FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GEDIMINAS ZVICEVIČIUS

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES

ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

Recenzentas: Darbą atliko

Doc. dr. Andrejus Ževžikovas Magistrantas

Gediminas Zvicevičius

TURINYS

3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 10

3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai ... 10

3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ... 12

3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai ... 16

3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas ... 16

3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai ... 17

3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai ... 19

4. TYRIMO METODIKA ... 21 4.1. Tyrimo objektas ... 21 4.2. Naudoti reagentai ... 21 4.3. Naudota aparatūra ... 21 4.4. Tyrimo metodai ... 22 5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 27

5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 29

5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 31

5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių minkštimuose ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 33

5.5. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu ... 37

5.5.1. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 37

5.5.2. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 39

5.5.3 Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP

metodu ... 40

5.6. Flavonoidų, fenolinių junginių ir proantocianidinų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo koreliacinių ryšių vertinimas ... 42

5.7. Kiekybinis pektinų įvertinimas gravimetriniu metodu ... 43

6. IŠVADOS ... 45

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47

SANTRAUKA

G. Zvicevičiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Prof., habil. dr.Valdimaras Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Malus, obuoliai, fenoliniai junginiai, flavonoidai, proantocianidinai, pektinai, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas.

Tyrimo objektas ir metodai: Obuolių žievelių ir minkštimų ėminių ekstraktai. Bendro fenolinių junginių kiekio, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio nustatymas atliktas spektrofotometriniu metodu. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta efektyviosos skysčių chromatografijos metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS, DPPH, FRAP reagentus. Pektinų kiekybinė sudėtis nustatyta gravimetriniu metodu.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvairavimą. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį. Nustatyti obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius. Nustatyti pektinų kiekį obelų obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.

Išvados: Veislės „Aldas" obuolių žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių (3,37±0,03 proc.), flavonoidų (0,24±0,003 proc.) ir proantocianidinų (0,29±0,006 proc.) kiekiai. Veislės „Lodel" obuolių minkštimuose nustatyti didžiausi fenolinių junginių (2,60±0,05 proc.), flavonoidų (0,03±0,001 proc.) ir proantocianidinų (0,21±0,007 proc.) kiekiai. „Aldas" ir „Lodel" veislių obuolių minkštimuose ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu didžiausiais kiekiais nustatyti tie patys junginiai (chlorogeno rūgštis, procianidinas B2, (-)-epikatechinas). Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislės „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g) obuolių žievelėse. Iš minkštimų didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g) minkštimai. Stipriausias koreliacinis ryšys nustatytas tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatyto DPPH metodu (0,953). Didžiausias pektinų kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių žievelėse (13,3±0,5 proc.) ir minkštimuose (16,2±0,6 proc.).

SUMMARY

Key words: Malus, apple, phenolics, flavonoids, proanthocyanidins, pectin, high performance liquid chromatography, spectrophotometry, antioxidant activity.

Object and methods: Apple peel and pulp extracts. Quantitative analysis of

the total content of phenolic compounds, flavonoids and proanthocyanidins was assesed by spectrophotometry. Qualitative and quantitative determination of phenolic compounds was performed using high performance liquid chromatography. The antioxidant activity was assesed by ABTS, DPPH and FRAP spectrophotometric methods. Pectin content was determined by a gravimetric method.

Aim: to determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of apple peels and pulp of apple cultivars grown in Lithuanian climatic conditions and to assess the antioxidant activity of their extracts.

Objective: to determine of the phenolic compounds quantitative composition variation of apple peels and pulp of apple cultivars 'Ligol', 'Connel Red', 'Aldas', 'Auksis', 'Rajka' and 'Lodel'. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of apple peels and pulp of apple cultivars 'Aldas' and 'Lodel' using high performance liquid chromatography. To assess the antioxidant activity of apple peel and pulp extracts. To evaluate the correlation between the total phenolic, flavonoid and proanthocyanidin content in apple peels and pulp and the antioxidant activity of their extracts. To determine the pectin content in apple peels and pulp.

Conclusions: among apple peels the highest amount of phenolic compounds (3,37±0,03%), flavonoids (0,24±0,003%) and proanthocyanidins (0,29±0,006%) were determined in the peels of cultivar 'Aldas'. Among apple pulp the highest amount of phenolic compounds (2,60±0,05%), flavonoids (0,03±0,001%) and proanthocyanidins (0,21±0,007%) were determined in the peels of cultivar 'Lodel'. 11 phenolic compounds were identified and quantified in apple peels and pulp of cultivars 'Aldas' and 'Lodel'. Chlorogenic acid, procianydin B2 and (-)-epicatechin were the main phenolic compounds found in both apple cultivars. The highest antioxidant activity in apple peels was determined in cultivar 'Aldas' (119,86±3,23 µmol TE/g) and the highest antioxidant activity in apple pulp was determined in cultivar 'Auksis' (77,43±3,56 µmol TE/g). The strongest correlation (0,953) was determined to be between the total amount of phenolic compounds and the antioxidant activity, determined by the DPPH method. The highest pectin amount was determined in cultivar 'Rajka' peels (13,3±0,5%) and pulp (16,2±0,6%).

1. SANTRUMPOS

DMD-MS – diodų matricos detektorius su masių spektrometru;

DMD-MS/MS – diodų matricos detektorius su tandeminine masių spektrometrija; DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power); GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent);

KE-ED – kapiliarinė elektroforezė su elektrochemine detekcija; MS – masių spektrometras;

MS/MS – tandeminė masių spektrometrija;

TAE – tanino rūgšties ekvivalentas (angl. Tannic acid equivalent); TE – trolokso ekvivalentas;

TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas; UV – ultravioletinė spinduliuotė.

2. ĮVADAS

Vaistinių augalinių žaliavų, maisto produktų ir maisto papildų tyrimai yra ypač aktualūs. Siekiant vaistines augalines žaliavas panaudoti ligų profilaktikai, būtina nustatyti profilaktinėmis ar gydančiomis sąvybėmis pasižyminčius biologiškai aktyvius junginius bei nustatyti šių junginių cheminės sudėties įvairavimą skirtingose augalo rūšyse ir organuose. Lėtinių ligų profilaktikai gali būti naudojami ne tik vaistiniai augalai, bet ir biologiškai aktyvias medžiagas kaupiančios daržovės ar vaisiai, kurie dažnai kaupia didelius kiekius fenolinių junginių, pasižyminčių antioksidaciniu aktyvumu.

Obuoliai yra vieni svarbiausių vidutinio klimato juostoje auginamų vaisių [52, 77, 98]. 2012 m. duomenimis, visame pasaulyje yra išauginama 76.38 milijonų tonų obuolių per metus. Obuoliai yra vieni dažniausiai Lietuvoje vartojamų vaisių. 2012 m. Lietuvoje buvo išauginta 72.5 tūkstančių tonų obuolių [100]. Obuoliai vartojami švieži, naudojami sulčių, sidro, vyno gamyboje. Obelų vaisiai yra angliavandenių, mineralinių medžiagų, maistinių skaidulų bei fenolinių junginių šaltinis. Obuoliai kaupia kvercetino glikozidus, epikatechiną, chlorogeno rūgštį, procianidinus ir dihidrochalkonus. Šie junginiai pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu in vitro [49].

Pastaraisiais metais epidemiologinių ir biocheminių tyrimų metu nustatytas reikšmingas ryšys tarp reguliaraus vaisių ir daržovių vartojimo bei jų įtakos širdies ligų, vėžio ir kitų degeneracinių ligų profilaktikai [35, 82, 89]. Atlikta daug mokslinių tyrimų, kurių rezultatai rodo teigiamą fenolinų junginių poveikį žmogaus organizmui. Įrodytas priešvėžinis poveikis [72, 80], antivirusinis veikimas prieš Herpes simplex padermes [32], antialerginis [22, 41, 87], trigliceridų ir mažo tanko lipoproteinų kiekį mažinantis, lipidų oksidaciją slopinantis poveikis [57, 86]. Obuoliuose esantys fenoliniai junginiai gali apsaugoti virškinamojo trakto ląsteles nuo neigiamo nesteroidinių vaistų nuo uždegimo poveikio [16], mažina astmos ir diabeto riziką [13]. Ankstesnių, kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad obuoliai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis sąvybėmis, kurios siejamos su fenolinių junginių kiekiu [55, 88].

Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis obuoliuose kinta priklausomai nuo auginimo technologijos, klimatinių sąlygų ypatymų, laikymo sąlygų ir obelų veislės. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad skirtingose obuolio dalyse fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis skiriasi [24, 44, 77]. Biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas obuolių žievelėse bei minkštimuose turi įtakos fenolinių junginių kiekiui obuolių produktuose. Obuoliai yra fenolinius junginius kaupianti augalinė žaliava, panaudojama kasdienėje mityboje, maisto produktų bei maisto papildų gamyboje. Fenolinių junginių kiekis skirtingų veislių obuoliuose ir obuolio dalyse gali

skirtis, todėl verta nustatyti fenolinių junginių kiekio įvairavimų dėsningumus skirtingų Lietuvoje auginamų obelų veislių obuolių žievelėse ir minkštimuose.

Darbo tikslas:

Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvairavimą.

2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį.

3. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

4. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

5. Nustatyti pektinų kiekį obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai

Obels (Malus Mill.) gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai

.

plačiai paplitusi pasaulyje, ypač vidutinio klimato juostoje [52]. Gentį sudaro 55 rūšys, iš kurių Europoje labiausiai paplitusi naminė obelis (Malus domestica Borkh.) ir miškinė obelis (Malus

sylvestris Mill.) [38,65].

M. domestica Borkh. geba prisitaikyti prie įvairių klimato sąlygų, tačiau geriausiai auga

vėsesnio klimato juostoje (35-50° šiaurės platumos), vandeniui pralaidžioje dirvoje, kurios pH 6-7. Obelis auga šiauriau nei daugelis kitų vaismedžių dėl vėlyvo žydėjimo bei didelio atsparumo šalčiui. Vaisiai sunoksta praėjus 120 – 150 dienų nuo žydėjimo pabaigos. Yra rūšių, kurios sunokina vaisius po 70 ar po 180 dienų [61].

Obelys yra vasaržaliai, daugiamečiai medžiai, užaugantys iki 3 – 12 m. aukščio. Lapai tamsiai žalios spalvos, ovalūs, dantytu kraštu, smailia viršūne. 5-12 cm ilgio, 3-6 cm pločio [61]. Obelų žiedai turi 5 taurėlapius ir 5 vainiklapius, kurių spalva gali kisti nuo baltos iki ryškiai rausvos [37], skersmuo 2,5-3,5 cm [61]. 20 kuokelių su geltonomis dulkinėmis yra išsidėstę trimis ratais (10+5+5). Mezginė apatinė su 3-5 lizdais. Liemenėliai penki, tarpusavyje suaugę [37]. Sėklų skaičius yra 5 – 15 [61], nors tam tikros atmainos gali išauginti iki 30 sėklų [37].

Obuoliai priklausomai nuo veislės yra labai įvairios, dažniausiai rutuliškos formos [1] ir labai įvairaus dydžio (nuo 5 cm iki 9 cm ir daugiau) [61], įvairių spalvų ir skonio, su išliekančiais taurėlapiais viršuje. Sėklos pailgai kiaušiniškos, iš šonų suplotos, dažniausiai vienu lygiu ar įgaubtu šonu, kitu – išgaubtu, pilkai rudos spalvos, matiniu, truputi blizgančiu paviršiumi, 6-7 mm ilgio, 3,5-4,5 mm pločio, 1,8-2,1 mm storio [1].

3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai

Yra atlikta daug obuolių cheminės sudėties tyrimų. Daugumoje tyrimų nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis obuoliuose. Dažnai nustatoma fenolinių junginių grupių arba atskirų junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Dalies tyrimų objektas yra obuolių žievelės ir minkštimai. Rečiau tiriamos obuolių sėklos ir obelų lapai.

Skirtingų obelų veislių obuoliuose nustatoma skirtinga fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties pokyčiams obuoliuose didžiausią įtaką daro augalo genotipas, vaisiaus subrendimo lygis ir mažiau klimatiniai aplinkos veiksniai [61]. Obuoliuose kaupiami fenoliniai junginiai skirstomi į du pagrindinius pogrupius: flavonoidus ir fenolines rūgštis. Svarbiausi obuoliuose nustatyti flavonoidai yra kvercetino glikozidai (avikuliarinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, rutinas, kvercetino-3-O-ksilozidas, kvercetino-3-O-arabinozidas), flavan-3-oliai - (+)-katechinas ir (−)-epikatechinas bei jų oligomerai - procianidinai B1, B2 ir C1, polimeriniai procianidinai, dihidrochalkonai – floridzinas ir floretinas [3, 46,78]. Obuoliuose nustatytos fenolinės rūgštys: chlorogeno rūgštis bei p-kumarokvinino rūgštis [3, 54].

Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 662 µg/g iki 4291 µg/g [3, 92]. Kvercetino glikozidų nustatyta 41,0 µg/g - 87,0 µg/g [54], (+)-katechino 50,1 µg/g – 148,2 µg/g, (−)-epikatechino 236,5 µg/g – 684,0 µg/g, procianidino B1 39,6 µg/g – 108,1 µg/g, procianidino B2 320,9 µg/g – 931,2 µg/g, floridzino 63,8 µg/g - 142,4 µg/g, chlorogeno rūgšties 341,3 µg/g – 2228,4 µg/g [3, 46].

Obuolių žievelėse vyraujantys fenoliniai junginiai yra procianidinai, (+)-katechinas, (−)-epikatechinas, chlorogeninė rūgštis, floridzinas, floretino-29-ksilozidas, kvercetino glikozidai, cianidin-3-O-galaktozidas [23, 26, 78]. Minkštimuose nustatyti mažesni, nei žievelėse (+)-katechino, (−)-epikatechino, procianidinų kiekiai. Obuolių minkštimuose chlorogeno rūgštis nustatoma didesniais kiekiais, nei žievelėse [8, 46, 78]. Fenolinių junginių kiekybinė sudėtis yra didesnė obuolių žievelėse, tačiau žievelės sudaro iki 10 proc. obuolių masės. Svarbesni yra obuolių minkštimai, nes jie sudaro didžiąją dalį obuolių masės [90].

Obuoliuose nustatyta pektinų - polisacharidų, sudarytų iš galakturono rūgšties fragmentų. Dėl gelifikuojančių savybių pektinai naudojami maisto, farmacijos ir kosmetikos pramonėje. Viena iš pramonėje naudojamų pektinų žaliavų yra obuoliai. Pektinų kiekiai obuoliuose, priklausomai nuo veislės ir ekstrakcijos sąlygų kinta nuo 3.4 proc. iki 15 proc. absoliučiai sausos žaliavos masės [27, 50].

Obelų lapuose nustatyti fenoliniai junginiai yra floridzinas, 3-hidroksifloridzinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercetino-3-O-ksilozidas, kvercetino-3-O-galaktozidas, avikuliarinas, apigeninas, mirecetinas, rutinas, kvercitrinas, kemferolis, izoramnetinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas,

chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis [4, 63, 66]. Iš obelų lapų išskirti ir identifikuoti triterpenai (ursolo ir oleaninė rūgštys), karotenoidai (α- tokoferolis) ir eteriniai aliejai (eukaliptolis, fitolis ir α-farnesenas) [51]. Literatūros duomenimis, obelų lapuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali

įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 58,28 mg/g iki 163,35 mg/g [4, 45]. Floridzino nustatyta 54,1 mg/g - 140,0 mg/g [4, 63], chlorogeno rūgšties 0,11 mg/g - 1,38 mg/g, kavos rūgšties 0,14 mg/g - 0,30 mg/g, (+)-katechino 0,05 mg/g - 0,82 mg/g, (-)-epikatechino 0,38 mg/g - 1,67 mg/g, rutino 0,03 mg/g - 8,85 mg/g, kvercitrino 0,61 mg/g - 9,01 mg/g [4, 45].

3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai

Tiriant augalinių žaliavų, maisto produktų, maisto papildų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, vienas svarbiausių analizės etapų yra fenolinių junginių ekstrakcija. Mėginių ekstrakcijos procedūros dažnai yra laikomos silpnuoju analitinio metodo etapu. Klasikiniai mėginių paruošimo metodai pasižymi ilga vykdymo trukme, dideliu sunaudojamu tirpiklių kiekiu bei yra bent trečdalio tyrimo klaidų priežastis [43, 78].

Tiriama įvairių obuolių produktų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis – sulčių, sidro, išspaudų, minkštimų, žievelių bei pilnų vaisių. Mėginio ekstrakcijos metodas priklauso nuo tiriamo objekto. Fenolinių junginių ekstrakcijai iš skystų obuolių produktų (sulčių, sidro) plačiausiai naudojama skysčių-skysčių ekstrakcija. Tai nebrangus metodas, tačiau jam būdingas ilgas vykdymo laikas. Tiriant skystus obuolių produktus, dažnai naudojamas kietafazės ekstrakcijos metodas [76]. Analizuojant išspaudas, minkštimus, žieveles bei pilnus vaisius, dažniausiai naudojama kieto mėginio ekstrakcija skysčiais ir dažnai vykdomas tolimesnis ekstrakto valymas, siekiant pašalinti angliavandenius, chlorofilą, karotenoidus, lipidus [73, 76, 77]. Įprastus metodus keičia modernūs ekstrakcijos metodai, tokie kaip superkritinių skysčių ekstrakcija, ekstrakcija suslėgtais skysčiais, ekstrakcija mikrobangų pagalba, ekstrakcija ultragarso pagalba. Šie ekstrakcijos metodai reikšmingai sumažina sunaudojamų tirpiklių kiekį, pagreitina ekstrakcijos procesą ir pagerina išeigą [76].

Fenolinių junginių ekstrakcija maceracijos metodu. Fenilkarboksi rūgščių ir kitų fenolių (benzoinės rūgšties, benzoinės rūgšties aldehidų, cinamono rūgšties ir katechinų) ekstrakcijai iš kietų ar puskiečių mėginių gali būti naudojama maceracija organiniais tirpikliais. Metodas reikalauja brangių, pavojingų sveikatai ir ekologinei sistemai organinių tirpiklių. Fenolinių junginių ekstrakcijai maceracijos būdu naudojami metanolis, etanolis, propanolis, acetonas, etilacetatas, jų tarpusavio mišiniai ir mišiniai su vandeniu. Ekstrakcija maceracijos būdu yra ilgai trunkantis procesas. Dėl ilgos ekstrakcijos trukmės yra tikėtinas junginių suirimas ir mažesnė fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga. Junginių suirimui įtakos turi šviesa ir aplinkos temperatūra. Fenolinių junginių ekstrakcijos trukmė priklauso nuo ekstrahuojamų junginių tirpumo, jų koncentracijos ekstrahuojamame objekte, pasirinkto

organinio tirpiklio ir jo tūrio santykio su mėginio mase. Dėl išvardintų priežasčių maceracijos metodas dažnai keičiamas atrankesniais, pigesniais, greitesniais ir ekologiškesniais augalinių žaliavų

ekstrakcijos metodais [76].

Fenolinių junginių ekstrakcija ultragarso pagalba. Obuolių išspaudų, obuolių ir jų minkštimų bei žievelių ekstrakcijai dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba [3, 69, 77]. Ultragarso savybė padidinti organinių junginių ekstrakcijos iš kietų objektų efektyvumą siejama su kavitacijos fenomenu, kuris inicijuojamas ultragarso bangai sklindant tirpikliu. Kavitacijos metu tirpiklyje esantys dujų burbulai dėl jų viduje staiga padidėjusio slėgio ir temperatūros sprogsta. Kavitacinio burbulo sprogimas šalia kieto paviršiaus (pvz. ląstelės sienelės) sukelia staigų tirpiklio judėjimą link ląstelės sienelių, taip didėjant tirpiklio skvarbumui į ląstelę bei kontaktinio paviršiaus tarp kietos ir skystos fazės plotui. Kuriant ekstrakcijos ultragarso pagalba metodikas, optimizuojamas ekstrahento poliškumas ir jo kiekis, mėginio masė, ekstrakcijos temperatūra ir laikas bei ultragarso šaltinio parametrai (dažnis ir intensyvumas). Svarbiausi iš šių parametrų yra ekstrakcijos tirpiklis bei jo santykis su vandeniu, ekstrakcijos temperatūra ir laikas [43].

Obuolių mėginių ekstrakcijai naudojant ultragarsą naudojami skirtingi tirpikliai: etanolio ir vandens (70:30 v/v) mišinys [3], metanolio-vandens-acto rūgšties (30:69:1, v/v/v) mišinys [69]. Alonso-Salces ir kt. atlikto tyrimo metu fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų vykdyta dviem etapais. Pirmojo etapo metu vykdyta ekstrakcija ultragarso vonelėje tirpikliu naudojant etilacetatą. Nufiltravus netirpų likutį ir iš filtrato išgarinus etilacetatą, tirpus etilacetate sausas likutis ultragarso vonelėje ekstrahuotas dichlormetanu. Netirpus dichlormetane likutis frakcionuojamas chromatografinėje kolonėlėje užpildytoje Sephadex LH-20 [77].

Ekstrakcija ultragarso pagalba yra vienas pigiausių, paprasčiausių, greičiausiai atliekamų ir ekologiškiausių ekstrakcijos metodų. Dėl gero atkartojamumo, mažo sunaudojamo tirpiklių kiekio ir žemos ekstrakcijos temperatūros ekstrakcija ultragarso pagalba pritaikoma daugybės skirtingų biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų [19, 99]. Metodas pritaikomas maisto, chemijos pramonėje [47].

Fenolinių junginių ekstrakcija mikrobangų pagalba. Fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių naudojant mikrobangas pasižymi pranašumu prieš tradicinius ekstrakcijos metodus, kadangi reikšmingai sutrumpinamas ekstrakcijos laikas, sumažinamas sunaudojamų tirpiklių kiekis kartu didėjant fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai [17].

Ekstrakcija mikrobangų pagalba yra paremta polinių cheminių junginių gebėjimu absorbuoti mikrobangų energiją. Mikrobangomis gali būti veikiami tik tie mėginiai, kurie savo sudėtyje turi dipolinių medžiagų arba mikrobangų absorbentų, kurie mikrobangų poveikyje greitai didina mėginio vidaus temperatūrą. Ekstrakcijos mikrobangų pagalba efektyvumas priklauso nuo tirpiklio bei

ekstrahuojamų medžiagų savybių ir ypač nuo jų dielektrinės konstantos [43]. Poliniai tirpikliai mikrobangų aplinkoje greičiau įkaista, efektyviau ardo biologines struktūras bei pasižymi didesne išeiga [20]. Mikrobangos gali būti naudojamos selektyviam, greitam ir lokalizuotam mėginyje esančio vandens temperatūros padidinimui. Toks lokalus mėginio ląstelių vidaus temperatūros padidėjimas sukelia greitą ekstrahuojamų medžiagų perėjimą į ekstrahentą [43]. Ekstrakcijos mikrobangomis procesui įtaką daro keletas parametrų. Vystant ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodus, įprastai optimizuojama tirpiklio rūšis, tirpiklio tūris, mikrobangų galingumas, ekstrakcijos trukmė bei ekstrahuojamo mėginio charakteristikos [20].

Literatūroje aprašyti fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių produktų metodai naudojant mikrobangas. Bai ir kt. [10], Rezaei ir kt. [74] bei Chandrasekar ir kt. [17] atliko tyrimus, kurių metu atlikta fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų. Tyrimų metu siekta optimizuoti fenolinių junginių ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodikas. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga bei metodikų parametrai buvo lyginami su kitais ekstrakcijos metodais. Tyrimų metu ekstrakcijai naudotas 60-65 proc. (v/v) koncentracijų etanolis. Tyrimuose nustatyti panašūs optimalūs tirpiklio ir mėginio santykiai (20:1 ir 22.9:1 (v/v)), o Chandrasekar ir kt. nustatė kitokį optimalų etanolio ir sausos mėginio masės santykį (10.3:1 (v/m)). Optimalus ekstrakcijos laikas bei mikrobangų galingumas varijavo: 650.4 W ir 53.7 s., 90 W ir 20 min., 735 W ir 149 s. Atitinkamai ženkliai skyrėsi fenolinių junginių išeiga: 0.63±0.0035 mg GAE/g, 235±12 mg TAE/g, 15.8 mg GAE/g). Bai ir kt. bei Rezaei ir kt. atliktų tyrimų metu ekstrakcija mikrobangų pagalba buvo lyginama su įprastiniais ekstrakcijos metodais (maceracija, ekstrakcija Soksleto aparate, ekstrakcija ultragarso pagalba bei ekstrakcija su grįžtamuoju kondensatoriumi).

Tyrimų autoriai nustatė, kad ekstrakcija mikrobangų pagalba yra pranašesnė už minėtus metodus dėl didesnės fenolinių junginių išeigos, trumpesnės ekstrakcijos trukmės bei mažesnių tirpiklių sąnaudų [10, 17, 74].

Fenolinių junginių ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Ekstrakcija suslėgtais skysčiais dar vadinama pagreitinta ekstrakcija tirpikliais, ultra aukšto slėgio ekstrakcija. Ekstrakcijos metu naudojami įprasti organiniai tirpikliai, aukštas slėgis ir (arba) aukšta temperatūra. Ekologiški, ekstrakcijai naudojantys vandenį, ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodai – ekstrakcija suslėgtu karštu vandeniu ir ekstrakcija superkarštu vandeniu. Tai vienas iš modernių kietų mėginių ekstrakcijos metodų. Įprastai, naudojant ekstrakciją suslėgtais skysčiais, kietas mėginys talpinamas į nerūdijančio plieno ekstrakcijos kamerą ir ekstrahuojamas tinkamu tirpikliu, esant aukštai temperatūrai (40–200 ºC) ir slėgiui (500-3000 psi). Ekstrakcija vykdoma trumpai (5–15 min). Ekstrahavimo pabaigoje mėginio ekstraktas suslėgtų dujų pagalba išstumiamas į surinkimo indą [76].

Alonso-Salces ir kt. atliko fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties įvertinimą obuolių minkštimuose ir žievelėse. Fenolinių junginių ekstrakcijai naudota ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Prieš ekstrakciją, siekiant sumažinti tirpiklių sąnaudas, liofilizuoti obuolių minkštimų ir žievelių mėginiai buvo sumaišyti su dispersine medžiaga diatomitu. Ekstrakcijos tirpikliu naudotas grynas metanolis, kadangi preliminarių tyrimų metu nustatyta, kad bet koks vandens kiekis ekstrakcijos sistemoje mažina tyrimo tikslumą, santykinei paklaidai didėjant iki 10-20 proc. Parinkta 40 ºC ekstrakcijos temperatūra, statinės ekstrakcijos trukmė - 5 min., slėgis 1000 psi [78]. H. Wijngaard atlikto tyrimo metu tirtas obuolių išspaudų antioksidacinis aktyvumas. Fenolinių junginių išskyrimui naudota pagreitinta ekstrakcija tirpikliais naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, 102 °C temperatūrą.

Autorių duomenimis, lyginant su tradicine kietų mėginių ekstrakcija skysčiais, naudojant ekstrakciją suslėgtais skysčiais, nustatytas 2,4 karto didesnis antioksidacinis ekstraktų aktyvumas [95]. Ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodo pranašumai yra mažas sunaudojamas tirpiklio kiekis, trumpa ekstrakcijos trukmė, galimybė naudoti tirpiklius esant aukštesnei nei jų virimo temperatūrai [76, 79].

Kietafazė ekstrakcija. Kietafazė ekstrakcija yra mėginio paruošimo metodas, naudojamas analičių ekstrakcijai iš skystos terpės, jų išskirstymui ir koncentravimui. Kietafazė ekstrakcija paremta junginių pasiskirstymu tarp kietos sorbento fazės ir skystos mėginio fazės. Kietafazės ekstrakcijos principas yra panašus į skysčių chromatografijos. Ekstrakcijos procesas susideda iš keturių etapų: kolonėlės kondicionavimo, mėginio pakrovimo, plovimo, analičių eliuavimo. Ekstrakcijos proceso vystymo metu, atsižvelgiant į analičių ir mėginio terpės savybes, būtina pasirinkti tinkamus sorbentus, plovimo tirpalą ir eiliuavimo tirpalą, kuris turi būti suderinamas su tolesnei analizei naudojama

analitine sistema [43].

Yra optimizuotas mažos molekulinės masės fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių sidro mėginių metodas, naudojant Extra-Sep C18 kolonėlę. Fenoliniai junginiai ekstrahuojami ir frakcionuojami į neutralius ir rūgštinius junginius. Tolimesnis skirstymas ir kokybinės bei kiekybinės sudėties nustatymas vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [67, 85]. Lyginant su skysčių-skysčių ekstrakcija naudojant etilacetatą, kietafazės ekstrakcijos metodas pasižymi didesne išeiga [67].

Lyginant su skysčių-skysčių ekstrakcija, kietafazė skystų mėginių ekstrakcija pasižymi šiais privalumais: didesnė išeiga, efektyvesnis junginių koncentravimas, naudojami mažesni organinių tirpiklių kiekiai, nėra putojimo ar emulsijų formavimo problemos, trumpesnė proceso vykdymo trukmė, paprastesnis atlikimas, procesą lengviau automatizuoti. Metodo trūkumai: prastas atkartojamumas, reikalingos brangios medžiagos [43].

3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai

Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties augalinėje žaliavoje nustatymas yra svarbus siekiant nustatyti augalinės žaliavos cheminę sudėtį bei įvertinti žaliavos kokybę. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui yra sukurta įvairių metodų. Plačiausiai naudojami metodai yra ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Rečiau naudojama kapiliarinė elektroforezė, dujų chromatografija, ciklinė voltamperometrija [2, 7].

3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant aliuminio (III) chloridą. Metodo principas yra aliuminio (III) chlorido ir flavonų bei flavonolių komplekso sudarymas. Aliuminio (III) chloridas geba sudaryti rūgščioje aplinkoje stabilius kompleksus, jungdamasis su C-4 keto grupe bei su C-3 arba C-5 hidroksi grupėmis esančiomis flavonų bei flavonolių struktūroje [18].

Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometru yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Šiuo metu naudojamos įvairios metodo modifikacijos.

Modifikacijas galima suskirstyti į dvi pagrindines rūšis. Pirmuoju atveju naudojamas 2-10 proc. (m/v) koncentracijos AlCl3 tirpalas. Reakcija vykdoma acto rūgšties arba natrio acetato aplinkoje. Šviesos absorbcija matuojama po 2-60 min. esant 404–430 nm šviesos bangos ilgiui. Rezultatai išreiškiami skirtingų flavonolių (kvercetino, rutino, kvercitrino, galangino) arba katechino ekvivalentais. Antruoju atveju kompleksacijos reakcija vykdoma bazinėje terpėje, pridėjus NaNO2. Šios metodo modifikacijos esmė – aromatinio žiedo, turinčio katecholio grupę su laisvomis trimis ar keturiomis pozicijomis nitrinimas. Matuojama 510 nm ilgio šviesos absorbcija. Rezultatai išreiškiami katechino ekvivalentais [64].

Pirmasis metodas yra jautrus tik flavonoliams ir flavonui liuteolinui. Antrasis metodas, atliekamas bazinėje terpėje, yra jautrus rutinui, liuteolinui, katechinams bei fenolinėms rūgštims. Tiriant tuos pačius augalinės kilmės mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi rezultatai [64].

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant

2,4-Dinitrofenilhidraziną. Šio metodo principas yra 2,4-dinitrofenilhidrazino gebėjimas jungtis su ketonais ir aldehidas, sudarant 2,4-dinitrofenilhidrazonus. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje. Matuojama 495 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [18]. Reagentas naudojamas nustatyti flavonoliams (rutinui, kvercitrinui, morinui) ir flavonams (diosminui, daflonui) [56], dihidroflavonams. Standartu naudojamas pinocembrinas [39].

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Reagentą sudaro 100 ml natrio volframato dihidrato, 25 ml natrio molibdato dihidrato, 50 ml 85 proc. fosforo rūgšties tirpalo ir 100 ml 36 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo [84].

Metodas paremtas nespecifine fenolinių junginių oksidacija dviem stipriais neorganiniais oksidatoriais (fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis) bazinėje terpėje. Reakcija vykdoma 30 min [28, 40, 64] arba mišinys 5 min. pašildomas vandens vonioje esant 50°C [84]. Matuojama 760-765 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [28, 40, 84]. Naudojant šį metodą, priklausomai nuo fenolinių junginių struktūros gaunami skirtingi rezultatai,. Folin-Ciocalteu reagentas kartu su fenoliniais junginiais gali oksiduoti ir keletą ne fenolinių organinių junginių bei tam tikras neorganines medžiagas, taip pervertinant fenolinių junginių kiekį mėginyje [64]. Nepaisant galimo fenolinių junginių kiekio pervertinimo,

Folin-Ciocalteu metodas labai plačiai taikomas fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui augalinės kilmės mėginiuose [28, 40, 64, 84]. Tai greitas, sudėtingos ir brangios įrangos nereikalaujantis

metodas.

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Berlyno mėlynąjį. Metodas pagrįstas fenolinių junginių reakcija su K4Fe(CN)6 ir FeCl3 rūgštiniu tirpalu. 700 nm bangos ilgio šviesos absorbcija matuojama po 7 min [28, 30].

Taip pat aprašyta metodo modifikacija, kuomet vietoje FeCl3 kaip pirmasis reagentas naudojamas FeNH4(SO)4 rūgštinis tirpalas. Taip išvengiama FeCl3 tirpumo problemos. Matuojama 720 nm bangos ilgio šviesos absorbcija vienos minutės intervalais [31].

3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai

Iš visų augalinių žaliavų mėginių tyrimo metodų chromatografinė analizė užima vieną svarbiausių vietų augalinių žaliavų analizės pasaulyje. Chromatografiniai analizės metodai yra randami visose farmakopėjose. Dėl reikšmingų privalumų, tokių kaip didelis specifiškumas ir galimybė metodą panaudoti kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui, chromatografiniai analizės metodai dažnai

sudaro esminę vaistinių augalinių žaliavų mėginių analizės metodikų dalį. Fitocheminėje analizėje dažniausiai naudojami šie chromatografiniai metodai: vienos ir dviejų krypčių popieriaus chromatografija, vienos ir dviejų krypčių plonasluoksnė chromatografija, kolonėlinė skysčių chromatografija, jonų mainų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija.

Visos chromatografijos rūšys yra paremtos tuo, kad esant tokioms pačioms sąlygoms, kiekvienas mišinyje esantis junginys su aplinka sąveikauja skirtingai. Chromatografija yra mišinio sudedamųjų dalių išskirstymo metodas. Judančiojoje fazėje (eliuente) esantys tiriamojo mėginio junginiai, judėdami per nejuntančiąją (stacionarią) fazę, dėl kiekvieno junginio savitos sąveikos su nejudančiąja faze, yra sulaikomi ant nejudančiosios fazės. Sulaikymo trukmė yra skirtinga ir specifiška kiekvienam junginiui [15].

Efektyvioji skysčių chromatografija. Efektyvioji skysčių chromatografija yra pirmo pasirinkimo metodas kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje. Dėl fenolinių junginių struktūros panašumo bei didelio skirtingų junginių kiekio ESC yra vienas tinkamiausių metodų fenolinių junginių analizei. Lyginant su įprasta kolonėline chromatografija, efektyvioji skysčių

chromatografija turi daug privalumų. Metodas pasižymi greita vykdymo trukme – mėginio analizė gali būti įvykdoma greičiau nei per 1 valandą. ESC yra jautrus metodas, pasižymintis aukšta rezoliucija. Galima kokybinė ir kiekybinė mėginio analizė, mėginiai nėra suardomi, reikalingas labai mažas mėginio kiekis. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu galima analizuoti daugybę skirtingų junginių: nukleotidus, nukleozidus, vaistus ir jų metabolitus, steroidus, alkaloidus, vitaminus, amino rūgštis, lipidus, baltymus, antioksidantus ir daugybę kitų junginių grupių. Iš esmės bet kuris tirpus junginys gali būti analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [15].

Fenolinių medžiagų išskirstymui naudojama skirtingų parametrų efektyvioji skysčių chromatografija. Naudojamos C18 50-300 mm ilgio kolonėlės su nuo 1,8 iki 5 µm dydžio dalelėmis. Mažiausi kolonėlių ilgiai naudojami kartu su tandemine masių spektrometrija [25, 69], kadangi tokiu atveju nėra būtinas pilnas junginių atskyrimas ir taip gerokai sutrumpinama tyrimo trukmė [69]. Fenolinių junginių chromatografiniam išskirstymui naudojamas gradientinis eliuavimas dviejų tirpiklių sudarytomis iš skruzdžių rūgšties – metanolio [69], amonio acetato, parūgštinto skruzdžių rūgštimi – metanolio [25], 10 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – metanolio [77], 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – 0,5 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo mišinyje su acetonitrilu (50:50, v/v) [81], 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – 100 proc. (v/v) acetonitrilo. [3] Eliuavimo greitis skirtingose metodikose naudojamas nuo 0,2 ml/min. iki 1 ml/min., kolonėlės temperatūra dažniausiai palaikoma 25°C [3, 77, 81]. Naudojant ultravioletinės spinduliuotės (UV) detekciją, absorbcijos spektrai paprastai registruojami esant 280 nm, 320 nm, 370 nm ir 530 nm

bangos ilgiams. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai registruojami 280 nm chromatogramoje, fenolinių rūgščių 320 nm, flavonolių 370 nm, antocianinų kiekiai 530 nm chromatogramose [3, 77, 81].

Fenolinių junginių išskirstymui naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją, dažniausiai naudojami detektoriai yra diodų matricos detektorius [3], masės spektrometras (MS), diodų matricos detektorius su masių spektrometru (DMD-MS), tandeminė masių spektrometrija (MS/MS) [69], diodų matricos detektorius su tandemine masių spektrometrija (DMD-MS/MS) [25, 45, 69,77, 81].

Kitaip nei detekcijai naudojant spektrofotometrinį metodą, masių spektrometro naudojimas kartu su ESC padeda išvengti nepilno analičių atsiskyrimo sukeliamų problemų. Ši problema ypač efektyviai sprendžiama naudojant tandeminę masių spektrometriją. ESC - MS/MS yra naudinga siekiant patvirtinti tiriamuose ekstraktuose nustatomų junginių struktūrą [25]. Rabaneda ir kt. 2004 m. atlikto tyrimo metu ESC–MS/MS buvo pritaikyta fenolinių junginių obuolių išspaudose kokybiniam įvertinimui. Tyrimo metu naudotas elektrosrauto jonizatorius ir trigubo kvadrupolio masių spektrometras. Dalis junginių buvo identifikuota pilno skenavimo ESC-MS metu, o likusi dalis junginių, kurių pirminiu skenavimu nepavyko identifikuoti, buvo nustatyti pasitelkiant MS/MS erdvėje skenavimo režimus (prekursoriaus skenavimą, neutralaus atskilimo skenavimą, pasirinktos reakcijos stebėjimą). Šis tyrimas įrodė galimybę pasitelkti ESC su tandemine masių spektrometrija sudėtingų biologiškai aktyvių junginių mišinių, tokių kaip obuoliai ir jų produktai kokybinės sudėties nustatymui. Šio tyrimo metu obuolių išspaudose identifikuota 60 fenolinių junginių, iš kurių 22, tuometinėmis autorių žiniomis, prieš tai nebuvo nustatyti obuoliuose ar jų išspaudose [69]. Flores ir kt. 2014 m. atlikto tyrimo metu fenolinių junginių identifikavimui bei kiekybiniam įvertinimui obuolių žievelėse, minkštimuose ir pilnuose obuoliuose, panaudota panaši aparatūra (ultra efektyvioji skysčių chromatografija su elektrostrauto jonizatoriumi bei trigubo kvadrupolio masių spektrometru). Tyrimo metu kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti 22 junginiai ar jų grupės obuolių minkštimuose ir 26 junginiai žievelėse [25].

3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai

Kapiliarinė elektroforezė. Kapiliarinė elektroforezė yra analitinis metodas, pasižymintis efektyviu atskyrimu ir trumpa trukme. Tačiau lyginant su ESC, kapiliarinė elektroforezė yra mažiau jautrus metodas, yra sistemos perpildymo mėginiais problema, prastesnis kiekybinių rezultatų

atkartojamumas. Taip pat, lyginant su ESC, ilgiau trunka metodo vystymas [7].Junginių išskirstymui dažniausiai naudojami elektroforetiniai metodai yra micelinė elektrokinetinė chromatografija (MEKC), kapiliarinė elektrochromatografija (CEC) ir kapiliarinė zonų elektroforezė (CZE). Detekcijai

dažniausiai naudojama spektrofotometrija, elektrocheminė detekcija arba masių spektrometrija [44]. Youyuan Peng ir kt. atliktas tyrimas, kurio metu panaudojant kapiliarinę elektroforezę su elektrochemine detekcija (KE-ED), buvo kiekybiškai įvertinti floridzinas, (-)-epikatechinas, chlorogeno rūgštis ir miricitinas, esantys obuolių sultyse bei sidre. Naudojant šiame tyrime aprašytą optimizuotą KE-ED metodiką, analitės buvo atskirtos per 20 min. naudojant 75 cm ilgio kapiliarą, 18 kV įtampą ir 50 mmol/l boratinį buferį (pH 8.7). detekcija buvo vykdoma naudojant 300 µm skersmens anglies disko elektrodą. Analičių identifikavimo ribos varijavo nuo 1 × 10−7

iki 5 × 10−7 g/ml. Tyrimo rezultatai pademonstravo, kad KE-ED yra sėkmingai pritaikoma obuoliuose nustatomų junginių kokybinei bei kiekybinei analizei ir pasižymi aukšta rezoliucija bei jautrumu, patenkinamu pakartojamumu, mažomis tyrimo išlaidomis ir minimaliu reikalingu mėginio tūriu [62].

***

Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose didžiausiais kiekiais nustatomi fenoliniai junginiai yra chlorogeno rūgštis, (-)-epikatechinas, floridzinas. Fenolinių junginių išskyrimui iš obuolių dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba. Yra atlikta tyrimų, įrodančių metodo tinkamumą ir pranašumą prieš kitus metodus, vykdant fenolinių junginių ekstrakciją iš obuolių. Dėl šių priežasčių tyrime naudotas kitų mokslininkų optimizuotas fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių ultragarso pagalba metodas.

Fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui obuolių mėginiuose labai dažnai taikomas Folin-Ciocalteu metodas. Nepaisant galimai pervertinamo fenolinių junginių kiekio, tai populiarus, paprastas ir greitai atliekamas metodas. Folin-Ciocalteu metodas leidžia palyginti fenolinių junginių kiekius skirtingose obuolių veislėse.

Kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje pirmo pasirinkimo metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija. Literatūroje aprašyta daug obuolių fenolinių junginių tyrimų, naudojant ESC metodą. Dėl šių priežasčių fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei obuoliuose naudotas kitų mokslininkų optimizuotas ESC metodas.

4. TYRIMO METODIKA

4.1. Tyrimo objektas

Tirti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimų ir žievelių ėminiai. Obelys auginamos Lietuvoje, Kauno r., Babtuose Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centro filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute. Tyrimui paruošti 2012 m. sezono vaisių ėminiai.

4.2. Naudoti reagentai

Tirpikliai, standartai ir reagentai yra analitinio švarumo. Acto rūgštis, ABTS, DMCA, (-)-epikatechino standartas, Trolox®-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis, galo rūgšties monohidrato standartas, Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas, aliuminio chlorido heksahidratas Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija), etanolis (96,3 proc. v/v) (AB Stumbras, Lietuva), rutino standartas (Extrasynthese, Genay, Prancūzija), natrio karbonatas, DPPH ir TPTZ (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija), heksametiltetraminas, azoto rūgštis (Lachema, Neratovice, Čekija), geležies (III) chlorido heksahidratas (Vaseline-Fabrik Rhenania, Bonn, Vokietija).

4.3. Naudota aparatūra

Obuolių minkštimai ir žievelės liofilizuoti liofilizatoriumi ZIRBUS sublimator 3x4x5/20 (Vokietija), liofilizuotas minkštimas ir žievelės sumalti, naudojant elektrinį malūną Retsch 200 (Vokietija).

Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija). Spektrofotometrinė etanolinių ekstraktų analizė atlikta naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70“ (JAV).

Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant Waters 2695 Alliance chromatografinę sistemą („Waters“, Milfordas, JAV), diodų matricos detektorių Waters 2998 PDA. Skirstymui naudota kolonėlė YMC-Pack ODS-A (250 × 4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su prieškolone YMC-Triart (10 × 3,0, C18, dalelių dydis 5 µm) (YMC Europe GmbH, Dinslakenas, Vokietija). Chromatografinio skirstymo valdymas, chromatogramų registravimas, duomenų kaupimas

ir apdorojimas atliktas naudojantis „Empower® 2 chromatography Data Software” („Waters“, Milfordas, JAV) programine įranga.

4.4. Tyrimo metodai

Obuolių minkštimų ir žievelių ekstraktų paruošimas. Pasveriama 2,5 g (tiksli masė) obuolių liofilizato, užpilama 30 ml 70 proc. (v/v) etanolio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min. 40°C temperatūroje sandariuose stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 480 W, dažnis – 35000 Hz. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą. Ant filtro esantis obuolių liofilizatas

praplaunamas 20 ml 70 proc. (v/v) etanolio į 50 ml matavimo kolbą, kurioje yra praskiedžiamas 70 proc. (v/v) etanoliu iki 50 ml. Prieš atliekant ESC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus [3].

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.

Tirpalo A paruošimas: 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio.

Tirpalo B paruošimas: 0,25 ml tirpalo A sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalais. Lyginamasis mėginys gaminamas vietoje tirpalo A naudojant 0,25 ml išgryninto vandens.

Gautas tirpalas paliekamas 60 min. tamsoje. Po to spektrofotometru išmatuojama 765 nm bangos ilgio šviesos absorbcija. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [83].

Galo rūgšties koncentracijų intervalas 0 - 2,5 mg/ml. y = 0,4679 x - 0,1291 R² = 0,9979

Procentinis fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės: 1000 100 1     m V X X ,

čia: X1 - bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml;

V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;

m - absoliučiai sausos žaliavos masė g. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras flavonoidų

su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties, 1,2 ml išgryninto vandens, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 min. tirpalas sumaišomas su 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo. Lyginamasis mėginys: 1,5 ml ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties ir 1,9 ml išgryninto vandens. 407 nm bangos ilgio šviesos absorbcija matuojama po sumaišymo su heksametilentetramino tirpalu. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [6].

Rutino koncentracijų intervalas 0-0,175 mg/ml. y = 5,9610x + 0,0117 R² = 0,9984

Procentinis flavonoidų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės: 1000 100 1     m V X X ,

čia: X1 - bendras flavonoidų kiekis mg/ml;

V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras proantocianidinų kiekis nustatytas spektrofotometru taikant reakciją su DMCA (4-dimetilaminocinamaldehidas) etanoliniu vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (9:1 v/v). Tiriamasis tirpalas: 20 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo. Lyginamasis tirpalas: 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo sumaišoma su 20 μl išgryninto vandens. Po 5 min. matuojama tirpalo šviesos absorbcija esant 640 nm bangos ilgio šviesai [33]. Bendras proantocianidinų kiekis išreiškiamas (-)-epikatechino ekvivalentu (mg/ml) pagal (-)-epikatechino kalibracijos lygtį.

y = 2,4979x + 0,0053 R² = 0,9990

(-)-epikatechino koncentracijų intervalas 0 – 0,4 mg/ml

Procentinis proantocianidinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės: 1000 100 1     m V X X ,

čia: X1 - bendras proantocianidinų kiekis mg/ml;

V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Spektrofotometrinis FRAP metodas. FRAP reagentas ruošiamas prieš pat darbą iš 300 mM (pH=3,6) natrio acetato buferinio tirpalo, 10 mM TPTZ tirpalo 40 mM vandenilio chlorido rūgštyje, 20 mM geležies chlorido heksahidrato tirpalo. Jie maišomi santykiu 10:1:1. Tiriamasis tirpalas: 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml FRAP reagento tirpalo. Lyginamasis tirpalas: 3 ml FRAP

reagento tirpalo sumaišoma su 10 μl išgryninto vandens. Po 60 min. matuojama 593 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [11]. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas μmol TE/g pagal trolokso kalibracijos kreivę.

y = 0,6154x + 0,0012 R² = 0,9966

Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml

Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš formulės: 29 . 250 1000 1     m V X X ,

čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Spektrofotometrinis ABTS metodas. Motininio ABTS radikalo tirpalo gamyba: 2 mM ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) ištirpinama išgrynintame vandenyje (50 ml) ir pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario temperatūroje, kol kalio persulfatas suoksiduoja ABTS. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+ katijonas. Motininis ABTS•+ tirpalas, apsaugotas nuo šviesos poveikio, kambario temperatūroje yra stabilus daugiau nei 2 paras. Darbinio ABTS•+ tirpalo gamyba: ABTS•+ motininis tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol matuojant 734 nm bangos ilgio šviesos absorbciją nustatomi 0,8±0,03 absorbcijos vienetai. Tiriamojo tirpalo gamyba: 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS•+ tirpalo. Kaip lyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Po 60 min. spektrofotometru matuojamas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 734 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [71].

y = -0,3246x + 0,7497 R² = 0,9972

Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml

Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš formulės: 29 . 250 1000 1     m V X X ,

čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Spektrofotometrinis DPPH metodas. Darbinio DPPH tirpalo gamyba: 60 µM DPPH tirpalas skiedžiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją

pasiekiami 0,8±0,03 absorbcijos vienetai. 10 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Kaip tuščias mėginys naudojamas 96,3 proc. (v/v) etanolis. Po 30 min. matuojamas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [96].

y = -0,227x + 0,782 R² = 0,999

Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml

Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš formulės: 29 . 250 1000 1     m V X X ,

čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;

V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Fenolinių junginių identifikavimui bei kiekybiniam įvertinimui naudota dviejų eliuentų sistema sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo vandenyje (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0–30 min 3–15 proc. B, 30–45 min 15–25 proc. B, 45–50 min 25–50 proc. B, 50–55 min 50–95 proc. B. Judrios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10 l. Kolonėlė termostatuota 25°C temperatūroje. Chro-matografinės smailės identifikuotos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo laikus ir UV absorbcijos spektrines charakteristikas ( = 200–600 nm). Identifikuotų junginių tapatybė patvirtinta priedo metodu į tiriamąjį ekstraktą pridėjus etaloninio junginio, monitoruojant chromatografinių smailių formos ir spektrinių charakteristikų pokyčius. Kiekinis obuolių minkštimų bei žievelių ėminių ekstraktuose identifikuotų junginių nustatymas atliktas išorinio standarto metodu naudojantis kiekvienai analitei sudarytais penkių lygmenų etaloninių junginių kalibravimo grafikais bei remiantis analitės chromatografinės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos analizuojamame ekstrakte. Visų obelų vaisių ir lapų ėminių ekstraktuose kiekybiškai įvertintų fenolinių junginių koncentracijos buvo kalibravimo grafikų ribose. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai tiriamuosiuose ekstraktuose apskaičiuoti bangos ilgiui esant 280 nm, fenolinių rūgščių – 320 nm, flavonolių – 360 nm [3].

Pektinų kiekio nustatymas gravimetriniu metodu. 2 g obuolių liofilizato (tikslus svėrinys) talpinama į 250 ml kolbą, užpilama 80 ml 100 mM azoto rūgšties tirpalu. 10 min. palaikoma virimo temperatūra. Kolbos turinys filtruojamas pro dvigubą marlės sluoksnį. Filtratas atvėsinamas iki 40 °C. Į filtratą pilama 60 ml atšaldyto iki 5°C etanolio 96 proc. (v/v). Gauta masė laikoma šaldytuve (5°C) 1

val. Masė filtruojama pro dvigubą marlės sluoksnį. Gauta pektinų masė džiovinama iki pastovios masės ir sveriama [45, 49, 60, 93].

Procentinis pektinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės:

m X X  1100

čia: X1 - pektinų masė g.;

m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Duomenų analizė. Duomenų analizė ir vertinimas atliktas „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys įvertinti apskaičiavus tyrimų rezultatų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį ir standartinę klaidą. Siekiant nustatyti duomenų koreliacinius ryšius, apskaičiuoti Pirsono koreliacijos koeficientai.

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Vertinant obuolių kokybę svarbu ištirti jų cheminę sudėtį, nustatyti fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvairavimą. Šis parametras leidžia įvertinti obuolių kokybę. Fenolinių junginių kiekybinės sudėties analizė svarbi obuolius vartojant ne tik mitybai, bet ir gaminant obuolių produktus bei maisto papildus.

Atlikti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimai. Obuolių minkštimų ir žievelių ėminių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimui pasirinktas populiarus, sudėtingos aparatūros nereikalaujantis spektrofotometrinis metodas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.

Fenolinių junginių kiekis tirtuose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių minkštimuose įvairuoja 1,92 - 2,60 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „Lodel" (2,60±0,05 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesni kiekiai - „Auksis" (2,44±0,04 proc.) ir „Aldas" (2,41±0,04 proc.) veislių obuolių minkštimuose. Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių minkštime (1,92±0,05 proc.). Labai panašūs fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Ligol" (2,06±0,07 proc.) ir „Connel Red" (2,05±0,08 proc.) bei „Aldas" (2,41±0,04 proc.) ir „Auksis" (2,44±0,04 proc.) minkštimuose (1 pav.).

Lyginant tyrimų rezultatus su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis, įvairuojantis nuo 0,072 iki 0,168 proc. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislių „Red Delicious", „Northern Spy" ir „Fortune" obuolių minkštimuose. Mažiausias - „Jonagold" ir „Empire" minkštimuose [48].

Fenolinių junginių kiekis tirtose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių žievelėse varijuoja 2,68 - 3,37 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislės „Aldas" (3,37±0,03 proc.) obuolių žievelėse. Šiek tiek mažesni kiekiai nustatyti „Auksis" (3,31±0,05 proc.) ir „Lodel" (3,20±0,10 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausias fenolinių jugninių kiekis nustatytas „Ligol" (2,68±0,02 proc.) žievelėse (2 pav.).

Kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu, kurio objektas buvo JAV populiarių obelų veislių obuolių žievelės ir minkštimai, obuolių žievelėse nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis, kuris įvairavo nuo 0,31 iki 0,59 proc. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Idared" ir „Rome Beauty" žievelėse. Mažiausi - „Cortland" ir „Golden Delicious" žievelėse [97].

5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Flavonoidai yra viena didžiausių ir dažniausiai augaluose aptinkamų junginių grupių. Vertinant augalinės žaliavos kokybę, svarbu nustatyti bendrą flavonoidų kiekį. Bendras flavonoidų kiekis obuolių minkštimų ir žievelių ėminiuose nustatytas plačiai naudojamu, nesudėtingu metodu, pagrįstu flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometru yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Mūsų tyrimo metu naudotas modifikuotas metodas.

Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Flavonoidų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,012 - 0,030 proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Lodel" (0,030±0,001 proc.) obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesnis kiekis nustatytas „Connel Red" (0,027±0,001 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Mažiausias kiekis - „Ligol" (0,012±0,001 proc.) minkštimuose. Panašūs flavonoidų kiekiai nustatyti „Aldas“ (0,019±0,001 proc.), „Auksis“ (0,019±0,001 proc.) ir „Rajka“ (0,018±0,001 proc.) obuolių minkštimuose (3 pav.).

Tyrimų rezultatus lyginant su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose flavonoidų kiekis yra didesnis ir varijuoja 0,036 - 0,047 proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Cortland" ir „Rome Beauty" veislių minkštimuose. Mažiausias - „Idared" veislės obuolių minkštimuose [97].

Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Flavonoidų kiekis tirtose obuolių žievelėse varijuoja 0,085 - 0,239 proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Aldas" (0,239±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Mažesnis flavonoidų kiekis nustatytas „Connel Red" (0,184±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Veislės „Auksis" obuolių žievelėse nustatytas mažiausias flavonoidų kiekis (0,085±0,003 proc.). Veislės „Auksis" žievelėse nustatytas 2,8 karto mažesnis flavonoidų kiekis, nei veislės „Aldas" žievelėse. Veislių „Ligol“ (0,141±0,003 proc.), „Rajka" (0,164±0,003 proc.) ir „Lodel“ (0,143±0,004 proc.) žievelėse nustatyti panašūs flavonoidų kiekiai (4 pav.).

Tyrimo rezultatus lyginant su kitų mokslininkų atlikto tyrimo rezultatais, JAV populiarių obelų veislių obuolių žievelėse nustatytas didesnis flavonoidų kiekis, kuris įvairuoja 0,167 - 0,306 proc ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Idared" ir „Rome Beauty" žievelėse. Mažiausias - „Cortland" ir „Golden Delicious" obuolių žievelėse [97].

Minėto tyrimo metu bendro flavonoidų kiekio nustatymui obuolių žievelėse ir minkštimuose, naudota reakcijos su aliuminio chloridu modifikacija, kurioje tiriamasis ekstraktas maišomas su 5 proc. NaNO2 tirpalu, 10 proc AlCl3 ir 1 M NaOH tirpalais [97]. Tiriant tuos pačius augalinės žaliavos mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi rezultatai, todėl sudėtinga lyginti skirtingų tyrimų rezultatus [64].

5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Proantocianidinai yra gamtoje plačiai paplitusi fenolinių junginių grupė, sudaranti didžiausią dalį su maistu ir gėrimais suvartojamų flavonoidų [94]. Proantocianidinų nustatymas atliktas spektrofotometriniu metodu, naudojant DMCA reagentą. Tai populiarus, sudėtingos aparatūros nereikalaujantis, paprastas ir labai greitas proantocianidinų nustatymo metodas. Lyginant su kitais proantocianidinų nustatymui naudojamais metodais, DMCA metodas pasižymi geresniu atkartojamumu, selektyvumu, greitesniu atlikimu [33, 94].

Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Proantocianidinų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,123 - 0,209 proc. ribose. Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas „Lodel" veislės minkštimuose (0,209±0,007 proc.). Mažiausias jų kiekis nustatytas „Connel Red" veislės obuolių minkštimuose (0,122±0,006 proc.). „Ligol“ (0,134±0,006 proc.) ir „Rajka“ (0,138±0,004 proc.) bei veislių „Aldas“ (0,151±0,007 proc.) ir „Auksis“ (0,153±0,005 proc.) minkštimuose nustatyti beveik vienodi proantocianidinų kiekiai (5 pav.).

Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Proantocianidinų kiekis tirtose obuolių žievelių ėminių ekstraktuose varijuoja 0,170 - 0,292 proc. ribose. Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas veislės „Aldas" (0,292±0,006 proc.) obuolių

žievelėse. Panašūs, mažesni proantocianidinų kiekiai nustatyti „Auksis" (0,257±0,010 proc.) ir „Connel Red" (0,236±0,013 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausi proantocianidinų kiekiai nustatyti „Rajka" (0,170±0,006 proc.) ir „Ligol" (0,176±0,005 proc.) veislių obuolių žievelėse (6 pav.).

Tyrimo rezultatus lyginant su Suomijos ir JAV mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad šių tyrimų metu obuoliuose nustatytas mažesnis proantocianidinų kiekis, varijuojantis nuo 0,070 iki 0,162 proc. [34, 29]. Jarkko K. ir kt. atlikto tyrimo duomenimis obuolių žievelėse proantocianidinų nustatyta nuo 0,182 iki 0,227 proc. [34].

Kitų mokslininkų nustatyti mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su skirtingomis obelų auginimo technologijomis, klimatinėmis sąlygomis bei veislių skirtumais. Taip pat nustatyti mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su kiekybinio tyrimo metodikų skirtumais. Mūsų atliktame tyrime naudotas DMCA reagentas, kuris yra jautrus ne tik (+)-katechino ir (-)-epikatechino oligomerams bei polimerams, bet ir monomerams [58]. Tyrimui naudojant didesniu specifiškumu pasižyminčius metodus, tokius kaip efektyvioji skysčių chromatografija, žaliavoje nustatomas proantocianidinų kiekis gali būti mažesnis.

5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių

minkštimuose ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. ESC pasižymi labai geru atkartojamumu, aukšta skiriamąja geba. Tai tikslus, daugelio junginių grupių atskyrimui pritaikomas metodas, pastaruoju metu dažnai naudojamas augalinių žaliavų ekstraktų kokybinei ir kiekybinei analizei.

ESC metodu tirti veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolių minkštimai ir žievelės. Tyrimui pasirinktos šios obuolių veislės, kadangi veislės „Aldas" žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių, flavonoidų bei proantocianidinų kiekiai bei didžiausias antioksidacinis aktyvumas, o veislė „Lodel" išsiskyrė didžiausiais minkštimuose nustatytais fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekiais, dideliu minkštimų antioksidaciniu aktyvumu. Anksčiau nebuvo atlikta veislės „Lodel" fenolinių junginių kokybinio ir kiekybinio tyrimo.

(a)

7 pav. Veislių Aldas (a) ir Lodel (b) žievelių ėminių etanolinių ekstraktų

chromatograma (λ=280 nm).1-procianidinas B1, 2-(+)-katechinas, 3-chlorogeno rūgštis, 4-procianidinas B2, 5-(–)-epikatechinas, 6-rutinas, 7-hiperozidas, 8-izokvercitrinas,

9-avikuliarinas, 10-kvercitrinas, 11-floridzinas. (b)