ŽALIAVŲ PARUOŠOS ĮTAKA VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ IŠEIGAI BRUKNIŲ VAISIUOSE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

LAURYNA PAULAUSKAITĖ

ŽALIAVŲ PARUOŠOS ĮTAKA VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ IŠEIGAI

BRUKNIŲ VAISIUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Vientisųjų studijų programa “Farmacija” valstybinis kodas 6011GX003

Studijų kryptis „Farmacija“

Darbo vadovas

Docentas Deividas Burdulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė

Data:

ŽALIAVŲ PARUOŠOS ĮTAKA VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ IŠEIGAI BRUKNIŲ

VAISIUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. Deividas Burdulis

Data:

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Lauryna Paulauskaitė

Data: Data:

TURINYS

SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 PADĖKA ... 9 SANTRUMPOS ... 10 ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1 Bruknių apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 13

1.2 Bruknių paplitimas ir augimo sąlygos ... 14

1.3 Bruknių vaisių cheminė sudėtis ... 15

1.4 Bruknių kutikulės sudėtis ... 15

1.5 Bruknių vaisiuose esančių cukrų sudėtis ... 16

1.6 Bruknių vaisių farmakologinis poveikis ... 17

1.6.1 Antioksidantinis poveikis ... 17

1.6.2 Antimikrobinis ir priešvirusinis poveikis ... 18

1.6.3 Poveikis nervinio audinio degeneracijai ... 19

1.6.4 Kardioprotektinis poveikis ... 20

1.6.5 Poveikis nutukimui ir su juo susijusioms ligoms ... 21

1.7 Bruknių vaisių žaliavų paruošos būdai ... 23

1.7.1 Žaliavų paruošimas liofilizuojant ... 23

1.7.2 Žaliavų paruošimas šaldant ... 24

1.7.3 Temperatūros įtaka žaliavų paruošimui ... 25

2. TYRIMŲ METODIKA ... 26

2.1 Tyrimo objektas ... 26

2.2 Tyriamojo laikotarpio meteorologinės salygos ... 26

2.3 Naudoti reagentai ir medžiagos ... 27

2.4 Naudota aparatūra ir darbo priemonės ... 27

2.5 Nuodžiūvio nustatymas skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių žaliavose ... 27

2.6 Tyriamųjų mėginių paruošimas ... 28

2.7 Tyrimo metodai ... 30

2.7.1 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 30

2.7.2 Suminio procianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 32

2.7.3 Suminio antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 33

2.7.5 Redukcininės gebos nustatymas FRAP metodu ... 35

2.7.6 Tyrimo duomenų analizė ... 37

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 38

3.1 Biologiškai aktyvių junginių kiekinės sudėties nustatymas skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose ... 38

3.1.1 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose ... 38

3.1.2 Suminio procianidinų kiekio nustatymas skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose .. 39

3.1.3 Antocianinų kiekio nustatymas skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose ... 41

3.1.4 Antioksidantinės gebos įvertinimas ABTS metodu skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėmininiuose ... 42

3.1.5 Redukcinės gebos įvertinimas FRAP metodu skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių ėmininiuose ... 43

3.1.6 Antioksidantinės gebos priklausomybės nuo suminio polifenolinių junginių kiekio įvertinimas ... 44

5. IŠVADOS ... 46

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48

8.0 PRIEDAI ... 54

SANTRAUKA

Magistrinį darbą parengė Lauryna Paulauskaitė. Darbo vadovas docentas Deividas Burdulis. Darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, medicinos akademijoje, farmacijos fakultete, farmakognozijos katedroje.

Darbo pavadinimas: žaliavų paruošos įtaka veikliųjų medžiagų išeigai bruknių vaisiuose.

Darbo tikslas – nustatyti bruknių vaisių skirtingų paruošos būdų įtaką veikliųjų medžiagų kiekiui. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo. 2. Nustatyti suminio procianidinų kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo. 3. Nustatyti antocianinų kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo. 4 Nustatyti antioksidantinį aktyvumą skirtingai paruoštose bruknių vaisių žaliavose. 5. Nustatyti antioksidantinio aktyvumo priklausomybę nuo suminio fenolinių junginių kiekio.

Tyrimo objektas: Žaliosios girios miške (55° 51′ 0″ N, 24° 30′ 0″ E 55.85°, 24.5° (WGS)), natūralioje augavietėjerinkti bruknių vaisiai.

Tyrimo metodai: suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustaytas remiantis kalorimetriniu Folin-Ciocalteu metodu, antocianinų ir suminis procianidinų kiekis – remiantis spektrofotometrija, antioksidantinė geba buvo nustatyta remiantis ABTS ir FRAP metodais.

SUMMARY

This Master's thesis was prepared by Lauryna Paulauskaitė. My Supervisor was Deividas Burdulis, the Associate Professor. The work was performed at the Medical Academy, Faculty of Pharmacy and the Department of Pharmacognosy of the Lithuanian University of Health Sciences. Title: influence of raw material preparation on the yield of active substances in lingonberry fruits. Aim: aim of the study was to determine the influence of different preparation methods of lingonberry fruits in the yield of active substances.

Objectives: 1. To determine the dependence of the total amount of phenolic compounds in the method of preparation of lingonberry fruit raw materials. 2. To determine the dependence of the total content of procyanidins on the method in preparation of lingonberry fruit raw materials. 3. To determine the dependence of anthocyanin content on the method of preparation of lingonberry fruit raw materials. 4 To determine different preparation methods of the the antioxidant activity in lingonberry fruit raw materials. 5. To determine the dependence of antioxidant activity on the total amount of phenolic compounds.

Object: lingonberry fruits collected in a natural habitat at the “Žalioji” forest.

Methods: total phenolic compounds were determined by calorimetric Folin-Ciocalteu method, anthocyanins and total procyanidins were determined by spectrophotometry, antioxidant capacity was determined by ABTS and FRAP methods.

PADĖKA

SANTRUMPOS

ABTS - 2,2‘–azinodi[3–etilbenztiazolino]–6–sulfoninė rūgštis COX – ciklooksigenazė

DMCA - 4-dimetilaminocinamaldehidas DNR – deoksiribonukleorūgštis

FRAP - trivalentės geležies jonų redukcijos jėga GAE – galo rūgšties ekvivalentai

HSV-1 – pirmo tipo herpes simplex virusas HSV-2 – antro tipo herpes simplex virusas NO - azoto oksidas

PSO – pasaulio sveikatos organizacija RNS - reaktyvios azoto formos ROS - reaktyvios deguonies formos

TE – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia TPTZ- 2,4,6-tripyridyl–s–triazinas

ĮVADAS

Oksidacinis stresas yra neišvengiama kasdienybės dalis, sukelianti negrįžtamus pakitimus organizme, kurie prisideda prie daugelio lėtinių ligų vystimosi. Oksidacinio streso metu sutrinka pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Antioksidantai gali būti natūraliai gaminami organizme arba gaunami su maistu. Polifenoliniai junginiai, pasižymi antioksidantnėmis savybėmis ir jų gausa nustatyta vaisiuose ir daržovėse [1].

Paskutiniais dešimtmečiais erikinių šeimos augalai, sulaukė ypatingo mokslininkų susidomėjimo. Buvo nustatyta, jog jų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Bruknių vaisių vartojimas yra taip pat siejamas su sumažėjusiu ląsteliu bei DNR pažeidimu, mažesniu oksidaciniu stresu. Dažnas šių vaisių vartojima gali būti puiki prevencijos priemonė širdies ir kraujagyslių, neurogeneracinėms bei virusų ir grybelių sukeliamoms ligoms. Taip pat ilgalaikis vartojimas siejamas su nutukimo ir su juo susijusių ligų, tokių kaip diabetas, mažinimu [2].

Pasak pasaulio sveikatos organizacijos (PSO), žmogus per dieną turėtų suvartoti bent 400 gramų vaisių ir daržovių. Tiesa, daržovių rekomenduojama suvalgyti 3-5 porcijas per dieną, o vaisių tik 2-4 porcijas. Deja, situacija yra tokia, jog daugelis žmonių šių rekomendacijų nesilaiko ir į savo mitybos racioną įtraukia nepakankamai šviežių vaisių ir daržovių. Atlikti tyrimai, kurių metu buvo nustatyta, jog šviežius vaisius ir daržoves Lietuvoje vartoja tik kas trečias žmogus ir tai tik vidutiniškai 260 gramų per dieną [3].

Maistui vartoti tinka ne tik šviežios, bet ir šaldytos, džiovintos bei kitaip apdorotos daržovės ir vaisiai [3]. Svarbu žinoti, jog antioksidacinis aktyvumas bei kokybinė ir kiekybinė veikliųjų medžiagų sudėtis vaisiuose ir daržovėse varijuoja priklausomai nuo žaliavos paruošos būdo, todėl yra svarbu išsiaiškinti, kokį paruošos būdą reikėtų rinktis siekiant gauti maksimalią veikliųjų medžiagų išeigą [4].

Mokslinio darbo aktualumas: remiantis šio atlikto mokslinio darbo tyrimo duomenimis galima nustatyti kokiu būdu geriausiai vykdyti bruknių vaisių paruošas, siekiant išgauti didžiausius veikiųjų medžiagų kiekius. Atsižvelgiant į tai, kokios veikliosios medžiagos tame paruošos būde dominuoja ir į tai kokia yra jų išeiga, galima pasirinkti tokį žaliavos paruošos būdą, kokio farmakologinio poveikio yra siekama.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – nustatyti bruknių vaisių skirtingų paruošos būdų įtaką veikliųjų medžiagų išeigai. Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo.

2. Nustatyti suminio procianidinų kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo.

3. Nustatyti antocianinų kiekio priklausomybę nuo bruknių vaisių žaliavų paruošos būdo. 4. Nustatyti antioksidantinę gebą skirtingai paruoštose bruknių vaisių žaliavose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Bruknių apibūdinimas ir morfologiniai požymiai

Bruknė (lotyniškai Vaccinium vitis-idaea) yra erikinių šeimos augalas, priklausantis magnolijainių (Magnoliopsida) klasei, magnolijūnų (Magnoliophyta) skyriui ir augalų (Plantae) karalystei. Tai daugiametis visžalis

krūmokšnis, kuris auga iki 15 centimetrų aukščio [5].

Šakniastiebis yra plonas, ilgas bei šakotas. Jis jungia keletą krūmokšnių. Šakniastiebiai driekiasi miško paklote ir nuo jų atsišakoja pridėtinės šaknys [6].

Bruknių lapeliai yra pražanginiai, atvirkščiai kiaušiniški arba elipsės formos, buki, lygiakraščiai arba nežymiai rinčiuoti. Lapai stori bei odiški. Lapus dengia epidermis. Viršutnis epidermio sluoknis yra

storesnis lyginant su apatiniu. Viršutinis lapelių paviršius tamsiai žalios spalvos, o apatinis šviesiai žalios spalvos ir gausiai taškuotas. Matomi rudos spalvos taškeliai yra liaukutės, kurios išskiria raugines medžiagas. Lapelių viršutinėje pusėje žiotelių nėra, o apatinėje pusėje žiotelių skaičius svyruoja nuo 300 iki 400 šimtų. Lapeliai yra žemyn užsirietusiais kraštais, nes lapalakščio krašte yra sklerenchimos plaušelių pluoštas ir turi būdingą trumpą 0,5 – 3,0 mm ilgio lapkotį. . Vidutinis lapo plotas – 1,5 cm2. Lapo plotas didėja tol, kol atviro ploto apšviestumas mažėja iki 50 procentų. Esant dar didesniam užtemdymui lapų plotas pradeda mažėti. Lapalakščio storis mažėja, kai mažėja apšviestumas. Lapų dydis ant tos pačios šakutės yra nevienodas – šakutės viršūnėje ir prie pagrindo jie yra smulkesni, o jos viduryje stambesni [6].

Bruknių pumpurai gali būti trijų skirtingų rūšių: vegetatyviniai, generatyviniai bei mišrūs. Iš pradžių pumpurėliai būna žalios spalvos, vėliau po šalnų jie tampa blankiai rausvos spalvos. Vegetatyviniai pumpurėliai smulkūs, o generatyviniai ir mišrūs yra stambesni [7].

Tačiau kartais būna ir tokių atvejų, jog žiedas prie pagrindo pražysta paskutinis. Tuo pačiu dėsningumu mažėja ir žiedų dydis. Iš pradžių žiedeliai būna rausvos spalvos, tačiau jiems besiskleidžiant tas rausvumas dingsta ir žiedeliai tampa baltos spalvos. Žiedų vainikėlis yra suaugusiais vainiklapiais, varpo formos ir sudarytas iš į išorę atsilenkusių 4-5 mentelių. Bruknių taurelė žalia, sudaryta iš 4 suaugusių taurėlapių, kurie yra prisiglaudę prie vainikėlio ir išsidėstę tarpuose tarp vainiklapių. Kuokelyne yra 8 kuokeliai. Kuokelis sudarytas iš rudos, dvilizdės dulkinės ir balto, laisvo bei išlenkto kotelio. Vaislapynas suaugtinis, sudarytas iš 4-5 vaislapėlių. Žiedai pasižymi silpu, bet maloniu kvapu [7].

Bruknių sėklos yra rausvai rudos spalvos, pusmėnulio arba įgaubto pusmėnulio formos bei truputį suplotos. Sėklų luobelės paviršius – blizgantis [6].

Bruknių vaisius – smulkios, sultingos, apvalios uogos, kurių paviršius yra blizgus. Uogų viršūnėje matomos taurelių liekanos. Šių uogų spalva kintanti – iš pradžių uoga žalia, tačiau jai nokstant spalva kinta iki įvairių atspalvių raudonos spalvos. Bruknių vaisiai auga kekėmis. Dažniausiai vienoje kekėje būna 5-6 uogos, tačiau pasitaiko ir išimčių. Bruknių vaisiai heterogeniški, nes prinoksta ne vienu metu. Pirmosios uogos prinoksta rugpjūčio viduryje, kitos noksta iki šalnų. Uoga keturlizdė, kartais penkializdė, storu egzokarpiu ir sultingu, gana rūgštaus skonio mezokarpiu. Augalas dauginasi šakniastiebiais ir sėklomis. Pastarąsias išnešioja bruknių vaisiais mintantys paukščiai bei vanduo [6].

1.2 Bruknių paplitimas ir augimo sąlygos

Bruknių vaisiai yra plačiai paplitę visame šiaurės pusrutulyje bei tundroje. Geriausiai auga vidutinio klimato juostoje. Jos dažniausiai aptinkamos aukštapelkėse, spygliuočių miškuose, beržynuose bei tarpinio tipo pelkėse [6].

2 pav. Bruknės paplitimas pasaulyje [8]

prisitaikiusios augti skurdžiame dirvožemyje, jų dažnai tręšti nerekomenduojama. Labiausiai šiam augalui reikaligas mikroelementas azotas. Jis itin svarbus žiedpumpurių formavimosi metu. Šio mikroelemento trūkmą galima atpažinti iš blyškių, pageltusių lapelių bei trumpesnių nei įprastai ūglių. Nedideliais kiekiais bruknėms taip pat reikalingas manganas, varis, baris bei mineralinės trąšos azotas, kalis ir fosforas. Per dideli mikroelementų ir mineralinių trąšų kiekiai slopina bruknių šaknijimąsi [10]. Bruknės yra sausrai atsparus augalas. Jos gali augti net tada, kai gruntiniai vandenys yra 0,5-2 m ar net giliau. Dėl puikiai išvystytų antioksidacinių mechanizmų, bruknės išgyvena net ir itin nepalankias aplinkos sąlygas. Pastebėta, jog augalai su prinokusiais vaisiais gali išgyventi net iki -2 °C temperatūros, o su dar nesunokusiais vaisiais net iki -3 °C temperatūros. Jei aplinkos temperatūra nukrenta iki -12 °C temperatūros, bruknes būtina apsaugoti apdengiant jas šiaudų mulčiumi [11].

1.3 Bruknių vaisių cheminė sudėtis

Z. Banzaitienės ir jos kolegų parengtoje knygoje nuodugniai aprašyta bruknių vaisių cheminė sudėtis. Knygoje teigiama, jog bruknių vaisiuose yra: „ ... apie 84,1-88,4 proc. vandens; 7-10 proc. cukraus; 1,7-2,9 proc. organinių rūgščių: obuolių, citrinos, oksalo, acto, benzoinės, kuri svarbi tuo, jog naikina puvimo ir rūgimo mikrobus; 0,2-1,7 proc. pektinų, 0,49 proc. rauginių medžiagų; eterinio aliejaus, glikozidų (0,1 proc. vakcinino, arbutino, ideinchlorido, likopino, zeaksantino); flavonų; mineralinių medžiagų (0,43-0,61 % kalio, 0,10-0,15 % fosforo, 68-87 mg % kalcio, 17-34 % geležies, vario, 70-83 % mangano, 310- 370 mg % magnio); vitaminų (0,5-6,1 mg % karotino, 0,02 mg % B1, 0,02 mg % B2, 10-21 mg % , C, 310-600 mg % P).Pagrindiniai fenoliniai junginiai bruknių vaisiuose yra proantocianidinai, kurie sudaro apie 71 % visų junginių. Proantocianidinai priklauso fenolinių junginių grupei ir pasižymi antimikrobiniu ir antioksidantiniu poveikiu.“ [6].

Labai svarbu paminėti, jog organinių medžiagų kiekis kinta vegetacijos laikotarpiu. Pavyzdžiui, tyrimų metu nustatyta, jog didžiausias cukraus kiekis bruknių vaisiuose yra aptinkamas vegetacijos pabaigoje [12]. Taip pat organinių medžiagų kiekiui žaliavoje gali turėti įtakos augavietės ekologinės ir gamtinės sąlygos, žaliavos surinkimo ir laikymo trukmė ir kt. [6].

1.4 Bruknių kutikulės sudėtis

2 pav. Bruknių vaisių vaškas [13]

Tyrinėjant bruknių vaisių kutikulę nuodugniau, nustatytas reiškinys, kuris vadinamas sintopizmu. Tai apibūdina reiškinį, kai ant vienos ląstelės paviršiaus yra aptinkama daugiau nei vienos rūšies kristaloidai (paveikslėlis 3) [13].

3 pav. Bruknių vaisių kutikulinio vaško morfologija

Kutikuliniame bruknių vaisių vaške dominioja triterpenoidai: triterpeno alkoholiai (β-amirinas, α-(β-amirinas, lupeolis) ir triterpeno rūgštys (oleanolio rūgštis, ursolio rūgštis). Taip pat buvo rasta adriatikolio ir uvaolio. Triterpenoidai sudaro net 69.6 proc. bruknių vaisių kutikulinio vaško. Šie junginiai turi įvairių sveikatai naudingų savybių, tokių kaip priešvėžinis, priešuždegiminis, antimikrobinis bei kardioprotkcinis poveikis. Be triterpenoidų taip pat aptinkama alkanų, riebalų rūgščių (lignocerino rūgštis) , pirminių alkoholių bei aldehidų [13].

1.5 Bruknių vaisiuose esančių cukrų sudėtis

[14]. Taip pat per didelis cukraus kiekis, gali prisidėti prie uždegiminių procesų atsiradimo, didėjančio atsparumo insulinui, beta ląstelių atsparumo ir oksidacinio streso. Pasak PSO (pasaulio sveikatos organizacijos), vidutinis cukraus suvartojimas turėtų būti ne didesnis nei 10 % visos suvartojamos energijos [12].

Buvo atliktas tyrimas, kurio metu tiek natūraliai augančių, tiek kultivuotų bruknių mėginiuose buvo bandoma aptikti 16 cukrų, įskaitant monosacharidus, disacharidus ir poliolius. Nustatyta, jog visuose mėginiuose vyravo fruktozė, gliukozė ir sacharozė [12].

Lyginant su laukinėmis bruknėmis, kultivuotose bruknėse bendras cukraus kiekis buvo 1.1, 1.1 ir 1.2 didesnis, tačiau atsižvelgiant į nepriklausomų mėginių testą, statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių dviejų grupių nebuvo [12].

Nors ir bruknių vaisiuose palyginus su kitomis cukraus kiekis yra nemažas (552.58 ± 63.57 mg/g laukinėse ir 596.92 ± 85.78 mg/g kultivuotose), tačiau jaudintis dėl galimo neigiamo poveikio neverta. Nustatyta, jog tam, kad pasireikštų neigiamas poveikis sveikatai, reiktų suvalgyti net 1,25 kg šviežių vaisių kasdien. Saikingas šių vaisių vartojimas suteikia sotumo jausmą bei dėl uogose esančių aktyvių junginių puikiai tinka lėtinių ligų prevencijai [12].

Atlikus tyrimą buvo nustatyta, jog didžiausias bendro cukraus kiekis aptinkamas vegetacijos pabaigoje, taigi norint, jog bruknių vaisai būtų saldesnio skonio, vertėtų jas rinkti rugsėjo pabaigoje [12].

1.6 Bruknių vaisių farmakologinis poveikis

Paskutiniais dešimtmečiais bruknių vaisiai susilaukė itin didelio mokslininkų susidomėjimo dėl savo biologiškai aktyvių fenolinių junginių, kurie pasižymi sveikatai naudingomis savybėmis [14]. Buvo nustatyta, jog pastarieji pasižymi antioksidantiniu [16], antimikrobiniu [17], priešuždegiminiu [18], kardioprotekciniu [19] poveikiu, taip pat yra puikiai tinka nutukimui ir su juo susijusių ligų prevencijai [20].

1.6.1 Antioksidantinis poveikis

rūkymas, įvairios organizmą alinančios dietos, patogeninės infekcijos, ultravioletiniai ir rentgeno spinduliai, cheminės medžiagos ir kt. [21].

Laisvieji radikalai savo išoriniame sluoksnyje turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų ir yra linkę sąveikauti su ląstelių struktūromis pakeisdami atomų ir molekulių cheminį aktyvumą [22]. Per didelis laisvųjų radikalų kiekis organizme yra žalingas, nes pastarieji gali pažeisti ląstelių membranas, DNR, baltymus, lipidus bei ilgainiui gali sukelti ląstelių disfunkciją ar net mirtį, pažeisti audinius ir organus [23]. Tam, kad išvengtume neigiamo laisvųjų radikalų poveikio, į savo mitybą turime įtraukti produktų, turinčių fenolinių junginių – antrinių augalų metabolitų, kurie pasižymi antioksidantiniu poveikiu [24].

Fenolinių junginių antioksidacinis poveikis yra grindžiamas keliais mechanizmais. Pirmasis jų, tas jog fenoliniai junginiai geba inaktyvuoti laisvuosius radikalus, atiduodami pastariesiems laisvos hidroksilo gupės vandenilio atomą ir taip sudarydami mažiau reaktyvius ir stabilesnius junginius. Antrasis veikimo mechanizmas grindžiamas fenolinių junginių gebėjimu surišti metalų jonus. Šis gebėjimas yra svarbus tuo, jog pereinamųjų metalų jonai dalyvauja laisvųjų radikalų susidaryme. Trečiasis veikimo mechanizmas grindžiamas šių junginių gebėjimu apsaugoti kitus antioksidantus nuo oksidacinio streso, nes pastarieji geba neutralizuoti laisvuosius radikalus bei surišti vario ir kitų pereinamųjų metalų jonus ir tokiu būdu apsaugoti nuo šių jonų sukeliamos oksidacijos [15].

1.6.2 Antimikrobinis ir priešvirusinis poveikis

Mikrobai yra vienaląsčiai arba kolonijiniai organizmai. Jiems priskiriamos bakterijos, grybeliai, dumbliai, mikroskopiniai pirmuonys bei virusai ir prionai. Šie mikroorganizmai yra prisitaikę gyventi beveik visose planetos aplinkose. Daugelis jų yra labai svarbūs įvairiuose biocheminiuose organizme vykstančiuose procesuose, tačiau kai kurie iš jų veikia patogeniškai ir sukelia įvairias infekcines ligas [25]. Buvo nustatyta, jog augaluose esantys polifenoliniai junginiai pasižymi stipriu antibakteriniu, antivirusiniu ir antiparazitiniu poveikiu. Tam, jog šie junginiai taptų aktyvūs organizme, jie yra transformuojami virškinimo fermentų bei mikrobiotos. Galutinai transformuoti junginiai patenka į kraujotaką ir ten pasižymi antibakterinėmis savybėmis [26].

Buvo nustatyta, jog flavonoliai pasižymi antivirusiniu poveikiu prieš žmogaus imunodeficito virusą ŽIV, Herpes simplex, resipracinį sinticinį virusą (sukelia ryklės, nosiaryklės, trachėjos ir bronchų uždegimą) bei poliovirusą (sukelia galūnių raumenų susilpnėjimą ir paralyžių) [27].

hesperidinas pasižymi priešgybeliniu poveikiu, kadangi jis slopina grybelio Phytophthora citrophthora augimą. Antiparazitinis šio glikozilinto flavonono poveikis buvo įrodytas in vitro ir in vivo tyrimuose prieš Schistosoma mansoni parazitą, kuris sukelia šistosomatozę ir kirminus [16].

Flavan-3-oliai blogindami viruso prisijungimą prie ląstelės slopina hepatito C viruso patekimą bei pasižymi antivirusiniu poveikiu prieš ŽIV-1 virusą [28]. Šie junginiai taip pat pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš Bacillus spp., Clostridium spp., Salmonella typhi ir E.coli bakterijas [29, 30].

Antocianinai slopina gramneigiamų bakterijų Salmonella enterica ser. Typhimurium,

Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, E. coli ir gramteigiamų bakterijų Enterococcus faecalis, S. aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes augimą [31]. Taip pat antocianinai,

konkrečiau Cianidin-3-O-gliukozidas, slopina pagrindinių H. Pylori bakterijų virulentiškumo faktorių sekreciją [32].

Atlikus tyrimus buvo nustatyta, jog flavonai veikia herpes simplex (HSV-2) viruso infekciją ankstyvose jos stadijose. Veikimo mechanizmas aiškinamas tuo, jog šie junginiai slopina Herpes

simplex viruso prisijungimą prie ląstelės membranos, todėl neleidžia pastarajam patekti į jos vidų [33].

Taip pat flavonai pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš E. coli, S. aureus, P. fluorescens bei B.

Subtilis [34].

Mokslinių tyrimų duomenimis hidrolizuoti taninai pasižymi antivirusiniu poveikiu prieš hepatito B bei Herpes simplex virusus [35]. Be to, šie junginiai veikia prieš S. typhi, E. coli ir S.

Aureus bakterijų priedermes [36].

1.6.3 Poveikis nervinio audinio degeneracijai

Kadangi gyvename tokiais laikais, kuomet žmonės išgyvena ilgiau nei bet kada, todėl su amžiumi susijusios ligos tampa vis svarbesnės [37]. Žmogui senstant išsenka antioksidantiniai mechanizmai, todėl vystosi oksidacinis stresas [38]. Oksidacinis stresas smegenyse sukelia DNR ir baltymų pažaidą bei daro įtaką tokių neurogeneracinių ligų kaip Alzhaimerio, Parkinsono, Hantingtono, šižofrenijos, amiotrofines lateralinės sklerozės bei priono ligų vystimuisi [39,40]. Nervinis audinys yra labai jautrus oksidaciniam stresui, todėl, kad nerviniame audinyje yra nedidelis antioksidacinių fermentų [41] kiekis bei smegenų membranos yra labai jautrios peroksidacijai [42].

oksidacinis stresas, kuris gali pažeisti ne tik nervinį audinį bet ir visas organizmo ląsteles [43]. Organizmuose yra susidarę natūralūs gynybos mechanizmai, kovojantys pries oksidacinį stresą, tačiau tokiais atvejais, kuomet pasireiškia disbalansas tarp aktyvių deguonies bei azoto formų ir antioksidantų, pačiam organizmui su tuo kovoti nebepavyksta, todėl savo mitybos racioną būtina papildyti antioksidantais [44].

Erikinių šeimos augalai pastaraisiais dešimtmečiais sulaukė itin didelio mokslininkų susidomėjimo. Kadangi šiuose augaluose yra gausu antioksidandų, tokių augalų įtraukimas į mitybos racioną gali būti naudingas apsisaugant nuo smegenų senėjimo ir neurodegeneracinių sutrikimų. Antioksidantai neutralizuoja laisvuosius radikalus, todėl pastarieji nespėję padaryti žalos pasišalina iš organizmo [45].

Kadangi augalai yra nejudrūs, jie negali taip paprastai išvengti neigiamo aplinkos poveikio. Nepalankios aplinkos sąlygos skatina laisvųjų radikalų gamybą bei oksidacinį stresą. Būtent dėl šių priežasčių augaluose yra susiformavę atioksidaciniai mechanizmai, kurie apima platų junginių spektrą, įskaitant superoksido dismutazę, katalzę, tokius antioksidantų metabolitus kaip askorbatas, glutationas, tokoferolis, karotinoidai bei fenolinius jungininius, tokius kaip flavonoidai ir antocianinai. Visi šie junginiai ir pasižymi antioksidacinėmis savybėmis bei yra naudingi mūsų organizmui [46].

Svarbiausias aspektas kalbant apie šiuos junginius ir jų teigiamą poveikį organizmui yra šių junginių bioprieinamumas. Tam, kad junginiai galėtų tiesiogiai veikti smegenis, jie turi būti absorbuojami iš virškinamojo trakto ir dar pereiti hemaentocefalinį barjerą. Buvo atlikti tyrimai, kurių metu buvo nustatyta, jog polifenoliniai junginiai geba pereiti pro hemaentocefalinį barjerą, nes antocianinai aptikti graužikų ir kiaulių [47,48,49] nerviniame audinyje pastariesiems vartojant polifenolinių junginių turinčias žaliavas [50].

1.6.4 Kardioprotektinis poveikis

Atsižvelgiant į Higienos instituto Sveikatos informacijos centro (2011) duomenis, širdies ir kraujagyslių sistemos ligos Lietuvoje sudaro daugiau kaip pusę visų mirties priežasčių [51]. Tai yra viena opiausių sveikatos priežiūros problemų ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje [52]. Buvo nustatyta, jog augalinių produktų įtraukimas į mitybos racioną, gali pagerinti širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą bei yra puikus prevencijos būdas siekiant užkirsti kelią šių ligų atsiradimui [53].

sumažina azoto oksido bei kitų faktorių sintezę ir jų biologinį prieinamumą. Viena pagrindinių šių faktorių funkcijų – kraujo spaudimo kontroliavimas. Jis vykdomas išlaikant pusiausvyrą tarp kraujagyslių susitraukimo ir atsipalaidavimo [55].

Kardioprotektinis bruknių viasių poveikis yra grindžiamas laisvųjų radikalų neutralizavimu t.y oksidacinio streso mažinimu organizme bei azoto oksido ir kitų už kraujagyslių susitraukimą ir atsipalaidavimą atsakingų faktorių ekspresijos reguliavimu. Už šį poveikį yra atsakingi bruknių vaisiuose esantys fenoliniai junginiai – ypač flavonoliai [56].

Atliktas tyrimas su žiurkėmis, kurio metu buvo išsiaiškinta, jog bruknių ekstraktas sustiprino raudonųjų kraujo kūnelių apsaugą nuo neigiamo oksidacinio streso poveikio, pagerino vazodilataciją, kuri yra priklausoma nuo endotelio bei sumažino kraujo spaudimą arterine hipertenzija sergančiųjų žiurkių tarpe [57].

Dar vienas svarbus aspektas kalbat apie širdies ir kraujagyslių ligas yra padidėjęs kraujo krešumas, kuris priklausomai nuo kraujagyslės vietos ir tipo gali būti įvairių ligų, tokių kaip infarktas, insultas ir kt. patologinių būklių priežastis [58]. Buvo nustatyta, jog ekstraktai, kuriuose yra gausu polifenolinių junginių, slopina trombocitų sukibimą su kalogenu. Tai yra be galo svarbu, nes trombocitams sukibus su kalogenu įvyksta šių raudonųjų kraujo kūnelių aktyvacija. Taip pat polifenoliniai junginiai sumažina integrino a2 b1 (GPIa / IIa) ir glikoproteinų GPIV ir GPVI receptorių ekspresiją. Šie receptoriai taip pat yra susiję su trombocitų sukibimu su kalogenu. Be viso šito, In vitro atlikti tyrimai rodo, jog bruknių vaisiuose esantis revestrolis sugeba blokuoti kalcio kanalus ir slopina Ca jonų antplūdį į trombocitus, kuriuos aktyvuoja trombinas, o kvercetinas slopina Ca mobilizaciją iš endoplazminio tinklo. Tai ypač svarbu antitrombocitiniu savybių požiūriu, nes daugelis trombocitų fermentų priklauso nuo kalcio [59].

1.6.5 Poveikis nutukimui ir su juo susijusioms ligoms

Nutukimas yra nuolat auganti sveikatos problema visame pasaulyje. Jis susijęs su žemo laipsnio sisteminiu uždegimu, kuris prisideda prie medžiagų apykaitos sutrikimų ir tokių gretutinių ligų kaip antro tipo cukrinis diabetas, širdies ir kraujagyslių ligos, hipertenzija, kepenų suriebėjimas, nesusijęs su alkoholio vartojimu ir t.t. [60]. Buvo nustatyta, jog į mitybos racioną įtraukus polifenolinių junginių turinčių maisto produktų, sumažėja nutukimo rizika [61].

alanino aminotransferazės aktyvumas. Atlikus tyrimą buvo nustatyta, jog bruknių vaisių įtraukimas į mitybos racioną, užkirto kelią daug riebalų turinčios mitybos sukeltam neigiamam cholesterolio, gliukozės bei insulino padidėjimui organizme. Taip pat buvo nustatyta, jog uždegimą skatinančio adipokino leptino, biomarkerio serumo amiloido A, alanino aminotransferazės aktyvumas kraujyje buvo mažesnis lyginant su tais peliukais, kurių mityboje buvo gausu riebalų ir papildomai į mitybos racioną nebuvo įtraukta bruknių vaisių. Buvo prieita išvados, jog bruknių vaisių įtraukimas į mitybos racioną mažina nutukimą, cholesterolio ir trigliceridų kiekį organizme, todėl sumažėja sisteminis žemo laipsnio uždegimas, medžiagų apykaitos sutrikimai ir su tuo susijusios gretutinės ligos [19].

1.6.7 Priešuždegiminis poveikis

Uždegimas – tai gynybinė imuninės sistemos reakcija į dirgiklius. Lėtinis uždegimas yra daugelio lėtinių sveikatos sutrikimų vystymosi priežastis. Jis sukelia tokias ligas kaip pirmo tipo cukrinis diabetas, aterosklerozė, išeminė širdies liga, Alzhaimeris, podagra ir kt. [62]. Tyrimų metu buvo nustatyta, jog polifenoliniai junginiai pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, todėl yra puiki alternatyva lėtinių uždegiminių ligų profilaktikai bei gydymui [17].

Nustatyta, jog polifenoliniai junginiai mažina ciklooksigenazės bei lipoksigenazės – uždegimą sukeliančių fermentų bei mediatorių prostaglandinų ir leukotrienų aktyvumą. Pagrindinis mechanizmas, kuriuo yra grindžiamas šių junginių priešuždegiminis poveikis yra tas, jog pastarieji slopina uždegimo mediatorių sintezę ir atpalaidavimą. Taip pat šie junginiai slopina fermentų ciklooksigenazės-1 ir ciklooksigenzės – 2 veiklą [63].

Klinikiniuose tyrimuose su pelėmis buvo nustatyta, jog bruknių vaisiuose esantis resveratrolis slopina ciklooksigenazę, indukuoja endotelio azoto oksido sintezę bei inaktyvuoja peroksisomos proliferatoriaus aktyvuotą gama receptorių makrofaguose [64,65] Be to, buvo įrodyta, jog šiose uogose esantis kvercetinas slopina leukotrienų biositezę žmogaus polimorfonukleariniuose leukocituose [66].

1.7 Bruknių vaisių žaliavų paruošos būdai

1.7.1 Žaliavų paruošimas liofilizuojant

Liofilizacija yra džiovinimo metodas, kuomet vanduo, esantis žaliavoje, užšaldomas, o vėliau pašalinamas iš jos sublimuojant (pirminis džiovinimas) ir desorbuojant (antrinis džviovinimas). Liofilizacija naudojama norint išsaugoti gerąsias maistines produkto savybes. Šis džiovinimo metodas puikiai tinka medžiagoms, kurios yra termolabilios t.y nestabilios vandeniniuose tirpaluose, tačiau yra stabilios sausoje būsenoje. Pagrindinis liofilizacijos metodo principas – reiškinys, vadinamas sublimacija, kurio metu vanduo iš kietosios būsenos (ledo) pereina ne į skystą, o į dujinę būseną. Vanduo iš žaliavos sublimuojamas temperatūrai ir slėgiui esant žemiau trigubo taško t.y 4,579 mm Hg ir 0,0099 °C (pasirenkamos šios sąlygos, nes įprastai esant atmosferos slėgiui vanduo gali turėti tris fizikines būsenas - kietą, skystą ir dujinę, tačiau temperatūrai ir slėgiui esant žemiau trigubo taško egzistuoja tik kieta ir dujinė būsenos). Produkte esantis ledas paverčiamas vandens garais, jei aplinkos dalinis vandens garų slėgis yra žemesnis už dalinį ledo slėgį esant atitinkamai temperatūrai [67]

Pagrindiniai liofilizacijos principai: 1) Produkto užšaldymas;

2) Sušąlęs produktas talpinamas į vakuumą. Vakuumas leidžia užšalusį tirpiklį vakuumee sublimuoti.

3) Sublimacijos pagreitinimui naudojama šiluma;

4) Žemos temperatūros kondensatoriaus plokštelės išgaravusį tirpiklį pašalina iš vakuuminės kameros, paversdamos jį vėl kietu. Taip užbaigiamas atskyrimo procesas.

Liofilizacijos privalumai:

1) Vanduo pašalinimas iš žaliavos nenaudojant aukštos temperatūros, todėl išsagomos vertingos medžiagos.

2) Sausoje būsenoje termolabilių medžiagų tinkamumo laikas prailgėja. 3) Liofilizuoti maisto produktai yra žymiai lengvesni lyginant su šviežiais.

Liofilizacijos trūkumai:

1) Liofilizacijos procese naudojamas vakuumas gali pašalinti lakiuosius junginius. 2) Metodui reikia įrangos, kuri yra brangi.

3) Sąlyginai sudėtingas procesas.

1.7.2 Žaliavų paruošimas šaldant

Žaliavų šaldymas yra vienas paprasčiausių ir geriausių produkto paruošos būų. Šis metodas sudaro sąlygas pakankamai ilgai išsaugoti šaldomų produktų spalvą, skonį, kvapą bei maistinę vertę. Šaldymo metodu gali naudotis kiekvienas žmogus, nes jis yra nesudėtingas ir nereikalauja brangos įrangos. Nepaisant to, yra keletas aspektų, į kurios reikėtų atsižvelgti, siekiant kokybiškai pasiruošti norimą produktą [68].

Tinkamas žaliavos paruošimas prieš šaldant

Aspektai į kurios reiškia atsižvelgti prieš užšaldant žaliavą:

1) Laikas tarp žaliavos surinkimo ir užšaldymo. Surinkus vaisius arba daržoves, žaliavoje vykstančios biocheminės reakcijos nesustoja. Vykdamos toliau, jos keičia žaliavų kokybę, dažnai ją blogindamos. Dėl šių priežasčių, nuskynus vaisius ar daržoves, reiktų kuo skubiau šaldyti.

2) Fermentų inaktyvavimas (peroksidazė, katalazė, lipoksigenazė). Vykstančios fermentinės reakcijos užšaldytoje žaliavoje taip pat gali ženklai pabloginti žaliavų kokybę. Dažniausiai fermentų inaktyvavimas vaisiuose ir daržovėse vykdomas juos blanširuojant t.y apdorojant karštu vandeniu arba garais [68].

Optimalių šaldymo sąlygų parinkimas:

Procesas, kuomet žaliavoje esantis vanduo kristalizuojasi į ledą, yra svarbiausias aspektas kalbant apie šį žaliavų paruošos būdą. Kristalizacija susideda iš dviejų veiksnių: branduolio susidarymo ir kristalų augimo. Pirmajame kritalizacijos etame, besiformuojantis branduolys žymi vietas, kuriose išaugs ledo kristalai. Susiformavus branduoliui, pradeda augti kristalai. Kristalų augimui turi įtakos šie veiksniai: šilumos pašalinimo greitis, aušinimo terpės temperatūra, difuzija bei klampos pokytis, priklausomai nuo temperatūros. Susidaręs branduolių ir kristalų kiekis žaliavoje turi įtakos šaldytų maisto produktų galutinei kokybei. Lėto užšaldymo metu, tarpląsteliniame skystyje susidaro sąlygini dideli kristalai, kurie daro žalą augaliniam audiniui. Žalingas kristalų susidarymo poveikis yra siejamas su kristalų augimu, ląstelėse viduje esančio vandens sąskaita. Kai vidinėse ir išorinėse ląstelių vietose susidaro nedideli ledo kristalai, žala kokybei sumažėja iki minimumo.

Procesai vykstantys šaldytoje žaliavoje

Šaldymo privalumai:

1) Pigus, nesudėtingas ir greitas metodas.

2) Šaldytoje žaliavoje stabdomas mikrobų augimas, todėl šiuo būdų paruošta žaliava gali ilgiau išsilaikyti.

Šaldymo trūkumai:

1) Veikliųjų medžiagų nuostoliai šaldymo metu ir atitirpinant žaliavą.

2) Veikiant žaliavą šalčiu, galima pažeisti jos paviršių (nudeginti), dėl to pasikeičia žaliavos tekstūra ir skonis

1.7.3 Temperatūros įtaka žaliavų paruošimui

Žaliavų džiovinimas yra vienas paprasčiausių ir seniausių maisto paruošos būdų. Pagrindinis šio paruošos būdo tikslas yra sumažinti žaliavoje esančią drėgmę iki tokio lygio, kad pastarąją būtų galima saugiai laikyti ilgesnį laiką. Džiovinamoje žaliavoje vandens kiekis mažėja palaipsniui iki tokios ribos, kurią pasiekus, susidaro nepalankios sąlygos vystytis, augti ir daugintis mikroorganizmams.

Norint žaliavą džiovinti kambario temperatūroje reikia nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotos ir gerai vėdinamos vietos. Džiovinimas kambario temperatūroje užtrunka bene ilgiausiai, nes šiam džiovinimo metodui nenaudojami jokie papildomi šilumos šaltiniai. Džiovinimas kambario temperatūroje yra pranašesnis lyginant su džiovinimu aukštoje temperatūroje. Esant aukštai temperatūrai gali suskilti fitocheminiai junginiai, todėl veikliųjų medžiagų išeiga taip paruoštose žaliavose bus mažesnė [69].

Džiovinimo privalumai:

1) Nesudėtingas, pigus, brangios įrangos nereikalaujantis metodas. 2) Nereikia ypatingų sąlygų paruoštai žaliavai sandeliuoti.

Džiovinimo trūkumai:

2. TYRIMŲ METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – bruknių vaisiai. Darbe tiriami Žaliosios girios miške (55° 51′ 0″ N, 24° 30′ 0″ E 55.85°, 24.5° (WGS)), natūralioje augavietėje rinkti bruknių vaisiai. Žaliosios girios miškas driekiasi Pasvalio ir Panevėžio savivaldybių teritorijose. Šiame miške vyrauja spygliuočių medžiai ir beržai, taigi tai ,iš tiesų, patvirtina literatūroje pateiktą informaciją, jog bruknių vaisiai geriausiai dera apysausiuose spygliuočių miškuose, beržynuose ir aukštapelkėse. Tyrimams žaliava buvo paruošta keturiais skirtingais būdais: bruknės buvo natūraliai džiovinamos kambario temperatūroje (18±1°C) , 55°C temperatūroje, bei šaldytos ir liofilizuotos. Bruknių vaisiai buvo rinkti 2020m. rugpjūčio mėn. 28d.

4 pav. Bruknių vaisių rinkimo vieta - Žaliosios girios miškas

2.2 Tyriamojo laikotarpio meteorologinės salygos

2.3 Naudoti reagentai ir medžiagos

Bendrieji reagentai: Distiliuotas vanduo, retifikuotas etilo alkoholis 96 proc. V/V;

Fenolinių junginių kiekio spektrofotometriniu metodu nustatymui: natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija), Folin-Ciocalteu reagentas (,,Sigma Aldrich“, St. Louis, JAV), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma Aldrich“, St. Louis, JAV);

Bendro procianidinų kiekio spektrofotometriniu metodu nustatymui: vandenilio chlorido rūgštis („Sigma Aldrich, Vokietija), 4-dimetilaminocinamaldehidas („Sigma Aldrich“, Vokietija), epikatechinas („Sigma Aldrich“, Vokietija);

Antioksidantinio aktyvumo nustatymui ABTS metodu: ABTS (2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin)-6-sulfoninė rūgštis) (,,Alfa Aesar, JAV),,kalio persulfatas („Alfa Aesar GmbH & Co“, Vokietija), 6-hidroksi2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karbokslinės rūgšties standartas - troloksas (,,Sigma Aldrich“ St. Louis, JAV;

Redukcinio aktyvumo nustatymui FRAP metodu: geležies (III) chlorido heksahidratas („Sigma Aldrich“, Vokietija), natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija), ledinė acto rūgštis, TPTZ (2,4,6-tripiridils-triazinas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma Aldrich, Vokietija), 6-hidroksi2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karbokslinės rūgšties standartas - troloksas (,,Sigma Aldrich“ St. Louis, JAV;

2.4 Naudota aparatūra ir darbo priemonės

Žaliavos smulkinimui naudotas elektrinis malūnėlis (Coffee grinder, “First”, Austrija), svėrimams - analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija), ekstrakcijai - ultragarsinė vonelė („Bandelin Sonorex Digital 10 P“, Vokietija), skysčių maišymui - mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija), mažiems skysčio tūrio matavimams- mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV), biologiškai aktyvių junginių kiekio nustatymui - spektrofotometras („CamSpec – M550“, Jungtinė Karalystė), nuodžiūviui matuoti – drėgmės matavimo aparatas „Presica HA 300”.

2.5 Nuodžiūvio nustatymas skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių

žaliavose

visą jos plotą plonu sluoksniu. Po to, lėkštelė buvo talpinama į aparatą žaliavoje esančiai drėgmei pamatuoti. Sausa žaliavos masė buvo apskaičiuojama remiantis šiomis formulėmis:

Nuodžiūvio apskaičiavimas: 𝑋𝑋0 =A x B₁₀₀ ; g

A – nuodžiūvis (procentais) B – atverta žaliavos masė (g)

Žaliavos nuodžiūvis buvo matuojamas tris kartus ir galutinis rezultatas apskaičiuojamas kaip trijų matavimų aritmetinis vidurkis.

Sausos žaliavos masės apskaičiavimas: 𝑋𝑋1 = 𝐵𝐵 − 𝑋𝑋0; g

B - atverta žaliavos masė (g) 𝑋𝑋0 - nuodžiūvis

1 lentelė. Skirtingais būdais paruoštų bruknių vaisių 1gramo žaliavos sausa masė

1. Džiovinti vaisiai kambario temperatūroje 0,9200 g 2. Džiovinti vaisiai 55 °C temperatūroje 0,9424 g

3. Šaldyti vaisiai 0,137 g

4. Liofilizuoti vaisiai 0,9175 g

2.6 Tyriamųjų mėginių paruošimas

Žaliavos paruošimas

2 lentelė. Bruknių žaliavos paruošimo būdai ir ypatybės

Žaliavos paruošimo būdas Žaliavos paruošimo sąlygos

saulės spindulių apsaugotoje) vietoje.

2) Džiovinti vaisiai 55 °C temperatūroje Bruknių vaisiai buvo džiovinami spec. vaisių džiovyklėje, kurioje pastovi temperatūra buvo 55 °C. Vaisiai šioje džiovyklėje buvo

džiovinamos 6 paras. Paruošta žaliava buvo perkeliama į sandarų indą ir laikoma sausoje, tamsioje (nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje) vietoje.

3) Šaldyti vaisiai Bruknių vaisiai buvo šaldomi šaldiklyje, kuriame pastovi temperatūra buvo -18 °C. Paruošta žaliava iki pat tyrimo pradžios buvo laikoma tame pačiame šaldiklyje, sandariame inde.

4) Liofilizuoti vaisiai Kadangi bruknių vaisius dengia stora luobelė, prieš liofilizuojant jos buvo sutrinamos

grūstuvėje. Susmulkinti vaisiai buvo talpinami į šaldiklį, kuriame buvo įrengta oro cirkuliarija ir jame temperatūra siekė -35 °C. Šaldiklyje vaisiai buvo laikomi vieną parą. Vėliau jiė buvo

perkeliami į sublimacinę džiovyklą, kurioje buvo palaikomas 0,05 mba slėgis ir -50 °C kondensatoriaus temperatūra. Pirmas 24h buvo liofilizuojama esant -20 °C temperatūrai, kitas 12h esant -5 °C temperatūrai ir paskutines 12h esant -1 °C temperatūrai.

Jau paruošta žaliava buvo perkeliama į sandarų indą ir laikoma, sausoje, tamsioje (nuo

tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje) vietoje.

Ekstraktų paruošimas

nustatyta, jog šios koncentracijos etanolis užtikrina didžiausią suminę biologiškai aktyvių junginių išeigą. Norint paruošti 100 ml 70 proc. V/V etanolio iš 96 proc. V/V etanolio, naudojama 70 ml 96 proc. V/V etanolio ir 30 ml distiliuoto vandens, kurie yra sumaišomi tarpusavyje. Kadangi žaliavos ir etanolio santykis yra 1:10 ekstraktų paruošimui atveriama 2g (±0,01 tikslumu) augalinės žaliavos, atsverta žaliava perkeliama į 25 ml talpos rudo stiklo buteliukus ir užpilama 20ml (±0,01 tikslumu) 70 proc. V/V etanoliu. Atlikus šiuos veiksmus, rudo stiklo buteliukai perkeliami į ultragarso vonelę ir ekstrahuojami joje 15 minučių.

Gauti ekstraktai filtruojami per sudrėkintą popierinį filtrą. Filtruoti ekstraktai perkeliami į švarius rudo stiklo buteliukus, yra sandariai uždaromi ir laikomi kambario temperatūroje, tamsioje (nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.

2.7 Tyrimo metodai

2.7.1 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu

metodu

Norint nustatyti bendrą fenolinių juginių kiekį bruknių vaisių uogose, remiamės kalorimetriniu Folin - Ciocalteu metodu. Folin - Ciocalteu metodas plačiai naudojamas laboratorijoje, kadangi jis yra nesudėtingas, efektyvus, greitas bei nebrangus. Šio metodo principas: bruknių vaisiuose esantys fenoliniai junginiai reaguoja su specifiniu Folin – Ciocalteu reagentu sudarydami mėlynos spalvos kompleksą, kurį kiekybiškai galima įvertinti pasitelkus spektrofotometriją.

Atliekant šį metoda, pirmiausia pasiruošiamas darbinis Folin - Ciocalteu reagentas. Jis gaunamas motininį Folin - Ciocalteu reagentą 10 kartų praskiedus distiliuotu vandeniu. Gamybai imama viena dalis motininio Folin - Ciocalteu reagento ir devynios dalys distiliuoto vandens (pvz. norint paruošti 10 ml darbinio Folin - Ciocalteu reagento, imama 1ml motininio Folin- Ciocalteu reagento ir 9 ml distiliuoto vandens).

Pasigaminus darbinį Folin - Ciocalteu reagentą, pasiruošiamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas. Norint paruošti 100 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo, atsisveriama 7,5 g natrio karbonato, kuris tirpinamas matavimo kolbutėje distiliuotu vandeniu iki 100 ml žymės.

palyginamasis tirpalą. Paliginamasis tirpalas ruošiamas 1 ml 70proc. V/V etanolio sumaišius su 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu ir 5 ml darbiniu Folin – Ciocalteu reagentu.

Gautų mišinių absorbcija matuojama spektrofotometru prie 765 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.

Bendras fenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais vienam gramui žaliavos ir apskaičiuojamas remiantis šia formule:

𝑮𝑮𝑮𝑮𝑮𝑮 =𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪_{𝒎𝒎 ; 𝒎𝒎𝒎𝒎/𝒎𝒎}

C- galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);

m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g) a -skiedimo faktorius

Bendras fenolinių junginių kiekis yra vertinamas lyginant gautus absorbcijos dydžius pagal etalono galo rūgšties kalibracinę kreivę. Duomenys yra įvertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį. Tam, kad sudarytume galo rūgšties kalibracinę kreivę, paruošiame skirtingos koncentracijos standartinius etaloninius galo rūgšties tirpalus (0,0125 mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,075 mg/ml; 0,1 mg/ml). Pirmiausia paruošiamas didžiausios koncentracijos etaloninis galo rūgšties tirpalas, vėliau jis skiedžiamas ir gaunami reikiami mažesnės koncentracijos tirpalai [71].

4 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

y = 9,1141x + 0,0047 R² = 0,9993 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Abso rbc ijo s dy di s

2.7.2 Suminio procianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Suminis procianidinų kiekis bruknių vaisiuose yra nustatomas naudojant 4– dimetilaminocinamaldehido tirpalą (DMAC) tirpalą parūgštintą vandenilio chlorido rūgštimi.

Atliekant bendrą procianidinų kiekio nustatymą, pirmiausia paruošiama parūgštintas etanolis. Norint paruošti 100ml parūgštinto etanolio, naudojama 75ml 93 proc. etanolis, kuris sumaišomas su 12,5 ml koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties 36 proc. ir 12,5 ml distiliuoto vandens.

Paruošus parūgštintą etanolį, gaminamas 0,1 proc. DMAC reagentas. Norint pagaminti 100 ml šio reagento, 100 ml parūgštinto etanolio ištirpinama 0,1g DMAC miltelių. Pagamintas DMAC reagentas yra jautrus šviesai, todėl jį pagaminus reikia iš karto sunaudoti.

Pagaminus parūgštintą etanolį ir DMAC reagentą, gaminami tiriamieji tirpalai. Tiriamieji tirpalai ruošiami tarpusavyje maišant 20 μl bruknių vaisių ekstrakto ir 2 ml 0,1 proc., DMAC reagento. Jau pagaminti tiriamieji tirpalai 15 minučių laikomi kambario temperatūroje. Galiausiai gaminamas palyginamasis tirpalas, kuris ruošiamas tarpusavyje maišant 20 μl distiliuoto vandens ir 2 ml 0,1 proc., DMAC reagento.

Tirpalų absorbcija matuojama spektrofotometru prie 640 nm bangos ilgio. Suminis procianidinų kiekis yra išreiškiamas epikatechino ekvivalentais vienam gramui žaliavos ir apskaičiuojamas remiantis šia formule:

𝑮𝑮𝑮𝑮 =𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪𝑪_{𝒎𝒎 ; 𝒎𝒎𝒎𝒎/𝒎𝒎}

C- epikatechino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);

m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g) a -skiedimo faktorius

epikatechino tirpalai. Jie ruošiami tarpusavyje maišant 2 ml 0,1 proc. DMAC reagento su 20 μl minėtų koncentracijų tirpalais. Išmatavus šių tirpalų absorbciją, sudaroma kalibracinė epkatechino kreivė [72]:

5 pav. Epikatechino kalibracinė kreivė

2.7.3 Suminio antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Nustatinėjant suminį antocianinių kiekį spektrofotometriniu metodu, pirmiausia paruošiami etanoliniai bruknių vaisių ekstraktai santykiu 1:20. Norint paruošti etanolinius bruknių vaisių ekstraktus nurodytu santykiu reikia atverti 1 g susmulkintos augalinės žaliavos ir užpilti 20 ml 70 proc. etanoliu, kuris yra parūgštintas 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Paruoštas ekstraktas ekstrahuojamas purtyklėje 15 minučių. Gauti ekstraktai filtruojami pasitelkiant piltuvėlį ir sudrėkintą popierinį filtrą. Perfiltruoti ekstraktai išpilstomi į tamsaus stiklo buteliukus.

Analizei imama 1 ml paruošto ekstrakto, kuris yra praskiedžiamas 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi parūgštintu etanoliu 50 ml matavimo kolboje iki 50 ml žymės. Kaip palyginamąjį tirpalą naudojame 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštį etanolyje. Norint paruošti 100 ml tokio tirpalo, 100 ml etanolio sumaišomas su 0,1 ml 36 proc. koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi. Išmatuojama paruoštų tirpalų absorbcija spektrofotometru prie 528 nm bangos ilgio [73].

Rezultatai apskaičiuojami remiantis šia formule:

𝑿𝑿 =𝑨𝑨𝑪𝑪𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏_{𝟕𝟕𝟏𝟏𝟕𝟕𝑪𝑪𝒎𝒎}

718 – cianidin – 3 gliukozido absorbcija prie 528 nm bangos ilgio;

A – absorbcija prie 528 nm bangos ilgio; m – žaliavos masė gramais;

2.7.4 Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

Remiantis ABTS metodu, galima nustatyti bruknių vaisių antioksidantinę gebą . Šio metodo esmė: 2,2‘–azinodi [3–etilbenztiazolino]–6–sulfoninės rūgšties (ABTS) laisvųjų radikalų - katijonų surišimas.

Nustatinėjant antioksidantinę gebą ABTS metodu, pirmiausia reikia paruošti ABTS tirpalą. Jis ruošiamas 50 ml distiliuoto vandens ištirpinus 0,0548 g 2,2‘–azinodi [3–etilbenztiazolino]–6– sulfoninės rūgšties (ABTS) miltelių ir 0,0095 g kalio persulfato. Paruoštas tirpalas perkeliamas į tamsaus stiklo buteliuką ir laikomas tamsoje 16 valandų kambario temperatūroje.

Praėjus nurodytam laiko tarpui iš paruošto tirpalo gaminamas darbinis ABTS tirpalas. Jis ruošiamas šiuo principu: paruoštą tirpalą reikia skiesti tol, kol šio tirpalo absorbcija matuojant spektrofotometru prie 734 nm ilgio bangos bus lygi 0,800 (±0,003). Kaip palyginamasis tirpalas čia naudojamas distiliuotas vanduo.

Paruošus darbinį ABTS tirpalą, ruošiami tiriamieji tirpalai. Tiriamieji tirpalai gaunami tarpusavyje sumaišius 20 µl tiriamojo ekstrakto ir 3 ml darbinio ABTS tirpalo. Paruošti tiriamieji tirpalai 1 valandą laikomi tamioje vietoje. Praėjus vienai valandai, spektrofotometru išmatuojami tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydžiai prie 734 nm bangos ilgio.

Antioksidantinė geba yra nustatoma remiantis šia formule:

𝑻𝑻𝑻𝑻 =_{𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝒄𝒄𝟏𝟏 , µ𝟏𝟏𝒎𝒎𝒎𝒎/𝒈𝒈}𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄

c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (µmol/l); V – paruošto ekstrakto tūris, ml;

y = 0.0002x + 0.023 R² = 0.9982 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Abso rbc ijo s po ky tis

Trolokso koncentracija, µmol/l

Sudaroma standartinė trolokso kalibracinė kreivė. Paruošiami (200µmol/l; 400µmol/l ; 800µmol/l; 1200µmol/l; 1600µmol/l) koncentracijų trolokso tirpalai. Pirmiausia pagaminamas didžiausios koncentracijos trolokso tirpalas, o tuomet skiedžiant jį, gaunami reikiami mažesnės kocentracijos tirpalai. Pagaminus šiuos žinomos koncentracijos tirpalus imama 20 µl šių tirpalų ir sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS tirpalo. Spektrofotometru išmatuojami gautų tirpalų absorbcijos dydžiai prie 734 nm bangos ilgio. Pamatavus absorbcijos dydžius, sudaroma trolokso kalibracinė kreivė [74]:

6 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

2.7.5 Redukcininės gebos nustatymas FRAP metodu

Bruknių vaisių ekstraktų redukcinė geba nustatoma remiatis FRAP metodu.

Norint šiuo metodu nustatyti bruknių vaisių ekstraktų redukcinį aktyvumą, pirmiausia reikia pasiruošti darbinį FRAP reagentą. Darbinis FRAP reagentas ruošiamas santykiu 10:1:1 sumaišius acetatinį buferį, TPTZ tirpalą bei geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą. Taigi, norint pagaminti 100 ml darbinio FRAP reagento, reikia 10 dalių acetatinio buferio, 1 dalies TPTZ tirpalo ir 1 dalies geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo.

TPTZ tirpalo paruošimas: atmatuojama 50 ml distiliuoto vandens, į jį pilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties ir 0,1562 g TPTZ miltelių. Tirpalas gerai išmaišomas. Gaunama 10 mM TPTZ tirpalo.

Geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo paruošimas: 50 ml distiliuoto vandens tirpinama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato. Tirpalas gerai išmaišomas. Gaunamas 20 nM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.

Pagaminus šiuos tirpalus, jie sumaišomi reikiamomis proporcijomis ir gaunamas darbinis FRAP tirpalas. Atlikus šiuos veiksmus, gaminami tiriamieji tirpalai. Tiriamieji tirpalai ruošiami tarpusavyje sumaišius 20 μl tiriamojo bruknių vaisių ekstrakto ir 3 ml darbinio FRAP tirpalo. Palyginamasis tirpalas ruošiamas tarpusavyje sumaišius 20 μl 70 proc. V/V etanolio ir 3 ml darbinio FRAP tirpalo. Gauti tirpalai vieną valandą laikomi tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po to išmatuojama šių tirpalų absorbcija spektrofotometru prie 593 nm bangos ilgio. Gauti duomenys lyginami su kalibracine trolokso standartinių tirpalų kreive.

Tirpalų redukcinė geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (µmol TE/g) ir apskaičiuojama remiantis šia formule:

𝑻𝑻𝑻𝑻𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭 =_{𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝒄𝒄𝟏𝟏 ; µ𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦𝐦/𝐠𝐠}𝑪𝑪𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄𝒄

c – trolokso koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (µmol/l); V – ekstrakto tūris ml;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g; a -skiedimo faktorius;

7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

2.7.6 Tyrimo duomenų analizė

Tyrimo metu gautų duomenų analizė buvo atliekama naudojantis šiomis programomis: „SPSS Statistics 27“ („IBM“, JAV) bei „Microsoft Office Excel 2013“(Microsoft, JAV). Visi bandymai buvo kartojami tris kartus ir buvo vedami šių pakartojimų aritmetiniai vidurkiai bei apskaičiuoti standartiniai nuokrypiai. Ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi (p<0,05), vertiname pasitelkiant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA.

y = 0,0007x + 0,0495 R² = 0,9971 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Abso rbc ijo s dy di s

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Biologiškai aktyvių junginių kiekinės sudėties nustatymas skirtingais

būdais paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose

3.1.1 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingais būdais

paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose

Ištyrus skirtingais būdais paruoštus bruknių vaisių mėginius buvo nustatyta, jog suminis fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 6,75±0,04 mg/g iki 42,11±0,15 mg/g priklausomai nuo

žaliavos paruošos būdo. Gauti rezultatai tarpusyje statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,005). Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas šaldytų bruknių vaisių mėginiuose – 42,11±0,15 mg/g. Suminis fenolinių junginių kiekis šaldytuose bruknių vaisiuose buvo net 6,45 karto didesnis palyginus su 55 °C temperatūroje džiovintuose bruknių vaisiuose. Juose suminis fenolinių junginių kiekis siekė vos 6,75±0,04 mg/g. Kambario temperatūroje džiovintuose bruknių vaisiuose bendras fenolinių junginių kiekis buvo 13,37±0,06 mg/g, o liofilizuotose bruknėse 27,19±0,08 mg/g. Kadangi vaisiai visiems ėminiams buvo rinkti vienu metu, iš tos pačios augavietės, galime daryti prielaidą, jog žaliavos paruošos būdas turi itin didelę įtaką veikliųjų medžiagų kiekiui. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingai paruošose bruknių vaisių žaliavose puikiai atsispindi 8 paveiksle:

8 pav. Suminis fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių ėminiuose 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Džiovinti vaisiai kambario temperatūroje

Šaldyti vaisiai Liofilizuoti vaisiai Džiovinti vaisiai 55 °C

temperatūroje GRE , m g/ g Paruošos būdas

Lenkijos mokslinikai atliko tyrimą, kurio metu remiantis kalorimetriniu Folin - Ciocalteu metodu buvo nustatinėjmas suminis fenolinių junginių kiekis šaltai laikomuose, šaldytuose ir liofilizuotuose bruknių vaisiuose. Tyrimo rezultatai taip pat buvo išreiškiami sausai žaliavai. Nustatyta, jog suminis fenolinių junginių kiekis šaldytoje bruknių vaisių žaliavoje siekė 52,83±0,88 mg/g, o liofilizuotoje 24,28±1,49 mg/g. Lyginant su šviežia žaliava, suminis fenolinių junginių kiekis šaldytuose vaisiuose padidėjo 1,3 karto, o liofilizuotose vaisiuose sumažėjo net 2,18 karto [67].

Rumunijos mokslininkų atliktame tyrime, kuriame analizei jie naudojo užšaldytus bruknių vaisius, buvo taip pat nustatinėjamas suminis fenolinių junginių kiekis užšaldytą žaliavą laikant 1,3 ir 6 mėnesius. Buvo nustatyta tendencija, jog suminis fenolinių junginių kiekis laikui bėgant šaldytoje žaliavoje mažėja, tačiau neženkliai. Praėjus vienam mėnesiui suminis fenolinių junginių kiekis buvo 58±0,1 mg/g, po 3 mėnesių 55±0,88 mg/g, o praėjus šešiems mėnesiams 54±0,12 mg/g [68].

Latvijos mokslininkai taip pat atliko tyrimą, kuriame jie remadamiesi tuo pačiu kalorimetriniu Folin – Ciocalteu metodu nustatinėjo suminį fenolinių junginių kiekį bruknių vaisių sultyse. Žaliavą pastarieji pasiruošė šiais būdais – liofilizavo bei džiovino skirtingose temperatūrose 40, 60 bei 80 °C laipsniuose. Iš pradžių žaliava buvo užšaldyta –20±2 °C temperatūroje, vėliau atšildyta ir paruošta skirtingais metodais. Kaip kontrolinė grupė buvo naudojami atšildyti bruknių vaisiai. Buvo nustatyta, jog suminis fenolinių junginių kiekis atšaldytuose bruknių vaisiuose siekė 681,54mg/g, liofilizuotuose vaisiuose 122,3mg/g, 40°C laipsnių džiovintuose 132,60 mg/g, 60 °C džiovintuose 122,4 mg/g bei 80 °C džiovintose 139,6mg/g [4]. Remiantis šio tyrimo duomenimis, nėra tiesioginio ryšio tarp žaliavos apdorojimo temperatūros ir suminio fenolinių junginių kiekio .

Šių mokslininkų gauti suminiai fenolinių junginių kiekiai buvo didesni už šiame tyrime gautus rezultatus, ypač Latvijos mokslininkų atliktame darbe. Didesnį suminį fenolinių junginių kiekį šių mokslininkų darbuose galėjo lemti daugybe veiksnių, tokių kaip skirtingas žaliavos rinkimo geografinis faktorius, vegetacijos fazė, skirtingas augalo genotipas bei amžius, skirtingos klimato sąlygos ir kt.

3.1.2 Suminio procianidinų kiekio nustatymas skirtingais būdais

paruoštuose bruknių vaisių ėminiuose

Ištyrus skirtingais būdais paruoštų bruknių vaisių mėginius, buvo nustatyta kad procianidinų kiekis mėginiuose kito nuo 2,76±0,13 mg/g iki 11,48±0,37 mg/g. Gauti rezultatai statistiškai

temperatūroje džiovintuose bruknių vaisiuose – 4,21±0,08 mg/g. Liofilizuotose bruknių vaisiuose bendras procianidinų kiekis siekė 7,23±0,10 mg/g. Procianidinų kiekio įvairavimas pateiktas 9 paveiksle:

9pav. Suminis proocianidinų kiekio įvairavimas skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių ėminiuose

Buvo atliktas mokslinis tyrimas, kuriame buvo nustatinėjamas procianidinų kiekio įvairavimas liofilizuotų bruknių vaisių žaliavoje. Rūgpjūčio mėnesį rinktuose bruknių vaisiuose, kurie vėliau tyrimui buvo liofilizuoti, suminis procianidinų kiekis buvo 9,04±0,41 mg/g. Lyginant rezultatus, matoma, jog procianidinų kiekis šiame darbe buvo 1,2 karto mažesnis [79]. Kiek mažesnį procianidinų kiekį šiame tyrime galėjo lemti skirtingas žaliavos rinkimo geografinis faktorius, oro sąlygos, augalo genotipas bei amžius.

Procianidinai pasižymi antioksidantinėmis, priešvėžinėmis, imunostimuliuojančiomis, antibakterinėmis bei antivirusinėmis savybėmis. Siekiant gauti didžiausią procianidinų kiekį iš bruknių vaisių, reiktų pastaruosius šaldyti. Tai nesudėtingas, pigus, brangios įrangos nereikalaujantis paruošos metodas [80].

0 2 4 6 8 10 12 14

Paruošos būdas

EE, mg/g

Suminis procianidinų kiekis

Džiovinti vaisiai 55 °C temperatūroje Liofilizuoti vaisiai

3.1.3 Antocianinų kiekio nustatymas skirtingais būdais paruoštuose bruknių vaisių

ėminiuose

Atlikus antocianinų kiekio nustatymą skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių ėminiuose buvo nustatyta, jog didžiausias antocianinų kiekis aptiktas šaldytuose bruknių vaisiuose. Jis siekė 1,74±0,04 mg/g. Kiek mažesnis antocianinų kiekis buvo liofilizuotose bruknių vaisiuose 1,33±0,01 mg/g. Mažiausios antocianinų išeigos buvo nustatytos kambario temperatūroje ir 55 °C temperatūroje džiovintuose bruknių vaisių ėminiuose - 0,33±0,01 mg/g ir 0,62±0,01 mg/g. Antocianinų kiekio įvairavimas pateikimas 11 paveikslėlyje:

11pav. Antocianinų kiekio įvairavimas skirtingais būdais paruoštose bruknių vaisių mėginiuose

Lenkijos mokslininkų atliktame tyrime, kuriame remiantis pH diferenciniu metodu buvo nustatinėjami antocianinai šaltai laikomuose, šaldytuose bei liofiliztuotuose bruknių vaisiuose, buvo nustatyta, jog šaltai laikomuose bruknių vaisuose antocininų kiekis buvo 4,89±2,81 mg/g, šaldytuose vaisiuose 5,49±3,70 mg/g, o liofiliztuotuose 1,51±0,21 mg/g. Gauti mokslinikų rezultatai buvo išreiškiami sausai žaliavai [77].

Latvijos mokslininkai taip pat nustatinėjo antocianinų kiekį skirtingai paruoštuose bruknių vaisių žaliavose. Buvo nustatyta, jog šaldytose, vėliau atitirpintose bruknių sultyse antocianinų kiekis buvo 5,66±2,44 mg/g, liofilizuotuose vaisiuose 3,96±0,34 mg/g, 40°C temperatūroje džiovintuose vaisiuose 3,87±0,50 mg/g, 60 °C temperatūroje džiovintuose vaisiuose 3,43±1,45 mg/g bei 80 °C temperatūroje džiovintuose vaisiuose 3,06±1,83 mg/g. Remiantis šio tyrimo duomenimis, galima

įžvelgti dėsningumą antocianinų kiekio įvairavime skirtingose temperatūrose apdorotuose bruknių vaisių sultyse. Didinant temperatūrą, žaliavoje nuosekliai mažėjo antocianinų kiekis. Šis tyrimas praktiškai patvirtina teiginį, jog antocianinai yra termolabilūs junginiai, t.y jautrūs temperatūros pokyčiams[4].

Kinijos mokslininkų atliktame tyrime antocianinų kiekis liofilizuotuose bruknių vaisiuose įvairavo nuo3,44 mg/g iki 3,57 mg/g sausos žaliavos [78].

Dar viename tyrime, kurį atliko Drozdž P. ir kiti mokslininkai, galime pastebėti, jog liofilizuotuose bruknių vaisiuose antocianinų kiekis įvairavo nuo 0,26±0,01 mg/g iki 0,43±0,29 mg/g. Pasak, šį tyrimą atlikusių mokslininkų, tokius tyrimo rezultatus galėjo įtakoti toksiški elementai, tokie kaip švinas ir kadmis [79].

Latvijos, Lenkijos ir Kinijos mokslininkų atliktuose tyrimuose antocianinų kiekiai lyginant su šiame darbe gautais rezultatais buvo didesni. Didesni kiekiai galėjo būti dėl skirtingų antocianinų nustatymo metodų pasirinkimo, skirtingo žaliavos rinkimo geografinio faktoriaus, vegetacijos fazes, vaisių genotipo ir kt.

3.1.4 Antioksidantinės gebos įvertinimas ABTS metodu skirtingais būdais

paruoštuose bruknių vaisių ėmininiuose

10 pav. Antioksidantinės gebos įvairavimas skirtingai paruoštose bruknių vaisių ėminiuose

Antioksidantinė geba atspindi antioksidantinį aktyvumą. Kuo didesnė antioksidantinė geba, tuo žaliava pasižymi didesniu antioksidantiniu poveikiu. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, didžiausiu antioksidantine geba pasižymi šaldyti bruknių vaisiai. Kadangi antioksidantinis aktyvumas skirtingai paruoštose bruknių vaisių žaliavose statistiškai reikšmingai skyrėsi, tai rodo, jog žaliavos paruošos būdas, išties, turi įtakos šiam rodikliui.

Atliktame moksliniame darbe, kuriame taip pat matuojama antioksidantinė geba liofilizuotuose bruknių vaisiuose, rinktuose skirtingose cenopopuliacijose buvo nustatyta, jog antioksidantinė geba svyravo nuo 1544,10±57,10 µmol/g iki 2354,72±119,79 µmol/g. Šiame moksliniame tyrime, liofilizuotų bruknių vaisuose nustatyta antioksidantinė geba buvo 1937,35±0,62 µmol/g. [79].

3.1.5 Redukcinės gebos įvertinimas FRAP metodu skirtingais būdais

paruoštuose bruknių vaisių ėmininiuose

Remiantis tyrimo metu gautais duomenimis, redukcinė geba skirtingai paruoštose bruknių vaisių ėminiuose vyravo nuo 164,5±0, 08 µmol/g iki 840,9±0,75 µmol/g. Gauti rezultatai statistiškai reikšmingai skyrėsi tarpusavyje (p<0,05). Didžiausia redukcine geba pasižymėjo šaldyti bruknių vaisiai. Juose redukcinė geba buvo 840,9±0,75 µmol/g. Mažiausia redukcine geba pasižymėjo 55 °C temperatūroje džiovinti bruknių vaisiai - 164,5±0, 08 µmol/g. Kiek didesnė redukcinė geba nustatyta

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Paruošos būdas TE , µ m ol/ g

Antioksidantinės gebos įvertinimas remiantis ABTS

metodu

Džiovinti vaisiai kambario temperatūroje