DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kofeino, teobromino ir teofilino kokybinis ir kiekybinis nustatymas bei palyginimas ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose“. 1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 – 10 Karolis Lukas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 – Karolis Lukas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 –
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 - Liudas Ivanauskas
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
KAROLIS LUKAS
KOFEINO, TEOBROMINO IR TEOFILINO KOKYBINIS IR KIEKYBINIS NUSTATYMAS BEI PALYGINIMAS KSANTINO GRUPĖS ALKALOIDŲ TURINČIUOSE PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
KOFEINO, TEOBROMINO IR TEOFILINO KOKYBINIS IR KIEKYBINIS NUSTATYMAS BEI PALYGINIMAS KSANTINO GRUPĖS ALKALOIDŲ TURINČIUOSE PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Kubilienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas
Data Karolis Lukas
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Tikrasis kakavmedis (Theobroma cacao L.) ... 11
1.2 Arabinis kavamedis (Coffea arabica L.) ... 13
1.3 Kakavos pupelių cheminė sudėtis ... 14
1.4 Kavos vaisių cheminė sudėtis ... 15
1.5 Tikrojo kakavmedžio (lot. Theobroma cacao) vaisių preparatų poveikis ir vartojimas ... 16
1.6 Arabinio kavamedžio (lot. Coffea arabica) vaisių preparatų poveikis ir panaudojimas ... 17
1.7 Kavos pupelių apdorojimas ... 18
1.8 Tiriamųjų veikliųjų medžiagų apibūdinimas ... 18
1.8.1 Kofeinas ... 18
1.8.2 Teobrominas ... 19
1.8.3 Teofilinas ... 20
1.9 Kokybiniai ir kiekybiniai ksantino grupės alkaloidų nustatymo metodai ... 21
1.9.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ... 22
1.9.2 Ultravioletinės regimosios šviesos spektrofotometrija... 23
1.9.3 Kapiliarinė skysčių chromatografija ... 23
1.9.4 Plonasluoksnė chromatografija ... 24
1.10 Lietaratūros apžvalgos apibendrinimas ... 24
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 26
2.1 Tyrimo planavimas ... 26
2.2 Tyrimo medžiagos ir reagentai ... 26
2.3 Įranga ... 27
2.4 Kakavos pupelių skrudinimas ... 27
2.5 Tyrimo objektai ir parinkimo kriterijai ... 27
2.6 Mėginių paruošimas ... 28
2.7 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 28
2.8 Duomenų analizės metodai ... 29
3.1 Kokybinis ir kiekybinis ksantinų grupės alkaloidų nustatymas naudojant ESC analizės metodą 30
3.1.1 Tiriamųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis nustatymas džiovintų kavos uogų arbatoje 31 3.1.2 Tiriamųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis nustatymas tirpioje kavoje ... 34 3.1.3 Skaldymo įtaka ksantino grupės alkaloidų kiekiui termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandiniuose ... 37 3.1.4 Skrudinimo laiko įtaka neskaldytų kakavos pupelių tiriamųjų medžiagų kiekių
nustatymui ... 38 4. IŠVADOS ... 40 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
K. Luko magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Asta Kubilienė 2018–2020 m.; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Kofeino, teobromino ir teofilino kokybinis ir kiekybinis nustatymas bei palyginimas ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose.
Tyrimo tikslas – Atlikti skirtinguose ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose kaupiamų kofeino, teobromino ir teofilino kokybinį ir kiekybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei palyginti gautus rezultatus.
Tyrimo uždaviniai: Atlikti kokybinį ir kiekybinį kofeino, teobromino ir teofilino nustatymą džiovintų kavos uogų arbatos bandiniuose, tirpioje kavoje ir kakavos pupelių bandiniuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Nustatyti ekstrahento įtaką kofeino, teobromino ir teofilino kiekiui džiovintų kavos uogų arbatoje, tirpioje kavoje ir kakavos pupelių bandiniuose. Įvertinti skaldymo įtaką ksantino grupės alkaloidų kiekiui termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandiniuose. Įvertinti skrudinimo laiko įtaką ksantino grupės alkaloidų kiekiui kakavos pupelių bandiniuose. Palyginti skrudintų kakavos pupelių ir termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandinių sudėtyje nustatytų ksantino grupės alkaloidų kiekius, skrudinant kakavos pupeles skirtingą laiką.
Tyrimo objektas ir metodai: Džiovintų kavos vaisių arbata, termiškai neapdorotos kakavos pupelės (skaldytos ir neskaldytos), termiškai apdorotos kakavos pupelės, tirpi kava. Tyrimo metu kokybinei bei kiekybinei medžiagų analizei pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas.
Rezultatai ir išvados: ESC metodu džiovintų kavos uogų arbatos bandiniuose ir tirpioje kavoje kokybiškai nustatyti kofeinas, teobrominas ir teofilinas, o kakavos pupelių bandiniuose – kofeinas ir teobrominas. Didžiausias (388,34 ± 7,22 µg/ml) kofeino kiekis nustatytas džiovintų kavos uogų arbatos preparatus ekstrahuojant 70 proc. etanoliu, didžiausias (p<0,05) teobromino kiekis – ekstrahuojant 10 proc. etanoliu (1,66 ± 0,17 µg/ml). Didžiausi (p<0,05) kofeino (3326,64 ± 328 µg/ml), teobromino (10,88 ± 1,52 µg/ml) ir teofilino (1,80 ± 0,21 µg/ml) kiekiai tirpioje kavoje nustatyti naudojant 70 proc. etanolį. Termiškai neapdorotų kakavos pupelių skaldymas neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos kofeino ir teobromino kiekiui. Įvertinus skrudinimo laiko įtaką ksantino grupės alkaloidų kiekiams skrudintų kakavos pupelių preparatuose, didžiausi (p<0,05) kofeino ir teobromino kiekiai nustatyti skrudinant kakavos pupeles 10 min. (atitinkamai 81,87 ± 2,46 µg/ml ir 400,12 ± 31,21 µg/ml). Skrudinant neskaldytas kakavos pupeles 5 minutes ir 10 minučių, kofeino ir teobromino koncentracijos didėja lyginant su termiškai neapdorotomis neskaldytomis kakavos pupelėmis. Skrudinant 15 minučių bei ilgiau, kofeino ir teobromino kiekiai pradeda mažėti, nustatyti tiriamųjų medžiagų kiekiai yra mažesni negu termiškai neapdorotų neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose.
SUMMARY
K. Lukas Master‘s thesis. Supervisor Doc. dr. Asta Kubilienė 2018–2020 yrs.; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas.
The title: Qualitative and quantitative determination and comparison of caffeine, theobromine and theophylline in xanthine alkaloid containing products.
The aim: Perform qualitative and quantitative determination of caffeine, theobromine and theophylline in different xanthine group alkaloids containing products by high performance liquid chromatography and compare the obtained results.
The objectives of the research: Perform qualitative and quantative determination of caffeine, theobromine and theophylline in dried coffee berries tea samples, instant coffee and cocoa beans samples by high performance liquid chromatography. Determine the effect of extractant on the content of caffeine, theobromine and theophylline in dried coffee berries tea, instant coffee and cocoa beans samples. Evaluate the effect of fragmentation on xanthine group alkaloids content in raw cocoa beans samples. Evaluate the influence of roasting time on the content xanthine group alkaloids in cocoa beans samples. Compare the amounts of xanthine group alkaloids found in samples of roasted cocoa beans and raw cocoa beans by roasting cocoa beans at different times.
The object and methods: Dried coffee berries tea, raw cocoa beans (fragmentated and non fragmentated), roasted cocoa beans, instant coffee. During this research the method of high performance liquid chromatography was chosen for qualitative and quantitative analysis of materials.
Results and conclusions: Caffeine, theobromine and theophylline were qualitatively detected in dried coffee berries tea samples and instant coffee, caffeine and theobromine were detected in cocoa beans samples by using high performance liquid chromatography method. The highest (388,34 ± 7,22 µg/ml) caffeine content was determined by extracting dried coffee berries tea preparations by 70 % ethanol, the highest (p<0,05) theobromine content was determined by extracting with 10 % ethanol (1,66 ± 0,17 µg/ml). The highest (p<0,05) amounts of caffeine (3326,64 ± 328 µg/ml), theobromine (10,88 ± 1,52 µg/ml) and theophylline (1,80 ± 0,21 µg/ml) in instant coffee were determined by using 70 % ethanol. The fragmentation of raw cocoa beans was found to have no statistically significant effect on caffeine and theobromine levels. After evaluating the influence of roasting time on caffeine and theobromine levels in cocoa beans preparations, the highest (p<0,05) amounts of caffeine and theobromine were determined by roasting cocoa beans for 10 minutes (respectively 81,87 ± 2,46 µg/ml and 400,12 ± 31,21 µg/ml). Roasting whole cocoa beans for 5 minutes and 10 minutes caffeine and theobromine concentrations increase compared to unheated whole cocoa beans. When roasted for 15
minutes or more, caffeine and theobromine levels begin to decrease, levels of tested substances are lower than in samples of unheated whole cocoa beans.
SANTRUMPOS
LOPL – lėtinė obstrukcinė plaučių liga ESC – efektyvioji skysčių chromatografija CYP450 – citochromo P450 fermentų sistema cAMF – ciklinis adenozino monofosfatas
ĮVADAS
Kava bei arbata yra vieni iš populiariausių nealkoholinių gėrimų pasaulyje [1]. Daugelis žmonių neįsivaizduoja savo ryto be kavos ar arbatos puodelio. Šių gėrimų populiarumą bei didelį suvartojamumą lemia tai, kad jie pasižymi tonizuojančiu poveikiu [2].
Kava yra pagrindinis biologiškai aktyvių junginių – kofeino, teobromino ir teofilino, šaltinis. Tai purino grupės alkaloidai, pasižymintys stimuliuojančiu poveikiu. Kofeinas ir teobrominas daugiausiai nustatomi kavos pupelėse, arbatos lapuose, kakavos pupelėse, kolos riešutuose ir matė lapuose [3]. Kofeinas yra vienas iš labiausiai vartojamų ir plačiausiai ištirtų stimuliatorių pasaulyje. Jis įeina į daugybė maisto produktų ir gėrimų sudėtį. Nustatyta, kad kofeiną kaupia apie 60 augalų rūšių [4].
Ksantino grupės alkaloidai pasižymi uždegimą slopinančiu, antimikrobiniu, antioksidaciniu ir priešnavikiniu poveikiu [5]. Mokslininkai nustatė, kad kofeinas veikia centrinę nervų sistemą, pasižymi diuretiniu poveikiu, padeda mažinti nuovargį, pagerina protinę veiklą, dėmesingumą ir sportinį pasirengimą. Atlikti moksliniai tyrimai įrodė, kad kofeinas mažina suvartojamų kalorijų kiekį, todėl gali būti naudingas metant svorį [4]. Teobrominas centrinę nervų sistemą stimuliuoja silpniau nei kofeinas. Jis dažniausiai vartojamas kaip lygiųjų raumenų relaksantas [3]. Teofilinas nuo seno yra vienas iš plačiausiai pasaulyje skiriamų vaistų kvėpavimo sistemos ligų gydymui [6].
Ksantino grupės alkaloidų kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui naudojama UV–regimosios šviesos spektrometrija, IR spektrometrija, efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija bei įvairūs elektroanalitiniai metodai [3,7]. ESC metodo taikymas leidžia greitai ir tiksliai nustatyti tiriamasias medžiagas ir jų kiekius. Norint kuo tiksliau kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti tiriamąsias medžiagas ir jų kiekius, reikia parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas [8].
Darbo naujumas. Kofeinas yra pagrindinis ir plačiausiai ištirtas ksantino grupės alkaloidas. Teobromino kiekis kavoje ir kituose ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose yra žymiai mažesnis ir mažiau ištirtas. Mokslinėje literatūroje pateikiama mažai duomenų apie teobromino kiekį žaliose kavos pupelėse [3]. Tyrimų stoka paskatino atlikti kofeino, teobromino ir teofilino kiekybinės sudėties analizę džiovintuose kavos vaisių preparatuose, tirpioje kavoje ir kakavos pupelėse bei įvertinti skrudinimo įtaką tiriamųjų junginių kiekiui.
Darbo tikslas. Atlikti skirtinguose ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose kaupiamų kofeino, teobromino ir teofilino kokybinį ir kiekybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei palyginti gautus rezultatus.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – atlikti skirtinguose ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose kaupiamų kofeino, teobromino ir teofilino kokybinį ir kiekybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei palyginti gautus rezultatus.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti kokybinį ir kiekybinį kofeino, teobromino ir teofilino nustatymą džiovintų kavos uogų arbatos bandiniuose, tirpioje kavoje ir kakavos pupelių bandiniuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2. Nustatyti ekstrahento įtaką išskirtam kofeino, teobromino ir teofilino kiekiui iš džiovintų kavos uogų arbatos, tirpios kavos ir kakavos pupelių bandinių.
3. Įvertinti skaldymo įtaką ksantino grupės alkaloidų išskiriamam kiekiui termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandiniuose.
4. Įvertinti skrudinimo laiko įtaką ksantino grupės alkaloidų išskiriamam kiekiui kakavos pupelių bandiniuose.
5. Palyginti skrudintų kakavos pupelių ir termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandinių sudėtyje nustatytų ksantino grupės alkaloidų kiekius, skrudinant kakavos pupeles skirtingą laiką.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Tikrasis kakavmedis (Theobroma cacao L.)
Tikrasis kakavmedis (Theobroma cacao L.) yra kakavmedžio (Theobroma L.) genties augalas, priklausantis dedešvinių (Malvaceae) šeimai.
• Karalystė: Augalai (Plantae)
• Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) • Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida)
• Eilė: Dedešviečiai (Malvales Juss. ex Bercht. & J.Presl) • Šeima: Dedešviniai (Malvaceae Juss.)
• Gentis: Kakavmedis (Theobroma L.)
• Rūšis: Tikrasis kakavmedis (Theobroma cacao L.) [9]
Kakavmedžio vaisiai yra pagrindinė augalinė žaliava, iš kurios gaminama kakava, šokoladas bei kiti gėrimai [10].
Tikrasis kakavmedis yra tropinių Amerikos miškų augalas, galintis užaugti iki 5–8 metrų [11], kartais iki 20 metrų aukščio ir 4–6 metrų pločio. Augalas gali užaugti iki 20 metrų aukščio augdamas natūralioje miško būklėje, tai lemia konkurencija dėl šviesos su kitomis augalų rūšimis [12,13].
Pagrindinė augalo šaknis susideda iš besisukančios šaknies, kurios ilgis ir forma priklauso nuo dirvožemio, kuriame augalas auga. Dažniausiai pagrindinė šaknis būna iki 2 metrų ilgio. Šoninės šaknys atsakingos už augalo mitybą, dažniausiai 20 – 30 centimetrų įsiskverbusios į žemę [12,13].
Lapai yra pailgos formos, stambūs, odiški su smailėjančia viršūne. Spalva varijuoja nuo žalios iki violetinės, priklausomai nuo antocianinų kiekio. Seni tikrojo kakavmedžio lapai praranda pigmentaciją ir tampa šviesiai žali, galiausiai tamsiai žali ir labai standūs [12,13].
Žiedai smulkūs, turintys nežymų specifinį kvapą ar bekvapiai, spalva įvairuoja nuo gelsvų, rausvų, rožinių ar kreminės spalvos, būna susitelkę puokštėmis. Kakavmedžiai žydi ir brandina vaisius ištisus metus [12,13].
Šio medžio vaisius yra ankštis, kurioje yra sėklos, plačiai žinomos kaip kakavos pupelės [14]. Vaisiai (ankštys) primena kiaušinio formą, yra raudonos ar rudos spalvos. Tikrojo kakavmedžio vaisiai yra 15–20 cm ilgio ir turi nelygų paviršių. Nesubrendusios ankštys gali būti žalios arba rausvos spalvos, luobelė mėsinga ir stora [12]. Raukšlėtame apyvaisyje yra nuo 25 iki 75 sėklų [11]. Sėklos yra padengtos saldžiu, gleivėtu dangalu, vadinamu minkštimu. Kakavos sėklos paprastai būna baltos, bet džiovinimo
metu tampa violetinės arba rausvai rudos [11,13]. Kakavmedžio sėklos yra labai jautrios temperatūros pokyčiams, gali greitai dehidratuoti [15].
1 pav. Tikrasis kakavmedis (lot. Theobroma cacao) (A), tikrojo kakavmedžio ankštis, kurios viduje kakavos vaisiai, padengti kakavos sviestu (B) ir kakavos sėklos (C) [11]
Kultivuojamų ir laisvai augančių kakavmedžių klasifikacija:
1. Criollo kakavmedis – prinokę ankštys yra raudonos arba geltonos spalvos, giliai raukšlėtos ir smailios. Ankščių luobelė plona, sėklos stambios, beveik apvalios. Skiltelės baltos arba šviesiai violetinės, mažai raukšlėtu paviršiumi. Šios rūšies kakavos pupelės greitai fermentuojasi, tačiau jų derlingumas yra mažas. Jos yra mažiau atsparios aplinkos stresui ir kenkėjų sukeliamoms ligoms, todėl auginamos nedaugelyje šalių ir laikomos delikatesu. Iš šios veislės kakavos pupelių gaunama kakava, naudojama aukščiausios kokybės šokoladų gamyboje [12,14,16]
2. Forastero kakavmedis – neprinokę ankštys yra žalios, nokimo metu tampa geltonos. Paviršius lygus, ankščių galai apvalūs ar nežymiai smailūs. Anksčių luobelė stora, skiltelės stipriai pigmentuotos ir yra violetinės spalvos. Ši kakavmedžio veislė yra plačiausiai kultivuojama ir iš jos pagaminama 80–90 proc. visos pasaulio kakavos produkcijos [12,14].
3. Trinitario kakavmedis – kilmės šalis yra Trinidadas. Ši veislė yra Criollo ir Forastero veislių hibridas [12,14].
Tikrasis kakavmedis (Theobroma cacao L.) yra kilęs iš Pietų Amerikos ir viršutinių Amazonės baseinų regiono dalies. Amazonės baseino regionas yra laikomas augalo kilmės centru. Tikrasis kakavmedis auginamas Pietų ir Centrinėje Amerikoje, Šiaurės ir Pietų pusrutulio tropinėse juostose. Iš viso yra 22 kakavmedžio rūšys, iš jų būtent tikrasis kakavmedis yra plačiausiai auginamas pramoniniais ir komerciniais tikslais [10,17]. Nors augalas plačiai auginamas Pietų Amerikoje, visgi didžioji dalis pasaulinės produkcijos išgaunama Vakarų Afrikoje – maždaug 70 proc. visos produkcijos, likusi dalis – Centrinėje ir Pietų Amerikoje, Vakarų Indijoje ir tropinėse Azijos vietose [11]. Daugiausia kakavos yra išgaunama Dramblio Kaulo Kranto valstybėje (40 proc.) [15]. Pirmą kartą kakava buvo pradėta vartoti ir kultivuoti majų ir actekų. XVI amžiuje pirmieji europiečiai, kurie įsivežė ir pradėjo vartoti kakavą, buvo ispanai. Jie iš actekų išmoko gaminti gėrimą, panašų į šokoladą, skrudinant ir trinant kavos pupeles [12].
1.2 Arabinis kavamedis (Coffea arabica L.)
Arabinis kavamedis (Coffea arabica L.) – tai kavamedžių (Coffea) genties augalas, priklausantis raudinių šeimai (Rubiaceae).
• Karalystė: Augalai (Plantae)
• Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) • Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida)
• Eilė: Gencijoniečiai (Gentianales Juss. ex Bercht. & J.Presl) • Šeima: Raudiniai (Rubiaceae Juss.)
• Gentis: Kavamedis (Coffea L.)
• Rūšis: Arabinis kavamedis (Coffea arabica L.) [18].
Kavamedžių gentis yra labai plati, jai priklauso 125 įvairios kavamedžio rūšys. Nors kavamedžio rūšių yra daug, tik dvi yra ekonomiškai svarbios ir auginamos dideliu mastu: arabinis kavamedis (Coffea arabica L.) ir didysis kavamedis (Coffea canephora L.) [19].
Arabinis kavamedis (Coffea arabica L.), tai visžalis krūmas ar mažas medis, galintis užaugti iki 4 – 5 metrų aukščio. Augalas turi dimorfinį įprotį šakotis, vertikalios šakos sudaro horizontalias, kurios žiedus ir vaisius sutelkia į kekes. Žiedai balti, turi keletą lapų pažastyse, būdingas trumpas vainikėlis ir ilgi kuokeliai. Kiekviename žiedyne paprastai būna nuo vieno iki penkių žiedų, augalo žydėjimas trunka ne ilgiau kaip tris dienas. Po apdulkinimo žiedai nudžiūsta per vieną ar dvi dienas, po 6 – 8 mėnesių nuo apdulkinimo augalas pradeda nokinti vaisius [19,20].
Paprastai kavos vaisiuose yra dvi sėklos, prinokę vaisiai turi storą mėsingą minkštimą, o vaisiaus viduje sėklas. Neprinokę vaisiai paprastai būna žalios spalvos, o prinokę tampa raudonai violetiniai arba tamsiai raudoni. Kiekviena sėkla yra apgaubta sidabriniu apvalkalu, kuris yra susiformavusios gyslos liekana. Šis apvalkalas apsaugo sėklas nuo virškinimo fermentų ir neleidžia joms suirti paukščių ar žinduolių žarnyne, taip leisdamas augalui daugintis [20].
Įvairios kavos rūšys yra kilusios iš Afrikos ir Madagaskaro, plačiai pradėtos auginti Etiopijoje ir Jemeno regione. Pastebėta, kad augalui augti puikiai tinka atogrąžų ir subtropikų klimatas, tad kava greitai išplito Pietų Amerikos ir Pietų Azijos regionuose. Dažniausiai augalai auga 950 – 2000 metrų aukštyje virš jūros lygio, esant 18 – 22 °C temperatūrai. Nustatyta, kad arabiniam kavamedžiui augti palankiausia nuo 1300 iki 1600 metrų aukštyje virš jūros lygio. Manoma, kad augalai, kurie auga aukštesniuosiuose regionuose užaugina geresnės kokybės kavos pupeles [21].
1.3 Kakavos pupelių cheminė sudėtis
Augalinių preparatų poveikį lemia augalo fitocheminė sudėtis. Tikrojo kakavmedžio vaisiai kaupia daug biologiškai aktyvių junginių. Produktai, pagaminti iš kakavmedžio pupelių, tai energijos suteikiantis, stimuliuojantis ir antioksidacinių savybių turintis maisto šaltinis. Džiovintose ir nefermentuotose kakavos pupelėse pigmentiniai junginiai sudaro 11–13 proc. junginių kiekio. Tikrojo kakavmedžio poveikį lemia juose esantys biologiškai aktyvūs junginiai, tokie kaip polifenoliai. Fenoliniai junginiai yra kiekybiškai didžiausia junginių grupė, esanti džiovintose nefermentuotose kakavos pupelėse ir sudaro 13,5 proc. junginių kiekio. Būdingą violetinę kakavos pupelių spalvą lemia sudėtyje esantys antocianinai [11]. Pagrindiniai fenoliniai junginiai, kurie yra kakavos pupelėse - taninai ir flavonoidai [15].
Pagrindinės fitocheminės medžiagos, nustatytos kakavos pupelėse:
•
ksantino grupės alkaloidai: kofeinas, teobrominas, teofilinas;•
fenoliniai junginiai: fenolinės rūgštys, hidroksibenzoinės rūgštys;•
flavonoidai ir flavonoliai: kvarcetinas ir jo dariniai (galaktozidas ir arabinozidas);•
flavonai: luteolinas, orientinas, viteksinas;•
flavan–3–oliai: katechinas, epikatechinas;•
flavanonai: naringeninas;•
stilbenoidai: resveratrolis ir picidai (stilbenoidinis gliukozidas, pagrindinis resveratrolio darinys vynuogių sultyse) [22].Kakavmedžio vaisių žievėje nustatyti mineralai: kalis, kalcis, forsforas, magnis. Kakavmedžio sėklose nustatyta gliukozė (41,51 mg/ g), fenoliniai junginiai (148,5 mg/ 100 g), joms būdingas mažas rūgštingumas. Sausos ir skrudintos sėklos, po fermentacijos vadinamos kakavos pupelėmis, kaupia lipidus (31%), baltymus (8,4%), polifenolinius junginius (5,2%) ir angliavandenius (13,7%) [23].
1.4 Kavos vaisių cheminė sudėtis
Populiariausia kavamedžio naudojama žaliava yra pupelės, savo sudėtyje turinčios polifenolių, alkaloidų bei kitų biologiškai aktyvių junginių. Būtent dėl polifenolių ir alkaloidų kava tapo itin populiari tiek mokslo, tiek socialinėje srityje [21]. Kofeino kiekis skirtingų rūšių kavos pupelėse varijuoja nuo 100 µg/ml iki 1000 µg/ml ir daugiau. Skirtingą alkaloidų kiekį žaliose kavos pupelėse lemia skirtingos kavos rūšys, veislių genetinės savybės, aplinkos veiksniai (dirvožemis, aukštis virš jūros lygio, saulės šviesa), klimato parametrai (kritulių kiekis, temperatūra), pupelių brandumas derliaus nuėmimo metu, derliaus nuėmimo būdas ir žemės ūkio praktika (pavėsis, genėjimas, tręšimas) [3,4].
Pagrindinės fitocheminės medžiagos, nustatytos kavos pupelėse: • alkaloidai: kofeinas, teobrominas, teofilinas, trigonelinas;
• polifenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis; • riebalų aliejai;
• karotenoidai;
• fitosteroliai: sitosterolis, stigmasterolis; • taninai;
• vaškai;
• angliavandeniai: monosacharidai (fruktozė, gliukozė, galaktozė, arabinozė), oligosacharidai (sacharozė), polisacharidai (celiuliozė, hemiceliuliozė);
• polimerai: celiuliozė, hemiceliuliozė;
•
nelakiosios bei lakiosios alifatinės rūgštys: citrinos, oksalo, acto, izovalerijono, dekano rūgštys [21,24].Kavos vaisių luobelė – tai pagrindinis šalutinis produktas, gaunamas atskiriant kavos pupeles nuo minkštimo. Iš vienos tonos kavos vaisių išgaunama apie 180 kilogramų kavos luobelių.
Kavos vaisių luobelėje kaupiasi:
• angliavandeniai (monosacharidai ir polisacharidai); • alkaloidai: kofeinas, teobrominas, teofilinas;
• polifenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis; • flavanoidai: procianidinas;
• flavan–3–oliai; • antocianidinai [19].
1.5 Tikrojo kakavmedžio (lot. Theobroma cacao) vaisių preparatų poveikis ir
vartojimas
Kakavos vartojimas prasidėjo Amerikoje, o maždaug šeštojo amžiaus viduryje greitai išplito visoje Europoje. Dėl saldaus, bei malonaus skonio šokoladas buvo laikomas ne tik delikatesu, bet ir maistingu produktu ir vaistu. Kakavos nauda sveikatai buvo siejama su dideliu antioksidacinių medžiagų kiekiu kakavos pupelėse [25]. Kakavos pupelės labiausiai vertinamos dėl antioksidacinio poveikio. Žaliavos sudėtyje esantys fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai, kurie suriša laisvuosius radikalus. Antioksidacinis poveikis pasireiškia dioksigenazės ir 5–lipoksigenazės slopinimu [11].
Kakavmedžio vaisių minkštime ir sėklose yra stimuliuojančiu ir tonizuojančiu poveikiu pasižyminčio alkaloido teobromino (sausose sėklose apie 3 %) [26].
Tikrojo kakavmedžio vaisiai nuo seno vartojami anemijos gydymui, tuberkuliozės, podagros prevencijai, padeda mažinti psichinį nuovargį, karščiavimą, palaikyti šlapimo takų funkciją. Preparatai iš kakavos pupelių pasižymi antioksidaciniu poveikiu [27], priešvėžiniu poveikiu [28], apsaugo nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų [29].
In vitro tyrimais nustatyta, kad kakavos pupelių sudėtyje esantys flavonoidai pasižymi plačiu biologinio poveikio spektru, susijusiu su priešnavikiniu poveikiu, įskaitant kelių kinazių ir transkripcijos faktorių (TF) slopinimą [30]. Manoma, kad flavonoidai yra proliferaciniai, sukelia apoptozę ir slopina angiogenezę, todėl yra veiksmingi gydant vėžį [23]. Kakavos pupelėse nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai, pasižymintys antiproliferaciniu aktyvumu – flavonoidai, fenoliniai junginiai ir procianidinai. Užsienio mokslininkai nustatė, kad kakavos pupelių sudėtyje esantys procianidinai pasižymėjo auglio augimą slopinančiu poveikiu. Kakavos ar šokolado, pasižyminčių stipriu antioksidaciniu aktyvumu, vartojimas gali būti naudingas mažinant genotoksinių ir epigenetinių kancerogenų sukeltą žalą ir slopinant sudėtingus procesus, sukeliančius vėžį. Atliktų mokslinių tyrimų duomenimis kakavos pupelių ekstraktuose esantys epikechechinas, katechinas, kvercetinas ir procianidinai reguliuoja NF–κB ir AP–
1 vėžinių ląstelių linijas ir gali būti vartojami Hodžkino ir Reed-Sternbergo (HRS), žmogaus ūminės monocitinės leukemijos (THP–1) gydymui [30–32].
1.6 Arabinio kavamedžio (lot. Coffea arabica) vaisių preparatų poveikis ir
panaudojimas
Kava, tai vienas populiariausių gėrimų, kurį kasdien geria milijonai žmonių visame pasaulyje. Tradiciškai, stimuliuojantis kavos poveikis priskiriamas labiausiai ištirtam bei pagrindiniam kavos ingredientui – kofeinui, tačiau kiti cheminiai junginiai taip pat prisideda prie šio gėrimo vertingųjų savybių.
Šalutiniai kavos vaisių ir pupelių perdirbimo produktai taip pat gali būti laikomi potencialiais funkciniais maisto pramonės ingredientais. Kavos lukštai, žievelė ir minkštimas, kurie sudaro beveik 45 proc. kavos vaisiaus, yra vieni iš pagrindinių šalutinių produktų ir gali būti naudojami kofeino ir polifenolių išgavimui. Pavyzdžiui, skrudintos kavos sidabrinė odelė gali būti naudojama kaip maistinių skaidulų ingredientas, taip pat pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [24].
Kava – tai dažniausiai vartojamas kofeino turintis gėrimas. Kofeinas – tai biologiškai aktyvus junginys, stimuliuojantis centrinę nervų sistemą ir pasižymintis atmintį gerinančiu poveikiu. Iš įvairių legendų ir pranešimų yra manoma, kad kavą pradėtą vartoti jau ankstyvajame XV amžiuje. Ankstyviausi pagrįsti įrodymai apie kavos gėrimą arba kavamedžių tyrinėjimą užfiksuoti Jemene sufijų vienuolynuose [33].
Kavamedžio vaisiai pasižymi plačia biologiškai aktyvių junginių įvairovę. Kavos sėklų ekstraktai dėl didelio polifenolių kiekio naudojami tiek kosmetikoje, tiek farmacijos pramonėje. Kavos turintys produktai pasižymi plačiu veikimo spektru ir farmakologiniu poveikiu. Tyrimais įrodyta, kad preparatai, pagaminti iš kakavos pupelių pasižymi antioksidaciniu, lipidų kiekį mažinančiu, uždegimą slopinančiu, priešnavikiniu, kvėpavimą ir kraujotaką veikiančiu poveikiu. Įrodyti šių preparatų antibakterinis, antivirusinis ir priešgrybelinis poveikiai [34].
Skirtinguose pasaulio regionuose kavamedis ir jo vaisiai tradicinėje medicinoje vartojami įvairių sveikatos sutrikimų ar ligų gydymui. Brazilijoje kavos pupelių nuoviras geriamas kaip preparatas nuo gripo. Kuboje vyrai karštą sėklų ekstraktą vartoja kaip afrodiziaką. Haityje keptų kavamedžio lapų ir vaisių nuoviras geriamas nuo anemijos, edemų, astenijos ir įniršio, o kavamedžio vaisius vartoja hepatito ir kepenų veiklos sutrikimų profilaktikai. Meksikoje iš kavos lapų daromas karštas kompresas, kuris naudojamas karščiavimui gydyti, skrudintų lapų ekstraktą vartoja krūtimi maitinančios moterys, siekdamos paskatinti laktaciją. Peru karštas džiovintų vaisių ekstraktas vartojamas mieguistumo mažinimui ir pagirių lengvinimui, kaip uždegimą slopinantis gėrimas, gripo ir pulmunologinių ligų
prevencijai. Tailande karštas džiovintų sėklų ekstraktas vartojamas kaip kardiotoninis ir neurotoninis preparatas. Vakarų Indijoje karštas sėklų ekstraktas geriamas sergant astma. Kavamedžio šaknų sultys vartojamos po skorpiono įgėlimo [35].
1.7 Kavos pupelių apdorojimas
Ksantino grupės alkaloidų kiekį kavos pupelėse lemia kavos pupelių rūšis, skrudinimo laipsnis, bei kavos paruošimo būdas. Pupelių apdorojimas yra labai svarbus, nes jo metu pupelėse vyksta įvairūs biologiškai aktyvių junginių pokyčiai, kurie lemia kavos poveikį bei jo stiprumą [24].
Kavos produktai apdorojami dviem būdais: drėgnuoju ir sausuoju procesu. Brazilijoje populiariausias kavos produktų apdorojimas vyksta sausuoju būdų, o Centrinėje Amerikoje – drėgnuoju būdu. Sausuoju būdu kavos vaisiai džiovinami gryname ore 2–3 savaites, po to vykdomas jų fermentavimas. Drėgnuoju būdu gali būti apdorojami tik pilnai prinokę kavos vaisiai, manoma, kad juos fermentuojant pupelės tampa kokybiškesnės bei geriau vertinamos.
Kad pupelės įgautų specifinį aromatą, jos yra skrudinamos. Skrudinimas atliekamas 200 – 250 °C temperatūroje ir apima tris fazes:
• Pradinė džiovinimo fazė – šio endoterminio etapo metu pašalinamas vanduo ir pupelė pagelsta. • Skrudinimo fazė – pagrįsta keliomis sudėtingomis pirolitinėmis reakcijomis, kurių metu susidaro įvairūs junginiai, suteikiantys kavai aromatą ir skonį. Egzoterminių ir endoterminių fazių metu pupelės tampa tamsiai rudos spalvos.
• Šaldymo fazė – naudojamas vanduo ir oras, norint baigti paskutinį egzoterminį procesą [21].
1.8 Tiriamųjų veikliųjų medžiagų apibūdinimas
1.8.1 Kofeinas
Kofeinas – tai metilksantino grupės alkaloidas, vienas plačiausiai vartojamų natūralių stimuliatorių. Kofeinas tirpus poliniuose ir nepoliniuose tirpikliuose, keliant vandens temperatūrą kofeino tirpumas didėja. Gryna medžiaga yra balti, bekvapiai, kristaliniai milteliai, kartaus skonio [36,37]. Tai natūralus junginys, kaupiamas įvairiuose augaluose. Kofeinas dažniausiai kaupiasi kavos
pupelėse, arbatos lapuose, kakavos pupelės, kolos riešutuose ir matės lapuose [38,39]. Natūraliai daugiausia kofeino nustatoma Amazonės miškų augale Guaranoje (Paullinia guarana). Kofeino yra įvairiuose gėrimuose ar maiste, pvz., kavoje, arbatoje, šokolade, kolos ar energetiniuose gėrimuose [40]. Kofeinas kaupiasi įvairiuose augaluose, tačiau mažais kiekiais. Manoma, kad jis yra atsakingas už apsauginę augalų funkciją. Sausoje kavos pupelių žaliavoje nustatoma 1 – 4 proc. kofeino, tačiau jo kiekis gali varijuoti priklausomai nuo augalo veislės bei augimo sąlygų [24]. Kava – tai vienas pagrindinių natūralių kofeino šaltinių. Kofeino kiekis kavoje tiesiogiai priklauso nuo kavos paruošimo būdo, kavos pupelių skrudinimo laipsnio ir kavos pupelių rūšies. Dažnu atveju kavos kokybė vertinama pagal kofeino kiekį [4].
Veikimo mechanizmas ir farmakokinetinės savybės. Kofeinas – tai adenozino receptorių antagonistas, konkurencinis fermento cAMP–fosfodiesterazės inhibitorius. Dėl savo molekulės struktūros, kuri yra panaši į adenoziną, jungiasi ir sąveikauja su adenozino receptoriais ir neleidžia prisijungti adenozinui. Būtent dėl tokio veikimo kofeinas yra priskiriamas psichomotoriniams stimuliatoriams [41]. Išgertas ar kitu peroraliniu būdų suvartotas kofeinas yra labai greitai absorbuojamas virškinamajame trakte. Kofeino absorbcija yra greita, trunka iki vienos valandos ir beveik visas kofeino kiekis yra absorbuojamas virškinamajame trakte. Absorbcijos greitis ir veiksmingumas tiesiogiai priklauso nuo suvartotos dozės, skrandžio pH, suvartoto kofeino turinčio produkto. Didžiausia kofeino koncentracija plazmoje susidaro maždaug po 20 – 60 minučių.
Farmakoterapinis poveikis. Kofeinas yra gerai žinomas dėl tonizuojančio poveikio, jis skatina budrumą stimuliuodamas centrinę nervų sistemą, gerina kraujotaką ir kvėpavimą. Šios priežastys lėmė kavos populiarumą visame pasaulyje. Šis alkaloidas gerina nuotaiką, reakciją, fizinį pajėgumą, skatina dėmesingumą, mažina nuovargį ir simptomus, susijusius su tremoru ar Parkinsono liga. Kofeinas pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Dėl konkurencinio veikimo cikliniam AMP–fosfodiesterazės inhibitoriui kofeinas bei jo metabolitai pasižymi uždegimą slopinančiu poveikiu [42].
1.8.2 Teobrominas
Teobrominas (1,3,7 – trimetilksantinas), tai metilksantinų grupės alkaloidas, savo struktūra bei poveikiu panašus į kofeiną [43]. Išgrynintas teobrominas yra baltos spalvos, miltelių pavidalu, daugiausiai gaminamas iš kakavos pupelių lukštų kaip šalutinis šokolado gamybos produktas. Pramoniniu būdu išgaunamas sintetinat iš 3–metil–šlapimo rūgšties. Mažai tirpus vandenyje ir alkoholyje, geriau tirpus verdančiame vandenyje, gerai tirpus šarmuose ar mineralinėse rūgštyse. Didžiausi teobromino kiekiai kaupiasi kakavmedžių vaisiuose, nedideli jo kiekiai nustatomi arbatoje, guaranoje, matėje, kolos riešutuose bei kavoje. Skirtingų rūšių arbatoje nustatomi skirtingi teobromino
kiekiai, pavyzdžiui Camellia ptilophylla arbatoje nustatyti teobromino kiekiai yra 15–18 kartų didesni negu žaliojoje arbatoje, būtent dėl šios priežasties ji netgi vadinama “kakavos arbata” [44].
Veikimo mechanizmas ir farmakokinetinės savybės. Teobrominas – tai alkaloidas, chemine struktūra panašus į kofeiną, daugiausia nustatomas šokolade, gerai tirpus riebaluose. Pagrindinis teobromino veikimo mechanizmas yra adenozino receptorių blokavimas, turi vienodą afinitetą A1 ir A2A receptoriams. Manoma, kad jo, kaip fosfodiesterazės inhibitoriaus poveikis yra silpnas [25,45]. Lyginant su kofeinu, teobromino absorbcija iš virškinamojo trakto vyksta lėtai, didžiausia koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama per 1 – 2 valandas po pavartojimo. Įdomu tai, kad vartojant šokoladą, didžiausia teobromino koncentracija plazmoje pasiekiama maždaug pusvalandžiu greičiau nei vartojant gryną teobrominą. Manoma, kad vartojant šokoladą, teobromino absorbcija vyksta greičiau, nes skatinama tulžies gamyba [46]. Eliminacija iš organizmo trunka maždaug 2 kartus ilgiau negu kofeino [44].
Poveikis ir panaudojimas. Šokoladas vartojamas kaip nuotaiką gerinantis bei protinę veiklą skatinantis maisto produktas. Nustatyta, kad šie poveikiai pasireiškia dėl psichoaktyvių ingredientų, esančių šokolade. Iš įvairių junginių, esančių šokolade, metilksantinai teobrominas ir kofeinas pasižymi psihoaktyviu poveikiu. Teobrominas yra struktūriškai panašus į kofeiną, todėl jų poveikis organizmui yra labai panašus. [45].
1.8.3 Teofilinas
Teofilinas, kitaip žinomas kaip 1,3- dimetilksantinas, tai metilksantinas, jau 80 metų naudojamas kvėpavimo sutrikimų gydymui. Kadangi priklauso ksantinų grupei, jis struktūriškai ir farmakologiškai panašus į teobrominą ir kofeiną. Šis junginys dažnai sutinkamas gamtoje, jo yra arbatoje (Camellia sinensis), kakavoje (Theobroma cacao) [47]. Teofilinas jau nuo seno yra vienas iš plačiausiai pasaulyje skiriamų vaistų astmai bei lėtinei obstrukcinei plaučių ligai (LOPL) gydyti. Jo populiarumą lemia tai, kad jis lengvai išgaunamas ir yra nebrangus. Natūraliai nedideliais kiekiais nustatomas arbatoje bei kakavos pupelėse. Jis pirmą kartą buvo išgautas iš arbatos ir chemiškai susintetintas 1895 m., iš pradžių vartotas kaip diuretikas. Vėliau nustatytos bronchus plečiančios savybės ir nuo 1922 m. pradėtas vartoti astmos gydymui [6].
Veikimo mechanizmas ir farmakokinetinės savybės. Teofilino poveikį lemia keli veikimo mechanizmai, tačiau poveikis pasireiškia tik vartojant didelėmis dozėmis. Jis slopina fosfodiesterazę, dėl kurios padidėja cAMF koncentracija ląstelėse, slopina prostaglandinų poveikį ir pasižymi adenozino receptorių blokavimu [48].Teofilinas greitai absorbuojamas, pasižymi visišku bioprieinamumu, tačiau
dėl skirtingo metabolizmo kepenyse jo klirensas gali individualiai skirtis. Vartojant vaistą tablečių pavidalu didžiausia jo koncentracija kraujyje pasiekiama per 0,5 – 2 val. Jis metabolizuojamas kepenyse citochromo P450 fermentų sistemos, daugiausia metabolizuojamas CYP1A2 fermento, o esant didelėms koncentracijoms plazmoje – CYP2E1 fermento [46].
Panaudojimo būdai:
• Ūminės astmos gydymui. Intraveninis aminofilinas vartojamas pacientams, sergantiems ūmine sunkia astma, kuriems nesukeliamas pakankamas atsakas vartojant beta–2 agonistus [49,50]. • Lėtinės astmos gydymas. Teofilinas yra bronchus plečianti medžiaga, vartojamas astmos
gydymui jei vartojant kitus vaistus nepasiekiamas reikiamas klinikinis efektyvumas. Yra nustatyta atvejų, kuomet teofilinas labiau pageriną astmos kontrolę pacientams nei beta–2 agonistai, kurie yra gydomi didelėmis inhaliuojamųjų kortikosteroidų dozėmis [51,52]. Keletas tyrimų parodė, kad pridedant mažą teofilino dozę prie inhaliuojamų kortikosteroidų, astma geriau kontroliuojama nei vartojant dvigubą kortikosteroidų dozę [53].
• Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos (LOPL) gydymas. Teofilinas padidina LOPL segančių pacientų toleranciją pratimams ir pagerina kvėpavimą [54,55]. Didelėmis dozėmis pasižymi bronchus plečiančiomis savybėmis ir naudojamas kartu su ilgo veikimo beta–2 agonistais. Mažomis dozėmis teofilinas padeda sumažinti staiga paūmėjusius LOPL simptomus [56,57]. • Neišnešiotų kūdikių apnėjos gydymas. Teofilinas buvo naudojamas siekiant išvengti
pasikartojančios apnėjos ir bradikardijos neišnešiotiems kūdikiams, stimuliuojant kvėpavimą. Tai veiksminga mažinant epizodus ir mechaninės ventiliacijos poreikį, nors poveikis mažiau efektyvus už kofeino poveikį [58].
1.9 Kokybiniai ir kiekybiniai ksantino grupės alkaloidų nustatymo metodai
Kofeinas yra pagrindinis ir labiausiai ištirtas ksantino grupės alkaloidas. Teobromino ir teofilino kiekiai kavoje ir kituose ksantino grupės alkaloidų turinčiuose produktuose yra žymiai mažesni ir mažiau ištirti. Mokslinėje literatūroje pateikiama mažai duomenų apie teobromino kiekį žaliose kavos pupelėse [3].
Ksantino grupės alkaloidų kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui naudojama UV–regimosios šviesos spektrometrija, IR spektrometrija, efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija bei įvairūs elektroanalitiniai metodai [3,7]. Spektrofotometriniai metodai populiaresni dėl jų greitumo, ekonomiškumo, paprastumo, patikimumo bei lengvo mėginių paruošimo būdo. Kofeino
kiekio nustatymui įvairiose kavos mėginiuose naudojami šie cheminės analizės metodai: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), kapiliarinė elektroforezė, kapiliarinė zonų elektroforezė [8].
1.9.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas
Kofeino, teobromino ir teofilino nustatymui naudojami chromatografiniai metodai, pvz., efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, spektofotometriniai metodai, pvz., jonų spektrofotometrijos metodas bei dujų chromatografijos metodai su masių spektrofotometrija [59]. Įvairūs atlikti tyrimai parodė, kad spektrofotometrinis ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodai pasižymi geresniu tikslumu. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas pasižymi savo paprastumu, tikslumu bei tuo, kad žaliavos paruošimas analizei yra paprastesnis [4].
Nors efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra jautrus ir paprastas, tačiau analizės trukmė yra pakankamai ilga (gali trukti iki 30 min.), o tai lemia didesnį eliuento kiekio suvartojimą. Ksantino grupės alkaloidų nustatymui taikomos ESC metodikos palyginimas pateikiamas 1 lentelėje [8].
1 lentelė. Ksantino grupės alkaloidų nustatymas [8]
Norint nustatyti kofeino kiekį kavos pupelių vandeniniame ekstrakte ESC metodas yra netinkamas, nes reikalinga selektyvesnė kofeino ekstrakcija, pavyzdžiui naudojant dichlormetaną. Šis metodas taip pat netinkamas teobromino nustatymui žaliose kavos pupelėse [3].
Mokslinės literatūros šaltiniuose pateikiama informacija apie kakavos pupelių tyrimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Tyrimo duomenimis, nustatytos visos tiriamosios medžiagos: kofeinas, teofilinas ir teobrominas. Tyrimo metu pastebėta, kad skrudintose kakavos
pupelėse nustatyti ksantinų grupės alkaloidų kiekiai buvo didesni negu termiškai neapdorotose kakavos pupelėse, kaip matome 2 lentelėje. Tyrimo metu nebuvo nurodyta kokiomis sąlygomis skrudinto kakavos pupelės [59].
2 lentelė. Ksantino grupės alkaloidų koncentracija kakavos sėklų bandiniuose [59] Teobrominas mg/g* Teofilinas mg/g* Kofeinas mg/g* Termiškai neapdorotų
kakavos pupelių pasta 33,00 0,20 5,60
Skrudintų kakavos pupelių sviestas 36,00 - 3,30 Termiškai neapdorotų kakavos pupelių milteliai 42,00 0,20 6,00 Skrudintų kakavos pupelių milteliai 59,50 2,00 8,00
* Trijų bandinių vidurkis
1.9.2 Ultravioletinės regimosios šviesos spektrofotometrija
UV–regimosios šviesos spektrofotometrija – tai dažnai laboratorijose taikomas medžiagų nustatymo metodas. Šiuo metodu galima nustatyti kofeino kiekį kavos pupelėse. Metodas nereikalauja didelių išlaidų, yra paprastas bei greitas. Nustatinėjant kofeiną vandeniniuose bei dichlormetano tirpaluose, buvo sukurtas ir pritaikytas metodas kofeino nustatymui kavos pupelėse. Kofeinas iš kavos pupelių ekstrahuojamas vandeniu, tuomet pridedama dichlormetano, kad tiriamos medžiagos pereitų į organinį tirpiklį. Kofeino kiekiai nustatyti esant 272–274,7 nm bangos ilgiui. Šalutinės medžiagos, pvz., chlorogeno rūgštis, pašalintos naudojant Gauso metodą. Tyrimą taip pat galima atlikti naudojant skrudintas kavos pupeles [60].
1.9.3 Kapiliarinė skysčių chromatografija
Mokslinėje literatūroje pateikiama informacija apie kofeino kiekio nustatymą kavoje izokratinės kapiliarinės skysčių chromatografijos metodu, naudojant atvirkštinių fazių monolitines kapiliarines
kolonėles. Šis metodas yra spartus ir taupus, o monolitinių sorbentų panaudojimas vietoje įpratų granuliuotų sorbentų padidina eliuacijos greitį 4–8 kartus, dėl to gerokai sutrumpėja analizės laikas. Chromatografavimo sąlygos: paruoštas judrios fazės tirpalas, degazuotas vakuumu. Eliuacija – izokratinė. Judrios fazės tėkmės greitis – 1,19 μl/min. Injekcijos tūris – 17,5 nl mėginio. Detekcija atliekama esant 200 nm arba 270 nm bangos ilgiui. Nors jautriausias metodas yra ESC, tačiau kapiliarinės skysčių chromatografijos metodas taip pat yra spartus (trunka iki 4 min) ir efektyvus, o sunaudotų reagentų kiekis yra šimtus kartų mažesnis nei atliekant analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [8].
1.9.4 Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija dažniausiai taikomas metodas augalinės kilmės mėginiams. Jis yra ganėtinai lengvas, nereikalauja didelių išlaidų, o rezultatus galima lengvai vizualizuoti [61]. Keletas tyrimų, kuriuose buvo lyginami plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodai, parodė, kad statistinio skirtumo tarp šių metodų nėra [62]. Šiuo metodu aptinkami tiek fenoliniai junginiai, tiek ksantino grupės alkaloidai. Atlikus tyrimą spektrometriniu metodu ir plonasluoksnės chromatografijos metodu nustatyti ksantinų kiekiai buvo panašūs. Plonasluoksnės chromatografijos metodas yra paprastas, todėl juo galima nustatyti ksantinų grupės alkaloidus įvairių augalinių žaliavų bandiniuose, maisto produktuose ar maisto papilduose [7].
1.10 Lietaratūros apžvalgos apibendrinimas
Kofeinas, teobrominas ir teofilinas – tai purino grupės alkaloidai, metilksantinai, plačiai vartojami kaip stimuliatoriai. Kofeinas ir teobrominas pasižymi stimuliuojančiu, budrumą, žvalumą bei ištvermę skatinančiu poveikiu. Teofilinas naudojamas kvėpavimo takų obstrukcinėms ligoms gydyti, sukeltoms astmos, lėtinio bronchito ar emfizemos. Mažomis dozėmis teofilinas pasižymi imunomoduliaciniu, priešuždegiminiu ir bronchus apsaugančiu poveikiu, didelėmis dozėmis pasižymi bronchus plečiančiu poveikiu. Šie ksantino grupės alkaloidai gali sukelti ir neigiamus poveikius, toksiškos dozės gali sukelti nemigą, galvos skausmą, širdies ritmo sutrikimus, galvos svaigimą, tremorą [58,63].
Chemijos ir biochemijos pagrindinė užduotis yra atskirti ir kokybiškai bei kiekybiškai nustatyti įvairias medžiagas. Mišinio sudėtis dažnai būna labai sudėtinga, o medžiagos giminingos fizikinėmis
cheminėmis savybėmis [8]. Ksantino grupės alkaloidų kokybiniam bei kokybiniam nustatymui naudojami įvairūs metodai: UV–regimosios šviesos spektrofotometrija, IR spektrofotometrija, ESC, plonasluoksnė chromatografija bei įvairūs elektroanalitiniai metodai [3]. ESC metodo taikymas leidžia greitai ir tiksliai nustatyti tiriamasias medžiagas ir jų kiekius. Norint kuo tiksliau kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti tiriamąsias medžiagas ir jų kiekius, reikia parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas bei technines priemones [8].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo planavimas
Prieš atliekant tyrimą išskirti pagrindiniai atlikimo etapai:
1. Tyrimo objektų parinkimas;
2. Tiriamųjų medžiagų standartų ekstraktų paruošimas;
3. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) optimizavimas ir pritaikymas kofeino, teobromino ir teofilino identifikavimui bei kiekybiniam nustatymui;
4. Kakavos pupelių skrudinimas skirtingomis sąlygomis;
5. Kofeino, teobromino ir teofilino ekstrahavimas iš tiriamųjų medžiagų distiliuotu vandeniu; 6. Kofeino, teobromino ir teofilino ekstrahavimas iš tiriamųjų medžiagų skirtingos koncentracijos
etanoliu;
7. Kofeino, teobromino ir teofilino identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas naudojant parinktą ESC metodą;
8. Gautų duomenų analizė ir vertinimas
2.2 Tyrimo medžiagos ir reagentai
• Kavos uogų arbata – „Cascara“ kavos uogų rūšis: Coffea arabica, Salvadoras • Tirpioji kava – „Nescafe classic“, Ispanija
• Ekologiškos kakavos pupelės – “Supernutrients”, Peru
• Skaldytos kakavos pupelės, ekologiškos – “Infinity Foods”, Peru • Etanolis 96 % – Spiritus Vilnensis, Lietuva.
• Išgrynintas vanduo – paruoštas naudojant vandens valymo sistemą „Milipore”, Bedford, JAV. • Kofeino standarto reagentas - „Sigma-Aldrich Chemie“, Kinija
• Teobromino standarto reagentas – „Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija • Teofilino standarto reagentas – „Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija
2.3 Įranga
• Reikiami žaliavų bei standartų medžiagų kiekiai atsverti naudojant svarstykles (Shimadzu AUW120D Bellingen, Vokietija);
• Žaliavoms smulkinti naudotas laboratorinis malūnėlis D–47906 Clatronic (Kempen, Vokietija); • Žaliavų ekstraktams gaminti naudotas distiliuotas vanduo, kuris buvo gaminamas MILIPORE
vandens gryninimo sistemoje (Millipore, Bedford, JAV); • Pupelėms atvėsinti naudotas elektrinis ventiliatorius;
• Ekstraktams šildyti naudota Heidolph MR Hei – Standart kaitinimo plokštė.
• Efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimui naudotas chromatografas WATERS 2690/5 (Millford, JAV) su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi (Waters 996, 210 – 400 nm bangų ilgio diapazonas).
2.4 Kakavos pupelių skrudinimas
Buvo atliktas Theobroma cacao rūšies žalių kakavos pupelių skrudinimas. 150 °C ± 5 °C temperatūroje kakavos pupelės buvo skrudinamos: 5 min., 10 min., 15 min. ir 20 min. Tuomet kakavos pupelės atvėsintos elektriniu ventiliatoriumi, susmulkintos ir naudojamos tiriamųjų medžiagų ekstrakcijai.
2.5 Tyrimo objektai ir parinkimo kriterijai
1. Termiškai neapdorotos kakavmedžio (lot. Cacao) sėklos arba kakavos pupelės. Kofeino, teofilino ir teobromino identifikavimui bei kiekybiniam nustatymui prieš skrudinimą ir po naudotos tikrojo kakavmedžio (lot. Theobroma cacao) sėklos. Pupelės termiškai neapdorotos, ekologiškos, be priedų. Rezultatų palyginimui naudotos skaldytos kakavos pupelės. Termiškai neapdorotos kakavos pupelės parinktos, nes:
• Kilusios iš Peru, vienos iš daugiausia kakavos produkcijos eksportuojančių šalių.
• Tikrojo kakavmedžio sėklos yra pagrindinis kakavos, iš kurios gaminamas šokoladas bei kakavos gėrimas, ingredientas.
2. Kavos vaisių uogų arbata “Cascara”. Naudotos arabinio kavamedžio (Coffee arabica) sėklos kofeino, teobromino ir teofilino identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui.
3. Tirpioji kava. Kofeino, teofilino ir teobromino identifikavimui ir nustatymui naudojant skirtingus tirpiklius. Gamintojas nenurodo kokiomis sąlygomis, bei kokios kavos pupelės naudotos tirpios kavos paruošimui.
2.6 Mėginių paruošimas
Tyrimo metu visos tiriamos medžiagos ekstrahuotos distiliuotu vandeniu (verdančiu arba kambario temperatūros) bei skirtingų koncentracijų (10 proc., 30 proc., 50 proc., 70 proc., 90 proc.) etanoliu (išskyrus kakavos pupeles). Kakavos pupelės buvo smulkinamos elektriniu malūnėliu, siekiant padidinti paviršiaus plotą ir palengvinti ekstrakciją. Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama po 1 g kiekvienos tiriamosios medžiagos, suberiama į tamsaus stiklo buteliuką, užpilama po 100 ml ekstrahento. Ekstrakcija vykdyta 30 min. ultragarso vonelėje. Gautas ekstraktas filtruojamas per popierinį filtrą. Gauti filtratai tiriami ESC metodu.
Kavos vaisių arbatai buvo naudoti ekstrahentai: distiliuotas verdantis vanduo, kambario temperatūros distiliuotas vanduo, skirtingų koncentracijų (10 proc., 30 proc., 50 proc., 70 proc., 90 proc.) etanolio tirpalai.
Tirpios kavos ekstrakcijai naudotas distiliuotas vanduo (verdantis ir kambario temperatūros) ir 70 proc. etanolis.
Kakavos pupelių ekstrakcijai naudotas kambario temperatūros distiliuotas vanduo.
2.7 Efektyvioji skysčių chromatografija
Analizei naudotas skysčių chromatografas WATERS 2690/5 (Millford, JAV) su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi Waters 996. Medžiagų skirstymui naudota chromatografavimo kolonėlė ACE C18 (250 mm x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 5 μm. Tyrimo metu termostate buvo palaikoma 25 °C temperatūra, tiriamųjų tirpalų injekcijos tūris – 10 μl.
Tyrimo metu eliuentais naudoti TFA (trifluoracto rūgštis) 0,1 % ir ACN (acetonitrilas) 100 %. Eliuavimas gradientinis, skirtingais laikais eliuentai pateikiami skirtingomis koncentracijomis (3 lentelė).
3 lentelė. Eliuacijos sąlygos Laikas, min Eliuento tėkmės
greitis, ml/min TFA (%) ACN (%)
0-2 1,23 100 0
2-35 1,23 70 30
35-40 1,23 10 90
40-45 1,23 10 90
45-46 1,23 100 0
Tiriamųjų medžiagų kokybinis vertinimas atliktas lyginant jų sulaikymo laikus analizuojamo standarto tirpaluose bei pagal gautus spektrinius duomenis chromatogramoje. Nustatytos detekcijos ribos buvo 200 – 600 nm.
2.8 Duomenų analizės metodai
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 201“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 17.0“ („IBM“, JAV). Grafiniam vaizdavimui bei pateikimui naudotos tos pačios programos. Visi tyrimų matavimai atlikti po 3 kartus, rezultatai išreikšti įvertinus gautų tyrimo rezultatų aritmetinius vidurkius ir standartinius nuokrypius. Vienfaktorinė dispersinė analizė ANOVA taikyta lyginamųjų duomenų statistinio reikšmingumo įvertinimui. Statistiškai reikšmingi vidurkių skirtumai įvertinti naudojant daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Kokybinis ir kiekybinis ksantinų grupės alkaloidų nustatymas naudojant ESC
analizės metodą
Siekiant kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti kavos vaisių arbatos, tirpios kavos ir kakavos pupelių mėginius, paruošti tiriamųjų bandinių tirpalai buvo analizuojami efektyviosios skysčios chromatografijos (ESC) metodu. Šis šiuolaikinis analizės metodas yra jautrus ir selektyvus, todėl pasirinktas tiriamųjų žaliavų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvertinimui. Žaliavose kokybiškai ir kiekybiškai vertinti kofeinas, teobrominas ir teofilinas. Tiriamųjų medžiagų kokybinis vertinimas atliktas lyginant jų sulaikymo laikus analizuojamo standarto tirpaluose bei pagal gautus spektrinius duomenis chromatogramoje. Standartų sulaikymo laikai: teobromino – 15,506 min, teofilino – 17,687 min, kofeino – 21,227 min. 2 paveiksle pateikta standartinių tirpalų chromatograma su spektrais ir sulaikymo laikais. 3 paveiksle pateikiama kavos uogų arbatos bandinių ESC chromatograma.
2 pav. Standartinių tirpalų sulaikymo laikai: raudona-teobrominas, mėlyna-teofilinas, žalia-kofeinas.
3.1.1 Tiriamųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis nustatymas džiovintų kavos uogų
arbatoje
3.1.1.1 Ekstrahento įtaka ksantino grupės alkaloidų nustatymui džiovintų kavos
uogų arbatoje
Kofeino, teobromino ir teofilino kokybinis ir kiekybinis nustatymas atliktas naudojant ESC metodą. Analizės metu vertinta, kokią įtaką išektrahuotiems kofeino, teobromino ir teofilino kiekiams turi skirtingi ekstrahentai. Pirmiausia atliktas tyrimas naudojant distiliuotą vandenį (verdantį ir kambario temperatūros) ir 70 proc. etanolį. Rezultatai pateikti 4 paveiksle.
4 pav. Kofeino kiekis (µg/ml) tirtuose džiovintų kavos uogų arbatos preparatuose naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų
bandinių (n=3, p<0,05)
Atlikus tyrimą pastebėta, kad statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnis kofeino kiekis nustatytas džiovintų kavos uogų arbatą ekstrahuojant 70 proc. etanoliu. Atlikus džiovintų kavos uogų ekstrakciją kambario temperatūros distiliuotu vandeniu ir verdančiu distiliuotu vandeniu statistiškai reikšmingų skirtumų, vertinant kofeino kiekį nebuvo nustatyta (p>0,05).
b b a 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo Etanolis (70 proc.) K of ein o k ie k is , µg/ m l Ekstrahentas
Įvertinus tai, kad ekstrahuojant 70 proc. etanoliu nustatytas didžiausias kofeino kiekis džiovintų kavos vaisių arbatos bandiniuose, atliktas tyrimas naudojant skirtingų koncentracijų etanolį, siekiant nustatyti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas. Rezultatai pateikti 5 paveiksle.
5 pav. Kofeino kiekis (µg/ml) tirtuose džiovintų kavos uogų arbatos preparatuose naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų
bandinių (n=3, p<0,05)
Analizuojant atlikto tyrimo rezultatus, nustatyta, kad etanolio koncentracija turi įtakos kofeino ekstrakcijai iš tiriamųjų džiovintų kavos uogų arbatos preparatų. Didžiausias (p<0,05) kofeino kiekis nustatytas džiovintų kavos uogų preparatus ekstrahuojant 70 proc. etanoliu (388,34 ± 7,22 µg/ml). Mažesni kofeino kiekiai nustatyti džiovintų kavos uogų arbatos preparatus ekstrahuojant 10 proc, 30 proc. ir 50 proc. etanoliu. Džiovintų kavos uogų arbatos preparatus ekstarhuojant 10 proc, 30 proc. ir 50 proc. etanoliu nustatyti kofeino kiekiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Mažiausi kofeino kiekiai nustatyti džiovintų kavos uogų preparatus ekstrahuojant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu (268,11 ± 5,92 µg/ml), verdančiu distiliuotu vandeniu (289,56 ± 6,68 µg/ml) ir 90 proc. etanoliu (286,95 ± 7,10 µg/ml). Dėl šios priežasties tęsti bandymus su šiais ekstrahentais yra netikslinga.
c c, d b b, d b a c 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo 10 proc. etanolis 30 proc. etanolis 50 proc. etanolis 70 proc. etanolis 90 proc. etanolis K of ein o k ie k is , µg/ m l Ekstrahentas
Apibendrinus galima teigti, kad optimalus ekstrakcijos tirpiklis kavos uogų arbatos preparatams yra 70 proc. etanolis, todėl jis pasirinktas tolimesniems tyrimams.
Vertinant ekstrahento įtaką teobromino kiekiui, didžiausias (p<0,05) teobromino kiekis nustatytas džiovintų kavos uogų preparatus ekstrahuojant 10 proc. etanoliu (1,66 ± 0,17 µg/ml). Džiovintų kavos uogų arbatos preparatus ekstrahuojant 50 proc, 70 proc. ir 90 proc. etanoliu nustatyti statistiškai reikšmingai (p<0,05) mažesni teobromino kiekiai (atitinkamai 1,20 ± 0,19 µg/ml, 1,18 ± 0,22 µg/ml ir 1,23 ± 0,11 µg/ml), lyginant su 10 proc. etanoliu, tačiau tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Teobrominas nebuvo nustatytas džiovintų kavos uogų preparatus ekstrahuojant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu ir verdančiu distiliuotu vandeniu. Rezultatai pateikiami 6 paveiksle.
6 pav. Teobromino kiekis (µg/ml) tirtuose džiovintų kavos uogų arbatos preparatuose naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų
bandinių (n=3, p<0,05)
Atlikus džiovintų kavos uogų preparatų ekstrakciją kambario temperatūros distiliuotu vandeniu, verdančiu distiliuotu vandeniu ir skirtingų koncentracijų etanolio tirpalais džiovintų kavos uogų sudėtyje teofilino nustatyti nepavyko.
0 0 a b c c b, c 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo Etanolis 10 proc. Etanolis 30 proc. Etanolis 50 proc. Etanolis 70 proc. Etanolis 90 proc. T eob rom in o kiek is , µ g/m l Ekstrahentas
3.1.2 Tiriamųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis nustatymas tirpioje kavoje
Buvo atliktas tyrimas tiriant tirpią kavą ir siekiant išsiaiškinti, ar skirtingi ekstrahentai turi įtakos tiriamųjų medžiagų kiekiui. Naudoti tirpikliai – kambario temperatūros distiliuotas vanduo, verdantis distiliuotas vanduo ir 70 proc. etanolis. Remiantis gautais tyrimo rezultatais, pateiktais 7 paveiksle, matome, kad statistiškai reikšmingai didžiausias (p<0,05) kofeino kiekis (3326,64 ± 328 µg/ml) nustatytas tirpią kavą ekstrahuojant 70 proc. etanoliu. Statistiškai reikšmingi mažiausias kofeino kiekis nustatytastirpią kavą ekstrahuojant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu (p<0,05).
7 pav. Kofeino kiekis (µg/ml) tirpioje kavoje naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)
b a, b a 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo 70 proc. etanolis K of ein o k iek is , µ g/m l Ekstrahentas
Vertinant ekstrahento įtaką teobromino kiekiui, galima teigti, kad statistiškai reikšmingai didžiausias (p<0,05) teobromino kiekis nustatytas tirpią kavą ekstrahuojant 70 proc. etanoliu (10,88 ± 1,52 µg/ml). Tirpią kavą ekstrahuojant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu ir verdančiu distiliuotu vandeniu nustatyti statistiškai reikšmingai (p<0,05) mažesni teobromino kiekiai, atitinkamai distiliuotu kambario temperatūros vandeniu 6,21 ± 1,32 µg/ml ir verdančiu distiliuotu vandeniu 6,41 ± 1,55 µg/ml. Rezultatai pateikiami 8 paveiksle.
8 pav. Teobromino kiekis (µg/ml) tirpioje kavoje naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)
b b a 0 2 4 6 8 10 12 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo 70 proc. etanolis T eob rom in o k iek is , µ g/m l Ekstrahentas
Vertinant ekstrahento įtaką teofilino kiekiui, matome, kad didžiausias (p<0,05) teofilino kiekis nustatytas tirpią kavą ekstrahuojant 70 proc. etanoliu (1,80 ± 0,21 µg/ml). Tirpią kavą ekstrahuojant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu ir verdančiu distiliuotu vandeniu nustatyti mažesni teofilino kiekiai, kurie tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Rezultatai pateikiami 9 paveiksle.
9 pav. Teofilino kiekis (µg/ml) tirpioje kavoje naudojant skirtingus ekstrahentus (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)
Apibendrinant tyrimo rezultatus, galima teigti, kad tirpią kavą ekstrahuojant etanoliu išgaunami didesni kofeino, teobromino ir teofilino kiekiai nei ekstrahuojant distiliuotu vandeniu. Pastebėta, kad ir džiovintų kavos vaisių arbatą, ir tirpią kavą ekstrahuojant etanoliu išekstrahuojami didesni tirtų ksantino grupės alkaloidų kiekiai nei ekstrahuojant vandeniu. Dėl šios priežasties etanolis gali būti pasirinktas kaip optimaliausias ekstrakcijos tirpiklis tolimesniems šių alkaloidų tyrimams.
b b a 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Kambario temperatūros distiliuotas vanduo Verdantis distiliuotas vanduo 70 proc. etanolis T eof il in o k iek is , µ g/m l Ekstrahentas
3.1.3 Skaldymo įtaka ksantino grupės alkaloidų kiekiui termiškai neapdorotų
kakavos pupelių bandiniuose
Tyrimo metu vertinta skaldymo įtaka ksantino grupės alkaloidų kiekiui termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandiniuose.
Tyrimo rezultatų duomenimis, pateiktais 10 paveiksle, matome, kad kofeino kiekis skaldytų ir neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Skaldytų kakavos pupelių bandiniuose nustatytas kofeino kiekis yra 52,26 ± 6,89 µg/ml, o neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose – 48,36 ± 5,17 µg/ml.
Remiantis gautais duomenimis, pateiktais 11 paveiksle, pastebime, kad teobromino, kaip ir kofeino, kiekis skaldytų ir neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Skaldytų kakavos pupelių bandiniuose nustatytas teobromino kiekis yra 330,96 ± 20,64 µg/ml, o neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose – 338,63 ± 18,27 µg/ml.
Galima teigti, kad kakavos pupelių skaldymas neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos kofeino ir teobromino kiekiui, nes statistiškai reikšmingi skirtumai tarp kofeino ir teobromino kiekio skaldytų ir neskaldytų kakavos pupelių bandiniuose nebuvo nustatyti. Tyrimo metu teofilinas termiškai neapdorotų kakavos pupelių bandiniuose nebuvo nustatytas.
a a 40 42 44 46 48 50 52 54 56 Skaldytos kakavos pupelės Neskaldytos kakavos pupelės K of ein o k iek is , µ g/m l
Kakavos pupelių rūšis
a a 315 320 325 330 335 340 345 Skaldytos kakavos pupelės Neskaldytos kakavos pupelės T eob rom in o k iek is , µ g/m l
Kakavos pupelių rūšis 10 pav. Kofeino kiekis (µg/ml) tirtuose
skaldytuose ir neskaldytuose kakavos pupelių bandiniuose (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)
11 pav. Teobromino kiekis (µg/ml) tirtuose skaldytuose ir neskaldytuose kakavos pupelių bandiniuose (Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)
