųjų vynuogių gaminamame raudonajame vyne [60, 64]. Farmacijos pramonėje dažniausiai naudojamas biotechnologiniu ar cheminės sintezės būdu gautas resveratrolis [60]. Resveratroliui būdingi šie poveikiai:

 Antimikromibinis veikimas. Pavyzdžiui, resveratroliui yra būdingas antimikrobinis aktyvumas prieš HSV-1 ir HSV-2 virusus [4]. Resveratroliui būdingas ir bakteriostatinis poveikis prieš gram teigiamas bakterijas (pavyzdžiui, Staphylococcus aureus) [57].

 Antioksidacinis veikimas [64]. In vitro tyrimų metu įrodyta, jog resveratrolis pasižymi 17 kartų stipresniu antioksidaciniu veikimu, nei, pavyzdžiui, sintetinis kofermentas Q10 (idobenonas) ar vitaminai E ir C [9]. Resveratrolis gali apsaugoti žmogaus odą nuo ultravioletinės spinduliuotės sukelto oksidacinio streso [54, 60].

 Priešvėžinis veikimas. Nustatyta, kad atitinkamos resveratrolio dozės gali slopinti vėžinių ląstelių angiogenezę, proliferaciją, skatinti apoptozę, autofagocitozę [72]. Mokslininkai teigia, kad resveratrolis galimai slopina auglio plitimą, augimą, metastazavimą. Šiuo metu nustatyta, jog resveratrolis aktyvus tik prieš tam tikrus vėžio tipus, pavyzdžiui, krūties ir odos, bet gali sukelti stiprius šalutinius poveikius, jei yra vartojamas sergant kraujo vėžiu [6, 10, 72].

 Profilaktinis poveikis sergant neurologiniais susirgimais bei širdies ir kraujagyslių ligomis [6, 10]. Nustatyta, kad resveratrolis gali turėti prevencinį poveikį aterosklerozės, hipertenzijos, Alzheimerio ligos vystymuisi. In vitro tyrimų metu įrodytas teigiamas antiagregacinis resveratrolio poveikis, kuris yra svarbus miokardo infarkto arba išeminio insulto profilaktikai [10].

 Priešuždegiminis veikimas. Įrodyta, kad resveratrolis gali sumažinti prostaglandinų − junginių sukeliančių uždegimą, sintezę. Dėl šios priežasties vietinio poveikio preparatai su resveratroliu yra tinkami vartoti periodontinių ligų, psoriazės gydymui [41,83].

 Žaizdų gijimą skatinantis veikimas. Ilgai vietiškai vartojamas resveratrolis gali greitinti odos žaizdų gijimą, skatindamas epidermio, plaukų folikulų atsinaujinimą, kolageno gamybą, gerindamas kraujotaką. Atlikti moksliniai tyrimai parodė, kad resveratrolis gali paskatinti kaulinio audinio gijimą, sumažinti gijimo laiką arba sumažinti dėl diabeto atsiradusių kojų opų dydį [16, 80].

1.3.2. Resveratrolio panaudojimą ribojantys veiksniai

Nepaisant resveratrolio plataus biologinio poveikio, jo panaudojimas yra ribotas. Pagrindinė to priežastis yra prastas biologinis pasisavinimas [20]. Blogą biologinį pasisavinimą lemia: prasta skvarba per biologines membranas, nestabilumas (fotoizomerizacija) veikiant šviesai, aukštai temperatūrai ar esant neoptimaliam, didesniam nei 6,8, pH. Didžiausią įtaką resveratrolio farmakokinetiniam profiliui ir terapiniam indeksui daro šviesos poveikis, kai veikiant šviesai trans-resveratrolis tampa cis-resveratroliu [38, 84]. Šis junginys pasižymi žymiai silpnesniu biologiniu poveikiu nei trans-resveratrolis.

Resveratrolio izomerizacija pavaizduota 2 paveiksle. Trans-resveratrolio izomerizaciją gali sukelti dienos šviesa, dirbtinė šviesa ar UVB, UVA, UVC spinduliai. Kuo ilgiau junginį veikia šviesa, tuo daugiau cis-resveratrolio susidaro [47]. Mokslinėje literatūroje teigiama, kad trans-resveratroliui būdingi keli izomerizacijos mechanizmai. Vienas iš pagrindinių mechanizmų yra tiesioginė izomerizacija veikiant šviesai [26].

2 pav. Resveratrolio izomerizacija

Vis dėlto šviesa, pH ir temperatūra nėra vieninteliai veiksniai, galintys pakeisti resveratrolio biologinį efektyvumą. Vartojant ant odos ir junginiui prasiskverbus pro raginį sluoksnį (stratum corneum) bei pasiekus epidermį, jis gali būti suardomas nefermentinės transformacijos metu arba veikiant pirmos ir antros metabolizmo fazių fermentams, todėl resveratrolis tampa biologiškai neaktyvus [60].

Atsižvelgiant į galimą trans-resveratrolio nestabilumą, svarbu apsaugoti jį nuo aplinkos veiksnių neigiamo poveikio ir padidinti šio junginio biologinį pasisavinimą, taip užtikrinant geresnį jo pritaikomumą medicinoje. Siekiant spręsti šią problemą, būtina kurti naujus mikrostruktūrinius nešiklius, pavyzdžiui, mikroemulsijas.

1.3.3. Mikroemulsijos su resveratroliu

Analizuojant mokslinę literatūrą, galima rasti daug pavyzdžių apie mikroemulsijų pritaikymo galimybes gerinant resveratrolio skvarbą į odą, padidinant šio junginio stabilumą:

 Mokslininkai Yutani R., Kikuchi T. ir kiti pagamino a/v tipo mikroemulsiją su surfaktantu sukrozės lauratu, kuri pagerino resveratrolio biologinį pasisavinimą. Tyrimo rezultatai parodė, kad mokslininkų pagaminta mikroemulsija padidino resveratrolio skvarbą į epidermį (19 kartų) ir dermą (15 kartų), lyginant su mikroemulsijomis, kurioms gaminti kaip surfaktantas naudotas

Tween 80. Darbe teigiama, kad mikroemulsija su surfaktantu sukrozės lauratu ateityje gali būti perspektyvus resveratrolio nešiklis į odą, ypač dermą [58].

 Mokslininkai Juškaitė V. ir kiti suformulavo termodinamiškai stabilias mikroemulsijas su surfaktantu kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridu, kosurfaktantu poligliceril-6-izostearatu bei aliejine faze etilo oleatu. Mokslininkai įrodė, kad mikroemulsijos, kuriose surfaktanto/kosurfaktanto santykis yra 5:1, reikšmingai padidina resveratrolio skvarbą į odą ex vivo [31].

 Japonijos mokslininkams pavyko pagaminti mikroemulsijas, kurios ateityje galėtų būti perspektyvus resveratrolio nešiklis. Mikroemulsijos buvo gamintos su surfaktantu, sočiosios rūgšties esteriu – sukrozės oleatu. Tyrimo rezultatai parodė, kad mikroemulsijų sudedamieji komponentai, gali pakeisti odos raginio sluoksnio (stratum corneum) struktūrą ir taip pagerinti skvarbą į odą. Resveratrolio skvarba į odą iš mikroemulsijų, tiesiogiai priklausė nuo mikroemulsijose esančios resveratrolio koncentracijos [79].

 Xia L. ir kiti mokslininkai vykdydami tyrimus, pritaikė mikroemulsijas su rožių, jazminų ir citrinų eteriniais aliejais reikšmingai padidinant trans-resveratrolio tirpumą ir fotostabilumą.

Nustatyta, kad mikroemulsijos su rožių ir jazminų eteriniais aliejais gali apsaugoti resveratrolį nuo izomerizacijos, taip padidinant jo antioksidacinį aktyvumą ir reikšmingai apsaugoti žmogaus odos ląsteles - keratinocitus nuo UVB spindulių poveikio [41].

Atlikus mokslinės literatūros analizę nustatyta, kad jau yra sumodeliuotų mikroemulsijų su resveratroliu. Tačiau tikslinga atlikti naujų mikroemulsijų gamybai naudojamų komponentų paiešką bei atranką, modifikuoti jų kiekius, siekiant sumodeliuoti naujus, stabilius mikrostruktūrinius nešiklius. Šių nešiklių modeliavimas leistų dar efektyviau apsaugoti resveratrolį nuo fotoizomerizacijos bei padidintų šio junginio skvarbą pro biologines membranas.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas:

2.2. Reagentai ir medžiagos

 Izopropilo miristatas įsigytas iš Alfa Aesar GmbH & Co KG (Karlsruhe, Vokietija).

 Kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas (Labrasol®) – iš Gattefosse Saint–Priest (Prancūzija).

 Poligliceril-6-izostearatas (Plurol® Isostearique) – iš Gattefosse Saint–Priest (Prancūzija).

 Etanolis (96 proc.) gautas iš AB „Vilniaus degtinė“ (Vilnius, Lietuva).

 Resveratrolis – iš Naturex (Avignon, Prancūzija).

 Išgrynintas vanduo

2.3. Naudota įranga

Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)

Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA® C–MAG HS 7, IKA® – Werke GmbH &

Co.KG, Vokietija)

ZetaSizer Nano ZS aparatas (Malvern Instruments, Ltd., Jungtinė Karalystė)

pH–metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija))

Vibracinis viskozimetras (Vibro viscometer SV–10, A&D Company Ltd., Japonija) Konduktometras (Cond 3110 SET 1, Vokietija)

Termostatinė purtyklė (GFM, Vokietija)

Centrifuga Eppendorf C5810R (Hamburgas, Vokietija)

UV lempa MRL-58 Multiple-Ray (Ultra-Violet Products Ltd, Jungtinė Karalystė) UVX radiometras (Ultra-Violet Products Ltd, Jungtinė Karalystė)

2.4. Tyrimo metodai ir metodika

2.4.1. Resveratrolio tirpumo nustatymas

Resveratrolio miltelių perteklius buvo pridėtas į surfaktanto/kosurfaktanto (S/KoS) mišinius (S/KoS santykis 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ir 7:1). S/KoS mišinių masė 10,0 g. Naudotas surfaktantas kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridas ir kosurfaktantai poligliceril-6-izostearatas bei etanolis (96 proc.). Mėgintuvėliai termostatinėje purtyklėje buvo purtomi 72 valandas, 37 ± 1 °C temperatūroje. Po inkubacijos mėgintuvėliai buvo centrifuguojami naudojant centrifugą 6000 aps/min greičiu.

Centrifugavimo laikas − 10 min. Po centrifugavimo paimtas tikslus kiekis tirpalo, kuris buvo skiestas etanoliu. Mėginiai filtruoti pro membraninį (0,22 μm) filtrą. Ištirpęs resveratrolio kiekis nustatytas Klinikinės farmacijos katedroje išvystytu ir validuotu efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu [41, 65].

2.4.2. Mikroemulsijų gamyba

Kaip lipofilinė fazė naudotas izopropilo miristatas, kaip surfaktantas (S) – kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridas, kaip kosurfaktantai (KoS) naudoti poligliceril-6-izostearatas ir etanolis.

Išgrynintas vanduo naudotas kaip hidrofilinė fazė. Mikroemulsijos (ME) be veikliosios medžiagos buvo gaminamos maišant išgrynintą vandenį, S/KoS mišinį ir aliejinę fazę ant magnetinės maišyklės. Po gamybos, ME paliktos 24 valandų ekvilibracijai.

2.4.3. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas

Pseudotrinarių fazių diagramos sumodeliuotos siekiant nustatyti ME susidarymo ribas ir įvertinti komponetų įtaką ME formavimuisi [29]. Eksperimentinės ME buvo pagamintos titravimo lipofiline faze metodu (angl. oil titration method) [79]. ME gamybai naudoti skirtingi S/KoS santykiai:

1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ir 7:1. ME gamyba atlikta 20−25°C temperatūroje, išgrynintą vandenį sumaišant su paruoštais skirtingų S/KoS santykių mišiniais. S/KoS mišinių ir išgryninto vandens santykiai buvo 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1. Į paruoštus mišinius mažais kiekiais lašintas izopropilo miristatas, nuolat maišant ant magnetinės maišyklės. Mėginiai vertinti vizualiai, o procedūra vykdyta iki sistemos susidrumstimo. Fiksuotas tikslus sulašinto aliejaus kiekis. Apskaičiuoti komponentų procentiniai kiekiai pažymėti pseudotrinarėse fazių diagramose.

2.4.4. Mikroemulsijų su resveratroliu gamyba

Resveratrolis tirpinantas S/KoS mišinyje nuolat maišant ant magnetinės maisyklės 20−25 °C temperatūroje. Ištirpus veikliajai medžiagai, pridėtas reikiamas kiekis izopropilo miristato ir išgryninto vandens. Toliau vykdytas maišymas naudojant magnetinę maišyklę. Maišymo trukmė − 10 min, maišymo greitis − 2000 aps/min. Mėginiai gaminimo metu nuo šviesos buvo apsaugoti folijos sluoksniu.

2.4.5. Mikroemulsijų kokybinių parametrų nustatymas ir vertinimas

Pradinis pagamintų ME kokybės vertinimas atliktas vizualiai – laikytasi kriterijaus, kad pagamintos ME turi likti skaidrios, neturi būti fazių atsiskyrimo.

VDD, PDI ir smailių skaičius matuoti naudojant dinaminės šviesos sklaidos metodą su Zetasizer NanoZS aparatu. Klampa matuota su vibraciniu viskozimetru, pH – su pH-metru, elektrinis laidis – su konduktometru. Visi matavimai atlikti esant 25 °C temperatūrai ir praėjus ME ekvilibracijos laikui (24 val. po ME pagaminimo) [56]. Kiekvienas matavimas atliktas 3 skirtingoms ME serijoms (n

= 3).

2.4.6. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo nustatymas

Atlikti 3 šildymo-šaldymo (angl. heating-cooling) ir 3 užšaldymo-atšildymo (angl. freeze-thaw) ciklai [43]. Atliekant šildymo-šaldymo ciklus, ME perkeltos iš termostato, kuriame palaikoma 45°C temperatūra, į šaldytuvą, kuriame palaikoma 4°C temperatūra. Po šildymo-šaldymo ciklų pabaigos, buvo atlikti užšaldymo-atšildymo ciklai. Atliekant užšaldymo-atšildymo ciklus, ME perkeltos iš šaldiklio, kuriame palaikoma -21°C temperatūra, į termostatą, kuriame palaikoma 25°C temperatūra. Kiekviename cikle ME laikytos po 48 valandas. ME kokybė vertinta vizualiai kiekvieno ciklo pabaigoje. Stebėta, ar nėra susidrumstimo, nuosėdų susidarymo, fazių atsiskyrimo. Tik tos ME, kurios išliko skaidrios, buvo perkeliamos į kitą ciklą.

2.4.7. Resveratrolio fotostabilumo mikroemulsijose vertinimas

Veikliosios medžiagos fotostabilumo vertinimas atliktas veikiant UVB spinduliuote. Tikslus kiekis tiriamojo mėginio buvo patalpintas į chemines stiklinėles, kurios buvo padėtos 15 cm atstumu

nuo UVB spindulių (290-320 nm bangos ilgio) šaltinio. Mėginių švitinimui naudota UV lempa ir palaikytas < 1 mW/cm UVB spinduliuotės intensyvumas [42]. UVB spinduliuotės intensyvumas išmatuotas naudojant UVX radiometrą. Tyrimas vykdytas 20-25 °C temperatūroje. Tyrimo metu mėginiai saugoti nuo kitų papildomų šviesos šaltinių. Mėginių veikimo UVB spinduliuote trukmė – 4 valandos. Mėginiai tyrimams imti po 15, 30, 60, 120 ir 240 min. Paimti mėginiai skiesti su etanoliu (96 proc.) ir filtruoti pro membraninį (0,22 μm) filtrą. Trans-resveratrolio izomerizacija į cis-resveratrolį bei kiekybinis jo nustatymas vykdytas naudojant Klinikinės farmacijos katedroje išvystytą ir validuotą ESC metodiką. Tyrimo pabaigoje po 240 min. vertintas tiriamųjų ME VDD ir PDI. Kontrolei naudotos ME be resveratrolio [21, 76].

2.3.8. Statistinis duomenų vertinimas

Eksperimentinis planavimas ir optimizavimas atlikti pritaikant D-optimalų dizaino modelį, naudojant Design-expert 12 programą. Tyrimų metu gautų duomenų statistinė analizė atlikta naudojant SPSS 20 statistinės analizės programą ir ,,Microsoft Office Excel 2010. Taikyti vieno faktoriaus dispersinės analizės (angl. One-Way ANOVA) ir blokuotų duomenų vieno faktoriaus dispersinės analizės (angl. Repeated Measures ANOVA) modeliai. Skaičiuoti Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientai.

Statistinio reikšmingumo lygmuo p < 0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1. Resveratrolio tirpumo mikroemulsijos komponentuose nustatymas

Vykdant eksperimentinių ME modeliavimą, pirmiausiai atliktas modelinės vaistinės medžiagos resveratrolio tirpumo tyrimas pasirinktuose ME komponentuose. Įvertinus mokslinėje literatūroje pateiktus duomenis, kaip S naudota nejoninė paviršinio aktyvumo medžiaga kaprilo/kaproilo makrogolio gliceridas (KKMG), nes resveratrolio tirpumas šiame tirpiklyje yra geras: 83,85 ± 7,66 (mg/g) [30]. Kaip KoS tyrimui pasirinkti alifatinis alhoholis etanolis ir poligliceril-6-izostearatas (ET ir PGI). Resveratrolio tirpumas vertintas skirtingų S/KoS santykių (kaprilo/kaproilo makrogolio glicerido/etanolio (KKMG/ET) ir kaprilo/kaproilo makrogolio glicerido/poligliceril-6-izostearato (KKMG/PGI)) mišiniuose (1 lentelė). Atliekant tirpumo tyrimą siekta įvertinti KoS bei skirtingo S/KoS santykio įtaką resveratrolio tirpumui.

1 lentelė. Resveratrolio tirpumas S/KoS mišiniuose (n=3).

S/KoS santykis Resveratrolio kiekis (mg/g), kai Kos ET

Resveratrolio kiekis (mg/g), kai KoS PGI

1:1 220,51 ± 3,18 5,51 ± 0,33

2:1 236,28 ± 6,63 7,02 ± 0,46

3:1 254,76 ± 6,43 7,73 ± 0,32

4:1 248,16 ± 5,04 7,37 ± 0,08

5:1 189,31 ± 9,25 10,44 ± 0,55

6:1 181,67 ± 7,89 39,32 ± 1,54

7:1 166,78 ± 5,04 40,58 ± 0,40

Tyrimo metu nustatyta, kad resveratrolio tirpumas yra statistiškai reikšmingai didesnis mišiniuose, pagamintuose kaip KoS naudojant ET, nei mišiniuose su KoS PGI (p < 0,05). Statistinė duomenų analizė parodė, kad geriausias reveratrolio tirpumas yra kai KKMG/ET (S/KoS) santykis 3:1 ir 4:1. Palyginus resveratrolio tirpumo rezultatus S/KoS mišinių santykiuose 3:1 ir 4:1, statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p < 0,05). Mažiausias resveratrolio tirpumas nustatytas, kai KKMG/ET (S/KoS) santykis yra 7:1.

Atlikus resveratrolio tirpumo vertinimą KKMG/PGI mišiniuose, nustatyta, kad didžiausias resveratrolio tirpumas yra, kai S/KoS santykis 6:1 ir 7:1. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių santykių nenustatyta (p < 0,05). Mažiausias resveratrolio tirpumas nustatytas, kai KKMG/PGI santykis yra 1:1. Mokslinės literatūros analizė parodė, kad resveratrolis gerai tirpsta tiek KKMG, tiek ET (geriau nei kituose alifatiniuose alkoholiuose) [19, 67]. Galima teigti, kad dėl šios priežasties buvo nustatytas geresnis resveratrolio tirpumas KKMG/ET nei KKMG/PGI mišinyje. Atsižvelgiant į gautus tirpumo tyrimo rezultatus, nuspręsta toliau tęsti tyrimus su šiuo KKMG/PGI mišiniu ir įvertinti galimą KoS (ET

ir PGI) įtaką ME modeliavimui ir kokybės parametrams. Gautas resveratrolio tirpumas šių komponentų deriniuose yra pakankamas, siekiant įterpti norimą kiekį (1 proc. ir 2 proc.) veikliosios medžiagos į ME.

Atlikus mokslinės literatūros analizę, nustatyta, kad resveratrolio tirpumas aliejuose yra prastesnis nei kituose ME komponentuose, todėl aliejinę fazę sudarančių komponentų atranka vykdyta, remiantis santykinai didžiausiu resveratrolio tirpumu junginiuose [22]. Atliktuose tyrimuose teigiama, kad resveratrolis izopropilo miristate (IPM) tirpsta geriau nei kituose aliejuose, pavyzdžiui, izopropilo palmitate, etilo oleate, oleino rūgštyje, alyvuogių aliejuje. Resveratrolio tirpumas IPM yra lygus 0,49 ± 0,05 (mg/g) [30]. Mokslininkas Yuan Y. bei kiti nustatė, kad IPM gali gerinti vaistinių junginių skvarbą pro odą, o mokslininkės Djekic L. ir Primorac M. atliktais tyrimais įrodė, kad KKMG ir IPM derinys yra tinkamas mikroemulsijų formavimui [22, 78]. Dėl šių priežasčių ME gamybai kaip lipofilinė fazė pasirinktas IPM. Remiantis resveratrolio tirpumo vandenyje duomenimis, resveratrolis dėl polifenolinės struktūros yra praktiškai netirpus išgrynintame vandenyje. (tirpumas − 0,03 (mg/g)), todėl nuspręsta gaminti a/v/ tipo ME, siekiant, kad dispersinė fazė, į kurią įterpiama veiklioji medžiaga, būtų lipofilinė [3].

3.2. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas ir vertinimas

ME modeliavimui naudoti S/KoS santykiai 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ir 7:1. Parinkus tinkamas pagalbines medžiagas, vykdyta kryptinga ME sudėčių paieška. Vykdant titravimą lipofiline faze, suformuotos septynios pseudotrinarių fazių diagramos su KoS ET (žiūrėti 1 priede) ir penkios su KoS PGI (žiūrėti 2 priede). Formuojant pseudotrinarių fazių diagramas su KoS PGI, esant S/KoS santykiams 1:1 ir 2:1 formavosi geliai ar kitos struktūros, todėl šių santykių tolimesniuose tyrimuose buvo atsisakyta. Pseudotrinarių fazių diagramose apibrėžtos sritys (virš linijos) atitinka plotą, kuriame susidaro skaidrios sistemos – ME. Už nubrėžtų ribų (žemiau linijos), formuojasi kitos struktūros, pavyzdžiui, emulsijos arba koloidiniai tirpalai [59]. Remiantis mokslinėje literatūroje publikuotais duomenimis apie pseudotrinares fazių diagramas, buvo nuspręsta įvertinti S/KoS santykio bei KoS prigimties įtaką ME formavimuisi ir parinkti ME sudarančių komponentų koncentracijas, norint suformuoti a/v tipo ME [46] .

Atlikus pseudotrinarių fazių diagramų vertinimą, nustatyta, kad pasirinktas KoS turi įtakos ME formavimosi plotui pseudotrinarių fazių diagramoje. Gaminant dispersines sistemas su KoS PGI, pseudotrinarių fazių diagramose užimamas plotas buvo didesnis, nei formuojant dispersines sistemas, kai KoS naudotas ET (3 paveikslas). Tai pagrindžia mokslininkės Djekic L. ir kitų moksliniame darbe pateikiamą informaciją, jog KoS gali reikšmingai pakeisti ME formavimosi plotą pseudotrinarėse fazių diagramose [23].

3 pav. Pseudotrinarės fazių diagramos.

Tyrimo rezultatai parodė, kad su KoS ET mažiausias ME susidarymo plotas formuojamas, kai S/KoS santykis yra 1:1, o didžiausias – kai S/KoS santykis yra 7:1 (3 paveikslas). Pseudotrinarėse fazių diagramose, suformuotose su KoS PGI, didžiausias ME susidarymo plotas formuojamas kai S/KoS santykis 4:1, o mažiausias − kai S/KoS santykis 7:1 (3 paveikslas). Formuojant pseudotrinares fazių diagramas tiek su ET, tiek su PGI, stebima S/KoS mišinio ir lipofilinės fazės kiekių priklausomybė:

didėjant S/KoS mišinio kiekiui, didėja aliejinės fazės kiekis, kol įvyksta biištisinių ir v/a ME formavimasis, t.y. kol neįvyksta fazių inversija [62].

Tolimesniame tyrimų etape buvo norima įvertinti KoS įtaką ME VDD ir PDI. Vertinimui atlikti pasirinkta ta pati ME sudėtis visuose S/KoS santykiuose: išgrynintas vanduo 43 proc., aliejus (IPM) 2 proc., S/KoS 55 proc. Tyrimo rezultatai pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. VDD ir PDI, kai KoS naudoti ET arba PGI.

S/KoS santykis

VDD nm PDI

KoS ET KoS PGI KoS ET KoS PGI

1:1 30,64 ± 0,392 - 0,237 ± 0,009 -

2:1 28,03 ± 0,489 - 0,268 ± 0,011 -

3:1 30,23 ± 0,261 49,92 ± 0,715 0,287 ± 0,002 0,427 ± 0,010 4:1 31,78 ± 0,467 49,50 ± 0,153 0,298 ± 0,012 0,425 ± 0,005 5:1 32,15 ± 0,417 49,30 ± 1,095 0,289 ± 0,005 0,403 ± 0,047 6:1 33,72 ± 0,285 48,08 ± 0,731 0,300 ± 0,005 0,380 ± 0,052 7:1 35,41 ± 0,517 48,67 ± 0,356 0,303 ± 0,011 0,322 ± 0,003

Statistinė duomenų analizė parodė, kad reikšmingai mažesnės dalelės formuojamos tose ME, kurioms gaminti naudojamas KoS ET nei KoS PGI (p < 0,05). Analizuojant duomenis buvo parinkti ME kokybę pagrindžiantys kriterijai: VDD ≤ 100 nm, PDI < 0,400. Tyrimo rezultatai parodė, kad visos pagamintos ME su KoS ET atitiko VDD ir PDI keliamus reikalavimus. ME su KoS PGI, VDD atitiko reikalavimus, tačiau nustatyta, kad PDI, esant S/KoS santykiams 3:1 ir 4:1, viršijo nustatytą ribą (nustatytos vertės didesnės už 0,400).

Remiantis mokslinės literatūros duomenimis ir gautais tyrimų rezultatais, buvo įrodyta, kad skirtingi S/KoS mišinio santykiai, gali turėti įtakos ME kokybei (VDD bei PDI) ir daryti įtaką ME formavimuisi [46]. Šiame moksliniame darbe pateikti rezultatai, pagrindžia kitų mokslinkų tyrimų rezultatus, kad formuojant ME su KoS ET, formuojamos mažesnės dispersinės fazės dalelės, nei formuojant ME su KoS PGI [40, 82]. Mokslinėje literatūroje pateikiama informacija, kad ET, palyginus su kitais tirtais KoS, pavyzdžiui, izopropilo alkoholiu, pripilenglikoliu, gali efektyviau sumažinti ME VDD [24]. Taigi, ME kokybiniams parametrams (pavyzdžiui: VDD), įtaką gali daryti ir KoS, naudojamo gamyboje, prigimtis.

Tolimesniems tyrimams pasirinkti S/KoS santykiai atsižvelgiant į keletą kriterijų: didžiausią formuojamą ME susidarymo plotą pseudotrinarėje fazių diagramoje, didžiausią resveratrolio tirpumą S/KoS mišinyje, mažiausią VDD ir mažiausią PDI. Remiantis šiais kriterijais su KoS ET pasirinkti S/KoS santykiai 1:1 ir 7:1, o su KoS PGI – 4:1 ir 7:1.

3.3. Mikroemulsijų optimizavimas ir kokybės vertinimas

ME sudėčių atrankai atlikti pritaikytas eksperimentinis planavimas. Siekta gaminti a/v tipo ME, todėl ribos eksperimentiniam planavimui atsirinktos pagal šio tipo mokslinėje literatūroje nurodomas ME formavimosi sritis [18]. Remiantis literatūros duomenimis, kad didesnis nei 70 % surfaktanto kiekis gali dirginti odą ar gleivines, ir suformuotomis pseudotrinarėmis fazių diagramomis, apibrėžtos ME komponentų ribos [83]. Procentinės komponentų sudėtys, kai KoS buvo naudotas ET (S/KoS santykis 7:1): S/KoS mišinio 60–70 %, išgryninto vandens 28–39 %, aliejaus (IPM) 1–17 %. Atlikus literatūros apžvalgą, buvo nustatyta, kad vis daugiau mokslininkų formuodami mikrostruktūrinius nešiklius sudėties optimizavimui renkasi D-optimalaus dizaino modelį [30, 32, 35]. Pagrindiniai šio modelio privalumai yra eksperimentų skaičiaus sumažinimas bei darbo su statistika palengvinimas, nes modelis geba automatiškai įvertinti ME sudarančių komponentų kiekių optimaliausias ribas [35]. Remiantis šia informacija, ME sudėčių eksperimentiniam planavimui buvo pritaikytas D-optimalaus dizaino modelis.

Suformuota 16 ME sudėčių su KoS ET (S/KoS 7:1). ME sudėtys su KoS ET pateikiamos 4 paveiksle.

4 pav. ME su ET, kai S/KoS santykis 7:1

Įvertinus pagamintas ME, jos buvo skaidrios, termodinamiškai stabilios, nepastebėta susidrumstimo ar nuosėdų susidarymo. Nustatyta, kad VDD vyravo nuo 38,8 iki 87,11 nm, PDI nuo 0,245 iki 0,385, o smailių skaičius nuo 1 iki 3 (n=3). Siekiant įvertinti koreliaciją tarp ME kokybinių parametrų ir ME gamybai naudojamų komponentų kiekių, atlikta statistinė duomenų analizė. Nustatyta statistiškai reikšminga netiesioginė, stipri koreliacija tarp vandeninės fazės kiekio ir VDD (r = -0,890) – mažėjant išgryninto vandens kiekiui, VDD didėja (p < 0,05). Statistiškai reikšminga, stipri, tiesioginė koreliacija nustatyta tarp aliejinės fazės kiekio ir VDD (r= 0,937) parodė, kad didėjant aliejinės fazės kiekiui, VDD didėja.

Visos 16 ME sudėčių su KoS ET atitiko ME keliamus kokybės reikalavimus (VDD < 100 nm, PDI < 0,400), tačiau, siekiant atrinkti homogeniškiausias ME, kurių dispersinės fazės dalelės būtų pasiskirsčiusios vienoje smailėje, buvo nuspręsta pritaikyti pakartotinį eksperimentinio planavimo etapą.

Buvo susiaurintos ME sudarančių komponentų ribos: S/KoS (KKMG/ET) mišinio 60–62,6 proc., išgryninto vandens 28,0–33,4 proc., aliejaus (IPM) 6,3–12,0 proc. Pakartotinai pritaikius D-optimalų modelį, suformuotos papildomos 16 ME sudėčių, kurių VDD vyravo nuo 53,0 iki 83,4 nm, PDI nuo 0,252 iki 0,282, o smailių skaičius – 1. Tik vienos ME dispersinės fazės dalelės buvo pasiskirsčiusios dvejose smailėse. ME sudėtys ir kokybiniai parametrai pateikiami 3 lentelėje. Nustatyta, kad visos ME atitiko ME keliamus kokybės reikalavimus.

Įvertinus ME kokybinius parametrus, iš pakartotinio eksperimentinio planavimo metu sugeneruotų 16 sudėčių, tolimesniems tyrimams atrinktos 5 ME sudėtys: su mažiausiu VDD (nr. 3), su didžiausiu VDD (nr. 8), su mažiausiu PDI (nr. 7), su didžiausiu PDI (nr. 12) bei 1 sudėtis artimiausia VDD ir PDI vidurkiui (nr. 10). Po pakartotinio eksperimentinio planavimo atrinktos ME sudėtys su KoS ET pateikiamos 3 lentelėje ir 4 paveiksle.

3 lentelė. ME sudėtys ir kokybiniai parametrai.

Atrinktų sudėčių VDD pasiskirstymo pagal intensyvumą grafikas pateikiamas 5 paveiksle.

Dalelių dydžio pasiskirstymo grafikas parodė, kad sumodeliuotos homogeniškos ME, kurių dalelės pasiskirsčiusios vienoje smailėje. Papildomai buvo nustatyta 5 ME pH, klampa, elektrinis laidis.

Nustatyta, kad pH vyravo nuo 4,72 iki 5,17, klampa nuo 28,6 iki 31,2 mPa·s, elektrinis laidis nuo 4,7 iki 6,7 µS/cm. Nustatyta, kad atrinktos ME su KoS ET yra silpnai rūgštinės, todėl nuspręsta, kad pH galimai neturės įtakos resveratrolio stabilumui, po veikliosios medžiagos įterpimo į ME [83, 84]. Elektrinio laidžio matavimai parodė, kad pagamintos ME yra a/v tipo, nes nustatytos reikšmės didesnės nei išgryninto vandens (1,3 μS/cm) [14].

5 pav. ME dalelių dydžio pasiskirstymas, kai KoS ET Eilės nr. S/KoS 7:1

(KKMG/ET), proc.

Vanduo

proc. Aliejus

(IPM), proc. VDD, nm PDI Smailių

skaičius

1 61,47 28,00 10,53 72,95 ± 1,272 0,254 ± 0,020 1

2 61,28 29,34 9,39 69,65 ± 1,229 0,263 ± 0,006 1

3 60,00 33,40 6,60 52,99 ± 0,415 0,279 ± 0,003 1

4 62,60 29,14 8,26 65,32 ± 1,454 0,273 ± 0,006 1

5 60,50 30,71 8,79 65,33 ± 0,403 0,270 ± 0,003 1

6 60,00 32,16 7,84 60,66 ± 1,146 0,281 ± 0,008 1

7 61,47 28,00 10,53 72,19 ± 1,099 0,252 ± 0,006 1

8 60,00 28,00 12,00 83,41 ± 0,561 0,254 ± 0,004 1

9 61,72 31,98 6,30 54,56 ± 0,926 0,271 ± 0,001 1

10 60,50 30,71 8,79 64,53 ± 1,359 0,266 ± 0,004 1

11 61,72 31,98 6,30 55,17 ± 1,039 0,280 ± 0,011 1

12 62,60 29,14 8,26 66,88 ± 2,081 0,282 ± 0,009 1

13 62,60 30,68 6,72 56,79 ± 0,643 0,273 ± 0,002 1

14 60,00 29,35 10,65 71,95 ± 0,298 0,256 ± 0,004 1

15 60,50 30,71 8,79 64,80 ± 1,302 0,273 ± 0,007 1

16 61,34 31,11 7,55 64,93 ± 2,632 0,293 ± 0,006 2