TANACETUM VULGARE L. LAPŲ, ŽIEDYNŲ IR STIEBŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

RITA VASYLIŪTĖ

TANACETUM VULGARE L. LAP

Ų, ŽIEDYNŲ IR STIEBŲ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc

., Dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė: Prof. dr., Ramunė Morkūnienė

Data

TANACETUM VULGARE L. LAP

Ų, ŽIEDYNŲ IR STIEBŲ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc., Dr. Lina Raudonė Data

Recenzentas Data

Darbą atliko

Magistrantė Rita Vasyliūtė Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Tanacetum vulgare L. sistematika, augalo apibūdinimas, morfologiniai požymiai ir paplitimas...10

1.2. Paprastųjų bitkrėslių augalinių žaliavų cheminė sudėtis ... 11

1.3. Paprastųjų bitkrėslių preparatų farmakologinis poveikis ir panaudojimas ... 12

1.4. Fenoliniai junginiai, jų cheminė struktūra ir klasifikacija ... 14

1.5. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas, antioksidantai ... 16

1.6. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 18

2. TYRIMO METODIKA ... 20

2.1. Tyrimo objektas ... 20

2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 20

2.3. Naudota aparatūra ... 21

2.4. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 21

2.5. Tiriamųjų mėginių spektrofotometrinė analizė: ... 22

2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 22

2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 22

2.5.3. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 23

2.5.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 24

2.6. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 25

2.7. Duomenų apdorojimas ir statistinis vertinimas ... 25

3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 26

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių organuose ... 27

3.4. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių organuose (ABTS

metodas)... 35

3.5. Redukcinio aktyvumo įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių organuose (FRAP metodas)... 38

3.6. Paprastųjų bitkrėslių lapų, žiedynų ir stiebų fenolinių junginių kokybinis ir kiekybinis nustatymas ESC metodu ... 42

4. IŠVADOS ... 45

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47

SANTRAUKA

R.Vasyliūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. L. Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Tanacetum vulgare L., paprastoji bitkrėslė, fenoliniai junginiai, antioksidantinis aktyvumas, Folin – Ciocalteu, ABTS, FRAP.

Pavadinimas: Tanacetum vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.

Tyrimo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių Tanacetum vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą augalo vegetacijos metu.

Darbo uždaviniai: nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį Tanacetum vulgare L. lapuose, žiedynuose ir stiebuose vegetaciniais tarpsniais; ištirti T. vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą (antiradikalinį ir redukcinį); nustatyti T. vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Tyrimo objektas: natūraliai Lietuvoje augančių bitkrėslių lapai, žiedynai ir stiebai.

Tyrimo metodai: bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas nustatyti spektrofotometriniais metodais; fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

SUMMARY

R.Vasyliūtė master‘s thesis/ research supervisor assoc. prof. dr. L. Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. Kaunas.

Keywords: Tanacetum vulgare L., Common tansy, phenolic compounds, antioxidant activity, Folin – Ciocalteu, ABTS, FRAP.

Title: Research of phenolic compounds and antioxidant activity in leaves, inflorescences and stems of Tanacetum vulgare L.

The aim of the research: to investigate the phenolic content and antioxidant activity variation in Lithuania naturally growing Tanacetum vulgare L. leaves, inflorescences and stems extracts during the vegetation period.

Tasks of the research: to determine the total content of phenolic compounds and flavonoids in Tanacetum vulgare L. leaves, inflorescences and stems during vegetation period; to investigate the antioxidant activity (antiradical and reducing) of T. vulgare L. leaves, inflorescences and stem extracts; to evaluate qualitative and quantitative composition of individual phenolic compounds in leaves, inflorescences and stems.

Research object: leaves, inflorescences and stems of Tanacetum vulgare L. growing naturally in Lithuania.

Research methods: the total content of phenolic compounds, of flavonoids and antioxidant activity is determined by spectrophotometric methods; qualitative and quantitative evaluation of phenolic compounds is determined by high performance liquid chromatography analysis.

The results and conclusions: the highest amount of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity in T. vulgare L. leaves and stems were determined in period of massive flowering; the highest amount of phenolic compounds in extract of inflorescences was at the beginning of the flowering period, the highest amount of flavonoids and antioxidant activity were determined in period of massive flowering. Leaves accumulate the highest amounts of phenolic compounds and flavonoids and have the highest antioxidant activity. It was found that the highest amounts of phenolic compounds in the leaves and inflorescences were collected on the slope of the gravel careers and the highest amount of flavonoids in the forest edge; the dominant phenolic compounds during mass flowering in

T. vulgare L. leaves, inflorescences and stems are luteolin-7-glucoside, chlorogenic acid and 3,5-

SANTRUMPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. effective liquid chromatography) UV- ultravioletinė spinduliuotė (angl. ultraviolet radiation)

ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) RNS - reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species)

VAP - vandenilio atomo perdavimo reakcijos (angl. hydrogen atom transfer mechanisms) EP - elektrono perdavimo reakcijos (angl. electron transfer mechanisms)

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas ABTS - 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolino-6-sulfono rūgštis)

FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. ferric reducing antioxidant power)

CUPRAC - vario redukcijos antioksidantinė galia (angl. cupric ion reducing antioxidant capacity) TRAP - bendras radikalų gaudyklės parametro nustatymo metodas (angl. total radical-trapping

antioxidant parameter)

HORAC – hidroksilo radikalų antioksidantinė galia (angl. hydroxyl radical antioxidant capacity) ORAC - deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. oxygen radical absorbance capacity)

WGS – globalinė geocentrinė koordinačių sistema (angl. World Geodetic System) ANOVA- vienfaktorinė dispersinė analizė (angl. analysis of variance)

GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. gallic acid equivalents)

ĮVADAS

Paprastoji bitkrėslė (lot. Tanacetum vulgare L.) – tai žolinis, daugiametis, aromatingas, vaistinis, astrinių šeimos augalas, plačiai paplitęs šiauriniame pusrutulyje, auga Azijoje, Europoje, Šiaurės Afrikoje ir Amerikos srityse [1]. Augalas nuo seno naudojamas tradicinėje medicinoje kaip antihelmitinė, antibakterinė, apetitą skatinanti ir diuretinė priemonė [2, 3]. Ekstraktai šiuolaikinėje medicinoje taip pat naudojami kaip priemonė reumatui, virškinimo sutrikimams ir žaizdoms gydyti, bei pasižymi priešuždegiminiu, antioksidantiniu, vazodilataciniu aktyvumu [3, 7]. Bitkrėslių augalinių žaliavų farmakologinį poveikį lemia kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai: eteriniai aliejai, nelakūs seskviterpeniniai laktonai, fenoliniai junginiai. Eteriniai aliejai sąlygoja antibakterinį ir antihelmitinį paprastųjų bitkrėslių augalinių žaliavų veikimą, tuo tarpu vazodilatacinį ir stiprų antioksidantinį aktyvumą lemia fenoliniai junginiai [2, 19].

Fenoliniai junginiai, kaip natūralios medžiagos pasižyminčios stipriu antioksidantiniu aktyvumu, plačiai naudojami įvairiose pramoninėse srityse: medikamentų, maisto priedų, kosmetikos gamyboje [5].

Fenoliniai junginiai, augalų antriniai metabolitai, atlieka svarbų vaidmenį apsaugodami augalus nuo stresinių sąlygų [5]. Viso vegetacinio laikotarpio metu fenolinių junginių biosintezė augaluose kinta priklausomai nuo augalų amžiaus, sezoninių pokyčių (temperatūros, drėgmės ir šviesos kiekio), ontogenezės fazės, bei agrikultūrinės praktikos ir dirvožemio ypatumų [4, 5].

Moksliniuose šaltiniuose nėra daug duomenų apie fenolinių junginių įvairavimą paprastųjų bitkrėslių žaliavose vegetacijos periodu. Siekiant surinkti kokybišką augalinę žaliavą, pasižyminčią dideliu fenolinių junginių kiekiu ir stipriu antioksidantiniu aktyvumu, svarbu nustatyti optimalų žaliavos rinkimo laiką. Šiuo tikslu įvertintas vegetaciniu laikotarpiu fenolinių junginių įvairavimas ir antioksidantinis aktyvumas paprastųjų bitkrėslių skirtinguose antžeminiuose organuose, surinktuose iš natūralių augaviečių.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių Tanacetum vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą augalo vegetacijos metu.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį Tanacetum vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų ekstraktuose.

2. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį T. vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų ekstraktuose. 3. Nustatyti T. vulgare L. lapų, žiedynų ir stiebų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą.

1.

LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 . Tanacetum vulgare L. sistematika,

augalo apibūdinimas, morfologiniai

požymiai ir paplitimas

Sistematika:

o Karalystė: Augalai (Plantae)

o Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) o Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) o Poklasis: Astražiedžiai (Asteridae) o Eilė: Astriečiai (Astrales)

o Šeima: Astriniai (Asteraceae) o Gentis: Bitkrėslė (Tanacetum L.)

o Rūšis: Paprastoji bitkrėslė (Tanacetum vulgare L.) [6]

Tanacetum genčiai priskiriama apie 160 žiedinių augalų rūšių [7]. Paprastoji bitkrėslė (lot. Tanacetum vulgare L., angl. Common tansy) priklauso astrinių (lot. Asteraceae, sinon. Compositae)

augalų šeimai. Tai daugiametis bitkrėslės genties žolinis augalas, galintis užaugti iki 30 – 120 cm aukščio [8].

Augalo šakniastiebis yra 1 - 2,5 cm skersmens, šliaužiantis, sumedėjęs, išsišakojęs ir galintis išauginti keletą stiebų. Stiebas status, briaunuotas, prie pagrindo dažniausiai būna rausvai dryžuotas. Viršūnėje stiebas išsišakoja į graižus [8].

Graižai susitelkę į tankią skydišką šluotelę. Šluotelę gali sudaryti iki 100 graižų, turinčių daugybę tamsiai geltonų vamzdiškų žiedų. Pusrutulio formos graižų skersmuo yra 5 - 8 mm [8, 9].

Augalo lapai pražanginiai, plunksniškai suskaldyti, turi trumpus, retus plaukelius, su taškelių pavidalo liaukutėmis. Apatiniai augalo lapai kotuoti, viršutiniai - bekočiai.

Bitkrėslių vaisiai yra smulkūs lukštavaisiai, žalsvai/ rusvai pilkos spalvos. Vaisių viršūnėlės yra su dantytomis karūnėlėmis [8, 10].

Paprastosios bitkrėslės žydi liepos - rugpjūčio mėnesiais. Priklausomai nuo klimato, gali žydėti ilgiau [8].

Augalą identifikuoti galima remiantis morfologiniais požymiais, bei organoleptinėmis savybėmis. Bitkrėslės skleidžia stiprų specifinį kvapą dėl kaupiamų eterinių aliejų, bei turi kartų skonį [8].

1 pav. Paprastoji bitkrėslė (Tanacetum vulgare L.) [8]

Lietuvoje yra tik viena natūraliai auganti Tanacetum genties rūšis – Tanacetum vulgare L. (sinon. Chrysanthenum vulgare L.). Augalas plačiai paplitęs visoje šalyje, tačiau rečiau sutinkamas šiaurinėje Lietuvos dalyje. Yra randamos dvi augalo variacijos: var. vulgare ir var. crispum [11, 12].

Paprastųjų bitkrėslių natyvinės populiacijos yra Europoje ir Azijoje. Kadangi bitkrėslės gali daugintis natūraliai ir augti kaip laukinis augalas, arba būti kultivuojamos, jos buvo pristatytos kitose pasaulio šalyse. Pastebėta, kad paprastosios bitkrėslės gali natūraliai augti vidutinio klimato zonoje, todėl tapo invazinėmis kituose pasaulio žemynuose [1, 13].

Paprastųjų bitkrėslių populiacija natūraliose augimvietėse būna tanki ir užima ribotą teritoriją (tvoros linija, geležinkelis, žvyro duobė). Auga pakelėse, upių šlaituose ir dykvietėse. Didžiojoje Britanijoje bitkrėslės vyrauja dirvožemio sluoksnyje atsiradusiuose plyšiuose ar griuvėsiuose. Augalas taip pat aptinkamas smėlio kopose, pelkėse, miškingose vietovėse ir pievose. Upės ir ežero krantuose bitkrėslių populiacija tankiausia, vidutinio ir mažo tankumo populiacijos randamos ganyklose [14].

Augalas toleruoja įvairų klimatą, tačiau sėklos lengviau dygsta šaltame klimate [14].

Paprastosios bitkrėslės mėgsta priemolio ir smėlio dirvožemį, auga mažo ir didelio derlingumo dirvožemyje, saulėtoje vietoje [12, 14].

1.2 .

Paprastųjų bitkrėslių augalinių žaliavų cheminė sudėtis

Eteriniai aliejai. Lietuvoje augančių paprastųjų bitkrėslių eteriniame aliejuje identifikuotas 41 eterinio aliejaus komponentas [11]. Nustatyti keturi eterinio aliejaus chemotipai: 1,8-cineolis (23.6– 6.3 proc.), trans-tujonas (35.7–78.4 proc.), kamparas (19.8–61.8 proc.) ir mirtenolis (13.1–24.9 proc.) [1, 11]. Nustatyta, kad iš T. vulgare L. žiedynų gautas eterinis aliejus turi didesnį kiekį pagrindinių sudedamųjų dalių, nei eterinis aliejus gautas iš bitkrėslių lapų [11].

Flavonoidai. Antžeminėse bitkrėslių žaliavose nustatyti flavonoidai: apigeninas, liuteolinas, liuteolino-7-gliukozidas, 6-hidroksiliuteolinas, skutelareinas, akacetinas, cinarozidas, jaceidinas, eupatilinas. [16, 55].

Fenolinės rūgštys. Antžeminėse bitkrėslių žaliavose nustatytos fenolinės rūgštys: chlorogeno, neochlorogeno, kavos, 3,5-dikafeoilchino, 4,5-dikafeoilchino, ferulo. [16].

Triterpenai. Bitkrėslių žolėje nustatyti triterpenai: α-amirinas, β-amirinas [17].

Seskviterpeniniai laktonai. Žolėje nustatyti seskviterpeniniai laktonai: chrisaninas, tamarinas, tanachinas, tavulinas, tanacetinas, kostunolidas, partenolidas. Taip pat nustatytas nelakus seskviterpeninis alkoholis - tanacetolis [16].

Steroliai. T. vulgare L. žolėje nustatytas β-sitosterolis, stigmasterolis, kampesterolis, cholesterolis [17].

Karotenoidai. Žiedynuose nustatytas violaksantinas, liuteinas, β-karotenas, α-kriptoksantinas [47].

Polisacharidai. Bitkrėslių žieduose nustatytas polisacharidas – tanacetanas [52]. Žieduose tanacetaną sudaro pagrindiniai monosacharidai: D-galakturono rūgštis (61.4 proc.), arabinozė (14.7 proc.), galaktozė (10.2 proc.) ir ramnozė (3.7 proc.) [53].

Alkaloidai: T. vulgare L. žolėje nustatytas arekolinas ir peleterinas [54].

1.3 .

Paprastųjų bitkrėslių preparatų farmakologinis poveikis ir panaudojimas

Paprastoji bitkrėslė (Tanacetum vulgare L.) yra gerai žinomas tradicinėje medicinoje vaistinis augalas [7]. Iš bitkrėslių pagaminta arbata liaudies medicinoje naudojama kaip antihelmitinė, antispazminė, stimuliuojanti pilvo ertmėje esančius vidaus organus, antidiabetinė, diuretinė ir antihipertenzinė priemonė [7, 13, 18]. Išoriškai bitkrėslių lapų ir žiedų užpilo vonelės ar kompresai buvo naudojami sausgyslių patempimams ir reumatiniams sąnarių skausmams malšinti, taip pat mėlynėms ir žaizdoms gydyti [26].

Moksliniais tyrimais įrodytas T. vulgare L. antihelmitinis aktyvumas prieš Schistosoma

mansoni parazitines kirmėles, kurios sukelia šistosomatozę. Antihelmitinį veikimą lemia augalų

gali sukelti traukulius [30]. Nėščioms moterims paprastųjų bitkrėslių užpilus naudoti draudžiama, kadangi augalas gali sukelti vaisiaus praradimą [16, 26]. Paprastųjų bitkrėslių vandeninio ekstrakto, galinčio sukelti nepageidaujamas ir toksiškas reakcijas, dozė yra 9g/kg kūno svorio [30].

Tanacetum vulgare L. diuretinį poveikį pagrindė Sanaa Lahlou ir kiti mokslininkai atlikę

tyrimą paprastųjų bitkrėslių lapų vandeninio ekstrakto diuretiniam, saliuretiniam ir kaliuretiniam aktyvumui įvertinti. Tyrimas buvo atliekamas su laboratorinėmis žiurkėmis. Rezultatai buvo palyginti su kontroline grupe (pelės buvo girdomos vandeniu 10ml/kg) ir vaisto furozemido (10 mg/kg) sukeliamu poveikiu. Paprastųjų bitkrėslių lapų vandeninis ekstraktas padidino Na+ _{ir K}+ jonų

išsiskyrimą su šlapimu. Tuo tarpu furozemidas padidino tik Na+ ekskreciją. Nustatyta, kad augalinio

ekstrakto poveikyje išskiriamo šlapimo kiekis buvo didesnis, nei kontrolinės grupės, tačiau nesiskyrė nuo vaisto furozemido poveikyje išskiriamo šlapimo kiekio. Mokslininkų išvada - Tanacetum vulgare L. lapų ekstraktai veikia diuretiškai ir nesukelia nepageidaujamų reakcijų ar toksiškumo inkstams [24].

Moksliniu tyrimu įrodyta, kad Tanacetum vulgare L. vandeniniai lapų ekstraktai sukelia vazodilatacinį poveikį. Tyrimas buvo atliktas in vitro Tanacetum vulgare L. vandeniniais ekstraktais paveikiant laboratorinių žiurkių aortą. Ekstrakte esantys junginiai: taninai, terpenoidai ir flavonoidai, manoma suteikė vazodilatacinį poveikį [23].

Paprastosios bitkrėslės naudojamos ne tik tradicinėje medicinoje [25]. Paprastosios bitkrėslės yra sudedamoji dalis augalinio imunomoduliacinio preparato „Setarud“ (IMODTM), skirto Irane ŽIV infekcija sergantiems pacientams gydyti. Šio preparato sudėtyje esanti Tanacetum vulgare L. naudojama, siekiant pacientams sumažinti uždegiminius simptomus [27, 28]. Jungtinių Amerikos valstijų farmakopėjoje Tanacetum vulgare L. yra nurodyta kaip priemonė peršalimui ir karščiavimui gydyti [25].

Tanacetum vulgare L. antžeminės dalies atlikti moksliniai tyrimai parodė, kad gausus augale

esančių fenolinių junginių kiekis pasižymi antioksidantinėmis savybėmis [7]. Augale nustatyti antioksidantiniai junginiai - 3,5-dikafeoilchino rūgštis ir aksilarinas - buvo pagrindiniai junginiai, kurie pasižymėjo antivirusiniu aktyvumu prieš Herpes simplex virusus [22, 29].

1.4 .

Fenoliniai junginiai, jų cheminė struktūra ir klasifikacija

Fenoliniai junginiai – tai antriniai augalų metabolitai, kurie apsaugo augalus nuo ultravioletinės spinduliuotės, patogenų, parazitų ir plėšrūnų, pritraukia apdulkintojus, skatina atsparumą ligoms, apsaugo nuo reaktyviosios deguonies formos, susidarančios, kai augaluose dėl aplinkos poveikio sutrinka aerobinis ar fotosintetinis metabolizmas [31, 32].

Fenoliniai junginiai pasižymi antialerginiu, antiarterogeniniu, priešuždegiminiu, antimikrobiniu, antioksidantiniu, prieštrombotiniu, kardioprotekciniu, priešvėžiniu ir vazodilataciniu poveikiais [33]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad fenoliniai junginiai naudingi daugelio degeneracinių ligų prevencijai ir gydymui [34, 56].

Fenoliniai junginiai augaluose sintezuojami šikimato rūgšties metaboliniame kelyje. Šis kelias yra endogeniškai kontroliuojamas. Taip pat reguliuojamas išoriniais veiksniais: šviesa, temperatūra [32].

Fenolinių junginių struktūra pasižymi didele įvairove. Struktūra sudaryta iš vieno ar kelių aromatinių žiedų, prie kurių prisijungę viena ar daugiau hidroksilo grupių [31]. Vienas hidroksilintas aromatinis žiedas gali konjuguotis su cukrumi ar organinėmis rūgštimis, sudarydamas sudėtingesnes fenolinių junginių struktūras. Priklausomai nuo struktūros, fenoliniai junginiai skirstomi į keturias pagrindines klases: fenolinės rūgštys, stilbenai, lignanai, flavonoidai [32].

Fenolinės rūgštys skirstomos į du poklasius: hidroksibenzenkarboksirūgšties (C6 – C1) ir

hidroksicinamono rūgšties (C6 - C3) darinius [32]. Fenolinių rūgščių struktūros pavaizduotos 1

lentelėje. Hidroksicinamono rūgšties dariniai yra plačiai paplitę augaluose ir jų produktuose: grūduose, kavoje, vaisiuose. Hidroksicinamono rūgštys dažniausiai būna konjuguotose ir esterių formose [57]. Chlorogeno rūgštis - hidroksicinamono rūgščių (kavos ir chino) esteris, būdingas astrinių šeimos augalams [48, 58].

1 lentelė. Fenolinių rūgščių struktūra

Fenolinės rūgštys Struktūros pagrindas Radikalai Junginiai

Hidroksicinamono rūgšties dariniai -H -H -OCH3 -OCH3 -H -OH -H -OCH3 p-kumaro rūgštis kavos rūgštis ferulo rūgštis sinapo rūgštis

Stilbenai – nedidelė fenilpropanoidų grupė, kuriai būdingas 1,2-difeniletileno struktūros pagrindas (C6 - C2 - C6) (2 pav.). Dauguma augaluose aptinkamų stilbenų yra trans - resveratrolio

dariniai. Augaluose stilbenai atlieka fitoaleksinų funkciją. Fitoaleksinus augalai gamina metabolizmo būdu apsaugai nuo patogenų, bakterijų ir grybų [32].

2 pav. Stilbenų struktūros pagrindas

Lignanai ([C6 - C3]2) – fenolinių junginių klasė, viena iš fitoestrogenų grupių. Kaip ir kiti

fenoliniai junginiai, lignanai veikia kaip antioksidantai. Jų struktūros pagrindą sudaro dvi sujungtos cinamono rūgšties mikromolekulės (3 pav.) [32].

3 pav. Lignanų struktūros pagrindas

Flavonoidai – tai labiausiai paplitusi fenolinių junginių klasė [49]. Augaluose flavonoidai sintezuojami citozolyje, iš kurio transportuojami kauptis į vakuoles. Flavonoidų biosintezės mechanizmas ir transportavimas augalo ląstelės dalyse yra ištirtas, tačiau flavonoidų transportavimo mechanizmas augalo audiniuose nežinomas [50, 51].

Flavonoidų struktūros pagrindą sudaro difenilpropano skeletas (C6 - C3 - C6). Tai trijų žiedų

naringeninas), flavan-3-oliai (katechinas, epikatechinas) ir antocianinai (apigenidinas, cianidinas). Dalį sudaro chalkonai, auronai ir biflavonoidai [31, 32, 49].

4 pav. Flavonoidų klasių struktūrų pagrindai [32]

Didelę flavonoidų struktūros įvairovę lemia šių junginių metoksilinimas, glikozilinimas ir hidroksilinimas. Hidroksilo grupės atlieka esminį vaidmenį funkcinėje flavonoidų veikloje. Kuo didesnis hidroksilo grupių skaičius molekulėje, tuo didesnis junginio antioksidantinis aktyvumas [32].

1.5 . Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas, antioksidantai

Laisvieji radikalai – tai molekulė arba molekuliniai fragmentai, kuriuose yra vienas ar daugiau nesuporuotų elektronų išorinėje atominėje arba molekulinėje orbitoje ir yra pajėgūs nepriklausomai egzistuoti. Tai medžiagos, kurios susidaro žmogaus kūne medžiagų apykaitos proceso metu. Laisvieji radikalai gali būti formuojami iš endogeninių ir egzogeninių medžiagų. Aerobinio ir anaerobinio proceso metu oksiduojasi baltymai, riebalai ir angliavandeniai sudarydami laisvuosius radikalus. Jie nuolat formuojasi ląstelėje ir susidaro aplinkoje dėl pesticidų, jonizuojančiosios spinduliuotės, alkoholio vartojimo, cigarečių dūmų, UV spinduliuotės, sunkiųjų metalų, oro užterštumo. Laisvieji radikalai dažniausiai sukelia grandinines reakcijas, regeneruodami radikalą, kuris gali pradėti naują reakcijų ciklą. [35, 36].

Laisvieji radikalai yra skirstomi į reaktyvias deguonies formas (ROS) ir reaktyvias azoto formas (RNS). ROS ir RNS gali sudaryti radikalinius ir neradikalinius junginius. Radikaliniai junginiai yra reaktyvesni, bei mažiau stabilūs, nei neradikaliniai junginiai [36].

ROS ir RNS radikalinėms formoms priskiriama:

Flavonoliai Flavanonai

Antocianinai Flavonai Izoflavonai

• superoksido anijonas (O2•-)

• hidroksilo radikalas (OH•₎

• peroksilo radikalas (RO2•)

• hidroperoksilo radikalas (HO2•)

• alkoksilo radikalas (RO•₎

• azoto oksido radikalas (NO•₎

• azoto dioksido radikalas (NO2•)

• lipidų peroksilo radikalas (LOO•₎

Svarbiausi ROS ir RNS neradikaliniai junginiai: • vandenilio peroksidas (H2O2)

• hipochlorito rūgštis (HOCl) • ozonas (O3)

• singletinis deguonis (1_O 2)

• peroksinitrito anijonas (ONOO-₎

• diazoto trioksidas (N2O3) [36].

Reaktyvios deguonies formos įprastai gaminasi gyvuose organizmuose ląstelių metabolizmo metu. Susidariusi didelė ROS koncentracija sukelia nepageidaujamas ląstelių lipidų, baltymų ir DNR modifikacijas. Reaktyvios deguonies formos sukelia lipidų peroksidaciją, kuri veikia ląstelės membranos dvisluoksnyje esančius fosfolipidus. To pasekoje yra inaktyvuojami su membrana surišti receptoriai ir fermentai, padidinamas audinių pralaidumas. Lipidų peroksidacijos metu susidaręs malodialdehidas gali inaktyvuoti daugelį ląstelinių baltymų. Baltymus sudarančios aminorūgštys neatsparios ROS poveikiui. ROS sukelia peptidinių jungčių destrukciją ir baltymų fragmentaciją į aminorūgštis. Cisteinas ir metioninas yra labiausiai oksidacijai jautrios aminorūgštys [37].

Disbalansas tarp reaktyviosios deguonies formų gamybos ir jų pašalinimo apsauginiais mechanizmais, didėjant ROS kiekiui, vadinamas oksidaciniu stresu [38].

Oksidacinis stresas prisideda prie audinių ląstelių pažeidimo, gali sukelti daugelį sveikatos problemų: vėžinių ląstelių atsiradimą, paspartinti senėjimo procesą, diabetą, širdies ir kraujagyslių ligas, lėtinę obstrukcinę plaučių ligą, idiopatinę plaučių fibrozę, neurodegeneracines ligas [35, 36, 37].

Nefermentiniams antioksidantams priskiriami: glutationas, melatoninas, šlapimo rūgštis, transferinas, kofermentas Q10, bilirubinas, L-argininas, metalus surišantys proteinai [35, 36, 37]. Egzogeniniai antioksidantai gaunami mitybos metu. Jiems priklauso vitaminas C (askorbo r.) ir vitaminas E ( α-tokoferolis), karotenoidai (β-karotenas), omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštys, metalai (selenas, manganas, cinkas), fenoliniai junginiai [36].

1.6 . Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai pagrįsti dviem veikimo mechanizmais: vandenilio atomo perdavimo reakcijomis (VAP) arba elektrono perdavimo reakcijomis (EP). Abiem veikimo mechanizmais pasiekiamas laisvųjų radikalų veikimo sustabdymas, tačiau gali skirtis mechanizmų kinetika ir šalutinių reakcijų galimybės [39].

Antioksidantinis aktyvumas yra matuojamas taikant spektrofotometrinius, elektrocheminius, chromatografinius metodus. Plačiausiai paplitę spektrofotometriniai kolorimetriniai analizės metodai (5 pav.) [40].

5 pav. Spektrofotometriniai antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

DPPH radikalų surišimo metodas. Tai EP ir VAP veikimo mechanizmais pagrįstas metodas, kuriame EP yra dominuojantis. DPPH● (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) yra violetinės spalvos chromogeno radikalas, stabilus, todėl jam nereikia specialaus paruošimo prieš atliekant tyrimą. Reakcijos metu įvyksta spalvos pokytis. Spalvos nykimas priklauso nuo antioksidantinio veiksmingumo, kuris matuojamas spektrofotometru prie 517 nm bangos ilgio [39, 40].

ABTS radikalų - katijonų surišimo metodas. Šiuo metodu matuojamas antioksidanto gebėjimas surišti ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalus - katijonus (ABTS●+). Radikalai – katijonai gaunami ABTS paveikiant stipriomis oksidacinėmis medžiagomis (kalio persulfatu, mangano dioksidu). Reakcijos metu susidaro stabilus mėlynai žalios spalvos tirpalas

Spektrofotometriniai metodai

Kolorimetriniai

DPPH _ABTS FRAP CUPRAC

Fluorescenciniai

ORAC HORAC

Chemiliuminescenciniai

(ABTS●+). Absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui. ABTS●+ reaguojant su antioksidantais, ABTS●+ spalvos intensyvumas nyksta ir gali virsti į pradinį bespalvį ABTS. Spalvos intensyvumas proporcingas likusiam ABTS●+ kiekiui. Gauti tyrimo rezultatai išreiškiami standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais [39, 40].

FRAP redukcinio aktyvumo metodas. FRAP metodas pagrįstas EP veikimo mechanizmu. Skirtingai nei kiti EP metodai, FRAP metodas atliekamas rūgštinėje terpėje (pH 3,6), siekiant išlaikyti geležies tirpumą. Šis metodas pagrįstas antioksidantinių junginių gebėjimu redukuoti Fe3+ − TPTZ

(geležies [III]-2,4,6-tripiridil-s-triazinas) į Fe2+ _{- TPTZ.} Reakcijos metu susidaro intensyvi mėlyna

spalva. Absorbcija matuojama prie 593 nm bangos ilgio [39, 41]. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso arba askorbo rūgšties ekvivalentais [40].

CUPRAC redukcinio aktyvumo metodas. Tai vario redukcijos tyrimas. Metodas pagrįstas antioksidantinių junginių gebėjimu redukuoti Cu2+ _{- neokupraino (2,9-dimetil-1,10-fenantrolinas)}

kompleksą į Cu+ _- neokuprainą. Reakcijos metu absorbcija matuojama esant 450 nm bangos ilgiui

2. TYRIMO METODIKA

2.1 . Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – paprastųjų bitkrėslių (Tanacetum vulgare L.) lapai, stiebai ir žiedynai surinkti natūraliose augavietėse 2017 m. birželio – rugpjūčio mėnesiais (2 lentelė).

Augalinė žaliava rinkta tais pačiais laiko tarpsniais trejose skirtingose Pagėgių savivaldybės (Tauragės apskritis) augavietėse:

• Radavietė - Anužių kaimas (55°09'16.8"N 21°51'13.6"E (WGS)); augavietė - žvyro karjero, rekultivuoto į vandens telkinį, šlaitas.

• Radavietė - Būbliškės kaimas (55°07'19.0"N 21°55'34.4"E (WGS)); augavietė – pieva. • Radavietė - Pagėgiai (55°07'51.1"N 21°55'36.8"E (WGS)); augavietė – pamiškė. Iš augaviečių surinkti lapai, žiedynai ir stiebai buvo džiovinti kambario temperatūroje, vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinti bitkrėslių lapai, žiedynai ir stiebai supakuoti į popierinius maišelius ir laikyti sausoje, tamsioje, vėdinamoje patalpoje.

2 lentelė. Tiriamojo objekto rinkimas vegetaciniu laikotarpiu Vegetacinis

laikotarpis

Rinkimo vieta

Rinkimo data

Anužių kaimas Pagėgiai Būbliškės kaimas Vegetacijos

pradžia 2017-06-24 Lapai Lapai Lapai

Butonizacija 2017-07-08 Lapai, stiebai Lapai, stiebai Lapai, stiebai Žydėjimo pradžia 2017-07-22 Lapai, stiebai, žiedynai Lapai, stiebai, žiedynai Lapai, stiebai, žiedynai Masinis

žydėjimas 2017-08-19 Lapai, stiebai, žiedynai

Lapai, stiebai, žiedynai Lapai, stiebai, žiedynai Masinio žydėjimo pabaiga 2017-09-16 Lapai, stiebai, žiedynai Lapai, stiebai, žiedynai Lapai, stiebai, žiedynai

Sėklų branda 2017-09-30 Lapai, stiebai, žiedynai

Lapai, stiebai, žiedynai

Lapai, stiebai, žiedynai

2.2 . Naudoti reagentai ir tirpikliai

(Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Vokietija), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma - Aldrich“, St. Louis JAV), 99,8 proc. V/V acto rūgštis (,,Lach - Ner“, Tovarti Čekijos respublika; etiketė - ,,Avsista“ Visaginas, Lietuva), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma - Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim Vokietija), rutinas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Vokietija), heksimetilentetraminas („Sigma - Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim Vokietija), ABTS (2,2'-azino-bis-(3 etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) reagentas („Alfa Aesar“, Karlsruhe Vokietija), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar“, Karlsruhe Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (,,Sigma-Aldrich“ St. Louis JAV), natrio acetatas (,,Sigma – Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim, Vokietija), 37 proc. V/V vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis JAV), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) („Alfa Aesar“ GmbH & Co“, Karlsruhe Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas (Vaseline - Fabrik Rhenania, Bonn Vokietija).

2.3 .

Naudota aparatūra

Tyrimo metu naudota aparatūra: elektrinis malūnėlis „Binatone“ (Jungtinė Karalystė), analitinės svarstyklės „Sartorius AG Gottingen CP64-OCE“ (Vokietija), ultragarso vonelė „Elmasonic P“ (Vokietija), spektrofotometras „Spectronic Camspec M 550" (Jungtinė Karalystė), chromatografas „Waters 2695“ (Milford, JAV)

2.4 .

Tiriamųjų mėginių paruošimas

2.5 .

Tiriamųjų mėginių spektrofotometrinė analizė:

2.5.1.

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Suminis fenolinių junginių kiekis spektrofotometriškai nustatytas naudojant Folin - Ciocalteu metodą [33].

Folin - Ciocalteu reagentas praskiedžiamas 10 kartų su distiliuotu vandeniu. Gaunamas darbinis Folin - Ciocalteu reagentas. 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišomas su 5 ml pagamintu darbiniu Folin – Ciocalteu reagentu ir įpilama 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Kolbutėje esantis mišinys sumaišomas ir laikomas tamsoje kambario temperatūroje 1 valandą.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas 1 ml 60 proc. V/V etanolio sumaišant su 5 ml darbiniu Folin – Ciocalteu reagentu ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu. Palyginamojo tirpalo mišinys laikomas tamsoje kambario temperatūroje 1 valandą.

Po 1 val. spektrofotometru išmatuojama tiriamojo mišinio absorbcija. Absorbcija matuojama 765 nm bangos ilgyje.

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui sausos augalinės žaliavos. GAE apskaičiuojamas naudojant galo rūgšties skirtingų koncentracijų (0,0125 - 0,075 mg/ml) tirpalų kalibracinės kreivės tiesinę regresijos lygtį (y = 10,778x - 0,1163 ; R² = 0,9901) ir taikant formulę:

GAE = 𝐶𝐶 𝑥𝑥 𝑉𝑉 𝑥𝑥 𝑎𝑎

𝑚𝑚 ( mg/g)

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml) gauta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimas;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Suminis flavonoidų kiekis ekstraktuose nustatomas naudojant aliuminio chlorido spektrofotometrinį metodą.

tamsioje vietoje 30 min. Po 30 min. į kolbutę įpilama 0,4 ml 5 proc. heksimetilentetramino tirpalo ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 5 ml kolbutės žymės.

Palyginamasis tirpalas paruošiamas 5 ml kolbutėje sumaišant 0,2 ml tiriamosios žaliavos ekstraktą su 2 ml 96 proc. V/V etanoliu, 0,1 ml 30 proc. acto rūgštimi. Mišinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 5 ml kolbutės žymės.

Spektrofotometru išmatuojama tiriamojo mišinio absorbcija. Absorbcija matuojama 407 nm bangos ilgyje.

Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) gramui sausos augalinės žaliavos. RE apskaičiuojamas naudojant rutino skirtingų koncentracijų (0,0156 - 0,5 mg/ml) tirpalų kalibracinės kreivės tiesinę regresijos lygtį (y = 1,3578x - 0,0144; R² = 0,9986) ir taikant formulę:

RE = 𝐶𝐶 𝑥𝑥 𝑉𝑉 𝑥𝑥 𝑎𝑎

𝑚𝑚 ( mg/g)

c – rutino koncentracija (mg/ml) gauta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimas;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.5.3. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

Antiradikalinis aktyvumas spektrofotometriškai nustatomas naudojant ABTS reagentą. Motininis 2 mM koncentracijos ABTS tirpalas paruošiamas tamsaus stiklo buteliuke 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinant 50-yje ml distiliuoto vandens. Į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato. Tirpalas sumaišomas ir laikomas tamsoje kambario temperatūroje 16 val. Po 16 val. iš motininio ABTS tirpalo gaminamas darbinis ABTS tirpalas, praskiedžiant motininį tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas distiliuotas vanduo.

Tiriamasis tirpalas gaminamas sumaišant 3 ml darbinio ABTS tirpalo su 20 μl tiriamuoju augalinės žaliavos ekstraktu. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Po valandos laiko spektrofotometru matuojama tiriamojo mišinio absorbcija 734 nm bangos ilgyje. Absorbcijos pokytis apskaičiuojamas iš darbinio ABTS tirpalo absorbcijos atėmus tiriamojo tirpalo absorbciją.

Antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEABTS) gramui sausos augalinės žaliavos. TEABTS apskaičiuojamas naudojant trolokso skirtingų

TEABTS = 𝐶𝐶 𝑥𝑥 𝑉𝑉 𝑥𝑥 𝑎𝑎

𝑚𝑚 (μmol/g)

c – trolokso koncentracija (μmol/L) gauta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L);

a – skiedimas;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.5.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Redukciniam aktyvumui nustatyti FRAP metodu gaminami šie reagentai:

a) 300 mM acetatinis buferis. Jis gaminamas atsveriant 3,1 g natrio acetato, suberiant į 1000 ml matavimo kolbą, įpilant 16 ml ledinės acto rūgšties ir praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki kolbos žymės (pH 3,6).

b) 10 mM TPTZ tirpalas. Tirpalas gaminamas į 50 ml distiliuoto vandens įpilant 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties. Į gautą tirpalą suberiami 0,1562 g TPTZ milteliai.

c) 20 mM geležies (III) chlorido heksihidrato tirpalas. Tirpalas paruošiamas 50 – yje ml distiliuoto vandens ištirpinant 0,2703 g geležies (III) chlorido heksihidrato.

Darbinis FRAP tirpalas gaminamas sumaišant 300 mM acetatinį buferį, 10 mM TPTZ tirpalą ir 20 mM geležies (III) chlorido heksihidrato tirpalą santykiu 10: 1: 1.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas sumaišant 3 ml darbinio FRAP tirpalo su 20 μl tiriamuoju augalinės žaliavos ekstraktu. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas sumaišant 3 ml FRAP tirpalo su 20 μl 60 proc. V/V etanoliu. Mišinys taip pat laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val.

Po 1 val. spektrofotometru išmatuojama tiriamojo mišinio absorbcija. Absorbcija matuojama 593 nm bangos ilgyje.

Redukcinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEFRAP)

gramui sausos augalinės žaliavos. TEFRAP apskaičiuojamas naudojant trolokso skirtingų koncentracijų

(400 - 2400 μmol/L) tirpalų kalibracinės kreivės tiesinę regresijos lygtį (y = 0,0003x - 0,0176; R² = 0,9984) ir taikant formulę:

TEABTS = 𝐶𝐶 𝑥𝑥 𝑉𝑉 𝑥𝑥 𝑎𝑎

𝑚𝑚 (μmol/g)

V – ekstrakto tūris (L); a – skiedimas;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.6 .

Efektyvioji skysčių chromatografija

ESC analizė atlikta naudojant „Waters 2695“ chomatografą (Milford, USA) su diodų matricos detektoriumi „Waters 2998“ (Milford, USA). Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5 - μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4.6 mm) su prieškolone 5 - μm ACE C18 (20 × 4.0 mm) (Aberdeen, Scotland), 25 °C temperatūroje. Eliuentų sistema: 1 % (v/v) skruzdžių rūgšties (A) ir acetonitrilo (B). Eliucijos sistema: 10 – 15 % tirpiklis B 0 – 20 min, 15 % tirpiklis B 20 – 30 min, 15 – 30 % tirpiklis B 30 – 45 min, 30 – 40 % tirpiklis B 45 – 55 min. Judrios fazės tėkmės greitis 1 ml/min, injekcijos tūris - 10 μl. Fenoliniai junginiai identifikuoti pagal smailių sulaikymo trukmę ir UV spektrą (λ = 200 – 600 nm) palyginant juos su žinomais standartais. Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas pagal standartų kalibracines kreives.

2.7 .

Duomenų apdorojimas ir statistinis vertinimas

3.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 .

Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Ekstrakcijos tirpiklio parinkimas. Fenolinių junginių ekstrakcijai nėra vienintelio standartinio ekstrahento. Literatūros duomenimis fenolinių junginių ekstrakcijai dažniausiai naudojamas metanolis, etanolis, acetonas ir šių medžiagų skirtingų proporcijų mišiniai su vandeniu [42,43]. Lietuvių mokslininkai bitkrėslių žolės tyrimams naudojo du skirtingo poliškumo organinius tirpiklius: acetoną ir vandenį. Acetonas, kaip aprotoninis tirpiklis, ekstrahuoja mažesnio poliškumo junginius. Fenoliniai junginiai dėl hidroksilo grupių yra poliniai, todėl geriau ekstrahuojami protoniniame tirpiklyje – vandenyje. Mokslininkai nustatė, kad fenolinių junginių kiekis vandeniniame paprastųjų bitkrėslių ekstrakte didesnis nei acetoniniame bitkrėslių ekstrakte [44]. Šiame tyrime tirpiklio pasirinkimui naudotas vanduo ir skirtingų koncentracijų etanolis (6 pav.). Didžiausias fenolinių junginių kiekis (25,54 ± 1,06 mg/g) nustatytas naudojant 60 proc. V/V etanolį (p < 0,05). Mažiausias fenolinių junginių kiekis (13,62 ± 0,18 mg/g) nustatytas naudojant 96 proc. V/V etanolį (p<0,05). Nenustatytas reikšmingas skirtumas tarp vandens ir 40 proc. V/V, 70 proc. V/V etanolio. Tolesniems tyrimams kaip tirpiklis pasirinktas 60 proc. V/V etanolis.

6 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) paprastųjų bitkrėslių žiedynuose ekstrakcijai naudojant vandenį ir vandens-etanolio mišinius; statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių

pažymėti raidėmis

Ekstrakcijos trukmės parinkimas. Ekstrakcijos laikui nustatyti buvo pasirinkti 6 laiko taškai: 5 min., 10 min., 15 min., 30 min., 45 min. ir 60 min. (7 pav.). Ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje. Nustatyta, kad didžiausias paprastųjų bitkrėslių lapuose fenolinių junginių kiekis išekstrahuotas po 60 min. (85,94 ± 0,93 mg/g) (p < 0,05). Didžiausi fenolinių junginių kiekiai

0 5 10 15 20 25 30 Vanduo 40 proc. etanolis 60 proc. etanolis 70 proc. etanolis 80 proc. etanolis 96 proc. etanolis Fe no lini ų jung ini ų ki eki s mg /g

Ekstrakcijai naudotas tirpiklis

a

b _{b b}

c

stiebuose nustatyti po 45 min. (21,4 ± 1,61 mg/g) ir po 60 min. (22,76 ± 1,91 mg/g) (p < 0,05). Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp 45 min. ir 60 min. nenustatytas. Didžiausias fenolinių junginių kiekis žiedynuose nustatytas po 60 min. (51,79 ± 1,05 mg/g) (p < 0,05). Nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis visuose augalo organuose išekstrahuojamas veikiant 60 min. ultragarsu, todėl ekstrakcijai pasirinktas laikas – 60 min.

7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) paprastųjų bitkrėslių organuose skirtingais

ekstrahavimo laikais

3.2 . Bendro

fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtinguose paprastųjų

bitk

rėslių organuose

Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas Tanacetum vulgare L. organuose vegetacijos eigoje. Mokslinėje literatūroje gausu atliktų tyrimų, kurie patvirtina, kad skirtingi augimo etapai augalų gyvavimo cikle turi įtakos antrinių augalų metabolitų kiekiui. Antriniai augalų metabolitai neturi pastovios koncentracijos visame augalo vegetacijos laikotarpyje ir kinta priklausomai nuo skirtingų aplinkos sąlygų [45].

Paprastųjų bitkrėslių antžeminiuose organuose (lapuose, žiedynuose, stiebuose) fenolinių junginių kiekis kinta priklausomai nuo fenologinių vystymosi tarpsnių (8, 9, 10 pav.). Lapuose fenolinių junginių maksimumai nustatyti bitkrėslių masinio žydėjimo metu – 94,50 ± 0,48 mg/g (rugpjūčio antroji dekada) ir vegetacijos pradžioje – 90,90 ± 0,82 mg/g (birželio trečiojoje dekadoje), minimumas nustatytas butonizacijoje – 73,06 ± 0,59 mg/g (p < 0,05) (8 pav.).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

5min 10min 15min 30min 45min 60min

8 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.; statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti

raidėmis

Paprastųjų bitkrėslių žiedynuose fenolinių junginių kiekis vegetaciniais tarpsniais kinta nuo 63,08 ± 1,13 mg/g iki 66,74 ± 0,47 mg/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis bitkrėslių žiedynuose nustatytas augalų žydėjimo pradžioje – 66,74 ± 0,47 mg/g (p<0,05). Masinio žydėjimo metu - 63,08 ± 1,13 mg/g (rugpjūčio antroji dekada) ir masinio žydėjimo pabaigoje – 63,51 ± 0,96 mg/g (rugsėjo antroji dekada) nenustatyti reikšmingi skirtumai tarp ėminių (9 pav.).

9 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti

raidėmis

Paprastųjų bitkrėslių stiebuose fenolinių junginių kiekis fenologiniais tarpsniais svyruoja nuo 15,04 ± 0,50 mg/g iki 27,05 ± 0,49 mg/g. Mažiausias fenolinių junginių kiekis – 15,04 ± 0,50 mg/g –

0 20 40 60 80 100 Vegetacijos pradžia(06.24) Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) Fe no lini ų jung ini ų ki eki s m g/ g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

58 60 62 64 66 68 Žydėjimo pradžia (07.22) Masinis žydėjimas (08.19) Masinio žydėjimo pabaiga (09.16) Sėklų branda(09.30) Fe no lini ų jung ini ų ki eki s mg /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

nustatytas augalų žydėjimo pradžioje (liepos trečiojoje dekadoje) (p<0,05). Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas masinio žydėjimo metu – 27,05 ± 0,49 mg/g (rugpjūčio antrojoje dekadoje) (p<0,05) (10 pav.). Nustatyta, kad vegetaciniu laikotarpiu stiebuose didėjant fenolinių junginių kiekiui, žiedynuose fenolinių junginių kiekis mažėja (R2 _{= 0,83; R = 0.91; p<0,05).}

10 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių

pažymėti raidėmis

Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas Tanacetum vulgare L. organų ėminiuose, surinktuose iš skirtingų augaviečių. Fenolinių junginių kiekis augale kinta priklausomai nuo vegetacinio tarpsnio, tačiau augavietės ypatumai, susiję su edafinėmis ir klimatinėmis sąlygomis, turi įtakosfenolinių junginių susikaupimui augale [45].

Viso vegetacinio laikotarpio metu statistiškai patikimai didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti žvyro karjero šlaite surinktuose paprastųjų bitkrėslių lapų ėminiuose (p<0,05). Bitkrėslių masinio žydėjimo ir sėklų brandos tarpsniuose, pievoje surinktuose paprastųjų bitkrėslių lapuose nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis, nei pamiškėje surinktuose bitkrėslių lapuose (p<0,05) (11 pav.). 0 5 10 15 20 25 30 Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) Fe no lini ų jung ini ų ki eki s m g/ g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

a

b c

d

11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Paprastųjų bitkrėslių žiedynuose, surinktuose trijose skirtingose augavietėse (žvyro karjero šlaite, pamiškėje ir pievoje), nustatyta fenolinių junginių kiekio kitimo tendencija. Statistiškai reikšmingai didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas žvyro karjero šlaite surinktuose žiedynų ėminiuose (p<0,05). Nuo bitkrėslių žydėjimo pradžios iki masinio žydėjimo pabaigos, fenolinių junginių kiekis žiedynuose kinta sekančia tvarka: žvyro karjero šlaite surinktuose žiedynų ėminiuose > pamiškėje surinktuose ėminiuose > pievoje surinktuose žiedynuose (p<0,05) (12 pav.).

12 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Skirtingose augavietėse surinktuose bitkrėslių stiebų ėminiuose fenolinių junginių kiekis kinta tarp vegetacinių tarpsnių, tačiau statistiškai reikšminga augavietės įtaka fenolinių junginių susikaupimui nenustatyta (13 pav.).

0 20 40 60 80 100 120 06.24 07.08 07.22 08.19 09.30 Vegetacijos pradžia Butonizacija Žydėjimo pradžia Masinis žydėjimas Sėklų branda Fe no lini ų jung ini ų ki eki s mg /g Vegetacinis tarpsnis Žvyro karjero šlaitas Pieva Pamiškė 0 20 40 60 80 100 07.22 08.19 09.16 09.30

Žydėjimo pradžia Masinis

žydėjimas Masinio žydėjimopabaiga

13 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Bendro fenolinių junginių kiekio palyginimas Tanacetum vulgare L. antžeminiuose organuose. Bitkrėslių antžeminiai organai (lapai, žiedynai ir stiebai) pasižymi skirtingu sukauptu fenolinių junginių kiekiu. Vegetaciniu laikotarpiu didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas augalo lapuose (masinio žydėjimo metu – 94,5 ± 0,48 mg/g). Mažesniu fenolinių junginių kiekiu pasižymi bitkrėslių žiedynai (didžiausias nustatytas kiekis žydėjimo pradžios tarpsnyje – 66,74 ± 0,47 mg/g). Mažiausiai fenolinių junginių kaupia stiebai (didžiausias nustatytas kiekis masinio žydėjimo metu – 27,05 ± 0,49 mg/g).

Serbijos mokslininkai ištyrė gegužės mėn. surinktų paprastųjų bitkrėslių žaliavų etanolinius ektraktus. Jų atliktas tyrimas patvirtino šio tyrimo išvadą, kad didesniu fenolinių junginių kiekiu pasižymi paprastųjų bitkrėslių lapai (31,6 ± 0,5 mg/g) nei žiedai (19,0 ± 0,5 mg/g) [7].

3.3 . Bendro

flavonoidų kiekio įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių

organuose

Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas Tanacetum vulgare L. organuose vegetacijos eigoje. Bendras flavonoidų kiekis T. vulgare L. lapuose vegetacijos eigoje kinta nuo 26,72 ± 0,37 mg/g iki 36,25 ± 0,36 mg/g. Didžiausi flavonoidų kiekiai nustatyti masinio žydėjimo metu ir vegetacijos pradžioje (35,80 ± 0,92 mg/g). Mažiausias kiekis nustatytas žydėjimo pradžioje (p<0,05) (14 pav.).

0 10 20 30 40 07.08 07.22 08.19 09.30

Butonizacija Žydėjimo pradžia Masinis

14 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

Žiedynuose flavonoidų maksimumai nustatyti žydėjimo pradžioje (20,11±0,43mg/g) ir masinio žydėjimo metu (20,24±0,50 mg/g) (p<0,05). Mažiausi flavonoidų kiekiai nustatyta augalų žydėjimo pabaigoje (15,11±0,29 mg/g) ir sėklų brandos tarpsnyje (14,76 ±0,4 mg/g) (p<0,05) (15 pav.).

15 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti

raidėmis

Vegetaciniu laikotarpiu bitkrėslių stiebuose flavonoidų kiekis mažiausias reikšmes pasiekia augalų žydėjimo pradžioje, o maksimalias reikšmes pasiekia masinio žydėjimo metu. Stiebuose nustatytas flavonoidų kiekis žydėjimo pradžioje yra 6,52 ± 0,22 mg/g, masinio žydėjimo metu – 9,14±0,31 mg/g (p<0,05) (16 pav.). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Vegetacijos pradžia(06.24) Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) Fl avon oi dų k ie ki s m g/ g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

0 5 10 15 20 25 Žydėjimo pradžia (07.22) Masinis žydėjimas (08.19) Masinio žydėjimo pabaiga (09.16) Sėklų branda(09.30) Fl avon oi dų k ie ki s m g/ g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

16 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas Tanaetum vulgare L. organų ėminiuose, surinktuose iš skirtingų augaviečių. Bendras flavonoidų kiekis įvertintas bitkrėslių lapų, žiedynų ir stiebų ėminiuose, surinktuose iš trijų skirtingų augaviečių: žvyro karjero šlaito, pievos ir pamiškės. Bitkrėslių lapuose statistiškai reikšmingai didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas pamiškėje surinktuose lapų ėminiuose (p<0,05). Likusiose dvejose augavietėse surinktuose bitkrėslių lapų ėminiuose, flavonoidų kiekis kito vegetaciniais tarpsniais, tačiau statistiškai reikšmingos augavietės įtakos flavonoidų susikaupimui lapų ėminiuose tarp pievos ir žvyro karjero šlaito nenustatyta (17 pav.).

17 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Nustatyta flavonoidų kiekio kitimo tendencija skirtingose augavietėse surinktuose paprastųjų bitkrėslių žiedynuose. Nuo bitkrėslių masinio žydėjimo pradžios iki masinio žydėjimo pabaigos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) Fl avon oi dų k ie ki s m g/ g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

statistiškai patikimai flavonoidų kiekis skirtingose augavietėse surinktuose žiedynuose kito. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas pamiškėje surinktuose žiedynuose, mažesnis flavonoidų kiekis nustatytas žvyro karjero šlaite surinktuose žiedynų ėminiuose, mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas pievoje augusių bitkrėslių žiedynų ekstraktuose (p<0,05) (18 pav.).

18 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Paprastųjų bitkrėslių stiebuose bendras flavonoidų kiekis įvairavo vegetaciniais tarpsniais skirtingose augavietėse. Visu vegetaciniu laikotarpiu nenustatyta statistiškai reikšminga augavietės įtaka stiebuose susikaupusiam flavonoidų kiekiui (19 pav.).

19 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Bendro flavonoidų kiekio palyginimas Tanacetum vulgare L. antžeminiuose organuose. Paprastųjų bitkrėslių lapuose, žiedynuose ir stiebuose didžiausi flavonoidų kiekiai nustatyti masinio žydėjimo metu. Lapuose nustatytas flavonoidų kiekis (36,25 ± 0,36 mg/g) 1,8 karto didesnis nei

0 5 10 15 20 25 30 07.22 08.19 09.16 09.30 Žydėjimo pradžia Masinis

žydėjimas žydėjimoMasinio pabaiga Sėklų branda Fl avon oi dų k ie ki s m g/ g Vegetacijos tarpsnis Žvyro karjero šlaitas Pieva Pamiškė 0 2 4 6 8 10 12 07.08 07.22 08.19 09.30

Butonizacija Žydėjimo pradžia Masinis žydėjimas Sėklų branda

nustatytas flavonoidų kiekis žiedynuose (20,24 ± 0,5 mg/g). Stiebuose nustatytas flavonoidų kiekis (9,14 ± 0,31 mg/g) yra 4 kartus mažesnis nei lapuose ir 2,2 karto mažesnis nei žiedynuose.

Rumunijos mokslininkai Mureşan M., Benedec D. ir kiti ištyrė 2013 m. liepos mėn. iš Tansilvanijos Alba ir Sibiu miestų surinktus paprastųjų bitkrėslių žiedų etanolinius ekstraktus. Spektrofotometriniu metodu mokslininkai nustatė flavonoidų kiekį Sibiu mieste surinktuose žieduose – 10,35 ± 0,73 mg/g, o Alba mieste surinktuose žieduose – 7,73 ± 0,27 mg/g (įvertinta rutino ekvivalentais) [46]. Lyginant su šio tyrimo rezultatais Rumunijos mokslininkai nustatė mažesnį suminį flavonoidų kiekį žieduose nei šiame tyrime nustatytas flavonoidų kiekis bitkrėslių žiedynuose.

3.4 . Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių

organuose (ABTS metodas)

Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas Tanacetum vulgare L. organuose vegetacijos eigoje. Antiradikalinis aktyvumas paprastųjų bitkrėslių organuose kinta priklausomai nuo vegetacinio tarpsnio. Lapuose statistiškai reikšmingai mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas augalų žydėjimo pradžioje - 396,97 ± 5,78 μmol/g (p<0,05). Didžiausias antiradikalinis aktyvumas lapuose nustatytas masinio žydėjimo metu – 546,12 ± 3,43 μmol/g (20 pav.). Nustatyta, kad antiradikalinis aktyvumas lapuose vegetacijos eigoje koreliuoja su fenolinių junginių (R = 0,940; p<0,05) ir flavonoidų kiekiu (R = 0,943; p<0,05). Lapuose didėjant fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiui, didėja antiradikalinis aktyvumas.

20 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

0 100 200 300 400 500 600 Vegetacijos pradžia(06.24) Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) A n ti rad ik al in is ak tyvu m as , μm ol /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

b

a

Bitkrėslių žiedynuose didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu (393,87 ± 5,20 μmol/g) (p<0,05). Mažiausi antiradikaliniai aktyvumai nustatyti masinio žydėjimo pabaigoje (333,40 ± 3,11 μmol/g) ir sėklų brandos laikotarpiu (337,59 ± 6,13 μmol/g) (p<0,05) (21 pav.).

21 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti

raidėmis

Bitkrėslių stiebuose, didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu – 96,67 ± 4,61 μmol/g (p<0,05) (22 pav.). Mažiausias nustatytas antiradikalinis aktyvumas stiebuose buvo augalų žydėjimo pradžioje (42,33 ± 2,41 μmol/g) ir butonizacijoje (46,12 ± 1,76 μmol/g) (p<0,05). Nustatyta, kad antiradikalinis aktyvumas stiebuose vegetacijos eigoje statistiškai reikšmingai koreliuoja su bendru fenolinių junginių kiekiu (R = 0,900; p<0,05).

22 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti

raidėmis 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Žydėjimo pradžia (07.22) Masinis žydėjimas (08.19) Masinio žydėjimo pabaiga (09.16) Sėklų branda(09.30) A n ti rad ik al in is ak tyvu m as , μm ol /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

0 20 40 60 80 100 120 Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) Masinio žydėjimopabaiga(09.16)

Sėklų branda(09.30) A n ti rad ik al in is ak tyvu m as , μm ol /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

a

b _{c c}

a

b b

Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas Tanacetum vulgare L. organų ėminiuose, surinktuose iš skirtingų augaviečių. Antiradikalinis aktyvumas vegetaciniu laikotarpiu kinta trijose skirtinguose augavietėse. Statistiškai reikšmingai didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas pamiškėje surinktuose bitkrėslių lapuose (p<0,05). Mažiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo pievoje surinkti bitkrėslių lapų ėminiai (p<0,05) (23 pav.).

23 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Bitkrėslių masinio žydėjimo pabaigoje ir sėklų brandos tarpsniuose antiradikalinis aktyvumas reikšmingai nesiskiria tarp dviejų augaviečių: pamiškės ir pievos. Šiuose vegetaciniuose tarpsniuose žiedynuose statistiškai reikšmingai mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas žvyro karjero šlaite surinktuose žiedynų ėminiuose (p<0,05) (24 pav.).

24 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 06.24 07.08 07.22 08.19 09.30 Vegetacijos pradžia Butonizacija Žydėjimo pradžia Masinis žydėjimas Sėklų branda A n ti rad ik al in is ak tyvu m as , μm ol /g Vegetacinis tarpsnis Žvyro karjero šlaitas Pieva Pamiškė 0 100 200 300 400 500 07.22 08.19 09.16 09.30

Žydėjimo pradžia Masinis

žydėjimas žydėjimo pabaigaMasinio Sėklų branda

Stiebų ėminiuose antiradikalinis aktyvumas masinio žydėjimo ir sėklų brandos tarpsniuose statistiškai reikšmingai skiriasi tarp bitkrėslių augaviečių. Masinio žydėjimo ir sėklų brandos tarpsniuose antiradikalinis aktyvumas stiebu ėminiuose kinta sekančia tvarka: žvyro karjero šlaite surinkti stiebai > pamiškėje surinkti stiebai > pievoje surinkti stiebai (25 pav.).

25 pav. Antiradikalinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

Antiradikalinio aktyvumo palyginimas Tanacetum vulgare L. antžeminiuose organuose.

T. vulgare L. viso vegetacinio laikotarpio metu didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo lapai,

mažesniu aktyvumu pasižymėjo žiedynai, mažiausiu stiebai. Lapuose nustatytas antiradikalinis aktyvumas (masinio žydėjimo metu – 546,12 ± 3,43 μmol/g) 1,4 karto didesnis nei žiedynuose (masinio žydėjimo metu – 393,87 ± 5,20 μmol/g) ir 5,7 karto didesnis nei stiebuose (masinio žydėjimo metu – 96,67 ± 4,61 μmol/g)

Serbijos mokslininkai ABTS metodu ištyrė 2012 m. gegužės mėn. pietryčių Serbijos kalnų viršūnėse surinktus paprastųjų bitkrėslių lapus ir žiedus. Mokslininkai nustatė antioksidantinį aktyvumą lapų etanoliniame ekstrakte - 25,5 ± 0,5 mg/g ir žiedų etanoliniame ekstrakte - 12,2 ± 0,3 mg/g (įvertinta trolokso ekvivalentais). Lyginant su šio tyrimo duomeninis Serbijos mokslininkai nustatė didesnį antiradikalinį aktyvumą paprastųjų bitkrėslių lapuose nei nustatyta šiame tyrime [7].

3.5 .

Redukcinio aktyvumo įvairavimas skirtinguose paprastųjų bitkrėslių

organuose (FRAP metodas)

Bitkrėslių organuose redukcinis aktyvumas kinta vegetaciniais tarpsniais. Lapuose didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu (645,91 ± 2,82 μmol/g) (p<0,05). Mažiausias

0 20 40 60 80 100 120 140 07.08 07.22 08.19 09.30

Butonizacija Žydėjimo pradžia Masinis

aktyvumas nustatytas augalų žydėjimo pradžioje (431,32 ± 5,07 μmol/g) (p<0,05) (26 pav.). Nustatytas, kad lapuose didėjant fenolinių junginių (R = 0,941; p<0,05) ir flavonoidų kiekiui (R =0,943; p<0,05), didėja redukcinis aktyvumas.

26 pav. Redukcinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

Žiedynuose didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu (352,44 ± 4,49 μmol/g) (p<0,05). Mažiausias redukcinis aktyvumas žieduose yra sėklų brandos metu – 287,04 ± 4,75 μmol/g) (p<0,05). Žiedynuose nustatytas redukcinis aktyvumas žydėjimo pradžioje ir masinio žydėjimo pabaigoje statistiškai reikšmingai nesiskiria (27 pav.).

27 pav. Redukcinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių žiedynų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

0 150 300 450 600 750 Vegetacijos pradžia(06.24) Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) R edukc ini s a kt y v um a s, μ m ol /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)

0 50 100 150 200 250 300 350 400 Žydėjimo pradžia (07.22) Masinis žydėjimas (08.19) Masinio žydėjimo pabaiga (09.16) Sėklų branda(09.30) R edukc ini s a kt y v um a s, μ m ol /g

Paprastųjų bitkrėslių stiebai didžiausiu redukciniu aktyvumu pasižymėjo masinio žydėjimo metu (160,65 ± 3,43 μmol/g) (p<0,05). Stiebuose mažiausias redukcinis aktyvumas nustatytas augalų žydėjimo pradžioje surinktuose stiebuose (77,45 ± 2,85 μmol/g) (p<0,05) (28 pav.). Stiebuose didėjant fenolinių junginių (R=0,997; p<0,05) bei flavonoidų kiekiams (R=0,900; p<0,05), didėja redukcinis aktyvumas.

28 pav. Redukcinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių stiebų ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.); statistiškai reikšmingi skirtumai tarp ėminių pažymėti raidėmis

Redukcinio aktyvumo įvairavimas Tanacetum vulgare L. organų ėminiuose, surinktuose iš skirtingų augaviečių. FRAP metodu įvertintas redukcinis aktyvumas bitkrėslių lapų ėminiuose, surinktuose žvyro karjero šlaite, pievoje ir pamiškėje. Redukcinis aktyvumas vegetaciniais tarpsniais įvairavo šiose augavietėse surinktuose lapų ėminiuose, todėl statistiškai reikšmingai nenustatyta, kurioje augavietėje surinkti lapų ėminiai pasižymėjo didžiausiu redukciniu aktyvumu (29 pav.).

29 pav. Redukcinio aktyvumo (μmol/g) kitimas paprastųjų bitkrėslių lapų skirtingų augaviečių ėminiuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)

0 40 80 120 160 200 Butonizacija (07.08) Žydėjimo pradžia(07.22) Masinis

žydėjimas(08.19) žydėjimoMasinio pabaiga(09.16) Sėklų branda(09.30) R edukc ini s a kt y v um a s, μm ol /g

Vegetacinis tarpsnis (rinkimo data)