MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
Klinikinės farmacijos katedra
Rasa Dzedzevičiūtė
Propolio ekstrakcija nevandeniniais tirpikliais ir propolio fenolinių
junginių atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas in vitro
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė:
doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
Magistro baigiamasis darbas
Propolio ekstrakcija nevandeniniais tirpikliais ir propolio fenolinių
junginių atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas in vitro
Darbo vadovas Recenzentas
Dr. doc. Asta Marija Inkėnienė Prof. Daiva Majienė
Darbą atliko Magistrantė
Rasa Dzedzevičiūtė
TURINYS
TURINYS...3
SANTRUMPOS...5
1. ĮVADAS ...9
1. 1. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė ...10
1.2. Darbo tikslas ir uždaviniai ...10
2. LITERATŪROS APŽVALGA ...12
2.1. Propolio cheminė sudėtis, savybės, naudojimas medicinoje gydymo tikslais ...12
2.1.1. Fizinės propolio savybės ...12
2.1.2. Cheminė propolio sudėtis ...13
2.1.3. Farmakologinės propolio savybės...14
2.1.4. Vaistų formų su propoliu taikymas medicinoje ...15
2.2. Tirpikliai, jų savybės ir panaudojimas ...16
2.2.1. Tirpikliams keliami reikalavimai ...17
2.2.2. Etanolis ...17
2.2.3. Izopropilo miristatas ...18
2.2.4. Ricinos aliejus ...19
2.3. Propolio ekstrakcijai naudojami metodai ...20
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS ...21 3.1. Tyrimo medžiagos ...21 3.2. Naudota įranga ...21 3.3. Tyrimo metodai ...22 3.3.1 Gamybos metodas ...22 3.3.2. Analizės metodai ...23
3.3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu ...23
3.3.2.2. Propolio žaliavos fizinių savybių įtaka ištraukų kokybei ...24
3.3.2.3. Ekstrakcijos sąlygų įtaka propolio ekstraktų kokybei ...24
3.3.2.4. Propolio ekstraktų stabilumo įvertinimas ...25
3.3.2.5. Propolio ekstraktuose esančių fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas ...25
4. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...27
4.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ...27
4.1.1. Etanolio įtaka propolio ištraukų kokybei ...27
4.1.2. Ricinos aliejaus įtaka propolio ištraukų kokybei ...28
4.1.3. Izopropilo miristato įtaka propolio ištraukų kokybei ...28
4.1.4. Skirtingų nevandeninių tirpiklių įtakos propolio ištraukų kokybei palyginimas ...29
4.1.5. Sistemų iš ricinos aliejaus ir izopropilo miristato įtaka propolio ištraukų kokybei ...30
4.1.6. Nevandeninių tirpiklių ir jų sistemų įtakos propolio ištraukų kokybei palyginimas ...30
4.2. Smulkinimo įtaka propolio ekstraktų kokybei ...31
4.3. Ekstrakcijos sąlygų įtaka propolio ištraukų kokybei ...33
4.3.1. Maceravimo aplinkos temperatūros įtaka propolio ištraukų kokybei ...33
4.3.2 Šildymo įtaka propolio ištraukų su ricinos aliejumi kokybei. ...33
4.4. Propolio ekstraktų stabilumo įvertinimas ...34
4.5. Propolio ekstraktuose esančių fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas ...35
5. IŠVADOS ...40
Santrumpos
A/V - aliejus vandenyje
BAJ - biologiškai aktyvūs junginiai BFK - bendras fenolinių junginių kiekis I arba IPM - izopropilmiristatas
KRE - kumaro rūgšties ekvivalentas PE - propolio ekstraktas
PEE - propolio etanolinis ekstraktas R - ricinos aliejus
Tween80 - polioksietileno sorbitano monooleatas UV - ultravioletinis
SANTRAUKA
Rasos Dzedzevičiūtės magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė doc. dr. Asta Marija Inkėnienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto klinikinės farmacijos katedra – Kaunas.
Propolio ekstrakcija nevandeniniais tirpikliais ir propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas in vitro.
Darbo tikslas. Parinkti tinkamą nevandeninį tirpiklį propolio ekstrakcijai bei ekstrakcijos
sąlygas; įvertinti propolio fenolinių junginių atpalaidavimą iš skystų modelinių sistemų biofarmaciniu tyrimu in vitro.
Darbo uždaviniai. Parinkti nevandeninius propolio ekstrahentus bei įvertinti jų gebą
ekstrahuoti polifenolinius propolio junginius. Nustatyti ekstraktų kokybę lemiančius fizikocheminius rodiklius. Parinkti technologinius parametrus ir ištirti jų įtaką propolio ekstraktų kokybei. Įvertinti ekstraktų su propoliu stabilumą. Atlikti biofarmacinį tyrimą in vitro, siekiant nustatyti propolio fenolinių junginių atpalaidavimą iš skystos modelinės sistemos su tiriamuoju propolio ekstraktu (PE).
Tyrimo metodai. Ekstraktai gaminti maceracijos metodu, bendras polifenolinių junginių
kiekis (BFK) pagal kumaro rūgšties ekvivalentą (KRE) nustatytas ultravioletiniu (UV) spektrofotometru, taikant Folin-Ciocalteu metodą. Propolio ekstraktuose esančių polifenolinių junginių kiekio atpalaidavimas iš modelinių sistemų vykdytas in vitro metodu naudojant modifikuotas Franc tipo difuzines celes [4].
Rezultatai ir išvados. Tyrimo metu propolio ekstrakcijai parinkti trys nevandeniniai
tirpikliai - izopropilo miristatas (IPM arba I), ricinos aliejus (R), etanolis, bei sistemos, sudarytos iš ricinos aliejaus ir izopropilo miristato, sumaišytų masės dalimis – 25R:75I, 50R:50I ir 75R:25I. Nustatytas tiesioginis ryšys tarp propolio koncentracijos ištraukose bei BFK naudojant skirtingus tirpiklius bei sistemas. Daugiausia biologiškai aktyvių junginių (BAJ) nustatyta 30% ekstraktuose, mažiausiai – 2,5% ekstraktuose. Daugiausia polifenolinių junginių išsiskiria ekstrahuojant etanoliu, mažiausiai – ricinos aliejumi. Lyginant sistemų iš izopropilo miristato ir ricinos aliejaus įtaką BFK išsiskyrimui, geriausiai ekstrakcija vyksta sistemoje 25R:75I. Propolio smulkinimas turi įtakos klampesnių ekstrahentų ištraukų kokybei nei mažiau klampių. Naudojant klampius tirpiklius (ricinos aliejų), geriau naudoti smulkintą žaliavą, nes išsiskiria daugiau polifenolinių junginių, esant mažiau klampiems tirpikliams (IPM ar etanolis) ekstrahavimui tinkama ir nesmulkinta propolio žaliava. Nustatyta, kad ekstrakcija vyksta efektyviau naudojant pašildytus aliejus. Vertinant maceravimo
aplinkos temperatūros įtaką propolio ekstraktų kokybei, nustatyta, kad prasčiausiai maceracija vyksta šaldytuve, kiek geriau termostate, o optimaliai – natūraliomis sąlygomis, nes išsiskiria daugiausia polifenolinių junginių. Atlikus stabilumo tyrimą, nustatyta, kad ekstraktai išlieka stabilūs, jie tinkami ilgesniam laikymui ir naudojimui. Vertinant propolio BAJ atpalaidavimą iš modelinių sistemų, geriausiai išsiskyrimas vyko iš sistemos, sudarytos iš 25R:75I propolio ekstrakto ir vazelino aliejaus, prasčiausiai atpalaidavimas vyko iš sistemos, sudarytos iš 25R:75I propolio ekstrakto ir 25R:75I mišinio.
SUMMARY
Propolis extraction with non-aqueous solvents and propolis phenolic compounds release study from model systems in vitro.
The aim of the study is to find out the most appropriate non-aqueous solvent and
conditions for the propolis extraction; evaluate how propolis phenolic compounds release from the liquid model systems during the biopharmaceutical research called in vitro.
The task of the study is to evaluate the ability of non-aqueous propolis extractions to
extract poly-phenolic propolis compounds. Then find out physic-chemical characteristics which determine the quality of extracts. Next examine how selected technological parameters influence the quality of propolis extracts and evaluate the stability of propolis extracts. Conduct the biopharmaceutical research in vitro to determine the release of propolis phenolic compounds with propolis extract (PE) as an object of the study from the liquid model systems.
Research methods. Extracts were produced using the maceration method. The ultraviolet
(UV) spectrophotometer and Folin - Ciocalteu method were used to get the total quantity of poly-phenolic compounds (TFK) in accordance to the coumaric acid equivalent (KAE). The release of polyphenol compounds from the model systems in propolis extracts was carried out by in vitro method with modified Franc -type diffusion cells [4].
Results and Findings. The study of propolis extraction included three non-aqueous solvents, such as
isopropyl myristate, castor oil and ethanol), as well as, systems made up with castor oil and isopropyl myristate, mixed in such ratios: 25R:75I , 50R:50I and 75R:25I. The direct link between the concentration of propolis extracts and TFK was found using different solvents and systems. Most of
the biologically active compounds (BAC) were found in 30% of all extracts and the least – in 2.5 % of the extracts. The most polyphenolic compounds are extracted during experiments with ethanol, and the least – with castor oil. Comparing the results how different systems made of isopropyl myristate and castor oil have an impact on TFK release, the most efficient was 25R:75I system. Granulated propolis has more influence on quality of the more vicious extraction solvents extracts than on the less viscous. Granulated raw materials with viscous solvent (castor oil) produce more polyphenols compounds in less viscous solvents (IPM or ethanol) extraction of money and whole propolis material. It was found out that the extraction is more efficient when using pre-heated oils. Environmental assessment of maceration temperature on the quality of propolis extracts showed that the maceration takes place at the lowest rate in the refrigerator, but a little bit better in thermostat and the most efficiently - under natural conditions when the biggest amount of poly-phenolic compounds is emitted. Stability study revealed that the extracts still remain stable, so they are suitable for long-term storage and use. In experiment of propolis BAC release in model systems, the best separation was in the system, containing 25R:75I propolis extract and vaseline oil, the least relaxation of the system was in 25R:75I propolis extract and 25R:75I mixture.
1. ĮVADAS
Augant natūralių produktų rinkai ir alternatyviems vaistams, didėja susidomėjimas bičių produktais – medumi, žiedadulkėmis, bičių pieneliu, propoliu [16].
Apie bičių ir jų produktų naudą žinota jau gilioje senovėje, šios žinios buvo tam tikros žmonių grupės intelektinė nuosavybė bei perduodamos iš kartos į kartą. To pasekoje ir formavosi apiterapija [2].
Vienas iš naudingiausių medų nešančių bičių Apis millifera produktų yra propolis (bičių pikis). Propolis naudotas jau nuo senovės. Egiptiečiai propolį taikė kaip puvimą stabdančią medžiagą balzamuojant mirusiuosius. Graikų ir romėnų gydytojai praktikoje propolį taikė kaip antiseptiką ir žaizdų gijimą gerinančią priemonę po skarifikacijos. 17 amžiaus Londono Farmakopėjoje propolis buvo įtrauktas kaip oficiali vaistinė priemonė. Šiai dienai propolis nepraranda populiarumo, jis naudojamas vienas ir mišiniuose su kitais natūraliais produktais kosmetikoje, kaip sveiko maisto sudedamoji dalis, sveikatą gerinanti priemonė. Paskutiniaisiais dešimtmečiais mokslininkai intensyviau tyrė propolio sudėtį, biologines savybes [45].
Propolis - augalinės kilmės bičių produktas. Jis gali būti žiedadulkių kilmės – dervingas likutis po pirminio žiedaduklių virškinimo (žiedadulkių turinys, išvalytas nuo kieto žiedadulkių apvalkalo, kuris beveik nevirškinamas žmogaus virškinamajame trakte). Bei lipčiaus – jį bitės renka nuo medžių pumpurų ir kitų augalų, išskiriančių dervingas ir kvapiąsias medžiagas [53].
Bitės propolį naudoja kaip statybinę medžiagą, juo užglaisto avilio plyšius, tvirtina korius, padengia avilio sienas, siaurina avilio lataką, poliruoja korių akeles, padengia propolio sluoksniu svetimkūnius – taigi propolis avilyje yra svarbiausia higienos priemonė, padedanti bitėms apsisaugoti nuo invazinių ligų [50].
1. 1. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Preparatai, į kurių sudėtį įeina propolis bei jo ekstraktai, plačiai taikomi kosmetologijoje, taip pat odontologijos, dermatologijos, ginekologijos praktikoje. Daugiausia gaminama etanolinių propolio ekstraktų. Nevandeninius ekstraktus nesunku įterpti į hidrofobinius pagrindus ar kitus skystus nešiklius, tad ištraukų gamyba ne etanolio pagrindu atvertų dar didesnes pritaikymo galimybes. Paskutiniaisiais dešimtmečiais susidomėjimas šia žaliava tik auga. Nemažai mokslinių darbų apie propolio etanolinių ištraukų gamybos ir tyrimo metodus, cheminę sudėtį [44], tačiau yra labai mažai bandymų su aliejiniais propolio ekstraktais ir praktiškai nėra tyrimų naudojant ricinos aliejų, izopropilo miristatą bei jų mišinius propolio žaliavos ekstrakcijai. Izopropilo miristatas technologiniu atžvilgiu patogus naudoti dėl savo klampos bei savybių didinti kitų medžiagų skverbimąsi per odos raginį sluoksnį [20, 42]. Ricinos aliejus dėl savo teigiamų savybių odai plačiai taikomas kosmetikos pramonėje [8, 30].
Nėra atlikta biofarmacinių, stabilumo, biologinio aktyvumo tyrimų su tokiomis aliejinėmis ištraukomis. Šiame darbe bus tiriamos ištraukos su pastaraisiais tirpikliais, ištraukų kokybę lemiantys rodikliai bei fenolinių junginių atpalaidavimas iš modelinių sistemų su propolio ekstraktais.
Medžiagos magistro baigiamajam darbui ieškota paieškos sistemose Google Scholar, PubMed.
Naudoti raktiniai žodžiai: propolis, phenolic compouds, isopropyl myristate, castor oil, прополис.
1.2. Darbo tikslas ir uždaviniai
Tyrimo objektas: skystieji nevandeniniai propolio ekstraktai.
Darbo tikslas: Parinkti tinkamą nevandeninį tirpiklį propolio ekstrakcijai bei ekstrakcijos sąlygas;
įvertinti propolio fenolinių junginių atpalaidavimą iš skystų modelinių sistemų biofarmaciniu tyrimu
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti nevandeninius propolio ekstrahentus bei įvertinti jų gebą ekstrahuoti polifenolinius propolio junginius.
2. Nustatyti ekstraktų kokybę lemiančius fizikocheminius rodiklius.
3. Parinkti technologinius parametrus ir ištirti jų įtaką propolio ekstraktų kokybei. 4. Įvertinti ekstraktų su propoliu stabilumą.
5. Atlikti biofarmacinį tyrimą in vitro, siekiant nustatyti propolio fenolinių junginių atpalaidavimą iš skystos modelinės sistemos su tiriamuoju propolio ekstraktu.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
1 paveiksle pateikti duomenys apie mokslinių darbų su propoliu pasiskirstymą pagal dešimtmečius. Pastebima tendencija – didėjantis darbų skaičius. Vien per 2011 – 2012 metus atlikta beveik trečdalis 2001-2010 metais atliktų darbų skaičiaus. Didėjantis susidomėjimas natūraliomis žaliavomis, tarp jų ir bičių produktais, skatina mokslininkus ieškoti naujų panaudojimo sričių, pritaikyti naujesnius ir tobulesnius metodus produktų gamybai [9].
1 pav. Mokslinių publikacijų apie propolį pasiskirstymas pagal metus [9]
2. 1. Propolio cheminė sudėtis, fizinės savybės, naudojimas medicinoje gydymo
tikslais
2. 1. 1. Fizinės propolio savybės
Pagal tai, nuo kurių augalų ir kada buvo surinktas, propolis skiriasi savo išvaizda ir sudėtimi. Spalva – nuo geltonos iki tamsiai rudos ar žalios. Laikant propolio žaliava tamsėja. Kvapas – būdingas dervai, topolio ar pušų pumpurams, medui [22]. Skonis – kartus, deginantis. Kambario temperatūroje propolis yra kietas, žemesnėje nei 15°C - trapus, esant 36-38°C tampa lipnus, klampus, plastiškas, o prie 80-104°C temperatūros lydosi. Tankis – 1,112-1,180 g/cm3
. Tirpumas vandenyje mažas ir siekia iki 10%, gerai tirpsta aliejuose, eteryje, metanolyje, etanolyje (tirpumas 50-70%) [23].
2.1.2. Cheminė propolio sudėtis
Propolis yra biologiškai aktyvi medžiaga. Šiai dienai yra nustatyta daugiau nei 300 propolį sudarančių junginių. Skirtinga sudėtis priklauso nuo geografinės vietos bei rinkimo laiko, tačiau biologinis aktyvumas išlieka [29, 33, 43]. Europiniam „tuopų“ propoliui yra būdingi polifenoliniai junginiai: fenolinės rūgštys (kumaro, ferulinė, kavos) ir fenolinių rūgščių esteriai, flavonai (apigeninas, chrizinas) bei flavononai (pinocembrinas) [6]. Brazilijos „žaliajam“ Bacharis
dracunculifolia propoliui būdingos chlorogeninė rūgštis bei prenilinti cinamono rūgšties dariniai, tokie
kaip artepilinas C ir bacharinas [41]. Brazilijos „raudonojo“ propolio botaninis šaltinis - Dalbergia
ecastaphyllum, jame daugiausiai rasta izoflavonoidų ir pterokarpanų. Brazilijos „rudojo“ propolio
botaninis šaltinis - Lotus uliginosus, jame nustatyti daugelis flavonoidų bei fenolinių rūgščių esterių. Nustatytas bendras flavonoidų kiekis visose Brazilijos propolio rūšyse buvo panašus, ir sudarė apie 32% [17]. Įvairiuose šaltiniuose išskiriamos dar kelios propolio rūšys, tokios kaip „Viduržemio jūros“ ir „Kluzia“ tipai. Sudėties skirtumai sunkina žaliavos standartizavimą. Duomenys pateikiami 1 lentelėje [45].
1 lentelė. Propolio tipai, cheminės sudėties įvairovė [45]
Propolio tipas Geografinis regionas Augmenija Pagrindiniai bioaktyvūs junginiai
„Tuopų“ tipas Europa, Šiaurės Amerika, netropinio klimato Azijos regionas, Naujoji Zelandija Daugiausia Populus spp. Flavonai, flavononai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai „Žaliasis“ (Rozmarino) tipas
Brazilija Baccharis spp. p-kumaro rūgštis,
diterpeninės rūgštys „Beržų“ tipas Rusija Betula verrucosa Ehrh. Flavonai ir flavonoliai
(kitokie nei tuopų propolyje)
„Raudonasis“ tipas Kuba, Brazilija, Meksikas Dalbergia spp. Izoflavonoidai (izoflavanai, pterokarpanai) „Viduržemio jūros‘ tipas
Sicilija, Kreta, Malta, Graikija
Cupressaceae (rūšys
nenustatytos)
Diterpenai
Kluzia Kuba, Venesuela Cllusia spp. Poliprenilbenzofenonai „Ramiojo vandenyno“
tipas
Ramiojo vandenyno regionas (Taivanas, Indonezija, Okinava)
Pirminėje žaliavoje randama 40-45% dervų, 20-35% vaškų ir riebiųjų rūgščių, apie 10% eterinių aliejų, apie 5% žiedadulkių. Būtent dervose esantys biologiškai aktyvūs junginiai lemia farmakologinį aktyvumą [28].
Lietuvoje surenkama propolio žaliava priskiriama europiniam „tuopų“ tipui. Ištyrus Lietuvoje surinkto propolio sudėtį daugiausiai nustatyta kumaro, ferulo ir vanilino rūgščių [3].
Žaliavoje taip pat aptinkama mikro ir makroelementų tokių kaip kalcis, magnis, kalis, cinkas, jodas, manganas, geležis, natris, vandenyje tirpių vitaminų B1, B2, B6, C, riebaluose tirpaus
vitaminas E, riebiųjų rūgščių, fermentų [28].
2. 1. 3. Farmakologinės propolio savybės
Propolis pasižymi vietiškai anestezuojančiu, imunomoduliuojančiu, priešvėžiniu, radioprotekciniu, kraujodarą skatinančiu, antimikrobiniu, priešgrybiniu, antivirusiniu, priešdiabetiniu, priešopiniu, antiagregaciniu, antioksidaciniu, regeneraciniu, neuroprotekciniu, angiogeniniu, antiaterosklerotiniu, hepatoprotekciniu poveikiais [9, 10, 15, 17, 24].
Dėl unikalios sudėties propolio preparatai pasižymi plačiu antimikrobiniu veikimo spektru tiek prieš Gram+, tiek prieš Gram- bakterijas. Propolio preparatus galima vartoti kartu su antibiotikais, siekiant sinergistinio poveikio. Jis sustiprina streptomicino, penicilino, neomicino bei kitų antibiotikų antimikrobinį poveikį [7]. H. Shokri et al. [46] tirtas propolio ekstrakto poveikis flukonazoliui atspariam Candida glabrata makšties ir tarpvietės grybeliui. Grybelis buvo atsparus visiems flukonazolio praskiedimams, visos propolio etanolinės ištraukos pasižymėjo priešgrybiniu poveikiu. J. Beltrame Daleprane et al. [17] ištyrė tris propolio rūšis, įrodyta, kad propolis kaip prevencinė priemonė sėkmingai gali būti naudojamas siekiant užkirsti kelią aterosklerozės progresavimui dėl sudėtyje esančių polifenolinių junginių. Vienas iš vandeninio propolio ekstrakto radioprotekcinio ir kraujodarą skatinančio poveikio mechanizmų yra tas, kad ekstraktas skatina makrofagų aktyvumą gaminti interleukiną-1. Žinoma, kad interleukinas-1 stimuliuoja kamienines ląsteles ir kraujodarą. Tyrimo metu kontrolinį ir vandeninį propolio ekstraktą vartojusios pelės buvo švitintos γ spinduliais. Propolio vartojusios pelės buvo atsparesnės žalingam švitinimo poveikiui [39].
Iš visų bičių produktų propolis turi stipriausią antioksidacinį poveikį, ekvivalentišką troloksui ir askorbo rūgščiai. Veikia tris reaktyvias deguonies formas H2O2, O2_, HO.. Ši savybė gali
būti panaudota oksidacinio streso sukeltų ligų gydymui [36]. Tyrimais įrodyta, kad diabetikams, vietiškai vartojantiems propolio preparatus, pagerėja žaizdų gijimas, sumažėja opų vystymasis ir galūnių amputacijos rizika [13]. Teigiamų rezultatų pasiekta studijuojant pikio ekstrakto poveikį
Herpes simplex I tipo virusui. Nustatyta, kad efektyvumas siekia >98% ir gali būti naudojamas
vietiniam Herpes viruso infekcijos gydymui. [43].
2. 1. 4. Vaistų formų su propoliu taikymas medicinoje
Paprastai propolis gerai toleruojamas ir yra pakankamai saugus vartoti. Nepakankamai duomenų turima apie propolio vartojimą nėštumo ir žindymo laikotarpiu. Atsargiai reiktų vartoti žmonėms, alergiškiems tuopoms, spygliuočiams, salicilatams, taip pat sergantiems astma. Paprastai netoleravimas pasireiškia odos alerginės reakcijos, tačiau yra užfiksuota atvejų, kai pavartojus propolio prasidėjo ūmus inkstų nepakankamumas [14]. Rekomenduojama paros dozė 1,4mg/kg arba 70mg [9].
Dėl plataus farmakologinio poveikio, propolio produktai naudojami įvairiose srityse. Pačios pagrindinės vaistų formos su propoliu – tirpalai. Tai įvairios koncentracijos ištraukos su tirpikliais – vandeniu, etanoliu, aliejais, turinčios daugiausia išorinį panaudojimą. Didžioji dalis produktų pagaminama etanolinio ekstrakto pagrindu [41].
Ginekologijos ir proktologijos praktikoje naudojami tepalai, žvakutės su bičių propoliu. Dezinfekcijai gali būti naudojamas propolio aerozolis. Sutinkamos ir tabletuotos formos, akių lašai [2]. Odontologijoje naudojamos formos - dantų pastos [41], burnos skalavimo skysčiai įvairių tirpiklių pagrindu, apsaugantys nuo ėduonies susidarymo, periodonto ligų. stomatito, dantenų uždegimo, karieso. Preparatai tinkami tiek gydymui, tiek prevencijai [18, 25, 40]. Siekiant paskatinti žaizdų gijimo procesą, buvo sukurtos propolio ekstraktu impregnuotos antibakterinės kempinėlės [34]. Kartu su kitomis antibakterinėmis ir priešuždegiminėmis medžiagomis propolis naudojamas tvarstymo priemonėms gaminti, kurios pritaikomos gydant nudegimus, pooperacinius pjūvius, žaizdas, nubrozdinimus [52]. Išoriškai naudojami kremai bei tepalai, į kurių sudėtį įeina 10 - 50% propolio [13].
Per pastaruosius dešimtmečius inkapsuliavimas polimerinėmis medžiagomis (pvz. ciklodekstrinais) plačiai taikomi ir vaistų pramonėje. Veikliosios medžiagos apsaugomos nuo išgaravimo, tarpusavio reakcijų, oksidacijos. Nejaučiamas stiprus kvapas ar aštrus skonis, etanolio priemaišos [19, 27].
Plačiai naudojami propolio produktai ir kosmetologijoje – tai deozodorantai, priemonės po skutimosi, nuo spuogų, šampūnai, losjonai. [14]
2.2. Tirpikliai, jų savybės ir panaudojimas
Pagrindinė propolio technologinė problema – tai mažas tirpumas. Kad žaliava būtų tinkama mediciniam panaudojimui, ji turi būti išgryninta - inertiškos medžiagos pašalintos, išsaugant polifenolinę frakciją [41]. Pagrindinė užduotis yra parinkti tinkamus metodus biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimui. Tam naudojami įvairūs tirpikliai. Tirpikliai - tai medžiagos (paprastai skysčiai), gebančios ištirpinti kitas medžiagas ir sudaryti su jomis tirpalus. Vieni daugiausiai naudojamų tirpiklių yra alkoholiai - metanolis bei etanolis. Dažnai naudojamas įvarių koncentracijų etanolis – 70%, 75% [26], 90%, 96%. Didžiausią propolio bioaktyvių junginių, bet ne vaškų, kiekį išekstrahuoja 70% etanolis [29, 44, 45]. Vanduo išekstrahuoja apie 10% BAJ nuo viso propolio svorio, tuo tarpu etanolis – 50-70%, priklausomai nuo vaškų kiekio [45]. Pašarminus vandenį gerokai padidėja biologiškai aktyvių junginių išsiskyrimas [31, 32]. Kiti ekstrahentai praktikoje sutinkami rečiau, tai acetonas, heksanas, chloroformas [24], dimetilsulfoksidas [11], įvairūs aliejai – alyvuogių [3], rapsų, saulėgrąžų [49].
Mokslui nestovint vietoje, ieškoma būdų, kaip išskirti pavienius propolyje esančius junginius, atsakingus už tam tikrą farmakologinį poveikį. Vienas iš atskyrimo būdų – naudojant polimerines medžiagas β-ciklodekstrinus [35], β- ciklodekstrinai taip pat gali būti panaudojami veikliųjų medžiagų tirpumui padidinti [27].
2.2.1. Tirpikliams keliami reikalavimai
Tirpikliams yra keliami tam tikri reikalavimai - jie turi gerai tirpinti vaistines medžiagas, neturi dalyvauti cheminėse reakcijose, turi būti biologiškai nekenksmingi, netoksiški, priimtinų organoleptinių savybių (malonios spalvos, skonio ir kvapo), nebrangūs [5].
2.2.2. Etanolis
Etanolis (Spiritus vini, Spiritus aethylicus) priskiriamas nevandeniniams, lakiems tirpikliams. Tai judrus, deginančio skonio, specifinio kvapo, skaidrus, bespalvis, lakus skystis. Virimo temperatūra 78°C. Klampumas esant 20°C temperatūrai – 1,2mPa·s. Koncentracija išreiškiama tūrio procentais, kurie nurodo absoliutaus etanolio kiekį mililitrais tirpale, esant 20°C temperatūrai. Įvairių medžiagų tirpumas etanolyje priklauso nuo jo koncentracijos. Geriausiai etanolyje tirpsta nepolinės medžiagos. Gerai maišosi su vandeniu, acetonu, gliceroliu, trichlormetanu, eteriu. Tai farmakologiškai neindiferentinė medžiaga, turinti narkotizuojantį poveikį, veikia dehidratuojančiai, linkusi oksiduotis. Etanolis turi baktericidinį ir bakteriostatinį poveikį mikroorganizmams [1, 5].
1 pav. Flavonoidų kiekio ekstrakcijos priklausomybė nuo etanolio koncentracijos [47]
Priklausomybę tarp ekstrakcijai naudojamo etanolio koncentracijos ir išskirto flavonoidų kiekio iš propolio vaizduoja 1 paveikslas. Esant etanolio koncentracijai iki 75%, flavonoidų kiekis
ištraukoje didėja didėjant etanolio koncentracijai ekstrahente, nes didėja flavonoidų tirpumas. Kai etanolio kiekis tirpiklyje yra didesnis už 75%, flavonoidų išsiskyrimas lėtai mažėja iki tam tikros ribos esant 85% etanolio koncentracijai, jai toliau didėjant flavonoidų koncentracija ištraukoje ir vėl lėtai kyla [47]. Dėl šios priežasties ekonomiškiausia naudoti 70% etanolį, kuris taip pat pasirinktas šiame darbe. Ekstrahentu naudojant metanolį yra išekstrahuojama daugiau flavonoidų nei ekstrahuojant etanoliu, tačiau etanolis yra mažiau toksiškas, lengvai perdirbamas bei maišosi su vandeniu įvairiais kiekiais [5, 47].
2.2.3. Izopropilo miristatas
2 pav.Izopropilmiristato struktūrinė formulė [54]
Remiantis Europos farmakopėjos monografija, izopropilo miristatas yra skaidrus, aliejingas, neturintis spalvos skystis. Nesimaišo su vandeniu, maišosi su aliejais, spiritu, vazelino aliejumi. Tankis apie 0,853g/cm3. Klampumas 5-6 mPa·s [24].
Gaunamas reaguojant miristoil chloridui ir 2-propanoliui, pridėjus tinkamos dechlorinančios medžiagos [42].
Izopropilo miristatas priklauso odos skvarbą didinančioms medžiagoms. Jo veikimo mechanizmas pagrįstas padidėjusiu raginio odos sluoksnio lipidų judrumu ir sumažėjusiu difuziniu atsparumu skverbimuisi, kuris atsiranda dėl to, kad izopropilo miristatas skverbiasi į raginės odos lipidinį sluoksnį ir sumažina riebiųjų rūgščių ir odos glaudžiuosius ryšius [20].
Kosmetikos pramonėje taip pat naudojamas kaip minkštiklis ir slidiklis. Puikiai drėkina ir minkština odą, gerai susigeria nepalikdamas riebumo pojūčio [42]. 50% izopropilmiristato tirpalai naudojami gydant pedikuliozę [12].
2.2.4. Ricinos aliejus
Ricinos aliejus yra unikalus ricinmedžio (Ricinus communis) sėklų produktas, kurio 90% riebiųjų rūgščių sudaro ricinoleatas. Dėl savo fizikinių ir cheminių savybių ricinos aliejus naudojamas daugelyje produktų [30].
Tai klampus, bespalvis arba iki šviesiai geltonos spalvos skystis. Skonis šiek tiek aitrus. Tankis esant 20°C 0,958 g/ml, klampa 1000-1500mPa·s. Maišosi su spiritu, eteriu, ledine acto rūgštimi, chloroformu, mažai tirpus vandenyje.
Aliejus gaunamas sėklas spaudžiant šaltuoju būdu. Naudojamas kaip emulsijų stabilizatorius, paviršiui aktyvi medžiaga, odos būklę gerinanti priemonė kosmetikos pramonėje. Paprastai 5-12,5% įeina į kremų ir tepalų sudėtį.
Ricinos aliejus gali keisti kitų medžiagų skverbimąsi per odą. Medicinoje panaudojamas kaip efektyvus ir saugus vidurius laisvinantis preparatas. Atliktuose klinikiniuose tyrimuose su žmonėmis nustatytas nežymus fotosensibilizuojantis, odą jautrinantis, skatinantis paraudimą ricinos aliejaus poveikis, tačiau šie reiškiniai gali būti stipriau išreikšti žmonėms, turintiems profesinių dermatozių.
3 pav. Ricinos aliejaus struktūrinė formulė [8]
3 paveiksle pavaizduota ricinos aliejaus struktūra. Radikalas R – ricinolio rūgštis, sudaranti 87 - 90% visų riebalinių acilo grupių, kitą dalį sudaro oleino (2-7%), linolo (3-5%), palmitino (1-2%), stearino (1%), dihidrostearino (1%) rūgštys. Remiantis kitų šaltinių duomenimis, ricinos aliejuje yra lauro rūgšties, lipazės, cholesterolio, β- sitosterolio, vitamino E [8].
Palyginus su kitais augaliniais aliejais ilgai negenda ir neapkarsta, nebent būtų veikiamas aukšta temperatūra. Sėklose yra nuodingų medžiagų – ricino, ricinino bei tam tikrų alergenų, kurie yra toksiški [38].
2.3. Propolio ekstrakcijai naudojami metodai
Ekstrahavimas gali būti atliekamas pačiu paprasčiausiu būdu – maceracija. Šis metodas tradicinis, trunka nuo 2 iki 10 parų. Dažniau taikomas efektyvesnis metodas – Soksleto ekstrakcija. Ieškoma naujų ir našesnių ekstracijos metodų, kurie sąlygotų didesnį bioaktyvių propolio junginių kiekį ištraukose ir sutrumpintų ekstrahavimo laiką. Tokiais metodais gali būti ekstrakcija panaudojant mikrobangas, ultragarsinė ekstrakcija, ekstrakcija superkritiniais skysčiais, efektyvioji skysčių chromatografija [51].
Tyrimų duomenimis ekstrakcija mikrobangomis yra greitas metodas, tačiau kartu išektrahuojama daug balastinių medžiagų. Lyginant metodą su ekstrakcija ultragarsu, pastaroji pasižymi didesniu selektyvumu, trumpesniu ekstrakcijos laiku bei didesniu fenolinių junginių išekstrahavimu [24].
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
3.1. Tyrimo medžiagos
1. Propolio žaliava (UAB „Bičių korys“, Lietuva). 2. Vazelino aliejus (Sigma – Aldrich, Vokietija).
3. Natrio karbonatas, grynas > 99,5% (Carl Roth GmbH, Vokietija). 4. Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Sigma – Aldrich, Šveicarija). 5. Etanolis 96,3% V/V (Stumbras, Lietuva).
6. Emulsiklis Tween®80 (Alfa Aesar, Vokietija). 7. Ricinos aliejus (Flucka, Ispanija).
8. Izopropilmiristatas (Sigma – Aldrich, JAV).
3.2. Naudota įranga
1. Analitinės svarstyklės SBC-31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija). 2. Viskozimetras SV-10 (A&D Instruments, Japonija).
3. Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija).
4. Kaitlentė su magnetine maišykle C-MAG HS-2 (IKA, Vokietija). 5. Spektrofotometras Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, JAV). 6. Parafilmo juostelė PARAFILM® M (Sigma – Aldrich, Vokietija). 7. Maišytuvas Ultra-Turrax (Kühn-Bayer, Vokietija).
8. Mikroskopas „Motic“ su kamera „Motic Moticam 1000“ (Motic Instruments, Kinija). 9. Celiuliozinė plėvelė „Cuprophan“ (Medicell International, Didžioji Britanija).
3.3. Tyrimo metodai
3.3.1. Gamybos metodas
2 lentelė. Ekstraktų gamybos parametrai. Propolio
koncentracija (%)
Maceravimo sąlygos Naudota propolio žaliava
Tirpiklis ar sistema
2,5 Natūralios Smulkinta Etanolis
5,0 Šaldytuve Nesmulkinta Ricinos aliejus
10,0 Termostate Izopropilo miristatas
30,0 50R:50I
75R:25I 25R:75I
Ekstraktų gamybai naudotas maceracijos metodas. Išdžiovinta ir smulkinta arba nesmulkinta propolio žaliava dedama į kolbutę, užpilama atitinkamau kiekiu ekstrahento ir sandariai uždengiama parafilmu bei folija. Laikoma atitinkamomis sąlygomis septynias paras dažnai pamaišant. Ištrauka filtruojama arba centifuguojama ir dekantuojama į tamsaus stiklo talpykles, žaliava nuspaudžiama. Laikoma vėsioje vietoje. Lentelėje pateikti duomenys apie ruošiamus ekstraktus.
Ruošiami 2,5%, 5%, 10%, 30% tiramieji propolio tirpalai. Tirpikliais naudojami 70% V/V etanolis, ricinos aliejus, izopropilmiristatas bei tirpiklių mišiniai masės dalimis (sistemos sudarytos masės dalimis) – ricinos aliejus : izopropilmiristatas 50:50 (50R:50I), ricinos aliejus : izopropilmiristatas 25:75 (25R:75I), ricinos aliejus : izopropilmiristatas 75:25 (75R:25I).
Etanolinių propolio ištraukų gamyba: paruošiami 2,5%, 5%, 10% ir 30% ekstraktai tirpikliu naudojant 70% V/V etanolį. Atitinkamas smulkintos arba nesmulkintos žaliavos kiekis užpilamas ekstrahentu iki 50ml žymės, paliekama maceruotis savaitei pasirinktomis sąlygomis dažnai pamaišant. Filtruojama pro popieriaus filtrą į tamsaus stiklo talpykles. Laikoma vėsioje vietoje.
Propolio ištraukų su ricinos aliejumi gamyba: ruošiami 5%, 10% ir 30% ekstraktai. Tirpikliu naudojamas ricinos aliejus. Atitinkamas smulkitos arba nesmulkintos žaliavos kiekis užpilamas šildytu iki 50°C temperatūros arba nešildytu ricinos aliejumi iki bendros 50g masės.
Paliekama savaitei maceruotis natūraliomis sąlygomis dažnai pamaišant. Ekstraktas centrifuguojamas 10 minučių esant 4000 apsisukimų per minutę greičiu. Dekantuojama į tamsaus stiklo talpykles. Laikoma vėsioje vietoje.
Propolio ištraukų su izopropilmiristatu gamyba: ruošiami 5%, 10%, 30% tirpalai. Atitinkamas smulkintos arba nesmulkintos propolio žaliavos užpilama izopropilo miristatu iki bendros 50g masės. Septynias dienas maceruojama natūraliomis sąlygomis nuolat pamaišant. Filtruojama per kelių sluoksnių marlę į tamsaus stiklo talpykles. Laikoma vėsioje vietoje.
Propolio ištraukų, naudojant dviejų tirpiklių sistemą, gamyba: ruošiami 10% ir 30% tirpalai. Ekstrahentu naudojamas mišinys iš ricinos aliejaus ir izopropilmiristato, sumaišytų masės dalimis, atitinkamomis proporcijomis - ricinos aliejus : izopropilmiristatas 50:50 (50I:50R), ricinos aliejus : izopropilmiristatas 25:75 (25R:75I), ricinos aliejus : izopropilo miristatas 75:25 (75I:25R). 5g smulkintos arba nesmulkintos propolio žaliavos užpilama 45g mišinio. Maceruojama natūraliomis sąlygomis savaitę laiko dažnai pamaišant. Ekstraktai centrifuguojami, aliejinė fazė dekantuojama į tamsaus stiklo talpykles. Laikoma vėsioje vietoje.
3.3.2. Analizės metodai
3.3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu
Propolio ekstraktuose esančių aktyvių junginių kiekio nustatymui gali būti naudojami chromatografiniai metodai - efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, plonasluoksnė chromatografija; kapiliarinė elektroforezė. Dažniausiai yra taikomi spektrofotometriniai metodai. Jie yra paprasti, atkartojami ir gana tikslūs. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas Folin-Ciocalteu metodas, pagrįstas spalvine reakcija, kuri vyksta naudojant fenolinį Folin-Ciocalteu reagentą [1, 48].
Šarminėje aplinkoje vyksta oksidacijos – redukcijos reakcija, kurios rezultatu matomas spalvos pasikeitimas. Absorbcija matuojama esant 765nm bangos ilgiui UV spektrofotometru. Bendras fenolinių junginių kiekis skaičiuojamas pagal p-kumaro rūgšties kalibracinę kreivę (nuo 20 iki 140 μg/ml) ir išreiškiamas kumaro rūgšties ekvivalentu (KRE).
Spalvinė reakcija. Į 2ml išgryninto vandens ir 1ml Folin – CioCalteu reagento mišinį pilamas atitinkamas ekstrakto kiekis mikrolitrais arba mikrogramais. Pilama 1,5ml 20% natrio karbonato tirpalo, skiedžiama matavimo kolbutėje iki 10ml žymės išgrynintu vandeniu. Paliekama 30 minučių kambario temperatūroje, kad įvyktų reakcija. Palyginamuoju tirpalu, matuojant absorbciją, naudojamas išgrynintas vanduo [4].
3.3.2.2. Propolio žaliavos fizinių savybių įtaka ištraukų kokybei
Siekiant įvertinti propolio žaliavos fizinių savybių įtaka ištraukų kokybei buvo pasirinktas smulkumo parametras. Vienų ekstraktų gamybai naudota natūrali propolio žaliava, esanti netaisyklingos formos grūdelių pavidalu, kitiems ekstraktams gaminti pasirinkta malūnėliu iki miltelių sumalta žaliava. Gaminti tiriamieji ekstraktai su smulkinta ir nesmulkinta žaliava. Ekstrahentais naudoti 70% etanolis, ricinos aliejus, sistema 25R:75I. Po savaitės maceravimo ekstraktuose esantys biologiškai aktyvūs junginiai nustatyti spektrofotometriškai, vertinta smulkinimo įtaka.
3.3.2.3. Ekstrakcijos sąlygų įtaka propolio ekstraktų kokybei
Siekiant įvertinti ekstrakcijos sąlygų įtaką propolio ištraukų kokybei, buvo pasirinkti du rodikliai. Pirmu atveju buvo maceruojama esant skirtingai aplinkos temperatūrai. 2,5% ir 5% koncentracijų etanolinių propolio ištraukų ekstrakcija vykdyta šaldytuve (2-8°C), natūraliomis sąlygomis (20°C) ir termostate (37°C) 7 dienas dažnai pamaišant. Antru atveju lyginta ekstrahento šildymo įtaka propolio ištraukų kokybei. Ricinos aliejus šildytas iki 50°C temperatūros ir paruošti 5% propolio ekstraktai su nesmulkinta žaliava. Maceruota 7 dienas natūraliomis sąlygomis dažnai pamaišant. Ekstrakcijos sąlygų įtaka vertinta pagal BFK, nustatytą spektrofotometriškai.
3.3.2.4. Propolio ekstraktų stabilumo įvertinimas
Siekiant įvertinti propolio ištraukų stabilumą, propolio ekstraktai laikyti vėsioje vietoje tamsaus stiklo talpyklėse ir po 6 mėnesių vėl spektrofotometriškai nustatytas biologiškai aktyvių junginių kiekis, duomenys palyginti.
3.3.2.5. Propolio ekstraktuose esančių fenolinių junginių atpalaidavimo iš
modelinių sistemų tyrimas
Buvo pasirinktos dvi aliejinės sistemos ir pagaminti 30 % bičių pikio ekstraktai. Pirmu tirpikliu pasirinktas izopropilmiristatas, kitu – sistema iš 25 % ricinos aliejaus ir 75 % izopropilmiristato (25R:75I). Gaminta po 300 gramų ekstraktų.
Siekiant įvertinti gauto propolio ekstrakto įterpimo galimybę ir propolio aktyviųjų junginių išsiskyrimą iš kitų sistemų, pasirinkta paprasta emulsinė sistema aliejus – vandenyje (A/V) pagal S. Noguchi ir Y. Maeda [37].
Pagamintos dvi emulsijos (A ir B) aliejus-vandenyje (50/50), naudojant emulsiklį Tween80. Riebalinės fazės sudėtis: 30% vazelino aliejaus, 50% atitinkamo propolio ekstrakto, 20% emulsiklio.
Taip pat tirtas polifenolių išsiskyrimas iš riebalinės fazės, tam tikslui atitinkamas ekstraktas buvo maišytas su vazelino aliejumi (C ir D). Palyginimui paimti mėginiai su ekstraktais, užpiltais atitinkamu tirpikliu (E ir F).
Į stiklinę supilami atsverti tikslūs reikalingų sudedamųjų dalių kiekiai, maišoma 5 minutes elektriniu maišikliu Ultra-Turrax 600 apsisukimų per minutę greičiu iki vienalytės masės. Gaminta po 100g sistemų. Modelinių sistemų duomenys pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Gamintos modelinės sistemos ir jų sudėtys. A B C D E F Sistema Ekstraktas emulsijoje A/V Ekstraktas emulsijoje A/V Ekstraktas vazelino aliejuje Ekstraktas vazelino aliejuje Ekstraktas ekstrahente Ekstraktas ekstrahente Vanduo (g) 50 50 Vazelino aliejus (g) 15 15 75 75 Tween80 (g) 10 10 PE su 100% izopropilmiristato (g) 25 25 25 PE su 25% ricinos al. ir 75% izopropilmiristato (g) 25 25 25 Izopropilmiristatas (g) 75 56,25 Ricinos aliejus (g) 18,75
BAJ atpalaidavimo vertinimas vykdytas in vitro metodu naudojant modifikuotas Franc tipo difuzines celes [4]. 10ml tiriamosios sistemos pilta į celę su dializine natūralios celiuliozės membrana Cuprophan, kurios paviršiaus plotas 1,77 cm2. Celės merktos į 25 ml 37°C ±0,5°C temperatūros
distiliuotą vandenį, kuris naudotas kaip akceptorinė terpė. Vanduo maišytas megnetine maišykle. Po 1, 2, 3, 4 valandų imti 1ml mėginiai (paimtas kiekis kompensuotas distiliuotu vandeniu) ir nustatyti polifenoliniai junginiai spektrofotometriškai vykdant Folin-Ciocalteu reakciją.
4. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis propolio ištraukose nustatytas spektrofotometrijos metodu pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą (KRE). Tyrimai kartojami 3 kartus, rezultatai pateikiami išvedus vidurkį.
4.1.1.Etanolio įtaka propolio ištraukų kokybei
BFK nustatymas propolio etanoliniuose ekstraktuose
4 pav. BFK etanolinėse propolio ekstraktuose, išreikštas KRE mg/ml
Iš 4 paveiksle pateikto grafiko matoma tendencija didėjant propolio koncentracijai etanolinėse ištraukoje, didėja ir bendras fenolinių junginių kiekis jose. Daugiausia polifenolių išsiskiria 30% ištraukose, mažiausiai – 2,5%.
4.1.2. Ricinos aliejaus įtaka propolio ištraukų kokybei
BFK nustatymas propolio ekstraktuose su ricinos aliejumi
5 pav. BFK ištraukose su ricinos aliejumi, išreikštas KRE mg/g
Iš 5 paveiksle pateikto grafiko matoma tendencija didėjant propolio koncentracijai ricinos aliejaus ištraukoje didėja bendras fenolinių junginių kiekis. Daugiausia išsiskyrė 30% ekstraktuose, mažiausiai - 5%. Lyginant su etanolinėmis ištraukomis, fenolinių junginių išssiskyrė mažiau.
4.1.3. Izopropilo miristato įtaka propolio ištraukų kokybei
BFK nustatymas propolio ištraukose su izopropilo miristatu
6 pav. BFK ekstraktuose su izopropilo miristatu, išreikštas KRE mg/g
Iš 6 paveiksle pateikto grafiko matyti, kad biologiškai aktyvių junginių kiekis tendencingai didėja, didėjant propolio kiekiui ištraukoje. Daugiausia biologiškai aktyvių junginių išsiskyrė 30%
ekstraktuose, mažiausiai - 5%. Lyginant su etanoliniais ekstraktais, BFK yra mažesnis, tačiau didesnis nei ištraukose su ricinos aliejumi.
4.1.4. Skirtingų nevandeninių tirpiklių įtakos propolio ištraukų kokybei
palyginimas
BFK nustatymas propolio ištraukose naudojant skirtingus tirpiklius
7 pav. BFK propolio ekstraktuose su skirtingais tirpikliais, išreikštas KRE mg/g
Lyginant tyrime naudotus ekstrahentus, geriausiai BFK išekstrahuoja etanolis, o prasčiausiai - ricinos aliejus. Didėjant propolio koncentracijai ištraukose, didėja fenolinių junginių kiekis jose. Duomenys pateikti 7 paveiksle.
4.1.5. Sistemų iš ricinos aliejaus ir izopropilo miristato įtaka propolio ištraukų
kokybei
BFK nustatymas propolio ekstraktuose, naudojant sistemas iš ricinos aliejaus bei izopropilmiristato
8 pav. BFK kiekis propolio ištraukose su izopropilo miristato ir ricinos aliejaus sistemomis,
išreikštas KRE mg/g
Vertinti 10% propolio ekstraktai, ekstrahuojant sistemomis iš ricinos aliejaus ir izopropilo miristato. Iš 8 paveiksle pateikto grafiko matyti, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis išsiskiria sistemoje iš 25% ricinos aliejaus ir 75% izopropilmiristato. Sistemose 50% ricinos aliejaus ir 50% izopropilo miristato bei sistemoje 75% ricinos aliejaus ir 25% izopropilmiristato išsiskiria panašūs fenolinių junginių kiekiai.
4.1.6. Nevandeninių tirpiklių ir jų sistemų įtakos propolio ištraukų kokybei
palyginimas
BFK nustatymas 10% propolio ištraukose su skirtingais tirpikliais ir jų sistemomis
9 pav. BFK 10% propolio ekstraktuose su skirtingais tirpikliais ir jų sistemomis, išreikštas KRE
Vertinant 10% propolio ekstraktus su skirtingais tirpikliais, iš paveiksle pateikto grafiko duomenų galima teigti, kad mažiausiai biologiškai aktyvių junginių išssiskiria ekstrahuojant ricinos aliejumi, o kiek daugiau sistemoje 50I:50R ir 25I:75R, dar daugiau ekstrahuojant izopropilo miristatu, sistema 75I:25R. Daugiausiai polifenolinių junginių išsiskiria ekstrahentu naudojant etanolį, vertinant kitus ekstrahentus, nemažai polifenolinių junginių išssiskiria ekstrahuojant sistema 75I:25R, ši sistema pasirinkta BFK atpalaidavimo tyrime. Duomenys pateikti 9 paveiksle.
4.2. Smulkinimo įtaka propolio ekstraktų kokybei
BFK nustatymas skirtingo smulkumo etanoliniuose propolio ekstraktuose
10 pav. BFK etanoliniuose skirtingo smulkumo propolio žaliavos ekstraktuose, išreikštas KRE mg/g
Vertinant smulkinto ir nesmulkinto propolio įtaką 2,5% ir 5% etanolinių ekstraktų kokybei, nenustatyta reikšmingo skirtumo. Duomenys pateikti 10 paveiksle
BFK nustatymas sistemoje 25R:75I naudojant skirtingo smulkumo propolio žaliavą
11 pav. BFK skirtingo smulkumo propolio žaliavos ekstraktuose su 25R:75I sistema, išreikštas
KRE mg/g
Naudojant smulkintą propolį, fenolinių junginių išsiskiria daugiau nei nesmulkinto propolio ekstraktuose, kai ekstrahentu pasirenkama sistema 25R:75I. Duomenys apteikti 11 paveiksle.
BFK nustatymas skirtingo smulkumo propolio žaliavos ekstraktuose su ricinos aliejumi
12 pav. BFK skirtingo smulkumo propolio žaliavos ekstraktuose su ricinos aliejumi, išreikštas KRE
mg/g
Iš 12 paveiksle pateikto grafiko matoma, kad tirpikliu naudojant ricinos aliejų biologiškai aktyvių junginių išsiskiria daugiau ekstraktuose su smulkinta propolio žaliava.
Lyginant propolio žaliavos smulkumo įtaką skirtingų ekstrahentų propolio ekstrakų kokybei, galima teigti, kad smulkinta žaliava atpalaiduoja BAJ geriau už nesmulkintą tada, kai naudojami klampesni ekstrahentai, mažiau klampūs ekstrahentai gerai ekstrahuoja ir nesmulkintą žaliavą.
4.3. Ekstrakcijos sąlygų įtaka propolio ištraukų kokybei
4.3.1. Maceravimo aplinkos temperatūros įtaka propolio ištraukų kokybei
BFK nustatymas etanolinėse propolio ištraukose esant skirtingoms maceravimo sąlygoms
13 pav. BFK etanolinėse ištraukose, esant skirtingoms maceravimo sąlygoms, išreikštas KRE
mg/ml
Iš 13 paveiksle pateikto grafiko matyti, kad mažiausiai fenolinių junginių išsiskiria ekstrakciją vykdant šaldytuve (tiek 2,5%, tiek 5% ekstraktuose), daugiau polifenolių išsiskiria termostate, o daugiausia – maceruojant natūraliomis sąlygomis. Todėl ekonomiškiausia ekstrahuoti natūraliomis sąlygomis.
4.3.2. Šildymo įtaka propolio ištraukų su ricinos aliejumi kokybei
BFK nustatymas propolio ištraukose naudojant šildytą ir nešildytą ricinos aliejų
Vertinant nesmulkintos žaliavos 5% ricinos aliejaus ekstraktus, nustatyta, kad ekstrahuojant pašildytu ricinos aliejumi išsiskiria daugiau biologiškai aktyvių junginių, nei ekstrakciją vykdant nešildytu aliejumi. Duomenys pateikti 14 paveiksle.
Vertinant ekstrakcijos temperatūros įtaką propolio ištraukų kokybei, nustatyta, kad ekstrakcija geriau vyksta natūraliomis sąlygomis (ekstrahuojant etanoliu), o ekstrahuojant ricinos aliejumi, efektyviau naudoti pašildytą aliejų.
4.4.Propolio ekstraktų stabilumo įvertinimas
Propolio ekstraktų stabilumo nustatymas
15 pav. BFK propolio ekstraktuose su skirtingais tirpikliais, nustatytas šviežiose ištraukose ir po 6
mėnesių, išreikštas KRE mg/g
Iš 15 paveiksle pateikto grafiko matyti, kad visuose ekstraktuose po 6 mėnesių laikymo vėsioje vietoje BFK nežymiai sumažėjo, todėl galima teigti, kad propolio ekstraktai yra stabilūs.
4.5. Propolio ekstraktuose esančių fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių
sistemų tyrimas
Gautų emulsinių sistemų A ir B nuotraukos pavaizduotos 16 paveiksle. Tirta mikroskopu „Motic“ padidinus 100 kartų, fotografuota su kamera „Motic Moticam 1000“. Įvertinus sistemos A dispersiškumą, nustatyti dalelių dydžiai nuo 4,4 iki 9,8μm, sistemos B- nuo 0,5 iki 8μm.
25R:75I ekstrakte nustatytas BFK – 14,2mg/g, izopropilo miristato ekstrakte BFK – 19,4mg/g.
16 pav. Sistema A Sistema B
BFK atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas po 1 valandos
Po vienos valandos atpalaidavimo tyrimo, daugiausia polifenolinių junginių atsipalaidavo sistemoje D (39,5mkg/ml), mažiausiai sistemoje F (8,81mkg/ml). Geriausiai BAJ atsipalaidavo iš sistemų su vazelino aliejumi (C ir D). Biologiškai aktyvūs junginiai, esantys mišinio 25R:75I ekstraktuose geriausiai atsipalaidavo iš sistemos D su vazelino aliejumi (39,5mkg/ml), mažiau iš emulsijos A/V (sistema B, 17,5mkg/ml) ir mažiausiai iš sistemos su mišiniu 25R:75I (sistema F, 8,81mkg/ml). Vertinant izopropilo miristato ekstraktų BAJ atpalaidavimą, išsiskyrimas geriausiai vyko iš sistemos su vazelino aliejumi (sistema C, 25mkg/ml), kiek mažiau iš sistemos su izopropilo miristatu (sistema E, 20,7mkg/l), mažiausiai iš emulsijos A/V (sistema A, 1,6mkg/ml). Duomenys pateikti 17 paveiksle.
BFK atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas po 2 valandų
18 pav. BFK, išsiskyręs iš modelinių sistemų po 2 valandų, išreikštas mkg/ml
Po 2 valandų biologiškai aktyvių junginių išsiskyrė daugiau nei po 1 valandos. Daugiausia BFK nustatytas sistemoje D (49,9mkg/ml), mažiausiai – sistemoje F (15,4mkg/ml).
Iš emulsinių A/V ir propolio ekstraktų sistemų (A ir B) geriau atpalaidavimas vyko naudojant 25R:75I ekstraktą (sistema B, 21,5mkg/ml) nei izopropilo miristato ekstraktą (sistema A, 19mkg/ml). Geresnis BAJ išsiskyrimas iš sistemų su vazelino aliejumi (C ir D) taip pat nustatytas naudojant propolio ir 25R:75I mišinio ekstraktą (sistema D, 49,9mkg/ml). Vertinant, kaip BAJ išsiskiria iš sistemų su tais pačiais ekstrahentas, kurie naudoti propolio ekstrakcijai (E ir F), efektyvesnis atpalaidavimas vyko sistemoje E (35,25mkg/ml), kurią sudarė izopropilmiristatinis propolio ekstraktas, skiestas izopropilo miristatu, nei sistemoje F (15,4mkg/ml).
Vertinant izopropilo miristato ekstraktų (sistemos A, C, E) BAJ atpalaidavimą, išsiskyrimas geriausiai vyko iš sistemos su izopropilo miristatu (sistema E 35,25mkg/ml), kiek mažiau
iš sistemos su vazelino aliejumi (sistema C, 28,6mkg/l), mažiausiai skyrėsi iš emulsijos A/V (sistema A, 19mkg/ml). Biologiškai aktyvūs junginiai, esantys mišinio 25R:75I ekstraktuose geriausiai atsipalaidavo iš sistemos su vazelino aliejumi (sistema D, 49,9mkg/ml), mažiau iš emulsijos A/V (sistema B, 21,5mkg/ml) ir mažiausiai iš sistemos su mišiniu 25R:75I (sistema F, 15,4mkg/ml).
Duomenys pateikti 18 paveiksle.
BFK atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas po 3 valandų
19 pav. BFK, išsiskyręs iš modelinių sistemų po 3 valandų, išreikštas mkg/ml
Po 3 valandų tyrimo, nustatytas vis didėjantis polifenolinių junginių atpalaidavimas, bet tendencijos išliko kaip ir antrą tyrimo valandą. Daugiausia BFK nustatytas sistemoje D (68,5mkg/ml), mažiausiai – sistemoje F (16,34mkg/ml). Duomenys pateikti 19 paveiksle.
BFK atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas po 4 valandų
Ketvirtą tyrimo valandą nustatytas biologiškai aktyvių junginių atpalaidavimo mažėjimas, tačiau atpalaidavimas vyko tendencingai kaip 2 bei 3 tyrimo valandas. Daugiausia BFK išsiskyrė sistemoje D (64,9mkg/ml), mažiausiai – sistemoje F (12,4mlg/ml). Duomenys pateikti 20 paveiksle.
BFK atpalaidavimo iš modelinių sistemų tyrimas
21 pav. BFK kiekis, išsiskyręs iš modelinių sistemų, išreikštas mkg/ml
21 paveiksle pateikti duomenys apie fenolinių junginių atpalaidavimą iš tirtų modelinių sistemų. Nuo tyrimo pradžios iki 3 valandos fenolinių junginių atpalaidavimas iš sistemų didėjo, vėliau išsiskyrė mažesni kiekiai.
Geriausiai polifenoliniai junginiai skyrėsi iš 25R:75I mišinio ekstrakto ir vazelino aliejaus sistemos (D). Mažesni kiekiai skyrėsi (mažėjimo tvarka) iš sistemos E (izopropilmiristatinis propolio ekstraktas, skiestas izopropilo miristatu), sistemos C (izopropilmiristatinė propolio ekstrakto sistema su vazelino aliejumi), sistemos B (propolio ekstraktas iš 25R:75I mišinio, įterptas į A/V emulsiją), sistemos A (izopropilmiristatinis propolio ekstraktas, įterptas į A/V emulsiją), bei mažiausias BFK nustatytas sistemoje F – propolio ekstrakto su 25R:75I mišinio, skiesto ta pačia tirpiklių sistema.
Geriau BAJ atsipalaidavo iš propolio ekstrakto iš 25R:75I mišinio nei iš izopropilo miristato ekstrakto, tai parodo spektrofotometriškai nustatytas BFK.
Vertinant izopropilo miristato ekstraktų BAJ atpalaidavimą, išsiskyrimas geriausiai vyko iš sistemos su izopropilo miristatu (sistema E), kiek mažiau iš sistemos su vazelino aliejumi (sistema C), mažiausiai iš emulsijos A/V (sistema A).
Biologiškai aktyvūs junginiai, esantys mišinio 25R:75I ekstraktuose geriausiai atsipalaidavo iš sistemos su vazelino aliejumi (sistema D, 39,5mkg/ml), mažiau iš emulsijos A/V (sistema B, 17,5mkg/ml) ir mažiausiai iš sistemos su mišiniu 25R:75I (sistema F, 8,81mkg/ml).
Atlikus in vitro tyrimą galima teigti, kad propolio ekstraktus įmanoma terpti į aliejines sistemas, taip pat į emulsijas A/V.
5. IŠVADOS
1. Propolio ekstrakcijai parinkti nevandeniniai tirpikliai (etanolis, izopropilo miristatas, ricinos aliejus) bei sistemos 25R:75I, 50R:50I, 75R:25I. Spektrofotometriniu metodu nustatyta, kad geriausias iš tirtų tirpiklių, išekstrahuojantis daugiausia biologiškai aktyvių junginių yra etanolis. Daugiausia BAJ išiskyrė 30% etanoliniame ekstrakte – 30,9mg/ml pagal KRE. Geriausia sistema – 25R:75I, ja ekstrahuojant 10% propolio ekstraktus išsiskyrė 3,07mg/g biologiškai aktyvių junginių pagal kumaro rūgšties ekvivalentą.
2. Jei ekstrahuojama klampiu skysčiu, tokiu kaip ricinos aliejus, geriausia naudoti smulkintą propolio žaliavą, mažiau klampūs skysčiai (etanolis, izopropilo miristatas) gerai ekstrahuoja ir nesmulkintą žaliavą.
3. Vertinant maceravimo aplinkos temperatūros įtaką ekstraktų kokybei, nustatyta, kad geriausiai maceracija vyksta natūraliomis sąlygomis, prasčiausiai – šaldytuve, tai parodo nustatytas BFK.
4. Tyrimo metu nustatyta, kad naudojant pašildytą ricinos aliejų išsiskiria daugiau polifenolinių junginių (0,88mg/g pagal KRE) nei naudojant nešildytą aliejų (0,63mg/g pagal KRE).
5. Atlikus pakartotinį ekstraktų spektrofotometrinį nustatymą po 6 mėnesių laikymo vėsioje vietoje nustatytas nežymus biologiškai aktyvių junginių sumažėjimas. Visi ekstraktai po 6 mėnesių išliko stabilūs, todėl yra tinkami naudojimui ir ilgesniam laikymui,
6. Įterpus propolio ekstraktus į modelines sistemas, in vitro metodu nustatyta, kad geriausiai atpalaidavimas vyko iš 25R:75I mišinio ekstrakto ir vazelino aliejaus sistemos D. Mažiausiai BAJ atsipalaidavo iš 25R:75I mišinio estrakto ir 25R:75I mišinio sistemos F. Iš tirtų modelinių sistemų BAJ geriau atsipalaidavo įterpus propolio ir 25R:75I mišinio ekstraktą (sistemos B, D) nei naudojant izopropilmiristatinį propolio ekstraktą (sistemos A, C). Ekstraktai su propoliu tinkami įterpimui į įvairias aliejines sistemas, emulsijas aliejus-vandenyje.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Andrulytė D. Propolio tirpalų technologija ir kokybės vertinimas. 2011. PhD Thesis. Kauno medicinos universitetas. [Žiūrėta 2013-02-21]. Prieiga per internetą:
http://vddb.library.lt/fedora/get/LT-eLABa-0001:E.02~2011~D_20110628_151355-44926/DS.005.0.01.ETD.
2. Gendrolis A. Propolis. Kaip sveikai ir ilgai gyventi. Kaunas. 2010.
3. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural product research, 25(15), 1463-1468. 2011 June 30 [Žiūrėta
2013-02-20]. Prieiga per internetą:
http://www.tandfonline.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/doi/pdf/10.1080/14786419.2010.529440. 4. Ramanauskienė K., Žilius M., Briedis V. Rheological and biopharmaceutical studies of the
experimental propolis semisolid preparations. Medicinos teorija ir praktika 2012. T. 18 (Nr. 2),
181-188p. [Žiūrėta 2013-06-20]. Prieiga per internetą:
http://www.mtp.lt/files/medicina_TP_2012_2_str13.pdf.
5. Savickas A., Švambaris L., Bernatonis D., Aleknavičienė B., Briedis V., Buragienė I., Štakėnaitė S. Vaistų technologija (II tomas), Kaunas, Medicinos akademijos leidykla, psl 66-67. 6. Savickas A., Ramanauskienė, K., Pukalskas, A., Kasparavičienė, G., Briedis, V.,
Inkėnienė, A Žilius M. & Kasparavičius, S. The influence of solvent on the quantity and antioxidant activity of ethanolic extracts of Lithuanian propolis. chemija, 21(2-4), 118-122. 2010 [Žiūrėta 2012-11-12]. Prieiga per internetą: http://www.lmaleidykla.lt/publ/0235-7216/2010/2-4/118-122.pdf.
7. Žilius, M. Propolio emulsinio (vanduo aliejuje) kremo sudėties parinkimas, įvertinant fizikines-chemines savybes (Doctoral dissertation, Kauno medicinos universitetas). 2008 [Žiūrėta 2013-01-12]. Prieiga per internetą: http://vddb.library.lt/fedora/get/LT-eLABa-0001:E.02~2008~D_20080616_100456-54056/DS.005.0.01.ETD.
8. Andersen, F. A. Final Report on the Safety Assessment of Ricinus Communis (Castor) Seed Oil. Hydrogenated Castor Oil, Glyceryl Ricinoleate, Glyceryl Ricinoleate SE, Ricinoleic Acid, Potassium Ricinoleate, Sodium Ricinoleate, Zinc Ricinoleate, Cetyl Ricinoleate, Ethyl Ricinoleate, Glycol Ricinoleate, Isopropyl Ricinoleate, Methyl Ricinoleate, and Octyldodecyl Ricinoleate. Int J Toxicol, 26(Suppl 3), 31-77. 2007 August 24. [Žiūrėta 2013-05-27]. Prieiga per internetą:
http://web.b.ebscohost.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/ehost/detail?sid=6ba47f1f-2290-43e1-a403 27efd0640c35%40sessionmgr113&vid=1&hid=125&bdata=JnNpdGU9ZWhvc3QtbGl2ZQ%3d%3d# db=a9h&AN=27902007.
9. Ashry, E. S. H. E., Ahmad, T. A. The use of propolis as vaccine's adjuvant. Vaccine, 31(1), 31-39. 2012 December 17. [Žiūrėta 2013-08-07]. Prieiga per internetą: http://ac.els- cdn.com/S0264410X1201568X/1-s2.0-S0264410X1201568X-main.pdf?_tid=c8b6712a-b365-11e3-a88d-00000aacb35f&acdnat=1395673729_e0a378e7c1732990431794c7bae5e78d
10. Barbarić, M., Mišković, K., Bojić, M., Lončar, M. B., Smolčić-Bubalo, A., Debeljak, Ž., & Medić-Šarić, M. Chemical composition of the ethanolic propolis extracts and its effect on HeLa cells. Journal of ethnopharmacology, 135(3), 772-778. 2011 June 1. [Žiūrėta 2013-07-10]. Prieiga per internetą: http://ac.els-cdn.com/S0378874111002558/1-s2.0-S0378874111002558-
main.pdf?_tid=271a4c2a-b51c-11e3-bd3f-00000aacb35e&acdnat=1395862007_bc0c4be94459eb629314289af8ced768.
11. Barlak, Y., Değer, O., Çolak, M., Karataylı, S. C., Bozdayı, A. M., & Yücesan, F. Effect of Turkish propolis extracts on proteome of prostate cancer cell line. Proteome science, 9(1), 74. 2011 [Žiūrėta 2013-05-14]. Prieiga per internetą: http://europepmc.org/articles/PMC3286392?pdf=render 12. Barnett, E., Palma, K. G., Clayton, B., & Ballard, T. . Effectiveness of isopropyl
myristate/cyclomethicone D5 solution of removing cuticular hydrocarbons from human head lice (Pediculus humanus capitis). BMC dermatology, 12(1), 15. 2012 [Žiūrėta 2013-01-23]. Prieiga per internetą: http://europepmc.org/articles/PMC3468409?pdf=render.
13. Bogdanov, S. Propolis: Composition, health, medicine: A review. Bee Product Science, www. bee-hexagon. net, 4. 2014 February [Žiūrėta 2014-03-01]. Prieiga per internetą: http://www.bee-hexagon.net/files/file/fileE/Health/PropolisBookReview.pdf.
14. Cherbuliez, T. Apitherapy – The Use of Honeybee Products. In Biotherapy-History, Principles and Practice (pp. 113-146). Springer Netherlands. 2013 [Žiūrėta 2013-12-10]. Prieiga per internetą: http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-007-6585-6_5#page-1.
15. Cvek, J., Medić‐Šarić, M., Jasprica, I., Zubčić, S., Vitali, D., Mornar, A., Vedrina-Dragojevic I., Tomić, S. Optimisation of an extraction procedure and chemical characterisation of Croatian propolis tinctures. Phytochemical analysis, 18(5), 451-459. 2007 May 4 [Žiūrėta
2012-10-17]. Prieiga per internetą:
16. Daleprane, J. B., Abdalla, D. S. (2013). Emerging Roles of Propolis: Antioxidant, Cardioprotective, and Antiangiogenic Actions. Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine, 2013. [Žiūrėta 2013-07-16]. Prieiga per internetą: http://europepmc.org/abstract/MED/23662115
17. Daleprane, J. B., da Silva Freitas, V., Pacheco, A., Rudnicki, M., Faine, L. A., Doerr, F. A., Ikegaki M., Salazar L. A., Abdalla, D. S. P. Anti-atherogenic and anti-angiogenic activities of polyphenols from propolis. The Journal of nutritional biochemistry, 23(6), 557-566. 2013 March 20 [Žiūrėta 2013-07-15]. Prieiga per internetą: http://europepmc.org/articles/PMC3638596?pdf=render. 18. Dodwad, V., & Kukreja, B. J. Propolis mouthwash: a new beginning. Journal of Indian
Society of Periodontology, 15(2), 121. 2011 April-June [Žiūrėta 2013-04-23]. Prieiga per internetą: http://europepmc.org/articles/PMC3183661.
19. Durán, N., Marcato, P. D., Buffo, C. M. S., De Azevedo, M. M. M., & Esposito, E. Poly (-caprolactone)/propolis extract: microencapsulation and antibacterial activity evaluation. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 62(4), 287-290. 2006 August 8
[Žiūrėta 2013-04-20]. Prieiga per internetą:
http://docserver.ingentaconnect.com/deliver/connect/govi/00317144/v62n4/s9.pdf?expires=13967158 35&id=77771547&titleid=75007325&accname=Guest+User&checksum=9F9E4251929A9152CC1F7 9A806AAE640.
20. Engelbrecht, T. N., Demé, B., Dobner, B., & Neubert, R. H. H. Study of the influence of the penetration enhancer isopropyl myristate on the nanostructure of stratum corneum lipid model membranes using neutron diffraction and deuterium labelling. Skin pharmacology and physiology, 25(4), 200-207. 2012 May 16 [Žiūrėta 2013-04-19]. Prieiga per internetą: http://www.karger.com/Article/Pdf/338538.
21. European Pharmakopoeia 7th edition. 2011, p. 2287-2288.
22. Falcão, S. I., Freire, C., Vilas-Boas, M. A Proposal for Physicochemical Standards and Antioxidant Activity of Portuguese Propolis. Journal of the American Oil Chemists' Society, 90(11), 1729-1741. 2013 November [Žiūrėta 2013-12-16]. Prieiga per internetą: http://link.springer.com/article/10.1007/s11746-013-2324-y#page-1.
23. Fokt, H., Pereira, A., Ferreira, A. M., Cunha, A., & Aguiar, C. How do bees prevent hive infections? The antimicrobial properties of propolis. Current Research, Technology and Education
Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, 1, 481-4493. 2010 [Žiūrėta 2013-01-17]. Prieiga per internetą: http://www.formatex.info/microbiology2/481-493.pdf.
24. Guo, S., Fu, S., Shen, Z., Zhang, Z., & Xu, Q.. Chemical composition, biological activity and application in animal science of propolis. A review. In Proceedings of Advances in biomedical Engineering, International conference on Agricultural and biosystems Engineering (pp. 98-101). 2011 [Žiūrėta 2013-01-23]. Prieiga per internetą: http://www.ier-institute.org/2160-0589/abe1/v1-2/098.pdf. 25. Jahromi, M. Z., Toubayani, H., & Rezaei, M. Propolis: a new alternative for root canal
disinfection. Iranian endodontic journal, 7(3), 127. 2012 April 02. [Žiūrėta 2012-12-15]. Prieiga per internetą:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/pmc/articles/PMC3467135/pdf/iej-07-127.pdf.
26. Jun, X. Comparison of antioxidant activity of ethanolic extracts of propolis obtained by different extraction methods. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 84(4), 447-451. 2006
August [Žiūrėta 2013-01-23]. Prieiga per internetą:
http://onlinelibrary.wiley.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/doi/10.1002/cjce.5450840405/pdf. 27. Kalogeropoulos, N., Konteles, S., Mourtzinos, I., Troullidou, E., Chiou, A., & Karathanos,
V. T. Encapsulation of complex extracts in β-cyclodextrin: an application to propolis ethanolic extract. Journal of microencapsulation, 26(7), 603-613. 2009 November [Žiūrėta 2013-02-17]. Prieiga per internetą:
http://web.a.ebscohost.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/ehost/pdfviewer/pdfviewer?sid=f70c24cc-8253-4527-a1a3-7612fef67d1a%40sessionmgr4003&vid=2&hid=4107.
28. Lotfy, M.. Biological activity of bee propolis in health and disease. Asian Pac J Cancer Prev, 7, 22-31. 2006 [Žiūrėta 2013-02-17]. Prieiga per internetą: http://www.apocpcontrol.org/paper_file/issue_abs/Volume7_No1/Lotfy.pdf.
29. Mavri, A., Abramovič, H., Polak, T., Bertoncelj, J., Jamnik, P., Smole Možina, S., & Jeršek, B. Chemical properties and antioxidant and antimicrobial activities of Slovenian propolis. Chemistry & biodiversity, 9(8), 1545-1558. 2012 August 12 [Žiūrėta 2013-08-17]. Prieiga per internetą:
