ŠERMUKŠNIŲ ŢIEVĖS IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VAIDA MAZŪRAITĖ

ŠERMUKŠNIŲ ŢIEVĖS IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ

SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

ŠERMUKŠNIŲ ŢIEVĖS IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

Recenzentas: Darbą atliko Prof. Liudas Ivanauskas Magistrantė

Vaida Mazūraitė

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

2. ĮVADAS ... 8

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9

4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10

4.1. Paprastųjų ir švedinių šermukšnių apibūdinimas, morfologiniai poţymiai ir paplitimas ... 10

4.2. Šermukšnių augalinių ţaliavų ţievės ir vaisių kokybinė ir kiekinė sudėtis ... 12

4.3. Šermukšnių vaisių ir ţievės fenolinių junginių kokybinis ir kiekinis įvertinimas ... 13

4.4. Šermukšnių vaisių ir ţievės fenolinių junginių poveikis organizmui ... 16

4.5. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 18

5. TYRIMO METODIKA ... 19 5.1. Tyrimo objektas ... 19 5.2. Naudoti reagentai ... 19 5.3. Naudota aparatūra ... 19 5.4. Tyrimo metodai ... 20 5.4.1. Ţaliavos paruošimas ... 20

5.4.2. Šermukšnių vaisių ir ţievės ekstraktų paruošimas ... 20

5.4.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. ... 20

5.4.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 21

5.4.5. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu... ... 22

5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu FRAP metodu ... 22

5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu ABTS metodu ... 23

5.4.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu DPPH metodu ... 24

5.4.9. Fenolinių junginių kokybinis ir kiekinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 25

5.5. Duomenų analizė ... 25

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

6.1. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių fenolinių junginių kiekio įvairavimo tyrimas spektrofotometriniu metodu ... 26

6.1.2. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių ţievės ėminių

ekstraktuose ... 28

6.1.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas šermukšnių ţievės ir vaisių ėminiuose ... 28

6.2. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu ... 30

6.2.1. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 30

6.2.2. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu... ... 32

6.2.3. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu... ... 33

6.3. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas šermukšnių vaisių ir ţievės ėminiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 35

7. IŠVADOS ... 40

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 42

SANTRAUKA

V. Mazūraitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof., habil. dr.Valdimaras Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra - Kaunas.

Pavadinimas: Šermukšnių ţievės ir vaisių fenolinių junginių sudėties įvairavimo ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.

Raktiniai ţodţiai: Sorbus L, vaisiai, ţievė, fenoliniai junginiai, proantocianidinai, hidroksicinamono rūgštis, antioksidacinis aktyvumas, spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija.

Tyrimo objektas ir metodai: Sorbus L. genties augalų ţievės ir vaisių ėminių ekstraktai. Bendras fenolinių junginių, proantocianidinų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas UV spektrofotometriniu metodu. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis nustatyta efektyviosios chromatografijos metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu naudojant DPPH, ABTS, FRAP reagentus.

Darbo tikslas: Ištirti fenolinių junginių sudėties įvairavimą Lietuvoje augančių šermukšnių vaisių ir ţievės ėminiuose.

Darbo uţdaviniai: Nustatyti šermukšnių ţievės ir vaisių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą spektrofotometriniu metodu. Nustatyti šermukšnių ţievės ir vaisių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį efektyviosios chromatografijos metodu. Atlikti šermukšnių ţievės ir vaisių antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu.

Rezultatai: Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų šermukšnių ţievės ekstraktuose nustatytas rūgpjūčio 16 dienos (10,51±0,006 proc.) ėminiuose, proantocianidinų - rugsėjo 13 dienos (4,92±0,118 proc.) ėminiuose, hidroksicinamono rūgšties - balandţio 26 dienos (0,38±0,006 proc.) ėminiuose. Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas švedinio šermukšnio, augančio Draugystės parke (Kauno miestas.), vaisių ėminiuose (2,36±0,052 proc.). Paprastųjų šermukšnių vaisių ėminiuose bendras fenolinių junginių kiekis didţiausias, rinktuose Pauslajo miške (Kėdainių r.) (1,98±0,138 proc.), hidroksicinamono rūgšties darinių - Daumėnų miške (Panevėţio r.) (1,74±0,018 proc.). Paprastųjų šermukšnių ţievėje nustatyta neochlorogeno rūgštis, chlorogeno rūgštis ir izokvercitrinas, o šermukšnių vaisiuose - neochlorogeno rūgštis, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas ir astragalinas. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas ţievės ėminiuose, rinktuose geguţės 10 dieną (949,54±3,47 µmol /g), o vaisių ėminiuose –

rinktuose Pauslajo miške (Kėdainių r.) (299,96±3,4 µmol /g).

SUMMARY

Title: Phenolic Compounds and Antioxidant Activity composition research in Rowan bark and fruits.

Keywords: Sorbus L, fruit, bark, phenol compounds, proanthocyanidins, hydroxycinnamonic acid, antioxidant activity, spectrophotometry, high performance liquid chromatography.

Object and methods: Extracts of Sorbus L. bark and fruits. Total phenolic compounds, proanthocyanidins, hydroxycinnamonic acid derivatives are determined for UV spectrophotometry. Phenolic compounds qualitative and quantitative configuration is established by high-performance chromatography. Antioxidant activity by spectrophotometric method using DPPH, ABTS, FRAP reagents.

Aim: To investigate the composition of phenolic compounds entry Lithuania growing rowan fruits and bark samples.

Objective: Set rowan bark and fruits total phenolics variation of spectrophotometry method. Set rowan bark and fruits phenolics qualitative and quantitative compositions of the high-performance chromatography. Perform rowan bark and fruits antioxidant activity of spectrophotometry.

Results: The highest total phenolic compounds common rowan bark established on August 16 in sample (10,51 ± 0,006 per cent.), proanthocyanidins - September 13th in sample (4,92 ± 0,118 per cent.), hydroxycinnamonic acid - April 26th in sample (0,38 ± 0,006 per cent.). Rowan fruits largest phenolic compounds set of Swedish mountain ash, grown in Draugystės park (Kaunas city), in sample (2,36 ± 0,052 per cent.), rowan fruits of these compounds largest growing in Pauslajo forest (Kėdainiai district) (1,98 ± 0,138 per cent.) and a maximum hydroxycinnamonic acid content as determined by conventional rowan growing in Daumėnų forest (Panevėţys district) , the sample (1,74 ± 0,018 per cent.). Neochlorogenic acid, chlorogenic acid and isoquercitrin found in Rowan bark. Neochlorogenic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, rutin, hyperoside, isoquercitrin and astragalin found in rowan fruits. The highest antioxidant activity of the cortex in the sample was gathered on 10 May (949,54 ± 3,47 micromoles TE/g), and fruit, dialed Kėdainiai region, in sample (299,96 ± 3,4 micromoles TE/g).

1. SANTRUMPOS

ABTS - 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); DMCA - 4-dimetilaminocinamaldehidas;

DNR – deoksiribonukleorūgštis;

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas; ESC - efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP - geleţies redukcijos antioksidacinė galia; OPC - oligomeriniai proantocianidinai;

p - reikšmingumo lygmuo; R² - regresijos koeficientas; TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas; TE – trolokso ekvivalentas; UV - ultravioletinė spinduliuotė;

2. ĮVADAS

Pastaraisiais dešimtmečiais labai suintensyvėjo vaistinių augalinių ţaliavų tyrinėjimas ir vartojimas. 2007 metų duomenimis 35-70 tūkstančių augalų rūšių naudojama medicinoje. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 35-40 proc. vaistinių preparatų gaminama iš vaistinių augalinių ţaliavų. Vaistinėse augalinėse ţaliavose kaupiamos biologiškai aktyvūs junginiai pasiţymi farmakologinio poveikio įvairove ir sukelia maţiau šalutinių poveikių nei sintetiniai vaistai. [93].

Nustatyta, kad augalų biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis gali kisti nuo aplinkos veiksnių. Augalinės ţaliavos kokybė gali kisti dėl naudojamos augalo dalies, ţaliavų paruošų laiko, surinktos augalinės ţaliavos laikymo ir ekstrahavimo salygų. Kokybinės ir kiekinės biologiškai aktyvių junginių cheminės sudėties duomenys gali būti panaudojami ruošiant norminius dokumentus atitinkančią produkciją, todėl svarbu ištirti augalų vegetatyvinėse ir generatyvinėse dalyse kaupiamus biologiškai aktyvius junginius.

Paprastųjų šermukšnių vaisiai medicinos praktikoje naudojami kaip polivitamininė ţaliava [3]. Paprastųjų šermukšnių vaisiuose gausu vitaminų C, E, K, taip pat šermukšnių augalinėse ţaliavose mokslininkų nustatyta ir fenolinių junginių, pektinų ir kt., tačiau duomenys apie galimą fenolinių junginių įvairavimą nepakankami. Fenoliniai junginiai - stiprūs antioksidantai, pasiţymi antimutageninėmis, antitrombozinėmis, antimikrobinėmis, antiuţdegiminėmis, priešvėţinėmis savybėmis [42;43]. Vartojant fenolinius junginius kaupiančias augalines ţaliavas padidėja antioksidantų kiekis organizme ir tai gali sulėtinti ankstyvą senėjimą, padidinti ląstelių regeneraciją, gerinti regėjimą, gali sumaţinti geltonosios dėmės degeneraciją [22]. Biologiškai aktyvūs junginiai gali būti kaupiami ir kituose šermukšnių organuose: ţievėje, lapuose, ţieduose, bei panaudojami maisto produktų, maisto papildų pramonėje.

Ieškant naujų augalinių ţaliavų, pritaikant ţaliavas medicinos praktikoje ir plečiant medicinoje vartojamų augalinių ţaliavų asortimentą, atliekami fitocheminės sudėties tyrimai. Atlikus išsamius augalinių ţaliavų fitocheminės sudėties ir biologinio poveikio tyrimus, augalinės ţaliavos gali būti panaudojamos medicinos praktikoje, o vaistinių augalinių ţaliavų asortimentas papildytas nauja augaline ţaliava. Nustatant augalinių ţaliavų biologiniškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus vegetatyvinėse ir generatyvinėse augalo dalyse, svarbu tirti Lietuvoje augančių augalų cheminę sudėtį.

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas - ištirti fenolinių junginių sudėties įvairavimą Lietuvoje augančių šermukšnių vaisių ir ţievės ėminiuose.

Darbo uţdaviniai:

1. Spektrofotometriniu metodu nustatyti fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose vegetacijo metu.

2. Spektrofotometrijos metodu nustatyti šermukšnių vaisių, rinktų įvairiose Lietuvos augimvietėse, fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą.

3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti paprastųjų šermukšnių ţievės fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį skirtingais augalo vegetacijos periodais.

4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti šermukšnių vaisių, rinktų įvairiose Lietuvos augimvietėse, fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį.

5. Nustatyti paprastųjų šermukšnių ţievės antioksidacinį aktyvumą vegetacijos metu.

4. LITERATŪROS APŢVALGA

4.1.

Paprastųjų ir švedinių šermukšnių apibūdinimas, morfologiniai poţymiai

ir paplitimas

Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia L.) ir švedinis šermukšnis (Sorbus intermedia (Ehrh) Pers.) - erškėtinių (Rossaceae) šeimos, erškėtiečių (Rosales) eilės, erškėčiaţiedţių (Rosidae) poklasio, dviskilčių (Magnoliopsida) klasės, gaubtasėklių (Magnoliophyta) skyriaus augalai [5,8,9]. Rosaceae šeimai priskiriama 100 augalų genčių ir 2000 rūšių ţolinių augalų. Sorbus L. gentis apima 85 augalų rūšis ir daugiau nei 100 porūšių, veislių augalų [1;4,10].

Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia L.) – medis arba krūmas, kurio aukštis 3-15 m., išimties atvejais pasiekia 20 m. aukštį ir gali gyventi iki 100-200 metų [1;14;15]. Ţievė - šviesiai pilkšva, lygi, jaunų medţių blizgi, rudai pilkos spalvos senesnių [14]. Laja reta, kiaušiniška. Ūgliai rausvai rudi, apaugę pilkais plaukeliais [1]. Šakos paprastai nukreiptos aukštyn ir baigiasi pumpurais [7;14;15]. Pumpurai yra tamsiai violetinės spalvos, su pilkais plaukeliais, nelipnūs, viršūniniai pailgai kūgiški, o šoniniai šiek tiek maţesni, prigludę prie šakelių [1]. Pumpurai sprogsta balandţio mėnesį [15]. Lapai sudėtiniai, neporomis plunksniški, ovalios formos, sudaryti iš 9-15 (kartais 17) lapelių [1;14;15]. Lapeliai 3-8 cm ilgio, 1-2 cm pločio, pailgai lanceniški, dantyti, trumpakočiai. Lapelių viršutinė pusė tamsiai ţalia, plika, o apatinė – apaugusi pilkais plaukeliais [1]. (1 paveikslėlis).

1 pav. Sorbus aucuparia L. pumpurai, lapai, ţievė, ţiedai ir vaisiai

Paprastasis šermukšnis paplitęs skirtingose klimato zonose, auga lapuočių, spygliuočių bei mišrių miškų trake, kirtimuose, retmėse, pamiškėse, krūmuose taip pat plačiai auginamas pakelėse, sodybose ir parkuose [1;11]. Jis paplitęs Europoje, Šiaurės Amerikoje, Maţojoje Azijoje, Šiaurės Afrikos Maroko kalnuose, Islandijoje, Ispanijoje, Italijoje, Portugalijoje, Šiaurės Korėjoje, šiaurinėje Irano dalyje, aptinkamas ir Sibire [1;4;9;12].

2 pav. Sorbus intermedia (Ehrh) Pers. pumpurai, lapai, ţievė, ţiedai ir vaisiai Švedinis šermukšnis paplitęs šiaurinėje vakarų Europos dalyje, auga Estijoje, Pietų Skandinavijoje, Anglijoje. Lietuvoje auginamas kaip dekoratyvinis augalas parkuose ir sodybose [1].

4.2.

Šermukšnių augalinių ţaliavų ţievės ir vaisių kokybinė ir kiekinė sudėtis

Šermukšnis kaupia fenolinius junginius: antocianinus, flavonolius, taninus ir fenolines rūgštis [16]. Išskiriamos fenolinės rūgštys (chlorogeno rūgštis, neochlorogeno rūgštis, kavos rūgštis), flavanoidai (izokvercitrinas, rutinas, hiperozidas).

1 lentelė. Sorbus aucuparia L. vaisių cheminė sudėtis

Vaisiuje Sėklose Odelėje Minkštime

Pelenų kiekis (proc.) 5,1 4,4 4,7 10,2 Baltymų kiekis (proc.) 9,3 25,5 8,7 6,4 Lipidų kiekis (proc.) 6,2 16,5 8,3 2,3 Celiuliozės kiekis (proc.) 8,9 13,3 20,7 5,3 Cukrų kiekis (proc.) 6,6 5,5 2,3 17,7 Kalcio kiekis (mg/g) 2,0 2,9 2,3 1,8 Fosforo kiekis (mg/g) 2,1 5,7 2,2 1,1 Kalio kiekis (mg/g) 15,8 9,1 16,3 15,8 Magnio kiekis (mg/g) 1,6 3,6 1,2 0,9

Šermukšnių vaisių absoliučiai sausos ţaliavos biologiškai aktyvių junginių kiekis varijuoja nuo 19 proc. iki 34 proc., o pelenų kiekis varijuoja nuo 0,55 proc. iki 1,7 proc. Išdţiovintame vaisių minkštime yra 2,3-3,1 proc. lipidų, 3,2-6,4 proc. baltymų, 76,1-77,0 proc. tirpių angliavandenių ir 5,3-15,9 proc. celiuliozės. Išdţiovintame minkštime yra ir 1,6-1,8 mg/g kalcio, 1,1-1,3 mg/g fosforo, 9,0-15,8 mg/g kalio, 0,4-0,9 mg/g magnio, 0,2 mg/g natrio, 1 mg/kg mangano, 3 mg/kg cinko ir 6 mg/kg vario (1 lentelė) [17].

Svarbiausios riebalų rūgštys S. aucuparia L. sėklose yra linolo, oleino ir maţesniu kiekiu palmitino rūgšties, taip pat sėklose kaupiamos organinės rūgštys - gintaro rūgštis ir metilo obuolių rūgštis [19-21].

Paprastųjų šermukšnių ţievėje kaupiamos mineralinės medţiagos: kalcis (1,6±0,2 proc.), kalis (0,4±0,1 proc.), natris (0,02±0,01 proc.), magnis (0,15±0,02 proc.), fosforas (0,07±0,01 proc.), taip pat taninai (7,9±1,4 proc.) ir rauginės medţiagos (14 proc.) [17].

4.3.

Šermukšnių vaisių ir ţievės fenolinių junginių kokybinis ir kiekinis

įvertinimas

ţaliava, bet kaupia ir fenolinius junginius (550-1010 mg/100g), todėl kokybinės ir kiekinės fenolinių junginių sudėties augalinėje ţaliavoje nustatymas svarbus įvertinant ţaliavos kokybę. Fenolinių junginių nustatymui yra daug įvairių metodų, bet plačiausiai naudojami UV ir regiamojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija [55].

Sugerties spektrų analizė nustato molekulinę struktūrą. Kiekinės analizės metodai, pagrįsti nustatomosios medţiagos savybe sugerti optinio ruoţo elektromagnetinę spinduliuotę vadinami spektrofotometriniu analizės metodu, jeigu junginių analizė atliekama, panaudojant monochromatinės spinduliuotės atrankiąją sugertį regimajame, ultravioletiniame, infraraudonajame spektre. Daugelis biologiškai aktyvių junginių pasiţymi specifine sugertimi šiame spektrų ruoţe. Sugerties spektras yra tiriamo objekto priklausomybė nuo tiriančios šviesos bangos ilgio. Spektrofotometrinis metodas naudojamas, nes yra nesudėtinga ir palyginti nebrangi aparatūra. Spektrofotometrinis metodas pasiţymi analizės atlikimo sparta. Spektrofotometriniu metodu galima nustatyti biologinių junginių kiekį plačiame bangų ilgio spektre ir atlikti biologinių junginių kiekinę analizę. Labiausiai taikomi metodai, kurie remiasi šviesos sugertimi artimojo ultravioletinio, infraraudonojo, regimojo spektro ruoţe (200-1100 nm) [94].

Bendras fenolinių junginių kiekis vaisių ţaliavų ėminiuose gali būti nustatomas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą. Metodas grindţiamas fosfomolibdeno – fosfovolframo ir fenolinių junginių redukcija šarminiame tirpale [95]. Fenoliniai junginiai, esantys augalinių ţaliavų ekstraktuose, reaguoja su Folin-Ciocalteu reagentu sudarydami mėlynos spalvos kompleksą, kurio absorbcija nustatoma matuojant su UV/VIS spektrofotometru [57]. Rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentu. Metodas yra plačiai naudojamas, nes yra paprastas, greitas, pigus ir yra taikomas įprastam laboratoriniam naudojimui, tačiau vaisių ekstraktuose gali būti ir kitų reduktorių (cukrų, baltymų), dėl kurių gali būti fenolinių junginių kiekio pervertinimas [56;99].

Proantocianidinų nustatymui augaluose plačiai naudojamas tyrimas su vanilinu. Atliekant tyrimą. 0,5-2 proc. vanilinas metanolio tirpale sumaišomas su 4 proc. vandenilio chlorido tirpalu, gali būti naudojama ir kita rūgštis. Po 15 min šildymo 30˚C temperatūroje, optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant apie 500-510 nm bangos ilgiui. Kai naudojama vandenilio chlorido rūgštis arba sieros rūgštis, absorbcija matuojama esant apie 500 nm bangos ilgiui, kai ledinė acto rūgštis - esant apie 510 nm bangos ilgiui [101]. Daugelyje vaisių antocianinų bangos šviesos sugertis ta pati kaip ir proantocianidinų, todėl gali būti proantocianidinų kiekio pervertinimas [99].

[61]. Reagentas yra jautrus (+)-katechino oligomerams, monomerams ir polimerams [62]. Absorbcija matuojama esant 632-640 nm bangos ilgiui [62;101], taip išvengiama galimybės nustatyti proantocianidinų ir antocianinų bendrą kiekį. Metodas gali suteikti informacijos apie hidroksilinimą ir flavan-3-olių steriochemiją [60].

Remiantis Europos farmakopėja, hidroksicinamono rūgšties kiekis apskaičiuojamas chlorogeno rūgšties ekvivalentu [63]. Tiriant hidroksicinamono rūgšties kiekį naudojamas Arnow reagentas, susidedantis iš 10 proc. natrio nitrito tirpalo ir 10 proc. natrio molibdato tirpalo santykiu 1:1. Matuojama absorbcija spektrofotometru esant 525 nm bangos ilgiui [64]. Šis metodas pasiţymi geru atkartojamumu, selekcija, paprastu atlikimu [59].

Efektyvioji skysčių chromatografija plačiai taikoma junginių kokybiniam ir kiekiniam nustatymui. Metodas yra efektyvus ir greitas [65]. Fenolinių junginių skirstymo efektyvumui įtakos turi bandinio grynumas, eliuentas, kolonėlės tipas ir detektoriai [66]. Fenolinių junginių nustatymui naudojama atvirkštinių fazių C18 kolonėlė, detektoriai - UV/VIS šviesos, fotodiodo, UV- fluorescencinis, masių spektrometrijos, taip pat naudojami poliariniai parūgštinti organiniai tirpikliai [67].

Daţniausiai judančiajai fazei naudojamas acetonitrilas ir metanolis arba jų vandeniniai tirpalai [68-73]. Patariama eliuento pH išlaikyti intervale 2-4 pH. Eliuento parūgštinimui daţniausiai naudojama acto rūgštis, bet gali būti naudojama ir skruzdţių ar fosforo rūgštis arba fosfatas, citratas, esant maţam pH - amonio acetato buferis [66;68;74].

Atitinkamų kolonėlių pasirinkimas yra svarbus fenolinių junginių kokybiniam ir kiekiniam nustatymui. Remiantis poliškumu, skirtingų klasių fenolinius junginius galima nustatyti naudojant įprastą C18 arba atvirkštinių fazių (RP-C18) kolonelę [75;76]. Tačiau naujų tipų kolonėlės (monolitinės ir paviršiuje akytų dalelių kolonėlės) yra labiau pritaikytos identifikuoti fenolinius junginius ESC metodu [77;78].

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo atlikimo laikas yra kitas veiksnys, įtakojantis fenolinių junginių aptikimą ir gali varijuoti nuo 10 min iki 150 min. Analizę patariama atlikti ilgesnį laiką, kad būtų tikslesni rezultatai. Norint didelio aptikimo esant ilgai analizei reikia pastovios temperatūros [80].

Suţadinimo bangos ilgis būna apie 275-280 nm, o emisijos apie 315-325 nm. Fluorescencinio detektoriaus aptikimo jautrumas yra daug didesnis nei UV-VIS [103].

Masių spektrometrija yra metodas aptinkantis ir preliminariai nustatantis fenolinius junginius. Elektropurkštuvinė jonizacija ir atmosferos cheminė jonizacija yra daţniausiai naudojami jonizacijos būdai ESC. Elektropurkštuvinė jonizacija taikoma poliniams junginiams, atmosferos cheminė jonizacija - neutraliems ir nepoliniams junginiams. Skysčių chromatografija su masių spektrometro detektoriumi sujungtas su jonų gaudykle tinka analizuojant fenolinius junginius [104].

Šermukšnių vaisių ir ţievės antioksidacinis aktyvumas turi kelis mechanizmus, todėl įvertinti antioksidacinį aktyvumą reikia nors dviem metodais. Tyrimo metu antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudajamos ABTS, DPPH ir FRAP metodikos. Metodikos turi skirtumų: FRAP metodas skirtas nustatyti elektronų redukavimo galią. ABTS ir DPPH metodai skirti įvertinti molekulinę savybę antioksiduoti laisvus ABTS ir DPPH radikalus [84;85]. ABTS katijonas yra tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, todėl gali nustatyti antioksidacinį aktyvumą hidrofiliniuose ir lipofiliniuose junginiuose, o DPPH tirpus tik organiniuose tirpikliuose, todėl gali nustatyti antioksidacinį aktyvumą tik lipofiliniuose junginiuose. Dėl metodų skirtumų gali skirtis TE nustatytos reikšmės [18;21].

4.4.

Šermukšnių vaisių ir ţievės fenolinių junginių poveikis organizmui

Priešvėţinis poveikis. Ištirta, kad vaisiuose kaupiami fenoliniai junginiai slopina vėţinias ląsteles sergant krūties ir gaubtinės ţarnos vėţiu [6;23]. Vėţines ląsteles slopina flavanoidai (įskaitant antocianinus, flavonoidus ir flavanolius), stilbenai, hidroksicinamono ir hidroksibenzoinės rūgštys, lignanai, kondensuoti taninai (proantocianidinai) ir hidrolizuoti taninai (elagitaninas ir galotaninas) [24;25;29;30-37]. Veikimo mechanizmas gali būti siejamas su laisvųjų radikalų slopinimu, fermentų indukcija, dalyvaujančių ksenobiotikų metabolizme, genų ekspresijos reguliavimu, ląstelių signalų moduliacija, įskaitant tuos, kurie atsakingi uţ DNR paţeidimų taisymą, ląstelių proliferaciją, apoptozę ir invaziją [26-28]. Augaluose esantys fenoliniai junginiai gali moduliuoti daug ląstelių procesų, kurie kontroliuoja proliferazę, diferenciaciją ir apoptozę, kurie gali lemti priešvėţinį poveikį [38;39]. Šiam poveikiui yra jautresnės vėţinės ląstelės nei sveikos [40;41].

Oligomeriniai proantocianidinai (OCP) turi natūralių antimutageninių savybių, kai susiduria su tam tikromis bakterijomis. Nors tikslus šio poveikio mechanizmas nėra ţinomas, in vitro tyrimo metu nustatyta, kad OCP būdingas selektyvus citotoksiškumas tam tikroms vėţinėms ląstelėms [46].

Priešuţdegiminis poveikis. Atlikti in vitro tyrimai įrodo OCP priešuţdegiminį poveikį. Priešuţdegiminis poveikis pasireiškia tuo, kad proantocianidinai slopina makrofagų peroksido gamybą [47]. Tyrimo metu nustatyta, kad proantocianidinai, ypač oligomerai, veikia kaip reguliatoriai uţdegiminiams procesams, kuriuos sukelia oksidacinis stresas sergant diabetu [45].

Antimikrobinis, antibakterinis, priešvirusinis poveikis. Sorbo rūgštis randama šermukšnių vaisiuose maţina mikrobų ir bakterijų poveikį odoje ir organizme. Šermukšnių vaisiai gali būti naudojami kosmetikos sudėtyje kaip antibakterinė ţaliava [22].

Flavonoidai ir polifenoliai turi slopinantį poveikį ŢIV. Manoma, kad flavonoidai gali slopinti viruso receptorių jungimąsi prie limfocitų, uţkirsdami kelią infekcijai [42].

Fenolinių junginių poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Paprastojo šermukšnio vaisiai kaupia daug vitamino C. Askorbo rūgštis yra labai svarbi ţmonių sveikatai, ji gali skatinti baltųjų kraujo kūnelių gamybą ir veikti kaip antioksidantas. Vitaminas C yra būtinas organizmo procesams, įskaitant kolageno gamybai, kuris stiprina raumenis ir padeda atsistatyti kraujagyslėms [5].

Įrodyta, kad OCP sumaţina maţo tankio lipoproteinų peroksidaciją. OCP slopina fermentus, dalyvaujančius kolageno, elastino ir hialurono rūgšties degradacijoje - tai gali sumaţinti kraujagyslių endotelio oksidaciją. Proantocianidinai teigiamai veikia širdies pakitimus, kuriuos sukelia aldosterono natrio druska. Tyrimo su ţiurkėmis metu buvo nustatyta, kad proantocianidinai panaikino aldosterono sukeltą hipertenziją ir diastolinę disfunkciją [46;47].

Rutinas stiprina kraujagyslių sieneles ir maţina kapiliarų laidumą. Ištirta, kad rutinas slopina trombocitų agregaciją, todėl kraujas skystėja ir pagerina jo apytaką [51]. 2009 metais atlikto tyrimo su gyvūnais metu ištirta, kad rutinas yra pagrindinis maţo tankio lipoproteinų antioksidantinis junginys. Rutinas kartu su lovastatinu gali maţinti cholesterolio kiekį kraujyje [52].

Fenolinių junginių poveikis virškinimo traktui. Pektinai, kaupiami šermukšnių vaisiuose, gerina virškinamojo trakto darbą, veikia liuosuojančiai. Vaisiuose kaupiamos rauginės medţiagos slopina viduriavimą, nors tikslus mechanizmas dar nėra aiškus [22].

Antiglikeminis poveikis. 2012 metais atlikto tyrimo in vivo su ţiurkėmis metu nustatyta, kad proantocianidinai gali sumaţinti hiperglikemijos riziką [46]. Rutinas maţina simptomus esant diabetui ir normalizuoja cukraus kiekį kraujyje [54].

Kiti fenolinių junginių poveikiai. 2007 metais atlikto tyrimo in vivo metu išsiaiškinta, kad fenoliniai junginiai efektyviai sukelia apoptozę 3T3-L1 preadipocituose ir adipocituose. Tyrimas įrodė, kad fenoliniai junginiai turi teigiamos įtakos esant nutukimui [44]. Yra ţinoma, kad kavos rūgšties fenetilo esteris apsaugo dopaminerginius neuronus ir sušvelnina metamfetamino poveikį [50]. Kvercetinas ir sorbo rūgštis gali sulėtinti ankstyvą senėjimą, padidinti ląstelių regeneraciją, gerinti regėjimą, gali sumaţinti geltonosios dėmės degeneraciją [22].

4.5.

Literatūros apţvalgos apibendrinimas

Literatūroje nurodoma, kad šermukšnių vaisiuose daugiausiai kaupiama fenolinių junginių, kuriuos sudaro flavonoidai (flavonoliai, antocianidinai, proantocianidinai), hidrolizuoti ir kondensuoti taninai, fenolinės rūgštys. Fenoliniai junginiai plačiai taikomi įvairių ligų prevencijai, profilaktikai ir gydymui, nes pasiţymi antibakteriniu, antivirusiniu, priešvėţiniu, priešuţdeginimiu veikimu.

Fenoliniai junginiai, kaupiami paprastųjų šermukšnių vaisiuose ir ţievėje, gali būti nustatomi spektrofotometriniu metodu. Jis suteikia informacijos apie hidroksilinimą ir flavan-3-olių steriochemiją. Metodas paprastas, pigus ir greitai atliekamas, tačiau gali nustatyti tik kiekiškai ir tik tam tikras junginių grupes. Fenolinių junginių nustatymui galima naudoti Europos farmakopėjoje nurodytus tyrimų metodus.

5. TYRIMO METODIKA

5.1.

Tyrimo objektas

Tirti šermukšnių vaisiai ir ţievė.

Paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia L.) vaisiai rinkti 2014 metų spalio mėnesį skirtingose augimvietėse. Ţaliava buvo renkama: Maţeikių rajone – Balėnų miške; Panevėţio rajone – Daumėnų miške; Lazdijų rajone - Kalniškės miške; Kėdainių rajone - Pauslajo miške; Utenos rajone - Vyţuonų miške; Kauno rajone – Pilėnų miške; Vilniaus rajone - Panerių miške; Švenčionių rajone - Adutiškio miške.

Sorbus aucuparia L. vaisių ţaliavų ėminiuose esančių fenolinių junginių palyginimui buvo rinkti Švedinio šermukšnio (Sorbus intermedia (Ehrh.) Pers.) vaisių ėminiai Utenos mieste (Vyţuonų parke) ir Kauno mieste (Draugystės parke).

Paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia L.) ţievės ėminiai rinkti 2014 metais Utenos rajone, Gaiţiūnų kaime. Šermukšnių ţievės fenolinių junginių kitimui vegetacijos metu ėminiai buvo renkami 2014.04.26-2014.09.27 (dviejų savaičių intervalu).

5.2.

Naudoti reagentai

Naudoti analitinio ir chromatografinio švarumo reagentai. 96,3 proc. (v/v) etanolis (AB „Stumbras―, Kaunas, Lietuva); Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Steinheim, Vokietija); natrio karbonatas; galo rūgšties monohidrato standartas, natrio acetato tirpalas, vandenilio chloridas, DMCA, geleţies (III) chlorido heksahidratas („Sigma–Aldrich GmbH―, Steinheim, Vokietija); TPTZ (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija); Trolox®-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis („Acros organics―, Niu Dţersis, JAV); ABTS, kalio persulfatas („Fluka Chemie―, Buchs, Šveicarija).

5.3.

Naudota aparatūra

Spektrofotometrininai ekstraktų analizei naudojamas UV/VIS spektrofotometras M550 (Jungtinė Karalystė).

Kokybinė ir kiekinė ėminių ekstraktų analizė atliekama efektyviosios chromatografijos metodu chromatografine Waters 2695 Alliance sistema („Waters―, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 996. Skirstymui naudota ACE C18 („ACT―, Didţioji Britanija) kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3μm) su ACE C18 („ACT―, Didţioji Britanija) prieškolone (dalelių dydis 3μm).

5.4.

Tyrimo metodai

5.4.1. Ţaliavos paruošimas

Surinktos ţaliavos ėminiai buvo dţiovinami tamsioje, vėdinamoje, nuo tiesiogių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje. Laikomi sausoje, tamsioje vietoje. Šermukšnių ţievės ir vaisių ėminiai smulkinami iki dalelių praeinančių pro 450 µm sietą.

5.4.2. Šermukšnių vaisių ir ţievės ekstraktų paruošimas

Pasveriama 0,1 g (tiksli masė) ţievės arba vaisių, uţpilama 7 ml 70 proc. (v/v) etanolio (ţievės ekstraktams) arba 50 proc. (v/v) etanolio (vaisių ekstraktams) ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 40 min (ţievė) arba 20 min (vaisiai) esant 25 ˚C temperatūrai sandariuose tamsaus stiklo buteliukuose. Ultragarso stipris 1130 W, daţnis 60 Hz. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą. Šermukšnių ţievės likutis ant filtro praplaunamas 70 proc. (v/v) etanoliu į 10 ml matavamo kolbą, iki 10 ml ţymės, vaisių – 50 proc. (v/v) etanoliu. Prieš atliekant ESC analizę, ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų dydţio membraninius filtrus [81].

5.4.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu.

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.

B tirpalo gamyba: į 0,5 ml tirpalo A įpilama 2,5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir 2 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo, ir sumaišoma.

Lyginamasis tirpalas ruošiamas kaip tirpalas B, tik vietoj tirpalo A pilama 0,5 ml distiliuoto vandens.

Gautas tirpalas paliekamas 60 min. tamsoje, po to spektrofotometru išmatuojama 765 nm bangos ilgio šviesos absorbcija. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [82]:

y= 0,5616x+0,0063; R²=0,999

Galo rūgšties koncentracijų intervalas 0-2,5 mg/ml.

Procentinis fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje apskaičiuojamas pagal formulę:

- bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml;

V - tiriamosios ţaliavos ekstrahento naudoto gamybai tūris ml; m - absoliučiai sausos ţaliavos masė g.

5.4.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras proantocianidinų kiekis nustatomas su DMCA (4-dimetilaminocinamaldehido) etanoliniu vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (9:1 v/v).

Tiriamojo tirpalo paruošimas: 20 µl tiriamojo tirpalo sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalu.

Lyginamojo tirpalo paruošimas: 20 µl distiliuoto vandens sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalu.

Paruošus tiriamąjį tirpalą, paliekama 5 min ir po to matuojama tirpalo šviesos absorbcija esant 640 nm bangos ilgio šviesai [62]. Bendras proantocianidinų kiekis išreiškiamas (-)-epikatechino ekvivalentu (mg/ml) pagal (-)-epikatechino kalibracijos lygtį:

y=1,9083x+0,0195; R²=0,9996

(-)-epikatechino koncentracijų intervalas 0,03125-0,5 mg/ml.

Procentinis proantocianidinų kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje skaičiuojamas pagal formulę:

- bendras proantocianidinų kiekis mg/ml;

V - tiriamosios ţaliavos ekstrahento naudoto gamybai tūris ml; m - absoliučiai sausos ţaliavos masė g.

5.4.5. Bendro

hidroksicinamono

rūgšties

darinių

kiekio

nustatymas

spektrofotometriniu metodu

Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatomas su Arnow reagentu [63].

Tiriamojo tirpalo gamyba: į 0,5 ml tiriamojo ekstrakto įpilama 1 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 0,5 ml Arnow reagento (sudarytas iš 10 proc. natrio molidbato tirpalo ir 10 proc. praskiesto natrio nitrito tirpalo santykiu 1:1), 1 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedţiama distiliuotu vandeniu iki 5 ml.

Kiekvienam tiriamajam tirpalui ruošiamas lyginamasis tirpalas: į 1 ml tiriamojo ekstakto pilama 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedţiama distiliuotu vandeniu iki 10 ml.

Spektrofotometru matuojama tiriamojo tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas chlorogeno rūgšties ekvivalentu pagal kalibracijos lygtį:

y=0,2429x+0,0065; R²=0,9954

Chlorogeno rūgšties koncentracijų intervalas 0,03125-1,0 mg/ml.

Procentinis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje skaičiuojamas pagal formulę:

- bendras hidroksicinamono rūgšties kiekis mg/ml;

V - tiriamosios ţaliavos ekstrahento naudoto gamybai tūris ml; m - absoliučiai sausos ţaliavos masė g.

Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 10 µl tiriamojo ekstrakto įpilama 3 ml FRAP reagento ir sumaišoma.

Lyginamojo tirpalo paruošimas: į 10 µl distiliuoto vandens įpilama 3 ml FRAP reagento ir sumaišoma.

Paruoštas tiriamasis tirpalas paliekamas 60 min. ir po to matuojama 593 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [83]. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas µmol TE/g pagal trolokso kalibracijos kreivę:

y=0,609x+0,0093; R²=0,9905

Trolokso koncentracijų intervalas 0-2,0 mg/ml.

Absoliučiai sausos ţaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas pagal formulę:

- antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

V - tiriamosios ţaliavos ekstrahento naudoto gamybai tūris ml; m - absoliučiai sausos ţaliavos masė g.

5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu ABTS metodu

Motininio ABTS radikalo tirpalo gamyba: 2 mM ABTS (2,2‗-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) ištirpinama 50 ml distiliuotame vandenyje ir pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario temperatūroje. Tuo metu kalio persulfatas suoksiduoja ABTS. Reakcijos metu susidaro stabilus katijonas. Laikant motininis ABTS·+ tirpalas išlieka stabilus daugiau nei 2 paras (kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos).

Darbinio tirpalo gamyba: tirpalas skiedţiamas distiliuotu vandeniu, kol matuojant spektrofotometru 734 nm bangos ilgio šviesos absorbciją pasiekiami 0,8±0,03 absorbcijos vienetai.

Tiriamojo tirpalo gamyba: į 10 µl tiriamojo ekstakto įpalama 3 ml darbinio _{tirpalo ir}

sumaišoma.

Lyginamasis tirpalas - distiliuotas vanduo.

Pagaminus tiriamąjį tirpalą paliekama 60min ir matuojamas spektrofotometru jo šviesos absorbcijos sumaţėjimas esant 734 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracijos lygtį [84]:

Trolokso koncentracijų intervalas 0-2,0 mg/ml.

Absoliučiai sausos ţaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas pagal formulę:

- antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

V - tiriamosios ţaliavos ekstrahento naudoto gamybai tūris ml; m - absoliučiai sausos ţaliavos masė g.

5.4.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu DPPH metodu

Darbinis DPPH tirpalo gamyba: 60 µM DPPH tirpalas yra skiedţiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją pasiekiami 0,8±0,03 vienetai.

Tiriamojo tirpalo gamyba: į 10 µl tiriamojo ekstrakto įpilama 3 ml darbinio DPPH ir sumaišoma.

Kaip tuščias mėginys naudojamas 96,3 proc. (v/v) etanolis. Pagamintas tiriamasis mėginys paliekamas 30 min ir matuojamas jo šviesos absorbcijos sumaţėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracijos lygtį [85]:

y=0,2485x-0,0268; R²=0,9604

Trolokso koncentracijų intervalas 0-2,0 mg/ml.

Absoliučiai sausos ţaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas pagal formulę:

- antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

5.4.9. Fenolinių junginių kokybinis ir kiekinis nustatymas efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos eliuentas sudarytas iš 0,05 proc. trifluoracto rūgšties (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Naudotas gradiento kitimas: 0-5 min 12 proc. B, 5-50 min 12-30 proc. B, 50-51 min 30-90 proc. B, 51-56 min 90 proc. B, 57 min 12 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis buvo 0,5 ml/min, o injekcijos tūris 10 µl. Kolonėlė termostatuojama 25 ˚C temperatūroje. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal ekstraktų analites ir etaloninio mėginio sulaikymo laiką. Buvo lyginama diodų matricos detektoriumi gauti etaloninių junginių ir analičių UV absorbcijos spektrai. Kiekinis analičių įvertinimas atliktas pagal analitės smailės ploto priklausomybę nuo analitės koncentracijos tirpale. Buvo sudarytos šermukšnių ţievės ir vaisių ekstraktuose identifikuotų junginių kalibracijos kreivės pagal kurias apskaičiuotas junginių kiekis. Chlorogeno, neochlorogeno, kavos rūgščių kiekiai skaičiuoti bangos ilgiui esant 325 nm, hiperozido, astragalino, rutino ir izokvercetino esant 350 nm bangos ilgiui [81].

5.5.

Duomenų analizė

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

6.1.

Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių fenolinių junginių kiekio įvairavimo

tyrimas spektrofotometriniu metodu

Vertinant šermukšnių augalinių ţaliavų kokybę svarbu ištirti fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą. Fenolinių junginių kiekinės sudėties analizė svarbi šermukšnių ėminius vartojant ne tik mitybai, bet ir ieškant naujų pritaikymo galimybių.

6.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas šermukšnių ţievės ir vaisių

ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Siekiant pritaikyti naują augalinę ţaliavą naudojimui, svarbu ištirti šermukšnių ţievės ėminių bendrą fenolinių junginių kiekį vegetacijos metu. Biologiškai aktyvių junginių kokybinei ir kiekinei sudėčiai augalų augalinėse ţaliavose įtakos turi augimo sąlygos. Skirtinguose regionuose surinktos šermukšnių vaisių ţaliavos gali skirtis fenolinių junginių kiekine sudėtimi, todėl svarbu ištirti skirtingose augavietėse surinktų ėminių fenolinių junginių kiekio kitimą. Gauti rezultatai gali papildyi turimą informaciją apie fenolinių junginių kiekį vaisiuose ir suteikti mokslinių ţinių apie skirtingose augavietėse augančių šermukšnių vaisių augalinių ţaliavų fenolinių junginių kiekio varijavimą. Bendrai fenolinių junginių kiekinei sudėčiai tirti pasirinktas spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą.

3 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių žievės ėminiuose

pradţioje - geguţės 10 d. (10,0 ±0,2 proc.), vaisių nokimo tarpsnyje - rugpjūčio 16 d. (10,51±0,16 proc.), ir vaisių brandos tarpsnyje - rugsėjo 13 d. ( 9,95±0,13 proc.) ėminiuose. Ţydėjimo pradţioje bendras fenolinių junginių kiekis padidėjo. Vegetacijos periodo metu vystantis vaisiams bendras fenolinių junginių kiekis maţėjo, liepos 5 dieną (6,4±0,13 proc.) surinktuose ėminiuose nustatytas maţiausias kiekis. Vaisiams nokstant fenolinių junginių kiekis šermukšnių ţievėje didėjo iki rugpjūčio 16 d ir vaisiams sunokus kito neţenkliai (3 pav.).

4 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas šermukšnių vaisių ėminiuose

Bendras fenolinių junginių kiekio įvairavimas šermukšnių vaisių ėminiuose, surinktuose įvairiose Lietuvos augimvietėse, skiriasi (rezultatai pateikti 4 paveikslėlyje). Bendras fenolinių junginių kiekis varijuoja nuo 0,9 proc. iki 2,36 proc. Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis (p<0,05) nustatytas švedinio šermukšnio, augančio Draugystės parke (Kauno miestas), vaisių ţaliavų ėminiuose (2,36±0,05 proc.). Ištyrus paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminių fenolinių junginių kiekinę sudėtį, didţiausi fenolinių junginių kiekiai (p<0,05) nustatyti Pauslajo miške (Kėdainių rajonas) (1,98±0,04 proc.), Daumėnų miške (Panevėţio rajonas) (1,84±0,06 proc.) bei Panerių miške (Vilniaus rajonas) (1,73±0,07 proc.) rinktuose paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose. Maţiausias bendras fenolinių junginių kiekis – Vyţuonų miške (Utenos rajonas) (0,9±0,03 proc.) rinktuose paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose (4 pav.).

vienas iš didţiausių, todėl tęsiant tyrimus bendro fenolinių junginių kiekio paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose vegetacijos metu patariama atlikti su kovo – spalio mėnesių ėminiais.

6.1.2. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių ţievės

ėminių ekstraktuose

Proantocianidinų kiekis šermukšnių ţievės ėminių ekstraktuose nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant DMCA reagentą.

5 pav. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių žievės ėminiuose

Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas šermukšnių ţievės ėminiuose pateiktas 5 paveikslėlyje. Bendras proantocianidinų kiekis ţievės ėminiuose varijuoja nuo 1,72 proc. iki 4.92 proc. Didţiausias bendras proantocianidinų kiekis (p<0,05) nustatytas vaisių brandos tarpsnyje - rugsėjo 13 d. (4,92±0,09 proc.), ir rugsėjo 27 d. (4,05±0,08 proc.) rinktuose ţievės ėminiuose. Vegetacijos periodo metu bendras proantocianidinų kiekis paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose kito neţenkliai (2,22-2,65 proc.). Maţiausias bendras proantocianidinų kiekis nustatytas vaisių vystymosi tarpsnyje - birţelio 21 d. rinktuose ţievės ėminiuose (1,72±0.12 proc.) (5 pav.).

Remiantis tyrimo rezultatais, paprastųjų šermukšnių ţievės ėminius patariama rinkti rugsėjo mėnesį. Rugsėjo mėnesį bendras proantocianidijų kiekis ţenkliai skiriasi nuo kitų ėminių vegetacijos metu, todėl patariama toliau tiriant paprastųjų šermukšnių ţievės ėminius rinkti ir spalio mėnesį.

6.1.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas šermukšnių

ţievės ir vaisių ėminiuose

ir vaisių bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis spektrofotometriniu metodu, naudojant Arnow reagentą.

6 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių žievės ėminiuose

Paprastųjų šermukšnių ţievės ėminių ekstraktuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis varijuoja 0,18-0,38 proc. Didţiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis (p<0,05) nustatytas butonizacijos tarpsnyje - balandţio 26 d. (0,38±0,01 proc.) ir vaisių brandos tarpsnyje - rugpjūčio 30 d. (0,33±0,02 proc.), rugsėjo 13 d. (0,36±0,02 proc.) ir rugsėjo 27 d. (0,35±0,01 proc.) rinktuose ţievės ėminiuose. Maţiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas ţydėjimo tarpsnio pradţioje - geguţės 10 d. rinktuose ţievės ėminiuose (0,18±0,01 proc.) (6 pav.).

7 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas šermukšnių vaisiuose

Vyţuonų (Utenos rajonas) (1,24±0,01 proc.) miškuose. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šiose augavietėse surinktų paprastųjų šermukšnių vaisių hidroksicinamono rūgšties darinių kiekinės sudėties nenustatyta (p>0,05). Maţiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių, rinktų Balėnų (Maţeikių rajonas) ir Adutiškio (Švenčionių rajonas) miškuose, ţaliavų ėminiuose (0,87±0,003 proc.). Didesnis bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas švedinio šermukšnio vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Draugystės parke (Kauno miestas) (1,39±0,02 proc.) nei Vyţuonų parke (Utenos miestas) (0,69±0,01 proc.) (7 pav).

Tyrimo metu šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose nustatytas bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis neţymiai skiriasi nuo kitų mokslininkų atliktų tyrimų metu nustatyto hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (0,1-0,13 proc.) [90,91]. Lietuvoje augančių paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminius patariama rinkti Daumėnų (Panevėţio rajonas) ir Panerių (Vilniaus rajonas) miškuose. Remiantis tyrimo rezultatais, paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis vegetacijos metu ţenkliai nesiskiria. Ţenklus hidroksicinamono rūgšties darinių sumaţėjimas matomas tik pilno paprastųjų šermukšnių ţydėjimo metu ( geguţės 10 d ėminiai), todėl ţaliavą patartina rinkti prieš arba po ţydėjimo.

6.2.

Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo

įvertinimas spektrofotometriniu metodu

Kaupiamų fenolinių junginių kiekis priklauso nuo augalų augimvietės ir vegetacijos periodo, todėl svarbu nustatyti, kuriose Lietuvos augimvietėse šermukšnių vaisių ėminuose, taip pat kuriuo vegetacijos metu šermukšnių ţievės ėminiuose didţiausias antioksidacinis aktyvumas. Šermukšnių ţievės ir vaisių antioksidacinis aktyvumas nustatytas ABTS, DPPH ir FRAP spektrofotometriniu metodu.

6.2.1. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo

nustatymas ABTS metodu

Maţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas vaisių nokimo tarpsnyje - liepos 5 d. ţievės ėminiuose (466,4±12,09 µmol TE/g) (8 pav.).

8 pav. ABTS spektrofotometriniu metodu nustatytas paprastųjų šermukšnių žievės ėminių antioksidacinis aktyvumas

Šermukšnių vaisių antioksidacinis aktyvumas varijuoja 143,99-299,96 µmol TE/g. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių, rintų Pauslajo (Kėdainių rajonas) (299,96±3,4 µmol TE/g), ir Vyţuonų (Utenos rajonas) (296,98±3,61 µmol TE/g) miškuose, ţaliavų ėminiuose bei švedinio šermukšnio vaisių, rinktų Draugystės parke (Kauno miestas) (296,23±3,61 µmol TE/g), ţaliavų ėminiuose. Maţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas Balėnų miške (Maţeikių rajonas) (143,99±4,84 µmol TE/g) rinktuose paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose (9 pav.).

Kitų mokslinių tyrimų metu šermukšnių vaisių ţaliavų antioksidacinis aktyvumas nustatytas tik 5,94 µmol TE/g [92] ir skiriasi nuo šio tyrimo rezultatų. Lietuvoje augančių šermukšnių vaisių antioksidacinis aktyvumas ţenkliai didesnis, bet tarp regionų ţenkliai nesiskiria, išskyrus Balėnų miške (Maţeikių rajonas) rinktų ėminių nustatytus rezultatus. Remiantis rezultatais, paprastojo šermukšnio ţievės ėminius patariama rinkti balandţio 26 - geguţės 10 dienomis, taip pat rugpjūčio 30 dieną. Antioksidacinis aktyvumas panašus balandţio 26 d. ir geguţės 10 d. rinktuose ėminiuose, todėl tęsiant tyrimus patartina ţaliavą rinkti nuo kovo mėnesio.

6.2.2. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių antioksidacinio aktyvumo nustatymas

DPPH metodu

Paprastųjų šermukšnių ţievės ėminių antioksidacinis aktyvumas varijuoja 451,81-949,54 µmol TE/g. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas ţydėjimo tarpsnio pradţioje - geguţės 10 d. (949,54±10,24 µmol TE/g) rinktuose ėminiuose ir vegetacijos periodo metu antioksidacinis aktyvumas maţėjo. Maţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas vaisių nokimo tarpsnyje - rugpjūčio 2 d. (451,81±15,09 µmol TE/g) rinktuose ţievės ėminiuose (10 pav.).

10 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas šermukšnių žievės ėminių antioksidacinis aktyvumas

11 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas šermukšnių vaisių ėminių antioksidacinis aktyvumas

Kitų mokslininkų atliktų tyrimų metu, šermukšnių vaisių ėminių antioksidacinis aktyvumas yra 86,9-956,2 µmol TE/g [18]. Šio tyrimo metu šermukšnių vaisių ėminių antioksidacinis aktyvumas tarp augimviečių ţenkliai nesiskiria išskyrus ėminiuose, rinktuose Daumėnų (Panevėţio rajonas) ir Panerių (Vilniaus rajonas) miškuose, kur antioksidacinis aktyvumas didţiausias. Remiantis tyrimo rezultatais, paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminius patariama rinkti Daumėnų (Panevėţio rajonas) arba Panerių (Vilniaus rajonas) miškuose, taip pat patariama rinkti švedinio šermukšnio vaisių ėminius Draugystės parke (Kauno miestas). Remiantis gautais rezultatais paprastųjų šermukšnių ţievės ėminius patariama rinkti geguţės mėnesį ir rugpjūčio pabaigoje.

6.2.3. Šermukšnių vaisių ir ţievės ėminių antioksidacinio aktyvumo nustatymas

FRAP metodu

12 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas šermukšnių žievės ėminių antioksidacinis aktyvumas

Šermukšnių vaisių antioksidacinis aktyvumas varijuoja 6,34-93,99 µmol TE/g. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Pauslajo (Kėdainių rajonas) (93,99±3,38 µmol TE/g) ir Daumėnų (Panevėţio rajonas) (79,03±2,62 µmol TE/g) miškuose, bei švedinio šermukšnio vaisių ėminiuose, rinktuose Draugystės parke (Kauno miestas) (71,82±2,42 µmol TE/g). Maţiausias antioksidacinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Adutiškio (Švenčionių rajonas) (10,91±2,46 µmol TE/g) ir Balėnų (Maţeikių rajonas) (8,29±1,82 µmol TE/g) miškuose, ir švedinio šermukšnio vaisių ėminiuose, rinktuose Vyţuonų parke (Utenos miestas) (6,34±1,11 µmol TE/g) (13 pav.).

Lyginant su kitų mokslininkų atliktais tyrimais, šermukšnių vaisių ţaliavose nustatytas antioksidacinis aktyvumas varijuoja vienodai [21]. Vertinant rezultatus, paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavos ėminius patariama rinkti Pauslajo (Kėdainių rajonas) ir Daumėnų (Panevėţio rajonas) miškuose, o švediško šermukšnio – Draugystės parke (Kauno miestas). Remiantis tyrimų rezultatais, geriausia Sorbus aucuparia L. ţievės ėminius rinkti rugpjūčio pabaigoje - rugsėjo mėnesiais. Tęsiant tyrimą, kadangi šermukšnių ţievės ėminių antioksidacinis aktyvumas didţiausias rugsėjo mėnesį, norint nustatyti kada antioksidacinis aktyvumas maţėja, patariama ţievės ėminius rinkti ir spalio mėnesį.

6.3.

Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas šermukšnių

vaisių ir ţievės ėminiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Vertinant fenolinių junginių kokybę ir kiekybę, ir norint pritaikyti ėminius vartojimui, svarbu identifikuoti fenolinius junginius. Šermukšnių ţievės ėminių vegetacijos metu ir skirtinguose Lietuvos regionuose augančių šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose kaupiamus fenolinius junginius identifikuoti ir kiekio kitimui nustatyti pasirinktas ESC metodas.

ESC metodu paprastųjų šermukšnių ţievės ėminių etanoliniuose ekstraktuose identifikuota neochlorogeno rūgštis, chlorogeno rūgštis ir izokvercitrinas (14 pav.).

14 pav. Paprastųjų šermukšnio žievės etanolinio ekstrakto ESC chromatograma (λ=360 nm). 1 - neochlorogeno rūgštis, 2 - chlorogeno rūgštis, 3 - izokvercitrinas.

proc.). Maţiausi neochlorogeno rūgšites ir chlorogeno rūgšties kiekiai nustatyti vaisių brandos tarpsnyje - rugsėjo 27 d. rinktuose ėminiuose: atitinkamai 0,0039±0,002 proc. (neochlorogeno rūgštis) ir 0,0076±0,0003 proc. (chlorogeno rūgštis) (15 pav.).

15 pav. Neochlorogeno rūgšties ir chlorogeno rūgšties kiekio kitimas paprastųjų šermukšnių žievės ėminiuose vegetacijos metu

Paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose identifikuotas flavonoidas izokvercitrinas. Įvertinus izokvercitrino kiekinės sudėties varijavimą nustatyta, kad jo kiekis šermukšnio ţievėje vegetacijos metu įvairuoja nuo 0,0014 proc. iki 0,0027 proc. Didţiausias izokvercitrino kiekis (p<0,05) nustatytas ţydėjimo tarpsnio pradţioje - geguţės 10 dieną (0,0027±0,00006 proc.) rinktuose šermukšnių ţievės ėminiuose. Nuo geguţės 24 dienos iki rugpjūčio 2 dienos rinktuose ţievės ėminiuose izokvercitrino kiekis varijuoja nuo 0,0014 proc. iki 0,0017 proc. Vaisių nokimo tapsnio pabaigoje - rugpjūčio 16 dieną rinktuose ėminiuose, izokvercitrino kiekis padidėja (0,0024±0,00009 proc.) (16 pav.).

16 pav. Izokvercitrino kiekio įvairavimas paprastųjų šermukšnių žievės ėminiuose vegetacijos metu

17 pav. Šermukšnių vaisių etanolinio ekstrakto ESC chromatograma (λ=360 nm). 1 - neochlorogeno rūgštis, 2 - chlorogeno rūgštis, 3 - kavos rūgštis, 4 - rutinas, 5 - hiperozidas, 6 -

izokvercitrinas, 7 - astragalinas

Šermukšnių vaisiuose neochlorogeno rūgšties kiekis varijuoja nuo 0,1334 proc. iki 0,5120 proc., chlorogeno rūgšties kiekis įvairuoja nuo 0,0739 proc. iki 0,3651 proc. Didţiausias neochlorogeno rūgšties ir chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Panerių miške (Vilniaus rajonas): atitinkamai 0,5120±0,01 proc. (neochlorogeno rūgštis) ir 0,3651±0,07 proc. (chlorogeno rūgštis) Visose augimvietėse, išskyrus Panerių mišką (Vilniaus rajonas), paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose dominuoja chlorogeno rūgštis, o švedinio šermukšnio - neochlorogeno rūgštis (18 pav.)

18 pav. Šermukšnių vaisių neochlorogeno rūgšties ir chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos augimvietėse

kavos rūgšties kiekis - 0,0017±0,0001 proc., o Vyţuonų parke (Utenos miestas) rinktuose - 0,0006±0,0001 proc. (19 pav.).

19 pav. Šermukšnių vaisių ėminių kavos rūgšties kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos augimvietėse

Šermukšnių vaisiuose nustatyti flavonoidai: rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas ir astragalinas. Šermukšnių vaisiuose rutino kiekis įvairuoja nuo 0,0012 proc. iki 0,0209 proc., hiperozido - 0,0026-0,0204 proc., izokvercitrino - 0,0074-0,0139 proc. ir astragalino kiekis įvairuoja nuo 0 proc. iki 0,0022 proc. Didţiausias rutino ir hiperozido kiekis nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Balėnų miške (Maţeikių rajonas): atitinkamai 0,0108±0,0001 proc. (rutinas) ir 0,0204±0,0002 proc. (hiperozidas). Didţiausias izokvercitrino kiekis nustatytas paprastųjų šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Pilėnų miške (Kauno rajonas) (0,0139±0,0002 proc.), o astragalino – Pauslajo miške (Kėdainių rajonas) (0,0022±0,00001 proc.) rinktuose ėminiuose (20 pav.).

20 pav. Šermukšnių vaisių ėminių flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos augimvietėse

Švedinių šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose astragalinas neaptiktas. Švedinių šermukšnių vaisių ţaliavų ėminiuose, rinktuose Vyţuonų parke (Utenos miestas), nustatytas rutino kiekis - 0,0209±0,0004 proc., o Draugystės parke (Kauno miestas) rinktuose vaisių ţaliavų ėminiuose - 0,0022±0,0006 proc. Hiperozido ir izokvercitrino vaisiuose daugiau (p<0,05) kaupia Draugystės parke (Kauno miestas) augantis švedinis šermukšnis, atitinkamai (0,0042±0,0002 proc.) ir (0,0130±0,0002 proc.). Vyţuonų parke (Utenos miestas) augančio švedinio šermukšnio vaisių ţaliavų ėminiuose nustatyta 0,0026±0,0001 proc. hiperozido ir (0,0079±0,0002 proc.) izokvercitrino (7 pav.).

7. IŠVADOS

1. Nustatytas bendro fenolinių junginių, proantocianidinų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas vegetacijos metu paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose. Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas vaisių nokimo tarpsnyje - rugpjūčio 16 dieną (10,51±0,16 proc.) rinktuose ţievės ėminiuose, proantocianidinų – vaisių brandos tarpsnyje - rugsėjo 13 d. (4,92±0,09 proc.) rinktuose ėminiuose, o hidroksicinamono rūgšties darinių – butonizacijos tarpsnyje - balandţio 26 d. (0,38±0,01 proc.) rinktuose ţievės ėminiuose.

2. Spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis šermukšnių, augančių skirtingose Lietuvos augimvietėse, vaisių ėminiuose. Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas švedinio šermukšnio vaisių ėminiuose, rinktuose Draugystės parke (Kauno miestas), (2,36±0,05 proc.), paprastųjų šermukšnių vaisiuose šių junginių kiekis didţiausias, rinktuose Pauslajo miške (Kėdainių rajonas) (1,98±0,04 proc.), ėminiuose, o didţiausias hidroksicinamono rūgšties kiekis nustatytas paprastųjų šermukšnių, rinktuose Daumėnų miške (Panevėţio rajonas) (1,74±0,02 proc.), vaisių ėminiuose.

3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta paprastųjų šermukšnių ţievės fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis vegetacijos metu. Paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose atitinkamai nustatyta: neochlorogeno rūgštis (0,0039-0,1927 proc.), chlorogeno rūgštis (0,0076-0,0264 proc.) ir izokvercitrinas (0,0014-0,0027 proc.).

4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta skirtingose Lietuvos augimvietėse augančių šermukšnių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis: neochlorogeno rūgštis (0,1334-0,5120 proc.), chlorogeno rūgštis (0,0739-0,3651 proc.), kavos rūgštis (0,0006-0,0059 proc.), rutinas (0,0012-0,0209 proc.), hiperozidas (0,0026- 0,0204 proc.), izokvercitrinas (0,0074-0,0139 proc.) ir astragalinas (0-0,0022 proc.).

5. Nustatytas paprastųjų šermukšnių ţievės ėminių antioksidacinis aktyvumas vegetacijos metu. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas paprastųjų šermukšnių ţievės ėminiuose, rinktuose geguţės 10 dieną (949,54±10,24 µmol /g).

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Remiantis atliktais tyrimais rekomenduojama paprastųjų šermukšnių ţievės ėminius rinkti vaisių brandos tarpsnyje - nuo rugpjūčio mėnesio vidurio iki rugsėjo pradţios. Paprastųjų šermukšnių ţievė kaupia daugiau fenolinių junginių nei vaisiai, todėl būtų tikslinga atlikti tolimesnius paprastųjų šermukšnių ţievės tyrimus.

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. B. Aleksandravičiūtė, A. Bagdonaitė, S. Butkienė ir kt. Lietuvos TSR flora IV tomas. 1971; p. 245-249.

2. Hübschmann H. Handbook of GC/MS: Fundamentals and applications. 2nd edition p. Wennheim: Wiley. 719 s. 2009.

3. Prieiga internete: https://m-d.lt/straipsniai/sermuksnis-ir-jo-savybes/. Perţiūrėta: 2014.12.15. 4. Banga Grigaliūnaitė, Edvardas Meidus, Dalia Radaitienė. Šermukšnio (Sorbus L.) fitosanitarinė

būklė Vilniaus universiteto botanikos sode. Perţiūra internete: http://www.zak.lt/mokslo_darbai/2010_49_53.pdf. Perţiūrėta: 2015.01.18.

5. Plessi M., Bertelli D., Miglietta F. Extraction and identification by GC-MS of phenolic acids in traditional balsamic vinegar from Modena. J Food Comp Anal. 2006; 19: 49-54.

6. J. Ruolia, N. Vaitiekūnaitė. Krūtų vėţys, fitoterapijos svarba vėţio profilaktikai. Vilniaus universiteto Lietuvos onkologijos institutas. 2012.10.11.

7. Wild and show . The wild rowanberry. Wicklow. Nov. 19/20th 2011.

8. Simona Diana. Medicinal plants with antioxidant properties From banat region (Romania): a rich pool for the discovery of multi-target phytochemicals active in free-radical related disorders. Analele Universităţii din Oradea - Fascicula Biologie. XVII 2010; (1): 14-22.

9. United Stales Department of Agriculture. Classification for Kingdom Plantae Down to Species Sorbus aucuparia L. Natural Resourses Conservation Servise. Prieiga internete:

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=SOAU&display=31. Perţiūrėta: 2015.02.01.

10. Ewans William Charles.Trease and Evans Pharmacognosy. 16 edition 2009; p. 29.

11. Zywiec Magdalena, Ledwon Mateusz. Spatial and temporal patterns of rowan (Sorbus aucuparia L.) regeneration in West Carpathian subalpine spruce forest. Plant Ecology. 2008; (194): 283-291.

12. Olszewska M. Quantitative hplc analysis of flavonoids and chlorogenic acid in the leaves and inflorescences of Prunus serotina ehrh. Acta Chromatographica. 2007.

13. Raspe Olivier, Jacquemart Anne-Laure. Allozyme diversity and genetic structure of European populations os Sorbus aucuparia L. (Rosaceae: Maloideae). Heredity. 1998; 81: 537– 545.

14. Prieiga internete: http://treesforlife.org.uk/forest/species-profiles/rowan/. Perţiūrėta: 2015.02.02 15. Prieiga

16. Kylli P., Nohynek L., Puupponen-Pimiä R. Rowanberry phenolics: compositional analysis and bioactivities. 2010.

17. Olivier Raspe, Catherine Findlay, Anne - Laure Jacquemart. Sorbus aucuparia L. Journal of Ecology. 2000; 88: 910–930.

18. Monika A. Olszewskaa, Piotr Michela. Antioxidant activity of inflorescences, leaves and fruits of three Sorbus species in relation to their polyphenolic composition. Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters. Volume 23, Issue 16. 2009.

19. Kaspars Kampuss, Solvita Kampuse, Elga Bera. Biochemical composition and antiradical activity of rowanberry (Sorbus L.) cultivars and hybrids with different Rosacea L. cultivars. 2009.

20. Jiri Mlcek, Otakar Rop, Tűnde Jurikova. Bioactive compounds in sweet rowanberry fruits of interspecific Rowan crosses. Cent. Eur. J. Biol. 2014; 9(11): 1078-1086.

21. Harri Kokko, Anne Hukkanen, Sirpa Kärenlampi. Cultivated sweet rowanberries have high phenolic content and antioxidant capacity. Nordic Associationo f Agricultural Scientists NJF Report.Vol 3.Nr 1. 2007.

22. Health Benefits of Rowan Berries. Prieiga internete: https://www.organicfacts.net/health-benefits/fruit/rowan-berries.html. Perţiūrėta: 2015.03.07

23. Stewart B.W., Kleihues P., Eds. World Cancer Report. IARC Press: Lyon. 2003.

24. Seeram N. P. Berries. In: Nutritional Oncology, 2nd ed.; Heber, D.; Blackburn, G.; Go, V.L.W.; Milner J. Eds. Academic Press: London, U.K., Chapter 37, pp. 615-625. 2006

25. Manach C., Scalbert A., Morand C., Rémésy C., Jiménez L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 2004; 79(5): 727-747.

26. Stoner G.D., Wang L.S., Casto B.C. Laboratory and clinical studies of cancer chemoprevention by antioxidants in berries. Carcinogenesis. 2008; 29(9): 1665-1674.

27. Stoner G.D. Foodstuffs for preventing cancer: the preclinical and clinical development of berries. Cancer Prev. Res. (Phila). 2009; 2(3): 187-194.

28. Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol: from rodent studies to clinical trials. Cancer Prev. Res. (Phila). 2009; 2(5): 409-418.

29. Mattila P., Hellström J., Törrönen R. Phenolic acids in berries, fruits, and beverages. J. Agric. Food Chem 2006; 54(19): 7193-7199.

30. Liu R.H. Potential synergy of phytochemicals in cancer prevention:mechanism of action. J. Nutr. 134(Suppl. 1). 2004; S3479-S3485.