FLAVONOIDŲ NUSTATYMAS IR JŲ ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GINKGO BILOBA L. EKSTRAKTUOSE

(1)

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „FLAVONOIDŲ NUSTATYMAS IR JŲ ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GINKGO BILOBA L. EKSTRAKTUOSE“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Ieva Urbonienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Ieva Urbonienė

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

IEVA URBONIENĖ

FLAVONOIDŲ NUSTATYMAS IR JŲ ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GINKGO BILOBA L. EKSTRAKTUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Augusta Ževžikovienė

Kaunas, 2020

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto prof. dr. dekanė Ramunė Morkūnienė Data 2020-06-11

FLAVONOIDŲ NUSTATYMAS IR JŲ ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GINKGO BILOBA L. EKSTRAKTUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: Doc. dr. Augusta Ževžikovienė Data 2020-06-11

Darbą atliko magistrantė: Ieva Urbonienė Data 2020-06-11

Recenzentas:

Data 2020-06-11

Kaunas, 2020

(4)

TURINYS

SANTRAUKA ... 6

SUMMARY ... 7

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas ... 12

1.4 Vaistinė augalinė žaliava, jos rinkimas, paruošimas ir laikymas ... 13

1.5 Svarbiausios ginkmedžio lapų ekstraktuose esančios veikliosios medžiagos ... 13

1.5.1 Flavonoidų struktūra ir klasifikacija ... 14

1.5.2 Terpenoidų struktūra ... 16

1.6 Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų biologinis ir antioksidacinis aktyvumas ... 17

1.7 Patentuotas ginkmedžio ekstraktas EGb 761 ... 18

1.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 18

1.9 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 21

2. TYRIMO METODIKA ... 22

2.2 Naudoti reagentai ... 22

2.3 Naudota aparatūra ir prietaisai ... 23

2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 23

2.5 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 23

2.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 25

2.7 Statistinis duomenų įvertinimas ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1 Bendras flavonoidų kiekis G. biloba lapų ekstraktuose ... 27

(5)

3.2 Antioksidantinio aktyvumo G. biloba lapuose rezultatų įvertinimas ... 29

3.3 Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų rezultatų palyginimas su ankstesnių metų tyrimais ... 31

3.3.1 Suminis flavonoidų kiekis ... 32

3.3.2 Antioksidacinis aktyvumas ... 33

3.4 Rezultatų priklausomybės nuo oro sąlygų įvertinimas ... 34

4. IŠVADOS ... 38

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40

(6)

I. Urbonienės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc., dr. Augusta Ževžikovienė;

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.

Pavadinimas: Flavonoidų nustatymas ir jų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas Ginkgo biloba L. ekstraktuose.

Raktiniai žodžiai: Ginkgo biloba L., dviskiautis ginkmedis, flavonoidai, suminis flavonoidų kiekis, spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas, ABTS.

Tyrimo tikslas: Nustatyti flavonoidų kiekį Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktuose ir įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį skirtingu vegetacijos laikotarpiu iš skirtingų miestų surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose. 2. Įvertinti Ginkgo biloba L. lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu ABTS metodu. 3. Palyginti skirtingose augavietėse surinktų ginkmedžio lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. 4. Įvertinti koreliacinį ryšį tarp suminio flavonoidų kiekio ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

Tyrimo objektas ir metodika: Tyrimo objektas – Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapai. Bendras flavonoidų kiekis augalinėje žaliavoje nustatytas spektrofotometriškai po reakcijos su aliuminio (III) chloridu. Antioksidacinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS reagentą.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias suminis flavonoidų kiekis G. biloba nustatytas rugpjūčio mėnesį Klaipėdos botanikos sode rinktoje žaliavoje 9,82 mg/g., mažiausias rugsėjo mėnesį Šiaulių botanikos sode – 1.55 mg/g. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas taikant ABTS metodiką, nustatytas Klaipėdos botanikos sode rugsėjo mėnesį rinktoje žaliavoje - 535,85 TE, µmol/g., mažiausias - Šiaulių botanikos sode birželio mėnesį - 150,35 TE, µmol/g. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausias bendras flavonoidų kiekis ir didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas Klaipėdos botanikos sode rinktoje žaliavoje, o mažiausias – Šiaulių botanikos sode. Rezultatai gauti žaliavoje, kuri buvo rinkta Šiaulių miesto botanikos sode. Koreliacinio ryšio tarp suminio flavonoidų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nenustatyta.

Nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp suminio flavonoidų kiekio nuo bendrosios saulės spinduliuotės Kauno augavietės žaliavos ekstraktuose ir Klaipėdos augavietės žaliavos ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir bendrosios saulės spinduliuotės.

(7)

I.Urbonienė's master's thesis / scientific supervisor assoc. prof., PhD. Augusta Ževžikovienė;

Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas.

Title: Determination of flavonoids and their antioxidant activity in Ginkgo biloba L. extracts.

Keywords: Ginkgo biloba L., flavonoids, total flavonoid content, spectrophotometry, antioxidant activity, ABTS.

The aim of the study: To determine the amount of flavonoids in the leaf extract of ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) growing in Lithuania and to evaluate their antioxidant activity.

Tasks: 1. To evaluate the total amount of flavonoids in the extracts of ginkgo leaves collected from different cities during growing season. 2. To assess the antioxidant activity of Ginkgo biloba L. leaves extracts by spectrophotometric ABTS method. 3. To compare the antioxidant activity of ginkgo leaves extracts collected in different places. 4. Estimate correlation between the total amount of flavonoids and the antioxidant activity of the extracts.

Object and methodology of the research: The object of the research is samples of the leaves of Ginkgo biloba L. The total amount of flavonoids in the raw material was determined spectrophotometrically after reaction with aluminum (III) chloride. Antioxidant activity was evaluated by ABTS spectrophotometric method.

Research results and conclusions: The highest total amount of flavonoids in the raw material of G. biloba was determined in the raw material which was collected in August in Klaipėda Botanical Garden 9.82 mg / g, the lowest in September in Šiauliai Botanical Garden - 1.55 mg / g. When determining the antioxidant activity using the ABTS methodology, the highest activity was obtained in the raw material collected in Klaipėda Botanical Garden in September 535.85 TE, µmol / g, the lowest in Šiauliai Botanical Garden collected in June 150.35 TE, µmol / g. The obtained results showed the highest total amount of flavonoids and the highest antioxidant activity in raw material collected in Klaipeda Botanical Garden, the lowest in raw material collected in Šiauliai botanical garden. No correlation was found between total flavonoid content and antioxidant activity. A statistically significant dependence of the total share of flavonoids on the total solar radiation extraction of the raw material of Kaunas habitat and the antioxidant active and total solar radiation of the raw material extract of Klaipėda plant site was determined.

(8)

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lekt. Laurai Rimkienei ir mokslinio darbo vadovei doc., dr. Augustai Ževžikovienei už pagalbą ir patarimus atliekant mokslinį tyrimą.

(9)

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)

CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (anglų k. - cupric ion reducing antioxidant capacity)

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

EGb 761 – standartizuotas dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas

FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) MIC - mažiausia slopinamoji koncentracija

QE – kvercetino ekvivalentas (angl. Quercetin equivalent) RE – rutino ekvivalentas

rs– koreliacijos koeficientas TE – trolokso ekvivalentas

TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity)

UV – ultravioletiniai spinduliai

(10)

ĮVADAS

Pasaulyje atsiranda vis daugiau naujų technologijų, gydymo metodikų, tačiau kai kurie augalai išlieka nepakeičiami tūkstančius metų. Šiuolaikinė visuomenė vis daugiau dėmesio skiria augaliniams vaistams, maisto papildams, arbatoms. Atsigręžiama į protėvių taikytus gydymo ir sveikatinimo metodus, natūralų gyvenimo būdą. Technologijos stipriai keičia mūsų gyvenimo įpročius - dabartiniai žmonės susiduria su tokiomis problemomis, apie kurias seniau nebuvo net galvojama. Nors problemos atsiranda naujos, tačiau joms spręsti pasitelkiamos laiko patikrintos priemonės, viena iš tokių - nuo seno naudojamas augalas dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.), kuris sušvelnina daugelį sveikatos sutrikimų. Pavyzdžiui, jis gali būti naudojamas pagyvenusių žmonių pažinimo funkcijoms, kraujo apytakai gerinti, galvos svaigimui mažinti, hormonų disbalansui gydyti, palengvinti simptomus sergantiems demencija [21].

Augalinė žaliava - lapai (Ginkgo biloba folium L.). Platų šio augalo vartojimą nulemia daug biologiškai aktyvių sudedamųjų dalių: flavonoidai, terpenoidai, polifenoliai, polisacharidai, vitaminai ir mineralai [21].

Farmakologinis poveikis priklauso nuo veikliųjų medžiagų kiekio. Pagrindinė užduotis gaminant vaistinius preparatus bei arbatas yra veikliųjų medžiagų kiekio ir santykio išlaikymas, bei nuodingųjų medžiagų pašalinimas. Todėl svarbu nustatyti ir įvertinti flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį ginkmedžio ekstraktuose, bei įvertinti flavonoidų antioksidacinį aktyvumą.

Vaistinėse gausu įvairių preparatų, kuriuose yra ginkmedžių lapų ištraukos – tai sirupai, tabletės, kapsulės, tinktūros, taip pat ginkmedžių lapų arbatų. Tačiau klinikiniais tyrimais patvirtintu gydomuoju poveikiu pasižymi tik tie preparatai, kuriuose yra standartizuoto dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto (EGB-761).

Žaliavų kokybę lemia biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis, todėl tikslinga ištirti Lietuvoje augančių Ginkgo biloba L. lapų sudėtį. Tyrimui pasirinkta spektrofotometrija. Mokslininkai teigia, kad „spektrofotometrija - paprasta, patikima dažniausiai naudojama regimosios šviesos adsorbcijos pokyčio detekcija. Puikiai tinkamas metodas grynų junginių antioksidacinėms savybėms įvertinti“ [2].

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Nustatyti flavonoidų kiekį Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktuose ir įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį skirtingu vegetacijos laikotarpiu iš skirtingų miestų surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose.

2. Įvertinti Ginkgo biloba L. lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu ABTS metodu.

3. Palyginti skirtingose augavietėse surinktų ginkmedžio lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

4. Įvertinti koreliacinį ryšį tarp suminio flavonoidų kiekio ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas

„Dviskiautis ginkmedis, ginkmedis“, (lot. Ginkgo biloba L.) – vienintelė ginkainių; (lot.

Ginkgophyta) skyriaus, ginkmedainių (lot. Ginkgoopsida) klasės, ginkmedinių (lot. Ginkgoaceae) šeimos rūšis. Klasifikuojamas jis atskirai, dėl to, kad nėra aiškus šios rūšies santykis su kitais augalais. Kinų kalboje ginkmedis apibūdinamas žodžiu „sankyo“ arba „yinkuo“, išvertus į lietuvių kalbą jis reiškia: kalnų abrikosas arba sidabrinis vaisius. Dar 1712m. pirmasis pavadinimą „Ginkgo“ panaudojo Englbert Kaempfer, o 1771m. Linėjus pavadino jį „Ginkgo biloba“ (bi – du, lopa – skiautės. Japonų kalboje „Ginkgo” yra kilęs iš neteisingo pavadinimo perrašymo „Yin-Kwo“ (sidabriniai vaisiai), „biloba“ - nurodo lapų formą, kuriuose yra žiedų [7,29,31].

1.2 Augalo morfologinis aprašymas

Vasarą žaliuojantis dvinamis augalas. Dvinamis reiškia, kad augalas turi ir vyriškus ir moteriškus reprodukcinius organus. Aplinkoje, kurioje jis auga natūraliai, medis užauga nuo 10-15 m. iki 20-41 m.

aukščio. Kamieno skersmuo 1-4 m. Vienas iš didesnių G. biloba medžių auga Korėjoje, jo aukštis siekia 64 m. aukščio, skersmuo 4,45 m. Lapai yra vėduoklės pavidalo, sėklos panašios į kaulavaisius, nes turi sultingą išorinį dangalą. Sėklinis embrionas yra apsuptas endospermo. Ginkgo biloba L. dauginamas sėklomis, šaknų ar stiebo auginiais. Sėklos sudygsta po 3-4 savaičių. Vidinė sėklos dalis yra valgoma, panaši į briaunotą riešutėlį [26,36].

1.3 Augalo paplitimas ir kultivavimas

Lietuvoje jis labai retas. Auginamas parkuose, botanikos soduose, privačiuose ūkiuose kaip dekoratyvinis medis. Seniausias ginkmedis auga Švėkšnos parke. Natūraliai auginamas Kinijoje, Japonijoje ir Korėjoje, dažnai prie šventyklų. Paplitęs auginimas Europoje, Amerikoje ir vidutinio klimato zonose:

Naujoje Zelandijoje, Argentinoje, Indijoje [8]. Geriau auga kalkinguose, derlinguose ir pakankamai drėgnuose dirvožemiuose, esant vidutinei dirvožemio temperatūrai. G. biloba egzistuojantis tūkstančius metų mūsų planetoje yra senoji vaistinių medžių rūšis, kuri nepasikeičia dėl atsparumo aplinkos poveikiui.

Paleobotanikos istorija parodė visame pasaulyje platų rūšių pasiskirstymą, tačiau per geologinį laiką

(13)

pastebėtas sumažėjimas. Medis auga lėtai, prisitaiko prie daugumos ekologinių sąlygų ir pasižymi prisitaikymu prie daugybės vystymosi modelių [29,31].

1.4 Vaistinė augalinė žaliava, jos rinkimas, paruošimas ir laikymas

Tradicinėje kinų medicinoje daugiausia dėmesio buvo skiriama moteriško dviskiaučio ginkmedžio auginamiems vaisiams ir sėkloms. Beveik prieš 5000 metų jie buvo vartojami gydant kosulį, astmą, šlapimo nelaikymo sutrikimus. Ilgainiui gydymo tikslais buvo pradėti taikyti ir šio augalo lapai [34]. Europos farmakopėjoje nurodyta, kad G. biloba vaistinė augalinė žaliava yra lapai [15]. Lapai renkami liepos – rugpjūčio mėnesiais siekiant išgauti didžiausią naudingų medžiagų kiekį. Vėliau jie džiovinami džiovyklėse ir smulkinami. Laikomi kambario temperatūroje, tamsiose vietose, kad nesusidarytų skilimo produktai.

Augalinei žaliavai didelę reikšmę turi tai, kada ji buvo renkama, kokiame dirvožemyje augo, klimato sąlygos [26,36]. Daugelyje tyrimų nustatyta, kad lapus skinant rudenį antioksidacinės savybės stipresnės nei lapus skinant vasaros viduryje ar pavasarį.

1.5 Svarbiausios ginkmedžio lapų ekstraktuose esančios veikliosios medžiagos

Biologiškai aktyvios medžiagos ir jų kiekis lemia, kad šio augalo ekstraktai yra plačiai naudojami medicinoje. Pagrindinės junginių klasės: flavonoidai (flavono glikozidai – kvercetinas, kemferolis, rutinas ir kt.) ir terpenoidai (terpeno laktonai – ginkolidai ir bilobalidai) (1 lentelė). Svarbią reikšmę turi ginkolinės rūgštys, kurios pasižymi toksinėmis savybėmis. Taip pat yra nedideli kiekiai kitų junginių: vaškai, gliukozė, ramnozė, steroidai, karotinoidai, alkanai, lipidai, fenilpropanoidai. Mokslininkai nurodo, kad standartizuotame EGB-761 ekstrakte yra 24 proc. flavono glikozidų, 7 proc. proantocianidinų ir 6 proc.

terpenoidų [6,7,35].

1 lentelė. Pagrindiniai junginiai esantys dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktuose Junginių klasė Sudedamosios dalys

Flavonoidai Flavonai, flavononai, katechinai, antocianinai, izoflavonai

Terpenoidai Diterpenoidai (ginkolidai A, B, C, J, M) triterpenoidai (steroliai), bilobalidai

Biflavonoidai Ginkgedinas, izoginkgedinas ir kt.

Organinės rūgštys Benzoinės rūgšties dariniai (ginkolinė rūgštis) ir kt.

Kita Vaškai, cukrūs, steroidai ir kt.

(14)

1.5.1 Flavonoidų struktūra ir klasifikacija

Flavonoidų aglikono pagrindą sudaro C6-C3-C6 , todėl jie laikomi benzo-γ-pirono dariniais. Du benzeno žiedai A ir B, kuriuos jungia C3 (propano) fragmentas (1 pav.). Propano fragmento dėka daugumoje flavonoidų molekulių susidaro heterociklas, kuris yra pirano ar γ- pirono darinys. Flavonoidai (lot. flavus–

geltonas) – polifenoliniai, heterocikliniai, silpnomis rūgštinėmis savybėmis pasižymintys hidrofobiniai, organiniai junginiai [7,24].

1 pav. Pagrindinė cheminė flavonoidų struktūra [24]

Atsižvelgiant į C žiedo struktūros pokyčius, tai yra oksidacijos laipsnio ir skirtingų pakaitų A ir B žieduose, flavonoidai skirstomi į 6 klases (2 lentelė). Gamtoje labiausiai paplitę 12 C- ar O-glikozidų formomis. Cukrinė dalis O-glikoziduose prie aglikono jungiasi per hidroksilo grupę, tuo tarpu C- glikoziduose ši dalis jungiasi tiesiogiai (6 ar 8 padėtyse). C- glikozidai yra retesni nei O-glikozidai [7,34].

Ginkgo biloba L. ekstraktuose kai kurie autoriai proantocianidinus (2 pav.) pažymi kaip labai svarbią flavonoidų grupę, nes jiems jungiantis su baltymais inaktyvuojami antioksidaciniai fermentai. Tokiu būdu jie gali mažinti antioksidacinį poveikį. Gana didelis jų kiekis (apie 7 proc.) yra ginkmedžių lapų ekstrakte, kuris yra vienodai svarbus bendram ekstrakto poveikiui kaip ir antioksidacinis aktyvumas, kraujagysles atpalaiduojantis poveikis [1,10,18].

2 pav. Proantocianidinų struktūra [18]

(15)

2 lentelė. Flavonoidų klasės: struktūra ir priskiriami junginiai [10]

Flavonoidų klasė Struktūra Flavonoidai

Flavonai apigeninas,

diosmetinas liuteolinas,

Flavonolai kamferolis,

kvercetinas

Flavononai naringeninas,

hesperedinas

Katechinai epikatechinas,

galakatechinas

Izoflavonai genisteinas,

daidzeinas

Antocianinai Pelargonidinas,

cianidinas, malvidinas

(16)

1.5.2 Terpenoidų struktūra

Terpenoidams priskiriami ginkolidai ( diterpenai C²⁰) ir bilobalidai (triterpenai, C¹⁵). Ginkolidai pagal šonines grupes dar skirstomi į ginkolidus A, B, C, J, M (3 lentelė ). Unikaliausi ekstraktų komponentai yra terpeno trilaktonai - ginkgolidai ir bilobalidas (3 pav.). Teigiama, kad jie iš dalies sukelia G. biloba ekstraktų neuromoduliacines savybes [24,37].

3 pav. Ginkolidas (A) ir bilobalidas (B) [24]

Ekstraktuose aptinkama ir ginkolinės rūgšties, klasifikuojamos dar į: ginkolio, bilobalolio, karnanolio, kardolo ir kt. Pagal nustatytus reikalavimus rūgšties negali būti daugiau kaip 5ppm, dėl jos alergizuojančių savybių [7,12,24].

3 lentelė. Terpenoidų struktūra [24]

R1 R2 R3

Ginkolidai A OH H H

Ginkolidai B OH OH H

Ginkolidai C OH OH OH

Ginkolidai J OH H OH

Ginkolidai M H OH OH

(17)

1.6 Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų biologinis ir antioksidacinis aktyvumas Pagal atliktus mokslinius tyrimus buvo nustatyta, kad stipriausią ginkmedžio ekstraktų aktyvumą sukelia lapų sudėtyje esantys flavono glikozidai. Pirmieji moksliniai straipsniai apie flavonoidų aktyvumą aptinkami 1936 m., mokslininkų Rysznyak ir Szent-Georgui darbe, kur šie junginiai priskiriami ir vadinami vitaminu „P“. Atlikta daug tyrimų apie flavonoidų aktyvumą ir daugelis jų parodė, kad flavonoidai pasižymi antiagregaciniu, priešvėžiniu, prieš uždegiminiu, prieš virusiniu poveikiais [7]. Flavonoidų farmakologinis poveikis yra platus, jų toksiškumas mažas, todėl jie labai perspektyvūs gamtiniai junginiai. Mokslininkams ištyrus tiesioginį flavonoidų antioksidacinį aktyvumą nustatyta, kad vienas iš aktyviausių laisvuosius radikalus surišančių junginių yra kvercetinas. Prijungdami Fe²⁺ kvercetinas, katechinas, taksifolinas, apsaugo nuo galimo geležies radikalų susidarymo, tačiau galanginui ši savybė nėra būdinga. Flavonoidai, kurie turi 3-hidroksigrupę geba surišti sunkiuosius metalus taip apsaugodami nuo sunkiųjų metalų sukeltos lipidų peroksidacijos [1,11]. Laisvus radikalus sugeba sujungti į chelatus, atiduodami vandenilio atomą arba pernešdami vieną elektroną. Kitas galimas flavonoidų veikimo būdas chelatų sudarymas su pereinamaisiais metalais. Flavonoidai pasižymi turi gebėjimu sudaryti chelatus arba jungtis su metalo jonais žmogaus kūne, kad jie nebūtų prieinami oksidacijai. Kai kurie flavonoidai gali sudaryti chelatus su tokiais mikroelementais kaip Fe²⁺ ir Cu⁺, kurie vaidina svarbų vaidmenį deguonies apykaitoje ir laisvųjų radikalų susidaryme [30].

Ginkmedžio lapų ekstraktai yra vertinami dėl juose esančių flavonoidų antioksidacinio poveikio.

Jie apsaugo kūno ląsteles ir padeda joms ilgiau išlikti stangrioms, nes sujungia laisvuosius radikalus, atsirandančius dėl ląstelių gyvybinės veiklos [24]. Poveikis stresui ir depresijos simptomams, kraujagyslių kraujotakai, bei priešuždegiminės savybės yra ginkmedžio ekstraktų vartojimo pagrindas [31]. G. biloba nuo seno gerai žinomas dėl antioksidacinių savybių, tačiau buvo skirtas ribotas dėmesys jo antimikrobinėms savybėms.

2012 metais Indijoje buvo atliktas tyrimas, įvertinti ginkmedžio lapų ekstraktų (ekstrahuotų skirtingais tirpikliais) antimikrobinį aktyvumą. Antimikrobinis potencialas ir mažiausia slopinamoji koncentracija (MIC) buvo nustatyta atliekant testus lėkštelėse. Tyrime buvo naudojamos „Gram+“ ir

„Gram-“ bakterijos, aktinomicetai, grybeliai. Lapų ekstraktai buvo paruošti organiniuose tirpikliuose:

metanolyje, etilo acetate, n-butanolyje ir distiliuotame vandenyje. Mėginiai pasižymėjo antimikrobiniu poveikiu prieš visas tris mikroorganizmų grupes. Geriausi rezultatai fiksuoti metanoliniame ekstrakte, tuo tarpu vandeninis ekstraktas jokio aktyvumo neturėjo. Antimikrobiniu poveikiu pasižymėjo ir etaloninės medžiagos - ginkgolidas A, ginkgolidas B ir bilobalidas [9].

(18)

1.7 Patentuotas ginkmedžio ekstraktas EGb 761

G. biloba lapų preparatai apie 1965 m. pradėti vartoti ir Vakarų pasaulyje. Juos pradėjo gaminti vokiečių kompanija Dr. Willmar Schwabe [12], prekinis ženklas - „Tebonin“. Vėliau kompanija „Schwabe“

pradėjo bendradarbiauti su Prancūzų kompanija „Beaufour-Ipsen“, jie kartu sukūrė standartizuotą G. biloba ekstraktą, kurį pavadino EGb 761 [20]. Prekyboje atsirado tokie vaistai kaip „Tanakan“, „REkan“ ir

„Tebonin forte“. EGb 761 ekstraktas gaunamas iš supjaustytų lapų ir tai vienas iš plačiausiai vartojamų ginkmedžių lapų ekstraktų pasaulyje. Sudėtyje yra: 24 proc. flavono glikozidų, 6 proc. terpeno laktonų (2,8–

3,4 proc. ginkolidų A, B, C ir 2,6–3,2proc. bilobalidų), mažiau nei 5 ppm (5 mg/kg) ginkolinės rūgšties.

Tokią standartizuoto lapų ekstrakto sudėtį patvirtino Vokietijos bei Prancūzijos sveikatos ekspertai [37].

Farmakologiniais tyrimais įrodyta, kad G. biloba lapų ekstraktai pasižymi priešgrybeliniu, antiparazitiniu, antivirusiniu ir antibakteriniu poveikiu [17].

Pastaraisiais metais didelis dėmesys skiriamas aterosklerozės, širdies infarkto, aukšto kraujo spaudimo, išemijos pažeidimų mechanizmus išsiaiškinti [7]. ꞵ-sitosterolis pagrindinė G. biloba ekstrakto dalis, kuri padeda sulėtinti prostatos, krūties ir storosios žarnos navikų augimą, gerina metabolizmą, suaktyvina moteriškų lytinių hormonų gamybą, sumažina menopauzės simptomus, mažina mėšlungį, neleidžia susidaryti tulžies akmenims [32,36]. Dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktai, standartizuoti veikliųjų medžiagų mišiniai medicinos praktikoje naudojami kaip polivalentiniai terapiniai junginiai. Jie yra vartojami ligoms, kurioms būdingas kraujotakos sutrikimas ar kurios greičiausiai yra susijusios su laisvaisiais radikalais, gydyti. Pavyzdžiui, psichikos ir elgesio sutrikimai, periferinių kraujagyslių ar išeminės kilmės tinklainės nepakankamumas [19]. EGb 761 preparatai buvo itin paplitę Vokietijoje ir Prancūzijoje su demencija susijusių ligų simptomų gydymui [16].

1.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai

Antioksidacinis aktyvumas yra medžiagos gebėjimas sustabdyti oksidacinės degradacijos procesus, kuriuos sukelia kiti junginiai. Pavyzdžiui, ląstelių uždegiminių procesų mažinimas, kraujo krešulių susidarymo stabdymas. Norint įvertinti antioksidacinio poveikio stiprumą, tikslinga jį tirti žaliavose. Yra daugybė nustatymo metodų, tačiau jų visų esmė ta pati. Antioksidacinio aktyvumo išmatavimui turi būti sukurti tam tikri radikalai. Tuomet išmatuojamas tiriamojo mėginio stiprumas prieš sukurtus radikalus. Plačiausiai naudojami spektrofotometriniai metodai: DPPH radikalų ir ABTS radikalų- katijonų surišimo įvertinimas bei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės

(19)

galios nustatymas. Antioksidanto aktyvumas negali būti tiesiogiai matuojamas, tačiau jį lemia antioksidanto poveikis oksidacijos laipsniui kontroliuoti. Šie testai taip pat gali būti įspėjimai apie galimą kenksmingą cheminių junginių poveikį. Kadangi oksidaciją gali paveikti daugelis veiksnių, įskaitant temperatūrą, deguonies koncentraciją reakcijos terpėje ir metalinius katalizatorius, rezultatai gali skirtis priklausomai nuo naudojamų oksidacijos sąlygų. Testai, kuriais matuojami substratai ar gaminiai, taip pat gali duoti įvairius rezultatus, atsižvelgiant į jų specifiškumą [2,27]. 2012 metais Kinijoje buvo atliekamas tyrimas, kurio autoriai teigia: „tiriant tokios pačios augalinės žaliavos mėginius ir naudojant skirtingus metodus, gauti skirtingi rezultatai įrodo, kad įtakos rezultatams gali turėti ir metodo metu naudoti skirtingi reagentai“ [33].

1.8.1 ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas

Paprastas, gali būti naudojamas rutininei analizei. Greitai reaguoja su antioksidantais, dažniausiai per 30min. Ilgai išliekantis spalvotas radikalas. Regimosios šviesos spektre turi kelis absorbcijos maksimumus ( 415, 650, 734 ir 815 nm). Gali būti naudojamas plačiame pH diapazone.

Tirpsta daugelyje tirpiklių, neturi įtakos jonų stiprumui. Ši savybė leidžia atlikti analizes keliose terpėse ekstraktų ir kūno skysčių hidrofilinėms ir lipofilinėms antioksidantų savybėms nustatyti. Taikomas tiek lipofiliniams, tiek hidrofiliniams antioksidantams, įskaitant ﬂavonoidus, hidroksicinamatus, karotenoidus ir plazmos antioksidantus. ABTS yra tikslinė molekulė, naudojama įvertinti antioksidantų mėginių reaktyvumą esant peroksidams. Iš pradžių ABTS veikiama oksidacijos reakcija su kalio permanganatu, kalio persulfatu arba 2,2′-azo-bis (2-amidinopropanu), gaunant radikalųjį melsvai žalsvos spalvos ABTS katijoną (ABTS • +). ABTS stabilus keletą minučių. Todėl spalvos pasikeitimo laipsnį galima išreikšti kaip ABTS radikalo slopinimo procentą, kuris nustatomas kaip antioksidantų koncentracijos ir laiko funkcija (4 pav.). Nustatant antioksidanto aktyvumą, atsižvelgiama į antioksidanto koncentracijos ir reakcijos trukmę, slopinant radikalų katijonų absorbciją [2,25,27].

4 Pav. ABTS radikalo reakcija su antioksidantų junginiais [27]

(20)

1.8.2 DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas

Paprastas ir greitas, jautrus metodas. Šis metodas gali būti naudojamas tiek su poliniais, tiek su nepoliniais organiniais tirpikliais hidrofiliniams ir lipofiliniams antioksidantams įvertinti. Apibūdinamas kaip stabilus laisvasis radikalas, nes molekulėje esančių aromatinių sistemų pi elektronai gali kompensuoti elektronų trūkumą. Galima įvertinti bet kurio junginio antioksidacinį aktyvumą in vitro arba in vivo modeliais. Priešingai nei dauguma laisvųjų radikalų DPPH nesumažėja. Sąveikoje elektrono delokalizacijos procese atsiranda ryškiai violetinė spalva, kurios skiriamoji savybė absorbcija tirpale, vyraujant 517 nm.

Dauguma mokslininkų tarp jų Brand-Williams naudodami DPPH metodą, siekiant įvertinti specifinių junginių ar ekstraktų aktyvumą tirpale. Kai DPPH tirpalas kontaktuoja su medžiaga, galinčia duoti vandenilio joną, arba su kitu radikalu (R •), susidaro redukuota forma DPPH-H arba DPPH-R, dėl to prarandama spalva, todėl sumažėja arba neįvyksta absorbcija (5 pav.). Taigi DPPH redukcija suteikia vertę, skirtą įvertinti bandomojo junginio sugebėjimui sulaikyti radikalus [22,25,27].

5 Pav. DPPH radikalo reakcija su kitu radikalu (R=H, alkilo radikalas ir k.t.) [22]

1.8.3 FRAP metodas

Matuoja gebėjimą rūgštinėje terpėje redukuoti geležies joną (Fe³⁺-TPTZ) į intensyviai mėlynos spalvos geležies joną (Fe²⁺-TPTZ). Metodas vertinamas pagal tirpalų spalvos pasikeitimą (6 pav.). Priešingai nei kiti bendrojo antioksidanto galios testai, FRAP tyrimas yra paprastas, greitas,

nebrangus, todėl jam nereikia specializuotos įrangos. FRAP metodą galima atlikti naudojant automatinius, pusiau automatinius arba mechaninius įrankius. Rezultatai gali labai skirtis, priklauso nuo analizės laiko.

Greitai reaguojantys fenoliai, kurie suriša geležį arba suskyla į junginius, kurių mažas ar kitoks reaktyvumas, geriausiai analizuojami naudojant trumpą reakcijos laiką, pavyzdžiui, 4 min. Tačiau kai kurie polifenoliai reaguoja lėčiau ir jų aptikimui reikalingas ilgesnis reakcijos laikas, pavyzdžiui, 30 min.

[2,25].

(21)

Fe³⁺-TPTZ + antioksidanto mažejimas Fe²⁺-TPTZ intensyviai mėlyna prie 595 nm.

6 Pav. FRAP reakcijos mechanizmas esant antioksidantui [27]

1.8.4 CUPRAC metodas

Paprastas, nebrangus, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros. Varis lyginant su geležimi turi pranašumų atliekant antioksidantų tyrimus, nes visų klasių antioksidantai, įskaitant tiolius yra nustatomi mažai reaguojant į radikalus ir vario reakcijos kinetika yra greitesnė nei geležies. Askorbo rūgšties, šlapimo rūgšties, galo rūgšties ir kvercetino CUPRAC tyrimas atliekamas per kelias minutes, tačiau sudėtingesnėms molekulėms reikia 30–60 min. tai yra šio metodo trūkumas [2,25].

1.9 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktas sertifikuotas, plačiai naudojamas medicinoje, tačiau jo farmakologinis poveikis vis plačiau tyrinėjamas dėl kitų savybių. Atlikinėjami tyrimai apie jo antimikrobines savybes, daromą poveikį vėžinėms ląstelėms. Taip pat apie naudingųjų medžiagų sudėtį auginant žaliavas joms neįprastose augimo sąlygose. Reikia toliau plėtoti tyrimus apie kitas ekstrakto savybes, galbūt praplėsti kokybiškos žaliavos auginimo Europoje analizę.

(22)

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrime naudoti dviskiaučių ginkmedžių lapai, surinkti skirtingu vegetacijos laikotarpiu iš skirtingų Lietuvos vietovių. 2019 m. balandžio – spalio mėnesiais. Vaistinė augalinė žaliava buvo išdžiovinta, susmulkinta elektriniu malūnėliu ir laikoma kambario temperatūroje, tamsaus stiklo buteliukuose.

Botanikos sodų žaliava buvo išdžiovinta džiovyklėje palaikant 30-40º C temperatūrą, namų ūkių žaliava buvo džiovinama kambario temperatūroje.

• Klaipėda, botanikos sodas

• Kaunas, botanikos sodas

• Šiauliai, botanikos sodas

• Ignalina, namų ūkis

• Druskininkai, namų ūkis

• Radviliškio rajonas, namų ūkis 2.2 Naudoti reagentai

• ABTS reagento ruošimui: 2,2‘-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) diamonio druska (Buchs, Switzerland);

• Aliuminio chloridas (99,99 proc. „Sigma-Aldrich“, Scnelldorf, Vokietija);

• Buferinei sistemai sudaryti amonio acetatas („Sigma-Aldrich“, Belgija).

• Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);

• Heksametilentetraminas (≥99,9 proc., Roth, Vokietija);

• Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema „Milipore“, Bedford MA, JAV);

• Kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija);

• Kvercetino dihidratas (,,Carl Roth GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija);

• Ledinė acto rūgštis (99,5 proc. „Sigma-Aldrich“, Scnelldorf, Vokietija);

• Metanolis 99,8 proc. („Sigma-Aldrich“, Scnelldorf, Vokietija);

• Natrio karbonatas („Sigma-Aldrich“, Scnelldorf, Vokietija);

• Trolokso reagentas („Sigma – Aldrich“, Vokietija).

(23)

2.3 Naudota aparatūra ir prietaisai

• Analitinės svarstyklės (,,Shimadzu Auw“ 120 D, Bellingen, Vokietija);

• Automatinės pipetės (,,Eppendorf Research“, Eppendorf, JAV);

• Elektrinis malūnas (,,Retsch 200“, Haan, Vokietija);

• Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika (,,GmbH“, Šveicarija);

• Termostatinė vonelė (,,Heidolph“, Schwabach, Vokietija);

• Vandens gryninimo sistema (,,Millipore“ Bedford, MA);

• Q-Max membraninis filtras (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, ,,Frisenette“, Knebel, Vokietija).

2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas

Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktai buvo ruošiami remiantis Europos farmakopėjos 01/2008:1828 straipsnyje nurodytu metodu [14]. 0,5g žaliavos suberta į kaitinimui skirtus buteliukus, užpilta 2,5 ml metanolio ir mišinys gerai suplaktas. Ekstrakcija atlikta termostatinėje vonelėje 10 min, palaikant pastovią 65º C temperatūrą. Po ekstrakcijos kiekvienas buteliukas supurtytas ir paliktas atvėsti kambario temperatūroje. Atvėsęs buteliukuose esantis mišinys filtruotas pro membraninį filtrą sudrėkintą metanoliu. Gauti ekstraktai išpilstyti į rudo stiklo buteliukus, sandariai uždaryti ir laikyti vėsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje [14].

2.5 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas augalinį ekstraktą veikiant aliuminio (III) chlorido tirpalu (pH<7). Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbą įpilant 0,2 ml praskiestos (1:10) vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio (III) chlorido tirpalo. Praėjus 30 minučių į tirpalų mišinį įpilama 0,4 ml 5 proc.

heksametilentetramino tirpalo, skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Esant 407 nm

(24)

bangos ilgiui spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu.

Rezultatai įvertinami naudojant kvercetino kalibracinę kreivę (7 pav.). Kvercetino kalibracinei kreivei gauti ruošiami etaloniniai kvercetino tirpalai. Jie ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj 0,2 ml vaistinės žaliavos ištraukos, pilama 0,2 ml šešių žinomų koncentracijų (0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml) kvercetino tirpalai.

Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui sausos žaliavos.

Apskaičiuojama remiantis formule:

X = ^C^×^V

m ; mg/g , kur

C- kvercetino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės;

V- ekstrakto tūris (ml);

m – pasvertas vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).

y= 1,7791x+0,0241 ; R²= 0,9974.

7 pav. Kvercetino kalibracinės kreivės grafikas

y = 1.7791x + 0.0241 R² = 0.9974

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Adsorbcija

Kvercetino koncentracija, mg/ml

(25)

2.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

Etaloniniam ABTS tirpalui paruošti atsveriama 0,0549 g ABTS miltelių, tirpinama tamsaus stiklo buteliuke su 50 ml distiliuoto vandens. Atsveriama 0,0095 g kalio persulfato miltelių, jie suberiami į gautą tirpalą praėjus 4 min. Tirpalas sumaišomas ir paliekamas stovėti 16 valandų tamsioje vietoje, kambario temperatūroje [13]. Darbiniui ABTS tirpalui paruošti reikia praskiesti pradinį ABTS tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Tirpalas spektrofotometriniam tyrimui ruošiamas sumaišant 3 ml darbinio ABTS tirpalo su 20 μl dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto. Mišinys laikomas 60 min tamsioje vietoje, kambario temperatūroje.

Spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija esant 734 nm bangos ilgiui [23].

Rezultatai įvertinami naudojant trolokso kalibracinę kreivę (8 pav.). Trolokso kalibracinei kreivei gauti etaloniniai tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj vaistinės žaliavos ekstrakto pilama 20 μl šešių žinomų koncentracijų (800 μmol/L, 600 μmol/L, 400 μmol/L, 200 μmol/L, 100 μmol/L, 50 μmol/L) trolokso tirpalai.

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartiniais antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) vienam gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:

TE^ABTS = c × V/m (μmol/g), kur c- trolokso koncentracija (μmol/L) nustatyta iš kalibracinės kreivės;

V- ekstrakto tūris (L);

m- tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

y= 0,0002x+0,0183 R²=0,9976

8 pav. Trolokso kalibracinės kreivės grafikas

y = 0.0002x + 0.0183 R² = 0.9976

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

0 200 400 600 800 1000

Adsorbcijos pokytis

Trolokso koncentracija, µmol/L

(26)

2.7 Statistinis duomenų įvertinimas

Gauti tyrimų rezultatai įvertinami statistiškai, naudojant „Microsoft Excel 2010“ („Microsoft“, JAV) programą ir statistinę duomenų vertinimo sistemą „IBM SPSS Statistics“ (SPSS Inc., JAV).

Naudojant „Microsoft Excel 2010“ programą apskaičiuoti gautų rezultatų matematiniai vidurkiai. Statistinis patikimumas įvertintas „IBM SPSS Statistics“ programa. Rezultatai laikyti statistiškai patikimais, kai p<0,05.

(27)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Atlikto tyrimo metu buvo naudojama 2019 metais surinkta žaliava. Iš dviskiaučio ginkmedžio žaliavos lapų gauti etanoliniai ekstraktai, kuriuose tirtas suminis flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas. Antioksidacinis aktyvumas tirtas spektrofotometrijos metodu, naudojant ABTS reagentą.

3.1 Bendras flavonoidų kiekis G. biloba lapų ekstraktuose

Gautuose etanoliniuose lapų ekstraktuose didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas rugpjūčio mėnesį Klaipėdoje rinktoje žaliavoje - 9,82 mg/g. Mažiausias rugsėjį Šiauliuose – 1,55 mg/g, didžiausias šio miesto augavietėjė kiekis nustatytas birželio mėnesį 7,3 mg/g. Liepą ir rugpjūtį Šiaulių augavietės žaliavos bendras flavonoidų kiekis mažėjo, o rugsėjo mėnesį pakilo iki 7,27 mg/g. Klaipėdos miesto botanikos sodo žaliavos flavonoidų kiekis reikšmingai didėjo, rugsėjį lapams pageltus sumažėjo, tačiau nepasiekė birželio ir liepos rezultato (9 pav.). Rugpjūčio mėnesį Klaipėdoje oro temperatūra buvo aukštesnė nei daugiametis vidurkis, kritulių kiekis mažesnis ir saulės spindėjimo stiprumas didesnis.

Sustiprėjęs saulės poveikis padidina flavonoidų sintezės intensyvumą [9]. Toks reiškinys taip pat buvo nustatytas 2016 metų atliktame tyrime su G. biloba ekstraktais. Galima teigti, kad būtent dėl to taip skiriasi liepos ir rugpjūčio mėnesio rezultatai. Kauno botanikos sodo žaliavoje didžiausias flavonoidų kiekis buvo nustatytas liepos mėnesį - 8,5 mg/g, lapams pradėjus gelsti rugpjūtį, kiekis mažėjo iki 7,18 mg/g rugsėjo mėnesį. Šių metų vegetacijos laikotarpis neįprastai sausesnis ir šiltesnis nei daugiamečiai vidurkiai, kas galėjo daryti įtaką naudingų medžiagų kiekiams.

9 pav. Suminio flavonoidų kiekio pokyčiai vegetacijos periodu (birželio – rugsėjo mėn.)

7.3

3.6

1.5

7.27

4.28 5.05

9.82

7.89 8.5 8

6.6 7.18

0 2 4 6 8 10 12

Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis

Flavonoidų kiekis, mg/g

Lapų rinkimo laikas Šiauliai Klaipėda Kaunas

(28)

Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp Klaipėdos ir Kauno augaviečių (p<0,05).

Vegetacijos periodu surinktos žaliavos suminio flavonoidų kiekio rezultatų vidurkiai: 6,79 mg/g Klaipėdos, 6,68mg/g Kauno, 4,9 mg/g Šiaulių žaliavos ekstraktuose. Mažiausias kiekis nustatytas Šiaulių miesto botanikos sodo žaliavos ekstraktuose (10 pav.).

10 pav. Suminio flavonoidų kiekio rezultatų palyginimas skirtingose žaliavos rinkimo augavietėse

Namų ūkiuose rinktoje žaliavoje nustatyti mažesni kiekiai flavonoidų nei botanikos sodų žaliavoje. Skirtumas tarp jų statistiškai nereikšmingas (p>0,05). Lyginant namų ūkių augaviečių žaliavas, didesnis kiekis nustatytas Druskininkų žaliavoje (11 pav.). Mažiausias Radviliškio rajono 2,34mg/g.

Skirtumai tarp miestų augaviečių statistiškai nereikšmingi (p>0,05).

11 Pav. Namų ūkių žaliavos ekstraktų suminio flavonoidų kiekio rezultatų palyginimas vegetacijos periodu skirtingose žaliavos rinkimo augavietėse

4.9

6.79 6.68

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Vietovės Šiauliai Klaipėda Kaunas

2.34

4.21

3.8

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Vietovės

Radviliškis Druskininkai Ignalina

(29)

3.2 Antioksidantinio aktyvumo G. biloba lapuose rezultatų įvertinimas

Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas rugsėjo mėnesį Klaipėdoje 535,85 µmol/g, tai yra didžiausias rezultatas tarp miestų, mažiausias birželio mėnesį Šiauliuose 150,35 µmol/g. Klaipėdos žaliavos ekstraktų pokyčiai svyravo nuo 209,85 µmol/g iki 535,85 µmol/g. Šiaulių ekstraktuose mažiausias aktyvumas nustatytas birželio mėnesį 150,35 µmol/g, didžiausias rugsėjo mėnesį 494,35 µmol/g. Kauno miesto svyravo nuo 203,85 µmol/g gegužės mėnesį iki 505,85 µmol/g rugsėjo mėnesį. Lyginant šiuos keturis mėnesius (birželis-rugsėjis) Kauno žaliavos ekstraktuose fiksuotas didesnis antioksidacinis aktyvumas. Klaipėdos žaliavos ekstrakte tik rugsėjo mėnesį fiksuotas didesnis aktyvumas (12 pav.).

Skirtumai statistiškai reikšmingi (p<0,05).

12 Pav. Antioksidacinio aktyvumo rezultatų pokyčiai vegetacijos periodu (birželio – rugsėjo mėn.)

Nustatytas statistiškai reikšmingas antioksidacio aktyvumo skirtumas tarp miestų augaviečių (p<0,05). Viso vegetacijos periodo gautų rezultatų išvestas vidurkis didžiausią antioksidacinį aktyvumą parodė Kauno miesto žaliavos ekstraktuose 352,35 µmol/g, mažesnis aktyvumas Klaipėdos 334,85 µmol/g, mažiausias Šiaulių 284,6 µmol/g. (13 pav.).

150.35

535.85

0 100 200 300 400 500 600

Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis

Antioksidacinis aktyvumas TE, µmol/g

Lapų rinkimo laikas Šiauliai Klaipėda Kaunas

(30)

13 pav. Antioksidacinio aktyvumo rezultatų palyginimas skirtingose žaliavos rinkimo augavietėse

Namų ūkių žaliavose, didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas rugsėjo mėnesio Radviliškio rajono žaliavoje 324,85 µmol/g. (14 pav.). Mažiausias Druskininkų rugpjūčio mėnesį 133,35 µmol/g. Nustatytas skirtumas tarp augaviečių statistiškai nereikšmingas (p>0,05).

14 Pav. Namų ūkių žaliavos antioksidacinio aktyvumo rezultatų palyginimas skirtingose žaliavos rinkimo augavietėse

2019 metais nustatyti ginkmedžio žaliavos ekstraktų rezultatai pagal ABTS metodiką nerodo antioksidacinio aktyvumo koreliacijos su suminiu flavonoidų kiekiu. Tačiau suminis flavonoidų kiekis kaip

334.85 352.35

284.6

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Vietovės Klaipėda Kaunas Šiauliai

243.85

270.51

239.85

220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275

Vietovės

Druskininkai Radviliškis Ignalina

(31)

ir antioksidacinis aktyvumas panašus lyginant Kauno žaliavos ekstraktus ir Klaipėdos žaliavos ekstraktus.

Šiaulių žaliavos ekstraktuose nustatyti mažesni kiekiai nei Kauno ir Klaipėdos.

Namų ūkių žaliavos ekstraktuose nustatytas mažesnis aktyvumas nei botanikos soduose rinktose žaliavose. Galima daryti prielaidą, kad džiovinant žaliavą kambario temperatūroje pakinta naudingų medžiagų kiekis.

3.3 Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų rezultatų palyginimas su ankstesnių metų tyrimais

Tyrime, atliktame 2012 metais, autoriai teigia, kad „daugiausia tyrimų atliekama iš G. biloba lapų, kurie renkami liepos - rugpjūčio mėnesiais ir nuo ketverių iki septynerių metų amžiaus medžių, tačiau nuo medžių su vaisiais (vyresnių nei 10 metų medžių) lapai neskinami ir pasensta pasibaigus vaisių derliaus sezonui (lapkritį)“ [33].

2017 metais atliktame tyrime buvo tirtas antioksidacinis aktyvumas iš surinktų lapų, kurie vėlyvą rudenį jau buvo nukritę ant žemės. Iš žaliavos buvo gaminami etanoliniai ekstraktai. Dalis lapų buvo džiovinti, kita dalis šviežiai surinkti. Antioksidacinis aktyvumas tirtas DPPH metodu, polifenoliai „Folin–

Ciocalteu“ metodu. Džiovintų ginkmedžio lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas svyravo nuo 37,69 ± 1,97 iki 92,85 ± 0,28 proc. Didžiausias bendras fenolio kiekis siekė apie 9,15 mg/g, nustatytas mėginiuose ekstrahuotuose 40 proc. (tūrio/tūrio) etanolio „Skolseto“ aparate. Taip pat tirtuose mėginiuose buvo įrodyta teigiama koreliacija tarp bendro polifenolio kiekio ir antioksidacinio aktyvumo. Ginkgo biloba L. geltonųjų lapų ekstraktai, surinkti pasibaigus auginimo sezonui, parodė didelį gebėjimą sunaikinti laisvuosius radikalus, tai suteikė galimybę panaudoti nukritusius lapus kaip vertingą antioksidantų šaltinį [36].

2013 metais Indijoje mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu nustatė dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto bendrą flavonoidų ir fenolių kiekį, antioksidacinį aktyvumą pagal vietą, sezoną ir tirpiklių sistemą.

Antioksidacinį aktyvumą nustatinėjo su ABTS, DPPH ir FRAP reagentais. Nustatytas didžiausias bendras fenolio ir flavonoidų kiekis bei antioksidantinis aktyvumas rudenį, kai lapai pradeda gelsti. Tarp tirpiklių fenolio ir flavonoidų kiekiui geriausi rezultatai nustatyto acetono / vandens ekstraktai, tuo tarpu antioksidacinio aktyvumo rezultatai didžiausi buvo nustatyti metanolio ekstraktuose. ABTS reagentas parodė didesnį antioksidacinį aktyvumą nei jų naudojami DPPH ir FRAP, skirtingose vietovėse ir sezoniškumą [28].

(32)

3.3.1 Suminis flavonoidų kiekis

Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Kauno botanikos sode birželio-liepos mėnesiais rinktoje žaliavoje. Mažiausias - spalio mėnesį. Flavonoidų kiekis didėjo nuo gegužės iki rugpjūčio mėnesio, rugsėjį, pradėjus lapams gelsti, užfiksuotas nežymus padidėjimas 8,5mg/g ir spalį ženklus sumažėjimas (15 pav.).

Mažiausias kiekis nustatytas spalio mėnesį, kai lapai visiškai pageltę. Rezultatai svyravo nuo 3,46 mg/g iki 8,5 mg/g. Suminio flavonoidų kiekio skirtumas statistiškai reikšmingas (p<0,05).

15 pav. Kauno botanikos sodo augavietėje rinktos žaliavos suminio flavonoidų kiekio pokyčiai vegetacijos laikotarpiu (gegužes-spalio mėn.)

2018 metais atliktame tyrime autorius teigia, kad „pagal rutiną išreikštas flavonoidų didžiausias kiekis buvo rastas (5,09 RE mg/g) žaliavoje surinktoje Kauno botanikos sode. Taip pat didelis kiekis flavonoidų rastas Klaipėdos botanikos sode (5,04 RE mg/g) “ [4]. Atliktame tyrime 2019 metų žaliavoje pagal kvercetiną didžiausias kiekis buvo rastas taip pat Klaipėdos ir Kauno botanikos sodų žaliavoje. 2016 metais atliktame tyrime autorius nustatė, kad Šiauliuose 2014 metais rinktų lapų ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis svyravo nuo 7,04 ± 0,32 mg/g iki 10,07 ± 1,29 mg/g. Didžiausią flavonoidų kiekį nustatė birželio ir spalio mėnesiais, o mažiausią – rugpjūčio mėnesį. Šio tyrimo 2014 metais Šiaulių miesto žaliavoje fiksuotas bendro flavonoidų kiekio proporcingas mažėjimas nuo birželio iki rugpjūčio mėnesio, o augimas pastebėtas rugsėjį bei spalį. 2015 metų rinktos žaliavos mėginiuose tyrime teigiama, kad kiekio svyravimai buvo visiškai priešingi nei 2014 metų. Flavonoidų kiekis 2015 metų mėginiuose buvo 1,2 karto didesnis nei 2014 metais rinktoje žaliavoje (4 lentelė) [3].

6.45

8.5

3.46

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lapų rinkimo laikas

Gegužis Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis

(33)

4 lentelė. G. biloba lapų ekstraktų suminio flavonoidų kiekio palyginimas skirtingų tyrimų, skirtingais metais žaliavoje

Vietovė 2014m. 2015m. 2018m. 2019m.

Kaunas Nėra duomenų Nėra duomenų 5.09 RE mg/g. 3,46 mg/g iki 8,5 mg/g.

Klaipėda 4,81 ± 0,24 mg/g iki 7,34 ± 0,56 mg/g.

5,57 ± 2,2 mg/g iki 7,36 ± 1,3 mg/g.

5.04 RE mg/g. 4,28 mg/g iki 9,82 mg/g.

Šiauliai 7,04 ± 0,32 mg/g iki 10,07 ± 1,29 mg/g.

8,25 ± 0,31 mg/g iki 11,85 ± 2,3 mg/g.

3.58 RE mg/g. 1,55 mg/g iki 7,3 mg/g.

2019 metų žaliavos ekstraktuose žemutiniai rezultatai mažesni nei ankstesnių metų kitų autorių atliktuose tyrimuose. Kauno ir Klaipėdos botanikos sodų žaliavų ekstraktuose rezultatai aukštesni, Šiaulių miesto žemesni lyginant su prieš tai atliktų tyrimų rezultatais. Palyginus su 2014 metų ir 2015 metų žaliavos tyrimų rezultatais, Šiaulių miesto augavietės rezultatai stipriausiai skiriasi 2019 metų žaliavos.

3.3.2 Antioksidacinis aktyvumas

2016 metais atliktame tyrime, kuriame buvo nagrinėjamos 2014 ir 2015 metų žaliavos, rastas didesnis mažiausias aktyvumas nei 2019 metų atlikto tyrimo žaliavoje. Atsižvelgiant į ankstesnių metų tyrimo rezultatus Šiaulių mieste, stebėtinas tolygus tyriamosios žaliavos aktyvumo lygis, 2014 m. – 452,49 µmol/g, 2015 m. - 453,06 µmol/g ir 2019 m. - 494,35 µmol/g. Klaipėdoje 2019 m. žaliavoje nustatytas didesnis aktyvumas nei ankstesniais metais (5 lentelė). 2014 metų Šiaulių žaliavos mažiausia reikšmė nustatyta rugpjūčio mėnėsį, 2015 m. spalio mėnesį, o 2019 m. mažiausias aktyvumas birželio mėnesį.

Didžiausios reikšmės 2014 m. spalio mėnesį, 2015 m. liepos ir rugpjūčio mėnesiais, 2019 m. rugsėjo mėn.

Palygindamas Klaipėdos ir Šiaulių 2014 ir 2015 metais rinktos žaliavos ekstraktų antioksidacinį aktyvumą autorius teigia, kad „2015 metais surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų antioksidacinis aktyvumas yra 0,98 karto didesnis, nei lapų rinktų 2014 metais“ [3].

(34)

5 lentelė. Šiaulių ir Klaipėdos miestų antioksidacinio aktyvumo rezultatų palyginimas

Antioksidacinio aktyvumo reikšmės žemutiniai rezultatai mažesni 2019 metų rinktoje žaliavoje, tačiau didžiausios nustatytos reikšmės didesnės nei ankstesnių metų tyrimų. Didesnis kontrastas tarp žemiausių ir didžiausių aktyvumo reikšmių.

3.4 Rezultatų priklausomybės nuo oro sąlygų įvertinimas

Kauno botanikos sodo augavietės žaliavos suminis flavonoidų kiekis svyravo nuo 3,46 mg/g spalio mėnesį iki 8,5 mg/g liepos mėnesį (p<0,05). Galima įžvelgti, kad kai kritulių kiekis buvo mažesnis nei daugiametis vidurkis, o saulės spinduliuotė stipresnė nei daugiametis vidurkis, nustatytas didesnis flavonoidų kiekis. Kaune nuo birželio iki spalio iškrito mažesnis kritulių kiekis ir saulės spinduliuotė buvo stipresnė. Taikant ABTS metodiką tyrimo rezultatai parodė Kauno botanikos sodo augavietės žaliavos mėginiu flavonoidų didesnę reikšmę visą vegetacijos laikotarpį lyginant su kitomis vietovėmis, pagal vegetacijos laikotarpį. Nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp bendrosios saulės spinduliuotės ir suminio flavonoidų kiekio G. biloba lapų ekstraktuose (p<0,05). (6 lentelė).

Vietovė 2014m. 2015m. 2019m.

Šiauliai 333,43 ± 0,97 μmol/g iki 452,49 ± 0,43 μmol/g.

349,55 μmol/g iki 453,06 μmol /g

150,35 μmol/g iki 494,35 μmol /g.

Klaipėda 293,56 ± 21,99 μmol/g iki 337,68 ± 5,9 μmol/g.

309,96 μmol/g iki 333,43 μmol /g.

184,85 μmol/g iki 535,85 μmol /g.