FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Artūr Kozlovskij
MEŠKINIŲ ČESNAKŲ (ALLIUM URSINUM L.) BENDRO
FENOLINIŲ IR FLAVANOIDINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO BEI
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Ramunė Morkūnienė
MEŠKINIŲ ČESNAKŲ (ALLIUM URSINUM L.) BENDRO
FENOLINIŲ IR FLAVANOIDINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO BEI
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
DddDData Data Darbą atliko Magistrantas Artūr Kozlovskij Data KAUNAS, 2018 Recenzentas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 111.1. Meškinių česnakų charakteristika ... 11
1.2. Meškinių česnakų cheminė sudėtis ... 12
1.3. Meškinių česnakų biologiškai aktyvių junginių poveikis... 14
1.3.1. Antimikrobinis poveikis ... 15
1.3.2. Antigrybelinis poveikis ... 15
1.3.3. Gastro protekcinis poveikis ... 16
1.3.4. Priešuţdegiminis poveikis ... 16
1.3.5. Antiagregacinis poveikis ... 17
1.3.6. Nepageidaujamas poveikis ... 17
1.4. Biologiškai aktyvių junginių nustatymo metodai ... 18
1.5. Fenolinių darinių biologinės savybės ... 19
1.6. Fenolinių junginių ir flavanoidų išskyrimas ... 19
1.6.1. Spektrofotometriniai metodai naudojami fenolinių, flavanoidinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo nustatymui ... 20
1.6.2. Reakcija su Folin- Ciocalteu reagentu ... 20
1.6.3. Reakcija su Aliuminio (III) chloridu ... 20
1.6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 21
1.7. Literatūros apibendrinimas ... 21
2.EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Įranga ... 22
2.3. Medţiagos ir reagentai ... 22
2.4. Meškinių česnakų ištraukų ruošimas ... 23
2.5. Spektrofotometriniai metodai ... 24
2.5.1. Bendras fenolinių junginių kieko išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciacalteu metodu ... 24
2.5.2. Bendro flavanoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrometriniu metodu
... 25
2.5.3. Antioksidacinio potencialo nustatymas CUPRAC metodu ... 26
2.6. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR APTARIMAS ... 27
3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 27
3.2. Fenolinių junginių kiekio palyginimas skirtingo brandinimo laikotarpio ištraukose ... 27
3.3. Flavanoidų kiekio palyginimas skirtingo brandinimo laikotarpio ištraukose ... 28
3.4. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas skirtingo brandinimo laikotarpio etanolinėse ištraukose 29 3.5. Fenolinių junginių palyginimas meškinių česnakų esencijos su namų sąlygomis uţaugintos ţaliavos ir rinktos miške ... 30
3.6. Flavanoidų palyginimas meškinių česnakų esencijos su namų sąlygomis uţaugintos ţaliavos ir miške rinktos ţaliavos ... 31
3.7. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas meškinių česnakų esencijoje, namų sąlygomis uţaugintoje ţaliavoje ir miške rinktoje ţaliavoje ... 32
3.8. Bendras fenolinių junginių kiekio įvertinimas tiriamuose meškinių česnakų mėginiuose ... 33
3.9. Bendras flavanoidinių junginių kiekis nustatytas tiriamuosiuose meškinių česnakų mėginiuose ... 34
3.10. Bendras antioksidacinio aktyvumo vertinimas tiriamuose mėginiuose ... 35
4. IŠVADOS ... 37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
SANTRAUKA
Artūr Kozlovskij magistro baigiamasis darbas - meškinių česnakų bendro fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo nustatymas. Darbo vadovas prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra - Kaunas.
Raktiniai ţodţiai: meškinis česnakas, spektrofotometrija, fenoliniai junginiai, flavanoidai,
antioksidacinis aktyvumas, CUPRAC.
Darbo tikslas: Nustatyti Lietuvoje rinktų meškinių česnakų (Allium ursinum L.) ţaliavų bendrą
fenolinių junginių ir flavanoidų kiekį, ištirti antioksidacinį aktyvumą naudojant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uţdaviniai: 1.Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį meškinių česnakų ekstraktuose
naudojant spektrofotometrinį metodą. 2.Nustatyti flavanoidų kiekį meškinių česnakų ekstraktuose naudojant spektrofotometrį metodą. 3.Palyginti bendrą fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekį tiriamuose meškinių česnakų ekstraktuose. 4.Įvertinti meškinių česnakų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą naudojant CUPRAC spektrofotometrinį metodą.
Tyrimo objektas ir metodai:
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) lapų ţaliava, kuri buvo uţauginta namų sąlygomis.
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) lapų ţaliava, rinkta miške.
Meškinių česnakų skirtingo brandinimo laikotarpio (24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių) etanolinės ištraukos.
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) esencija ( vietinis verslas ,,Rasoklė").
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus apskaičiuojant remiantis galo rūgšties kalibraciniu grafiku mg/ml. Bendras flavanoidų kiekis nustatytas aliuminio (III) chloridu reakcija spektrofotometriniu metodu, rezultatai apskaičiuoti ir išreikšti rutino ekvivalentu mg/ml. Antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas CUPRAC spektrofotometriniu metodu, gauti rezultatai apskaičiuoti ir išreikšti troloksono ekvivalentu mg/ml. Rezultatai ir išvados: Atlikus tyrimus didţiausias fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekis (2,093 ±
0,10 GRE mg/ml ir 1,41 ± 0,07 RE mg/ml ) bei stipriausias antioksidacinis poveikis (1,713 ± 0,08 TE mg/ml) nustatytas miške rinktos lapų ţaliavose. Maţiausi kiekiai fenolinių (0,616 ± 0,03 GRE mg/ml), flavanoidinių (0,147 ± 0,01 RE mg/ml) junginių bei silpniausias antioksidacinis aktyvumas (0,255 ± 0,01 TE mg/ml) nustatytas etanolinėje ištraukoje, kuri buvo brandinta 24 dienas. Nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp fenolinių junginių bei flavanoidų kiekio ir meškinių česnakų tiriamųjų
mėginių antioksidacinio aktyvumo, įvertinto CUPRAC spektrofotmetriniu metodu atitinkamai (0,951, p<0,05) ir (0,949, p<0,05).
SUMMARY
Artur Kozlovskij„s master thesis, evaluation of total phenolic and flavanoid content as well as antioxidant activity in bear's garlic (Allium ursinum L.). Thesis manager prof. Liudas Ivanauskas, Lithuanian University Of Health Science, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analitical and Toxicological Chemistry – Kaunas .
Key words:
Bear's garlic, Allium ursinum L., spectrophotometry, phenols, flavanoids, antioxidant
activity , CUPRAC.Aim: To evaluate the total phenolic and flavanoid content as well as determining antioxidant activity
in bear's garlic (Allium ursinum L.), obtained in Lithuania, using spectrophotometric methods.
Objectives of the study: 1.To determine the total amount of phenolic content in bear's garlic extracts
using the spectrophotometric method. 2.To determine the total amount of flavanoid content in bear's garlic extracts using the spectrophotometric method. 3.To compare the total amount of phenolic and flavanoid content in the tested bear's garlic extracts. 4.To evaluate the antioxidative activity of bear's garlic extracts using CUPRAC spectrophotometric method.
Object and methodology:
Materials used in this study:
Bear's garlic (Allium ursinum L.), grown under household conditions.
Bear's garlic (Allium ursinum L.) obtained from the forest.
Bear's garlic (Allium ursinum L.) etanolic extracts with different extraction periods ( 24 days, 1 month, 6 months, 7 months, 12 months).
Ethanolic essence of bear's galic (Allium ursinum L.) ( local business ,,Rasoklė").
Total quantaty of phenolic compounds was determined by spectrophotometry using Folin – Ciocalteu reagent. Results were calculated based on galic acid calibration curve mg/ml. Total amount of Flavanoids was evaluated by spectrophotometry using aluminum (III) chloride reaction, the results were calculated and expressed using the equivalent of rutin mg/ml. Antioxidant activity was identified using CUPRAC spectrophotometric method, results were calculated and expressed using the
equivalent of troloxon mg/ml.
Results: In this study, the highest content of phenolic and flavanoid compounds (2,093 ± 0,10 GRE
mg/ml and 1,41 ± 0,07 RE mg/ml) and the strongest antioxidant effect (1,713 ± 0,08 TE mg/ml) was observed in bear's garlic which was obtained from the forest. The least amounts of phenolic (0.616 ± 0.03 GRE mg/ml), flavanoid (0.147 ± 0.01 RE mg/ml) compounds and the weakest antioxidant activity (0.255 ± 0.01 TE mg/ml) were detected in the ethanolic extract that was matured for 24 days. Strong correlation has been noticed between phenolic, flavanoid compound content and the antioxidative activity of determined by the CUPRAC spectrophotometric method (0.951, p <0.05) and (0.949, p <0.05).
Padėka
Dėkoju Rasai Subačienei ( vietinis verslas ,,Rasoklė"), uţ parūpintą meškinių česnakų ţaliavą, gauta 2018 m.
Dėkoju Marijonui Bernotavičiui ir Vytautui Saltonui uţ iš nuosavo miško parūpintą meškinių česnakų ţaliavą gauta 2018 m.
Uţ patarimus ir pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai. Taip pat dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui, profesoriui Liudui Ivanauskui uţ patarimus, pagalbą, konsultaciją ir pamokymus ruošiant magistro baigiamąjį darbą.
SANTRUMPOS
BAJ- Biologiškai aktyvūs junginiai
CUPRAC- Vario jonų redukcijos antioksidantinė geba GRE- Galo rūgšties ekvivalentas
RE– Rutino ekvivalentas TE- Troloksono ekvivalentas
ĮVADAS
Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai pateikė nemaţai įrodymų dėl efektyvaus meškinių česnakų kardioprotekcinio ir prevencinio poveikio, be to nemaţai turimų duomenų rodo
antiagregacinį, priešgrybelinį, antibakterinį, gastroprotekcinį, antioksidacinį poveikį, kuris gali būti naudojamas, kuriant naujus vaistinius preparatus arba maisto papildus meškinių česnakų pagrindu [29,3]. Tai galėtų būti pagalbinė priemonė antibiotikų paskirtame gydyme, sustiprinant antibakterinį poveikį arba kaip maisto papildas, pasiţymintis cholesterolį maţinančiu ir kraujagysles stiprinančiu poveikiu. Siekiant pritaikyti šiuos poveikius gydymo tikslams, būtina gerai išmanyti paties meškinių česnakų cheminę sudėtį ir pagrindinius junginius, atsakingus uţ šiuos poveikius.
Viena grupė junginių, kuri didţiąją dalimi prisideda prie visų šių poveikių yra fenoliniai junginiai, kurie atsakingi uţ antioksidacinį poveikį surišant laisvuosius radikalus, maţinimą bendro cholesterolio ir taip pat maţo tankio lipoproteinų koncentraciją, inhibavimą fermento ciklooksigenazės atsakingą uţ uţdegiminius procesus ir antiagregacinį poveikį trombocitams [13]. Kitose šalyse
meškinis česnakas yra vis daţniau nagrinėjamas dėl savo įvairių farmakologinių poveikių, ir netgi teigiama, jog yra pranašesnis negu valgomasis česnakas, dėl to yra svarbu nustatyti, kokį kiekį
biologiškai aktyvių junginių, šiuo tyrimo atveju, fenolių, kaupia meškinis česnakas, augintas Lietuvoje. Nustačius fenolinių junginių bei flavanoidų kiekį ir antioksidacinį potencialą meškinių česnakų, kuris yra uţaugintas Lietuvoje, būtų galima apsvarstyti įvairių, kombinuotų ir vientisų, medicininių
preparatų gamybą ateityje, kai šis augalas bus išbrauktas iš raudonosios knygos. Šio darbo tikslas yra nustatyti ir įvertinti bendrą fenolinių junginių, flavanoidų kiekį ir taip pat antioksidacinį meškinių česnakų, kuris buvo uţaugintas Lietuvoje, aktyvumą taikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo tikslas:
Atlikti Lietuvoje uţaugtinų meškinių česnakų (Allium ursinum L.) ţaliavos fenolinių junginių kiekybinę analizę bei nustatyti antioksidacinį aktyvumą taikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį meškinių česnakų ekstraktuose naudojant spektrofotometrinį metodą.
2. Nustatyti flavanoidų kiekį meškinių česnakų ekstraktuose naudojant spektrofotometrį metodą. 3. Palyginti bendrą fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekį tiriamuose meškinių česnakų
ekstraktuose.
4. Įvertinti meškinių česnakų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą naudojant CUPRAC spektofotometrinį metodą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Meškinių česnakų charakteristika
1 pav. Meškinis česnakas (Allium ursinum L.) [35]
Meškinis česnakas (Allium ursinum L.), amarilinių šeimos, česnako genties, daugiametis ţolinis augalas, pailgais svogūnais, augantis iki 15-50 cm aukščio. Ţydi geguţės - birţelio mėnesį, pradėjus nokti sėkloms lapai nunyksta. Dauginasi sėklomis ir vegetatyviniu būdu – dukteriniais svogūnėliais. Ţiedynas panašus į baltą skėtį. Augalas išaugina nuo 2 iki 3 lapų, kurie yra trumpesni negu stiebas, lapai plokšti eliptiški - lancetiški, smailios formos viršūnėlėje, siaurėjantys ties pagrindu, lapų plotis būna 20 - 64 mm(1 pav.) [31]. Paplitęs tamsesnėse miško vietose, kur dirvoţemis
drėgnesnis ir šiek tiek rūgštesnis. Randama Kaukaze, Skandinavijoje, Vidurio ir Atlanto Europoje [12]. Lietuvoje įrašytas į raudonąją knygą, meškinis česnakas gana retas, jo randama Birţų, Gargţdų, Alytaus, Trakų, Panevėţio, Jurbarko, Plungės, Prienų ir Vilkaviškio rajonuose. savo pavadinimą įgavęs per mitus, kuriuose minima, jog kai meškos pabusdavo iš ţiemos miego suvalgydavo šį augalą, kad pašalintų toksinus iš savo organizmo ir atgautų jėgas [24]. Meškinis česnakas jau daugelį amţių vartojamas kaip sveikatą stiprinanti priemonė, manoma, jog šis augalas buvo naudojamas mesoličio eros ţmonių. Graikų mokslininkas Dioskoridas minėjo 4 česnakų rūšis, jų tarpe ir meškinį, prie kurio priskyrė detoksikacinį poveikį, Loniceras netgi tvirtino, jog meškinis česnakas pranašesnis negu valgomasis česnakas [31].
1.2. Meškinių česnakų cheminė sudėtis
Šio augalo, kaip ir kitų česnakinių genties narių, skiriamasis bruoţas tai didelė koncentracija sieros junginių, cistein sulfoksidų, kurių meškiniame česnake gausiausia - metijino ir alijino tipo, tačiau galima rasti ir propijino ir isoalijino (1 lentelė), priklausomai nuo kultivacijos laiko. Manoma, jog daugiausiai biologiškai aktyvių junginių randama tarp kovo ir balandţio mėnesio [30].
1 lentelė. Dažniausiai randami cisteino sulfoksidai meškiniame česnake.[31]
Pavadinimas Formulė Molekulinė masė
Metijinas 151.18 g/mol
Alijinas 177.218 g/mol
Isoalijinas 177.218 g/mol
Propijinas 179.234 g/mol
Etijinas 165.207 g/mol
Cisteino sulfoksidai linkę hidrolizuotis padedant C,S- liazių ko pasekoje susidaro tiosulfinatai , piruvatinė rūgštis ir amoniakas. Tiosulfinatai yra atsakingi uţ česnako skonį ir kvapą. Daţniausiai randami tiosulfinatai meškinių česnakų ištraukose yra alicinas (dialyl thiosulfinatas) ir metil-alil tiosulfinatas (2 lentelė). Tiosulfinatai yra nestabilūs, raktantiški junginiai, kurie lengvai suyra į polisulfidus, diitinus, ajoenus ir kitus lakius ir nelakius junginius. Šios reakcijos vyksta normaliomis laikymo sąlygomis ar atliekant ekstrahavimą, pavyzdţiui: Alicinas yra nestabilus esant kambario temperatūroje. Tyrimai atlikti Bagiu et. al. rodo kad po 20 valandų esant 20o laipsnių alicinas visiškai suiro, ko pasėkoje susidarė di-2-propenil disulfidas, di-2-propenyil trisulfidas, di-2-propenil sulfidas ir sieros dioksidas [6].
2. Lentelė. Dažniausiai randami Tiosulfinatai [31]
Pavadinimas Formulė Molekulinė Masė
Alicinas 162.26 g/mol
Metil-Alil-Tiosulfinatas 152.226 g/mol
Alil-Metil-Tiosulfinatas 152.226 g/mol
Dimetil-tiosulfinatas 110.189 g/mol
Dar viena grupė junginių yra Vinilditijinai, kurie susidaro skylant alicinui, jie taipogi susidaro kaip reakcijos produktai naudojant tirpiklius maţiau poliškus negu 2-propanolis. Kita grupė
degradacijos produktų yra metil- arba dimetil ajoenai, kurie daţniausiai identifikuojami iš česnako galvučių acetono-chloroformo ištraukų [31].
Be jau minėtų sieros turinčių sulfoksidų degradacijos produktų, įvairūs sieros junginiai yra randami meškinių česnakų eteriniame aliejuje. Aliejaus kiekis priklauso nuo dirvos savybių, drėgmės, geografinės padėties. Serbijoje rinktų meškinių česnakų ţaliavoje buvo rasta daugiau negu 20
komponentų jų eteriniuose aliejuose. Didţiausią frakciją sudarė disulfidai (54,7 proc.), trisulfidai (37.0 proc.), tetrasulfidai (47 proc.) ir ne sieros junginiai (1 proc.) [17].
Dar viena svarbi grupė, kurios pakankamai gausu - fenoliniai junginiai, kurie pasiţymi plačiu biologiniu aktyvumu ir įvairia struktūrų gausa nuo paprastų junginių iki sudėtingų polimerinių
kompleksų, kurių randamas kiekis glaudţiai susijęs su naudojamu ekstrakcijos metodu. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentais (GRE). Apskaičiuotas po 12 dienų maceracijos su 70 proc. etanoliu prie kambario temperatūros 20o C buvo ţenkliai didesnis lyginus su ultragarso vonelėje ekstrahuotu po 15 min. prie 25 o
C : 29.9 GRE/100 g lyginant 10 GRE/100g. Fenoliniai junginiai pasiţymi plačiu biologiniu poveikiu, kuris skirstomas į: antioksidantinis,
antimutageninis, antibakterinis, antivirusinis, priešuţdegiminis ir antitrombozinis poveikis [16]. Nors kituose česnako genties atstovuose randami Kvercetino ir Kempferolio dariniai, meškiniame česnake aptinkami tik kempferolio dariniai, nustatyta, jog česnako ţieduose randami didesnė koncentracija kempferolio darinių, o lapuose didesnė kumarolinės rūgšties darinių (109.11µg per 100g) ir ferulinės rūgšties (40.16 µg per 100g) [27,24].
Steroidiniai glikozidai (saponinai) yra randami visuose česnakinių šeimose. Meškiniame česnake aptinkami diosgenin
rhamnopiranosil-(1→4)-α-L-rhamnopyranosil-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosil-(1→2)]-β-D-slucopyranosidas ir (25R)-spirost-5,25(27)-dien-3β-ol 3-O-α-L-
rhamnopyranosil-(1→4)-α-L-[rhamnopyranosil-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosil-(1→2)]-β-D-glucopyranosidas. Panašiai kaip ir kitų biologiškai aktyvių junginių kiekis priklauso nuo kultivacijos laiko, didţiausias diosgenino kiekis (0.137 proc.) buvo rastas iš metanolinių ekstraktų paruoštų iš švieţiai surinktų Balandţio mėnesį prieš ţydėjimą česnako svogūnų. Renkant ţaliavą Kovo ir Birţelio mėnesiais steroidiniai glikozidai buvo neaptinkami, dėl pakankamai maţo kiekio diosgenino meškinis česnakas netinkamas sapogeninų ekstrakcijai [30,24].
1.3. Meškinių česnakų biologiškai aktyvių junginių poveikis
Bene svarbiausiai nagrinėjamas meškinių česnakų poveikis yra į širdies ir kraujagyslių sistemą, skirtingi ekstraktai, gauti iš švieţių česnako lapų, pasiţymi antiagregaciniu poveikiu, kurio poveikio mechanizmas panašus į klopidogrelio. Manoma, kad aktyvūs junginiai, kurie sukelia
antiagregacinį poveikį yra 1,2-di-O-a-linolenoil-3-O-b-D-galaktopyranosil-sn-glicerol (DLGG) ir b-sitosterol-O-b-D-gliukopiranosidas, be šių junginių česnake esantys flavanoidai kaempferol 3-O-b-neohesperidosidas-7-O-b-D-glukopyranosidas ir 3-O-b-neohesperidosidas in vitro tyrimuose parodė agregaciją inhibuojantį poveikį indukuotą kalogeno. Tyrime atliktame 1993 (Rietz et al.) buvo lyginama meškinių česnakų ir valgomojo česnako terapinis poveikis. Rezultatai parodė , jog po mėnesio vartojimo sistolinis kraujo spaudimas kur kas daugiau sumaţėjo tiriamosiose ţiurkėse , kuriom buvo paskirtas meškinis česnakas negu tom , kuriom buvo duotas valgomasis. Buvo pasiekta išvados, kad šis poveikis gali būti asocijuojamas su didele koncentracija glutamil peptidazių,
adenosido ir fenolinių junginių randamų meškiniame česnake. Meškinis česnakas taipogi pasiţymi cholesterolio sinteze stabdančiu poveikiu. Iš esamų meškinių česnakų biologiškai aktyvių junginių esančių ekstraktuose ajoenai, 2-vinyl-4h-1,30ditijinas ir alicinas buvo stipriausiai cholesterolio sintezę slopinantys junginiai [9,31,32].
1.3.1. Antimikrobinis poveikis
Česnako genčiai būdingas bakterinius organizmus naikinantis poveikis, kuris pasireiškia dėka alicino, kitų tiosulfinatų ir jų skilimo produktų. Iš česnako išgauti antimikrobiniai dariniai inhibuoja mikroorganizmus saveikaudami su sulfhidryl (SH) grupėmis esančiomis ląstelės baltymuose. Esminiai antimikrobiniai česnakų dariniai yra formuojami degraduojant S-alk(en)yl-L-cisteino sulfoksidam kai ląstelė yra paţeidţiama veikiant fermentui alinazei. Sieros turintys antimikrobiniai junginiai išgauti iš sulfoksidų nėra natūraliai randami česnakuose , kaip antraeiliai antimikrobiniai dariniai randami fenoliai , terpenoidai, alkaloidai, organinės rūgštus ir polipeptidai. Tiosulfinatai inhibuoja mikroorganizmus dėl juose esančios -S(O)-S- grupės, kuri reaguoja su SH grupe esančia
membraniniuose baltymuose sudarant disulfidus. Antimikrobinis poveikis tiosulfinatų yra stabdomas sulfhidryl darinių tokių kaip cisteinas. Efektyvumas stabdant mikroorganizmų plitimą taip pat
priklauso ir nuo pasirinkto ekstrakcijai tirpiklio, daţniausiai naudojami vanduo, etil acetatas ir etanolis rečiau acetonas , chloroformas, butanolis. Česnako ekstraktai yra efektyvūs prieš saprofitiškas ir patogeniškas bakterijas, kurios pasiţymi rezistentiškumu vaistam. Tyrimais patvirtintas teigiamas inhibicinis, sinergistinis poveikis kartu su ciprofloksacinu stabdantis E.coli augimą ir inhibuojantis Helicobacter pylori augimą in vitro [22].
1.3.2. Antigrybelinis poveikis
Ţinant, jog meškinių česnakų biologiškai aktyvūs junginiai, ypač sieros, pasiţymi
antimikrobiniu poveikiu viename tyrime buvo tirtas antigrybelinis poveikis in vitro į įvairias Candida grybelio rūšis. Manoma, kad cisteino sulfoksidai (Alijinas) ir ne lakūs γ-glutamilcisteino peptidai sudaro daugiau negu 82 proc. visų sieros junginių meškiniuose česnakuose. Tiosulfinatai, ajoenai - alicino degradacijos produktai- vinildithiinai ir sulfidai , nėra natūraliai randami junginiai.
Tiosulfinatai susidarę česnake yra degraduojami į įvairius polisulfidus ir ajoenus, kurie taip pat rodo tam tikra antimikrobinį poveikį. Lakūs sieros junginiai labiau linkę inhibuoti grybelius negu bakterijas. Kai česnako galvutė yra minkoma ar spaudţiama, alijinas yra išspaudţiamas iš ląstelių, sąveikaudamas su fermentu alinaze, kartu su hidrolize ir kondensacija, kaip tarpiniu reaktantu susiformuoja alijinas [8]. Antigrybelinis vaistų efektyvumas ir saugumas priklauso nuo jų aktyvumo spektro, jų poveikio ir maţiausios inhibuojamos koncentracijos. Pasiţymi antigrybeliu tiek in vivo tiek in vitro poveikiu tokiom grybelių rūšim kaip: Botrytis cinerea, Plectospherella cucumerina, Alternaria brassicicola ir
Magnaporthe grisea. Alicinas gali būti naudojamas kaip paviršinis preparatas Candida infekcijom gydyti, šis poveikis savo efektyvumu netgi lyginamas su fluticonazolio [21]. Duomenys rodo didelį antigrybelinį potencialą turinčios ištraukos taip pat pasiţymi gebėjimu blokuoti morfogeninę transformaciją. Sieros turintys junginiai reaguoja su membranine vezikule ir sutrikdo ADP metabolizmą, DNR ir RNR sintezę ir taip pat inhibuoja sienelės sintezę. Grybuose jie sukelia panašius pakitimus kaip antibiotikai, tačiau tai reikalauja tolimesnio tyrimo ir naujo modelio siekiant atlinkti klinikinius bandymus su gyvūnais [6].
1.3.3. Gastro protekcinis poveikis
Šiuo metu tai yra maţiausiai tirtas poveikis meškinių česnakų tačiau, net turimi duomenys tvirtina teigiamą poveikį, susijusį su skrandţio spazmų malšinimu, galimai veikiančiu per Ca2+
kanalų inhibiciją, manoma, kad antioksidantiškas ir antimikrobinis aktyvumas prisideda prie bendro gastro protekcinio poveikio. Bandymai su ţiurkių klubinėmis ţarnomis sukėlė nuo koncentracijos
priklausomą ţarnų relaksaciją lyginant įvairius metanolinius ir vandeninius ekstraktus su papaverinu, nors, poveikis nebuvo toks stiprus lyginant su papaverinu. Papaverinas veikia kaip raumenų
relaksantas inhibuodamas L-tipo Ca2+ kanalus. Etanoliniai ektraktai su didţiausia fenolių ir alk(en)yl cisteinų sulfoksidų koncentracija sukėlė stipriausią spazmolitinį poveikį. Be jau ţinomų meškinių česnakų teigiamų vaistinių savybių jis taip pat galimas naudoti nesunkių gastrinių sutrikimų atveju [28].
1.3.4. Priešuţdegiminis poveikis
Uţdegimas apibrėţiamas, kaip nespecifinė organizmo apsauga nuo mechaninių, cheminių ir invazinių paţeidimų. Kadangi meškinių česnakų sudėtyje yra antioksidacinėm savybėm pasiţyminčių junginių, tokių kaip sieros turintys junginiai ir polifenoliniai junginiai ir kitų mikroelementų, kurie manomai sinergistiškai veikia maţindami oksidacinį ląstelės stresą taip inhibuodami fagocitozę ir taip maţindami uţdegiminį poveikį, tačiau tyrimai šiuo poţiūriu buvo atliekami tik su laboratorinėmis ţiurkėmis, kurioms dirbtinai buvo sukeliamas uţdegimas, todėl būtini tolimesni tyrimai siekiant pritaikyti mediciniškai šį poveikį [3].
1.3.5. Antiagregacinis poveikis
Tyrime atliktame 2011 Lepzige Vokietijoje buvo tiriamas meškinių česnakų trombocitų agregacijos inhibavimo potencialas. Tiriamasis mėginys buvo lyginamas su jau gerai ţinomų
antikoaguliantų (adenosindifosfatu, kolagenu ir epinefrinu) poveikiu ir taipogi su valgomojo česnako svogūnais. Siekiant suţinoti antiagregacinį efektyvumą savanorių kraujo plazma buvo veikiama vandeninių ir etanolinių meškinių česnakų ištraukų ir lyginami rezultatai su pasirinktais
atikoaguliantais. Vandeninis ekstraktas sukėlė nespecifinę trombocitų agregaciją, nepriklausomai koks stimulas buvo naudojamas, etanolinis meškinių česnakų ekstraktas trombocitų agregaciją labiausiai veikė lyginant jį su adenisindifosfato poveikiu, kituose nebuvo sukeliamas efektyvus poveikis. Abiejų tiriamųjų ţaliavų etanoliniai ekstraktai pasiţymėjo panašiu antiagregaciniu poveikiu , kurio veikimo mechanizmas lyginamas su klopidogrelio. Tyrime svarstoma, jog vandeniniuose ekstraktuose alijinų ir alicinų kompleksas sinergistiškai kaţkuria dalimi veikia antiagregacinį procesą, tačiau lipofiliniai ekstraktai yra esminiai siekiant sukelti stipresnį antiagregacinį poveikį. Be šių ekstraktų taip pat buvo nagrinėjami eteriniai aliejai išgauti po alijino degradacijos ir jų trombocitų agregaciją inhibuojantis poveikis, manoma, jog dialyl sulfidai ir ajoenai būtent ir sukelia šį poveikį ir buvo įtraukti į
antiagregacinį tyrimą, rezultatai parodė efektyvų antiagregacinį poveikį (80 proc.-90 proc.). Tyrimas patvirtino panašų antiagregacinį poveikį tiek meškiniame, tiek valgomajame česnake, jų
antiagregacinis poveikis yra tiesiogiai priklausomas nuo dozės [19].
1.3.6. Nepageidaujamas poveikis
Bendru poţiūriu meškinis česnakas yra saugus vartojimui, tačiau oksidacinis stresas gali sukelti eritrocitų paţeidimus. Eterinių aliejų pavidale esantys di-,tri-,tetrasulfidai yra toksiški eritrocitams, galima anemijos rizika. Apsinuodijus augalu pasireiškia bendriniai negalavimo simptomai: Pykinimas, vėmimas, viduriavimas, kartais kruvinom išmatom [4, 14].
1.4. Biologiškai aktyvių junginių nustatymo metodai
Kokybiniam ir kiekybiniam BAJ įvertinimui daţniausiai taikomas metodas – efektyvioji skysčių chromatografija su UV detektoriumi. Kiek rečiau naudojami ir masių spektro (MS) detektoriai. Efektyvioji skysčių chromatografija (ang. High performance liquid chromatography) –
chromatografijos rūšis, kai kolonėlėje yra sudaromas didelis slėgis, o nejudančiąją fazę sudaro maţo skersmens dalelės. Ši chromatografija gali būti normaliųjų ir atvirkštinių fazių. Normaliųjų fazių chromatografijoje nejudančioji fazė yra polinė, o judančioji – nepolinė. Atvirkštinių fazių
chromatografijoje nejudančioji fazė yra nepolinė, o judančioji – polinė [1]. Beveik 90 proc. tyrimų su maţos molekulinės masės junginiais atliekami taikant atvirkštinių fazių ESC metodą. Viena iš
pagrindinių šio reţimo didelio populiarumo prieţasčių – gebėjimas atskirti tarpusavyje labai panašius junginius ir taip palengvinti jų identifikavimą. Kokybiškai ir kiekybiškai biologiškai aktyvūs junginiai nustatomi remiantis gauta chromatograma. Pirmiausia smailės identifikuojamos - nustatomos
kokybiškai. Vėliau nustatant junginių koncentracijas svarbiausias parametras - smailės plotas [23]. Masių spektrofotometrija - medţiagų tyrimo metodas, kurio metu dalelės yra jonizuojamos, o po to nustatoma jonizuotų molekulių masė. Dalelės atskiriamos pasitelkiant elektrinį ar magnetinį lauką priklausomai nuo jono masės ir krūvio santykio. Gauti signalai sudaro spektrą, kuriame jų padėtis atitinka jonų masės ir krūvio santykio dydį, o signalo stiprumas proporcingas jonų kiekiui. Naudodamiesi kompiuterinėmis duomenų bazėmis iš gauto spektro nustatoma analitės struktūra. Masių spektrometrija puikiai tinka tiek kokybinei tiek kiekybinei analizei ir daţnai taikoma kartu su dujų arba skysčių chromatografija , kaip pastarosios detektorius [1].
Branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija - tai maţo daţnio energijos sugėrimas branduolyje. Gavęs šios energijos branduolio sukinys iš ţemesnio energetinio lygmens pereina į aukštesnį. Apsiversdami branduolių sukiniai sukelia magnetinio lauko stiprio pokytį, kuris
registruojamas kaip signalas. Vandenilio branduolių sukinio orientacijos kitimas sudaro šio tyrimo pagrindą, naudojama kokybės kontrolėje , nustatant , tiriant tam tikro junginio grynumą ir jo molekulinę struktūrą [20]. Tai informatyviausias organinių junginių sandaros tyrimo metodas. Metodas leidţia vienu metu įvertinti įvairius organinius junginius, kuriems būdingas įvairus
poliškumas. BMR spektroskopija galima tirti izomerų ar net stereoizomerų mišinius. BMR metodika nėra ribojama junginių galimybė jonizuotis tam tikromis sąlygomis , kur reikalinga MS, o
eksperimento metu tiriamieji junginiai nepakinta. Taikymą riboja savitųjų tirpiklių ir reagentų poreikis bei brangi aparatūra. Maţas jautrumas, bet jį galima pagerinti aukštesnio lygio lauko stipriu, krio ir dinaminė branduolinė poliarizacija [11].
1.5. Fenolinių darinių biologinės savybės
Flavanoidai yra grupė junginių pasiţyminčių fenoline struktūra sudaryta iš dviejų aromatinių ţiedų A ir B sujungtų trijų anglies atomų, kurie yra susijungę į heterociklį ţiedą C (2 pav), flavanoidai gali būti skirstomi į kelias grupės priklausomai nuo anglies atomo, kuris jungia B ir C ţiedus ir ţiedo įsotinimo, jos skirstomos: isoflavanai, flavanai, flavanoliai, flavanonai, flavanoliai arba katechinai, antocianai ir chalkoai. Natūraliai randami įvairiuose vaisiuose, darţovėse, grūduose, ţievėje, šaknyse, gėlėse, arbatoj ir vyne [26,34].
2 Pav. Bendra flavanoidų struktūra.
Meškinių česnakų lapai pasiţymi didţiausia flavanoidų gausa, randama net 21 flavanoidų darinių, didţioji dauguma jų yra kempferolio atmainos. Polifenoliai yra biologiškai aktyvios
molekulės, kurios pasiţymi labai plačiu antioksidaciniu, antimutageniniu, antibakteriniu , antivirusiniu, priešuţdegiminiu poveikiu. Taip pat pasiţymi dideliu reaktyvumu kaip vandenilio ar elektronų
donorai, apsaugo nuo laisvųjų radikalų, kurie sukelia ląstelių ţūtį ir audinių paţeidimus. Laisvųjų radikalų perteklius sukelia oksidacinius paţeidimus , kurie gali įtakoki aterosklerozę , koronarinę širdies liga, neurologinius sutrikimus, vėţio vystymąsi [24, 7].
1.6. Fenolinių junginių ir flavanoidų išskyrimas
Pirminis ţingsnis išskiriant junginius yra ţaliavos paruošimas, ţaliavos gali būti švieţios, dţiovintos, šaldytos, jos yra smulkinamos siekiant efektyvesnės ekstrakcijos. Ekstrakcijai naudoti galimi įvairūs tirpikliai : Etanolis, acetonas, metanolis , vanduo ar jų mišiniai. Būtina atkreipti dėmesį į polifenolinių junginių hidroksi grupes, nes jos gali būti susijungusios su cukrais, rūgštim ar alkyk grupėmis, dėl to yra labai svarbu tirpiklio poliškumas ir tinkamų sąlygų ekstrakcijai parinkimas kaip temperatūra ,pH ir laikas [15]. Yra pakankamai gausu ekstrakcijos metodų daţniausiai naudojamas Soksleto metodas, kurio privalumas būtų trumpas ekstrakcijos laikas ir maţos tirpiklių sąnaudos, bet
dėl sąlyginai maţo efektyvmo buvo sukurti ir ištobulinti nauji metodai kaip : Utragarso pagalbos ekstrakcija (UAE- ultrasound assisted extraction), mikrobangos ekstrakcija (MAE- microwave assisted extraction), superkritinių skysčių ekstrakcija(SCWE- sub critical water extraction) [18].
1.6.1. Spektrofotometriniai metodai naudojami fenolinių, flavanoidinių junginių
bei antioksidacinio aktyvumo nustatymui
Bendram fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekui nustatyti daţniausiai naudojama reakcija su Folin- Ciocalteu reagentu ir reakcija su AlCl3 [29, 2]. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti gali būti taikomi ABTS, DPPH, FRAP, CUPRAC metodai [2].
1.6.2. Reakcija su Folin- Ciocalteu reagentu
Metodas yra paremtas elektronų perdavimo reakcijomis silpnai šarminėje terpėje, fenoliniai junginiai reaguoja su fosfovolframo ir fosfomolibdato rūgščių kompleksu. Šios reakcijos metu Folin – Ciocalteu reagento spalva kinta nuo geltonos iki mėlynos. Gautų ekstraktų absorbcija matuojama UV spektrofotometru, po 90min. 720-765 nm šviesos bangos ilgyje. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentą [10].
1.6.3. Reakcija su Aliuminio (III) chloridu
Šio kolorimetrinio metodo esmė, kad Aliuminio Chloridas sudaro stabilius rūgštinius junginius flavanuose ir flavanoiduose su C-4 keto grupėmis arba C-3 arba C-5 hidroksilo grupėmis. Gauta absorbcija matuojama po 30 min esant 404-430 nm bangos ilgiui. Bendras flavanoidinių junginių kiekis gali būti išreikštas pagal kvercetino, rutino ar kitos medţiagos ekvivalentu [5].
1.6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Vienas iš galimų metodu tirti antioksidacinį aktyvumą yra Vario jonų redukcijos
antioksidantinė gebos metodas (CUPRAC). Šis metodas yra gana nesudėtingas ir pasiţymi plačiu pritaikymu tiriant polifenolius, flavanoidus, karotenoidus, antocianus, vitaminus C, E. Šiame metode naudojamas chromogeninis oksiduojantis reagentas bis(neokuproinas)(Cu(II)-Nc), kuris veikia kaip išorinio sluoksnio elektronų perkelėjas. CUPRAC chromoforas yra gaunamas redukuojant šį reagentą su antioksidantais (Cu(I)-Nc). Metodui naudojama neutrali terpė. Reakcija pilnai įvyksta po 30 min. matuojama absorbcija esant 450 nm bangos ilgiui. Tiriamųjų junginių antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas remiantis troloksono, ar kitų standartinių antioksidantų, ekvivalentu [25].
1.7. Literatūros apibendrinimas
Meškiniame česnake randami BAJ tokie kaip : cisteino sulfoksidsiai, kurių meškiniame česnake gausiausia metijino ir alijino tipo, tačiau galima rasti ir propijino ir isoalijino, Tiosulfinatai, kurie yra atsakingi uţ česnako skonį ir kvapą.[31] Daţniausi tiosulfinatai randami meškinių česnakų ištraukose yra alicinas (dialyl thiosulfinatas) ir methyl-allyl thiosulfinatas [30, 6]. Alicinas nėra stabilus junginys todėl skyla ir susidaro vinildiitinai, metyl- arba dimetil ajoenai, be jau minėtų sieros turinčių sulfoksidų degradacijos produktų , įvairūs sieros junginiai yra randami meškinių česnakų eteriniame aliejuje, jie daţnai būna di-,tri,-tetra sulfidų pavidalu [31, 17, 8]. Meškinis česnakas savyje kaupia ir fenolinius junginius iš kurių didţiausią dalį sudaro kempferolio dariniai [24, 6, 27]. Dar viena grupė junginių, kurie randami visuose česnakinių šeimose yra steroidiniai glikozidai (saponinai). Meškiniame česnake aptinkami diosgenin α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-slucopyranoside ir (25R)-spirost-5,25(27)-dien-3β-ol 3-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-[rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside [24, 31, 33]. Šių junginių nustatymui tiek kiekybiškai tiek kokybiškai naudojami įvairūs fiziko-cheminiai analizės metodai : Efektyvioji skysčių chromatografija, masių
spektrofotometrija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, dujų chromatografija, įvairūs spektrofotometrijos metodai [1, 18, 23, 29, 11]. Dėka biologiškai aktyvių junginių randamų
meškiniame česnake jis pasiţymi antimikrobiniu, antigrybeliniu , antiagregaciniu, priešuţdegiminiu, gastro protekciniu poveikiu [22, 6, 26, 3, 28, 19].
2.EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1. Tyrimo objektas
Etanoliniu pagrindu pagamintos meškinių česnakų (Allium ursinum L.) lapų ištraukos, kurios buvo brandintos skirtingais laiko tarpais : 24 dienas, 1 mėnesį, 6 mėnesius, 7 mėnesius, 12 mėnesių. Lapai rinkti Rumšiškių rajone.
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) uţauginto namų sąlygomis lapai. Ţaliava buvo gauta sodinant meškinių česnakų (Allium ursinum L.) šaknis su gumbais į vazonėlius skirtingomis ţemėmis, pirmame vazone buvo dedamas specialus parūgštintas ţemių mišinys (Ph- 5,5 ± 1) (Nr1), antrame vazone buvo dedama ţemė iš sodo (Ph- 7 ± 1) (Nr2). Šaknys su gumbais buvo gauti iš vietinio verslo ,,Rasoklė", Vilniaus rajonas.
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) etanolinė esencija (vietinis verslas Rasoklė).
Meškinių česnakų (Allium ursinum L.) lapai rinkti miške.
Namų sąlygomis auginta ţaliava buvo gauta iš Rasos Subačienės (vietinis verslas Rasoklė), ţaliavos gumbai buvo paimti iš nuosavo ūkio, pasėta kovo mėnesį , kultivuota balandį. Miške auginto meškinių česnakų ţaliava ( lapai) buvo rinkti iš nuosavo miško Rumšiškių rajone balandţio mėnesį. Tiriamoji metodika buvo atlikta remiantis Santos Gasparavičiūtės, Eimanto Skalandţio baigiamaisiais magistrų darbais.
2.2. Įranga
Meškinių česnakų sausos ţaliavos ekstraktas buvo gaminamas naudojant ultragarso vonelę (WiseClean), Bendras fenolinių junginių, flavanoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica , HALO DB-20)
2.3. Medţiagos ir reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., “acros organics”); Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);
Ledinė acto rūgštis (99,5 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Aliuminio chloridas (99,99 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Heksametilentetraminas (≥99,9 proc., Roth, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV); Vario (II) chlorido dihidratas (Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija); Neokuproinas (Sigma-Aldrich, Vokietija);
Amonio acetatas (Sigma-Aldrich ,Belgija);
Troloksonas (98proc., FlukaChemika ,Buchs, Šveicarija);
2.4. Meškinių česnakų ištraukų ruošimas
Skirtingo laikotarpio etanolinės meškinių česnakų (Allium ursinum L.) ištraukos buvo gaminamos įdedant kuo daugiau grynos ţaliavos, į 20 litrų stiklinį indą ir uţpilant naminiu etanoliniu tirpalu, po to laikoma tamsioje vėsioje vietoje iki vienerių metų laiko nupilant skirtingais laiko tarpais.
Namų sąlygomis uţauginto meškinių česnakų (Allium ursinum L.) lapai buvo dţiovinami ir smulkinami. Iš gautos sausos, smulkintos ţaliavos atsveriamas 1g ir kambario temperatūroje ekstrahuota į 10ml talpos kolbutę naudojant etanolio 96 proc. – distiliuoto vandens mišinį (80:20, V/V), ekstrakcija vykdoma 30 min. ultragarso vonelėje prie 30O
C, gautas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą, ištrauka laikoma kolbutėje tolimesniems tyrimams, tokiu pačiu principu ekstrahuojamas meškinis česnakas, kuris buvo surinktas miške.
Meškinių česnakų etanolinė esencija (vietinis verslas Rasoklė), buvo gaminama dedant 300 g smulkintos augalinės ţaliavos į 3 litrų stiklinį indą ir uţpilama iki viršaus naminiu etanoliniu tirpalu.
2.5. Spektrofotometriniai metodai
2.5.1. Bendras fenolinių junginių kieko išreikšto galo rūgšties ekvivalentu,
nustatymas Folin-Ciacalteu metodu
Tyrimams atlikti paruošiamas natrio karbonato 7 proc. reagentas, tirpalas ruošiamas 17,5 g natrio karbonato tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml augalinės ţaliavos
etanolinio ekstrakto , kuris sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagentu, 9 ml distiliuot vandens. Po 5 min. įpilamas 10 ml 7 proc. natrio karbonato tirpalas ir praskiedţiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Praėjus inkubaciniam laikotarpiui spektrofotometru prie 750 nm bangos ilgio matuojama tirpalo absorbcija. Matavimai kartojami tris kartus.
Etaloninis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis, tačiau vietoj meškinių česnakų ekstrakto pilamas 0,4ml distiliuoto vandens.
Lyginamieji galo rūgšties tirpalai ruošiami kaip ir tiriamajame, tik vietoje 0,4ml ekstrakto imamas 0,4 ml ţinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant 70 proc. metanolinį galo rūgšties tirpalą paruošiami penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5 ,2,0, ir 2,5 mg/ml.
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesės regresijos lygtį y=0,9068X+ 0,0617;
R2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
2.5.2. Bendro flavanoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas
spektrometriniu metodu
Gaminamas reagentas iš 4ml, 96 proc. etanolio, 0,2 ml, 33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,8 ml, 5 proc. heksametilentetraamino (5g medţiagos tirpinami 100 ml distiliuoto vandens), 0,6 ml, 10 proc. aliuminio chlorido (10g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 100 ml distiliuoto vandens), distiliuoto vandens ir 0,2 ml augalinės ţaliavos ekstrakto. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30min. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje.
Lyginamasis tirpalas gaminamas tuo pačiu metodu, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 70 proc. (v/v) etanolis.
Po 30 min. atliekami matavimai spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai atliekami 3 kartus.
Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml) rutino tirpalai. Kalibrainis rutino grafikas sudaromas iš 5 skirtingų tirpalo koncentracijų.
Duomenys vertinami pagal rutino kalibracinio grafiko regresijos lygtį y = 0.9465X - 0.0950;
R2 = 0.9960;
y = absorbcijos dydis;
2.5.3. Antioksidacinio potencialo nustatymas CUPRAC metodu
CUPRAC reagento tirpalas buvo gaunamas sumaišius vario druską (CuCl2x2H2O),
neokuproiną ((CH3)2 C12 H6N2)) ir acetaninį buferį, kurio pH=7, santykiu 1:1:1. Sumaišytas tirpalas 60 min. buvo laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. CuCl2 tirpalas buvo gaminamas atsvėrus 0,17 g CuCl2x2H2O druskos, kuri buvo tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedţiama matavimo kolboje iki 100 ml. Neokuproino tirpalas buvo gaminamas tirpinant 0,1566 g neokuproino 70 proc.. metanolyje ir skiedţiant matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml. Gaminant acetatinį buferį buvo atsverta 0,077 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinama vandenyje ir praskiesta vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml.
Po 60min į paruoštas 3 ml kiuvetes įpilama CUPRAC reagento ir 10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio ir matuojama absorbcija spektrofotometru prie 450nm bangos ilgio.
Gauti duomenys vertinami pagal Troloksono kalibracinio grafikos regresijos lygtį. y=0.3899x + 0.0908;
R2 =0.99;
y = absorbcijos dydis;
x = antioksidantinis aktyvumas;
2.6. Statistinė duomenų analizė
Gautų duomenų analizė atlikta ,,Microsoft Office Excel 2007"(Microsoft, JAV), programine įranga, Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, apskaičiavus gautų tyrimo duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį. Statistikai reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0.05.
3. REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Tyrimai buvo atliekami naudojant meškinių česnakų skirtingo laikotarpio etanolines ištraukas (24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių). Meškinių česnakų esenciją. Meškinių česnakų lapų ţaliavos uţaugintos namų sąlygomis ir rinktos miške etanolinius (80:20 V/V) ekstraktus. Tyrime nustatinėjamas bendras fenolių, flavanoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas. Fenolių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/ml, bendras flavanoidų kiekis išreikštas rutino
ekvivalentu RE mg/ml, antioksidacinis aktyvumas išreikštas TE mg/ml. Tyrimai kartoti 3 kartus (n=3), gauti rezultatai buvo statistiškai įvertinti, statistiškai reikšmingai skirtumas buvo laikomas kai p<0,05. Gauti rezultatai pateikiami 3 - 11 paveikslėlyje.
3.2. Fenolinių junginių kiekio palyginimas skirtingo brandinimo laikotarpio
ištraukose
Remiantis galo rūgšties ekvivalentu buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis, rezultatai pateikiami 3 paveikslėlyje. Didesni fenolinių junginių kiekiai nustatyti 7 mėnesius brandintoje etanolinėje ištraukoje (1,277 ± 0,06 GRE mg/ml) ir 6 mėnesius brandintoje etanolinėje ištraukoje (1,023± 0,05 GRE mg/ml), maţiausias kiekis nustatytas 24 dienų etanolinėje ištraukoje (0,616 ± 0,03 GRE mg/ml). Nors etanoliniams ekstraktams buvo naudojama iš tos pačios vietos rinkta ţaliava ir gaminta remiantis tuo pačiu principu, bendras fenolinių funginių kiekis juose skiriasi, tai galėjo įtakoti, ekstrakcijos laikas, laikymo sąlygos, temperatūra, kontaktas su šviesa, rinktos vietos ţemės kokybė, drėgmė, klimato pokyčiai, įvairūs augalų kenkėjai.
3 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuose etanolinėse ištraukose brandintose skirtingais laiko tarpais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių, išreikštas GRE mg/ml.
Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.3. Flavanoidų kiekio palyginimas skirtingo brandinimo laikotarpio ištraukose
Remiantis rutino ekvivalentu didţiausia flavanoidų koncentracija buvo aptikta etanolinėje ištraukoje, kuri buvo brandinta 7 mėnesius (0,332 ± 0,02 RE mg/ml), maţiausios koncentracijos flavanoidinių junginių nustatytos etanolinėse ištraukose, kurios buvo brandintos 24 dienas (0,147 ± 0,01 RE mg/ml) ir 12 mėnesių (0,156 ± 0,01 RE mg/ml), rezultatai pateikiami 4 paveikslėlyje.24 dienos 1 mėnesis 6 mėnesia i 7 mėnesia i 12 mėnesių Bendras Fenoliniu
junginių kiekis GRE mg/ml 0,616 0,704 1,023 1,277 0,748 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 B endra s F eno lin iu jun gini ų kiek is G RE m g /m l
4 pav. Bendras flavanoidų kiekis pateikiamas RE mg/ml tiriamose etanolinėse ištraukose
brandintose skirtingais laiko tarpais: (24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių)Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.4. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas skirtingo brandinimo laikotarpio
etanolinėse ištraukose
Įvertinus etanolinių ištraukų brandintų skirtingais laikotarpiais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių tiriamuosius ekstraktus nustatyta, kad didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi ištrauka, kuri buvo brandinta 7 mėnesius (0,577 ± 0,03 TE mg/ml), maţiausias antioksidacinis aktyvumas aptiktas 24 dienų ištraukoje (0,255 ± 0,01 TE mg/ml. Rezultatai pateikiami 5 paveikslėlyje. 24 dienos 1 mėnesis 6 mėnesiai 7 mėnesiai 12 mėnesių Bendras flavonoidinių junginių kiekis RE mg/ml 0,147 0,217 0,214 0,332 0,156 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 B endra s fla v o no idi ni ų j un gini ų kiek is RE m g /m l
5 pav. Antioksidacinis vertinimas tiriamose etanolinėse ištraukose brandintose skirtingais laiko tarpais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių, išreikštas TE mg/ml. Matavimai
atlikti tris kartus n=3
3.5. Fenolinių junginių palyginimas meškinių česnakų esencijos su namų sąlygomis
uţaugintos ţaliavos ir rinktos miške
Remiantis galo rūgšties ekvivalentu buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis, rezultatai pateikiami 6 paveikslėlyje. Didţiausias fenolinių junginių kiekis aptiktas miške rinktų lapų ekstrakte (2,093 ± 0,10 mg/ml). Namų sąlygomis uţaugintos lapų ţaliavos Nr.1 (1,597 ± 0,08 GRE mg/ml) nustatytas fenolinių junginių kiekis buvo didesnis negu namų sąlygomis uţaugintų lapų Nr.2. (1,229 ± 0,06 GRE mg/ml), maţiausias kiekis tarp lyginamųjų buvo nustatytas meškinių česnakų esencijoje (0,924 ± 0,04 GRE mg/ml). Nustatytą fenolinių junginių kiekį galėjo įtakoti: auginimo sąlygos, kultivacijos laikas , naudotas tirpiklis, dirvos kokybė.
24 dienos 1 mėnesi s 6 mėnesi ai 7 mėnesi ai 12 mėnesi ų Koncentracija TE mg/ml 0,255 0,377 0,382 0,577 0,271 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 K on ce n tr aci ja T E m g/ m l
6 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuose : meškinių česnakų esencija, namų sąlygomis užauginta lapų žaliava Nr1 ir Nr2, ir lapų žaliava rinkta miške. Kiekis išreikštas GRE mg/ml.
Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.6. Flavanoidų palyginimas meškinių česnakų esencijos su namų sąlygomis
uţaugintos ţaliavos ir miške rinktos ţaliavos
Remiantis rutino ekvivalentu didţiausia flavanoidų koncentracija buvo aptikta miške rinktų lapų ekstrakte (1,41 ± 0,07 mg/ml). Namų sąlygomis uţaugintos lapų ţaliavos Nr1 ekstrakte (1,103 ± 0,06 RE mg/ml) nustatytas didesnis flavanoidų kiekis negu namų sąlygomis uţaugintos lapų ţaliavos Nr2 (0,667 ± 0,03 RE mg/ml). Maţiausias kiekis flavanoidinių junginių nustatytas meškinių česnakų esencijoje ( 0,302 ± 0,01 RE mg/ml). Rezultatai pateikiami 7 paveikslėlyje.
Esencija Namų
Nr1
Namų
Nr2 Miško
Bendras Fenoliniu junginių kiekis GRE
mg/ml 0,924 1,597 1,229 2,093 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Be nd ras F enol in iu j un gin ių ki eki s G RE m g/m l
7 pav. Bendras flavanoidų kiekis pateikiamas RE mg/ml mėginiuose: meškinių česnakų esencija, namų sąlygomis užauginta lapų žaliava Nr1 ir Nr2, ir lapų žaliava rinkta miške. Kiekis išreikštas
RE mg/ml. Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.7. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas meškinių česnakų esencijoje, namų
sąlygomis uţaugintoje ţaliavoje ir miške rinktoje ţaliavoje
Įvertinus tiriamuosius ekstraktus didţiausiu antioksidaciniu poveikiu pasiţymėjo miške rinktų lapų ţaliavos ekstraktas (1,713 ± 0,08 TE mg/ml), maţiausias antioksidacinis poveikis nustatytas meškinių česnakų esencijoje (0,525 ± 0,03 TE mg/ml). Namų sąlygomis augintos lapų ţaliavos ekstrakto Nr1 (0,907 TE mg/ml ± 0,05 TE mg/ml) antioksidacinis poveikis buvo didesnis negu namų sąlygomis auginto ekstrakto Nr2 (0,698 ± 0,03 TE mg/ml). Rezultatai pateikiami 8 paveikslėlyje.
Esencija Namų Nr1 Namų Nr2 Miško Bendras flavonoidinių junginių kiekis RE mg/ml 0,302 1,103 0,667 1,41 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 B en d ras flavon oid in ių jun gin ių k ieki s RE m g/m l
8 pav. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas mėginiuose: meškinių česnakų esencija, namų užauginta sąlygomis lapų žaliava nr1 ir nr2, ir lapų žaliava rinkta miške. Išreikšta TE mg/ml.
Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.8. Bendras fenolinių junginių kiekio įvertinimas tiriamuose meškinių česnakų
mėginiuose
Remiantis galo rūgšties ekvivalentu buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis. Rezultatai pateikiami 9 paveikslėlyje. Didţiausias fenolinių junginių kiekis tarp visų tiriamųjų buvo nustatytas miške rinktos ţaliavos ekstrakte (2,093 ± 0,10 GRE mg/ml). Maţiausias kiekis buvo nustatytas etanolinėje ištraukoje , kuri buvo brandinta 24 dienas (0,616 ± 0,03 GRE mg/ml). Namų sąlygomis uţaugintos ţaliavos ekstraktkte Nr.1 (1,597 ± 0,08 GRE mg/ml) buvo nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis negu namų sąlygomis uţaugintos ţaliavos ekstrakte Nr2. (1,229 ± 0,06 GRE mg/ml). Skirtingo laikotarpio brandinimo etanolinėse ištraukose didesniu fenolinių junginių kiekiu išsiskiria 6 mėnesius brandinta (1,023 ± 0,05 GRE mg/ml) ir 7 mėnesius brandinta (1,277 ± 0,06 GRE mg/ml). Esencija Namų Nr1 Namų Nr2 Miško Koncentracija TE mg/ml 0,525 0,907 0,698 1,713 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Ko
ncentra
ci
ja
TE m
g
/m
l
9 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuose: etanolinėses ištraukos brandintos skirtingais laiko tarpais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių, etanolinė meškinių česnakų
esencija, namų sąlygomis užauginta lapų žaliava nr1 ir nr2, ir lapų žaliava rinkta miške. Išreikšta GRE mg/ml. Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.9. Bendras flavanoidinių junginių kiekis nustatytas tiriamuosiuose meškinių
česnakų mėginiuose
Remiantis rutino ekvivalentu buvo nustatytas bendras flavanoidų kiekis. Gauti duomenys pavaizduoti 10 paveikslėlyje. Didţiausias flavanoidų kiekis nustatytas miške rinktų lapų ekstrakte (1,41 ± 0,07 RE mg/ml), maţiausias flavanoidų kiekis aptiktas 24 dienas brandintoje etanolinėje ištraukoje (0,147 ± 0,01 RE mg/ml). Iš visų skirtingo brandinimo laikotarpio etanolinių ištraukų didţiausias flavanoidų kiekis aptiktas 7 mėnesius brandintoje ištraukoje (0,332 ± 0,02 RE mg/ml). Pakankamai nemaţi kiekiai flavanoidų taip pat buvo nustatyti namų sąlygomis uţaugintos ţaliavos lapų ekstraktuose Nr.1 (1,103 ± 0,06 RE mg/ml) ir Nr.2 (0,667 ± 0,03 RE mg/ml). Meškinių česnakų esencijoje aptiktas flavanoidų kiekis (0,302 ± 0,02 RE mg/ml) yra didesnis negu daugelio skirtingo brandinimo laikotarpio etanolinių ištraukų, išskyrus brandintos 7 mėnesius, tačiau lyginant su namų sąlygomis uţaugintų ir miške rinktų lapų ekstraktais šis kiekis nėra gausus.
24 dieno s 1 mėnes is 6 mėnes iai 7 mėnes iai 12 mėnes ių Esenc ija Namų Nr1 Namų Nr2 Miško Bendras Fenoliniu junginių kiekis
GRE mg/ml 0,616 0,704 1,023 1,277 0,748 0,924 1,597 1,229 2,093 0 0,5 1 1,5 2 2,5 B endras F enol iniu jun gi nių kie kis G R E m g/ m l
10 pav. Bendras flavanoidinių junginių kiekis tiriamuose : etanolinės ištraukos brandintos skirtingais laiko tarpais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių, etanolinė meškinių česnakų esencija, namų sąlygomis užauginta lapų žaliava nr1 ir nr2, ir lapų žaliava rinkta
miške. Išreikšta RE mg/ml. Matavimai atlikti tris kartus n=3
3.10. Bendras antioksidacinio aktyvumo vertinimas tiriamuose mėginiuose
Įvertinus visus tiriamuosius mėginius stipriausiu antioksidaciniu poveikiu pasiţymėjo miške rinktų lapų ţaliavos ekstraktas (1,713 ± 0,08 TE mg/ml), silpniausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas etanolinėje ištraukoje, kuri buvo brandinta 24 dienas (0,255 ± 0,01 TE mg/ml). Namų sąlygomis augintos lapų ţaliavos ekstrakto Nr1 (0,907 TE mg/ml ± 0,05 TE mg/ml) antioksidacinis aktyvumas buvo didesnis negu namų sąlygomis auginto ekstrakto Nr2 (0,698 ± 0,03 TE mg/ml). Tarp skirtingo brandinimo laikotarpio etanolinių ištraukų 7 mėnesių ekstraktas pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu poveikiu (0,577 ± 0,03 TE mg/ml). Gauti antioksidacinio aktyvumo rezultatai koreliuoja su aptinkamu bendru fenolinių junginių kiekiu tiriamuosiuose ekstraktuose. Rezultatai pateikiami 11 paveikslėlyje.. 24 dienos 1 mėnesi s 6 mėnesi ai 7 mėnesi ai 12 mėnesi ų Esenci ja Namų Nr1 Namų Nr2 Miško Bendras flavonoidinių junginių
kiekis RE mg/ml 0,147 0,217 0,214 0,332 0,156 0,302 1,103 0,667 1,41 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 B endras fl avonoidi nių jun gi nių kie kis R E m g/ m l
11 pav. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas tiriamuose: etanolinės ištraukos brandintos skirtingais laiko tarpais: 24 dienos, 1 mėnesis, 6 mėnesiai, 7 mėnesiai, 12 mėnesių, etanolinė meškinių česnakų esencija, namų sąlygomis užauginta lapų žaliava nr1 ir nr2, ir lapų žaliava rinkta miške. Išreikšta
TE mg/ml. Matavimai atlikti tris kartus n=3 24 dienos 1 mėnesis 6 mėnesia i 7 mėnesia i 12 mėnesi ų Esencij a Namų Nr1 Namų Nr2 Miško Koncentracija TE mg/ml 0,255 0,377 0,382 0,577 0,271 0,525 0,907 0,698 1,713 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Ko
ncentra
ci
ja
TE m
g
/m
l
4. IŠVADOS
1. Meškinių česnakų lapų ekstraktuose buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis naudojant Folin-Ciocalteu spektrofotometrinį metodą. Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuose įvairuoja nuo 0,616 GRE mg/ml iki 2,093 GRE mg/ml. Didţiausias kiekis aptiktas miške rinkos lapų ţaliavos ekstrakte (2,093 ± 0,10 GRE mg/ml). Maţiausias kiekis nustatytas meškinių česnakų
etanolinėje ištraukoje, kuri buvo brandinta 24 dienas (0,616 ± 0,03 GRE mg/ml).
2. Bendras flavanoidinių junginių kiekis tiriamuose meškinių česnakų ekstraktuose buvo nustatytas spektrofotometriniu metodu. Tiriamųjų bendras flavanoidų kiekis varijuoja nuo 0,147 RE mg/ml iki 1,41 RE mg/ml. Didţiausias kiekis, kaip ir fenolinių junginių, buvo aptiktas meškinių česnakų lapų ţaliavoje, kuri buvo rinkta miške (1,41 ± 0,07 RE mg/ml). Maţiausias kiekis nustatytas meškinių česnakų etanolinėje ištraukoje, kuri buvo brandinta 24 dienas (0,147 ± 0,01RE mg/ml).
3. Nustačius bendrą fenolinių ir flavanoidinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose spektrofotometriniu metodu pastebėta reikšminga koreliacija tarp nustatytų fenolinių junginių kiekio ir aptinkamos flavanoidų koncentracijos. Didţiausi kiekiai fenolinių ir flavanoidinių junginių rasti meškinių česnakų lapų ţaliavoje, kuri buvo rinkta miške 2,093 ± 0,10 GRE mg/ml ir 1,41 ± 0,07 RE mg/ml. Vidutiniškai randamas flavanoidinių junginių kiekis yra 2,2 karto maţesnis negu bendras fenolinių junginių kiekis.
4. Atlikus meškinių česnakų tiriamųjų mėginių antioksidacinio aktyvumo analizę taikant CUPRAC spektofotmetrijos metodą nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp fitocheminių rodiklių kiekio ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo. Pastebėta, kad kuo didesnis fenolinių junginių ir
flavanoidų kiekis ţaliavose, tuo didesnis jų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp fenolinių junginių bei flavanoidų kiekio meškinių česnakų tiriamųjų mėginių
antioksidacinio aktyvumo įvertinto CUPRAC spektrofotmetriniu metodu atitinkamai (0,951, p<0,05) ir (0,949, p<0,05). Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo meškinių česnakų lapų ţaliava, kuri buvo rinkta miške (1,713 ± 0,08 TE mg/ml).
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Gaminant etanolinę ištrauką iš meškinių česnakų lapų rekomenduojamas brandinimo laikotarpis yra 6-7 mėnesiai siekiant gauti didţiausios kokybės ištrauką turinčią didţiausią kiekį fenolinių junginių.
Ateityje rekomenduojama toliau tęsti meškinių česnakų lapų ekstraktų cheminės sudeties tyrimus norint įvertinti biologiškai aktyvių junginių sudėtį ir kiekį.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Vitkus D. Klinikinės biochemijos tyrimo metodai. Mokomoji knyga. Vilnius; 2013. p. 21-23
2. Alexieva J, MIHAYLOVA D, POPOVA A. Antioxidant capacity and thin layer chromatography of ethanol extracts of Allium ursinum L. and Allium bulgaricum L. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies. 2014;18:91-6.
3. Alina elena, Parvu & CĂTOI, Florinela & DEELAWAR, Sameera & SARUP, Darshana & Pârvu, Marcel. (2014). Anti-Inflammatory Effect of Allium ursinum</i. Notulae Scientia Biologicae. 6. 10.15835/nsb.6.1.9252
4. Al-Snafi, Ali Esmail. "Pharmacological effects of Allium species grown in Iraq. An overview." International Journal of Pharmaceutical and health care Research 1.4 (2013): 132-147 5. Bag GC, Devi PG, Bhaigyabati T. Assessment of total flavanoid content and antioxidant activity of
methanolic rhizome extract of three Hedychium species of Manipur valley. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 2015;30(1):154-9
6. Bagiu RV, Vlaicu B, Butnariu M. Chemical composition and in vitro antifungal activity screening of the Allium ursinum L.(Liliaceae). International journal of molecular sciences. 2012 Jan 30;13(2):1426-36
7. BÂRLĂ GF, POROCH-SERIŢAN M, SĂNDULEAC E, CIORNEI SE. ANTIOXIDANT ACTIVITY AND TOTAL PHENOLIC CONTENT IN ALLIUM URSINUM AND RANUNCULUS FICARIA. Food and Environment Safety Journal. 2016 Apr 15;13(4)
8. Borlinghaus J, Albrecht F, Gruhlke MC, Nwachukwu ID, Slusarenko AJ. Allicin: chemistry and biological properties. Molecules. 2014 Aug 19;19(8):12591-618.
9. Chan JY, Yuen AC, Chan RY, Chan SW. A review of the cardiovascular benefits and antioxidant properties of allicin. Phytotherapy Research. 2013 May 1;27(5):637-46.
10. Cicco N, Lanorte MT, Paraggio M, Viggiano M, Lattanzio V. A reproducible, rapid and inexpensive Folin–Ciocalteu micro-method in determining phenolics of plant methanol extracts. Microchemical Journal. 2009 Jan 1;91(1):107-10.
11. Emwas AH, Roy R, McKay RT, Ryan D, Brennan L, Tenori L, Luchinat C, Gao X, Zeri AC, Gowda GN, Raftery D. Recommendations and standardization of biomarker quantification using NMR-based metabolomics with particular focus on urinary analysis. Journal of proteome research. 2016 Jan 20;15(2):360-73.
12. Fayvush G, Aleksanyan A, Mehdiyeva NP, Alizade VM, Batsatsashvili K, Kikvidze Z, Khutsishvili M, Maisaia I, Sikharulidze S, Tchelidze D, Zambrana NY. Allium paradoxum (M. Bieb.) G. Don Allium ursinum L. Allium victorialis L. A maryllidaceae. Ethnobotany of the Caucasus. 2017:99-105.
13. Fraga CG, editor. Plant phenolics and human health: biochemistry, nutrition and pharmacology. John Wiley & Sons; 2009 Oct 22.
14. Fuchs J, Rauber-Lüthy C, Kupferschmidt H, Kupper J, Kullak-Ublick GA, Ceschi A. Acute plant poisoning: analysis of clinical features and circumstances of exposure. Clinical toxicology. 2011 Aug 1;49(7):671-80.
15. Garcia-Salas P, Morales-Soto A, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A. Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules. 2010 Dec 3;15(12):8813-26.
16. Gitin L, Dinica R, Parnavel R. The influence of extraction method on the apparent content of bioactive compounds in Romanian Allium spp. leaves. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2012 Jan 1;40(1):93.
17. GoĎevac D, Vujisić L, Mojović M, Ignjatović A, Spasojević I, Vajs V. Evaluation of antioxidant capacity of Allium ursinum L. volatile oil and its effect on membrane fluidity. Food chemistry. 2008 Apr 15;107(4):1692-700.
18. Hasmida MN, Nur Syukriah AR, Liza MS, Mohd Azizi CY. Effect of different extraction techniques on total phenolic content and antioxidant activity of Quercus infectoria galls. International Food Research Journal. 2014 May 1;21(3)..
19. Hiyasat B, Sabha D, Grötzinger K, Kempfert J, Rauwald JW, Mohr FW, Dhein S. Antiplatelet activity of Allium ursinum and Allium sativum. Pharmacology. 2009;83(4):197-204..
20. Holger Försterling F. Spin dynamics: basics of nuclear magnetic resonance. Medical Physics. 2010 Jan;37(1):406-7.
21. Khodavandi A, Harmal NS, Alizadeh F, Scully OJ, Sidik SM, Othman F, Sekawi Z, Ng KP, Chong PP. Comparison between allicin and fluconazole in Candida albicans biofilm inhibition and in suppression of HWP1 gene expression. Phytomedicine. 2011 Dec 15;19(1):56-63..
22. Kyung KH. Antimicrobial properties of allium species. Current opinion in biotechnology. 2012 Apr 1;23(2):142-7.
23. Meyer VR. Practical high-performance liquid chromatography. John Wiley & Sons; 2013 Mar 25. 24. Oszmianski J, Kolniak-Ostek J, Wojdyło A. Characterization and content of flavanol derivatives of
Allium ursinum L. plant. Journal of agricultural and food chemistry. 2012 Dec 18;61(1):176-84. 25. Özyürek M, Güçlü K, Tütem E, Başkan KS, Erçağ E, Celik SE, Baki S, Yıldız L, Karaman Ş, Apak R.
A comprehensive review of CUPRAC methodology. Analytical methods. 2011;3(11):2439-53.
26. Panche AN, Diwan AD, Chandra SR. Flavanoids: an overview. Journal of nutritional science. 2016 Jan;5.
27. Parvu M, Toiu A, Vlase L, Alina Parvu E. Determination of some polyphenolic compounds from Allium species by HPLC-UV-MS. Natural product research. 2010 Sep 10;24(14):1318-24.
28. Pavlović DR, Veljković M, Stojanović NM, Gočmanac‐Ignjatović M, Mihailov‐Krstev T, Branković S, Sokolović D, Marčetić M, Radulović N, Radenković M. Influence of different wild‐garlic (Allium ursinum) extracts on the gastrointestinal system: spasmolytic, antimicrobial and antioxidant properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2017 Sep 1;69(9):1208-18.
29. Pejatović T, Samardţić D, Krivokapić S. Antioxidative properities of a traditional tincture and several leaf extracts of Allium ursinum L.(collected in Montenegro and Bosnia and Herzegovina). Journal of Materials and Environmental Sciences. 2017:1929-34.
30. Schmitt B, Schulz H, Storsberg J, Keusgen M. Chemical characterization of Allium ursinum L. depending on harvesting time. Journal of agricultural and food chemistry. 2005 Sep 7;53(18):7288-94 31. Sobolewska D, Podolak I, Makowska-Wąs J. Allium ursinum: botanical, phytochemical and
pharmacological overview. Phytochemistry reviews. 2015 Feb 1;14(1):81-97.
32. Vlase L, Parvu M, Parvu EA, Toiu A. Chemical constituents of three Allium species from Romania. Molecules. 2012 Dec 21;18(1):114-27.
33. Wu H, Dushenkov S, Ho CT, Sang S. Novel acetylated flavanoid glycosides from the leaves of Allium ursinum. Food chemistry. 2009 Jul 15;115(2):592-5.
34. Wu H. Isolation and characterization of natural products from ginger and Allium ursinum. Rutgers The State University of New Jersey-New Brunswick; 2007.
35. Meškinių česnakų paveikslai. Prieiga per internetą:
