MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS KVERCETINUI STABILIZUOTI IR BIOFARMACINIS TYRIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

KRISTINA ŽYMANČIŪTĖ

MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS KVERCETINUI

STABILIZUOTI IR BIOFARMACINIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Lekt. dr. Modestas Žilius

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

MIKROEMULSIJŲ PRITAIKYMAS KVERCETINUI

STABILIZUOTI IR BIOFARMACINIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Lekt. dr. Modestas Žilius Data

Recenzentas Darbą atliko

Prof. Andrejus Ževžikovas Magistrantė

Kristina Žymančiūtė

Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Mikroemulsijų apibūdinimas ... 10

1.2. Mikroemulsijų gamyba ... 11

1.3. Mikroemulsijų gamyboje naudojamos pagalbinės medžiagos ... 12

1.4. Mikroemulsijų charakterizavimas, fizikiniai ir cheminiai analizės metodai. Kokybės reikalavimai ... 14

1.5. Mikroemulsijų pritaikymas apsaugant medžiagas nuo fizinio ir cheminio nestabilumo ... 15

1.6. Šviesai jautrios medžiagos nestabilumo mechanizmas. Kvercetino skilimo mechanizmai .... 16

2. TYRIMO METODIKA ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Tyrimams naudoti reagentai ir įranga ... 21

2.2.1. Naudoti reagentai ... 21

2.2.2. Naudota įranga ... 21

2.3. Tyrimų metodai ... 22

2.3.1. Kvercetino analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 22

2.3.2. Kvercetino analizės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu pritaikymas ir validacija ... 22

2.3.3. Kvercetino tirpumas ... 24

2.3.4. Mikroemulsijų gamyba... 24

2.3.5. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas ... 25

2.3.7. Kvercetino mikroemulsijų stabilumo šviesoje tyrimas ... 26

2.3.8. Kvercetino atpalaidavimo iš mikroemulsijų in vitro tyrimas ... 26

2.3.9. Statistinis duomenų vertinimas ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Kvercetino tirpumo vertinimas ... 27

3.2. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo ir fizikinių–cheminių savybių vertinimas ... 28

3.3. Kvercetino mikroemulsijų fotostabilumo vertinimas ... 35

3.4. Kvercetino atpalaidavimo iš mikroemulsijų in vitro vertinimas ... 36

4. IŠVADOS ... 38

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40

K. Žymančiūtės magistro baigiamasis darbas ,,Mikroemulsijų pritaikymas kvercetinui stabilizuoti ir biofarmacinis vertinimas‘‘/ mokslinis vadovas lekt. dr. Modestas Žilius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: Pagaminti mikroemulsijas, pritaikyti jas kvercetinui stabilizuoti ir atlikti biofarmacinį tyrimą.

Darbo uždaviniai: Įvertinti kvercetino tirpumą ir fotostabilumą šviesoje; įvertinti skirtingos sudėties mikroemulsijų fizikines ir chemines savybes bei termodinaminį stabilumą; įvertinti pasirinktų mikroemulsijų su kvercetinu fizikines ir chemines savybes; įvertinti kvercetino fotostabilumą pasirinktose mikroemulsijose; įvertinti kvercetino atsipalaidavimą iš pasirinktų mikroemulsijų.

Metodai: Kvercetino kiekybiniam nustatymui naudotas išvystytas ir validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Mikroemulsijų dalelių dydžiai ir polidispersiškumo indeksai nustatyti dinaminės šviesos sklaidos metodu. Fotostabilumo tyrimai buvo atlikti dirbtinėmis (naudojant UVA šviesos srautą skleidžiančią lempą) ir natūraliomis sąlygomis. Biofarmacinis atpalaidavimo in vitro tyrimas atliktas naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes ir regeneruotas celiuliozės membranas.

Rezultatai: Mikroemulsijų be kvercetino vidutinis dalelių dydis buvo 44,03±0,7–162,8±1,4 nm ribose, PDI - 0,151±0,009–0,338±0,05 ribose, pH buvo nuo 5,5 iki 6,7, elektrinis laidis nuo 12,6 iki 18,3 μS/cm, o klampa nuo 20,0 iki 42,1 mPa·s. Įterpus kvercetiną, mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis varijavo nuo 62,8±13,4 iki 243,6±8,2 nm, PDI buvo 0,163±0,06–0,316±0,09 ribose, pH sumažėjo iki 3,95–5,27, elektrinis laidis padidėjo iki 17,5–21,0 μS/cm, o klampa buvo 19,9–42,0 ribose mPa·s. Kvercetinas buvo nestabilus pagamintose mikroemulsijose, laikant jas natūralioje šviesoje. Didžiausias kiekis kvercetino atpalaiduotas iš QME-EtOH (srautas 427,5±54,9 µg/cm2), o mažiausias iš QME-PEG-400 (297,0±8,0 µg/cm2).

Išvados: Kvercetino įterpimui į mikroemulsijas labiausiai tinka propilenglikolis. Mikroemulsijos atitiko kokybės reikalavimus ir buvo termodinamiškai stabilios. Įterpus kvercetiną, pakito fizikinės-cheminės savybės, tačiau mikroemulsijos atitiko kokybės reikalavimus. Mikroemulsijos, sudarytos iš 33 proc. išgryninto vandens, 3 proc. izopropilo miristato, 64 proc. labrasolio ir etanolio, propilenglikolio ar PEG-400 mišinio (santykis 5:1), neapsaugo kvercetino nuo skilimo šviesoje ir nėra tinkamos sistemos kvercetino tiekimui, nes atpalaidavimo iki 2 proc. kvercetino per 4 valandas.

K. Žymančiūtė‘s final thesis for masters’s degree ”Microemulsion application for stabilization of quercetin and biopharmaceutical evaluation‘‘/ scientific supervisor lect. dr. Modestas Žilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.

Aim of the research: to produce oil-in-water type quercetin microemulsions, evaluate its photostability and evaluate quercetin release from prepared microemulsions in vitro.

Main tasks: to evaluate solubility and photostability of quercetin in components used in microemulsion formulation; to evaluate physicochemical properties and thermodynamic stability of prepared microemulsions; to evaluate physicochemical properties and thermodynamic stability of prepared quercetin microemulsions; to evaluate photostability of quercetin in microemulsions; to evaluate in vitro release of quercetin from microemulsions.

Methods: identification and quantification of quercetin was performed by validated HPLC method. The particles sizes and polydispersity index of microemulsions were determined using dynamic light scattering method. The photostability of quercetin in microemulsions were investigated under forced exposure to UVA irradiation and in natural conditions. Biopharmaceutical in vitro release studies were performed using modified Franz type diffusions cells system.

Results: Average particle size of microemulsions without quercetin was in the range of 44.03±0.7– 162.8±1.4 nm and polydispersity index was in the range of 0.151±0.009–0.338±0.05. pH values were from 5.5 to 6.7, conductivity was in the range of 12.6–18.3 μS/cm and viscosity was from 20.0 to 42.1 mPa·s. After incorporation of quercetin average particle size varied from 62.8±13.4 to 243.6±8.2 nm, polydispersity index was in the range of 0.163±0.06–0.316±0.09. pH values decreased to 3.95–5.27, conductivity increased to 17.5–21.0 μS/cm and viscosity was in the range of 19.9–42.0 mPa·s. The highest amount of quercetin was released from QME-EtOH (flux 427,5±54,9 µg/cm2) and the least amount was released from QME-PEG-400 (flux 297,0±8,0 µg/cm2).

Conclusions: Propylene glycol is the most appropriate solvent for quercetin incorporation in oil-in-water type microemulsion. Quercetin incorporation in microemulsion did not have an influence on its quality ant termodinamic stability. Microemulsions were unable to protect quercetin from degradation under natural light. The amount of quercetin released from microemulsions after 4 hours was under 2 percent.

SANTRUMPOS

a–v – aliejus–vanduo tipo mikroemulsija IPM – izopropilo miristatas

KoS – kosurfaktantas

ME – mikroemulsija be kvercetino PDI – polidispersiškumo indeksas PEG–400 – polietilenglikolis 400 QME – mikroemulsija su kvercetinu UV – ultravioletinė spinduliuotė

UVA – ultravioletinė spinduliuotė, skleidžianti 320–400 nm bangos ilgio spindulius UVB – ultravioletinė spinduliuotė, skleidžianti 290–320 nm bangos ilgio spindulius UVC - ultravioletinė spinduliuotė, skleidžianti 200–280 nm bangos ilgio spindulius v–a – vanduo–aliejus tipo mikroemulsija

ĮVADAS

Kvercetinas – natūralus flavonoidas, stiprus antioksidantas, pasižymintis priešuždegiminiu, priešvėžiniu aktyvumu, odos regeneraciją skatinančiu poveikiu [1,2]. Tai lipofilinis junginys, praktiškai netirpus vandenyje, tačiau tirpus daugelyje organinių tirpiklių. Kvercetino panaudojimą farmacijoje riboja tirpumas bei cheminis nestabilumas, maža geba prasiskverbti pro odos barjerą [1–7]. Vienas iš pagrindinių kvercetino pritaikymą ribojančių veiksnių – jautrumas šviesos poveikiui [1,8– 10].

Mikroemulsijos yra sudarytos iš vandeninės, aliejinės fazių bei paviršinio aktyvumo medžiagų (surfaktantų ir kosurfaktantų). Jos gali ištirpinti ir pernešti tiek hidrofilinės, tiek lipofilinės kilmės vaistus, pagerinti jų tirpumą. Mikroemulsijos pagerina didelių, lipofilinių molekulių skvarbą per odą, nes sudaro labai mažas daleles (10–200 nm), o itin žema paviršiaus įtemptis sistemoje užtikrina gerą kontaktą su oda. [11–13]. Literatūros duomenimis, mikroemulsijos buvo sėkmingai pritaikytos, siekiant apsaugoti oksidacijai, šarminiam pH, šviesos poveikiui jautrias medžiagas, polifenolinius junginius nuo skilimo [14–17]. Mikroemulsijos yra patrauklios išorinės vaistų formos dėl nesudėtingo gamybos proceso, termodinaminio stabilumo, mažos klampos, vaistinių medžiagų stabilumo, tirpumo ir skvarbos per odą pagerinimo [13,18].

Šio darbo tikslas yra pagaminti stabilias kvercetino mikroemulsijas ir įvertinti, ar jos apsaugo kvercetiną šviesos poveikyje. Tyrimo metu bus įvertintas kvercetino poveikis mikroemulsijos kokybei, fizikinėms ir cheminėms savybėms: termostabilumui, pH, elektriniam laidžiui, klampai, vidutiniam dalelių dydžiui ir polidispersiškumo indeksui. Taip pat bus įvertintas kvercetino stabilumas mikroemulsijose jas veikiant šviesa natūraliomis ir dirbtinėmis sąlygomis. Bus atliktas biofarmacinis

in vitro atpalaidavimo tyrimas, kurio metu bus nustatytas atpalaiduotas kvercetino kiekis iš pagamintų

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo objektas: aliejus–vanduo tipo mikroemulsijos su kvercetinu.

Darbo tikslas: pagaminti mikroemulsijas, pritaikyti jas kvercetinui stabilizuoti ir atlikti biofarmacinį tyrimą.

Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti kvercetino tirpumą ir fotostabilumą šviesoje.

2. Įvertinti skirtingos sudėties mikroemulsijų fizikines ir chemines savybes bei termodinaminį stabilumą.

3. Įvertinti pasirinktų mikroemulsijų su kvercetinu fizikines ir chemines savybes. 4. Įvertinti kvercetino fotostabilumą pasirinktose mikroemulsijose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Mikroemulsijų apibūdinimas

Mikroemulsija – skaidri, izotropinė, termodinamiškai stabili, daugiakomponentė dispersinė sistema sudaryta iš vandeninės fazės, aliejinės fazės ir paviršinio aktyvumo medžiagų – surfaktanto, kosurfaktanto. Mikroemulsijos dalelių diametras 10–200 nm [11,12,19–21]. Dalelių dydis priklauso nuo surfaktanto savybių, surfaktanto ir aliejaus anglies grandinės ilgio bei temperatūros [22]. Galimybė naudoti įvairius sudedamųjų dalių santykius, leidžia padidinti tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių vaistinių medžiagų tirpumą [12]. Mikroemulsijos laikomos stabiliausiomis iš emulsinių sistemų ir tokios išlikti gali iki kelių metų. Emulsinėms sistemoms priklauso mikroemulsijos, nanoemulsijos ir makroemulsijos. Tarpusavyje jos skiriasi išvaizda, tipais, dalelių dydžiu, formavimosi ypatumais ir fizikinėmis savybėmis [22]. Emulsinių sistemų palyginimas pateiktas 1 lentelėje.

1 lentelė. Mikroemulsijų, nanoemulsijų ir makroemulsijų charakteristikų palyginimas. Sudaryta pagal [11,13,22–24]

Charakteristikos Mikroemulsija Nanoemulsija Makroemulsija Išvaizda Skaidri Balkšva, neskaidri Drumsta, neskaidri

Tipai

I tipas: aliejus–vanduo (a–v); II tipas: vanduo–aliejus (v–a);

III tipas: trifazė biištisinė; IV tipas: vienfazė sistema. Aliejus–vanduo (a– v); vanduo-aliejus (v–a). Aliejus–vanduo (a–v); vanduo–aliejus (v–a); vanduo-aliejus–vanduo (v–a–v); aliejus–vanduo– aliejus (a–v–a). Dalelių dydis 10–200 nm 200–500 nm >500 nm

PDI Žemas Žemas Aukštas

Stabilumas Stabili

termodinamiškai

Stabilios kinetiškai (susiformavimui reikalinga energija, per laiką fazės atsiskiria), nestabilios

termodinamiškai.

Klampa Maža Didelė

Surfaktanto

koncentracija Didelė Vidutinė Maža

Gamyba Susiformuoja spontaniškai Homogenizavimas (ultragarsu ar dideliu slėgiu) Reikalingas didelis energijos kiekis (mechaninis maišymas, purtymas)

Pagal struktūrą mikroemulsijos skirstomos į aliejus-vanduo (a–v), vanduo-aliejus (v–a), biištisines bei monofazes sistemas. Pirmo tipo mikroemulsijose aliejus disperguotas vandeninėje fazėje, antro tipo mikroemulsijose vanduo disperguotas aliejinėje fazėje, o biištisinės mikroemulsijos susidaro, kai vandeninės ir aliejinės fazės santykiai yra panašūs. Mikroemulsijų stabilumas siejamas su žema paviršiaus įtemptimi tarp skirtingų fazių [25]. Termodinaminis stabilumas pasiekiamas tada, kai paviršiaus įtemptis tarp fazių yra arti 0. Tai pasiekti padeda surfaktanto bei kosurfaktanto mišinio naudojimas [11]. Jėgos tarp aliejinės ir vandeninės fazės stumia viena kitą. Surfaktantas atskiria fazes, keičia sąveikaujančių jėgų pusiausvyrą, padeda susiformuoti skirtingoms mikrostruktūroms sistemos viduje [26]. Paviršinio aktyvumo medžiaga (surfaktantas) – amfoterinė molekulė sudaryta iš hidrofilinės (polinės) „galvos“ ir hidrofobinės (nepolinės) „uodegos“ [26]. Šios savybės leidžia surfaktantui tuo pačiu metu sąveikauti su dviem skirtingom fazėm. Polinė surfaktanto dalis yra didesnė, ypač joniniuose surfaktantuose [27].

1.2.

Mikroemulsijų gamyba

Esant tinkamoms sąlygoms ir komponentų santykiui, mikroemulsija susiformuoja spontaniškai, sumaišius komponentus. Mikroemulsijos susiformavimo pagreitinimui praktikoje gai būti naudojamas maišymas ar temperatūra [11,28].

Pagrindiniai mikroemulsijų gamybos metodai:

 Fazių titravimo metodas. Vaistinė medžiaga ištirpinama aliejinėje arba vandeninėje fazėje,

maišant mišinį įdedamas tikslus surfaktanto ir kosurfaktanto kiekis. Maišant susidariusį mišinį lašinama (titruojama) aliejinė arba vandeninė fazė tol, kol mišinys nuskaidrėja [24].

 Fazių inversijos metodas. Naudojant šį metodą aliejus-vandenyje tipo mikroemulsija yra

paverčiama vanduo-aliejuje tipo mikroemulsija. Tai atliekama pridedant perteklių disperguotos fazės arba pakėlus temperatūrą [24].

Fazių diagramos parodo sistemos fazių ir skirtingų jų koncentracijų tarpusavio ryšį. Trikampio formos diagrama naudojama tiriant įprastą iš trijų komponentų (vandeninės fazės, aliejinės fazės ir surfaktanto) sudarytą sistemą [22].

1.3.

Mikroemulsijų gamyboje naudojamos pagalbinės medžiagos

Mikroemulsijos paprastai yra sudarytos iš vandeninės ir aliejinės fazių, surfaktanto ir kartais kosurfaktanto. Mikroemulsijos yra sudarytos iš šių komponentų:

Vandeninė fazė. Vandens fazėje tirpinamos hidrofilinės vaistinės medžiagos, gali būti įdėta natrio chlorido, buferio, konservantų, skvarbą gerinančių medžiagų. Norint padidinti mikroemulsijos klampą, dedama klampą didinančių medžiagų (poliakrilinės rūgšties (Carbopol®), želatinos) [11].

Aliejinė fazė. Svarbi tuo, kad ištirpina hidrofobines vaistines medžiagas. Pagerina hidrofobinių vaistinių medžiagų absorbciją pro žarnyno membranas [29]. Trumpos anglies grandinės aliejai lengviau suformuoja mikroemulsijas nei ilgesnės anglies grandinės aliejai. Tuo tarpu aliejaus geba tirpinti hidrofobines veikliąsias medžiagas priklauso nuo anglies grandinės ilgio. [30]. Dažniausiai aliejinei fazei naudojamas izopropilo miristatas ir nesočioji riebalų rūgštis – oleino rūgštis [31]. Kiti aliejinei fazei naudojami aliejai pateikti 2 lentelėje.

1 lentelė. Mikroemulsijų gamyboje aliejinei fazei naudojamos medžiagos. Sudaryta pagal [11,24,30]

Aliejinė fazė Pavyzdžiai

Sočiosios riebalų rūgštys lauro rūgštis, miristino rūgštis, kaprino rūgštis

Nesočiosios riebalų

rūgštys oleino rūgštis, linolo rūgštis, linoleno rūgštis Riebalų rūgščių ir

alkoholių esteriai izopropilo palmitatas, izopropilo miristatas, etilo oleatas

Trigliceridai (TCG):

 Ilgos grandinės TCG (riebalų rūgščių grandinės sudarytos iš ≥ 1420 anglies atomų). Augaliniai aliejai: saulėgrąžų, kukurūzų, sezamų, riešutų, sojų pupelių, alyvuogių aliejai.

 Vidutinio ilgio grandinės TCG (riebalų rūgščių grandinės sudarytos iš ≥ 612 anglies atomų). Frakcionuotas kokosų, palmių sėklų aliejus, glicerolio trikaprilatas.

 Trumpos grandinės TCG riebalų rūgščių grandinės sudarytos iš ≤ 612 anglies atomų.

Terpenai limonenas, mentolis, cineolis

Surfaktantai. Vieni arba mišinyje su kosurfaktantu mažina paviršiaus įtemptį tarp skirtingų fazių ir palengvina spontaninį mikroemulsijos susidarymą. Tam, kad susiformuotų stabili mikroemulsija, naudojama didelė surfaktanto koncentracija (30–60%) [11,22,30]. Mikroemulsijų formavimui surfaktantai sudaryti iš vienos arba dviejų anglies grandinių [31].

Surfaktantai skirstomi į:

 Nejoninius. Polisorbatas (Tween ®) 20, 40, 60, 80; sorbitano monooleatas (Span 80); Makrogolio-glicerolio ricinoleatas (Cremophor ®), Dietileno-glikolio monoetilo eteris (Transcutol ®), kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas (Labrasol ®).

 Cviterjoninius. Fosfolipidai – lecitinas iš sojų pupelių ar kiaušinių.

 Katijoninius. amonio alkilo druskos su heksadeciltrimetilamonio bromidu, didodcecilamonio bromidas.

 Anijoninius. Natrio bis-2-etilenheksilsulfosukcinatas.

Gaminant mikroemulsijas dažniausiai naudojami nejoniniai surfaktantai (~90 proc.), nes jie yra saugūs, neturi krūvio, yra mažiau toksiški [11,19,22,30]. Anijoniniai surfaktantai naudojami rečiau dėl būdingo toksiškumo (~2,5 proc.). Toksiškiausiais laikomi katijoniniai surfaktantai, jie naudojami rečiausiai (~0,6 proc.). Surfaktantai gali būti pasirenkami pagal HLB reikšmę. HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas, tai - hidrofilinių ir hidrofobinių grupių santykis surfaktanto molekulėje. Žemo HLB (3-6) surfaktantai (pvz.: kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas, polisorbatas 20, 80) tinkamesni vanduo-aliejus tipo mikroemulsijų gamybai, o aukšto HLB (8-18) (pvz.: sorbitano monostearatas 20, 80) – aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų gamybai [13,27].

Kosurfaktantai. Stabilios mikroemulsijos susiformavimą palengvina kosurfaktanto naudojimas kartu su surfaktantu. Vidutinio ilgio grandinės alkoholiai (pvz.: propilenglikolis) dar labiau sumažina paviršiaus įtemptį, padidina fazių ribos takumą, pagerina vaistinių medžiagų tirpumą ir pagreitina spontaninį mikroemulsijos susiformavimą. Trumpos ir vidutinio ilgio grandinės alkoholiai pagerina vaistinių medžiagų tirpumą fazėse [27,30,31]. Kaip kosurfaktantai yra naudojami organiniai tirpikliai – trumpos anglies grandinės (etanolis, propanolis, izopropanolis, butanolis), vidutinio anglies

grandinės ilgio (propilenglikolis, polisorbatas 80), ilgos anglies grandinės (polietilenglikoliai) [24,30,31].

Pasirenkant komponentus mikroemulsijoms, svarbu, kad jie būtų saugūs, netoksiški ir derėtų tarpusavyje. Gaminant išoriškai vartojamas mikroemulsijas svarbu, kad naudojamos medžiagos nedirgintų odos, nekimštų odos porų [25]. Pastebėta, kad mikroemulsijos komponentų kiekiai ir santykiai turi įtakos sistemos fizikinėms-cheminėms savybėms [15,16,32].

1.4.

Mikroemulsijų charakterizavimas, fizikiniai ir cheminiai analizės metodai.

Kokybės reikalavimai

Pagamintų mikroemulsijų kokybei įvertinti atliekami šie testai [15,33]:

 Organoleptinių charakteristikų vertinimas. Įvertinama mikroemulsijos išvaizda, spalva,

skaidrumas, homogeniškumas, fazių atsiskyrimo nebuvimas.

 Stabilumo testas. Atliekamas laikant mikroemulsijas skirtingose temperatūrose ar centrifuguojant. Mikroemulsijos stabilumas įvertinamas stebint ar neatsiranda fazių atsiskyrimo, susidrumstimo ar kitų nestabilumo požymių.

 pH matavimas. pH reikšmė nustatoma potentiometru. Išoriškai vartojamų mikroemulsijų pH turėtų būti 4–6 [34,35].

 Elektrinio laidumo matavimas. Naudojamas mikroemulsijos tipo nustatymui. Santykinai didelio laidumo mikroemulsijos (10–100 μS/cm) priskiriamos 1 tipui (aliejus-vanduo), o mažo laidumo (0,01−0,1µS/cm) – 2 tipui (vanduo–aliejus) [17,32,36].

 Klampos matavimas. Naudojamas mikroemulsijos tipo nustatymui. Klampa daro įtaka formuluotės stabilumui, vaistinės medžiagos atpalaidavimo greičiui. Ji priklauso nuo mikroemulsijos komponentų santykio ir koncentracijų [11].

 Lūžio rodiklio matavimas. Lūžio rodiklio testas leidžia įvertinti mikroemulsijos

skaidrumą. Skaidrios mikroemulsijos lūžio rodiklis turėtų būti 1–2 [32].

 Vidutinis dalelių dydis. Nustatomas pasitelkiant dinaminį šviesos išsklaidymo metodą.

Matavimo metu apskaičiuojamas polidispersiškumo indeksas, kuris parodo dalelių dydžio pasiskirstymą tiriamame mėginyje. Visiškai homogeniško mėginio PDI turėtų būti 0,0. Kokybiškos mikroemulsijos PDI turėtų būti ne daugiau nei 0,5 [15,37].

 Sklidumo (angl. spreadability) testas. Šis testas atliekamas išoriškai vartojamiems odos preparatams, nes parodo mikroemulsijos gebą tolygiai pasiskirstyti ant odos. Mėginio

lašas suspaudžiamas tarp dviejų stikliukų ir matuojamas susidariusios dėmės diametras [32].

1.5.

Mikroemulsijų pritaikymas apsaugant medžiagas nuo fizinio ir cheminio

nestabilumo

Dėl savo teigiamų charakteristikų, mikroemulsijų pritaikymas gali būti labai platus. Dažniausiai mikroemulsijos yra naudojamos siekiant pagerinti vaistinės medžiagos biologinį pasisavinimą, padidinant tirpumą, siekiant apsaugoti fiziškai ar chemiškai nestabilias vaistines medžiagas.

2017 metais Lietuvos mokslininkai pagamino 2 proc. resveretrolio mikroemulsiją, sudarytą iš 57 proc. surfaktanto/kosurfaktanto mišinio, 38 proc. vandeninės fazės ir 5 proc. aliejinės fazės. Resveretrolio įterpimas į mikroemulsiją, padidino jo stabilumą UVB spinduliuotei ir sulėtino skilimo procesą. Po 4 valandų poveikio UVB spinduliuote, resveretrolio koncentracija mikroemulsijoje buvo 3,2 karto didesnė nei kontroliniame etanolio tirpale [38].

Salimi A. ir Hajiani M.K (2017) suformulavo mikroemulsijas, kurios pagerino hidrochinono stabilumą. Hidrochinonas – medžiaga, gebanti apsaugoti odą nuo pigmentacinių dėmių. Dėl hidrofilinės prigimties sunkiai prasiskverbia pro odos sluoksnį bei greit oksiduojasi. Pagamintos mikroemulsijos išliko stabilios 6 mėnesius – nepakito vidutinis dalelių dydis, neatsirado fazių atsiskyrimo požymių po temperatūros pokyčių ir centrifugavimo, o hidrochinono kiekis beveik nepakito, nustatyta 99,9% pradinio kiekio. Įrodyta, kad mikroemulsijos gali apsaugoti oksidacijai jautrias medžiagas papildomai nenaudojant antioksidanto [15].

2017 metais Taivano mokslininkams pavyko sumodeliuoti polifenolinio junginio katechino mikroemulsijas išoriniam vartojimui, kurios buvo termodinamiškai stabilios. Eksperimentinių mikroemulsijų komponentai buvo: izopropilo miristatas (3–10 proc.), surfaktantų mišinys Brij35/Brij30 (15–20 proc.), katechinas (0,5–3 proc.), kosurfaktantas etanolis (21,7–30 proc.) ir distiliuotas vanduo (40–50 proc.). Praėjus trims mėnesiams po pagaminimo, katechnino koncentracija mikroemulsijoje išliko nežymiai pakitusi - 98,44 proc. [16].

Geltonas augalų pigmentas kurkuminas yra polifenolinis junginys, netirpus vandenyje, silpnai tirpsta organiniuose tirpikliuose, skyla neutraliame, silpnai baziniame pH. Gaminant aliejus-vandenyje tipo mikroemulsiją buvo panaudoti surfaktantai lecitinas ir Tween 80, aliejinei fazei – etilo oleatas, vandeninei fazei – distiliuotas vanduo. Kurkuminas ištirpintas aliejinėje fazėje. Kurkumino

mikroemulsija išliko stabili du mėnesius po pagaminimo. Kurkumino įterpimas į mikroemulsiją ne tik apsaugojo medžiagą nuo skilimo, bet ir pagerino jo tirpumą hidrofiliniame tirpiklyje [14].

2011 metais mikroemulsijos buvo sėkmingai pritaikytos apsaugant junginį nuo šviesos poveikio. Izotretinoinas – retinoinės rūgšties darinys, naudojamas aknės gydymui. Jis pasižymi blogu tirpumu vandenyje ir jautrumu šviesai. Pagaminta izotretinoino mikroemulsija buvo palikta natūralioje šviesoje. Po 4 valandų izotretinoino koncentracija mikroemulsijoje buvo 75 proc., kai tuo tarpu kontroliniame metanolio tirpale izotretinoino liko 16 proc. [39].

Yra atlikta tyrimų, kurių tikslas naudojant mikroemulsijas, apsaugoti kvercetiną nuo skilimo. 2017 metais Kinijos mokslininkai sumodeliavo kvercetino mikroemulsijas siekdami pagerinti jo tirpumą, skvarbą per odą ir padidinti stabilumą pH ir šviesoje. Aliejinei fazei buvo panaudoti eteriniai aliejai (pipirmėčių, gvazdikėlių, rozmarinų), surfaktantas – Cremophor EL, kosurfaktantas – 1,2– propandiolis, o vandeninė fazė – dejonizuotas vanduo. Nustatyta, kad kvercetinas skyla šarminėje aplinkoje, tačiau įterpus jį į mikroemulsiją, jautrumas pH pokyčiams žymiai sumažėjo. Stabilumo šviesoje testas buvo atliktas naudojant UVB lempą, skleidžiančią spektrą 270–400 nm diapazone. Kontroliniame vandeniniame kvercetino tirpale po 12,5 valandų, nesuskilusio kvercetino liko mačiau nei trečdalis, tuo tarpu mikroemulsijoje suskilo tik 7 proc. kvercetino [40].

2011 metais mokslininkai bandė sumodeliuoti v–a tipo mikroemulsiją, kuri apsaugotų kvercetiną nuo skilimo šviesoje. Mikroemulsija buvo sudaryta iš: 15 proc. vandens ir propilenglikolio mišinio (3:1) (vandeninė fazė), 46,75 proc. Span 80 ir Tween 80 mišinio (3:1) (surfaktanto/kosurfaktanto sistema), 38 proc. rapsų aliejus (aliejinė fazė) su 0,3 proc. ištirpinto kvercetino. Mikroemulsija 7 dienas buvo veikiama UVB šviesos srautu (270–400 nm, maksimumas – 313 nm. Ištyrus kvercetino kiekį ir antioksidacinį aktyvumą mikroemulsijoje, kuri buvo veikta UVB šviesos srautu ir kontrolinėje mikroemulsijoje, kuri nebuvo veikta šviesos srautu, nepastebėta jokių reikšmingų skirtumų. Įrodyta, kad v–a tipo mikroemulsija apsaugo kvercetiną nuo skilimo UVB spinduliuotės poveikyje [41].

1.6.

Šviesai jautrios medžiagos nestabilumo mechanizmas. Kvercetino skilimo

mechanizmai

Vaistinės medžiagos stabilumas šviesai gali būti apibūdinamas kaip vaistinės medžiagos atsakas ją paveikusiam UV ar regimosios šviesos srautui. Priklausomai nuo veikiamos medžiagos, gali vykti skilimo (fotolizės) reakcijos, kurių metu susidaro laisvieji radikalai arba sužadinimo reakcijos,

kurių metu vyksta tarpmolekuliniai energijos mainai. Šios reakcijos skirstomos į pirmines (fotochemines) ir antrines (chemines), kurių metu susidaro galutiniai vaistinės medžiagos skilimo produktai [42,43]. Jautrumo šviesai pasekmės – vaisto terapinio poveikio sumažėjimas ar praradimas, vaisto formos fizikinių-cheminių savybių pokyčiai (pvz.: klampos, dalelių dydžio pokyčiai) [43].

Daugelis vaistinių medžiagų absorbuoja UV spindulius tam tikrame diapazone, todėl teoriškai šios medžiagos gali būti jautrios šviesai [43]. Įvairių medžiagų jautrumą šviesos poveikiui lemia cheminė struktūra, fizinės charakteristikos ir medžiagos skilimo būdas. Junginio reaktyvumą šviesai didina šios funkcinės grupės [42]:

 Dvigubas ryšys, C=C;

 Karbonilo grupė C=O;

 Aril chlorido grupė C6H4Cl2;

 Aromatinė grupė su nitro grupe –C6H4NO2;

 Sulfidinės, alkeno, polieno, fenolinės grupės;

 Silpnas C-H ryšys.

Kvercetinas (3,3',4',5,7-pentahidroksiflavonas)– polifenolinių junginių grupei priklausantis augalinis flavonoidas, aptinkamas daugelyje vaisių ir daržovių. Kvercetinas yra stipriausias antioksidantas tarp gamtoje aptinkamų flavonoidų, taip pat pasižymi, uždegimą slopinančiomis, odos regeneraciją skatinančiomis, odos senėjimą lėtinančiomis savybėmis [1,2]. Kvercetinas – lipofilinis junginys (logP=1.82 ± 0.32), praktiškai netirpus vandenyje (0,06mg/ml, 25ºC) ir tirpus organiniuose tirpikliuose (tirpumas etanolyje - 2mg/ml, 25°C) [2]. Šios augalinės medžiagos pritaikymą praktikoje riboja mažas tirpumas vandenyje ir cheminis nestabilumas. Kvercetino skilimą skatina tirpalo pH, fermentai, metalų jonai, elektrocheminė oksidacija, aukšta temperatūra, atmosferos deguonis bei UV spindulių poveikis [1,3–7,44]. Kvercetino skilimo mechanizmai skirtingomis sąlygomis yra pavaizduoti 1 priede.

Flavonoidų cheminį nestabilumą lemia jų struktūros ypatumai. Flavonoidų struktūros pagrindui būdingi du fenolio (A ir B) ir vienas pirano (C) žiedas (bendroji flavonoidų struktūrinė formulė pavaizduota 1 paveiksle) [10]. OH grupės ir nestabilus pirano žiedas lemia cheminį junginių nestabilumą [42,44]. Vertinant kelių skirtingų flavonoidų elektrochemines savybes, pastebėta, kad OH grupių skaičius ir vieta yra labai svarbūs šių molekulių oksidaciniam mechanizmui. OH grupių skaičiaus didėjimas tiesiogiai proporcingas nestabilumo didėjimui [44,45]. Maini S. ir kt. (2012) atliko tyrimą, kurio metu siekė išsiaiškinti ar pakaitai B žiede turi įtakos flavonoidų stabilumui, juos veikiant UVA spinduliuote. Gauti rezultatai parodė, kad junginiai, turintys daugiau pakaitų B žiede, veikiami UVA spinduliuote skyla greičiau, todėl yra mažiau stabilūs. Galanginas, kuris B žiede neturi pakaitų,

veikiamas UVA spinduliais 6 valandas, išlieka stabiliausias (suskyla 24 proc.). Miricetinas, B žiede turintis tris OH pakaitus po 6 valandų UVA poveikio beveik visiškai suskilo (liko <1 proc.). Tuo tarpu kvercetino, B žiede turinčio du OH pakaitus po 6 valandų liko ~20 proc. [8]. Nepastebėta, kad OH pakaitai, esantys A žiede, turėtų įtakos kvercetino fotostabilumui [6].

Aukšta temperatūra ir tirpalo pH daro įtaką daugelio flavonoidų stabilumui [1,4]. Kvercetinas yra nestabilus organiniuose tirpikliuose (metanolyje, acetonitrile), kai pH >7 [1]. Kvercetinas skyla net ir tamsoje, jeigu tirpalo pH yra šarminis [6]. Kvercetinas oksiduojasi veikiamas deguonies vandenyje arba vandeniniame etanolio tirpale, kai pH yra 8–10, kambario temperatūroje. Oksidacija vyksta be pašalinių veiksnių – radikalų, fermentų ar šviesos poveikio. [4]. Tiriant kvercetino ir luteolino vandeninių ir alkoholinių tirpalų stabilumą deguonies aplinkoje, nustatyta, kad jie laikui bėgant oksiduojasi, mažėja jų farmakologinis aktyvumas [3]. Oksidacija paremto skilimo procesai apima tokias chemines reakcijas kaip hidroksilinimas ir dimerizacija. Pirminiai skilimo produktai yra nestabilūs. Tai lemia didelę kvercetino skilimo produktų įvairovę [46].

Kvercetino skilimas veikiant šviesa ar šarminėje terpėje vyksta dviem etapais: 1) kvercetino sąveika su tirpikliu; 2) oksidacija [6]. Kvercetino elektrocheminės oksidacijos mechanizmas yra sudėtingas ir sudarytas iš kelių reakcijų sekos. Vyksta elektrocheminių ir cheminių reakcijų etapai. Pirmame etape, po oksidacijos reakcijų susidaro chinono junginiai – orto-chinonas ir trys chinono metidai. Tai yra dažniausiai susidarantys kvercetino skilimo produktai [1]. Antrame etape vyksta cheminės reakcijos, kurių metu kvercetinas sąveikauja su tirpikliu, susidaro sudėtingi skilimo produktai: taksifolinas, depsidai, nedidelės fenolinės rūgštys, benzofuranonas, dimerai. Elektrocheminės oksidacijos procesas priklauso nuo naudojamo tirpiklio [46,47]. Buvo tirtas kvercetino stabilumas nukleofiliniuose (etanolyje ir metanolyje) tirpikliuose. Dėl oksidacijos ore ir

1 pav. Bendroji flavonoidų struktūrinė formulė

alkoholio molekulės prisijungimo prie 2,3C esančio dvigubo ryšio susidarė vienas skilimo produktas. Nenukleofiliniame tirpiklyje (acetonitrile) kvercetinas buvo stabilus [5].

Literatūros duomenimis, kvercetinas gali skilti veikiamas UV spinduliuotės [6]. Didžioji dalis Žemės paviršių pasiekiančios šviesos yra regimoji (~50 proc.) ir infraraudonųjų spindulių (~40 proc.). Apie 6-8 proc. yra UV, kuri skirstoma į UVA, UVB, UVC. UV bangų ilgiai yra trumpesni nei regimosios šviesos, todėl jie nėra matomi plika akimi. UVA spindulių bangos ilgis apima 320–400 nm, UVB – 290–320 nm, o UVC – 200–290 nm. UVC spindulius beveik visiškai sugeria ozono sluoksnis. [10,42,48,49].

Daugelis flavonoidų savo absorbcijos spektre turi dvi vietas, kuriose absorbcija didžiausia: 300–380 nm ir 240–280 nm ribose [4,33]. Kvercetino absorbcijos maksimumai yra UVA (365 nm) bei UVC (256 nm) diapazone. Didelė absorbcija UVA spinduliuotės srityje siejama su B žiedo buvimu, o UVC spinduliuotės srityje – su A ir C žiedais [5,9]. Kvercetino absorbcijos spektras pavaizduotas 3 paveiksle.

3 pav. Kvercetino absorbcijos spektras

Kvercetino absorbuota šviesa paverčiama kvercetino skilimo produktais arbai išsklaidoma karščio pavidalu [9]. Dirbtinėmis sąlygomis paveikus metanolyje ištirpintą kvercetiną 30min UVC šviesos arba 120min UVB šviesos srautu, jo kiekis atitinkamai sumažėja 95 proc. ir 50 proc. [10]. Veikiant flavonoidus UVA spinduliuote buvo išskirti tokie skilimo produktai: 1) depsidas; 2) 2,4,6 – trihidroksibenzoinė rūgštis; 3) 2,4,6-trihidroksibenzaldehidas [8]. Paveikus kvercetiną metanolyje UVA (365 nm) ar UVB (310 nm) šviesa, po 11 valandų kvercetino sumažėjo apie 17 proc. Buvo identifikuoti trys skilimo produktai: 1) 2,4,6 – trihidroksibenzaldehidas,

2-(3,4-dihidroksibenzoiloksi)-4,6-dihidroksibenzoinė rūgštis bei 3,4-dihidroksifeniletanolis. Visi trys produktai yra kvercetino C žiedo suirimo pasekmė [9].

Azzi J. ir kt (2018) tyrė vandeninio kvercetino tirpalo (5µg/ml) stabilumą, veikiant UVC spinduliuote. Po 3 valandų kvercetino koncentracija tirpale sumažėjo iki 50 proc., o po 72 valandų kvercetinas buvo visiškai suskilęs [7].

2. TYRIMO METODIKA

2.1.

Tyrimo objektas

Tyrimo objektas yra aliejus – vanduo tipo mikroemulsijos su kvercetinu.

2.2.

Tyrimams naudoti reagentai ir įranga

2.2.1. Naudoti reagentai

 Kvercetinas (grynumas ≥98,0 proc.) – Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija

 Išgrynintas vanduo

 Etanolis, 96 proc. – AB ,,Vilniaus degtinė‘‘, Vilnius, Lietuva

 Kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas (Labrasol®) – Gattefosse Saint–Priest, Prancūzija

 Polietilenglikolis-400 (PEG-400) – Carl Roth GmbH, Vokietija

 Propilenglikolis – Carl Roth GmbH+Co, Vokietija

 Izopropilo miristatas – Scharlab S. L., Ispanija

2.2.2. Naudota įranga

 Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)

 Termostatinė purtyklė (GFM, Vokietija)

 Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA® C-MAG HS 7, IKA® - Werke GmbH & Co. KG, Vokietija.

 pH–metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija))

 ZetaSizer Nano ZS aparatas (Malvern Instruments, Ltd., Jungtinė Karalystė)

 Konduktometras (Cond 3110 SET 1, Vokietija)

 Vibracinis viskozimetras (Vibro viscometer SV-10, A&D Company ltd, Japonija)

 MRL–58 Multiple–Ray UV lempa (Ultra–Violet Products Ltd., Jungtinė Karalystė) su UVA šviesos šaltiniu (spinduliuotės pikas ties 365 nm).

2.3.

Tyrimų metodai

2.3.1. Kvercetino analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Kvercetino analizė atlikta naudojant kapiliarinį skysčių chromatografą su diodų matricos detektoriumi „Agilent 1260 Infinity“. Chromatografinei analizei naudota C18 kolonėlė (150 x 0,5 mm, 5 µm dydžio dalelėmis). Judri fazė sudaryta iš 0,1 proc. TFA (trifluoracto rūgšties) vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Linijinio gradiento kitimas – nuo 10 iki 20 proc. per pirmas 5 min ir nuo 20 iki 50 proc. B per likusias 30min. Injekcijos tūris – 0,2 µl; tėkmės greitis – 20 µl/min. Kolonėlės temperatūra – 25 ºC. Kvercetino aptikimas atliktas esant 256nm bangos ilgiui [7].

2.3.2. Kvercetino analizės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

pritaikymas ir validacija

Efektyviosios skysčių chromatografijos validacijos metu įvertinti šie parametrai [50,51]:

 Specifiškumas – metodo geba atskirti norimą analitę tarp kitų junginių, priemaišų, skilimo produktų ir pan. Kvercetino specifiškumas buvo įvertintas lyginant kvercetino standarto chromatogramą su kvercetino, paveikto UV šviesos srautu, chromatogramomis, palyginti UV absorbcijos spektrai. Kvercetino sulaikymo laikas Rt – 21,8 min, analizės trukmė 35 min. Kvercetino chromatogramos PEG-400 tirpale pateiktos 4 paveiksle.

4 pav. Kvercetino chromatograma PEG-400 tirpale prieš ir po 4 savaičių natūralioje šviesoje, gauta esant 256nm bangos ilgiui. (1 – kvercetinas; 2 – po 4 savaičių susidaręs skilimo

produktas; 3 – po 4 savaičių susidaręs skilimo produktas)

1 2

 Aptikimo ribos (angl. limit of detection - LOD) ir kiekybinio nustatymo ribos (angl. limit of

quantification - LOQ) nustatytos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu.

Skaičiuojant aptikimo ribą, smailė turėtų būti 2 – 3 kartus didesnė už triukšmą, o skaičiuojant kiekybinio nustatymo ribą – 10 kartų didesnė. Kiekybinio nustatymo riba – mažiausia analitės koncentracija, kurią galima nustatyti kiekybiškai išlaikant reikiamą rezultatų tikslumą ir glaudumą.

 Tiesiškumas pasiekiamas tada, kai analitės smailės dydis chromatogramoje yra proporcingas

jos koncentracijai mėginyje. Metodo teisiškumui įvertinti, paruošti penkių skirtingų koncentracijų kvercetino etaloniniai tirpalai (1,0, 3,0, 9,0, 27,0 ir 81,0 µg/ml) iš kurių sudarytas kalibracinis grafikas. Nustatytas kalibracinio grafiko determinacijos koeficientas R2 patvirtinantis metodo teisiškumą. Kvercetino kalibracinės kreivės parametrai nurodyti 3 lentelėje.

3 lentelė. Kvercetino kalibracinės kreivės parametrai

Analitė Koncentracijos

intervalas (µg/ml) Regresijos lygtis R

2 LOD

(µg/ml)

LOQ (µg/ml)

Kvercetinas 1,0–81,0 Y = 90,93X - 60,48 0,99981 0,07 0,23

 Tikslumas ir glaudumas vertintas paruošus tris skirtingų koncentracijų (1,0, 9,0, ir 81,0 µg/ml) tą pačią dieną (pakartojamumo validacija) ir skirtingomis dienomis (atkartojamumo validacija). Tikslumas įvertintas nustačius procentinį aptiktos analitės kiekį, o glaudumas pagal santykinį standartinį nuokrypį SSN. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo tikslumo ir glaudumo reikšmės nurodytos 4 lentelėje.

2 lentelė. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo tikslumo ir glaudumo reikšmės pakartojamumo ir atkuriamumo sąlygomis

Analitė Pakartojamumas Atkuriamumas Tikslumas (%) Glaudumas SSN (%) Tikslumas (%) Glaudumas SSN (%) Kvercetinas 84,7–105,5 1,77–5,49 91,5–120,3 1,34–7,90

2.3.3. Kvercetino tirpumas

Įvertintas kvercetino tirpumas mikroemulsijų komponentuose: izopropilo miristate, labrasolyje, propilenglikolyje, PEG-400 ir 96 proc. etanolyje. Į kiekvieną tirpiklį buvo įdėtas perteklinis kvercetino kiekis, parinktas pagal literatūroje rastas kvercetino tirpumo reikšmes [18,52– 55]. Kvercetino tirpalai buvo laikomi termostatinėje purtyklėje 48 valandas esant 25 °C ir 100 aps/min purtymo greičiui, apsaugoti nuo šviesos. Gauti tirpalai filtruoti per membraninį filtrą (0,22 µm) ir analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Kvercetino tirpumo tyrimas atliktas 3 kartus.

2.3.4. Mikroemulsijų gamyba

Pagamintos trys mikroemulsijos naudojant skirtingus kosurfaktantus. Mikroemulsijos sudarytos iš vandeninės ir aliejinės fazės bei surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio. Visose mikroemulsijose vandeninė fazė – išgrynintas vanduo, aliejinė fazė – izopropilo miristatas, surfaktantas – labrasolis, keičiamas kosurfaktantas – 96 proc. etanolis, propilenglikolis ar PEG-400. Gamintų mikroemulsijų sudėtys ir komponentų santykiai nurodyti 5 lentelėje.

3 lentelė. Mikroemulsijų sudėtys ir komponentų santykiai [56].

ME Vandeninė fazė Aliejinė fazė Surfaktantas Kosurfaktantas 1ME

Išgrynintas vanduo Izopropilo miristatas Labrasolis

96 proc. etanolis

2ME Propilenglikolis

3ME PEG-400

33% 3% 64%, santykis 5:1

Mikroemulsijos pagamintos titravimo aliejumi metodu. Maišant ant magnetinės maišyklės sumaišytas išgrynintas vanduo bei surfaktanto ir kosurfaktanto mišinys, lašinta aliejinė fazė.

Gaminant kvercetino mikroemulsijas, dėl mažo tirpumo vandenyje bei izopropilo miristate, kvercetinas buvo ištirpintas aliejinėje fazėje, surfaktante bei kosurfaktantuose [18]. Kvercetinas gerai tirpsta, PEG-400, labrasolyje, propilenglikolyje ir etanolyje [53,54]. Siekiant išvengti kvercetino skilimo, mikroemulsijų gamybos metu visi komponentai buvo apsaugoti nuo šviesos. Komponentuose

ištirpintas toks kvercetino kiekis, kuris turėtų laisvai ištirpti, atsižvelgiant į kvercetino tirpumo komponentuose tyrimo rezultatus.

Paruošti mikroemulsijų komponentų tirpalai 48 valandas buvo laikomi termostatinėje purtyklėje esant 25±1 °C temperatūrai ir 100 aps/min purtymo greičiui, apsaugoti nuo šviesos. Po dviejų parų kvercetino koncentracija kiekviename komponente buvo įvertinta kiekybiškai efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Gaminant kvercetino mikroemulsijas, ant magnetinės maišyklės buvo sumaišyti vandens bei surfaktanto ir kosurfaktanto mišiniai su ištirpintu kvercetinu, lašintas aliejus su ištirpintu kvercetinu.

2.3.5. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas

Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų termodinaminis stabilumas įvertinamas atliekant šešis ciklus. Atliekami trys šildymo – šaldymo ciklai, kai mikroemulsijos 48 valandas laikomos 45 °C temperatūroje, tada 48 valandas 4 ºC temperatūroje. Po kiekvieno ciklo vizualiai vertinama mikroemulsijų išvaizda, ar nėra fazių atsiskyrimo požymių, susidrumstimo. Po to atliekami trys užšaldymo – atšildymo ciklai, kai mikroemulsijos 48 valandas laikomos -21 °C, tada 48 valandas 25ºC temperatūroje. Po kiekvieno ciklo vėl vykdomas vizualinis mikroemulsijos vertinimas.

2.3.6. Mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių nustatymas

Tiriamas pagamintų aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas

,

pH, elektrinis laidumas ir klampa. Vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas nustatyti naudojant dinaminės šviesos sklaidos metodą, ZetaSizer Nano ZS aparatą. Šviesos išsklaidymo kampas – 173 °, temperatūra – 25 ºC. Klampa nustatyta naudojant vibracinį viskozimetrą; pH reikšmė – pH–metrą; elektrinis laidumas – konduktometrą.

2.3.7. Kvercetino mikroemulsijų stabilumo šviesoje tyrimas

Kvercetino mikroemulsijos (QME–EtOH, QME–Pg, QME–PEG–400) bei mikroemulsijų komponentai su ištirpusiu kvercetinu (izopropilo miristatas, labrasolis, PEG–400, propilenglikolis, 96 proc. etanolis) buvo 6 valandas veikiami UVA spinduliuote 853,8–1307,5 μW·cm−2 intensyvumu (bangos ilgis 370 nm). Atstumas tarp mėginių ir šviesos šaltinio buvo 5 cm. Tyrimo trukmė – 6 valandos. Mėginiai buvo imami po 1 val, 2 val, 4 val ir 6 val, skiedžiami etanoliu ir filtruojami per membraninį filtrą (0,22 µm). Mėginių analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Kvercetino mikroemulsijos (QME-EtOH, QME-Pg, QME-PEG-400) bei mikroemulsių komponentai su ištirpusiu kvercetinu (izopropilo miristatas, labrasolis, PEG-400, propilenglikolis, etanolis) 4 savaites buvo laikomi ant palangės natūralioje šviesoje. Mėginiai buvo imami po 2 ir po 4 savaičių, skiedžiami etanoliu ir filtruojami per membraninį filtrą (0,22 µm). Mėginių analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2.3.8. Kvercetino atpalaidavimo iš mikroemulsijų in vitro tyrimas

Kvercetino atpalaidavimo iš aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų tyrimai (n=2) in vitro buvo atlikti naudojant modifikuotas Franz-tipo difuzines celes ir regeneruotas celiuliozės dializės membranas. Membranos difuzijos plotas – 1,13 cm2_{. Pasirinkta akceptorinė terpė – propilenglikolis, jo} tūris – 20ml. Pasirinktas akceptorinės terpės tūris neribojo kvercetino tirpumo ir tirpimo proceso. Akceptorinės terpės temperatūra – 32±1 °C, kuri palaikoma maišant. Akceptorinės terpės mėginiai (1ml) buvo imami po 30min, 1, 2, 3 ir 4 valandų, paimtą kiekį pakeičiant tokiu pačiu kiekiu šviežios terpės. Paimti mėginiai perfiltruoti per membraninį filtrą (0,22 µm) ir analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2.3.9. Statistinis duomenų vertinimas

Tyrimų metu gautų duomenų statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2010‘‘ ir SPSS 25.0 statistinės duomenų analizės paketus. Buvo skaičiuojami gautų rezultatų imčių vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, determinacijos koeficientai, taikytas vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (angl. One–Way ANOVA), naudojant LSD (angl. Least Significant Difference) kriterijų. Statistinio reikšmingumo lygmuo p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

Kvercetino tirpumo vertinimas

Atliekant kvercetino tirpumą mikroemulsijos komponentuose, nebuvo vertintas kvercetino tirpumas vandenyje. Literatūros duomenimis, esant 16°C temperatūrai, kvercetino tirpumas vandenyje siekia vos 0,06mg/ml [52,55]. Teoriškai apskaičiuota kvercetino tirpumo vandenyje reikšmė yra 0,261mg/ml [55]. 2014 metais JAV mokslininkai tirdami bevandenio kvercetino ir kvercetino dihidrato tirpumą vandenyje gavo dar mažesnes reikšmes. Esant 25°C temperatūrai, bevandenio kvercetino tirpumas – 0,00215mg/ml, o kvercetino dihidrato tirpumas – 0,00263mg/ml [57].

Kvercetino tirpumo mikroemulsijų komponentuose (surfaktante ir kosurfaktantuose) rezultatai pateikti 5 paveiksle.

5 pav. Kvercetino tirpumas mikroemulsijos komponentuose (surfaktante ir kosurfaktantuose)

Kvercetinas blogiausiai tirpsta ir izopropilo miristate (0,46±0,11 mg/ml). Jame kvercetino ištirpo 56–123 kartų mažiau nei kituose tirpikliuose. Atlikus statistinę analizę, nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp izopropilo miristato ir kitų mikroemulsijos komponentų gebos ištirpinti kvercetiną. Gauta tirpumo reikšmė patvirtina, kad kvercetino tirpumas izopropilo miristate yra labai mažas. Kitahawa S. ir kt. (2009) taip pat nustatė labai mažą kvercetino tirpumą izopropilo miristate – 0,173 mg/ml [18]. Tirpumo tyrimo rezultatai parodė, kad geriausiai kvercetinas tirpsta kosurfaktante PEG–400 (56,61±12,62 mg/ml) ir surfaktante labrasolyje (35,66±12,62 mg/ml). Nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp kvercetino tirpumo PEG-400 ir kituose

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Etanolis Propilenglikolis Labrasolis PEG-400

K ve rc et in a s, m g/ m l

komponentuose. Nustatytas statistiškai nereikšmingas (p>0,05) skirtumas tarp kvercetino tirpumo 96 proc. etanolyje, propilenglikolyje ir labrasolyje.

3.2.

Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo ir fizikinių–cheminių savybių

vertinimas

Atlikus tris šildymo-šaldymo ciklus nepastebėta jokių vizualinių pakitimų (susidrumstimo, fazių atsiskyrimo, spalvos pokyčių) visose mikroemulsijose. Atlikus tris užšaldymo-atšildymo ciklus nepastebėta jokių vizualinių pokyčių visose mikroemulsijose.

Fizikinės – cheminės mikroemulsijų be kvercetino savybės buvo įvertintos pagaminimo dieną. Fizikinės – cheminės kvercetino mikroemulsijų savybės įvertintos pagaminimo dieną ir praėjus 1, 2, 3 ir 4 savaitėms po pagaminimo. Fizikinių – cheminių kvercetino mikroemulsijų savybių (pH, elektrinio laidžio, klampos) rezultatai pateikti 6–10 paveiksluose.

6 pav. Kvercetino mikroemulsijų pH tyrimo rezultatai

Mikroemulsijų be kvercetino (ME-EtOH, ME-Pg ir ME-PEG-400) pH pagaminimo dieną atitinkamai buvo 5,5, 6,1 ir 6,7. Silpnomis rūgštinėmis savybėmis pasižyminčio kvercetino įterpimas į mikroemulsijas sumažino jų pH [58]. QME-ETOH pH buvo mažesnis 28,2 proc., QME-Pg pH buvo mažesnis 30 proc., o QME- PEG-400 pH buvo mažesnis 21,3 proc. Visose kvercetino mikroemulsijose stebimas pH mažėjimas jas laikant keturias savaites kambario temperatūroje. Po 4 savaičių labiausiai pH sumažėjo QME-Pg (14,8 proc.) ir QME-PEG-400 (10,2 proc). Mažiausiai pH pakito mikroemulsijoje, kurioje kosurfaktantas etanolis, sumažėjo vos 1,5 proc.

0 1 2 3 4 5 6

KoS - EtOH KoS - Pg KoS-PEG-400

pH

QME pagaminimo dieną QME po 1 savaitės QME po 2 savaičių QME po 3 savaičių QME po 4 savaičių

7 pav. Kvercetino mikroemulsijų elektrinio laidžio tyrimo rezultatai

Mikroemulsijų be kvercetino (ME-EtOH, ME-Pg ir ME-PEG-400) elektrinis laidis pagaminimo dieną atitinkamai buvo 14,5, 12,6 ir 18,3 μS/cm. Kvercetino įterpimas į mikroemulsijas su kosurfaktantu etanoliu ir propilenglikoliu žymiai padidino jų laidį. QME-EtOH elektrinis laidis buvo didesnis 44,8 proc., o QME-Pg elektrinis laidis buvo didesnis 54,8 proc. Tuo tarpu QME-PEG-400 elektrinis laidis pagaminimo dieną buvo nežymiai mažesnis (0,8 proc.) nei ME-PEG-QME-PEG-400. Visose kvercetino mikroemulsijose stebimas elektrinio laidžio padidėjimas jas laikant keturias savaites kambario temperatūroje. Labiausiai elektrinis laidis didėjo Pg (36,4 proc.), o mažiausiai – QME-PEG-400 (1,1 proc). QME-EtOH elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 13,8 proc. Elektrinio laidžio didėjimas rodo vykstantį perkoliacijos reiškinį, kai dėl tam tikrų aplinkos ar vidinių veiksnių, vandens lašeliai mikroemulsijoje ima traukti vienas kitą, jungtis, taip didindami mikroemulsijos laidumą . Tai rodo mikroemulsijos tipo pasislinkimą link biištisinės sistemos susidarymo. [11].

Mikroemulsijų be kvercetino (ME-EtOH, ME-Pg ir ME-PEG-400) klampa pagaminimo dieną atitinkamai buvo 20,0, 34,2 ir 42,1 mPa·s. Kvercetino mikroemulsijose su etanoliu ir PEG-400 klampa pagaminimo dieną yra nežymiai mažesnė (0,1 proc.) nei mikroemulsijų be kvercetino. Tuo tarpu QME-Pg klampa pagaminimo dieną buvo nežymiai didesnė (1,2 proc) nei ME-Pg. Visose kvercetino mikroemulsijose stebimas klampos padidėjimas jas laikant keturias savaites kambario temperatūroje. Po 4 savaičių klampa panašiai padidėjo visose mikroemulsijose – PEG-400 (14,5 proc), QME-Pg (14,0 proc), QME-EtOH (13,6 proc).

Gauti klampos tyrimo rezultatai patvirtina mokslininkų gautus duomenis, teigiančius, kad aliejus-vanduo mikroemulsijoms būdinga sąlyginai maža klampa [17,40].

0 5 10 15 20 25 30

KoS - EtOH KoS - Pg KoS-PEG-400

e le k tr in is l ai d is μ S /c m

QME pagaminimo dieną QME po 1 savaitės QME po 2 savaičių QME po 3 savaičių QME po 4 savaičių

8 pav. Kvercetino mikroemulsijų klampos tyrimo rezultatai

Mikroemulsijų be kvercetino (ME-EtOH, ME-Pg ir ME-PEG-400) vidutinis dalelių dydis pagaminimo dieną atitinkamai buvo 44,03±0,7, 58,63±1,6 ir 162,8±1,4 nm. Įterpus kvercetiną, stebimas vidutinio dalelių dydžio padidėjimas visose mikroemulsijose. QME-EtOH VDD buvo didesnis 45,6 proc., QME-Pg VDD buvo didesnis 45,2 proc., o QME-PEG-400 VDD buvo didesnis 49,6 proc. Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad VDD padidėjimas visose mikroemulsijose buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05).

9 pav. Mikroemulsijų vidutinio dalelių dydžio tyrimo rezultatai

Visose kvercetino mikroemulsijose stebimas vidutinio dalelių dydžio padidėjimas, laikant keturias savaites kambario temperatūroje. QME-EtOH dalelės statistiškai nereikšmingai (p>0,05) padidėjo 0,6 proc. (62,77–63,13 nm), QME-Pg dalelės statistiškai nereikšmingai (p>0,05) padidėjo

0 10 20 30 40 50 60

KoS - EtOH KoS - Pg KoS-PEG-400

k lam p a, m P a· s

QME pagaminimo dieną QME po 1 savaitės QME po 2 savaičių QME po 3 savaičių QME po 4 savaičių

0 50 100 150 200 250 300

QME-ETOH QME-Pg QME-PEG-400

V

D

D

, n

m

25,5 proc. (85,12– 106,8 nm), o QME-PEG-400 dalelės statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidėjo 10,3 proc. (243,6– 268,6 nm).

Kvercetinas buvo įterptas į aliejinę fazę bei surfaktanto/kosurfaktanto mišinį. Vaistinės medžiagos įterpimas į mikroemulsiją gali daryti įtaką fizikinėms ir cheminėms sistemos savybėms. Rezultatai patvirtina mokslininkų hipotezę, kad kvercetinui įsiterpus į tarpfazinę surfaktanto/kosurfaktanto plėvelę, vidutinis dalelių dydis reikšmingai padidėja [41].

10 pav. Mikroemulsijų polidispersiškumo indekso tyrimo rezultatai

Mikroemulsijų be kvercetino (ME-EtOH, ME-Pg ir ME-PEG-400) polidispersiškumo indeksas pagaminimo dieną atitinkamai buvo 0,307±0,009, 0,338±0,052 ir 0,151±0,009. QME-EtOH PDI pagaminimo dieną buvo didesnis 2,93 proc., QME-Pg buvo mažesnis 7,4 proc., o QME-PEG-400 PDI buvo didesnis 7,9 proc. Po 4 savaičių QME-EtOH PDI sumažėjo 11,7 proc., QME-PEG-400 PDI sumažėjo 5,5 proc., o QME-Pg PDI padidėjo 16,9 proc. Lyginant PDI mikroemulsijų be kvercetino ir su kvercetinu, nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp ME-EtOH ir QME-EtOH (PDI padidėjo 14,98 proc.) bei tarp ME-PEG-400 ir QME-PEG-400 (PDI sumažėjo 44,37 proc.) po 2 savaičių laikymo kambario temperatūroje. Lyginant kvercetino mikroemulsijų PDI tarpusavyje, nustatyta, kad PDI pokyčiai kvercetino mikroemulsijose, jas laikant 4 savaites kambario temperatūroje yra statistiškai nereikšmingi (p>0,05).

Remiantis vidutinio mikroemulsijų dalelių dydžio ir polidispersiškumo indekso tyrimų rezultatais, galima daryti prielaidą, kad kvercetino įterpimas į mikroemulsijas turi įtakos vidutiniam dalelių dydžiui (jos statistiškai reikšmingai padidėja), tačiau neturi įtakos dalelių pasiskirstymui mikroemulsijoje ir jos homogeniškumui.

Mikroemulsijų be kvercetino ir mikroemulsijų su įterptu kvercetinu, dalelių dydžio pokyčiai po 2 ir 4 savaičių pavaizduoti 11–16 paveiksluose.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

QME-ETOH QME-Pg QME-PEG-400

P

D

I

11 pav. Dalelių dydžio pasiskirstymo palyginimas tarp ME-EtOH ir QME-EtOH

Pagamintos ME-EtOH be kvercetino dalelės pasiskirstė 1,7−5,6 nm intervale. Įterpus kvercetiną, mikroemulsijos dalelės pasiskirstė nežymiai platesniame 1,5−5,6 nm intervale. Stebimas didesnių dalelių skaičiaus sumažėjimas intervale 2,3–3,6 nm (11,2 proc.) ir mažesnių dalelių pagausėjimas intervale 1,5–2,0 nm bei intervale 4,2–5,6 nm (11,3 proc.).

12 pav. Mikroemulsijų su kosurfaktantu etanoliu dalelių dydžio kitimai

Po dviejų savaičių QME-EtOH neliko 1,5 nm dydžio dalelių, 1,7−3,1 nm intervale žymiai sumažėjo mažesnių dalelių (44,5 proc.), o 3,6−5,6 nm intervale pagausėjo didesnių dalelių (4,5 proc.). Stebimas naujų dalelių susiformavimas intervale 24,4−91,3 nm (44,0 proc.). Po keturių savaičių nebeliko mažiausių dalelių 1,7−2,0 nm intervale, padaugėjo 2,3−3,6 nm dydžio dalelių (31,0 proc.) ir sumažėjo 4,2−5,6 nm dydžio dalelių (3,1 proc.) bei 24,4–78,2 nm (20,0 proc.) skersmens dalelių.

0 5 10 15 20 25 30 35 0. 964 9 1. 117 1. 294 1. 499 1. 736 _2.01 2. 328 2. 696 3. 122 3. 615 4. 187 4. 849 5. 615 6. 503 7. 531 8. 721 _10. 1 11. 7 13. 54 15. 69 18. 17 21. 04 24. 36 28. 21 32. 67 37. 84 43. 82 50. 75 58. 77 68. 06 78. 82 91. 28 105 .7 D al el ių sk ai či us, pr oc . Dalelių dydis, nm

ME-EtOH pagaminimo d. QME-EtOH pagaminimo d.

0 5 10 15 20 25 30 0. 964 9 1. 117 1. 294 1. 499 1. 736 _2.01 2. 328 2. 696 3. 122 3. 615 4. 187 4. 849 5. 615 6. 503 7. 531 8. 721 _10. 1 11. 7 13. 54 15. 69 18. 17 21. 04 24. 36 28. 21 32. 67 37. 84 43. 82 50. 75 58. 77 68. 06 78. 82 91. 28 105 .7 D al el ių sk ai či us, pr oc . Dalelių dydis, nm

QME-EtOH pagaminimo d. QME-EtOH po 2 sav. QME-EtOH po 4 sav.

Lyginant QME-EtOH dalelių dydžio pasiskirstymą įterpus kvercetiną ir po keturių savaičių, stebimas dalelių dydžio poslinkis link didesnio skersmens dalelių (20,0 proc.)

13 pav. Dalelių dydžio pasiskirstymo palyginimas tarp ME-Pg ir QME-Pg

Po ME-Pg be kvercetino pagaminimo, jos dalelių dydis buvo 1,3−5,6 nm intervale. Įterpus kvercetiną, mikroemulsijos dalelės žymiai padidėjo ir pasiskirstė siauresniame 1,7–4,8 nm intervale ir susiformavo naujos dalelės 28,2−141 nm intervale.

14 pav. Mikroemulsijų su kosurfaktantu propilenglikoliu dalelių dydžio kitimai

Po dviejų savaičių QME-Pg neliko 1,7–4,8 nm bei 28,2 nm dydžio dalelių, nežymiai sumažėjo 32,7 nm dydžio dalelių (iš viso 20,1 proc.) ir pagausėjo dalelių 37,8−141,8 nm intervale (20,0 proc.). Po keturių savaičių, įvyko dalelių sumažėjimas 37,8−43,8 nm intervale (12,4 proc.) ir

0 5 10 15 20 25 0. 964 9 1. 117 1. 294 1. 499 1. 736 _2.01 2. 328 2. 696 3. 122 3. 615 4. 187 4. 849 5. 615 6. 503 7. 531 8. 721 _10. 1 11. 7 13. 54 15. 69 18. 17 21. 04 24. 36 28. 21 32. 67 37. 84 43. 82 50. 75 58. 77 68. 06 78. 82 91. 28 105 .7 122 .4 141 .8 164 .2 190 .1 D ale lių sk aič iu s, pr oc . Dalelių dydis, nm

ME-Pg pagaminimo d. QME-Pg pagaminimo d.

0 5 10 15 20 25 0. 964 9 1. 117 1. 294 1. 499 1. 736 _2.01 2. 328 2. 696 3. 122 3. 615 4. 187 4. 849 5. 615 6. 503 7. 531 8. 721 _10. 1 11. 7 13. 54 15. 69 18. 17 21. 04 24. 36 28. 21 32. 67 37. 84 43. 82 50. 75 58. 77 68. 06 78. 82 91. 28 105 .7 122 .4 141 .8 164 .2 190 .1 D al el ių sk ai či ųs, pr oc . Dalelių dydis, nm

susiformavo naujos 28,2 nm bei 164,2 nm dydžio dalelės, įvyko dalelių pagausėjimas 58,8−141,8 nm intervale (12,3 proc.). Lyginant QME-Pg dalelių dydžio pasiskirstymą įterpus kvercetiną ir po keturių savaičių, nėra matoma žymaus dalelių dydžio poslinkio link didesnio skersmens dalelių.

15 pav. Dalelių dydžio pasiskirstymo palyginimas tarp ME-PEG-400 ir QME-PEG-400

Po ME-PEG-400 be kvercetino pagaminimo, dalelių dydis buvo pasiskirstęs 78,8−295,3 nm intervale. Pagaminus QME-PEG-400 žymiai sumažėjo (51,7 proc.) mažiausių dalelių 78,8–105,7 nm, 47,6 proc. padaugėjo dalelių 141,8–295,3 nm intervale ir susiformavo naujų didelių dalelių 342,0– 615,1 nm (6,1 proc.) intervale.

16 pav. Mikroemulsijų su kosurfaktantu PEG-400 dalelių dydžio kitimai

Po dviejų savaičių QME-PEG-400 sumažėjo mažiausių dalelių 78,8−164,2 nm intervale (19,1 proc.) ir 458,7−531,2 nm intervale (0,3 proc.). Padaugėjo dalelių 190,1–396,1 nm intervale (19,5

0 5 10 15 20 25 D al el ių sk ai či us, pr oc . Dalelių dydis, nm

ME-PEG-400 pagaminimo d. QME-PEG-400 pagaminimo d.

0 5 10 15 20 25 D al el ių sk ai či us, pr oc . Dalelių dydis, nm

proc.) Po keturių savaičių sumažėjo 105,7−255,0 nm dydžio dalelių (5,6 proc.) ir padaugėjo didžiausių dalelių 295,3−712,4 nm intervale (5,5 proc.). Lyginant QME-PEG-400 dalelių dydžio pasiskirstymą įterpus kvercetiną ir po keturių savaičių, nėra matoma žymaus dalelių dydžio poslinkio link didesnio skersmens dalelių.

3.3.

Kvercetino mikroemulsijų fotostabilumo vertinimas

Buvo įvertintas 0,03 proc. kvercetino mikroemulsijų fotostabilumas natūraliomis ir dirbtinėmis sąlygomis.

Veikiat mikroemulsijas UVA spinduliais 6 valandas, kvercetino koncentracija jose nesumažėjo. Mikroemulsijų komponentuose kvercetino koncentracija nesumažėjo arba sumažėjo nežymiai. Po 6 valandų nustatytas kvercetino koncentracijos sumažėjimas PEG-400 (3,1 proc.), 96 proc. etanolyje (4,4 proc.), izopropilo miristate (4,6 proc.) ir propilenglikolyje (8,6 proc.) Kvercetinas buvo stabilus ir nesuskilo viename komponente – labrasolyje. Po 4 savaičių laikymo natūralioje šviesoje, kvercetinas visiškai suskilo visose trijose mikroemulsijose bei PEG-400. Kvercetinas stabiliausias buvo propilenglikolyje (suskilo 12,9 proc. pradinio kiekio). 96 proc. etanolyje kvercetino koncentracija sumažėjo 34,6 proc., izopropilo miristate 39,7 proc., o labrasolyje 40,9 proc. Kvercetino stabilumo, mikroemulsijose ir atskiruose komponentuose, laikant jas 4 savaites natūralioje šviesoje, rezultatai pavaizduoti 17 paveiksle.

17 pav. Kvercetino stabilumo, laikant mikroemulsijų komponentus 4 savaites natūralioje šviesoje, rezultatai

Remiantis gautais fototabilumo tyrimų rezultatais, galima daryti prielaidą, kad kvercetino skilimą mikroemulsijose natūralioje šviesoje galėjo lemti UVB spinduliuotės poveikis. UVB srauto

0 20 40 60 80 100 120

IPM+Q Labrasolis+Q PEG-400+Q Propilenglikolis+Q Etanolis+Q

K ve r c e ti n o k ie k is , p r oc .

spinduliai (bangos ilgis 290–320 nm) yra apie 1000 kartų intensyvesni už UVA srauto spindulius (bangos ilgis 320–400 nm), nors apima tik 4–5 proc. viso Žemę pasiekiančio UV srauto [59]. Nors kvercetinas stipriausiai absorbuoja šviesą UVA (350–370 nm) bei UVC (260–270 nm) spinduliuotės srityje, mokslininkų tyrimų rezultatai rodo, kad kvercetinas gali skilti ir UVB spinduliuotės poveikyje [6,9]. Kadangi kvercetinas buvo mažai tirpus izopropilo miristate, gaminant aliejus-vanduo tipo mikromulsijas, kvercetinas papildomai buvo ištirpintas surfaktante ir kosurfaktante. Dėl to kvercetinas galėjo būti labiau prieinamas šviesos spindulių poveikiui. Mokslininkų atliktuose tyrimuose, kuriuose pavyko kvercetiną apsaugoti nuo skilimo UVB spinduliuotės poveikyje naudojant mikroemulsijas, kvercetinas buvo įterptas tik į aliejinę fazę [40,41]. Maža pradinė kvercetino koncentracija (0,03 proc.) tirtose mikroemulsijose taip pat galėjo lemti greitesnį skilimą laikant mikroemulsijas 4 savaites natūralioje šviesoje. Mikroemulsijų komponentuose pradinė kvercetino koncentracija buvo didesnė (0,034–0,045 proc.)

3.4.

Kvercetino atpalaidavimo iš mikroemulsijų in vitro vertinimas

Iš kvercetino mikroemulsijų atpalaiduoto suminio kvercetino kiekio kinetika pavaizduota 16 paveiksle.

16 pav. Suminis kvercetino kiekis (srautas), atpalaiduotas iš kvercetino mikroemulsijų per 4 valandas

In vitro atpalaidavimo tyrimai parodė, kad didžiausias suminis kvercetino kiekis per 4

valandas atpalaiduotas iš QME-EtOH (1,92 proc., srautas 427,5±54,9 µg/cm2). Mažiausias suminis kvercetino kiekis per 4 valandas atpalaiduotas iš QME-Pg (1,29 proc., srautas 285,7±6,7 µg/cm2). Iš

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1 2 3 4 K ve r c e ti n o at p al ai d avi m o sr au tas , µ g/ c m 2 Laikas, val.

QME-PEG-400 per 4 valandas atpalaiduotas panašus kvercetino kiekis (1,18 proc., srautas 297,0±8,0 µg/cm2). Statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas nustatytas tarp kvercetino kiekio atpalaiduoto iš QME-EtOH ir QME-Pg bei QME-EtOH bei QME-PEG-400. Skirtumas tarp kvercetino atpalaiduoto kiekio iš QME-Pg ir QME-PEG-400 yra statistiškai nereikšmingas (p>0,05).

In vitro atpalaidavimo tyrimų duomenys buvo analizuojami taikant pirmos eilės matematinį

modelį ir Higuchi matematinį modelį. Suformuluotos kvercetino mikroemulsijos atitiko Higuchi matematinį modelį (R2 _{= 0,9645–0,9974). Higuchi matematinis modelis remiasi Fiko dėsniu, kuris} teigia, kad pernešamos medžiagos kiekio srautas yra proporcingas koncentracijos gradientui [58].