LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
LORETA LEILIONAITĖ
MIKROEMULSIJŲ FORMULUOČIŲ SU TOLNAFTATU GAMYBA
IR VERTINIMAS
Magistro baigimasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Vitalis Briedis
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Medicinos akademija
Konsultantas
Prof. habil. dr. Valentinas Snitka Mikrosistemų ir nanotechnologijų centras
Kauno technologijos universitetas Recenzentas
Doc. dr. Rimantas Klimas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Medicinos akademija
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 PADĖKA ... 6 1. SANTRUMPOS ... 7 2. ĮVADAS ... 83. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI ... 10
4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
4.1. Mikroemulsijų sudėtis ... 11
4.2. Mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai ... 13
4.3. Mikroemulsijų formavimasis ir gamyba ... 14
4.4. Mikroemulsijų klasifikacija... 15
4.5. Mikroemulsijų charakterizavimas ... 16
4.5.1. Lazerinės šviesos išbarstymo technologijos ... 17
4.5.2. Ramano spektroskopija ... 18
4.5.3. Mikroskopija... 19
4.5.4. Laidumas ir klampumas ... 19
4.5.5. Branduolių magnetinis rezonansas ... 20
5. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 21
5.1. Darbe naudota aparatūra, medţiagos ir reagentai ... 21
5.2. Mikroemulsijų su etilo oleatu ir izopropilo miristatu gamyba ir vertinimas ... 22
5.3. Tolnaftato tirpumo surfaktante ir aliejinėje fazėje tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 23
5.4. 1 % tolnaftato mikroemulsijų gamyba ir vertinimas ... 23
5.5. Tolnaftato mikroemulsijų fazių diagramų sudarymas, esant skirtingiems surfaktanto ir kosurfaktanto santykiams 5:1, 3:1, 2:1 ... 25
5.6. Tolnaftato mikroemulsijų gamyba keičiant surfaktanto ir kosurfaktanto santykius ir vandens koncentraciją, mėginių analizė ... 26
5.7. Tolnaftato atsipalaidavimo kinetikos iš eksperimentinių mikroemulsijų pro dializės membraną tyrimas ... 26
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
6.1. Dalelių dydţių matavimo dinaminiu šviesos sklaidos metodu rezultatų vertinimas ... 28
6.3. 1 % tolnaftato mikroemulsijų tyrimo mikroskopinė analizė ... 29 6.4. 1 % tolnaftato mikroemulsijos tyrimo Ramano spektroskopijos metodu analizė ... 32 6.5. Mikroemulsijų su tolnaftatu fazių diagramų duomenų analizavimas ... 34 6.6. Tolnaftato mikroemulsijų, pagamintų keičiant surfaktanto ir kosurfaktanto santykius, vandens koncentraciją, analizės dinaminiu šviesos sklaidos metodu vertinimas ... 36 6.7. Tolnaftato atsipalaidavimo kinetikos iš eksperimentinių mikroemulsijų pro dializės membraną įvertinimas... 48 7. IŠVADOS ... 51 8. LITERATŪRA ... 52
SANTRAUKA
Loreta Leilionaitė. Mikroemulsijų formuluočių su tolnaftu gamyba ir vertinimas.
Raktaţodţiai: tolnaftatas, mikroemulsijos, fazių diagramos, dalelių dydis, dinaminė šviesos sklaida
Mikroemulsijos yra potencialios blogai vandenyje tirpių vaistų gabenimo sistemos dėl jų gebėjimo inkorporuoti tiek lipofilines, tiek hidrofilines medţiagas, termodinaminio stabilumo ir nesudėtingos gamybos. Darbo tikslas buvo pagaminti blogai vandenyje tirpaus, vietiniam vartojimui skirto priešgrybelinio vaisto tolnaftato (O-2-naftil metil (3-metilfenil) tiokarbamatas) mikroemulsijas, įvertinti jų biofarmacines savybes. Tyrimai: tolnaftato tirpumas izopropilo miristate ir Labrasol®
buvo įvertintas efektyviosios skysčių chlomatografijos metodu. 1% tolnaftato tirpumas buvo įvertintas 14 — oje eksperimentinių mėginių, sudarytų iš šių medţiagų: Labrasol®
, Plurol isostearique®, Tween® 20, Tween® 80, PEG — 400, 96,3º etanolio, izopropilo miristato, etilo oleato, distiliuoto vandens. Mėginiai išanalizuoti mikroskopiškai ir Ramano spektroskopijos metodu. Sudarytos tolnaftato mikroemulsijų fazių diagramos esant surfaktanto/kosurfaktanto (S/KoS; Labrasol®/Plurol isostearique®) santykiams 5:1, 3:1, 2:1, aliejinei fazei — izopropilo miristatui. Pagal fazių diagramų duomenis, pagamintos tolnaftato mikroemulsijos iš tų pačių medţiagų, esant kintamam S/KoS santykiui ir vandens koncentracijai. Mikroemulsijų dalelių dydţiai ir homogeniškumas išmatuoti dinaminiu šviesos sklaidos metodu. Tolnaftato pralaidumo pro dializės membraną įvertinimui parinktos maţiausio vidutinio dalelių dydţio ir siauriausio dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą intervalo mikroemulsijos. Rezultatai ir išvados: nepavyko pagaminti 1 % tolnaftato mikroemulsijų naudojant jų gamybai Labrasol®
, Plurol isostearique®, Tween® 20, Tween® 80, 96,3 º etanolį, izopropilo miristatą, etilo oleatą ir distiliuotą vandenį. Ramano spektroskopijos metodu nustatyta, jog sistemose vyksta tolnaftato rekristalizacija. Pagal fazių diagramų duomenis nustatyta, jog didėjant S/KoS santykiui mikroemulsijų susiformavimo srities plotas maţėja, sumaţėja ir sistemos gebėjimas inkorporuoti didesnį vandeninės fazės kiekį, tačiau didėja sistemų homogeniškumas. Išmatuoti vidutiniai dalelių dydţiai, atrinktų mikroemulsijų pralaidumo pro puslaide membraną tyrimui atlikti, yra nuo 39 nm iki 252 nm. Nustatyta, jog tolnaftato srautas didţiausias mikroemulsijose, kuriose vidutinis dalelių dydis maţiausias ir didţiausia vandens koncentracija.
SUMMARY
Loreta Leilionaitė. Development and evaluation of microemulsion formulations with tolnaftate. Keywords: tolnaftate, microemulsions, phase diagrams, particle size, dynamic light scattering
Microemulsions are considered as potential systems for poorly water soluble drugs delivery because of their ability to improve both lipophilic and hydrophilic drug solubilization, thermodynamic stability and ease of preparation. The aim of the present work was to formulate microemulsions containing poorly water soluble, topicaly used antifungal drug tolnaftate (O-2-naphthyl methyl (3-methylphenyl) thiocarbamate) and evaluate their biopharmaceutical characteristics. Experimental: Tolnaftate solubility in isopropyl myristate and Labrasol® were evaluated by high performance liquid chromatography method. 1 % tolnaftate solubility capacity was evaluated in 14 experimental formulations, containing following excipients: Labrasol®, Plurol isostearique®, Tween® 20, Tween® 80, PEG 400, 96.3º ethanol, isopropyl myristate, ethyl oleate, bidistilled water and formulations were analyzed microscopically and by Raman spectroscopy. Pseudo ternary phase diagrams for tolnaftate microemulsion region were constructed at surfactant to cosurfactant (S/CoS) ratios 5:1, 3:1, and 2:1. Different compositions of tolnaftate microemulsions were formulated using isopropyl myristate, Labrasol®, Plurol isostearique® with S/CoS ratios (5:1, 3:1, 2:1) and varying water content. Particle size was measured by dynamic light scattering method. Formulations with small droplet sizes and narrow range of particle size distribution were selected; tolnaftate release through dialysis membrane was performed. Results and conclusions: it was impossible to produce 1 % tolnaftate microemulsion from Labrasol®, Plurol isostearique®, Tween® 20, Tween® 80, PEG 400, 96,3º ethanol, isopropyl myristate, ethyl oleate, distilled water, in all samples crystallization occurred. Raman spectroscopy showed that crystals were formed from tolnaftate. According to the pseudo ternary phase diagrams S/CoS ratio increase was followed by microemulsion formation region plot decrease and lower ability to incorporate high water concentrations, however with increasing S/CoS ratio more homogeneous microemulsions were formed. In particle size measurements of selected formulations the mean diameter of microemulsion droplets was in range of 39 nm up to 252 nm. Tolnaftate release from these microemulsions was highest from samples with smaller particle size and higher water content.
PADĖKA
Uţ suteiktą galimybę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą nuoširdţiai dėkoju UAB „Fermentas― Thermo Fisher Scientific padaliniui Lietuvoje, Vilnius ir visam jo kolektyvui, Mikrosistemų ir nanotechnologijų mokslo centrui, KTU, šio centro direktoriui, Prof. Habil. Dr. Valentinui Snitkai, uţ patarimus ir pagalbą.
Esu dėkinga LSMU doktorantams, Tomai Keţutytei ir Modestui Ţiliui uţ pagalbą atliekant tyrimus, patarimus ir padrąsinimą.
1. SANTRUMPOS
A/V — aliejaus vandenyje tipo emulsija/mikroemulsija; V/A — vandens aliejuje tipo emulsija/mikroemulsija; A-V-A — aliejaus vandenyje tipo emulsija aliejuje; V-A-V — vandens aliejuje tipo emulsija vandenyje; BMR — branduolių magnetinis rezonansas;
D(H) — hidrodinaminis difuzijos koeficientas
DŠS (en. DLS – dynamic light scattering) — dinaminės šviesos sklaida; EO — etilo oleatas;
ESC — efektyvioji skysčių chromatografija; h — valandos;
HLB — hidrofilinis lipofilinis balansas; IPM — izopropilo miristatas;
KMK — kritinė micelių koncentracija;
KoS — pagalbinė paviršiui aktyvi medţiaga (kosurfaktantas); ME — mikroemulsija;
p — reikšmingumo lygmuo;
PAM — paviršiui aktyvi medţiaga; pav — paveikslas;
PDI — polidispersiškumo indeksas; PEG 400 — polietileno glikolis 400; PI — Plurol isostearique®;
rs — Spearman‘o koreliacijos koeficientas;
TEM — transmisinė elektroninė mikroskopija;
S — pagrindinė paviršiui aktyvi medţiaga (surfaktantas)
S/KoS — surfaktanto ir kosurfaktanto (pagrindinės ir papildomos paviršiui aktyvių medţiagų) mišinys;
2. ĮVADAS
Mikroemulsijos, tai iš vandens bei aliejaus fazių, kosurfaktanto ir surfaktanto sudarytos optiškai izotropiškos, termodinamiškai stabilios, monodispersinės sistemos, kurių dalelių dydis gali būti nuo 10 – 200 nm [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. Farmacijos mokslininkų susidomėjimą šiomis sistemomis kelia tai, jog mikroemulsijos yra potencialios vaistų pernešimo formos, kurios pasiţymi labai svarbia savybe – geba inkorporuoti įvairios kilmės, skirtingos struktūros ir fiziko — cheminių savybių vaistines medţiagas. Dėl savo termodinaminio stabilumo, maţo dalelių dydţio, ypatingos įrangos bei specialių sąlygų nereikalaujančios gamybos, mikroemulsijos yra patrauklios vaistų formos, kurios gali būti pritaikomos ne tik didinant parenteraliai ar per os vartojamų vaistų poveikį, tačiau ir kuriant aktualius transdermalinio ir dermalinio vartojimo farmacinius preparatus. Pastarosios sistemos vertingos tuo, jog geba talpinti tiek hidrofilines, tiek lipofilines vaistines medţiagas, padidinti ir pagerinti jų prasiskverbimą pro odą lyginant su kitomis vaistų formomis [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17].
Vandenyje netirpių vaistinių medţiagų integravimas į transdermalines ir dermalines mikroemulsijas yra svarbus pasiekimas farmacijos pramonei, kadangi sulaukiama greito vaisto poveikio, patogu vartoti, įmanoma padidinti vaisto koncentraciją ir taip sumaţinti vaisto vartojimo daţnumą, galima išvengti vaistų pirminio metabolizmo kepenyse, vartojant per os, virškinamojo trakto sudirginimo, surfaktantas ir kosurfaktantas pagerina vaisto skvarbą į odą. Nepaisant mikroemulsijų privalumų, pagrindinis uţdavinys naudojant tokias dermalines vaistų formas yra pagerinti vaisto prasiskverbimą pro odą, nesukeliant nepageidaujamų reakcijų, šalutinių poveikių ir nekeičiant odos barjerinės funkcijos [4, 13, 15,18, 19].
Priešgrybelinis vaistas, tolnaftatas, yra itin maţai vandenyje tirpi medţiaga. Vaistas priskiriamas tiokarbamatams. Veikimo mechanizmas nėra visiškai išaiškintas, tačiau daugelyje šaltinių teigiama, jog preparatas inhibuoja skvaleno epoksidazę, pagrindinį fermentą, dalyvaujantį ergosterolio biosintezėje [20, 21]. Tolnaftatas pasiţymi aktyvumu prieš epidermofitus, mikrosporas, trichofitų rūšis bei Malassezia furfur [20, 22].
Daţniausiai vartojamos 1% tolnaftato turinčios vaistų formos — milteliai, kremai, tepalai, purškalai, aerozoliai. Tolnaftatas vartojamas gydyti dermatomikozes (Tinea pedis, Tinea cruris) [22] Lyginant tolnaftato ir terbinafino sporocidinį ir inhibicinį poveikį dermatofitams in vitro, nustatyta, jog tolnaftato aktyvumas yra panašus ar net truputį didesnis nei terbinafino. Vertinant 17-os priešgrybelinių preparatų poveikį 6-oms dermatofitų rūšims in vitro nustatyta, kad tolnaftatas yra vienas aktyviausių dermatologinių vaistų šių dermatofitų sukeltoms ligoms gydyti [23]. Poveikis mieliagrybiams, C. albicans yra nedidelis lyginant su kitais preparatais, atlikto biochemino tolnaftato poveikio sveikoms ir paţeistoms C. albicans ląstelėms tyrimo rezultatai parodo, jog preparatas aktyvus
prieš skvaleno epoksidazę tik paţeistose C. albicans ląstelėse, kas rodo, jog vaistas sunkiai prasikverbia per C. albicans ląstelės apvalkalą [ 21, 24, 25].
Darbo tikslas: pagaminti ir įvertinti tolnaftato mikroemulsijas, jų biofarmacines charakteristikas.
3. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: pagaminti ir įvertinti tolnaftato mikroemulsijas, jų biofarmacines charakteristikas.
Darbo uţdaviniai:
1. Ištirti tolnaftato tirpumą izopropilo miristate ir surfaktante (Labrasol®) efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2. Pagaminti skirtingų aliejinių fazių mikroemulsijų mėginius be tolnaftato ir įvertinti jų dalelių dydţių kitimus laikant.
3. Pagaminti tolnaftato 1% mikroemulsijas naudojant įvairias pagalbines medţiagas, jų koncentracijas bei jas įvertinti.
4. Sudaryti mikroemulsijų su tolnafatu fazių diagramas esant skirtingiems pagrindinės ir pagalbinės paviršiui aktyvių medţiagų mišinių (surfaktano ir kosurfaktanto) santykiams (5:1, 3:1, 2:1).
5. Pagaminti tolnaftato mikroemulsijas esant skirtingiems surfaktanto ir kosurfaktanto santykiams (5:1, 3:1, 2:1) bei kintamai vandens koncentracijai ir įvertinti dalelių dydţius bei mėginių polidispersiškumą dinaminiu šviesos sklaidos metodu.
4. LITERATŪROS APŢVALGA
4.1. Mikroemulsijų sudėtis
Mikroemulsijos – skystos dispersinės sistemos, sudarytos iš aliejinės, vandeninės fazių, surfaktanto (S) ir daugeliu atveju kosurfaktanto (KoS) [1, 4, 5, 7, 8, 12, 16, 19, 26]. Aliejinės fazės komponentai gali būti riebalinės rūgštys, riebiųjų rūgščių ir alkoholių esteriai, vidutinio grandinės ilgio trigliceridai, acto rūgšties ir glicerolio triesteriai, terpenai bei prasiskverbimą pro odą gerinančios medţiagos. Daţniausiai mikroemulsijų formavimui naudojami esteriai – izopropilo miristatas, izopropilo palmitatas ir etilo oleatas [4, 5, 7, 13, 14, 27, 28]. Eterinių aliejų komponentai kaip limonenas, cineolas, ir mentolas gali būti pridedami į aliejinę fazę, siekiant panaudoti jų savybes gerinti sistemos komponentų prasiskverbimą pro odą [19, 29].
Vandeninei fazei naudojamas distiliuotas ar injekcinis vanduo, kuriame gali būti klampumą didinančių medţiagų, natrio chlorido, buferinių tirpalų, konservantų ir prasiskverbimą pro odą gerinančių medţiagų [4].
Mikroemulsijų gamybai labai svarbi pagrindinė paviršiui aktyvi medţiaga (surfaktantas), tai amfifilinė molekulė, kuri turi polinę ir nepolinę dalis. Ši dvilypė molekulė vandens ir aliejaus fazių turinčiose sistemose išsidėsto aliejaus ir vandens lašelių sąlyčio paviršiuje hidrofilinėms molekulės grupėms ištirpstant vandeninėje fazėje, o hidrofobinėms — aliejinėje fazėje. Daţniausiai mikroemulsijoms formuoti pasirenkamas surfaktantas, kurio hidrofilinio lipofilinio balanso (HLB) rodiklis yra 12 – 16. Pagrindinė ir svarbiausia surfaktanto savybė formuojant mikroemulsijas, tai gebėjimas sumaţinti paviršiaus įtempimą iki ypač maţų reikšmių [3, 4, 5, 6, 13, 15, 26, 30]. Surfaktantai, skirti mikroemulsijų gamybai skirstomi į joninius (katijoninius ir anijoninius) ir nejoninius (1 lentelė) [6, 7, 12]. Mikroemulsijų gamyboje daţniausiai naudojami nejoniniai surfaktantai. Jie pasiţymi maţiausiomis odą dirginančiomis savybėmis nei joniniai surfaktantai [4, 13, 18]. Anijoniniai surfaktantai pripaţinti potencialiais ţmogaus ir gyvūnų odos dirgikliais. Katijoniniai surfaktantai dirginančio poveikio stiprumu lygiavertiški anijoniniams, bet yra daug uţ juos citotoksiškesni. Renkantis surfaktantą, jo koncentracija turi būti pakankamai didelė tam, kad mikroemulsijose esantys mikrolašeliai būtų visiškai padengti monomolekuliniu jo sluoksniu, uţtikrintas jų stabilumas ir lašelių sąlyčio paviršiaus įtempimas būtų kuo maţesnis (<10-6
mN/m-1) [3, 4, 9, 13, 30].
1 lentelė. Mikroemulsijų gamyboje naudojami surfaktantai [4, 7, 12, 19, 28, 31].
Nejoniniai surfaktantai Katijoniniai surfaktantai Anijoniniai surfaktantai Izostearino rūgšties poliglicerolio esteris; Labrasol®; Propilenglikolio monostearatas; Glicerilmonostearatas; Span 80; Span 60; Span 40; Span 20; Metilceliuliozė;
Tween 60; Tween 80; Tween 40; Tween 20; Myrj 52
Atlas G-3570; Atlas G-2090; Ketvirtinio amonio druskų dariniai
Glicerilmonostearatas; Trietanolamino oleatas; Tragakantas
Pagalbinė paviršiui aktyvi medţiaga (kosurfaktantas) veikia sinergistiškai su surfaktantu [3, 4, 5, 18, 19]. Naudojant mikroemulsijų gamyboje tik vieną surfaktantą, įmanoma pakankamai sumaţinti tarpfazinį sąlyčio paviršiaus įtempimą, tačiau reikia didelės jo koncentracijos, kuriai esant gali įvykti micelių susidarymas, pasiekiama micelių susidarymo kritinė koncentracija. Norint to išvengti, papildomai naudojami kosurfaktantai, kurie padeda dar labiau sumaţinti tarpfazinio sąlyčio paviršiaus įtempimą naudojant maţesnes surfaktanto koncentracijas ir padidinant kritinę micelių susidarymo koncentracijos ribą [4]. Mikroemulsijų formavimui naudojami kosurfaktantai, kurių HLB 5 – 6. Daţniausiai naudojami trumpo ar vidutinio anglies atomų grandinės ilgio alkoholiai. Jie uţtikrina lašelių paviršių dengiančio surfaktanto sluoksnio lankstumą ir tuo pačiu prisideda prie paviršiaus įtempimo maţinimo, tačiau per didelis alkoholių pridėjimas potencialiai gali lemti papildomą odos sudirginimą ir dehidrataciją [4, 6, 7, 18, 30]. Šiuo metu vis daugiau gaminama mikroemulsijų kuriose naudojami maţiau dirginantys, pašalinių poveikių nesukeliantys kosurfaktantai (pvz., poliglyceril-6 dioleatas (Plurol Oleique®), poliglyceril-6 isostearatas (Plurol Isostearique®), dietilenglikolio monoetilo eteris (Transcutol®), propilenglikolio monokaprilatai (CaproylTM 90 ir CaproylTM PGMC), propilenglikolio monolauratai (LauroglycolTM 90 ir LauroglycolTM FCC)) [5, 7, 18, 19, 28, 30].
Dėl nepageidaujamo surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio poveikio odai atkiekami bandymai, kurių metu gaminamos mikroemulsijos naudojant tik surfaktantus arba tik kosurfaktantus [4, 12, 31].
4.2. Mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai
Daugybė bruoţų skiria mikroemulsijų sistemas nuo emulsijų (2 lentelė) [3, 4, 5, 6, 9, 15]. Mikroemulsijos, kaip apibūdinta anksčiau, yra termodinamiškai stabilios, spontaniškai susiformuojančios sistemos. Kitaip nei emulsijose, jų susiformavimui nereikalinga jokia papildoma energija [3, 5, 9, 12, 13, 15]. Mikroemulsijose nevyksta komponentų cheminiai pokyčiai ar fazių atsiskyrimas net laikant jas vienerius metus ar ilgiau 45° C. Tuo tarpu emulsijos pasiţymi tik kinetiniu stabilumu, jos yra agregatiškai nepatvarios, nes dėl didelio fazių sąlyčio paviršiaus esant laisvosios energijos pertekliui vyksta koalescencija, fazių separacija. Fazių separacija emulsijose gali vykti santykinai lėtai, gali susiformuoti ir tokios emusijos, kuriose fazių visiškas atsiskyrimas įvyksta tik po keleto savaičių ar net mėnesių [3, 15]. Nepaisant to, esminis skirtumas tarp emulsijų ir mikroemulsijų sistemų išlieka.
2 lentelė. Mikroemulsijų ir emulsijų palyginimas.
Emulsijos
Mikroemulsijos
Termodinamiškai nestabilios Termodinamiškai stabilios Maţas paviršiaus plotas: 15 m2
/g Didelis paviršiaus plotas: 200 m2/g Sąlyčio paviršiaus įtempimas 20 – 50 mN/m-1 Sąlyčio paviršiaus įtempimas 10-2
— 10-6 mN/m-1 Galimi tipai: A/V, V/A, A-V-A, V-A-V Galimi tipai: A/V, V/A, biištisinės.
Sistemą sudarančių lašelių diametras 1 – 100 µm Sistemą sudarančių lašelių diametras 10 – 200 nm Drumstos koloidinės sistemos Optiškai skaidrios sistemos
Didelis mikroemulsijų ir emulsijų skirtumas yra dispersinės fazės lašelių dydis (2 lentelė). Emulsijose jis yra 1µm — 100 µm, kai ME tik 10 nm — 200 nm. Emulsijų sistemose dispersinės fazės dalelės yra pakankamai didelės ir geba išsklaidyti šviesą, todėl jos yra matomos kaip drumsti koloidiniai tirpalai. Aiškūs fiziniai skirtumai tarp mikroemulsijų ir emulsijų gali būti nustatomi nagrinėjant jas vizualiai – mikroemulsijose fazės neturi polinkio atsiskirti viena nuo kitos ir sistemos daţniausiai yra optiškai skaidrios, kai tuo tarpu emulsijos opalescuoja, yra drumstos ir fazės neišvengiamai atsiskiria [3, 4, 5, 7, 9, 13].
Sistemos skiriasi aliejaus ir vandens fazių sąlyčio paviršiaus įtempimu (2 lentelė). Paviršiaus įtempimas vykstant tik aliejaus ir vandens sąveikai yra apie 50mN/m-1
. Emulsijos, suformuotos maišant aliejinę fazę, vandenį ir paviršiui aktyvią (-as) medţiagą (-as), paprastai charakterizuojamos pagal sąlyčio paviršiaus įtempimą, kuris yra maţdaug 20 – 50 mN/m-1
charakterizuojamos pagal ţymiai maţesnę sąlyčio paviršiaus įtempimo reikšmę — 10-3 – 10-6 mN/m-1 [3, 4, 5, 13, 15, 26].
4.3. Mikroemulsijų formavimasis ir gamyba
Mikroemulsijos susiformuoja, kai surfaktantas, o daţniausiai surfaktanto ir kosurfaktanto mišinys, pridėtas į vandeninę ir aliejinę fazes turinčią sistemą, elgiasi kaip paviršiaus įtempimą tarp aliejaus ir vandens lašelių maţinanti (-čios) medţiaga (-os) [3, 4, 5, 12]. Paviršiaus įtempimas gali būti sumaţintas iki ypač maţų verčių — 10-3
— 10-6 mN/m-1, sudarant sąlygas termodinaminiam judėjimui, kurio dėka atsiskiria ir yra išsklaidomos, tarpusavyje nesimaišančios fazės.
Tam, kad dispersija susiformuotų spontaniškai, laisvoji sistemos energija turi būti neigiama, tai yra – maţesnė nei atskirų sistemą sudarančių komponentų laisvoji energija [3, 4, 5, 15, 26]. Mišinio laisvoji energija (ΔG ) apibrėţiama formule (1):
ΔG = γΔA – TΔS (1)
γ – aliejinės ir vandeninės fazių sąlyčio paviršiaus įtempimas. ΔA – paviršiaus ploto pokytis, vykstant emulsifikacijai. ΔS – sistemos entropijos pokytis.T – temperatūra.
Mikroemulsijų susiformavimas yra lydimas reikšmingo paviršiaus ploto (ΔA) padidėjimo, susiformuojant dispersinės fazės lašeliams [5]. Surfaktantas ir kosurfaktantas veikdami kartu sumaţina paviršiaus įtempimą, padengdami sistemos lašelius monomolekuliniu sluoksniu, formuojantis dispersinei fazei taip pat didėja entropija (ΔS) [3, 5, 12]. Mikroemulsijose γΔA visada yra maţesnis uţ TΔS, taigi ir laisvoji sistemos energija (ΔG) < 0 [4, 15, 26].
Mikroemulsijos daţniausiai gaminamos aliejinę fazę sumaišant su surfaktanto ir kosurfaktanto mišiniu, tada į šį mišinį lašinamas vanduo, sistemos nuskaidrėjimas lašinant vandenį, vertinamas kaip mikroemulsijos susidarymas. Taip pat mikroemulsijas galima gaminti sumaišant aliejinę fazę ir surfaktantą, mišinį sumaišius su vandeniu į gautą sistemą lašinamas kosurfaktantas. Sistemos nuskaidrėjimas, įlašinus tam tikrą kiekį kosurfaktanto, vertinamas kaip mikroemulsijos susiformavimo taškas. Gamyba su vaistine medţiaga analogiška, tik vaistinė medţiaga tirpinama atitinkamoje sistemą sudarančioje medţiagoje, kurioje tirpsta ar jų mišinyje, tai gali būti aliejinė fazė, aliejinės fazės, kosurfaktanto ir surfaktanto mišinys, kosurfaktantas, vandeninė fazė [6, 7, 10, 11, 16, 17, 27, 28, 36, 41].
4.4. Mikroemulsijų klasifikacija
Mikroemulsijų tipai gali būti klasifikuojami pagal Vinsorą (Winsor, 1948 m.) (1 pav.) [3, 12, 15, 26, 31]:
Winsor I – dvifazė sistema. Apatinė A/V mikroemulsijos fazė formuoja pusiausvyrą su viršutine pertekline aliejaus faze. Surfaktantas labiausiai tirpus vandenyje, aliejinėje perteklinėje fazėje randamos itin maţos surfaktanto koncentracijos.
Winsor II – dvifazė sistema. Viršutinė mikroemulsijos V/A fazė formuoja dinaminę pusiausvyrą su apatine pertekline vandenine faze. Surfaktanto didesnis kiekis yra ištirpęs aliejinėje fazėje. Vandeninėje fazėje aptinkamos maţos surfaktanto koncentracijos.
Winsor III – trifazė sistema. Vidurinė fazė – biištisinė mikroemulsija, esanti pusiausvyroje su viršutine pertekline aliejine faze ir apačioje esančia pertekline vandenine faze. Perteklinėse aliejaus ir vandens fazėse aptinkami maţi surfaktanto kiekiai, jo didelės koncentracijos aptinkamos biištisinės struktūros vandeninėje fazėje.
Winsor IV – vienfazė homogeninė sistema, sudaryta iš surfaktanto, aliejaus ir vandens mišinio [3, 12, 15, 26, 31].
A/V ir V/A mikroemulsijos yra sudarytos iš sferinių lašelių, suformuotų disperguojant dispersinę fazę dispersinėje terpėje. Lašelių tipo mikroemulsijos gali būti arba vienfazės (Winsor IV) arba dvifazės sistemos (Winsor I — II) (1 pav.). Taip pat susiformuoja ir nelašelinės struktūros mikroemulsijos, kurios vadinamos vidurinės fazės arba biištisinėmis mikroemulsijomis. Šiuo atveju mikroemulsija yra dalis trifazės sistemos (Winsor III) (1 pav.). Biištisinio tipo mikroemulsija yra sudaryta ne iš sferinių lašelių, sistemoje aliejaus ir vandens fazės yra nenutrūkstamos, ištisinės, surfaktantas neleidţia šiems komponentams susilieti, todėl susidaro korėta, skylėta, panaši į kempinę struktūra su persidengiančiomis vandens ir aliejaus fazių vamzdelinėmis juostomis, kurių viduje yra aliejus, o išorėje vanduo [3, 4, 12, 31].
1 pav. Mikroemulsijų tipai, klasifikuojami pagal Vinsorą (Winsor, 1948)
Mikroemulsijų tipai gali kisti vykstant tarpfaziniams perėjimams, kuriuos įtakoja tokie faktoriai kaip temperatūros padidėjimas, kai surfaktantas nejoninis [13], elektrolitų koncentracijos padidėjimas, kai mikroemulsijoms gaminti naudojami joniniai surfaktantai (3 lentelė) [12, 9, 31].
3 lentelė. Tarpfazinių perėjimų kryptis įtakojantys faktoriai.
Tarpfazinius perėjimus įtakojantys faktoriai Tarpfazinių perėjimų kryptys
Temperatūra I ← III ← II
Elektrolitų koncentracija I ← III ← II
4.5. Mikroemulsijų charakterizavimas
Pagrindiniai informatyvūs mikroemulsijų charakterizavimo metodai, kurie daţniausiai taikomi yra: dinaminė šviesos sklaida, transmisinė elektroninė mikroskopija (TEM), krio — TEM, uţšaldymo ir nuskėlimo TEM, konduktometrija, reologinių savybių tyrimas, pH nustatymas, Ramano spektroskopija, branduolių magnetinis rezonansas [3, 4, 5, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 32, 33, 34, 35].
4.5.1. Lazerinės šviesos išbarstymo technologijos
Lazerinės šviesos sklaidos metodai (statinė ir dinaminė šviesos sklaida) kaip ir neoptiniai analizės metodai, tokie kaip maţo kampo rentgeno spindulių sklaida ir maţo kampo neutronų sklaida, taikomi mikroemulsijų charakterizavimui [3, 4, 5, 12, 13,19, 36].
Vis dėlto, šviesos sklaidos metodai turi trūkumų. Nurodyta, jog įkrautas sąlyčio tarp lašelių ir ištisinės fazių paviršius gali lemti klaidingą supratimą apie difuzijos koeficientą ir apytikrį dalelių dydį [36].
Dinaminė šviesos sklaida dar vadinama fotonų koreliacine spektroskopija — metodas, leidţiantis charakterizuoti tiriamajame mėginyje esančių dalelių dydį. Šiuo metodu tiriant mikroemulsijas, mėginys, kuriame vyksta dalelių Brauno judėjimas, apšviečiamas lazeriu ir matuojami dalelių išsklaidytos šviesos intensyvumo pokyčiai. Nuo laiko priklausantys šviesos sklaidos intensyvumo kitimai yra analizuojami autokoreliatoriumi, kuris nustato gauto signalo autokoreliacinę funkciją. Signalo koreliacijos G (lygtis 2) [37, 38] eksponentinis silpnėjimas priklauso nuo mėginį sudarančių dalelių difuzijos greičio, kuris įtakojamas dalelių dydţio (didesnės dalelės juda lėčiau, maţesnės — greičiau) [5, 8, 14, 37, 38, 39].
(2)
B — pradinis matavimo taškas A — amplitudė
D — verstinis difuzijos koeficientas
Sklaidos vektorius (q) apibrėţiamas lygtimi (3) [22]:
(3)
yra tirpiklio lūţio rodiklis, — lazerio šviesos bangos ilgis vakuume, θ — sklaidos kampas. Taigi šiuo metodu pamatuotas dalelių Brauno judėjimo greitis analizuojamame tirpale suteikia informacijos apie transliacinį (verstinį) difuzijos koeficientą (D). Šis difuzijos koeficientas gali būti konvertuojamas į hidrodinaminį diametrą (DH), naudojant Stokso — Einšteino lygtį (4) [5, 37, 38]:
(4)
k — Boltzmano konstanta T — absoliuti temperatūra
η — dispersinės fazės klampa
Reikia atkreipti dėmesį į tai, jog diametras, kuris matuojamas dinaminiu šviesos sklaidos metodu, parodo kaip dalelė difunduoja skystyje, taigi jis nurodomas kaip hidrodinaminis diametras. Hidrodinaminis diametras, tai sferinės dalelės diametras, kuris turi tą patį perskaičiuotą difuzijos koeficientą kaip ir matuojama dalelė [5, 37].
Paprastai dinaminės šviesos sklaidos matavimo prietaisuose naudojamas 90° išsklaidytos šviesos detekcijos kampas. Ši optinė konfigūracija gali būti nepakankamai jautri maţų dalelių ar molekulių matavime, net jei papildomai prijungiamas galingas trumpo bangos ilgio lazeris. Optinė konfigūracija, kuriai esant galima tiksliau matuoti maţų koncentracijų ir maţų dalelių dydţių mėginius, yra atgalinės sklaidos 173° kampu detekcija. Privalumai: sumaţinamas daugialypės sklaidos efektas, kai vienos dalelės išsklaidyta šviesa yra išsklaidoma kitų dalelių, sumaţinamas patekusių dulkių šviesos sklaidos fiksavimas, taip išvengiant neteisingo duomenų pateikimo ir interpretavimo, pamatuojamos didesnės mėginių koncentracijos, matuojant tokiu kampu stebima 8 kartus didesnė sklaidos apimtis nei matuojant 90° kampu [14]. Matavimas esant tokiai optinei konfigūracijai uţtikrina išskirtinį metodo jautrumą, kuris pageidaujamas matuojant mėginius, kuriuos sudaro nanodalelės (pvz., mikroemulsijos, nanoemulsijos) ir maţos koncentracijos mėginių molekulių dydį [39].
4.5.2. Ramano spektroskopija
Spektroskopiniai analizės metodai plačiai taikomi farmaciniuose tyrimuose. Dėl savo universalumo, vibracinė spektroskopija yra vienas pagrindinių analizės metodų, taikomų kokybės kontrolės laboratorijose ar analizuojant mėginius, kurių struktūra bandinio paruošimo metu (papildomai filtruojant, skiedţiant ar kitaip apdorojant) gali smarkiai pakisti. Ramano spektroskopija yra viena vibracinės spektroskopijos rūšių ir yra susijusi su artimojo ir vidutinio infraraudonojo spektro spektroskopija [32, 33]. Dėl technologinės paţangos ir naudojimo įvairiuose specialiuose tyrimuose kaip farmakologiškai aktyvių madţiagų ir kaip atskirų vienetų, ir kaip esančių atitinkamoje vaisto formoje, identifikavimas, charakterizavimas, tyrinėjimas, polimorfinių vaistų (pvz., karbamazepinas, nifedipinas ir kt.) analizė, kristalinių formų charakterizavimas ir nagrinėjimas, Ramano spektroskopija vis plačiau taikoma farmacijos pramonėje [33, 34].
Ramano spektroskopija matuoja įvairių molekulės dalių vibracinius pokyčius. Šie pokyčiai priklauso nuo ryšių stiprumo ir ryšius sudarančių atomų masės, taip pat priklauso ir nuo tarpmolekulinių sąveikų mėginiuose. Todėl molekulių vibracinių pokyčių „struktūra― yra
charakteringa molekulių rūšiai, o kietuose mėginuose kristalinėms molekulių konfigūracijoms [32, 33, 35].
4.5.3. Mikroskopija
Nors poliarizuotos šviesos mikroskopija patvirtina mikroemulsijos sistemos optinį izotropiškumą, tradicinė optinė mikroskopija negali būti naudojama mikroemulsijoms studijuoti dėl itin maţo lašelių dydţio. Vis dėlto transmisinė elektroninė mikroskopija (TEM), suderinta kartu su pavyzdţio uţšaldymo nuskeliant metodu gali būti sėkmingai taikoma mikroemulsijų charakterizavimui [5]. Mikroemulsijų struktūros jautrumas temperatūrai ir artefaktų atsiradimas bandinio paruošimo metu yra pagrindinis trūkumas, naudojant šį metodą [4, 13]. Kitos problemos, tai (1) elektronai gali indukuoti chemines reakcijas, tuo būdu keisdami mikroemulsijų struktūrą, (2) kontrasto stoka tarp mikroemulsijos stuktūros ir aplinkos (terpės) [4].
Kontroliuojamų uţšaldymo greičio kamerų įdiegimas, patobulinimai terminėje fiksacijoje sudaro galimybes itin staigiam tiriamų pavyzdţių uţšaldymo greičiui išvystyti (105 K/s), kad būtų
išvengta kristalų susiformavimo [4]. Krio – TEM ir pavyzdţio uţšaldymo nuskeliant TEM suteikia galimybę tiesioginei mikroemulsijų struktūrų vizualizacijai, išvengiant artefaktų keliamų problemų [4, 12, 13, 16, 19].
Transmisinės elektroninės mikroskopijos dėka galima stebėti ir mikrostruktūrinius perėjimus mikroemulsijų sistemose. Trūkumas – galimas bandinio uţteršimas ir daug atidumo reikalaujantis fotomikrodiagramų įvertinimas, atskiriant mikroemulsijas sudarančius lašelius nuo ledo sferinių dalelių [4, 5, 16].
4.5.4. Laidumas ir klampumas
Mikroemulsijų prigimtis ir fazių inversijos fenomenas gali būti nustatomi naudojant klasikinius reologinius metodus ir vykdant laidumo matavimus. Klampumo tyrimas suteikia naudingos informacijos apie tai, kaip koloidinės sistemos gali įtakoti vaistinių medţaigų atpalaidavimą. Ištisinės vandeninės mikroemulsijos pasiţymi aukštomis elektrinio laidumo reikšmėmis, kai tuo tarpu ištisinės aliejinės mikroemulsijos rodo menką laidumą arba yra visiškai nelaidţios, tai padeda nustatyti mikroemulsijos tipą ir fazių inversiją [3, 4, 5, 12, 13, 19, 42].
4.5.5. Branduolių magnetinis rezonansas
Metodas naudojamas matuojant savaiminės difuzijos koeficientus mikroemulsijų sistemose ir matuojant atskirų mikroemulsiją sudarančių komponentų savaiminius difuzijos koeficientus. Lyginant gautus grafikus galima identifikuoti mikroemulsijų tipą, ar net jos sudėtį [3, 4, 5, 12, 18, 19].
5. EKSPERIMENTINĖ DALIS
5.1. Darbe naudota aparatūra, medţiagos ir reagentai
Aparatūra: Analitinės svarstyklės GX — 200 — EC (A&D Instruments, Japonija)
Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
Modifikuotos Franz tipo celės (Kaunas, Lietuva)
Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) sistema (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonija)
Du siurbliai - Shimadzu LC – 10AD,
Degazatorius – DGU – 14A,
Automatinė mėginių įleidimo sistema – SIL – 10AD VP,
Sistemos reguliatorius kontroleris (valdymo ir duomenų registravimo sistema) – SCL – 10A VP,
UV — matomos šviesos detektorius – SPD – 10A;
Kolonėlės termostatas – CTO – 10AC VP.
Chromatografinė kolonėlė 125 x 4 mm, LiChrospher ®100 RP – 18, 5 µm (Merck KGaA, Darmstadt, Vokietija).
Magnetinė maišyklė su kontroliuojamos temperatūros šildymo įrenginiu (MSC Basic, Yellow line by IKA®, Werke GmbH & Co. KG Staufen, Vokietija)
Malvern ZetaSizer Nano — S aparatas (Malvern Instruments, Ltd., Didţioji Britanija)
Mikroskopas — MOTIC B3 — 220ASC (Motic China group Co. Ltd., Kinija)
Konfokalinis lazerinis skenuojantis mikroskopas NT-MDT Inc., integruotas su invertuotu mikro-Ramano spektroskopu NTEGRA Spectra
Ultragarso vonelė Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin electronic, Vokietija)
UV spektrometras — UNICAM Helios λ (Unicam, Kembridţas, Didţioji Britanija)
Medţiagos
Dializės membrana Biotech Regenerated Cellulose (RC) Membrane (Nyderlandai) Laboratoriniai indai
Laboratorinės stiklinėlės (25, 50, 250 ml)
Mentelės
Stiklinės lazdelės
Magnetukai 15x6 mm (Heidolph, Vokietija)
UV — kiuvetės (STARSTEDT, Aktiengesellschaft & Co., Vokietija)
Reagentai
Distiliuotas vanduo (Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros laboratorija, LSMU, Lietuva)
Etanolis 96,3º (AB „Stumbras―, Kaunas, Lietuva)
Etilo oleatas 70 % (Alfa Aesar GmbH & Co KG, A Johnson Mattey Company, Karlsruhi, Vokietija)
Izopropilo miristatas 98 % (Alfa Aesar GmbH & Co KG, A Johnson Mattey Company, Karlsruhi, Vokietija)
Labrasol® (kaprilo/kaprio makrogol – 8 – gliceridai), (Gattefosse, Prancūzija)
Plurol isostearique® (poligliceril -6 izostearatas), (Gattefosse, Prancūzija)
Polietileno glikolis 400 (Carl Roth GmbH Karlsruhe, Vokietija)
Tolnaftatas (AB „Sanitas―, Kaunas, Lietuva)
Tween® 20 (Applichem GmbH, Vokietija)
Tween® 80 (Applichem GmbH, Vokietija)
5.2. Mikroemulsijų su etilo oleatu ir izopropilo miristatu gamyba ir vertinimas
Pagamintos mikroemulsijos (ME) buvo tiriamos dinaminiu šviesos sklaidos metodu, norint nustatyti dalelių dydį bei įvertinti paruoštų mėginių homogeniškumą, monodispersiškumą. Matavimai pakartoti po 2 mėn. Mikroemulsijų dalelių dydis buvo matuojamas 173° kampu, 25° C temperatūroje, naudojantis Malvern ZetaSizer Nano — S aparatu (Malvern Instruments Ltd., England).Mikroemulsijos buvo pagamintos naudojant šias medţiagas: Labrasol®
– surfaktantas, Plurol isostearique® – kosurfaktantas, izopropilo miristatą (IPM), etilo oleatą (EO) — aliejinės fazės ir distiliuotą vandenį. Medţiagos pasirinktos dėl prasiskverbimą pro odą gerinančių savybių, maţo toksiškumo ir odos dirginimo. Tyrime naudojamos aliejinės fazės, surfaktantas ir kosurfaktantas daţnai naudojami mikroemulsijų gamyboje [5, 7, 10, 11, 18, 19, 28, 30]. Mikroemulsijų komponentų koncentracijos mišiniuose (4 lentelė) pasirinktos remiantis A/V mikroemulsijų gamybą aprašančia literatūra [40, 41].
4 lentelė. Mikroemulsijų komponentų kiekiai pagal A/V mikroemulsijų gamybą aprašančią literatūrą. Aliejinė fazė (m/m%) Surfaktantas (m/m%) Kosurfaktantas (m/m%) Vanduo (m/m%) MEIPM 7 44 14 35 MEEO 7 44 14 35
5.3. Tolnaftato tirpumo surfaktante ir aliejinėje fazėje tyrimas efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu
Tolnaftato tirpumas buvo vertinamas izopropilo miristate ir Labrasol®. Šios medţiagos pasirinktos dėl jų plataus panaudojimo mikroemulsijų gamybai, prasiskverbimą pro odą gerinančių savybių ir nedidelio toksiškumo bei odos sudirginimo, remiantis įvairiais atliktų mokslinių tyrimų straipsniais [5, 7, 10, 11, 18, 19, 28, 30].
Pagaminta po 3 mėginius, tirpinant 250 mg tolnaftato 3 ml surfaktanto (Labrasol®) ir 3 ml aliejinės fazės (izopropilo miristato). Tirpumo testas atliktas kambario temperatūroje, vibracinėje purtyklėje purtant mėginius 48 valandas. Po to mėginiai paruošiami analizei efektyviaja skysčių chromatografija (ESC): nucentrifuguojami, tirpalas filtruojamas. Kiekvieno mėginio paimama 10 µl ir praskiedţiama mėgintuvėlyje iki 10 ml 96,3 % etanoliu. Analizei paimama po 1 ml tirpalo.
ESC analizei naudojama LiChrospher®100 RP – 18 kolonėlė su blokuotomis silanolinėmis grupėmis, 125 x 4 mm, uţpildyta 5 µm dydţio dalelėmis (Merck KGaA, Darmstadt, Vokietija). Judri fazė sudaryta iš 70 % metanolio ir 30 % dukart distiliuoto vandens mišinio. Judrios fazės tekėjimo greitis 0.8 ml/min, injekuojamas bandinio tūris – 10 µl. Kolonėlės temperatūra 40 °C, UV detektoriaus bangos ilgis – 257 nm. Tolnaftato sulaikymo laikas 13.2 min.
Rezultatai įvertinti naudojant ESC tolnaftato metanolyje kalibracinę 0,6 — 100 µg/ml kreivę. Tolnaftato koncentracija [µg/ml] paskaičiuota pagal ekspresinę lygtį: x = (y + 3.8541) / 25.982 (R2
= 0.9999).
5.4. 1 % tolnaftato mikroemulsijų gamyba ir vertinimas
Norint įvertinti papildomų medţiagų įtaką mikroemulsijų susiformavimui, tolnaftato tirpumo pagerinimui, pagaminta 14 skirtingos sudėties bei tos pačios sudėties kintamo medţiagų santykio mėginių (5 lentelė), naudojant šias medţiagas ir keičiant gaminimo tvarką: Tolnaftatas, Labrasol®
Tween® 20, Tween® 80, Plurol isostearique®, etanolis 96,3º, PEG 400, izopropilo miristatas, etilo oleatas, distiliuotas vanduo. Papildomos medţiagos, kurios pasirinktos sudarant mikroemulsijas, daţnai naudojamos mikroemulsijų gamyboje kaip surfaktantai, kosurfaktantai ar tirpumą gerinančios medţiagos [5, 7, 28, 30, 43].
Nr. 1, Nr. 2 paţymėtų mišinių gamyba: tolnaftatas tirpinamas aliejinėje fazėje (izopropilo miristatas) 25 °C kambario temperatūroje, maišant magnetine maišykle 400 aps./min., 20 min., po to, pridedama surfaktanto (Labrasol®), maišoma apie 5 minutes magnetine maišykle, ištirpus vaistinei medţiagai, įdedama kosurfaktanto (Plurol isostearique®), ir maišoma 5 min., lašinamas distiliuotas
vanduo. Po 3 g vandens pridėjimo mišinys susidrumsčia, nuo 5 g vandens, tirpalas skaidrėja ir sulašinus visus 6 g tirpalas lieka skaidrus.
Nr. 3 paţymėto mėginio gamyba: tolnaftatas tirpinamas surfaktante (Labrasol®) 25°C kambario temperatūroje, maišant 400 aps./min greičiu, 20 min. Ištirpus vaistinei medţiagai pridedama aliejinė fazė (etilo oleatas), maišoma 5 min., pridedama kosurfaktanto (Plurol isostearique®), maišoma
5 min., sulašinamas etanolis, po to lašinamas distiliuotas vanduo. Gautas mišinys — skaidrus.
Nr. 4, Nr. 5 paţymėtų mėginių gamyba mišinių gamyba: tolnaftatas tirpinamas surfaktante (Labrasol®) 25°C kambario temperatūroje 400 aps./min, 20 min. Ištirpus pridedama aliejinė fazė (etilo oleatas), po 5 min. maišymo dedami kosurfaktantas (Plurol isostearique®) ir Tween® 20, pabaigoje lašinamas distiliuotas vanduo. Gauti skaidrūs tirpalai.
Nr. 6 paţymėto mėginio gamyba: tolnaftatas tirpinamas 25°C kambario temperatūroje surfaktante (Labrasol®), maišoma 400 aps./min. greičiu 20 min. Ištirpus vaistinei medţiagai pridedama PEG 400 ir Tween® 80, maišoma 5 min. Po to įlašinama aliejinė fazė (izopropilo miristatas), maišoma 5 min., lašinamas distiliuotas vanduo. Sulašinus 3,5 g tirpalas susidrumsčia, nuskaidrėja po 5,5 g vandens. Sulašinus 6,8 g vandens, mišinys išlieka skaidrus.
Nr. 7 paţymėto mėginio gamyba: tolnaftatas tirpinamas surfaktanto (Labrasol®) ir PEG 400 mišinyje 25°C kambario temperatūroje, 400 aps./min. Po 20 min., ištirpus vaistinei medţiagai, pridedama aliejinė fazė (izopropilo miristatas). Po 5 min. maišymo, lašinamas distiliuotas vanduo, po 3 g mišinys susidrumsčia ir sulašinus 5 g nuskaidrėja. Gautas skaidrus tirpalas.
Nr. 8 – 11 paţymėtų mišinių gamyba: tolanftatas tirpinamas surfaktante (Labrasol®) 25°C kambario temperatūroje magnetinės maišyklės pagalba 20 min., 400 aps./min. Ištirpus vaistinei medţiagai pridedama aliejinė fazė (izopropilo miristatas), maišoma 5 min. Po to pridedamas PEG 400 ir Plurol isostearique® mišinys santykiais (1:3, 1:5, 3:1, 5:1), maišoma 5 min. Pabaigoje lašinamas distiliuotas vanduo, po 3 – 4 g vandens pridėjimo mišinys susidrumsčia, sulašinus 7 g tirpalas nuskaidrėja ir išlieka skaidrus sulašinus 9 g distiliuoto vandens.
Nr. 12 – 14 paţymėtų mišinių gamyba: tolnaftatas tirpinamas aliejinėje fazėje (izopropilo miristatas) 30°C (Nr.12), 31°C (Nr.13), 34°C (Nr.14) temperatūrose, naudojant magnetinę maišyklę 25
min. 400 aps./min, atskirai su vandenine faze magnetinės maišyklės pagalba sumaišomi surfaktantas (Labrasol®) ir kosurfaktantas (Plurol isostearique®). Gautas mišinys sumaišomas su aliejiniu tolnaftato tirpalu. Maišymas atliekamas kambario temperatūroje, 400 rpm. Gaunami skaidrūs tirpalai.
5 lentelė. 1 % tolnaftato mėginių sudėtis ir komponentų koncentracijos.
Komponentai (% m/m) Mėginių Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tolnaftatas 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Labrasol® 44 44 37 34 44 20 35 25 25 25 25 27 32 37 Plurol isostearique® 14 14 14 14 14 — — 4 6 20 18 14 14 16 Etilo oleatas 7 — 7 7 7 — — — — — — — — — IPM — 7 — — — 10 10 5 5 5 5 26 21 16 PEG 400 — — — — — 15 24 20 18 4 6 — — — Tween® 20 — — — 9 11 — — — — — — — — — Tween® 80 — — — — — 20 — — — — — — — — Etanolis — — 6 — — — — — — — — — — — Vanduo 35 35 35 35 23 34 30 45 45 45 45 32 32 30
5.5. Tolnaftato mikroemulsijų fazių diagramų sudarymas, esant skirtingiems
surfaktanto ir kosurfaktanto santykiams 5:1, 3:1, 2:1
Mikroemulsijų fazių diagramos, remiantis literatūros šaltiniais [10, 11, 13, 42], sudarytos esant skirtingiems surfaktanto ir kosurfaktanto santykiams 5:1, 3:1, 2:1. Pagaminti mišiniai, kuriuose surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio ir izopropilo miristato santykiai yra: 4:1, 3:1, 2.5:1, 2.2:1, 2:1. Į kiekvieną pagamintą mišinį lašinamas distiliuotas vanduo. Mišiniai stebimi vizualiai ir uţrašomi sulašinto vandens kiekiai, kuriems esant įvyksta sistemos spontaniškas nuskaidrėjimas bei susidrumstimas. Apskaičiuojamos komponentų koncentracijos ir taškai atidedami fazių diagramoje [10, 11, 13, 42].
5.6. Tolnaftato mikroemulsijų gamyba keičiant surfaktanto ir kosurfaktanto
santykius ir vandens koncentraciją, mėginių analizė
Pagaminti mišiniai su vaistine medţiaga be vandens, maišant magnetine maišykle 560 aps./min. aliejinės fazės — izopropilo miristato (IPM), kurioje ištirpinta 50 mg tolnaftato, surfaktanto ir kosurfaktanto (S/KoS) mišinius, esant skirtingiems komponentų santykiams (6 lentelė).
6 lentelė. Mikroemulsijų su tolnaftatu sudėtys.
Mikroemulsijų pavadinimai A B C D E Komponentų kiekis (% m / m) IPM 20 25 35 40 45 Labrasol®/Plurol isostearique® 80 75 70 65 60 Mišinio masė (g) 20 24 28 32 36
Mėginiai A, B, C, D, E (6 lentelė) padalijami į kelias lygias dalis, kurios ţymimos A1, A2, B1, B2 ir t.t. Lašinant distiliuotą vandenį į vieną iš jų, nustatomos mikroemulsijos susidarymo ribos, paţymimas vandens kiekis, sukeliantis sistemos nuskaidrėjimą ir susidrumstimą. Skaidrios sistemos susidarymas vertinamas kaip mikroemulsijos susiformavimas. Ţinant vandens kiekį, kurį geba talpinti mikroemulsinė sistema, iš kitų padalintų mėginių A, B, C, D, E dalių pagaminami mišiniai esant skirtingoms vandens koncentracijoms.
Mėginiai buvo vertinami dinaminiu šviesos sklaidos metodu. Nustatytas dalelių dydţio pasiskirstymas pagal intensyvumą bei įvertintas mėginių homogeniškumas. Atrinktos eksperimentinės mikroemulsijos esant S/KoS santykiams 5:1, 3:1, 2:1, kurios naudojamos tolnaftato atsipalaidavimo iš mikroemulsijų pro dializės membraną tyrime.
5.7. Tolnaftato atsipalaidavimo kinetikos iš eksperimentinių mikroemulsijų pro
dializės membraną tyrimas
Tolnaftato atsipalaidavimo iš eksperimentinių mikroemulsijų pro dializės membraną kinetikos tyrimas atliktas modifikuotose Franz tipo difuzijos celėse. Naudojami donoriniai tirpalai A2, B3, D3,
E2. Akceptorinė terpė sudaryta iš PEG 400 ir 96.3° etanolio mišinio, santykiu (1:1), tūris — 40 ml. Dializės membranos, kontaktuojančios su akceptoriniu tirpalu plotas — 1,77 cm2
. Naudojamos regeneruotos celiuliozės dializės membranos. Tyrimo metu naudojamos 4 celės. Difuzinės celės patalpintos vandens vonelėje ant magnetinės maišyklės, tyrimo metu vandens vonelėje palaikoma 37 ° ± 1° C temperatūra. Bandiniai (po 3 ml) buvo imami po 0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h, kiekvieną kartą paėmus bandinį, pripilama švieţios akceptorinės terpės (3 ml).
Tolnaftato koncentracija bandiniuose nustatoma UV spektroskopijos metodu, naudojant tolnaftato tirpumo PEG 400 ir 96.3° etanolio (1:1) mišinyje kalibracinę kreivę, tolnaftato koncentracija [1,5 — 7,5 µg/ml].
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Dalelių dydţių matavimo dinaminiu šviesos sklaidos metodu rezultatų
vertinimas
7 lentelėje pateikiami eksperimentinių mikroemulsijų (4 lentelė), pagamintų 2010 05 mėn., matavimų dinaminiu šviesos sklaidos metodu rezultatai. Iš matavimo rezultatų pastebima, jog tiek 06 mėn., tiek 08 mėn. matuotoje mikroemulsijoje, kurioje kaip aliejinė fazė buvo naudojamas IPM (MEIPM), dalelių dydis yra didesnis nei MEEO (mikroemulsija, kurioje aliejinė fazė — etilo oleatas).
Polidispersiškumo indeksas (PDI) parodo mikroemulsijos homogeniškumą, kuo PDI reikšmė arčiau 0,1 ar < 0,1 [39], tuo dispersija yra homogeniškesnė, šiuo atveju galime teigti, jog matuotos mikroemulsijos yra santykinai homogeniškos.
7 lentelė. Eksperimentinių MEIPM ir MEEO matavimųdinaminiu šviesos sklaidos metodu
rezultatų (z — vidurkio, polidispersiškumo indekso) palyginimas.
Matavimo laikas MEIPM MEEO Z — vidurkis (nm) PDI Z — vidurkis (nm) PDI 2010 06 107,6 0,268 93,94 0,295 2010 08 218,6 0,213 198,5 0,191
Lyginant mikroemulsijų matavimų duomenis matuojant iškart po gamybos ir po 2 mėnesių laikymo kambario temperatūroje, stebimas vidutinio dalelių dydţio pakitimas bei PDI pokyčiai. Nustatyta, jog pagamintos mikroemulsijos nestabilios, kadangi susiformuoja didesnio z — vidurkio dalelės, tačiau jos tiksliau atspindi mikroemulsijoje vyraujančių dalelių dydį, kadangi pikai yra siauri, lyginant su 06 mėn. išmatuotų mėginių pikais (2 pav.). Mėginius laikant 2 mėnesius 25º C kambario temperatūroje, mikroemulsijoje su etilo oleatu z — vidurkis padidėjo 53 %, o mikroemulsijoje su izopropilo miristatu — 51 %.
2 pav. Mikroemulsijų, pagamintų 2010 05 28 – 27, matavimo duomenų skirtumai po 2 mėnesių laikymo
Vertinant mikroemulsijų dalelių dydţio pasiskirstymo pagal išsklaidytos šviesos intensyvumą pikus (2 pav.), aiškai matoma, jog 08 mėn. matuotų mėginių pikai pasislenka didesnių dalelių dydţių intervalų pusėn, pikų ribojami plotai supanašėja, jie yra siauresni (2 pav. Record 7, 29). 06 mėn. matuotų mėginių dalelių dydţių pikų skirtumai ryškesni (2 pav. Record 1, 2), aiškiai matoma, jog MEEO susidaro maţesnio dydţio dalelės, tačiau dydţių intervalas, kurį parodo piko ribojamas plotas
yra didesnis lyginant su MEIPM ir pikais, kurie uţfiksuoti po 2 mėn.
6.2. Tolnaftato tirpumo vertinimas
Įvertinus tolnaftato tirpumą surfaktante ir aliejinėje fazėje (8 lentelė), nustatyta, jog tolnaftato tirpumas surfaktante yra beveik 3 kartus didesnis nei izopropilo miristate. Vaistinės medţiagos geras tirpumas surfaktante kaip ir aliejinėje fazėje yra svarbus, norint įterpti į sistemą didţiausią įmanomą vaistinės medţaigos kiekį, pagerinti jo prasiskverbimą pro odą ir sustiprinti gydomąjį poveikį.
8 lentelė. Tolnaftato tirpumas Labrasol® ir izopropilo miristate.
Tolnaftato tirpumas (µg/ml)
Surfaktantas (Labrasol) 0,142
Aliejinė fazė (IPM) 0,052
6.3. 1 % tolnaftato mikroemulsijų tyrimo mikroskopinė analizė
14 — oje skirtingos sudėties bei tos pačios sudėties kintamo medţiagų santykio mėginiuose stebint vizualiai, matomi įvairios formos bei dydţio kristalai, kurie nufotografuoti optiniu mikroskopu.
Nr. 1 ir Nr. 2 mėginiai fotografuoti po 6 mėn., Nr. 3 – 11 mėginiai - po 2,5 mėn., Nr. 12 – 14 mėginiai - po 1 mėn. laiko nuo pagaminimo datos (3 pav.).
Nr. 1 ir Nr. 2 mėginiai fotografuoti po 6 mėn. nuo pagaminimo datos.
Nr. 3 ir Nr. 4 mėginiai, fotografuoti po 2.5 mėn. nuo pagaminimo datos.
Nr. 7 ir Nr. 8 mėginiai, fotografuoti po 2.5 mėn. nuo pagaminimo datos.
Nr. 12, Nr. 13 ir Nr. 14 mėginiai, fotografuoti po 1 mėn. nuo pagaminimo datos.
3 pav. 14 mėginių mikroskopinis įvertinimas
Visuose mėginiuose susiformavo kristalai nepriklausomai nuo komponentų koncentracijų (3 pav.). Mėginiuose Nr. 7, 8, 10, 11, kuriuose papildomai buvo naudojamas PEG 400 (5 lentelė), mikroskopu matomi dideli iki 100 µm dydţio lašeliai, kurie vertinami kaip emulsijos susidarymo poţymis. Gali būti, jog sistema nepakankamai stabili, komponentų santykis neuţtikrina sąlygų, būtinų formuotis mikroemulsijai, paviršiaus įtempimas yra didelis, kuris neuţtikrina savaiminio sistemos formavimosi, sistemos laisvosios energijos reikšmė tampa didesnė uţ nulį. Nr. 9, kuriame PEG 400 ir kosurfaktanto (PI) santykis 3 : 1 (5 lentelė), emulsinių lašelių, stebint mėginį mikroskopu, nematyti (3 pav.). Nepaisant to, kristalai susidaro.
6.4. 1 % tolnaftato mikroemulsijos tyrimo Ramano spektroskopijos metodu
analizė
Norint išsiaiškinti kristalų susiformavimo prieţastį, kuri spėjama yra tolnaftato atsipalaidavimas iš tirpiklio lašelių, mėginys Nr. 14, kuriame susiformavo maţiausi kristalai ir maţiausiais jų kiekis lyginant su kitais mėginias (4 pav.), ištirtas Ramano spektroskopijos metodu.
4 pav. Mėginys Nr. 14
Lyginant grynos medţiagos tolnaftato miltelių spektrą su spektru, uţrašytu nuo kristalo paviršiaus (5 pav.), matome jog visos smailės identiškos, todėl galime teigti, jog mėginiuose vyksta tolnaftato kristalizacija, mėginiai yra nestabilūs, komponentų, santykių bei koncentracijų parinkimas šiuose mėginiuose netinkamas, jog susiformuotų 1 % tolnaftato mikroemulsijos.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 -300 -200 -100 0 100 200 R a ma n si g n a l Raman shift, 1/cm [A] Tolnaftate (5s) big drop (5s)
5 pav. Gryno tolnaftato miltelių, emulsinio lašelio Nr. 14 mėginyje (kairėje) ir Nr. 14 mėginio kristalo paviršiaus (dešinėje) Ramano spektrai
Sistemoje taip pat matomi ir gana dideli lašeliai, iš kurių vieno (6 pav.) spektras taip pat uţrašytas. Lyginant Ramano spektrą nuo lašelio paviršiaus su tolnaftato spektru, galima matyti keletą tolnaftatui būdingų pikų, tačiau organinių medţiagų mėginyje pikai didesni ir platesni, stipresnio intensyvumo ir uţgoţia tolnaftato pikus bei trukdo vertinti tolnaftato pasiskirstymą sistemoje. Vis dėlto galime manyti, jog tolnaftato yra dispersinės fazės lašeliuose, tačiau jie nestabilūs, kadangi tolnaftatas iš jų atsipalaiduoja ir greičiausiai dėl vandeninės terpės poveikio kristalizuojasi.
6 pav. Emulsinio lašelio optinis vaizdas Nr. 14 mėginyje
6.5. Mikroemulsijų su tolnaftatu fazių diagramų duomenų analizavimas
Sudarytos fazių diagramos esant skirtingiems surfaktanto ir kosurfaktanto (S/KoS) mišinio santykiams 5:1, 3:1, 2:1 (7 pav., 8 pav., 9 pav.), leidţia nuspėti mikroemulsijų susiformavimo ribas, atpaţinti galimus tarpfazinius perėjimus mikroemulsijose bei nustatyti, kuriam S/KoS santykiui esant, mikroemulsijų susiformavimo ribos yra didţiausios. Fazių diagramos kartu su kitais analizės metodais parodo, kuris S/KoS santykis yra optimalus formuojant norimo tipo mikroemulsijas, padeda įvertinti ir nustatyti kitų komponentų koncentracijas.
8 pav. Fazių diagrama, kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykis 3:1
9 pav. Fazių diagrama, kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykis 2:1
Pavaizduotose fazių diagramose apibrėţta sritis reprezentuoja skaidrių sistemų, kurios vertinamos kaip mikroemulsijos, susiformavimo ribas. Uţ mikroemulsijų susdarymo ribų susiformuoja emulsijos, drumsti koloidiniai tirpalai (7 pav., 8 pav., 9 pav.).
Faziu diagramose nepastebimi tarpfaziniai perėjimai. Duomenys parodė, jog didėjant S/KoS santykiui siaurėja mikroemulsijų susidarymo sritys ir maţėja sistemos gebėjimas inkorporuoti didesnį vandeninės fazės kiekį. Norint pritaikyti tolnaftato mikroemulsijas dermatologiniam vartojimui, svarbu įvertinti mikroemulsijų dalelių dydį, kuris itin svarbus, norint pagerinti vaistinės medţiagos prasiskverbimą pro odą ir sukelti stipresnį gydomąjį poveikį.
6.6. Tolnaftato mikroemulsijų, pagamintų keičiant surfaktanto ir kosurfaktanto
santykius, vandens koncentraciją, analizės dinaminiu šviesos sklaidos metodu
vertinimas
Remiantis fazių diagramų duomenimis, sudarytos mikroemulsijų kompozicijos: kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykis (S/KoS) 2:1 — vandens koncentracija (21 % — 92 %), izopropilo miristato (IPM) (3 % — 20 %), S/KoS (5 % — 59 %); kai S/KoS 3:1 — vandens koncentracija (14 % — 86 %), IPM (3 % — 29 %), S/KoS (11 % — 57 %); kai S/KoS 5:1 — vandens koncentracija (14 % — 50 %), IPM (10 % — 27 %), S/KoS (40 % — 64 %). Pateikiamos tolnaftato procentinės koncentracijos pagamintose mikroemulsijose (9 lentelė), sudarytų mėginių matavimų rezultatai, dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas (PDI) (10, 11 lentelės).
9 lentelė. Tolnaftato procentinė koncentracija mikroemulsijose.
S/KoS 5 : 1 S/KoS 3 : 1 S/KoS 2 : 1
Mėginys Tolnaftato koncentracija ( % ) Mėginys Tolnaftato koncentracija ( % ) Mėginys Tolnaftato koncentracija ( % ) A1 0.6 A1 0.2 A1 0.8 A2 1 A2 0.5 B1 0.7 B1 0.7 A3 0.1 B2 0.7 C1 0.6 A4 0.3 B3 0.8 C2 0.7 B1 0.4 C1 0.1 C3 0.8 B2 0.3 C2 0.6 D1 0.6 B3 0.4 C3 0.5 D2 0.7 C1 0.4 C4 0.4 D3 0.6 D1 0.5 C5 0.3 E1 0.6 D2 0.5 C6 0.1 E2 0.5 E1 0.5 D1 0.06 E2 0.4 D2 0.4 E3 0.4 D3 0.3 E1 0.4
10 lentelė. Mikroemulsijų mėginių, kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykis 5:1, matavimo dinaminiu šviesos sklaidos metodu duomenys.
S/KoS 5:1
Pikas Nr. 1 Pikas Nr. 2 Pikas Nr. 3 PDI
A1 23,46 248,7 — 0,506 A2 197,4 — — 0,209 A3 24,44 261,6 — 0,509 B1 127,1 24,55 — 0,257 C1 236,5 34,86 — 0,589 C2 134,5 23,58 — 0,251 C3 237,4 — — 0,174 D1 325,6 — — 0,195 D2 305,1 — — 0,208 D3 157,0 — — 0,242 E1 575,5 — — 0,275 E2 183,3 — — 0,213
11 lentelė. Mikroemulsijų mėginių, kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykiai 3:1, 2:1, matavimo dinaminiu šviesos sklaidos metodu duomenys.
S/KoS 3:1 S/KoS 2:1 Pikas Nr. 1 Pikas Nr. 2 Pikas Nr. 3 PDI Pikas Nr. 1 Pikas Nr. 2 Pikas Nr. 3 PDI A1 21,29 1875 — 0,244 A1 89,93 — — 0,577 A2 24,77 253,7 — 0,538 B1 149,6 33,34 — 0,176 A3 18,61 3684 — 0,207 B2 155,1 — — 0,249 A4 16,20 145,4 — 0,471 B3 214,6 — — 0,177 B1 209,1 31,26 — 0,520 C1 16,05 660,6 98,10 0,754 B2 127,3 15,10 — 0,348 C2 127,2 — — 0,295 B3 307,4 18,93 — 0,773 C3 329,2 218,9 — 0,880 C1 327,5 26,17 — 0,989 C4 419,1 18,99 — 0,824 D1 152,8 — — 0,231 C5 15,55 169,0 — 0,496 D2 212,2 — — 0,169 C6 505,9 19,20 59,34 0,920 E1 275,1 — — 0,165 D1 59,63 — — 0,285 E2 195,7 — — 0,166 D2 317,8 23,38 — 0,948 E3 144,8 — — 0,252 D3 356,3 17,08 — 0,836 — D4 17,85 116,6 717,4 0,606 — E1 402,5 23,15 — 1,000
Gauti rezultatai parodo įvairių dalelių dydţių susiformavimą mikroemulsijose, kai vienur fiksuojami 2, 3 ar tik 1 dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą pikai (10, 11 lentelės). Daugiausiai nehomogeniškų sistemų susidaro, kai S/KoS santykis 2:1. Didėjant S/KoS santykiui formuojasi mikroemulsijos, kuriose dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą pikų plotis siaurėja, tarp jų nėra ryškių dalelių dydţių skirtumų. Aiškinantis mikroemulsijų heterogeniškumo prieţastis buvo įvertinta vidurinio dalelių dydţio (z — vidurkio) priklausomybė nuo laiko (10 pav., 11 pav., 12 pav.), esant skirtingiems S/KoS santykiams mėginiuose, kuriuose uţfiksuotas vienas dalelių dydţių pasiskirstymo pikas ir mėginiuose su 2 dalelių dydţių pikais.
Z — vidurkio kitimas parodo mikroemulsijos stabilumo pokyčius esant inkorporuotai vaistinei medţiagai [40].
10 pav. Z — vidurkio priklausomybė nuo laiko C5 mikroemulsijoje su 2 pikais (kairėje), ir C2 mikroemulsijoje su 1 piku (dešinėje), kai S/KoS 2:1
Didėjantis z — vidurkis rodytų mikroemulsijoje vykstančius agregacijos, kristalizacijos, vaisto atsipalaidavimo iš dispersinės fazės procesus [8]. Šiuo atveju lyginant C5 ir C2 mikroemulsijas (10 pav), matome, jog tokie pokyčiai nevyksta, kadangi z — vidurkio reikšmė svyruoja siaurame intervale, nepastebimas ryškus z — vidurkio kilimas.
11 pav. Z — vidurkio priklausomybė nuo laiko A1 mikroemulsijoje (2 pikai), kai S/KoS 3:1
12 lentelė. Z – vidurkio nuokrypiai analizuotose mikroemulsijose.
S/KoS santykis 5 : 1 3 : 1 2 : 1
Mėginiai C3 A1 C5 C2
Z — vidurkio
nuokrypis ± 7 nm ± 0,4 nm ± 2 nm ± 6 nm
Lyginant mėginius C5, C2, A1 ir C3 matome, jog z — vidurkis kinta labai maţose ribose (12 lentelė), taigi galime teigti, jog mikroemulsijose, esant skirtingiems S/KoS santykiams, nevyksta ištirpusių vaistinės medţiagos molekulių perėjimas į vandeninę fazę, kas lemtų galimą tolnaftato išsiskristalizavimą. Siauriausiomis z — vidurkio nuokrypių ribomis pasiţymi mikroemulsija A1, kai S/KoS 3:1 (11 pav.). Detalesnė analizė, vertinant dalelių dydţius mikroemulsijoje su vaistine medţiaga be vandeninės fazės ir skiedţiant mikroemulsiją, padėtų tiksliau įvertinti vaisto poveikį sistemos stabilumui, galimybei pritaikyti terapiniam vartojimui. Šiuo atveju galime teigti, jog ištirtuose mėginiuose nevyksta nei kristalizacijos, nei agregatų formavimosi procesai.
Nepaisant to, mėginių, kuriuose fiksuojami 2 ar daugiau pikai, vidutinio dalelių dydţio negalime įvardinti kaip vyraujančio visoje mikroemulsijoje, kadangi didelis dalelių skaičius tokiose mikroemulsijose, platus dalelių dydţių intervalas, neleidţia pasikliauti išmatuotu z — vidurkiu. PDI taip pat svarbus rodiklis, kuris mikroemulsijoje su 2 ar daugiau dalelių dydţius reprezentuojančių pikų yra labai didelis > 0,4 ir parodo mėginių bidispersiškumą ar polidispersiškumą. Tokių sistemų susiformavimas gali būti aiškinamas tuo, jog mikroemulsifikacijos procese nepavyko uţtikrinti termodinaminio sistemos stabilumo. Tai įtakoti galėjo ir netinkamai parinktas S/KoS santykis, S/KoS ir aliejinės fazės santykis, per didelė vandens koncentracija.
Lyginant mėginių medţiagų koncentracijas ir vyraujančių dalelių dydţių pikus, pastebėta, jog vienas dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą pikas fiksuojamas, kai vandens koncentracija (10 % — 30 %), IPM (20 % — 30 %), S/KoS (50 % — 62 %). Du ir daugiau pikų fiksuojama, kai vandens koncentracija > 30 %, IPM < 20 %, S/KoS (3:1; 2:1) < 50 %, S/KoS (5:1) > 50 %.
Iš visų mėginių, detalesnei analizei ir vertinimui buvo pasirinkti mėginiai, kurie labiausiai tenkina mikroemulsijų apibrėţimą (mikroemulsijas sudarančių dalelių diametras yra < 200 nm), taip pat atranka vykdoma pagal šiuos kriterijus: PDI, kuris taip pat svarbus rodiklis vertinant mikroemulsijas ir šiuo atveju siekiama, jog jis būtų < 0.3, parametrą, kuris nurodomas matavimo metu ir parodo duomenų patikimumą, koreliacijos funkcijos kreivę, dalelių dydţio pasiskirstymo pagal išsklaidytos šviesos intensyvumą piką, kuris turi būti vienas, siauras, jog galėtume mėginį vertinti kaip galimai monodispersišką [39, 42]. Esant vienam dalelių dydį atspindinčiam pikui, PDI reikšmei < 0.3 ir gerai koreliacijai, galime vertinti dalelių dydţius pagal z — vidurkį, kuris yra vidutinis
hidrodinaminis diametras, apskaičiuotas pagal internacionalinius dinaminio šviesos sklaidos metodo atlikimo standartus ISO 13321 [8, 39].
Vertinant mikroemulsijas pagal minėtus kriterijus, atrinkti ir palyginti šie mėginiai, kai S/KoS 2:1 (13 lentelė).
13 lentelė. Mėginių duomenys, kai S/KoS santykis 2 : 1.
Mėginys Z — vidurkis (d. nm) PDI Vandens koncentracija
(%)
B3 182.6 0.177 21.2
B2 115.5 0.249 29.2
C2 89.11 0.295 30.7
D1 39.77 0.285 92.08
Atlikus mikroemulsijų statistinę analizę, naudojant SPSS programinės įrangos paketą, 19.0 versiją, kurios sudarytos, kai surfaktanto ir kosurfaktanto santykis 2:1 (13 lentelė), siekiant išsiaiškinti dalelių dydţių kitimą įtakojančius faktorius, nustatytas stiprus ryšys tarp dalelių dydţio ir vandens koncentracijos: Spearman‘o koeficientas (rs) = -1. Ryšys yra atvirkštinis, kuris parodo, jog dalelių
dydis kinta atvirkščiai proporcingai vandens didėjimo koncentracijai. Surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio koncentracija taip pat turi įtakos dalelių dydţių pokyčiams (rs = 1). Tačiau pastebimas PDI
reikšmės didėjimas, didėjant dalelių dydţiui. Homogeniškiausia sistema susidaro, kai z — vidurkis yra 182.6 nm, o vandens koncentracija mišinyje — 21 % (13 lentelė).
13 pav. Atrinktų 4 mėginių (13 lentelė) dalelių dydžių pasiskirstymo pagal intensyvumą pikų palyginimas
Statistinės dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą diagramos tiksliau ir aiškiau parodo dalelių dydţių pasiskirstymo intervalus, išsibarstymo plotį (14 pav., 15 pav.).
Ţiūrint į šių 4 mėginių dalelių dydţių pasiskirstymo pagal intensyvumą statistines diagramas, matome, jog B3 mėginyje dalelių dydţių pasiskirstymo ribos [105.7 nm — 396.1 nm] yra siauresnės negu likusių 3 mėginių (15 pav.), iš kurių plačiausiomis ribomis [7.5 nm — 255 nm] pasiţymi D1 mėginys, kuriame z — vidurkis yra 39.77 nm (14 pav.).
14 pav. Statistinė mėginio D1 dalelių dydžių pasiskirstymo pagal intensyvumą diagrama
15 pav. Statistinė mėginio B3 dalelių dydžių pasiskirstymo pagal intensyvumą diagrama
Lyginant D1 ir B3 mikroemulsijų diagramas (S/KoS 2:1) (14 pav., 15 pav.), matomas aiškus dalelių išsibarstymas pikų ribojamame plote. Esant vandens koncentracijai 21.2 % B3 mėginyje, dalelių dydţių intervalas siauresnis, nei D1 mėginyje, kai vandens koncentracija 92.08 %, todėl ir PDI reikšmė yra didesnė. Statistinio ryšio tarp PDI bei mikroemulsiją sudarančių komponentų ar dalelių dydţio nėra, todėl PDI kinta greičiausiai dėl dalelių skaičiaus padidėjimo sistemose, galime manyti, jog didėjanti vandens koncentracija sistemoje sukelia dinaminius pokyčius. Padidėjus vandens tūriui, esamų aliejinės fazės lašelių bendras paviršiaus plotas sumaţėja, sistemos laisvoji energija trumpam
