MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
ARTŪRAS JUKNA
FLAVONOIDŲ ĮVERTINIMAS GRIKIŲ ŽALIAVOJE
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof. Vitalis Briedis Data
FLAVONOIDŲ ĮVERTINIMAS GRIKIŲ ŽALIAVOJE PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas
Data
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas Data Darbą atliko Magistrantas ARTŪRAS JUKNA Data KAUNAS, 2016
TURINYS
PADĖKA ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 8 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1. 1. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) ... 12
1.1.1.Augalo morfologinis aprašymas ... 12
1.1.2. Augalo paplitimas ir auginimas ... 13
1.1.3. Augalinė žaliava, jos paruošimas, laikymas ir panaudojimas ... 13
1.1.4. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) cheminė sudėtis ... 14
2. TYRIMŲ METODIKA ... 20
2.1. Tyrimų objektas ... 20
2.2. Tyrimų metodai ... 21
2.2.1. Medžiagos ir reagentai ... 21
2.2.2. Naudota aparatūra ... 21
2.2.3. Tiriamojo mėginio paruošimas... 21
2.3. Statistinis duomenų įvertinimas ... 23
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24
3.1. Flavonoidų tapatybės nustatymas aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodu .... 24
3.2. Žemdirbystės sistemų ir veislės įtaka sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose kaupiamių biologiškai aktyvių junginių kiekiui ... 26
3.2.1.1. Ekologinės žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka rutino kiekiui žolėje ir
žieduose ... 27
3.2.1.2. Intensyviosios žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka rutino kiekiui žolėje ir žieduose ... 29
3.2.1.3. Rutino kiekybinės analizės rezultatų apibendrinimas ... 30
3.2.2.1. Ekologinės žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka kvercitrino kiekiui žolėje ir žieduose ... 32
3.2.2.2. Intensyviosios žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka kvercitrino kiekiui žolėje ir žieduose ... 33
3.2.2.3. Kvercitrino kiekybinės analizės rezultatų apibendrinimas ... 35
IŠVADOS ... 37
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju už pagalbą ir patarimus mokslinio darbo vadovui Prof. Liudui Ivanauskui bei Analizinės ir toksikologinės katedros kolektyvui už pagalbą ruošiant baigamąjį magistro darbą.
SANTRAUKA
A. Juknos magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2016.
Magistrinio darbo tema: Flavonoidų įvertinimas grikių žaliavoje plonasluoksnės chromatografijos metodu
Darbo tikslas: Ištirti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų įtaką skirtingų sėjamųjų grikių veislių žolės ir žiedų kaupiamų fenolinių junginių kiekui.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti Lietuvoje auginamų skirtingų grikių veislių flavonoidų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodu.
2. Ištirti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų įtaką sėjamųjų grikių žolės ir žiedų kaupiamų rutino ir kvercitrino kiekiui.
3. Palyginti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemose augintų skirtingų veislių grikių žolėje ir žieduose nustatyto rutino kiekio kitimą.
4. Palyginti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemose augintų skirtingų veislių grikių žolėje ir žieduose nustatyto kvercitrino kiekio kitimą.
Tyrimų objektas: Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis auginti sėjamųjų grikių žiedai ir žolė (antžeminė biomasė). Flavonoidų kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimams panaudoti 'VB Vokiai', 'VB Nojai', 'Kora' ir 'Panda' veislių grikių ėminiai, kurie užauginti 2014 m. Lietuvoje, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filiale.
Tyrimo metodika: Darbo metu taikytos aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodikos. Rezultatai ir išvados: Atlikus skirtingų grikių veislių žolės ir žiedų etanolinių ekstraktų analizę aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodu, identifikuoti šie flavonoidai: rutinas ir kvercitrinas. Nustatyta, kad rutino ir kvercitrino kiekį sėjamųjų grikio žolėje ir žieduose lemia žemdirbystės sistema, veislė bei žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (p < 0,05). Dviejų veiksnių dispersinės analizės rezultatai rodo, kad rutino kiekiui žolėje didžiausią įtaką daro žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika, žieduose - veislė. Kvercetino kiekiui žolėje ir žieduose didžiausią įtaką daro veislė. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikiai daugiausia rutino sukaupė 'VB Nojai' veislės žolėje ir 'Panda' veislės žieduose. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis- daugiausia 'Kora' veislės žolėje ir žieduose.
Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikiai daugiausia kvercitrino sukaupė 'VB Nojai' veislės grikių žolės ir žiedų ėminiuose. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių grikių žolės ir žiedų ėminiuose daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' grikių veislėje.
SUMMARY
A. Juknos master‘s thesis/ supervised by Prof. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry - Kaunas, 2015.
Objective: To investigate the ecological and intensive farming systems on different buckwheat varieties of grasses and flowers collected phenolic compounds.
Objectives:
1. Investigate Lithuania cultivated different varieties of buckwheat flavonoids qualitative and quantitative composition of the variation in high-performance thin-layer chromatography.
2. To investigate the ecological and intensive farming systems on buckwheat grass and flowers collected rutin and kvercitrino quantity.
3. Compare the ecological and intensive cropping systems grown different varieties of buckwheat grass and finger rings set rutin flow.
4. Compare the ecological and intensive cropping systems grown different varieties of buckwheat grass and finger rings set kvercitrino flow.
Methods: During applied in high-performance thin-layer chromatography techniques.
Results and conclusions: After the buckwheat different varieties of herbs and flowers ethanol extract analysis of high-performance thin-layer chromatography to identify these flavonoids: rutin and kvercitrinas. It was found that rutin and kvercitrino amount of buckwheat grass and roundabouts due to cropping system, breed and farming system and the breed interaction (P <0.05). Two-factor analysis of variance showed that rutin content of the grass is mainly affected by cropping systems and a variety of interactions, finger rings - variety. Quercetin amount of grass and roundabouts are mainly affected by breed. Ecological farming conditions for growing buckwheat rutin mainly built 'DP Noah' grass varieties and 'Panda' varieties in flowers. Intensive farming sąlygomis- mainly 'Kora' grass varieties and roundabouts. Ecological farming conditions for growing buckwheat mainly accumulated kvercitrino 'DP Noah' varieties of buckwheat flowers and grass samples. Intensive cropping growing buckwheat flowers and grass samples mainly kvercitrino found 'DP Noah' buckwheat breed.
SANTRUMPOS
ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija
PC – Plonasluoksnė chromatografija
AEPC (HPTLC angl.) – Aukšto efektyvumo plonasluoksnė chromatografija
ES –Europos Sąjunga
UV – Ultravioletiniai spinduliai
KE – Kapiliarinė elektroforezė
ĮVADAS
Grikiai geba lengvai prisitaikyti prie įvairių augimo sąlygų, pasižymi didele maistine verte, dažnai yra įtraukiami į sveikai besimaitinančių asmenų valgiaraštį, dietas [15]. Grikiai neturi kviečiuose, rugiuose ir miežiuose esančio gliuteno (glitimo), kurio daugumos žmonių virškinimo sistema netoleruoja, todėl grikiai ateityje turėtų tapti viena iš svarbesnių žaliavių maisto pramonėje kaip alternatyva javams [32, 48]. Ateityje vis didesnį grikių suvartojimą lems sveiko maisto paklausos didėjimas, ekologinių produktų poreikio augimas.
Pastaruoju metu, Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, daug dėmesio skiriama maisto saugai ir kokybei. Gausėjant alerginiams, vėžiniams susirgimams, plintant apsigimimams ir pasitaikant apsinuodijimų pesticidais atvejų, žmonės pradeda vengti chemikalais apdorojamų produktų [49]. Sveiko maisto šalininkai labiau vertina vaisius, daržoves bei kitus produktus, užaugintus švarioje ir saugioje aplinkoje (be sintetinių trąšų ir cheminių augalų apsaugos priemonių) nei intensyviąją žemdirbystę plėtojančiuose ūkiuose. Europos Sąjungoje (ES) nėra kitos tokios žemės ūkio specializacijos srities, kuri taip sparčiai didėtų kaip ekologinė žemdirbystė. Kiekvienais metais ekologiškas maistas įgauna didesnį populiarumą ne tik Europoje, bet ir visame pasaulyje. Dėl to dažnai susiformuoja nuomonė, kad ekologiškai augintas maistas yra sveikesnis ir saugesnis nei užaugintas intensyviosios žemdirbystės sąlygomis. Norint teisingai įvertinti žemdirbystės sistemų įtaką auginamos produkcijos kokybei, trūksta išsamių sistemų (ekologinės ir intensyvios žemdirbystės) tyrimų. Siekiant išssiaiškinti, ar iš tiesų ekologiniame ir intensyvios žemdirbystės ūkiuose užauginta produkcija skiriasi savo kokybe ir poveikiu sveikatai, pirmiausia produktuose tiriami biologiškai aktyvių junginių kiekiai, jų kitimo dėsningumai. Norint gauti pastovų, didelį ir geros kokybės grikių derlių, labai svarbu auginti geriausias, pritaikytas vietai ir žemdirbystės sistemai veisles [37]. Šiuo magistriniu darbu siekiama ištirti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų įtaką sėjamųjų grikių žolės ir žiedų kaupiamų fenolinių junginių kiekui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Ištirti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų įtaką skirtingų sėjamųjų grikių veislių žolės ir žiedų kaupiamų fenolinių junginių kiekui.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti Lietuvoje auginamų skirtingų grikių veislių flavonoidų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodu.
2. Ištirti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų įtaką sėjamųjų grikių žolės ir žiedų kaupiamų rutino ir kvercitrino kiekiui.
3. Palyginti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemose augintų skirtingų veislių grikių žolėje ir žieduose nustatyto rutino kiekio kitimą.
4. Palyginti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemose augintų skirtingų veislių grikių žolėje ir žieduose nustatyto kvercitrino kiekio kitimą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1. 1. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench)
Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum) priklauso grikių (Fagopyrum Mill) genčiai, rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. Grikių gentį sudaro 19 skirtingų grikių rūšių, kurios skirstomos į dvi grupes: vienmečiai: Fagopyrum esculentum Moench ir Fagopyrum tataricum L. bei daugiamečiai:
Fagopyrum cymosum Meissn ir Fagopyrum suffruticosum Fr. Schmidt. Agrokultūriniu būdu auginamos
tik dvi grikių rūšys: Fagopyrum esculentum (1 pav.) ir Fagopyrum tataricum, o likusios yra kaip laukinės floros dalis [12].
1 pav. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) [40]
1.1.1. Augalo morfologinis aprašymas
Sėjamasis grikis- vienmetis, 15 - 70 cm aukščio žolinis augalas. Šaknis liemeninė. Stiebas stačias, mažai šakotas, plikas, vagotas, rausvas, vaisiams bręstant - raudonas, tuščiaviduris, žemiau bamblių šiek tiek plaukuotas. Lapai širdiškai trikampiški arba širdiškai strėliški, beveik penkiakampiai, nusmailėjusiomis viršūnėmis, apatiniai lapai - ilgakočiai, viršutiniai - bekočiai. Žiedai kekėse, stiebo viršūnėse kekės skėtiškos.Fiziologiškai grikių žydėjimas ir grūdų formavimasis vyksta vienu metu (nuo birželio pabaigos iki rugsėjo vidurio), o intensyviausiai grikiai žydi ir užmezga grūdus pirmoje jų
žydėjimo laikotarpio pusėje (liepos mėnesį). Užsimezgę grikių grūdai pradeda bręsti po mėnesio nuo žydėjimo pradžios, todėl derliaus formavimuisi yra svarbūs liepa ir rugpjūtis. Nepalankios šiuo laikotarpiu sąlygos nulemia labai mažą grikių derlių. Žydėjimo ir grūdų mezgimo tarpsniais grikiai labai jautrūs aukštai temperatūrai ir sausrai. Apyžiedis rožinis arba baltas, jo lapeliai kiaušiniški, 3 - 4 mm ilgio. Žydi birželio – rugpjūčio mėnesiais. Vaisiai (grūdai) rudi, 6 -7 mm ilgio, matiniai, tribriauniai, su lygiomis aštriomis briaunomis ir smailiais galais, bręsta pamažu [13, 33, 35].
1.1.2. Augalo paplitimas ir auginimas
Kilęs iš Centrinės Azijos. Paplitęs Europoje, Rusijoje, netropikinėje Azijoje, Šiaurės Amerikoje [50]. Sėjamuosius grikius pirmieji pradėjo auginti rytų Azijos stepių gyventojai [42]. Iš ten X a. grikiai išplito po Kiniją, viduramžių pabaigoje pradėti auginti Rytų Europoje, o dar vėliau Vidurio ir Vakarų Europoje. Auginamas rytinėje ir pietrytinėje Lietuvos dalyje, kituose regionuose retas. Lietuvoje Fagopyrum Mill. genties auginami 2 rūšių augalai: sėjamasis (Fagopyrum esculentum Moench) ir totorinis (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) grikiai [2].
Lietuvoje auginamas sausuose smėlio dirvožemiuose, laukuose. Kartais kaip piktžolė pasitaiko pelkėse, dykvietėse, ant geležinkelio pylimų. Grikius auginti tinka atviros, saulėtos vietos ir lengvesnės dirvos. Auga rūgščiuose priesmėliuose, nusausintuose durpynuose, nelabai laidžiose žemėse. Nemėgsta kalkingų, drėgnų dirvų. Vegetacijos pradžioje ir žydėjimo metu grikiams reikia šilumos. Sėjama po šalnų- birželio mėnesį, sydygsta per 10-13 dienų, žydi 4-6 savaites [4, 6].
1.1.3. Augalinė žaliava, jos paruošimas, laikymas ir panaudojimas
Kaip žaliava naudojama grikių žolė (Fagopyri herba). Žaliava ruošiama žydėjimo metu - birželio- rugpjūčio mėnesiais. Nupjautos 35-40 cm žydinčios augalų viršūnės džiovinamos pavėsyje gerai vėdinamoje patalpoje arba džiovyklėje esant 35- 40 °C temperatūrai. Išdžiovinta žaliava vartojimui tinkama 2 metus, jei yra laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje [33].
Grikius galima auginti kaip tarpinius ar pasėlinius augalus, žalia mase šerti galvijus, gaminti silosą ar šienainį. Taip pat grikius galima, ypač auginant kartu su lubinais, naudoti kaip žaliąją trąšą. Gydymui vartojami grikių žiedai, lapai ir kruopos. Iš grikių lapų išskirtas rutinas veikia kaip vitaminas P. Jis vartojamas su askorbo rūgštimi kraujagyslių sienelėms stiprinti, taip pat sergant kai kuriomis
infekcinėmis ligomis, reumatu, gastritu. Grikių žolės užpilu gydo kosulį, reumatą, aterosklerozę, hipertoninę ligą, mažakraujystę [26].
1.1.4. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) cheminė sudėtis
Sėjamieji grikiai plačiai vartojami medicinoje dėl kaupiamų biologiškai aktyvių medžiagų gausos. Sėjamųjų grikių cheminė sudėtis, skirtingose augalo dalyse (žolėje, lapuose, žieduose, stiebuose, sėklose) yra skirtinga. Cheminės sudėties skirtumus augalo dalyse lemia auginimo sąlygos, veislė, žaliavos rinkimo laikotarpis bei kiti veiksniai [21].
Grikių sėklos dažniausiai ir labiausiai tiriama bei vartojama sėjamųjų grikių dalis. Juose daugiausia randama krakmolo (50 – 67 proc. arba nuo 650 iki 750 mg/g), riebalų (1,8—3,1 proc. arba nuo 20 iki 25 mg/g), kuriuose svarbiausios šios riebalų rūgštys: oleino, linolio, palmitino, stearino, arachidino. Taip pat grikių sėkluose yra ląstelienos (1,2—2,2 proc.), lengvai pasisavinamų baltymų (11,7-18,9 proc. arba nuo 100 iki 125 mg/g): lizino, histidino, arginino, asparto rūgšties, treonino, serino, glutamo rūgšties, prolino, glicino, alanine, cistino, valino, metionino, izoleucino, leucino, tirozino [45], B grupės vitaminų- B1, B2, B3, B5, B6, vitamino E [20], mineralinių medžiagų (nuo 20 iki 25 mg/g). Iš mineralinių medžiagų grikiuose randama geležies, kalcio, vario, cinko, kobalto, fosforo, jodo. Be visų anksčiau išvardintų medžiagų grikių sėklose randama ir flavoniodų (rutino, orientino, viteksino, myricetino, kvercetino, izoviteksino ir izoorientino)- apie 10mg/g [26, 39] bei nedideli kiekiai katechino, (-) epikatechino [9] ir fagopirinų [11].
Grikių lapuose ir žieduose daugiausia randama rutino (80- 90 proc.). Jo kiekis jaunuose lapuose yra didesnis lyginant su senesniais lapais. Taip pat grikių lapuose randama tokių flavonoidų kaip hiperozido, chlorogeno, neochlorogeno, kavos, galo rūgšties [3, 39].
1.1.5. Sėjamųjų grikių kaupiami flavonoidai ir jų nauda žmogaus organizmui
Flavonoidai yra polifenoliniai, mažos molekulinės masės junginiai, randami beveik visuose žaliuose augaluose. Jų randama vaisiuose, daržovėse, riešutuose, sėklose. Gelėse esantys flavonoidai suteikia joms spalvą, saugo nuo grybelinių ligų sukėlėjų, dalyvauja augalo vystymosi ir augimo procese, fotosintezės reakcijose. Flavonoidų kiekį vaistinėje žaliavoje ir kaupimąsi atskiruose augalo dalyse lemia vidiniai ir
išoriniai veiksniai, aplinkos ir genetiniai faktoriai, tokie kaip augimvietė, gamtinės sąlygos ar sezoniškumas.
Tyrimais nustatyta, kad flavonoidai yra stiprūs antioksidantai, apsaugantys audinius nuo smarkių pažeidimų, kurie gali neigiamai paveikti įvairias psichines funkcijas, įskaitant atmintį ir koncentraciją. Mokslinės literatūros duomenimis, flavonoidai pasižymi priešuždegiminiu, priešvėžiniu, antivirusiniu poveikiu. Dauguma flavonoidų veikia panašiai kaip ir kai kurie vitaminai, malšina spazmus, slopina virusų dauginimimąsi, stabdo kraujavimą, skatina tulžies bei šlapimo išsiskyrimą [14, 17, 24, 31].
1.1.5.1. Rutino struktūra ir nauda žmogaus organizmui
2 pav. Rutino struktūrinė formulė [38]
Rutinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-3-[α-L-ramnopuranozil-(1→6)-β-Dgliukopiranoziloksi]-4H-chromen-4-onas) yra flavonoido kvercetino glikozidas (2 pav.). Tai dominuojantis flavonoidas sėjamųjų grikių lapuose ir žieduose. Rutinas slopina aldozės reduktazės aktyvumą. Aldozės reduktazė yra fermentas, kuris gliukozę verčia į sorbitolį. Šio fermento slopinimas gali padėti išvengti kai kurių diabeto komplikacijų, tokių kaip katarakta, retinopatija, nefropatija bei neuropatija. Grikiuose esantis rutinas, mažina gliukozės koncentraciją kraujyje, veikia kaip antioksidantas, apsaugantis organizmą nuo uždegimo ir krešulių formavimosi [23]. Iš rutino gaunamas hidroksietilrutozidas dažnai vartojamas esant hemorojui. Rutinas organizme stiprina kaulus, dantis, kraujagysles, gali būti naudingas esant padidėjusiam AKS ir kraujagyslių pralaidumui [47]. Grikio augalinėse žaliavose esantis rutinas, dar žinomas kaip vitaminas P, pasižymi kraujagyslių trapumą mažinančiu ir kapiliarų sieneles stiprinančiu, priešuždegiminiu, antioksidaciniu poveikiu. Dėl šių savybių jis yra naudojamas lėtinio venų nepakankamumo metu [3, 16, 43, 46]. Atlikti klinikiniai tyrimai su jūrų kiaulytėmis rodo, kad rutinas slopina histamino atpalaidavimą, todėl gali būti naudojamas astmos gydymui [30].
1.1.5.2. Kvercitrino struktūra ir nauda žmogaus organizmui
3 pav. Kvercitrino struktūrinė formulė [25]
Kvercitrinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-3-[[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihidroksi-6- metil-2-tetrahidropiranil]-oksi]-4-chromenonas) yra flavonoido kvercetino glikozidas (3 pav.). Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad kvercitrinas veikia priešuždegimiškai, mažina diarėją, pasižymi antioksidaciniu, lipidų peroksidaciją slopinančiu poveikiu bei atitolina kataraktos formavimąsi [47]. Kvercitrinas, kaip ir rutinas, slopina fermentą aldozės reduktazę, taip neleisdamas pakisti osmosiniam slėgiui akyse.
1.2. Sėjamųjų grikių žaliavoje esančių fenolinių junginių analizės metodai
Fenolinių junginių analizei gali būti taikomi įvairūs analitiniai metodai. Kokybiniam flavonoidų nustatymui naudojama IR ir UV spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija su UV ir diodų matricos detektoriais, masių spektrometrais, dujų chromatografija su masių spektrometrais detektoriais bei kiti rečiau naudojami metodai, pvz.: rezonansinė Ramano spektroskopija [8, 10]. Kiekybiniam flavonoidų įvertinimui dažniausiai yra naudojama spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, skysčių chromatografija, dujų chromatografija [18] rečiau- kapiliarinė elektroforezė. Visi kiekybinio nustatytmo metodai pagrįsti flavonoidų fizikinėmis- cheminėmis savybėmis [19]. Moksliniuose šaltiniuose nurodoma, kad flavonoidų analizei augaliniuose ekstraktuose reikalingi efektyvūs, jautrūs ir atrankūs metodai, kurie pateikia
duomenis ne tik apie žaliavos kokybę bet ir apie kiekybinę sudėtį, todėl toliau trumpai apžvelgsime dažniausiai taikomus metodus flavonoidų kokybinėje ir kiekybinėje analizėje.
1.2.1. Spektrofotometrija
Spektrofotometrinis metodas taikomas įvairios sudėties medžiagų analizei. Metodas yra pagrįstas flavonoidų savybe sugerti šviesą UV – spektro dalyje. Absorbcijos dydis matuojamas trumpabangėje ar ilgabangėje spektro dalyje, kurios būdingos daugeliui flavonoidų. Fenolinių junginių identifikavimas paremtas fenolinės grupės dalyvavimu oksidacijos – redukcijos reakcijoje, jei tos pačios reakcijos metu yra oksiduojama fenolinė grupė ir redukuojamas reagentas, tuomet yra galimas kiekybinis nustatymas. UV spektrofotometrija dažnai taikoma bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti. Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį dažniausiai yra naudojamas Folin-Ciocalteau reagentas ir reakcija su juo [5, 29]. Flavonoidų kiekio įvertinimas tiriamojoje žaliavoje spektrofotometriniu metodu nėra efektyvus ir ne visuomet tiksliai atspindi žaliavos cheminę sudėtį, todėl vis rečiau taikomas laboratorinėje praktikoje.
1.2.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) tiksliausias ir dažniausiai naudojamas metodas tiek kokybiniam tiek kiekybiniam flavonoidų įvertinimui. Tyrimams dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija, normalių fazių chromatografija taikoma retai ir tik silpnai poliniams aglikonams atskirti. ESC yra informatyvesnis, jautresnis metodas nei spektrofotometrija ir jautresnis nei KE. Šis metodas tinka nelakiems ar termolabiliems dariniams atskirti, galima tirti tokias medžiagas kaip aminorūgštys, baltymai, angliavandeniai, nukleorūgštys, vaistai, terpenoidai, steroidai, antibiotikai, pesticidai, metalo organiniai dariniai, įvairūs neorganiniai junginiai. Metodą lengva pritaikyti tiksliai kiekybinei sudėčiai nustatyti,
tačiau metodas turi ir trūkumų: ilgas analizės laikas, maža skiriamoji geba, brangi įranga. Atliekant sėjamųjų grikių žaliavoje esančių fenolinių junginių analizę, ESC yra dažniausiai taikomas metodas dėl universalumo, atrankumo, paprastumo ir plačių sudėtingų mišinių skirstymo galimybių [5, 44].
1.2.3. Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija naudojama organinių ir bioorganinių junginių atskyrimui, identifikavimui, jų valymui po ekstrakcijos iš vaistinių preparatų, biologinių skysčių bei kitų įvairių medžiagų. PC yra paprastas, patikimas, selektyvus, tikslus, lengvai atliekamas, pigus bei plačiai pritaikomas metodas fenolinių junginių nustatymui augalinėse žaliavose. Metodas naudojamas, kai: tiriamosios medžiagos yra neklampios arba labai mažai klampios; medžiagos stipriai polinės, vidutiniškai polinės, nepolinės arba joninės; didelis kiekis tiriamųjų junginių turi būti analizuojami greitai, turint mažas finansavimo galimybes ir ribotą laiko limitą; medžiagos, kurios negali būti aptinkamos skysčių ar dujų chromatografijos metodais. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai, lyginant su dujų ir skysčių chromatografija yra tai, kad tyrimams atlikti nereikalinga brangi įranga, galima naudoti labai įvairias tirpiklių sistemas bei sorbentus, tiriama medžiaga lieka ant chromatografinės plokštelės, nesuskyla dėl temperatūros poveikio, nes kaitinimas chromatografavimo metu nėra atliekamas [5, 22, 44].
1.3. Ekologinės žemdirbystės samprata ir principai
Per keletą pastarųjų metų ekologinio ūkininkavimo augimą visoje Europoje paspartino didėjantis vartotojų rūpinimasis savo sveikata ir siekis valgyti sveiką maistą. Neatsižvelgiant į tai, kad ekologiški produktai yra brangesni, pastaruoju metu vis daugiau vartotojų yra pasirengę sumokėti didesnę kainą, kad būtų garantuoti dėl produktų kokybės ir saugumo. Anksčiau ekologiškų produktų būdavo sunku gauti – jie buvo parduodami specializuotose parduotuvėse ar vietiniuose turguose. Dabar ekologiškų produktų galima pamatyti beveik visų prekybos centrų lentynose visoje Europoje [27].
Ekologinis ūkininkavimas – tausojančiosios ūkininkavimo sistemos dalis ir gyvybinga alternatyva tradiciniam ūkininkavimui. Tai subalansuotoji tausomoji arba organinė ekologinė žemdirbystės sistema, kai siekiama sumažinti aplinkos taršą iš dalies ar visiškai atsisakant mineralinių trąšų ir pesticidų, organinių trašų bei biologinių priemonių kovos su piktžolėmis, ligomis ir kenkėjais naudojimo. Ekologinės žemdirbystės viena iš svarbiausių užduočių yra gaminti aukštos kokybės maisto produktus ir taip prisidėti prie profilaktinės sveikatos priežiūros ir gerovės. Dėl šių priežačių ekologinio ūkininkavimo metu turi būti vengiama pesticidų, maisto priedų ir trąšų naudojimo. Laikantis būtinų produkcijos kokybės standartų, gaunamas mažesnis pirminės produkcijos kiekis, palyginti su tradiciniu ūkininkavimu, bet išauga ekologiškos produkcijos gamybos kaštai. Ekologinis ūkininkavimas apima visas
žemės ūkio sistemas. Ekologiniu būdu gali būti auginami ne tik grūdai, vaisiai bei daržovės, kopiamas medus, bet ir galvijai, paukščiai. Šioje sistemoje produktyvumo pagrindu imamas dirvožemio gyvybingumas, augalų bei gyvūnų genetinis paveldimumas [27, 28].
1.4. Intensyviosios žemdirbystės samprata ir principai
Intensyvi žemdirbystės sistema yra labiau orientuojama į augalų derlingumą, mažiau – į dirvožemio produktyvumo ir aplinkos išsaugojimą. Vienas nepageidaujamų reiškinių, kurį sukelia intensyvios žemdirbystės technologijų taikymas – dirvožemio organinės medžiagos mažėjimas (kai į dirvožemį patenka mažesnis organinių medžiagų kiekis nei suyra). Taip ūkininkaujant ilgesnį laiką ir siekiant išlaikyti didesnio derlingumo pasėlius, tenka didinti mineralinių trąšų (ypač azoto) ir pesticidų naudojimą. Intensyviosios žemdirbystės ūkiuose plačiai naudojamos ir sintetinės trąšos, kurios efektyviai didina derlių, tačiau mažina kalcio, magnio, mangano koncentraciją dirvožemyje, didina azoto nuostolius. Intensyvus ūkininkavimas neigiamai veikia dirvožemio mikroflorą, kvėpavimą, fermentų aktyvumą, florą ir fauną. [1].
Vis didėjantį ūkininkų siekį grįžti iš ekologinės žemdirbystės į intensyvę lemia sunkesnės nei tikėtasi ekologinės gamybos sąlygos, silpnas teorinis ir praktinis pasirengimas, perėjus į ekologinį ūkininkavimą dėl maisto medžiagų trūkumo augalai patyria stresą, sumažėja jų derlius.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Cheminės sudėties tyrimams naudoti intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis auginti sėjamųjų grikių žiedai ir žolė (antžeminė biomasė). Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimams panaudoti 'VB Vokiai', 'VB Nojai', 'Kora' ir 'Panda' veislių grikių ėminiai, užauginti 2014 m. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filiale. Sėjamųjų grikių fenoliniai junginiai buvo ištirti šiuose kolekciniuose pavyzdžiuose: intensyviosios žemdirbytės- 331, 332, 333, 334, 346, 347, 348, 349; ekologinės žemdirbystės- 271, 272, 273, 274, 286, 287, 288, 289. Tyrimui imti 2014 metų liepos mėnesį surinkti mėginiai.
Veislės 'VB Vokiai' augalai yra determinantinio tipo, žemi ir mažai šakoti, kompaktiškos formos. Ši veislė pasižymi ankstyvumu, gausiai žydi liepos mėnesį, mažiau- rugpjūtį. Tokiu būdu pagerėja jau esančių grūdų aprūpinimas maistingomis medžiagomi. Dėl to šios veislės grūdai net ir nepalankiais metais (pasižyminčiais didelėmis klimato anomalijomis) užauga stambūs, dažnai net stambesni negu palankiais [36, 41].
Sėjamųjų grikių veislė 'Kora' sukurta Lenkijoje. Veislė vidutinio ankstyvumo, vegetacijos periodo vidutinė trukmė- 87 dienos (skaičiuojant nuo sėklų sudygimo iki visiškos brandos).Vidutinis derlingumas ir anktstyvumas yra didesnis negu standartinės veislės 'VB Vokiai', tačiau grūdai smulkesni. Laboratorijoje įvertimus veislės išaugintų grikių kokybę, juose buvo nustatyta 11,7 proc. baltymų, 57,2 proc. krakmolo, o luokštuotumas- 22,9 proc. [41].
'Panda' sėjamųjų grikių veislė sukurta Lenkijoje. Veislė vidutinio ankstyvumo. Vidutinis veislės derlingumas yra didesnis negu standartinės veislės 'VB Vokiai', tačiau grūdai smulkesni. Laboratorijoje įvertinus veislės išaugintų grikių kokybę, juose buvo nustatyta 11,9 proc. baltymų, 57,2 proc. krakmolo, o luokštuotumas- 22,4 proc. [41].
Mokslinėje literatūroje pateikiama labai mažai duomenų apie 'VB Nojai' sėjamųjų grikių veislę. Literatūroje nurodoma, kad 'VB Nojai' sėjamųjų grikių veislė yra sukurta Lietuvos selekcininkų, tačiau išsamesnio veislės aprašymo nepateikiama.
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Medžiagos ir reagentai
Visi naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai buvo analitinio švarumo. Skruzdžių (98 %) rūgštis, acto rūgštis, etilacetatas ir metanolis (> 99,9 %) gauti iš Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija). Analizėje naudoti rutino (97,11 %) ir kvercitrino (98 %) standartai gauti iš HWI ANALYTIK GMBH (Steinheim,Vokietija). 2-aminoetildifenilborinatas (≥ 97 %) gautas iš Fluka analytical (Schnelldorf, Vokietija). Polietileno glikolis 400 gautas iš Fluka BioChemika (Bornem, Belgija). Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩ/cm), ruošta „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
2.2.2. Naudota aparatūra
Sėjamųjų grikių žolė ir žiedai sumalti naudojant elektrinį malūną Retsch 200 (Haan, Vokietija). Mėginių svėrimas atliktas analitinėmis svarstyklėmis Shimadzu Auw 120 D (Bellingen, Vokietija). Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Wertheim, Vokietija). Ekstraktų centrifugavimas atliktas naudojant Hermle Z206A centrifugą („Denville Scientific Inc“, JAV). Chromatografinėje analizėje naudotos 10 cm aukščio ir 10 cm pločio HPTLC (silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) stiklo plokštelės. Tiriamieji mėginiai ant plokštelės užnešti pusiau automatiniu
mėginių ėmikliu Camag Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija). Plokštelės džiovintos ant kaitlentės CAMAG TLC Plate heater III (Camag, Muttenz, Šveicarija), plokštelių fotovizualizacija atlikta naudojant CAMAG TLC Visualizer prietaisą (Camag, Muttenz, Šveicarija).
2.2.3. Tiriamojo mėginio paruošimas
Flavonoidų ekstrakcija iš sėjamųjų grikių žolės ir žiedų atlikta remiantis Žvikas ir kt. [51] mokslinėje literatūroje pateikta metodika. Atsveriama 0,1 g (tikslus svėrinys) išdžiovinto ir susmulkinto pavyzdžio, užpilama 10 ml 60 proc. (V/V) etanoliu ir ekstrahuojama 15 min. 45 °C temperatūroje ultragarsinėje vonelėje sandariai uždarytuose stikliniuose buteliukuose. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 10 min 6000 rpm. Supernatantas nupilamas nuo nuosėdų. Gautas ekstraktas per popierinį filtrą filtruojamas į 20 ml matavimo kolbutę. Nuosėdos, esančios ant filtro du kartus
praplaunamas po 5 ml 60 proc. (v/v) etanoliu. Tirpalas praskiedžiamas 60 proc. (V/V) etanoliu iki žymės. Prieš PC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus („Carl Roth GmbH“, Vokietija).
2.2.4. Flavonoidų kiekybinis ir kokybinis nustatymas aukšto efektyvumo
plonasluoksnės chromatografijos metodu
Flavonoidų nustatymas aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatgrafijos metodu sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose atliktas remiantis mokslinėje literatūroje pateikta Raina ir kiti [34] metodika. Chromatografija atlikta CAMAG Twin Trough Chamber 10 x 10 cm chromatografavimo kameroje. Naudotas tirpiklių sistemos tūris- 50 ml. Tirpiklių sistema sudaryta iš bevandenės skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vandens ir etilacetato (3,75: 3,75: 8,75: 33,75 V/V/V/V). Kameros prisotinimui tirpiklių sistemos garais ir garų koncentracijos vienodumo užtikrinimui naudotas filtrinio popieriaus lakštas. Mėginiai užnešti ant silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją
Camag Linomat 5 su 100µl tūrio mikrošvirktu, plokštelėje paliekančiu brūkšnio pavidalo dėmę. Po
chromatografavimo plokštelės kelias minutes džiovintos ant kaitlentės, esant 100-105 oC temperatūrai.
Dar karštos plokštelės apipurkštos 2-aminoetildifenilborinato tirpalu metanolyje (10 g/L) bei polietileno glikolio (PEG) 4000 tirpalu metanolyje (50 g/L). Po chromatografavimo išdžiovintos ir apipurkštos plokštelės apšviečiamos 366 nm šviesos bangos ilgio ultravioletine šviesa. Metodikos atrankumas pagrįstas lyginant analičių Rf reikšmių sutapimus su etaloninių junginių Rf reikšmėmis.
Pagrindinis parametras, kuriuo remaintis atliktas identifikuotų junginių kiekybinis įvertinimas, yra analitės smailės ploto priklausomybė nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale, todėl buvo sudaryti sėjamųjų grikių žolės ir žiedų ekstraktuose identifikuotų junginių kalibravimo grafikai. Rutino ir kvercitrino standartai buvo ištirpinti 10 ml 70 proc. etanolyje (V/V). Kalibracijos kreivių sudarymui, iš gautų etaloninių tirpalų skiedimo principu paruošti skirtingų koncentracijų tirpalai. Kalibracijų kreivės sudarytos kiekvienam standartui iš penkių taškų: pradinės koncentracijos bei standartų praskiestų du, keturis, aštuonis, šešiolika kartų.
Rutino koncentracijos ribos: 0,031 – 1,0 mg/ml; Kvercitrino koncentracijos ribos: 0,019 – 0,6 mg/ml;
2.3. Statistinis duomenų įvertinimas
Statistinis duomenų vertinimas atliktas panaudojant dispersinę analizę (ANOVA). Veiksnio įtakos dydis vertintas apskaičiuojant koeficiento Ƞ2 reikšmes. Visi eksperimentai kartoti tris kartus ir
duomenys išreikšti vidurkiais ± standartinė paklaida. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas jei p < 0,05. Duomenys apdoroti su Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV). Duomenų analizė atlikta statistiniu paketu „ SPSS 20” (SPSS Inc., Chicago, JAV).
3. REZULTATŲ APTARIMAS
3.1.
Flavonoidų
tapatybės
nustatymas
aukšto
efektyvumo
plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Skirtingų veislių sėjamųjų grikių cheminė sudėtis gali labai įvairuoti, todėl svarbu nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų veislių grikių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.
Atlikus 'VB Vokiai', 'VB Nojai', 'Kora' ir 'Panda' veislių grikių žolės ir žiedų etanolinių ekstraktų analizę aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodu, identifikuoti šie flavonoidai: rutinas ir kvercitrinas. Šie junginiai rasti visuose tirtuose ekstraktuose, tačiau jų kiekiai skirtinguose žemdirbystės sistemose ir veislėse reikšmingai skyrėsi. Išnagrinėjus gautus rezultatus, galima teigti, kad sėjamųjų grikių žolės ir žiedų ėminiuose vyrauja rutinas. Rutinas sudarė 70,193,2 proc. visų grikių žolės ėminiuose identifikuotų flavonoidų kiekio ir 60,482,7 proc. visų grikių žiedų ėminiuose identifikuotų fenolinių junginių kiekio.Gauti duomenys patvirtina literatūros šaltiniuose nurodytas rekomendacijas, kad sėjamųjų grikių vaistinę augalinę žaliavą rekomenduotina standartizuoti pagal rutino kiekį žaliavoje [23].
Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių etanolinių žolės ir žiedų ekstraktų chromatogramos pavyzdys pateikiamas 4 pav.
4 pav. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių etanolinių žolės ir žiedų ekstraktų chromatogramos pavyzdys Identifikuoti junginiai: 1- rutinas, 2- kvercitrinas. Sėjamųjų grikių
žolė: 271- VB Vokiai, 272- VB Nojai, 273- Kora, 274- Panda; Sėjamųjų grikių žiedai: 286- VB Vokiai, 287- VB Nojai, 288- Kora, 289- Panda.
Naudojant anksčiau aprašytą aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodiką, sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose esančių flavonoidų analizė kartota tris kartus. Gauti duomenys įvertinti statistiškai, apskaičiuojant aritmetinį gautų Rf reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį, standartinę paklaidą
(1 lentelė).
1 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš sėjamųjų grikių žolės ir žiedų etanolinių ekstraktų, Rf
reikšmių statistinis vertinimas
Tirpiklių sistema Tiriamasis junginys Rf reikšmių vidurkis Standartinis nuokrypis Santykinė paklaida
Bevandenė acto rūgštis: skruzdžių rūgštis: vanduo: etilacetatas (3,75: 3,75: 8,75: 33,75 V/V/V/V)
Rutinas 0,31 0,01 0,006
Kvercitrinas 0,69 0,01 0,004
Santykinė standartinė paklaida neviršijo leistinos 0,05 ribos, taikant šią tirpiklių sistemą pasiektas visiškas flavonoidų atskyrimas (vidutinių Rf reikšmių skirtumas tarp rutino ir kvercitrino –
0,38). Metodikos atrankumas pagrįstas lyginant analičių Rf reikšmių sutapimus su etaloninių junginių Rf
reikšmėmis. Atliekant glaudumo įvertinimą, nustatyti pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo įverčiai, kurie buvo išreikšti variacijos koeficientu. Rezultatų pakartojamumui įvertinti, tą pačią dieną buvo atliktos šešios to paties ekstrakto analizės. Pagal smailės plotą apskaičiuotas metodikos pakartojamumo variacijos koeficientas įvairavo nuo 3,12 proc. rutinui iki 3,52 proc. kvercitrinui. Rezultatų tarpinis preciziškumas apskaičiuotas iš per tris skirtingas dienas atliktų to paties ekstraktų analizių rezultatų, jo variacijos koeficientas kito nuo 5,45 proc. rutinu iki 7,76 proc. kvercitrinui.
Gauti rezultatai rodo, kad, naudojant šią metodiką, galima atlikti tolimesnius sėjamųjų grikių žolės ir žiedų etanolinių ekstraktų tyrimus.
3.2. Žemdirbystės sistemų ir veislės įtaka sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose
kaupiamių biologiškai aktyvių junginių kiekiui
Atlikus gautų duomenų dispersinę analizę, nustatyta, kad grikiuose identifikuotų veikliųjų junginių kiekiui (rutinui ir kvercitrinui) žolėje ir žieduose reikšmingos įtakos (p < 0,05) turėjo žemdirbystės sistema, veislė bei žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (2 lentelė).
2 lentelė. Žemdirbystės sistemos ir veislės įtaka rutino ir kvercitrino kiekiui grikių žolėje
Tiriamasis junginys
Žemdirbystės sistema Veislė Žemdirbystės sistema x
Veislė Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Rutinas 10,172 0,006 0,389 88,410 0,000 0,943 149,567 0,000 0,966 Kvercitrinas 1398,989 0,000 0,989 1335,822 0,000 0,996 660,779 0,000 0,992
Iš 2 lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad rutino kiekiui žolėje didžiausią, statistiškai reikšmingą įtaką turi žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (Ƞ2 = 0,966) bei veislė (Ƞ2 = 0,943), gerokai
mažesnę- žemdirbystės sistema (Ƞ2 = 0,389). Tuo tarpu kvercetino kiekiui žolėje didžiausią, statistiškai
reikšmingą įtaką turi veislė (Ƞ2 = 0,996) ir žemdirbystės sistema (Ƞ2 = 0,989), mažesnę- žemdirbystės
sistemos ir veislės sąveika (Ƞ2 = 0,992)
Kiek kitokie žemdirbystės sistemos ir veislės įtakos dėsningumai grikių žieduose. Rutino kiekiui žieduose didžiausią bei statistiškai reikšmingą įtaką turi veislė (Ƞ2 = 0,957) ir žemdirbystės sistema (Ƞ2 =
0,928), mažesnę - žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (Ƞ2 = 0,881), kvercetino kiekiui žieduose
didžiausią įtaką turi veislė (Ƞ2 = 0,994) ir žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (Ƞ2 = 0,989).
3 lentelė. Žemdirbystės sistemos ir veislės įtaka rutino ir kvercitrino kiekiui grikių žieduose
Tiriamasis junginys
Žemdirbystės sistema Veislė Žemdirbystės sistema x
Veislė Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Faktinis F kriterijus p Ƞ2 Rutinas 207,402 0,000 0,928 118,148 0,000 0,957 39,584 0,000 0,881 Kvercitrinas 28,873 0,000 0,643 852,536 0,000 0,994 460,038 0,000 0,989
Atlikus rutino ir kvercitrino kiekybinę analizę (žolėje ir žieduose) ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis augusių 4 skirtingų grikių veislių buvo nustatyta, kad yra sąveika tarp žemdirbystės sistemų ir veislių, todėl tikslinga rutino ir kvercitrino rezultatus aptarti atskirai.
3.2.1. Rutino kiekis sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose bei jį lemiantys veiksniai
3.2.1.1. Ekologinės žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka rutino
kiekiui žolėje ir žieduose
Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginta grikių žolė rutino sukaupė nuo 68,94 iki 75,51 mg/g. Daugiausia šio flavonoido rasta 'VB Nojai' veislės žolėje (75,51 mg/g), jis buvo 1,1 karto didesnis už mažiausią rutino kiekį (68,94 mg/g) nustatytą 'VB Vokiai' veislės grikių žolės ėminiuose. Sėjamųjų grikių žolės ėminiuose (augusios tiek ekologinės tiek intensyvios žemdirbystės sąlygomis) rutinas buvo dominuojantis komponentas. Mūsų tyrimų duomenis patvirtina ir kitų mokslininkų atlikti darbai [7]. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis augintoje grikių žolėje rutinas sudarė net 86,593,2 proc. visų grikių žolės ėminiuose identifikuotų flavonoidų veislės grikių žolėje sukaupiama statistiškai reikšmingai daugiau (p < 0,05) rutino nei 'Panda' > 'Kora' >'VB Vokiai' veislių grikių žolėje. (5 pav.)
.
5 pav. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukauptas rutino kiekis
Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikių žiedai rutino sukaupė nuo 58,82 iki 85,42 mg/g. Priešingai nei žolėje, daugiausia (85,42 mg/g) rutino rasta 'Panda' veislės žieduose, o mažiausiai (76,41 mg/g) kaip ir žolėje- 'VB Vokiai' veislės žieduose (6 pav.). 'Panda' veislės žieduose rutino kiekis buvo 1,1 karto didesnis už rutino kiekį nustatytą 'VB Vokiai' veislės grikių žiedų ėminiuose. Kaip ir ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis augintoje grikių žolėje, žieduose rutinas buvo vyraujantis komponentas ir sudarė didžiausią procentą (63,174,1 proc.) visų grikių žolės ėminiuose identifikuotų flavonoidų kiekio. Atlikus statistinę analizę, nutatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (pagal rutino kiekį) tarp visų grikių veislių žiedų ėminių, augintų ekologinės žemdirbystės sąlygomis (6 pav.).
64,00 66,00 68,00 70,00 72,00 74,00 76,00 78,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg/g
Ekologinė žemdirbystės sistema
grikių žolė
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg
/g
Ekologinė žemdirbystės sistema grikių žiedai
6 pav. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukauptas rutino kiekis
3.2.1.2. Intensyviosios žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka rutino
kiekiui žolėje ir žieduose
Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis auginta grikių žolė rutino sukaupė nuo 50,79 iki 86,99 mg/g, žiedai- nuo 76,41 iki 92,40 mg/g. Daugiausia rutino rasta 'Kora' veislės žolėje ir žieduose (atitinkamai 86, 99 mg/g ir 92,40 mg/g), mažiausiai- 'VB Nojai' veislės žolėje (50,79 mg/g) ir 'VB Vokiai' veislės žieduose (76,41 mg/g). Statistiškai reikšmingas skirtumas (pagal intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augintų grikių rutino kiekį žolėje) tarp 'Panda' ir 'Kora' bei tarp 'Panda' ir 'VB Vokiai' grikių veislių pavyzdžių nenustatytas, tačiau nustatyti statistiškai reikšmingi (p < 0,05) skirtumai palyginus 'VB Nojai' veislės žolėje esantį rutino kiekį su 'Panda', 'Kora' ir 'VB Vokiai' veislėse nustatytu rutino kiekiu (7 pav.).
7 pav. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukauptas rutino kiekis
Atlikus intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukaupto rutino kiekio statistinę analizę, rezultatai parodė, kad statistiškai reikšmingų skirtumų (p < 0,05) tarp
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg
/g
Intensyvi žemdirbystės sistema
grikių žolė
rutino kiekių 'Panda', 'Kora' ir 'VB Nojai' veislių pavyzdžiuose, nėra, skirtumai (pagal rutino kiekį žieduose) nustatyti tarp 'VB Vokiai' ir 'Kora' veislių pavyzdžių (8 pav.).
8 pav. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukauptas rutino kiekis
3.2.1.3. Rutino kiekybinės analizės rezultatų apibendrinimas
Visos veislės, išskyrus 'VB Nojai', augintos ekologinėmis žemdirbystės salygomis, rutino sėjamųjų grikių žolėje, sukaupė nuo 8,8 iki 16,6 mg/g mažiau nei augintos intensyviai (9 pav.). Tuo tarpu, ekologinėmis žemdirbystės salygomis augintos 'VB Nojai', 'Kora' ir 'VB Vokiai' veislės, grikių žieduose rutino sukaupė nuo 10,5 iki 20,8 mg/g mažiau nei augintos intensyviai (10 pav.).
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg
/g
Intensyvioji žemdirbystės sistema
grikių žiedai
9 pav. Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukaupto rutino kiekio palyginimas
10 pav. Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukaupto rutino kiekio palyginimas
Atsižvelgus į gautus tyrimo rezultatus, galima teigti, kad rutino kiekiui grikių žolėje didžiausią įtaką daro žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika, o žieduose- veislė. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikiai daugiausia rutino sukaupė 'VB Nojai' veislės žolėje ir 'Panda' veislės žieduose, tuo tarpu intensyviosios žemdirbystės sąlygomis- daugiausia 'Kora' veislės žolėje ir žieduose. Todėl rekomenduotina ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti bei rinkti 'Panda' veislės žiedus ir 'VB
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg/g
Grikių žolė
Ekologinė Intensyvi 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg/g
Grikių žiedai
Nojai' veislės žolę, o intensyviosios žemdirbystės sąlygomis rekomenduotina auginti bei rinkti 'Kora' veislės žolę ir žiedus.
3.2.2. Kvercitrino kiekis sėjamųjų grikių žolėje ir žieduose bei jį lemiantys veiksniai
3.2.2.1. Ekologinės žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka kvercitrino
kiekiui žolėje ir žieduose
Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis augintoje grikių žolėje kvercitrinas sudarė tik 6,813,5 proc. visų grikių žolės ėminiuose identifikuotų flavonoidų kiekio, o žieduose- 25,9- 36,9 proc. visų grikių žolės ėminiuose identifikuotų flavonoidų kiekio. Sėjamųjų grikių žieduose kvercitrino buvo nuo 2,7 iki 3,8 karto daugiau žiedų ėminiuose nei žolės ėminiuose. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės ėminiuose kvercitrino kiekis kito nuo 5,15 iki 11,81 mg/g. Didžiausias šio junginio kiekis (11,81 mg/g) nustatytas 'VB Nojai' veislės grikių žolės ėminiuose, mažiausias -'VB Vokiai' (5,16 mg/g) ir 'Kora' (5,15 mg/g) veislės ėminiuose (11. Pav.). Atlikus gautų duomenų statistinę analizę, nustatyta, kad grikių žolės ėminiuose kevrcitrino kiekių skirtumai tarp 'VB Nojai' ir 'Panda' bei 'VB Vokiai' ir 'Kora' veislių ėminių nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).
11 pav. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukauptas kvercitrino kiekis 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
K
iekis, mg/g
Ekologinė žemdirbystės sistema
grikių žolė
Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų ėminiuose kvercitrino kiekis svyravo nuo 20,52 mg/g iki 38,35 mg/g. Didžiausias šio junginio kiekis (38,35 mg/g) nustatytas 'VB Nojai' veislės grikių žiedų ėminiuose, mažiausias -'VB Vokiai' (20,52 mg/g) veislės ėminiuose (12 pav.). Kvercitrino kiekis skirtingų grikių veislių žieduose, augintuose ekologinės žemdirbystės sąlygomis, pasiskirsto sekančiai: 'VB Nojai' > 'Panda' = 'Kora' > 'VB Vokiai'. Nustatyta, kad 'VB Nojai' veislės grikių žieduose sukaupiama statistiškai reikšmingai daugiau (p < 0,05) kvercitrino nei 'VB Vokiai', statistiškai reikšmingo skirtumo (pagal kvercitrino kiekį žieduose) tarp 'Panda' ir 'Kora' grikių veislių nenustatyta.
12 pav. Ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukauptas kvercitrino kiekis
3.2.2.2. Intensyviosios žemdirbystės sistemos ir skirtingų grikių veislių įtaka
kvercitrino kiekiui žolėje ir žieduose
Atlikus intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žieduose
sukaupto kvercitrino kiekio statistinę analizę, nustatytas statiskiškai patikimas skirtumas (p < 0,05) tarp kvercitrino kiekių, 'Panda', 'Kora', 'VB Nojai' 'VB Vokiai' veislių pavyzdžiuose. Daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' veislės žolėje, mažiausiai- 'Panda' veislės žolėje (13 pav.). Analogiški dėsningumai0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiek
is
, mg
/g
Ekologinė žemdirbystės sistema
grikių žiedai
nustatyti ir tomis pačiomis sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų ėminiuose. Kaip ir žolėje, sėjamųjų grikių žieduose daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' veislės žieduose, mažiausiai- 'Panda' veislės žieduose (14 pav.), bei taip pat nustatytas statiskiškai patikimas skirtumas (p < 0,05) tarp kvercitrino kiekių, 'Panda', 'Kora', 'VB Nojai' 'VB Vokiai' veislių pavyzdžiuose
13 pav. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukauptas kvercitrino kiekis
14 pav. Intensyviosio žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukauptas kvercitrino kiekis 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
K
iekis, mg/g
Intensyvioji žemdirbystės sistema
grikių žolė
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg
/g
Intensyvioji žemdirbystės sistema
grikių žiedai
3.2.2.3. Kvercitrino kiekybinės analizės rezultatų apibendrinimas
'VB Nojai' 'Kora' ir 'VB Vokiai' grikių veislės, išskyrus 'Panda', augintos ekologinėmis žemdirbystės salygomis, kvercitrino sėjamųjų grikių žolėje sukaupė nuo 3,5 iki 9,9 mg/g mažiau nei augintos intensyviai. (15 pav.). Tuo tarpu, ekologinėmis žemdirbystės salygomis augintos 'VB Nojai' ir 'VB Vokiai' veislės, grikių žieduose kvercitrino sukaupė 18,3 ir 8,5 mg/g mažiau nei augintos intensyviai (16 pav.), o 'Kora' ir 'Panda' grikių veislės kvercitrino žieduose sukaupė daugiau augdamos ekologinės žemdirbystės sąlygomis.
15 pav. Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukaupto kvercitrino kiekio palyginimas
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiekis, mg /g
Grikių žolė
Ekologinė Intensyvi 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00'VB Vokiai' 'VB Nojai' 'Kora' 'Panda'
Kiek
is, mg/g
Grikių žiedai
16 pav. Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų sukaupto kvercitrino kiekio palyginimas
Mūsų tyrimų duomenimis, kvercitrino kiekiui žolėje ir žieduose didžiausią, statistiškai reikšmingą įtaką turi veislė. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis augintoje grikių žolėje didžiausias kvercitrino kiekis nustatytas 'VB Nojai' veislės grikių žolės ėminiuose, mažiausias -'VB Vokiai' ir 'Kora' veislės ėminiuose. Didžiausias šio junginio kiekis, kaip ir žolėje, nustatytas 'VB Nojai' veislės grikių žiedų ėminiuose, mažiausias - 'VB Vokiai' veislės žiedų ėminiuose. Atlikus intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žolės sukaupto kvercitrino kiekio analizę, daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' veislės žolėje, mažiausiai- 'Panda' veislės žolėje. Analogiški dėsningumai nustatyti ir tomis pačiomis sąlygomis augusių skirtingų grikių veislių žiedų ėminiuose. Kaip ir žolėje, sėjamųjų grikių žieduose daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' , mažiausiai- 'Panda' veislės žieduose. Atsižvelgus į gautus tyrimų rezultatus, rekomenduotina ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti bei rinkti 'VB Nojai' veislės žolę ir žiedus, analogiškai intensyviosios žemdirbystės sąlygomis rekomenduotina auginti bei rinkti 'VB Nojai' veislės žolę ir žiedus.
IŠVADOS
1. Pritaikius aukšto efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos metodą, atlikti Lietuvoje auginamų skirtingų grikių veislių flavonoidų (rutino ir kvercitrino) kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimo tyrimai.
2. Nustatyta, kad rutino ir kvercitrino kiekį sėjamojo grikio žolėje ir žieduose lemia žemdirbystės sistema, veislė bei žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika (p < 0,05). Trijų veiksnių dispersinės analizės rezultatai rodo, kad lyginant visas tirtas įtakas, rutino kiekiui žolėje didžiausią įtaką daro žemdirbystės sistemos ir veislės sąveika, žieduose- veislė. Kvercetino kiekiui žolėje ir žieduose didžiausią įtaką daro veislė.
3. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikiai daugiausia rutino sukaupė 'VB Nojai' (75,51 mg/g) veislės žolėje ir 'Panda' (85,42 mg/g) veislės žieduose. Intensyviosios žemdirbystės sąlygomis- daugiausia 'Kora' veislės žolėje (86,99 mg/g) ir žieduose (92,40 mg/g).
4. Ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti grikiai daugiausia kvercitrino sukaupė 'VB Nojai' veislės grikių žolės (11,81 mg/g) ir žiedų (38,35 mg/g) ėminiuose. Tokie patys dėsningumai (pagal sukauptą kvercitrino kiekį) nustatyti ir intensyviosios žemdirbystės sąlygomis augusių grikių žolės ir žiedų ėminiuose: daugiausia kvercitrino rasta 'VB Nojai' sėjamųjų grikių žolėje (21,67 mg/g) ir žieduose (56,69 mg/g).
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atsižvelgus į gautus tyrimo rezultatus, Fagopyrum esculentum Moench žolės ir žiedų augalinę žaliavą rekomenduotina standartizuoti pagal rutino kiekį žaliavoje. Sėjamųjų grikių standartizacijai (pagal rutino kiekį) rekomenduotina ekologinėmis žemdirbystės sąlygomis auginti bei rinkti 'Panda' veislės žiedus ir 'VB Nojai' veislės žolę, o intensyviosios žemdirbystės sąlygomis rekomenduotina auginti bei rinkti 'Kora' veislės žolę ir žiedus.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Arlauskienė A., Maikštėnienė S. Dirvožemio organinės anglies pokyčiai šiaurės Lietuvoje intensyviose žemdirbystės sistemose. Ekonomika ir vadyba: aktualijos ir perspektyvos 2009; 3(16): 132-138.
2. Batulevičiūtė L.Grikininkystės raida ir perspektyvos Pietryčių Lietuvoje. LŽŪU mokslo darbai. 2006; 73(26): 26-34.
3. Baumgertel A., Grimm R., Eisenbeiß W., Kreis W. Purification and characterization of a flavonol 3-O-β-heterodisaccharidase from the dried herb of Fagopyrum esculentum Moench.
Phytochemistry 2003; 64(2): 411-418.
4. Björkman T. Buckwheat production guide for the northeast. Cornell Cooperative Extension [interaktyvus]. 2009, spalis [žiūrėta 2015-12-12]. Prieiga per internetą: http://www.hort.cornell.edu/bjorkman/lab/buck/guide/main.php.
5. Bloor S. J. Overview of methods for analysis and identification of flavonoids.Methods in
enzymology 2001; 335: 3-14.
6. Cawoy V., Ledent J. F., Kinet J. M., Jacquemart A. L. Floral biology of common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). The European Journal of Plant Science and Biotechnology 2009; 3(1): 1-9.
7. Choi Y. S., Lee H. H., Park C. H. Food, chemical and nutraceutical research on buckwheat in Korea: Literature survey. Fagopyrum 2003; 20: 73-80.
8. Choi S. M., Ma, C. Y. Structural characterization of globulin from common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) using circular dichroism and Raman spectroscopy. Food
Chemistry 2007; 102(1): 150-160.
9. Danila A. M., Kotani A., Hakamata H., Kusu F. Determination of rutin, catechin, epicatechin, and epicatechin gallate in buckwheat Fagopyrum esculentum Moench by micro-high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of agricultural and food chemistry 2007; 55(4): 1139-1143.
10. De Rijke E., Out P., Niessen W. M., Ariese F., Gooijer C., Udo A. T. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A 2006; 1112(1): 31-63.
11. Eguchi K., Anase T., Osuga H. Development of a high-performance liquid chromatography method to determine the fagopyrin content of tartary buckwheat (Fagopyrum tartaricum Gaertn.) and common buckwheat (F. esculentum Moench). Plant Production Science 2009; 12(4): 475-480.
12. Halbrecq B., Romedenne P., Ledent, J. F. Evolution of flowering, ripening and seed set in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench): quantitative analysis. European journal of
agronomy 2005; 23(3): 209-224.
13. Hammer K., Heller J. Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops.
Schriften Genet Resour 1998; 8: 223-227.
14. Havsteen B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology &
therapeutics 2002; 96(2): 67-202.
15. Holasova M., Fiedlerova V., Smrcinova H., Orsak M., Lachman J., Vavreinova S. Buckwheat— the source of antioxidant activity in functional foods. Food Research International 2002; 35(2): 207-211.
16. Yang J., Guo J., Yuan J. In vitro antioxidant properties of rutin. LWT-Food Science and
Technology 2008; 41(6): 1060-1066.
17. Yao L. H., Jiang Y. M., Shi J., Tomas-Barberan F. A., Datta N., Singanusong R., Chen, S. S. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for Human Nutrition 2004; 59(3): 113-122.
18. Janeš D., Kantar D., Kreft, S., Prosen H. Identification of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) aroma compounds with GC–MS. Food chemistry 2009; 112(1): 120-124.
19. Janulis V., Puodžiūnienė G., Malinauskas F. Fitocheminė analizė. Kaunas 2008.
20. Kalinova J., Triska J., Vrchotova N. Distribution of vitamin E, squalene, epicatechin, and rutin in common buckwheat plants (Fagopyrum esculentum Moench). Journal of agricultural and food
chemistry 2006; 54(15): 5330-5335.
21. Kalinova J., Vrchotova, N Level of catechin, myricetin, quercetin and isoquercitrin in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench), changes of their levels during vegetation and their effect on the growth of selected weeds. Journal of agricultural and food chemistry 2009; 57(7): 2719-2725.
22. Kazlauskienė D., Vainauskas P., Rakauskaitė D. Vaistų mišinio komponentų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ūminių apsinuodijimų atvejais. Medicina. 2003; 39(2): 132- 136.
23. Kreft I., Fabjan N., Yasumoto K. Rutin content in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) food materials and products. Food Chemistry 2006; 98(3): 508-512.
24. Krueger R. J. Flavonoids. Chemistry, Biochemistry and Applications. Economic Botany 2007;
61(1): 101-101.
25. Kvercitrino struktūrinės formulės nuotrauka. [žiūrėta 2015-11-15] Prieiga per internetą: (https://en.wikipedia.org/wiki/Quercitrin)
26. Li S. Q., Zhang Q. H. Advances in the development of functional foods from buckwheat. Critical
reviews in food science and nutrition 2001; 41(6): 451-464.
27. Maikštėnienė S., Masilionytė L. Našių dirvožemių potencialo šiaurės Lietuvos regione išnaudojimo ekologinių ūkių plėtrai galimybių tyrimas. Ekonomika ir vadyba: aktualijos ir
perspektyvos 2010; 3(19): 129-135.
28. Maskoliūnaitė Daiva. Ekologinio ūkininkavimo ypatumai Europoje ir Lietuvoje. Mano ūkis 2004; 5: 1-3.
29. Naczk M., Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A 2004; 1054(1-2): 95-111.
30. Park H. H., Lee S., Son H. Y., Park S. B., Kim M. S., Choi E. J., Hyun M. C. Flavonoids inhibit histamine release and expression of proinflammatory cytokines in mast cells. Archives of
pharmacal research 2008; 31(10): 1303-1311.
31. Pietta, P. G. Flavonoids as antioxidants. Journal of natural products. 2000; 63(7): 1035-1042.
32. Quettier-Deleu C., Gressier B., Vasseur J., Dine T., Brunet C., Luyckx M., Trotin, F. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) hulls and flour. Journal of ethnopharmacology 2000; 72(1): 35-42.
33. Ragažinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas: Lututė;
2005. p. 134-136.
34. Raina A. P., Gupta V. Evaluation of buckwheat (Fagopyrum species) germplasm for rutin content in seeds. Indian Journal of Plant Physiology 2015; 20(2): 167-171.
35. Ratan P., Kothiyal P. Fagopyrum esculentum Moench (common buckwheat) edible plant of Himalayas: A Review. Asian Journal of Pharmacy and Life Science 2011; 1(4): 426-442.
36. Romanovskaja D. Grikių biologiniai ypatumai. Mano ūkis 2009; 9: 38–40
37. Romanovskaja D., Ražukas A. Grikių (Fagopyrum esculentum) selekcija Lietuvoje. Žemės ūkio
mokslai 2006; 1: 31-38.
38. Rutino struktūrinės formulės nuotrauka. [žiūrėta 2015-11-15] Prieiga per internetą: https://en.wikipedia.org/wiki/Rutin)
39. Sedej I., Sakač M., Mandić A., Mišan A., Tumbas V., Čanadanović‐Brunet J. Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) grain and fractions: antioxidant compounds and activities.
Journal of food science 2012; 77(9): C954-C959.
40. Sėjamojo grikio nuotrauka. [žiūrėta 2015-11-15] Prieiga per internetą: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fagopyrum_esculentum_Sturm64.jpg
41. Sėjamųjų grikių veislių, įrašytų į Nacionalinį augalų veislių sąrašą, aprašai.2014. [žiūrėta
http://www.vatzum.lt/uploads/documents/augalu_veisles/veisliu_aprasymai/griki_apraai_2014.pd f
42. Shah R. First Report on Buckwheat (Fagopyrum esculentum) from High Altitude Temperate Zone of North Western Himalayan Region. Indian Journal of Hill Farming 2013; 26(1): 52-54.
43. Sharma S., Ali A., Ali J., Sahni J. K., Baboota S. Rutin: therapeutic potential and recent advances in drug delivery. Expert opinion on investigational drugs 2013; 22(8): 1063-1079.
44. Stalikas C. D. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids.
Journal of separation science 2007; 30(18): 3268-3295.
45. Tang C. H., Peng J., Zhen D. W., Chen Z. Physicochemical and antioxidant properties of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) protein hydrolysates. Food Chemistry 2009; 115(2): 672-678.
46. Tian Q., Li D., Patil, B. S. Identification and determination of flavonoids in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench, Polygonaceae) by high‐performance liquid chromatography with electrospray ionisation mass spectrometry and photodiode array ultraviolet detection.
Phytochemical Analysis 2002; 13(5): 251-256.
47. Uppugundla N., Engelberth A., Vandhana Ravindranath S., Clausen E. C., Lay J. O., Gidden J., Carrier D. J. Switchgrass water extracts: extraction, separation and biological activity of rutin and quercitrin. Journal of agricultural and food chemistry 2009; 57(17): 7763-7770.
48. Wronkowska M., Troszynska A., Soral-Smietana M., Wolejszo A. Effects of buckwheat flour [Fagopyrum esculentum Moench] on the quality of gluten-free bread. Polish Journal of Food and
Nutrition Sciences 2008; 58(2):211-216.
49. Zemeckis R., Ribašauskienė E. Ekologiškas žemės ūkis – ateities ūkio modelis. Lietuvos agrarinės ekonomikos institutas. [žiūrėta 2015-10-23] Prieiga per internetą: http://www.laei.lt/?mt=publikacijos&straipsnis=159&metai=2004
50. Zhang Z. L., Zhou M. L., Tang Y., Li F. L., Tang Y. X., Shao J. R., Wu Y. M. Bioactive compounds in functional buckwheat food. Food research international 2012; 49(1); 389-395.
51. Žvikas V., Jakštas V., Šopaga L. Optimization of extraction process of rutin from Fagopyrum
esculentum Moench. The 5 th International conference on pharmaceutical sciences and pharmacy
