PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Skirtinguose regionuose surinkto propolio fitocheminės sudėties ir antioksidantinio poveikio tyrimas “.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID–19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020–05–19 Deimantė Damijonaitienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID–19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020–05–19 Deimantė Damijonaitienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID–19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020–05–19 Sonata Trumbeckaitė
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID–19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020–05–21 Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (–os) (vadovo (–ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID–19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Modestas Žilius
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
DEIMANTĖ DAMIJONAITIENĖ
SKIRTINGUOSE REGIONUOSE SURINKTO PROPOLIO
FITOCHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO POVEIKIO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Prof. Sonata Trumbeckaitė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
SKIRTINGUOSE REGIONUOSE SURINKTO PROPOLIO FITOCHEMINĖS
SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO POVEIKIO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. Sonata Trumbeckaitė Data Darbą atliko Magistrantė Deimantė Damijonaitienė Data KAUNAS, 2020 Recenzentas Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 7
SUMMARY ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Propolio naudojimo priešistorė ... 12
1.2. Propolio fizikinės savybės ... 12
1.3. Propolio cheminė sudėtis ... 13
1.4. Antioksidantinis propolio poveikis ... 16
1.5. Antiuždegiminis propolio poveikis ... 17
1.6. Antibakterinis, antivirusinis, antigrybelinis propolio poveikis ... 17
1.7. Priešvėžinis ir imunomoduliacinis propolio poveikis ... 18
1.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
2. METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Naudoti reagentai ... 20
2.3. Naudota aparatūra ... 21
2.4. Propolio ekstraktų paruošimas ... 21
2.5. Tyrimo metodai ... 22
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ekstrakte spektrofotometriniu metodu ……….22
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas propolio ekstrakte spektrofotometriniu metodu . 23 2.5.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas propolio ekstrakte spektrofotometriniu metodu ... 23
2.5.4. Antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte spektrofotometriniu metodu ……….24
2.5.4.1 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte ABTS radikalų−katijonų.surišimo..metodu………... 25
2.5.4.2 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte DPPH radikalų surišimo metodu ... 25
2.5.4.3 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte FRAP metodu ... 26
2.5.4.4 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu ... 26
2.5.5. Antioksidantinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas ... 27
2.5.6. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 27
2.6. Tyrimo duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas propolio žaliavose ... 30
3.2. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas propolio žaliavose ... 31
3.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas propolio žaliavose ... 32
3.4. Antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimas ABTS metodu tirtose propolio žaliavose ... 33
3.5. Antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimas DPPH metodu tirtose propolio žaliavose ... 35
3.6. Redukcinio aktyvumo in vitro įvairavimas FRAP metodu tirtose propolio žaliavose ... 36
3.7. Redukcinio aktyvumo in vitro įvairavimas CUPRAC metodu propolio žaliavose ... 37
3.8. Propolio ekstraktų kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 38
3.9. Propolio ekstraktų kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas ultra–ESC–masių spektrometrijos metodu ... 40
3.10. Rezultatų apibendrinimas ... 44
IŠVADOS ... 46
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48
SANTRAUKA
D. Damijonaitienės magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė prof. Sonata Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Pavadinimas: Skirtinguose regionuose surinkto propolio fitocheminės sudėties ir antioksidantinio poveikio tyrimas.
Tyrimo tikslas: ištirti skirtinguose regionuose surinktų propolio etanolinių ekstraktų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti šių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai: Ištirti skirtinguose regionuose: Lietuvoje, Rumunijoje bei Brazilijoje, surinkto propolio ekstraktų (fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolinių rūgščių) kiekinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodą. Atlikti skirtinguose regionuose (Lietuvoje, Rumunijoje bei Brazilijoje) surinktų propolio ekstraktų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro palyginamuosius tyrimus, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodą. Ištirti Lietuvoje surinkto propolio ekstrakto kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą, taikant ultra–ESC– masių spektrometrijos metodą. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp propolio ekstraktų fenolinių junginių kiekio ir jų antioksidantinio aktyvumo in vitro.
Tyrimo objektas ir metodai: Trys ėminiai, surinkti Lietuvoje bei po vieną ėminį, surinktus Rumunijoje bei Brazilijoje. Bendras fenolinių junginių, flavonoidų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis ir antioksidantinis aktyvumas in vitro vertintas UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Pritaikius ultra–ESC–masių spektrometrijos metodą, nustatyta kokybinė ir kiekinė fenolinių junginių sudėtis.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras fenolinių junginių (85,46 ± 3,98 mg GRE/g ir 81,98 ± 1,52 GRE/g), flavonoidų (21,31 ± 0,26 mg RE/g ir 16,35 ± 0,74 mg RE/g), hidroksicinamono rūgšties darinių (2,24 ± 0,03 mg CRE/g ir 1,99 ± 0,05 mg CRE/g) kiekis tirtose propolio žaliavose buvo Brazilijoje ir Rumunijoje surinktų žaliavų ėminiuose. Šiuose regionuose surinktas propolis pasižymėjo ir didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu, kuris buvo tirtas DPPH, ABTS, FRAP ir CUPRAC metodais. Atlikus Lietuvoje, Šiaulių rajone surinkto propolio pavyzdžio analizę ultra–ESC– masių spektrometrijos metodu, identifikuoti šie fenoliniai junginiai: flavonoidai, iš kurių gausiausia – flavonolių grupė, fenolinės rūgštys. Stiprus koreliacinis ryšys nustatytas tarp bendro fenolinių junginių ir redukcinio aktyvumo (r nuo 0,702 iki 0,730), bendro flavonoidų kiekio ir redukcinio aktyvumo (r nuo 0,703 iki 0,764) Brazilijoje surinktos propolio žaliavos ėminyje, silpnesni koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo Lietuvos bei Rumunijos propolio ekstraktuose.
SUMMARY
The title of the master thesis. Research of the phytochemical composition and antioxidant effects of propolis collected in different regions.
The aim of the research. To determine the phytochemical composition of ethanol extracts of propolis collected in different regions in Lithuania, Romania and Brazil and to evaluate the antioxidant activity
in vitro.
The objectives of the research. To determine the quantitative phytochemical composition (phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids) and antioxidant activity in vitro of propolis extracts, collected in different regions in Lithuania, Romania and Brazil using UV–VIS spectrophotometric analysis method. To perform comparative studies of antiradical and reduction activity in vitro of propolis extracts collected in different regions by UV–VIS spectrophotometric analysis method. To determine the qualitative and quantitative composition in the sample of Lithuanian propolis by UHPLC methodology. To evaluate correlation between propolis extracts containing quantitative composition of total phenolic compounds and their antioxidant activity in vitro.
The object and methods of the research. Propolis samples from 3 different regions: Lithuania – 3 samples, Brazil – 1 sample, Romania – 1 sample. Total phenolic compounds amount, total flavonoids amount, total hidroxycinnamic acid derivatives amount and antioxidant activity of propolis extracts were determined by UV–VIS spectrophotometric analysis method. Qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was performed using UHPLC method.
The results and conclusions of the research. The highest amount of total phenolic compounds (85.46 ± 3.98 mg GRE/g and 81.98 ± 1.52 GRE/g), flavonoids (21.31 ± 0.26 mg RE/g and 16.35 ± 0.74 mg RE/g), hydroxycinnamic acid derivatives (2.24 ± 0.03 mg CRE/g and 1.99 ± 0.05 mg CRE/g) were determined in the samples of propolis from Brazil and Romania. The propolis collected in these regions also showed the highest antioxidant activity which was studied using DPPH, ABTS, FRAP and CUPRAC methods. The following phenolic compounds were identified in the sample of propolis collected in Šiauliai district in Lithuania using UHPLC method: flavonoids, the most abundant group of them was flavonols, and phenolic acids. Strong correlation was determined between the amount of total phenolic compounds and reduction activity (r means from 0.702 to 0.730) and between the amount of total flavonoids and reduction activity (r means from 0.703 to 0.764) in propolis samples from Brazil. Weaker correlation between phenolic compounds and antioxidant activity was determined in propolis collected in Lithuania and Romania.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'–azino–bis–(3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgštis); COX–1 – ciklooksigenazė–1;COX–2 – ciklooksigenazė–2;
CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;
CUPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Cupric ion reducing antioxidant
capacity);
CV – variacijos koeficientas (anglų k. coefficient of variation); DPPH – 2,2–difenil–1–pikrilhidrazilo radikalas;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant
power);
GRE – galo rūgšties ekvivalentas;
RNS – aktyviosios azoto formos;
ROS – aktyviosios deguonies formos;
TE – trolokso ekvivalentas;
ĮVADAS
Propolis – tai bičių gaminamas produktas, kurio sudėtyje yra nuo įvairių augalų bei medžių pumpurų surinktų ir šiek tiek apvirškintų dervų bei kitų, su vašku sumaišytų, medžiagų. Propolis, dar vadinamas bičių pikiu, daugiausiai naudojamas etanolinių, mažiau – vandeninių, aliejinių ekstraktų gamyboje. Šie propolio ekstraktai vartojami profilaktikai ir gydymui, pasižymi stipriu antioksidantiniu, antibakteriniu, antivirusiniu, anestezuojančiu, uždegimą slopinančiu bei imunitetą stiprinančiu poveikiu. Šį poveikį lemia junginiai, įeinantys į propolio cheminę sudėtį, kurių aptinkama virš 300. Nors propolio sudėtis yra ypač gausi, daugiausiai aptinkami fenoliniai junginiai, kuriems priklauso įvairūs flavonoidai, fenolinės rūgštys, tačiau yra ir labai daug kitų veikliųjų junginių, ir kasmet identifikuojami vis nauji, todėl propolį verta ir toliau tirti, nes tai yra daugiakomponentė, augalinės ir gyvulinės kilmės natūrali žaliava, kurios sudėtis įvairialypė, be to, labai platus veikimo spektras, todėl propolis yra naudojamas tradicinėje ir alternatyvioje medicinoje jau ilgą laiką ir nepaliaujamai kelia mokslininkų susidomėjimą [30, 43].
Skirtingose pasaulio šalyse, pavyzdžiui, Lietuvoje, Rumunijoje, Brazilijoje surinkto propolio cheminė sudėtis skiriasi, tam įtakos turi klimato sąlygos, tenykštės augmenijos įvairovė. Skiriasi ir jų biologinis poveikis. Nagrinėjamas europinio tipo propolis dažniausiai surenkamas nuo beržų bei tuopų – augalų, paplitusių Lietuvoje ir beveik visoje Europoje, jame vyrauja flavonoidai, o tiriamo braziliško žaliojo propolio svarbiausias augalinis šaltinis – varvos (dažniausiai Baccharis dracunculifolia D.C.) [27], jame vyrauja prenilinti hidroksicinamono rūgšties dariniai.
Propolis pasižymi stipriu antioksidantiniu poveikiu, kurį lemia propolyje esantys junginiai, tačiau lig šiol dar nebuvo taip plačiai tirta ir palyginta europinio tipo propolio, surinkto Lietuvos skirtingose vietovėse bei Rumunijoje ir Brazilijoje surinkto propolio antioksidantinis poveikis bei kaip skiriasi šį poveikį nulemiančių junginių koncentracija [27].
Šio mokslinio darbo tikslas − ištirti Lietuvoje, Rumunijoje bei Brazilijoje surinktų propolio žaliavų etanolinių ekstraktų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti šių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti skirtinguose regionuose surinktų propolio etanolinių ekstraktų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti šių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti skirtinguose regionuose: Lietuvoje, Rumunijoje bei Brazilijoje, surinkto propolio ekstraktų (fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolinių rūgščių) kiekinę sudėtį, taikant UV– regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodą.
2. Atlikti skirtinguose regionuose (Lietuvoje, Rumunijoje bei Brazilijoje) surinktų propolio ekstraktų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro palyginamuosius tyrimus, taikant UV– regimosios šviesos spektrofotometrijos analizės metodą.
3. Ištirti Lietuvoje surinkto propolio ekstrakto kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą, taikant ultra–ESC–masių spektrometrijos metodą.
4. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp propolio ekstraktų fenolinių junginių kiekio ir jų antioksidantinio aktyvumo in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Propolio naudojimo priešistorė
Propolis – ypač gausios cheminės sudėties bičių gaminamas produktas, kuris nuo seno buvo naudojamas įvairių ligų gydymui. Senovės romėnai naudojo propolį kaip vaistą gydyti žaizdoms, pūliniams, burnos dezinfekcijai. Karų tarp Jungtinės Karalystės ir Pietų Afrikos Respublikos metu buvo manoma, kad propolio ir vazelino mišinys – puiki skubios pagalbos priemonė sužalojimams, efektyviam žaizdų gyjimui. Inkai vartojo propolį kaip antipiretinę priemonę, o egiptiečiai – kūno galūnių balzamavimui, kad būtų stabdomas ląstelių irimo procesas bei skatinamas audinių atsinaujinimas. Londono farmakopėjose propolis, kaip oficialus vaistas, buvo įvardytas XVII–ame amžiuje ir tapo labai populiarus Europoje nuo XVII–ojo iki XX–ojo amžiaus. Pirmasis mokslinis darbas apie propolį buvo paskelbtas 1908 metais, jame buvo aprašomos propolio cheminės savybės bei sudėtis, pagal šią medžiagą toliau buvo ir vis dar yra intensyviai vykdomi tyrimai [43, 49].
1.2. Propolio fizikinės savybės
Bičių pikis yra sakinga, augalinės ir gyvulinės kilmės medžiaga, turinti stiprų, bet malonų aromatą ir karčiai aitrų skonį.
Jo spalva įvairuoja nuo gelsvos iki tamsiai rudos, raudonai rudos, pilkos ar žalsvos. Kuo pikis senesnis, tuo spalva tamsesnė [47].
Propolis gerai tirpsta organiniuose tirpikliuose – alkolyje ir eteryje, blogai – vandenyje (tik 5 proc. propolio ištirpsta karštame vandenyje). 15oC temperatūroje pikis būna kietas ir tamprus, o 30oC temperatūroje – priešingai – minkštas ir lipnus [5].
Temperatūra, kurioje propolis lydosi – 80oC, santykinis tankis – 1,13–1,27 g/ml.
Lietuvos farmakopėjoje 2001 metais buvo pateikti reikalavimai propolio žaliavai, tačiau šiuo metu jie nebegalioja [5]. Kiekviena šalis ar propolio preparatus gaminanti įmonė turi pasitvirtinę reikalavimus propolio kokybei, tačiau vieningų reikalavimų propolio žaliavai nėra, kaip ir atskiro straipsnio propolio žaliavai Europos farmakopėjoje [7].
1 lentelė. Reikalavimai propolio kokybei [5, 47].
Kokybės rodikliai Rezultatai Metodai nustatymui
1. Savybės
1.1. Išvaizda Lazdelės, kruopelės, gabalėliai Organoleptinis 1.2. Spalva Rudai pilka, gelsvai ruda, šokolado, žaliai ruda Organoleptinis 1.3. Kvapas Būdingas medui, dervai, pušų, topolio Organoleptinis 1.4. Skonis Kartus, silpnai deginantis, aitrus Organoleptinis 1.5. Konsistencija Klampi (36–38°C), kieta, trapi (mažiau kaip 15°C) Organoleptinis 1.6. Tirpumas Sunkiai tirpsta vandenyje ir aliejuose, gerai –
etanolyje, eteryje
Ph. Eur. 01/2005, 1.2
2. Tapatybė
2.1. Reakcija A Teigiama (polifenoliai) FS 2:2001
2.2. Reakcija B Teigiama (flavonoidai) FS 2:2001
3. Fenolinių junginių kiekis
Ne mažiau kaip 30 proc. FS 2:2001
4. Vaškų kiekis Negali būti daugiau kaip 18 proc. FS 2:2001
5. Mechaninės priemaišos
Negali būti FS 2:2001
6. Jodo skaičius Ne mažesnis kaip 35 FS 2:2001
7. Oksidacijos greičio rodiklis
Ne didesnis kaip 20 s FS 2:2001
8. Mikrobinis užterštumas
Ne daugiau kaip 104 mikroorganizmai. Negali būti
Salmonella, E. Coli mikroorganizmų padermių.
Ph. Eur. 01/2005 2.6.12, 2.6.13
1.3. Propolio cheminė sudėtis
Gydomąjį antiseptinį, antioksidantinį, antivirusinį, anestezuojantį, uždegimą slopinantį bei imunitetą stiprinantį poveikį sąlygoja propolio išskirtinė cheminė sudėtis. Propolio žaliavą sudaro apie 50 proc. dervų, 30 proc. vaško, 10 proc. eterinių aliejų, 5 proc. žiedadulkių ir 5 proc. įvairių organinių junginių ir mineralų: kalcio, magnio, geležies, cinko ir kitų. Lakūs junginiai, gaunami iš augalinių šaltinių, propolio sudėtyje yra mažais kiekiais, o cukrus, manoma, jog patenka į propolio žaliavą
atsitiktinai, kai bitės perskrenda prie dirvos, augalų [13, 30, 42].
Bičių vašką sekretuoja patys vabzdžiai, todėl dėl propolio vaškingumo bei mechaninių savybių, bitės propolį naudoja savo avilių statymui bei taisymui, lygina vidines avilio sienas ir tokiu būdu apsisaugo nuo užpuolikų, pavyzdžiui, gyvačių bei driežų, taip pat nuo klimato kaitos – stipraus lietaus ar vėjo. Ne veltui terminas „propolis” yra kilęs iš graikų kalbos, kurioje „pro” reiškia „prie įėjimo į”, o „polis” – „bendruomenę” ar „miestą”, bendrai suteikiant propoliui reikšmę, jog jis naudojamas bičių avilių apsaugai nuo įvairių veiksnių [43, 49].
Propolio veiklieji junginiai yra išgaunami iš augalų ir nulemia propolio biologinį aktyvumą. Propolyje gausiai kaupiami šie biologiškai aktyvūs polifenoliniai junginiai: flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai, fenoliniai aldehidai, ketonai ir kt. [30, 43].
Įvairūs mokslininkų tyrimai įrodė, kad propolio cheminė sudėtis (2 lentelė) bei jo biologinis aktyvumas priklauso nuo įvairių faktorių, tokių kaip propolio surinkimo geografinė vieta ir tenykštės klimato sąlygos, augalijos tipas bei paties propolio amžius [30].
2 lentelė. Skirtingo geografinio regiono propolio vyraujančios medžiagos [52]. Geografinis
regionas
Fenoliniai junginiai: rūgštys ir jų esteriai
Flavonoidai
Europa Hidroksicinamono rūgštys, Hidroksibenzeno rūgštys, Kavos rūgšties fenetilo esteris, Vanilinas
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Azija Hidroksicinamono rūgštys,
Kavos rūšties fenetilo esteris, Vanilinas
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Šiaurės Amerika Hidroksicinamono rūgštys
(ypač p–kumaro rūgštis)
Flavonai, Flavanonai Pietų Amerika Hidroksicinamono rūgštys,
Hidroksibenzeno rūgštys, Kavos rūgšties fenetilo esteris, Artepilinas C (Brazilijos propolyje)
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai
Afrika Hidroksicinamono rūgštys Flavonai,
Flavanonai, Flavonoliai Okeanija Kavos rūgšties fenetilo esteris Flavonai,
Flavanonai
Flavonoidų aglikonai susidaro, nuo augalų surinktą sakingą medžiagą bitėms sumaišius su savo seilėmis, kuriose yra fermento 13–glikozidazės, sukeliančio gliukozilflavanoidų hidrolizę, kuri galiausiai lemia šių aglikonų susidarymą [34]. Pietų Amerikoje surenkamame propolyje daugiausiai randami: kavos rūgštis, p–kumaro rūgštis, 3,4–dimetoksicinamono rūgštis, kvercetinas, pinobanksino 5–metil eteris, apigeninas, kempferolis, pinobanksinas, chrizinas, pinocembrinas, galanginas, pinobanksino 3–acetatas, kavos rūgšties fenetilo esteris, artepilinas C [11, 25, 43]. Mokslininkai, tirdami Brazilijoje surenkamo propolio ekstraktus, nustato daugiau aromatinių rūgščių (14 proc.) nei europinio tipo propolyje (3–4 proc.), taip pat daugiau di– ir tri– terpenoidų [28].
Svarbu tai, jog skirtinguose žemynuose vešintys augalai kaupia nebūtinai vienodus kiekius ir grupes veikliųjų junginių, todėl skirtingų rūšių propolio cheminės sudėties įvairovė priklauso nuo propolio botaninės kilmės. Cheminė sudėtis itin stipriai skiriasi Europoje ir Pietų Amerikoje surenkamuose pavyzdžiuose. Štai europinio tipo propolis, kuris aptinkamas daugelyje Europos šalių, tarp jų – Lietuvoje, Rumunijoje, dažniausiai surenkamas nuo tuopų, beržų, kaštonų, liepų, pušų, uosių, o Pietų Amerikos šalyse, tarp jų ir Brazilijoje – nuo araukarijų, varvų [50]. Europinio tipo propolyje vyraujantys fenoliniai junginiai yra flavonai, flavononai, hidroksicinamono rūgštys ir jų esteriai [7]. Lietuvoje surenkamame propolyje daugiausiai nustatomi fenoliniai junginiai, aromatinių bei alifatinių rūgščių esteriai, taip pat lietuviškame propolyje nustatomos šios rūgštys: galo, kavos, p–kumaro, ferulo, rozmarino, cinamono ir kt. Tyrimai atliekami toliau ir identifikuojami vis kiti junginiai [40].
Šiuo metu pagal propolio fizikines–chemines savybes bei vietą, kurioje jis buvo rastas bei surinktas, išskiriama trylika vien tik braziliško propolio tipų, kurie dar išsamiau skirstomi pagal išvaizdą bei gautų ekstraktų spalvas. Varvos (Baccharis dracunculifolia D.C.), astrinių šeimos Brazilijos vietinis augalas, yra svarbiausias Brazilijos pietryčiuose surenkamo propolio, žinomo kaip žaliasis propolis, šaltinis. Būtent šis žaliasis propolis, įvairių mokslininkų tyrimais, nustatyta, jog pasižymi išskirtinai fungicidinėmis, imunomoduliacinėmis, nuo opų ir uždegimų saugiančiomis ir juos gydančiomis savybėmis, kadangi žaliavos pagrindiniai komponentai yra terpenoidai bei p–kumaro rūgšties dariniai [2, 7].
Iki šiolei nėra bendrai priimtų vieningų kriterijų propolio kokybei nustatyti. Rekomenduojama skirtingose klimato zonose propolio cheminę sudėtį charakterizuoti pagal šiuos junginius: suminį flavonų ir flavonolių kiekį, suminį flavononų ir dihidroflavonolių kiekį bei suminį fenolinių junginių kiekį [7].
Dėl propolyje esančių fenolinių junginių, jis pasižymi antioksidantiniu [12], antiuždegiminiu veikimu [35, 44], taip pat antibakteriniu [30, 44], antigrybeliniu [44], antivirusiniu [27, 28],
priešvėžiniu veikimu [9] ir imunomoduliaciniu aktyvumu [14, 36].
1.4. Antioksidantinis propolio poveikis
Propolyje esantys antioksidantiniai junginiai, tokie kaip flavonoidai bei kiti fenoliniai junginiai, gali būti naudingi apsisaugoti nuo oksidacinių pažeidimų. Flavonoidai pasižymi antioksidantiniu poveikiu, kadangi geba inaktyvuoti laisvuosius radikalus mažindami jų kiekį bei efektyvumą. Oksidacinis stresas yra balanso nebuvimo tarp aktyvių deguonies ir azoto (ROS ir RNS) junginių gamybos bei antioksidantinių procesų, kurių metu šie atomai inaktyvinami, pasekmė. Minėti aktyvūs deguonies junginiai sukelia DNR, RNR, baltymų, lipidų bei kitų biomolekulių oksidaciją. Šios biomolekulės dalyvauja antiuždegiminėse reakcijose bei būklėse, pavyzdžiui šių ligų: aterosklerozės, Parkinsono ligos, širdies funkcijos sutrikimo, miokardo infarkto, Alzheimerio ligos, šizofrenijos, vėžio, todėl oksidacinio streso metu didėja galimybė išsivystyti minėtoms ligoms [1, 25]. Oksidacinį stresą gali sukelti žalingi organizmui veiksniai: rūkymas, užterštas aplinkos oras, netaisyklinga, menkos maistinės vertės mityba. Organizme yra natūralių antioksidantinių veiksnių, kurie padeda kovoti su oksidaciniu stresu. Tokie veiksniai yra medžiagos (antioksidantai), kurias žmogaus organizmas pasisavina iš suvartojamo maisto, kai normaliai maitinamasi, pavyzdžiui: vitaminas C, E, flavonoidai bei kiti fenoliniai junginiai, karotenoidai, arba vartodamas įvairius maisto papildus. Propolio ekstraktai pasižymi antioksidantiniu poveikiu. Antioksidantinis propolio poveikis priklauso nuo propolio botaninės kilmės, surinkimo geografinio regiono, metų laiko ar kitų panašių aplinkybių [1, 25].
Hidroksicinamono rūgšties darinių klasės junginiai, pavyzdžiui: cinarinas, cinamono, p– kumaro, ferulo, kavos, kaftaro, chlorogeno, rozmarino rūgštys, lemia propolio antioksidantinį ir antiuždegiminį aktyvumą [25]. Fenolinių junginių geba veikti kaip antioksidantams ar prooksidantams
in vitro ir in vivo sistemose priklauso nuo jų koncentracijos, struktūros, naudojamos tyrimų sistemos
bei substrato [25]. Antioksidantinis fenolinių junginių poveikis siejamas su širdies ir kraujagyslių, inkstų, kepenų funkcijos tinkamu palaikymu. Prooksidantinės savybės gali būti siejamos su priešvėžiniu bei ląstelių žūtį sukeliančiu poveikiu [25].
Nustatyta, kad Rumunijoje surenkamo propolio antioksidantinis poveikis yra glaudžiai susijęs su fenolinių junginių koncentracija propolio mėginiuose – įvairių tyrimų duomenimis, kuo didesnis kiekis fenolinių junginių yra propolyje, tuo didesnis antioksidantinis poveikis lemiamas [31]. Skirtingų tyrimų duomenimis, tiriant propolio pavyzdžius iš skirtingų tiek Rumunijos, tiek kitų šalių regionų, didesnė fenolinių junginių koncentracija aptinkama pavyzdžiuose, surinktuose pietiniuose šalies regionuose [21]. Brazilų mokslininkai taip pat pastebėjo labai stiprų koreliacinį ryšį tarp fenolinių
junginių koncentracijos bei antioksidantinio poveikio, tad propolio antioksidantinės savybės gali tiesiogiai priklausyti nuo fenolinių junginių kiekio žaliavoje [17].
1.5. Antiuždegiminis propolio poveikis
Uždegimas – vietinė kraujagyslių, jungiamojo, nervinio audinio, humoralinių ir ląstelinių veiksnių reakcijų visuma į pažaidą. Propolio antiuždegiminis poveikis atsiranda dėl žaliavoje esančių aktyvių junginių – flavonoidų, kurių aktyviausias yra galanginas, taip pat kavos rūgšties fenetilo esterio (KRFE), kuris yra pats efektyviausias antiuždegiminį poveikį lemiantis propolio komponentas. Flavonoidas galanginas inhibuoja ciklooksigenazės (COX) bei lipooksigenazės aktyvumą, sumažina PGE2 atpalaidavimą ir COX–2 išsiskyrimą, todėl suteikiamas antiuždegiminis poveikis [45]. Kavos rūgšties fenetilo esteris pasižymi lipofiliškumu, kuris pagerina jo patekimą į ląsteles, inhibuoja arachidono rūgštį, slopindamas COX–1 ir COX–2 fermentų aktyvumą ir inhibuodamas COX–2 išsiskyrimą suteikia pageidaujamą antiuždegiminį poveikį [35]. Dar vienas iš kavos rūgšties fenilo esterio pagrindinių veikimo mechanizmų yra branduolio faktoriaus κB (BF–κB) aktyvavimo inhibavimas. BF–κB aktyvavimą gali sukelti įvairios uždegimininiuose procesuose dalyvaujančios medžiagos, tokios kaip lipopolisacharidai, auglio nekrozės faktorius (TNF–α), vandenilio peroksidas ir kt. BF–κB slopinimas vyksta dalinai dėl KRFE slopinamo IκB kinazės komplekso aktyvumo. KRFE susilpnina uždegimo citokinų gamybą [45].
Dėl propolio veikliųjų junginių antiuždegiminio veikimo mechanizmų, manoma, kad propolis tinkamas ūmiam, lėtiniam, dirgliam ar su imuniteto ligomis susijusiam uždegimui malšinti, todėl jis dažnai naudojamas esant uždegiminėms odos, sąnarių bei kitokio pobūdžio ligoms [9].
1.6. Antibakterinis, antivirusinis, antigrybelinis propolio poveikis
Svarbiausią poveikį propolyje lemia fenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai), alifatinės bei aromatinės rūgštys ir jų esteriai, terpenoidai. Iš šių grupių junginių gausiausi yra flavononai, dihidroflavonoliai bei kumaro ir ferulo rūgštys [30]. Moksliškai įrodyta, jog antibakterinis aktyvumas europinio tipo propolyje pasireiškia dėl jame esančių flavonoidų ir fenolinių junginių [30]. Fenolinių rūgščių esteriai, ypač kavos ir ferulo rūgščių, apibūdinami kaip antibakterinį, antivirusinį poveikį turintys, nuo grybelio saugantys veiklieji junginiai. Propolis yra vienas veiksmingiausių natūralių antibiotikų dėl savo plataus veikimo spektro. Propolio vartojimas nesukelia mikroorganizmų atsparumo ir nežaloja natūralios organizmo mikrofloros [24].
Būtent įvairūs flavonoidai, t.y. pinocembrinas, galanginas, chrizinas, tektochrizinas, kvercetinas, isoramnetinas, kemferolis, manoma, lemia svarbiausią antibakterinį, antigrybelinį, antivirusinį veikimą. Kuo flavonoidų nustatoma daugiau, tuo stipresnis poveikis lemiamas [30]. Chrizinas bei kemferolis gerai silpnina herpes, A ir B tipo gripo, rotavirusus [28]. Kiti propolyje esantys junginiai – terpenoidai arba terpenai, pavyzdžiui, celastrolis, kukurbitacinas, alisolis, pachiminė rūgštis bei kiti junginiai turi teigiamą poveikį apsaugant nuo vėžio, maliarijos, uždegimų bei daugelio infekcinių ligų, kurias dažnai sukelia virusai ir bakterijos. Būtent triterpenoidai yra labiausiai tiriami propolyje, tiek in vitro, tiek in vivo, kad galėtų būti plačiai taikomi vėžinių susirgimų gydymui [30].
Grupės mokslininkų buvo tirtos propolio antimikrobinės savybės prieš Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans ir Asparagus niger padermes. Etanoliniai propolio ekstraktai turėjo didelį antibakterinį aktyvumą prieš gram teigiamas bakterijų, t.y. Bacillus subtilis, padermes, bet mažą aktyvumą prieš gram neigiamas bakterijų (P. aeruginosa ir E. coli) padermes [44]. Propolio poveikis prieš C. albicans padermes buvo vidutinio stiprumo, tačiau neveikė A. niger padermių [44]. Dėl šio ir įvairių kitų propolio antimikrobinio bei antigrybelinio veikimo tyrimų, galima teigti, kad propolis yra vidutinio stiprumo antimikrobinis augalinis šaltinis, kurio antibakterinį poveikį daugiausiai lemia propolyje randami dideli fenolinių junginių kiekiai, iš kurių aktyviausi prieš bakterijas yra aromatinės rūgštys ir jų esteriai (cinamatai ir ftalatai) [44].
1.7. Priešvėžinis ir imunomoduliacinis propolio poveikis
Vienas junginių, nulemiančių propolio antiuždegimines bei antinavikines savybes yra kavos rūgšties fenetilo esteris (KRFE). Šio junginio daugiausiai aptinkama žaliajame Brazilijoje randamame propolyje, jis taip pat yra vienas stipriausių propolio biologiškai aktyvių junginių, sintetinamų laboratorijoje. Daugelio mokslininkų ištirtas šio junginio priešvėžinis poveikis slopinant DNR sintezę, slopinant navikų ląstelių augimo signalinius kelius ir apoptozės slopinimas veikiant vidinį apoptozės kelią bei antiangiogeninio poveikio skatinimas [15]. Nustatyta, jog Brazilijoje surenkamas propolis, padidina žmogaus makrofagų baktericidinį aktyvumą [2]. Propolis turi priešvėžinį poveikį, tačiau tikslūs šio poveikio mechanizmai vis dar nėra galutinai aiškūs. Braziliškame propolyje randamas artepilinas C (3,5–diprenil–4–hidroksicinamono rūgštis), kuris yra vienas pagrindinių šios rūšies propolio veikliųjų junginių [15]. Naudojant artepiliną C žmonių ir pelių piktybinių auglių in vitro ir in
vivo tyrimuose, pastebėta, kad ši medžiaga turi citotoksinį poveikį ir dėl to auglių ląstelių augimas gali
artepilinas C daro didelę žalą leukeminėms ląstelėms. Artepilinas C gali naikinti vėžines ląsteles, padidindamas T ląstelių, kitaip žinomų kaip T limfocitai, sukeliamą citotoksiškumą, didindamas santykį tarp antigenui specifiškų, su infekcijomis kovojančių CD4 T ląstelių ir vėžines ląsteles žudančių CD8 T ląstelių bei bendrą T ląstelių skaičių in vivo. Būtent CD4 ir CD8 T ląstelės daugiausiai kontroliuoja naviko augimą. Apibendrinant artepilino C poveikį, galima teigti, kad jis aktyvuoja organizmo imuninę sistemą ir turi tiesioginį priešvėžinį poveikį [36].
Imunomoduliacinį propolio poveikį taip pat lemia jame esantys aktyvieji junginiai, kurių kiekis ir įvairovė priklauso nuo vietos klimato, aplinkos bei augalų rūšių, iš kurių propolis buvo surinktas. Mokslininkai, palyginę keturiose skirtingose šalyse: Brazilijoje, Naujojoje Zelandijoje, Kinijoje bei Tasmanijoje surinkto propolio etanolinių ekstraktų poveikį žmogaus periferinio kraujo vienbranduolėms ląstelėms, nustatė, kad iš visų tirtų propolio rūšių, tik braziliškasis propolis turėjo reikšmingą proliferaciją skatinantį poveikį minėtoms ląstelėms [15]. Teigiama, kad stimuliuojantis braziliškojo propolio poveikis buvo dėl ląstelių mitochondrijų aktyvumo didinimo, kai, tuo tarpu, kitose šalyse surinkto propolio ekstraktai veikė ląsteles citotoksiškai. Braziliškasis propolis buvo vienintelis surinktas atogražų regione, todėl jo cheminė sudėtis, kuriai būdingas imunomoduliacinį poveikį turintis artepilinas C, išsiskyrė iš kitų propolio rūšių, kurių cheminė sudėtis buvo panaši vienas į kito. Dėl propolio skirtingo biologinio aktyvumo bei skirtingos cheminės sudėties, kuri kasmet gali įvairuoti, tyrimai atliekami ne vieną kartą, tam, kad būtų išvengiama klaidingos rezultatų interpretacijos [15].
Paties artepilino C imunomoduliuojančio poveikio tyrimų yra vykdoma mažiau nei KRFE, galimai dėl jo paplitimo vien tik Brazilijos žaliąjame propolyje. Yra žinoma, kad artepilinas C gali slopinti neutrofilų mobilizaciją į uždegimo vietą ir dėl šių savybių artepilinas C gali būti kaip antialerginis junginys, tiriamas jo imunomoduliacinis poveikis [36].
1.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Propolis kaupia įvairių grupių aktyvius junginius, todėl jo ekstraktai pasižymi kompleksiniu veikimu. Mokslinėse publikacijose galima rasti išsamios informacijos apie propolio fitocheminę sudėtį ar galimą biologinį poveikį žmogaus organizmui. Propolis tinkamas daugelio ligų ar būklių gydymui, nes pasižymi antioksidantiniu, antiuždegiminiu veikimu, taip pat antibakteriniu, antigrybeliniu, antivirusiniu, priešvėžiniu veikimu ir imunomoduliaciniu aktyvumu, kuriuos lemia fenolinių junginių gausa propolyje. Nors fitocheminės propolio sudėties tyrimų atliekama nemažai, trūksta duomenų apie propolio fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimus. Atsižvelgiant į tai, atlikti skirtinguose regionuose surinkto propolio ėminių sudėties tyrimai.
2. METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Eksperimentui naudota propolio žaliava iš 3 skirtingų regionų: Lietuvos – 3 mėginiai, Brazilijos –1 mėginys, Rumunijos – 1 mėginys. (3 lentelė). Propolio etanoliniai ekstraktai (ekstrahentu naudotas 70% etanolis) paruošti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedroje.
3 lentelė. Propolio bandinių žymėjimas Žymėjimas Kilmės šalis, regionas
I Lietuva, Šiaulių raj.
II Lietuva, Kėdainių raj.
III Lietuva, Lazdijų raj.
IV Rumunija, Sibiu reg.
V Brazilija, Minas Gerais apskr.
2.2. Naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva), Folin–Ciocalteu reagentas, natrio karbonatas, galo rūgštis, natrio hidroksidas (gamintojas „Chempur“, Tarnovske Gurai, Lenkija), DMCA (p– dimetilaminocinamaldehidas), acto rūgštis, ABTS (2,2'–azino–bis(3–etilbenzotiazolino–6–sulfoninė rūgštis), troloksas (6–hidroksi–2,5,7,8–tetrametilchroman–2–karboksilinė rūgštis), kalio persulfatas, vario (II) chlroridas, neokuproinas, amonio acetatas,DPPH (2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas), natrio acetatas (gamintojas „Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), TPTZ (gamintojas „Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), geležies (III) chloridas heksahidratas (gamintojas „Vaseline–Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), sieros rūgštis, acetonitrilas (gamintojas „Sigma–aldrich“, Steinheimas, Vokietija), acto rūgštis (gamintojas „Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); (+)– katechinas, (–)–epikatechinas,
rutinas, izokvercitrinas, chlorogeno rūgštis, natrio molibdatas, natrio nitritas, vandenilio chlorido rūgštis (gamintojas „Sigma–Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija).
ESC grynumo standartiniai junginiai: kvercitrinas (≥98 proc.) („ChromaDex“, JAV); chlorogeno rūgštis (≥95 proc.), galo rūgštis (≥95 proc.); apigeninas (≥95 proc.), viteksinas (≥95 proc.), avikuliarinas (≥95 proc.), floridzinas (≥95 proc.), galanginas (≥95 proc ), rutinas (≥95 proc.) iš „Carl Roth GmbH“, Karlsrujė, Vokietija; izoramnetinas (≥95 proc.), izoramnetino–3–O–rutinozidas (≥95 proc.), izoramnetino–3–O–gliukozidas (≥95 proc.), kvercetinas (≥95 proc.), kemferolio–3–O– gliukuronidas (≥95 proc.), kemferolis (≥95 proc.), neochlorogeno rūgštis (≥95 proc.), 3,4– dihidroksibenzoinė rūgštis (≥95 proc.), p–kumaro rūgštis (≥95 proc.), vanilino rūgštis (≥95 proc.), kavos rūgštis (≥95 proc.), ferulo rūgštis (≥95 proc.), kavos rūgšties fenetilo esteris (≥95 proc.), įsigyti iš „Sigma–Aldrich GmbH“, Steinheim, Vokietija; Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩ*cm
–1 ), ruoštas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
2.3. Naudota aparatūra
Propolio ėminių smulkinimas atliktas elektriniu malūnu „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Svėrimai atlikti elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64 – 0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija).
Spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV–regimosios šviesos spektrofotometrą „M550“ ( „Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė).
Fenolinių rūgščių ir flavonoidų analizė atlikta naudojant ultra efektyvųjį skysčių chromatografą ,,Acquity H–class“ („Waters“,Milfordas, JAV), taikant masių spektrometrinį detektorių ,,Waters Xevo“ („Waters“,Milfordas, JAV).
2.4. Propolio ekstraktų paruošimas
Ekstrakcija yra svarbi tiriamojo bandinio analizės dalis, ji turi didelę įtaką gautų duomenų tikslumui, vertinant augalinėje žaliavoje esančius biologiškai aktyvius junginius [18].
Žaliavos paruošimas. Propolis iki ekstrakto ruošimo turi būti laikomas sausoje, vėsioje,
tamsioje vietoje. Prieš ekstrakciją propolis atšaldytas ir susmulkintas malūnėliu iki miltelių.
Etanolinių ekstraktų paruošimas. Ruošiamas 30 proc. propolio etanolinis ekstraktas.
kambario temperatūroje tris paras, jį pamaišant keletą kartų (5–6 kartus) per dieną. Gautas ekstraktas nufiltruojamas per filtrinį popierių. Nufiltruotas ekstraktas dedamas į šaldytuvą dar dviems paroms, kad atsiskirtų vaškai. Tuomet ekstraktas dar kartą filtruojamas per filtrinį popierių, gaunamas skaidrus tirpalas, kurį galima naudoti tyrimams. Naudojant lietuvišką propolį gautas skaidrus, geltonai oranžinės spalvos tirpalas, rumunišką propolį – oranžiniai rusvos spalvos, o brazilišką – žaliai rusvos spalvos tirpalai.
2.5. Tyrimo metodai
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ekstrakte
spektrofotometriniu metodu
Tyrimo metu taikytas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis Folin–Ciocalteu metodas. Naudota Bobinaitės ir kt. straipsnyje aprašyta bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodika, nežymiai ją modifikavus [9].
Mėginio paruošimas. 0,2 ml etanolinės propolio ištraukos praskiedžiama 4 ml 70 proc. (v/v)
etanoliu. 0,2 ml praskiestos propolio etanolinės ištraukos sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin– Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [9].
Lyginamojo tirpalo paruošimas. 0,2 ml etanolio sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin– Ciocalteu
reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [9].
Visi tiriamieji mėginiai gerai sumaišomi pradedant nuo tuščio bandinio.
Visi tiriamieji bandiniai 60 min. laikyti tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Po to spektrofotometru, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [9]. Kalibravimo grafikas (y = 0,2029x − 0,0052; R2=0,9802) sudarytas, naudojant 0,25−4 mg/ml koncentracijos etaloninius galo rūgšties tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę ir išreikštas galo rūgšties ekvivalentu mg GRE/g:
! =# × & ' [9] C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g;
X – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas propolio ekstrakte
spektrofotometriniu metodu
Šis metodas yra selektyvus tik flavonoliams ir flavonams nustatyti, nors apibūdinamas kaip „bendro” flavonoidų kiekio nustatymui skirtas. Metodas pagrįstas aliuminio komplesų su flavonoidais susidarymu ir šis skaidrių tirpalų tyrimas spektrofotometru turi būti atliekamas esant bangos ilgiui 404 – 430 nm, kadangi tai yra selektyvi riba flavonoidų junginiams nustatyti, todėl tyrime tinkamai pasirinkta tirti tirpalus esant 407 nm bangos ilgiui. Aliuminio tirpalo koncentracija turėtų būti nuo 2 iki 10 proc., kaip ir pasirinkta aprašomame metode, o tirpalų parūgštinimui atitinkamai naudojama silpna rūgštis [8].
Tiriamojo tirpalo paruošimas : į 0,5 ml ekstrakto pilama 2 ml 96 proc. etanolio, 0,1 ml 30
proc. vandeninio CH3COOH tirpalo, 0,3 ml 10 proc. vandeninio AlCl3 tirpalo, 1,2 ml išgryninto vandens. Palaikoma 30 min. ir tuomet įpilama 0,4 ml 5 proc. vandeninio urotropino tirpalo [37].
Palyginamojo tirpalo paruošimas: į 0,5 ml ekstrakto pilama 2 ml 96 proc. etanolio, 0,1 ml 30
proc. vandeninio CH3COOH tirpalo, 1,9 ml išgryninto vandens.
Etaloninio rutino tirpalo paruošimas: 0,0125 g rutino ištirpinama 25 ml 70 proc. C2H5OH matavimo kolbutėje. Šviesos absorbcija matuojama po 30 min. Bangos ilgis l= 407 nm [37]. Buvo paruošta 25 ml šio tirpalo.
Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (proc.):
! = # %&'()* × , -./'%0.'* × 1 -./'%0.'*
# ž03(04*/ × 1 %&'()* × , %&'()* × 100% [37] m (rutino) – rutino masė, kuri buvo reikalinga rutino tirpalui paruošti, g;
V(ekstrakto) – visas paruoštas propolio ekstrakto tūris, ml;
D (ekstrakto) – paruošto propolio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m (žaliavos) – propolio masė sunaudota ekstraktui ruošti, g;
D (rutino) – tiriamojo rutino tirpalo absorbcijos dydis; V (rutino) – tiriamojo rutino tirpalo tūris, ml.
2.5.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas propolio
ekstrakte spektrofotometriniu metodu
darinių kiekio nustatymo metodika su nežymiais patobulinimais [20].
Mėginio paruošimas. Mėginys gaminamas 10 ml volumetrinėje kolbutėje. Į 0,5 ml ekstrakto
įpilama 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml Arnow reagento (10 proc. natrio molibdato tirpalo vandenyje su 10 proc. natrio nitrito tirpalu vandenyje, sumaišytų santykiu 1:1), 2 ml 8,5 proc. NaOH tirpalo. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio [20].
Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 0,25 ml ekstrakto, 0,9 ml
50 proc. (v/v) etanolio, 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml NaOH ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki brūkšnio [20].
Spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [20]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 1,3584𝑥 − 0,0616; R2=0,9973) sudarytas, naudojant 0,0625−1 mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuotas pagal formulę ir išreiškiamas chlorogeno rūgšties ekvivalentu:
! =# × & ' [20]
C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, mg CRE/g;
X – chlorogeno rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.4. Antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte
spektrofotometriniu metodu
ABTS ir DPPH antiradikaliniai metodai parodo antioksidantų gebėjimą surišti DPPH•, ABTS•+ laisvuosius radikalus [26]. ABTS•+ laisvasis radikalas−katijonas tirpus vandeniniuose ir organiniuose tirpikliuose, ši savybė leidžia atlikti hidrofilinių ir lipofilinių junginių antiradikalinio aktyvumo nustatymą, silpnai šarminėje reakcijos terpėje (pH=7,4) [26, 47]. DPPH• radikalas tirpus tik organiniuose tirpikliuose, todėl ši savybė apriboja hidrofilinių junginių antiradikalinio aktyvumo nustatymą [25]. Taikant CUPRAC metodą, redukcinis aktyvumas, esant pH=7,0, vertinamas pagal antioksidantų gebėjimą redukuoti Cu(II) į Cu(I) [3]. FRAP metodo pagalba rūgštinėje terpėje (pH=3,6) nustatomas antioksidantų redukcinis aktyvumas, redukuojant Fe(III) į Fe (II) [25].
2.5.4.1 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte
ABTS radikalų−katijonų surišimo metodu
Naudota Yim ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodika [51], nežymiai ją modifikavus. Pirmiausia gaminamas 2 mmol/l ABTS•+ motininis tirpalas. 0,0548 g ABTS (2,2'–azino–bis–(3–etilbenzotiazolin–6–sulfoninė rūgšties) miltelių tamsaus stiklo buteliuke ištirpinami 50 ml išgrynintojo vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K2S2O8. Pagamintas motininis ABTS tirpalas laikomas tamsoje 16 val., kol vyksta oksidacijos−redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+ [51]. Susidaręs radikalas−katijonas išlieka stabilus 2 paras, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje [51]. Darbinis ABTS•+ tirpalas gaminamas motininį tirpalą skiedžiant išgrynintuoju vandeniu, kol, esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8 ± 0,03 [51].
Mėginio paruošimas: 10 µl propolio etanolinės ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio ABTS•+
tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [51]. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,00009x – 0,0081; R² = 0,99886) sudarytas, naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.5.4.2 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte
DPPH radikalų surišimo metodu
Naudota Yim ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo DPPH metodika [51], nežymiai ją modifikavus. Pirmiausia gaminamas motininis 60 µmol/l koncentracijos DPPH tirpalas. 0,0012 g DPPH miltelių ištirpinama 50 ml 96 proc. (v/v) etanolyje. Darbinis tirpalas skiedžiamas 96 proc. (v/v) etanoliu, kol 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis, išmatuotas spektrofotometru, kai bangos ilgis 517 nm, pasiekia 0,8 ± 0,03 [51].
Mėginio paruošimas: 10 µl propolio ekstrakto sumaišyta su 3 ml darbinio DPPH tirpalo.
Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 517 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [51]. Lyginamasis tirpalas – 96 proc. (v/v) etanolis [50]. Kalibravimo grafikas (y = 0,00003x + 0,0152; R2=0,99889) sudarytas, naudojant 400–18000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.5.4.3 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas propolio ekstrakte
FRAP metodu
Tyrimo metu naudota Raudonės ir kt. straipsnyje skelbta redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [41]. Analizei paimta 5 µl propolio ekstrakto.
Darbinis FRAP tirpalas gaminamas sumaišius A, B ir C tirpalus santykiu 10:1:1.
• A tirpalas – 300 mmol/l buferinis CH3COONa tirpalas. Atsveriama 0,775 g CH3COONa, pridedama 4 ml ledinės acto rūgšties ir matavimo kolboje praskiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki 250 ml;
• B tirpalas – 10 mmol/l TPTZ tirpalas. Tirpalas gaunamas ištirpinant 0,0781 g TPTZ miltelių 40 mmol/l HCl parūgštintame išgrynintame vandenyje 25 ml matavimo kolbutėje;
• C tirpalas – 20 mmol/l FeCl3 x 6H2O vandeninis tirpalas. Atsveriama 0,1352 g FeCl3 x 6H2O (geležies (III) chlorido heksahidrato) ir ištirpinama išgrynintajame vandenyje 25 ml kolbutėje [41].
Mėginio paruošimas: 5 µl propolio ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio FRAP tirpalo.
Mėginys laikomas tamsoje 30 min., praėjus šiam laikui, esant 593 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – darbinis FRAP tirpalas, nepridėjus etanolinio propolio ekstrakto [41].
Kalibravimo grafikas (y = 0,00005x + 0,0183; R2 = 0,99918) sudarytas, naudojant 400–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.5.4.4 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu
Taikyta Apak ir kt. straipsnyje aprašytą redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [4], modifikavus paimamo ekstrakto tūrį. Darbinis CUPRAC tirpalas gaunamas sumaišius A, B ir C tirpalus santykiu 1:1:1:
• A tirpalas – 10 mmol/l CuCl2 tirpalas. 0,085 g CuCl2 ištirpinama išgrynintame vandenyje 50 ml kolbutėje;
• B tirpalas – 1 mmol/l CH3COONH4 buferinis tirpalas (pH=7). 0,0038 g CH3COONH4 ištirpinama išgrynintame vandenyje 50 ml kolbutėje;
• C tirpalas – 7,5 mmol/l neokuproino etanolinis tirpalas. 0,078 g neokuproino ištirpinama 96 proc. (v/v) etanolyje 50 ml kolbutėje [4].
Mėginio paruošimas: 10 µl propolio ekstrakto sumaišoma su 3 ml šviežiai paruošto darbinio
CUPRAC tirpalo. Mėginys laikomas tamsoje 30 min., praėjus šiam laikui, esant 450 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [4]. Lyginamasis tirpalas – darbinis CUPRAC tirpalas, nepridėjus etanolinio ekstrakto [4]. Kalibravimo grafikas (y=0,00005x + 0,0039; R2= 0,99929) buvo sudarytas, naudojant 400−24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.5.5. Antioksidantinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas
Propolio ėminių ekstraktų antioksidantinis aktyvumas apskaičiuotas pagal trolokso kalibravimo grafikus ir išreikštas trolokso ekvivalentu (µmol TE/g) absoliučiai sausai žaliavai. Trolokso ekvivalentas (TE) atitinka trolokso kiekį (µmol), kuris lygiai tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turi tokį patį antioksidantinį aktyvumą, kaip 1 g žaliavos. Tiriamųjų ištraukų antioksidantinis aktyvumas in vitro, išreikštas TE ekvivalentu (µmol TE/g), apskaičiuojamas pagal formulę: !" = $ + & ' × 1000 × , &'-.. 0 &'-..
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis;
a – nuolydis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;
V band. – tiriamos augalinės žaliavos ištraukos bandinio tūris, ml; m band. – tiriamos augalinės žaliavos atsvertas (tikslus) kiekis, g.
2.5.6. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Pritaikant mokslinėje literatūroje aprašytą validuotą ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, detekcijai naudojant masių spektrometrinį detektorių, bendradarbiaujant su FTI ir Farmakognozijos katedros mokslininkais, atlikta fenolinių rūgščių ir flavonoidų grupių junginių kokybinė ir kiekinė analizė.
Lietuvoje (Šiaulių raj.) surinktų propolio ėminių ekstraktų kokybinė ir kiekinė analizė atlikta UESC metodu. Naudotas Acquity H–class („Waters“, Milfordas, JAV) skysčių chromatografas su
„Xevo TQD“ masių spektrometru („Waters“, Milfordas, JAV). Chromatografiniam skirstymui taikyta „YMC Triart C18“ (100 Å, 1,9 µm 100 × 2,0 mm) („YMC“, Kiotas, Japonija) kolonėlė su prieškolonėle. Kolonėlė laikoma termostate, kur palaikoma pastovi 40 °C temperatūra. Metodikos mobili fazė sudaryta eliuento A (0,1 proc. vandeninis skruzdžių rūgšties tirpalas) ir eliuento B (acetonitrilas). Pradinės eliucijos sąlygos – 95 proc. A ir 5 proc. B išlaikomos 1 min. iki 5 min. kinta iki 70 proc. A, 7 min kinta iki 50 proc. A. 7,5 – 8 min išlaikoma 0 proc. A tirpiklio, 8,1 grąžinama į pradines sąlygas. Gradientinės eliucijos bendra trukmė – 10 min. Injekcijos tūris – 1 µl. Eliuento tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Masių spektrometro parametrai: neigiama elektropurkštuvinė jonizacija, įtampa kapiliare – 2500 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento dujų išgarinimo tėkmės greitis – 800 l/val, eliuento išgarinimo temperatūra – 500 °C.
Fenolinių junginių smailės buvo analizuojamos MRM režimu [53], skirtinguose MRM kanaluose kiekvienas junginys apskaičiuojamas pagal masę. Chromatografinės smailės identifikuotos pagal etaloninio junginio bei analitės sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus. Kiekybinis analičių įvertinimas buvo atliktas pagal sudarytas kalibracijos lygtis remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale [53]. Kiekvieno analizuojamo junginio masių spektrofotometro parametrai skiriasi (4 lentelė).
4 lentelė. Masių spektrometro parametrai fenolinių junginių analizei. Junginys Tėvinis jonas
(m/z) Dukterinis jonas (m/z) Kūgio įtampa, V Ardymo kameros energija, eV 3,4–dihidroksibenzoinė rūgštis 153 81 32 20 P–kumaro rūgštis 163 93 28 22 Vanilino rūgštis 167 152 26 12 Galo rūgštis 169 51 36 30 Kavos rūgštis 179 107 36 22 Ferulo rūgštis 193 134 32 18 Apigeninas 269 117 54 36 Galanginas 269 171 50 30
Kavos rūgšties fenetilo
esteris 283 135 50 30
Kemferolis 285 185 50 25
Kvercetinas 301 151 48 20
Neochlorogeno rūgštis 353 191 32 14 Chlorogeno rūgštis 353 191 32 14 Viteksinas 431,1 311 50 22 Avikuliarinas 433 301 50 20 Floridzinas 435 273 42 14 Kvercitrinas 447 300 50 26 Kemferolio–3–O– gliukuronidas 461 285 36 20 Izoramnetino–3–O– gliukozidas 477 314 60 28 Rutinas 609 300 70 38 Izoramnetino–3–O– rutinozidas 623 315 70 32
2.6. Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2017“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 23“ („IBM“, JAV). Tyrimo metu apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Kiekinės sudėties įvairavimo įvertinimui apskaičiuotas variacijos koeficientas. Taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA, įvertinta, ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi. Jei p reikšmė yra mažesnė už 0,05 (p<0,05) tai skirtumas tarp šių duomenų yra statistiškai reikšmingas.
Hipotezės apie dispersijų lygybę tikrinimui naudotas Livyno kriterijus. Nustačius, kad nepriklausomų kintamųjų dispersijos yra lygios, taikytas daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijus. Duomenų koreliacijai įvertinti nustatytas Pirsono koreliacijos koeficientas. Remiantis literatūra, koreliacijos koeficientų ryšiai vertinti pagal stiprumą: |r|<0,3 koreliacinis ryšys laikytas labai silpnu, kai 0,3<|r|<0,5 silpnu, kai 0,5<|r|<0,7 vidutinio stiprumo, kai 0,7<|r|<0,9 stipriu, o kai 0,9<|r|≤1 labai stipriu [14].
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas propolio žaliavose
Įvertintas suminis sukaupiamų fenolinių junginių kiekis skirtinguose regionuose surinkto propolio žaliavose. Bendras fenolinių junginių kiekis skirtinguose regionuose surinkto propolio žaliavose įvairuoja nuo 14,51 ± 0,63 mg GRE/g iki 85,46 ± 3,98 mg GRE/g (1 pav.). Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis propolio ekstrakte nustatytas Minas Gerais apskr., Brazilijoje surinktos žaliavos ėminiuose – 85,46 ± 3,98 mg GRE/g, nedaug skyrėsi Sibiu reg., Rumunijoje surinktoje žaliavoje nustatytas kiekis – 81,98 ± 1,52 mg GRE/g. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Lietuvoje surinktoje žaliavoje: visi trys tirti propolio ėminiai, surinkti skirtinguose Lietuvos rajonuose, pasižymėjo panašiu bendru fenolinių junginių kiekiu: Šiaulių rajone surinktame propolyje – 14,51 ± 0,63 mg GRE/g, Kėdainių rajone – 16,00 ± 0,45 mg GRE/g, o Lazdijų rajone– 15,14 ± 0,72 mg GRE/g. Taigi, Brazilijoje ir Rumunijoje surinktuose ėminiuose bendras fenolinių junginių kiekis buvo apie 6 kartus didesnis, nei Lietuvoje surinkto propolio mėginiuose. Šis skirtumas buvo statistiškai reišmingas (p<0,05).
1 pav. Skirtinguose regionuose surinkto propolio ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas;
Popova ir kt. atliktame tyrime nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis europinio tipo propolio ekstraktuose įvairavo nuo 19,0 iki 28,3 mg/ml [39], tad mūsų nustatyta fenolinių junginių koncentracija, įvairuojanti nuo 14,51 ± 0,63 mg GRE/g iki 16,00 mg GRE/g buvo šiek tiek mažesnė nei įvardijama Popovos ir kt. mokslininkų [39]. Mello ir kt. tirdami braziliškojo propolio etanolinius ekstraktus nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 49,80 ± 3,03 mg/g iki 100,59 ± 2,27 mg/g. [32], šis kiekis buvo panašus į mūsų nustatytą tirto braziliškojo propolio ekstrakto suminį fenlonių junginių kiekį – 85,46 ± 3,98 mg GRE/g. Stoia ir kt. tirdami skirtinguose Rumunijos regionuose surinkto propolio ekstraktus, nustatė, kad fenolinių junginių koncentracija – 971±79,6 mg GRE/100 g – ši koncentracija, persiskaičiavus, buvo mažesnė nei mūsų tirto rumuniškojo propolio ekstrakto (81,98 ± 1,52 mg GRE/g) [46], o Gatea ir kt. taip pat tirdami rumuniško propolio ekstraktus, nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis skirtinguose Rumunijos regionuose surinktame propolyje įvairuoja nuo 189,49 ± 0,23 iki 242,55 ± 0.41 mg KRE/g, tad mūsų tirtame Rumunijoje surinkto propolio pavyzdyje šis kiekis buvo 2,3–2,9 kartus mažesnis nei jų nustatyta [21].
3.2. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas propolio žaliavose
Suminis flavonoidų kiekis propolio žaliavoje skirtinguose regionuose įvairuoja nuo 10,38 ± 0,22 mg RE/g iki 21,31 ± 0,26 mg RE/g (2 pav.). Tirtuose propolio ėminių ekstraktuose didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas Brazilijoje (Minas Gerais apskr.) surinktos žaliavos ėminiuose – 21,31 ± 0,26 mg RE/g ir Rumunijoje (Sibiu apskr.) – 16,35 ± 0,74 mg RE/g, mažiausias – Lietuvoje: Lazdijų raj. – 10,38 ± 0,22 mg RE/g, Kėdainių raj. – 11,18 ± 0,53 mg RE/g ir Šiaulių raj. – 12,55 ± 0,56 mg RE/g (2 pav.). Taigi, Rumunijoje ir Brazilijoje surinktos žaliavos ėminiuose bendras fenolinių junginių kiekis buvo atitinkamai apie 1,5–2 kartus didesnis, nei Lietuvoje surinkto propolio mėginiuose. Šis skirtumas buvo statistiškai reišmingas (p<0,05).
2 pav. Skirtinguose regionuose surinkto propolio ekstraktų bendro flavonoidų kiekio įvairavimas; Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų propolio ekstraktų (p<0,05).
Bankova ir kt. tyrime nustatytas bendras flavonoidų kiekis europinio tipo propolyje įvairavo nuo 1,1 proc. iki 60,7 proc. [6], o mūsų tirtuose Lietuvoje surinktuose propolio ėminiuose, flavonoidų bendrą kiekį žaliavose perskaičiavus procentais, flavonoidų bendras kiekis žaliavose buvo 24,5 ± 1,0 proc., todėl šis kiekis atitinka Bankovos ir kt. nustatytą flavonoidų įvairavimą (nuo 1,1 proc. iki 60,7 proc.) europinio tipo propolyje [6]. Mello ir kt. autorių Brazilijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad braziliškojo propolio etanoliniuose ekstraktuose bendras flavonoidų kiekis buvo nuo 64,91 ± 1,11 mg/g iki 69,35 ± 0,38 mg/g [32], mūsų tirtas Brazilijoje surinktas propolis pasižymėjo apie 3 kartus mažesniu bendru flavonoidų kiekiu (21,31 ± 0,26 mg RE/g) nei nustatė Mello ir kt. Marghitas it kt. Rumunijoje atliktas europinio tipo propolio tyrimas nustatė, kad rumuniškame propolyje yra apie 10 proc. flavonoidų, tačiau tiriant mūsų rumuniško propolio pavyzdį, rezultatus perskaičiavus procentais, buvo nustatytas 3 kartus didesnis procentinis bendras flavonoidų kiekis (30,0 ± 1,0 proc.) nei nustatė Marghitas ir kt. [31].
3.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas propolio
žaliavose
Įvertintas bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis skirtingų regionų propolio ėminiuose. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis propolio žaliavoje skirtinguose regionuose įvairuoja nuo 0,30 ± 0,01 mg CRE/g iki 2,24 ± 0,03 mg CRE/g (3 pav.). Tirtuose mėginiuose didžiausias suminis hidroksicinamono rūgščių kiekis nustatytas Brazilijoje (Minas Gerais
apskr.) ir Rumunijoje (Sibiu reg.) surinktos žaliavos ėminiuose, 2,24 ± 0,03 mg CRE/g ir 1,99 ± 0,05 mg CRE/g, atitinkamai. Mažiausias kiekis hidroksicinamono rūgščių nustatyta Lietuvoje: Lazdijų raj. rinktos žaliavos ėminiuose – 0,30 ± 0,01 mg CRE/g, Kėdainių raj. – 0,37 ± 0,01 mg CRE/g, Šiaulių raj. – 0,38 ± 0,01 mg CRE/g. Taigi, Brazilijoje ir Rumunijoje surinktos žaliavos ėminiuose suminis hidroksicinamono rūgščių kiekis buvo apie 7 kartus didesnis, nei Lietuvoje surinkto propolio mėginiuose. Šis skirtumas buvo statistiškai reišmingas (p<0,05).
3 pav. Skirtinguose regionuose surinkto propolio ekstraktų bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas;
Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų propolio ekstraktų (p<0,05).
Pietta ir kt. Italijoje atliktame tyrime bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis skirtinguose mėginiuose įvairavo nuo 0,01 iki 0,86 mg/ml [38]. Šis kiekis, perskaičiavus, buvo panašus į mūsų tirtuose Lietuvos pavyzdžiuose nustatytą bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių kiekį.
3.4. Antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimas ABTS metodu tirtose
propolio žaliavose
4,15 ± 0,04 µmol TE/g iki 13,11 ± 0,26 µmol TE/g (4 pav.). Tirtuose mėginiuose didžiausias antiradikalinis aktyvumas, tirtas ABTS metodu, nustatytas Brazilijoje (Minas Gerais apskr.) surinktos žaliavos ėminiuose – 13,11 ± 0,26 µmol TE/g, kiek mažesnis – Rumunijoje (Sibiu apskr.) – 8,99 ± 0,28 µmol TE/g, mažiausias – Lietuvoje: Lazdijų raj. – 4,15 ± 0,04 µmol TE/g, Kėdainių raj. – 4,63 ± 0,11 µmol TE/g ir Šiaulių raj. – 4,76 ± 0,13 µmol TE/g (4 pav.). Taigi, Brazilijoje surinktų ėminių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas buvo apie 3 kartus didesnis, nei Lietuvoje surinkto propolio ėminių ekstraktų, Rumunijoje surinkto propolio ėminių ištraukų antiradikalinis aktyvumas in vitro apie 2 kartus didesnis nei Lietuvoje surinkto propolio ėminių ištraukų. Šis skirtumas buvo statistiškai reišmingas (p<0,05).
4 pav. Skirtinguose regionuose surinkto propolio ekstraktų antiradikalinio aktyvumo, nustatyto ABTS metodu, in vitro įvairavimas;
Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų propolio ekstraktų redukcinio aktyvumo įverčių (p<0,05).
Gatea ir kt. atliktame tyrime, kuriame buvo vertinami skirtinguose Rumunijos regionuose surinkti propolio mėginiai, nustatyta, kad ištyrus mėginius ABTS metodu, antioksidantinis aktyvumas įvairavo nuo 7,98 ± 0,21 µmol TE/g iki 12,16 ± 0,20 µmol TE/g [21]. Mūsų tirtame, Rumunijoje surinktame propolyje, antioksidantinis aktyvumas, nustatytas ABTS metodu, buvo panašaus dydžio kaip nustatytas Gatea ir kt. mokslininkų, tačiau tirto Lietuvoje surinkto propolio antioksidantinis aktyvumas buvo apie 2 kartus mažesnis nei nustatė Gatea ir kt. [21].
