ŠALTALANKIŲ VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES, ASKORBO RŪGŠTIES KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

IEVA KOZUBOVSKAITĖ

ŠALTALANKIŲ VAISIŲ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES,

ASKORBO RŪGŠTIES KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Raimondas Raudonis

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis 2015 m.

ŠALTALANKIŲ VAISIŲ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES,

ASKORBO RŪGŠTIES KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Raimondas Raudonis 2015 m.

Recenzentas Darbą atliko

2015 m. Magistrantė Ieva Kozubovskaitė 2015 m.

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŢVALGA... 10

1.1. Elaeagnaceae šeima ... 10

1.2. Hippophae L. gentis ... 10

1.3. Dygliuotasis šaltalankis ... 10

1.4. Šaltalankių vaisių fitocheminė sudėtis ... 12

1.5. Šaltalankių vaisių gydomosios savybės ... 13

1.6. Oksidacinis stresas ir antioksidantai, jų nustatymo metodai ... 14

1.7. Fenoliai junginiai ... 16

1.8. Askorbo rūgštis ... 19

1.9. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 20

2. TYRIMO METODIKA ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Naudoti reagentai ... 21

2.3. Naudota aparatūra ... 21

2.4. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 22

2.5. Tyrimo metodai ... 22

2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas... 22

2.5.2. Bendro flavonoidų junginių kiekio nustatymas ... 23

2.5.3. Askorbo rūgšties nustatymas ... 24

2.5.4. Laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas ABTS metodu ... 24

2.5.5. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 25

2.6. Fenolinių junginių nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 26

2.7. Duomenų statistinis vertinimas ... 27

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas H. rhamnoides L. veislių vaisių ekstraktuose... 28

3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 30

3.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 33

3.5. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 34

3.6. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė ESC metodu. ... 36

IŠVADOS...39

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41

SANTRAUKA

I. Kozubovskaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Raimondas Raudonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Šaltalankių vaisių fenolinių junginių sudėties, askorbo rūgšties kiekio ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.

Raktiniai ţodţiai: Hippophae rhamnoides, antioksidantinis aktyvumas, fenoliniai junginiai, flavonoidai, askorbo rūgštis, FRAP, ABTS.

Tyrimo objektas ir metodai: Dygliuotojų šaltalankių (Hippophae rhamnoides L.) veislių vaisių fenolinių junginių, flavonoidų, askorbo rūgšties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas. Fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu. Spektrofotometriškai įvertintas flavonoidų kiekis acto rūgštimi parūgštintoje terpėje, paveikus ekstraktus aliuminio chlorido tirpalu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS ir FRAP spektrofotometriniais metodais.

Darbo tikslas: Ištirti dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides L.) vaisių fenolinių junginių sudėties ir askorbo rūgšties įvairavimą skirtingose veislėse ir įvertinti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uţdaviniai: Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį šaltalankių vaisiuose Folin-Ciocalteu metodu. Nustatyti bendrą flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekį šaltalankių vaisiuose. Atlikti šaltalankių vaisių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimus spektrofotometriniais ABTS ir FRAP metodais. Atlikti šaltalankių vaisių kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių analizę ESC metodu.

SUMMARY

The topic of the master thesis by I. Kozubovskaitė/ Research supervisor dr. Raimondas Raudonis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas.

Title: Research on phenolic composition, ascorbic acid content and antioxidant activity of Sea buckthorn berries.

Keywords: Hippophae rhamnoides, antioxidant activity, phenolic compounds, flavonoids, ascorbic acid, FRAP, ABTS.

Research methods: Research of phenolic compounds, flavonoids, ascorbic acid and antioxidant activity of Hippophae rhamnoides L. The amount of phenolic compounds was determined by applying the spectrophotometric Folin – Ciocalteu method. The amount of flavonoids was evaluated spectrophotometrically by treating extracts with aluminium chloride solution in acetic acid medium. The antioxidant activity was determined by using ABTS and FRAP spectrophotometric methods.

The aim: to research variations of phytochemical composition of different varieties of

Hippophae rhamnoides L. and evaluate the antioxidant activity of extracts.

Objectives of the study: to determine a general amount of phenolic compounds in sea buckthorn fruit by applying Folin-Ciocalteu method. To define a general amount of flavonoids and ascorbic acid in sea buckthorn fruit. To perform an antioxidant activity test of sea buckthorn fruit extracts by applying ABTS and FRAP methods. To perform a qualitative and a quantitative analysis of sea buckthorn fruit phenolic compounds by applying HPLS method.

SANTRUMPOS

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FC – Folin – Ciocalteu metodas

FRAP – trivalentės geleţies jonų redukcijos galia GAE – galo rūgšties ekvivalentai

RE – rutino ekvivalentai

ROS – reaktyvios deguonies formos rs – Spirmeno koreliacijos koeficientas SOD – superoksido dismutazė

TE – trolokso ekvivalentai

ĮVADAS

Oksidacinio streso poveikis ţmogaus sveikatai yra pavojingas ir yra nustatyta, kad turi įtakos daugumos ligų, tokių kaip: cukrinio diabeto, vėţio, įvairių kvėpavimo takų ligų ir kitų ligų atsiradimui [1]. Siekiant išvengti ţalingo oksidacinio streso poveikio ţmogaus organizmui, buvo pradėti tyrinėti biologiškai aktyvūs junginiai, kurie pasiţymi antioksidantinėmis savybėmis. Antioksidantams būdinga tai, kad jie slopina oksidacinius procesus. Biologiškai aktyvios medţiagos uţkerta kelią oksidacijai arba slopina reakcijas, kurių metu susidaro deguonis arba peroksidazė, ir taip apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso ţalos [2, 3]. Pastaruoju metu pasaulyje atliekama nemaţai tyrimų su augalais, kurie kaupia biologiškai aktyvius junginius, pasiţyminčius antioksidantiniu aktyvumu [4].

Šaltalankių vaisiai pasiţymi priešuţdegiminiu, antimikrobiniu ir skausmą malšinančiu poveikiu, skatina audinių regeneraciją, stiprina imuninę sistemą ir vartojami kaip prevencinė priemonė nuo vėţio, širdies ir kraujagyslių ligų [4, 5]. Vaisių gydomąsias savybes lemia vaisių sudėtyje esantys biologiškai aktyvūs junginiai: fenolinės rūgštys, flavonoidai, askorbo rūgštis, karotenoidai, procianidinai, fitosteroliai, amino rūgštys ir kt. Šaltalankių vaisių antioksidantinis aktyvumas siejamas su vaisių sudėtyje esančiais fenoliniais junginiais, flavonoidais, askorbo rūgštimi, dėl šios prieţasties tikslinga įvertinti šių biologiškai aktyvių junginių kiekius vaisiuose. [5, 6].

Darbo naujumas. Lietuvos klimato sąlygomis augančių Hippophae rhamnoides L. veislių vaisių antioksidantinis aktyvumas maţai tyrinėtas, todėl šio tyrimo metu gauti rezultatai papildo ţinias apie šių vaisių antioksidantinį aktyvumą. Taip pat buvo atlikti tyrimai, siekiant įvertinti kiekybinį fenolinių junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties įvairavimą tarp skirtingų šaltalankių veislių vaisių. ESC metodu nustatyta kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių sudėtis skirtingų šaltalankio veislių vaisiuose.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas: Ištirti dygliuotojų šaltalankių (Hippophae rhamnoides L.) vaisių fenolinių junginių sudėties, askorbo rūgšties kiekio įvairavimą skirtingose veislėse ir įvertinti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uţdaviniai:

1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį šaltalankių vaisiuose Folin-Ciocalteu metodu. 2. Nustatyti bendrą flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekį šaltalankių vaisiuose.

3. Atlikti šaltalankių vaisių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimus spektrofotometriniais ABTS ir FRAP metodais.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Elaeagnaceae šeima

Ţilakrūminių (Elaeagnaceae) šeimai priskiriamos 3 gentys: Hippophae (šaltalankis),

Shepherdia (šefedrija), Elaeagnus (ţilakrūmis), kurioms priklauso apie 50 rūšių, paplitusių vidutinio

klimato juostoje ir subtropikų srityse. Šie augalai yra vasarţaliai, rečiau visţaliai krūmai arba nedideli medţiai [7, 8]

Ţilakrūminių šeimos augalų ūgliai ir lapai padengti ţvaigţdiškais plaukeliais arba bronziniais ţvyneliais. Lapai praţanginiai arba priešiniai, paprasti, daţniausiai sidabriškai pilkšvi. Augalų vaisiai yra netikri kaulavaisiai, kurie turi po vieną kauliuką [7].

Šiai šeimai būdinga tai, kad augalų šaknys yra gumbelinės, kuriose kaupiasi bakterijos, fiksuojančios atmosferoje esantį azotą. Ţilakrūminių šeimos augalus reikėtų sodinti ne aukščiau kaip 70 cm nuo dirvos paviršiaus, nes negiliai esantys podirvio vandenys gali lėtinti ar net sutrikdyti azoto pasisavinimą iš oro [7, 8].

1.2. Hippophae L. gentis

Hippophae L. – maţa Elaeagnaceae šeimos gentis, kurią sudaro 7 rūšys ir 9 porūšiai,

pasiţymintys didele maistine ir medicinine verte [9]. Dvi rūšys yra homoploidiniai hibridai (H.

goniocarpa ir H. litangensis) ir jų taksonominė padėtis nėra aiški. 3 rūšys natūraliai yra paplitusios

Europoje ir Azijoje. Visos Hippophae rūšys aptinkamos Azijos regione, išskyrus H. rhamnoides rūšį, kuri turi 9 porūšius, plačiai, bet fragmentiškai paplitusius Rytų Azijoje (yunnanensis, wolongensis,

sinensis ir mongolica), Centrinėje Azijoje (turkestanica), Vidurio Azijoje (caucasica) ir Europoje (carpatica, fluviatilis ir rhamnoides) [10].

Šios genties augalai yra dvinamiai vasarţaliai krūmai arba medeliai. Augalų ūgliai apaugę skydiškais ţvyneliais, lapai yra trumpakočiai. Ţiedai – vienalyčiai. Kuokeliai su labai trumpais koteliais. Kaulavaisis sultingas, turintis kauliuką su šonine vagele [7].

Ţinomiausias augalas Hippophae L. gentyje yra dygliuotasis šaltalankis (Hippophae

rhamnoides L.) [11].

1.3. Dygliuotasis šaltalankis

krūmas, rečiau medelis, kurio aukštis 2 – 4 m. Krūmo šiurkšti ţievė yra tamsiai rudos arba juodos spalvos, taip pat krūmui būdingos storos pilkšvai ţalios spalvos viršūnės. Augalo trumposios šakelės viršūnėse ir šonuose apaugusios aštriomis, tvirtomis akstimis (1 pav.). Lapai yra praţanginiai, linijiški, buki ir lygiakraščiai. Viršutinė lapo pusė pilkšvai ţalia, apatinė – sidabriškai balsva, ištisai plaukuota [7, 12].

Tai ištvermingas augalas, atsparus sausrai ir šalčiui, būdinga stipri ir sudėtinga gumbelinių šaknų sistema, kaupianti atmosferos azotą fiksuojančias bakterijas [7, 8, 13].

Šis augalas gali būti dauginamas sėklomis, sumedėjusiais ir ţaliais auginiais, šaknų atţalomis ir skiepijant. Daţniausiai šaltalankis yra labai šviesomėgis augalas, plintantis akmeninguose ir ţvyringuose upių šlaituose [7, 14].

1 pav. Dygliuotasis šaltalankis (Hippophae rhamnoides L.)

Šaltalankio lapai, vaisiai ir sėklos kaupia daug biologiškai aktyvių medţiagų [15, 16].

Lietuvoje dygliuotieji šaltalankiai daţniausiai aptinkami apleistuose ţvyro karjeruose, nederlingose ir nerūgščiose, orui laidţiose ţemėse, vandens telkinių pakrantėse, rečiau sodybose, miestų ţeldimvietėse. Daugumoje vietų dygliuotieji šaltalankiai yra paplitę savaime. Lietuvoje taip pat pradėtos auginti ir dygliuotųjų šaltalankių veislės be dyglių, su stambiais kaulavaisiais [7].

1.4. Šaltalankių vaisių fitocheminė sudėtis

Šaltalankių vaisiuose nustatyta daug naudingų komponentų ir dėl šios prieţasties šaltalankių vaisiai sulaukė didelio dėmesio visame pasaulyje [8, 19].

Vaisiuose yra gausu vertingų junginių, tokių kaip vitaminai (0,2 – 1,4 proc. vitamino C, E, K ir 0,1 – 0,16 proc. B grupės vitaminų), 0,04 – 0,1 proc. karotenoidų (β-karotenas, γ–karotenas kartu su likopenu, liuteinu, zeaksantinu).

2 pav. Likopeno ir β-karoteno struktūrinės formulės [18]

Taip pat vaisiuose aptinkama 1,5 proc. flavonoidų (kvercetinas, rutinas, izoramnetinas, kemferolis ir kt.). Šaltalankio vaisiuose nustatyta 18 iš 22 ţinomų amino rūgščių (treoninas, valinas, metioninas, leucinas, lizinas, triptofanas, izoleucinas, fenilalaninas, kurie yra būtini ţmogaus organizmui), 1,3 – 2 proc. sterolių (β-sitosterolis), organinės rūgštys (daugiausia obuolių ir kvinino), riebiosios rūgštys (13,7 proc. sočiųjų ir 86,3 proc. nesočiųjų riebiųjų rūgščių, tokių kaip linolio, oleino, palmitino ir kt.), mineralinės medţiagos (kalis, cinkas, selenas, kalcis, geleţis, manganas, natris, fosforas ir kt.), baltymai ir riebaliniai aliejai. Cukrai, tokie kaip gliukozė, fruktozė ir ksilozė, taip pat yra svarbūs komponentai šaltalankio vaisiuose. Bendras cukrų kiekis švieţiuose vaisiuose siekia 5,6 – 22,7 proc. [6, 8, 18, 20, 21].

1.5. Šaltalankių vaisių gydomosios savybės

Dygliuotasis šaltalankis yra unikalus ir vertingas augalas, išsiskiriantis savo gydomosiomis ir maistinėmis savybėmis [8]. Ypač šaltalankių vaisiai pasiţymi įvairiausiais gydomaisiais poveikiais dėl jų sudėtyje esančių įvairių junginių. Pagrindiniai sudėtiniai komponentai ir jų farmokologiniai – fiziologiniai poveikiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Pagrindiniai šaltalankių vaisių junginiai ir jų gydomosios savybės [8]

Junginys Gydomosios savybės

Tokoferoliai Veikia kaip antioksidantai, apsaugo nuo lipidų oksidacijos ir padeda sumaţinti skausmą.

Karotenoidai Veikia kaip antioksidantai, dalyvauja kolageno sintezėje ir epitelizacijoje.

Vitaminas K Palaiko normalų kraujo krešėjimą, stabdo kraujavimą, skatina ţaizdų gijimą, pasiţymi priešopiniu poveikiu.

Vitaminas C Veikia kaip antioksidantas, palaiko ląstelių membranų vientisumą, pagreitina kolageno sintezę.

Vitamino B kompleksas Skatina ląstelių atsinaujinimą ir nervų regeneraciją.

Fitosteroliai Gerina mikrocirkuliaciją odoje, pasiţymi priešopiniu, antiaterogeniniu ir priešvėţiniu poveikiu. Reguliuoja uţdegiminį procesą.

Polifenoliniai junginiai Veikia kaip antioksidantai, būdingas ląsteles apsaugantis ir kardioapsauginis poveikis. Skatina ţaizdų gijimą.

Polinesočiosios riebiosios rūgštys

Pasiţymi imunomoduliuojamu, neuroapsauginiu ir antinavikiniu poveikiu.

Organinės rūgštys Sumaţina širdies priepuolio ir insulto riziką. Būdingas priešopinis, antiartritinis ir skatinantis ţaizdų gijimą poveikis.

Kumarinai ir triterpenai Dalyvauja apetito, miego, atminties ir mokymosi reguliavime. Cinkas Stiprina kraujotaką, veikia kaip fermentų kofaktorius. Reikalingas

vitamino A veikimui.

Vaisių farmakologinį poveikį lemia vitaminai, mikroelementai, aminorūgštys ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai, pvz.: β-karotenas, zeaksantinas, likopenas, flavonoidai, folio rūgštis, triterpenai, riebiosios rūgštys ir t.t. Šaltalankių vaisiuose esantys polifenoliai pasiţymi antioksidantinėmis savybėmis ir jie gali apsaugoti ţmogaus organizmą nuo oksiduotų radikalų ţalingo poveikio [5].

virškinimo trakto, širdies, kraujo ir metabolinių sutrikimų gydymui, sudėtį [6, 20, 22].

Švieţios sultys, sirupas, vaisių ar sėklų aliejus yra vartojamas peršalimo, karščiavimo metu, norint palengvinti drėgną kosulį, vartojamas skrandţio opų ir vėţio gydymui ir esant medţiagų apykaitos sutrikimui. Vaisių ir sėklų aliejus vartojamas kepenų ligoms, uţdegimams, virškinimo sistemos sutrikimams (skrandţio opos, gastritas) ir kitiems opiniams gleivinės audinių sutrikimams, ţaizdoms, nudegimams, nušalimams, psoriazei, raudonajai vilkligei ir lėtinėms odos ligoms gydyti [6]. Nustatyta, kad dygliuotųjų šaltalankių vaisiuose ir lapuose esantys flavonoidai pagerina širdies ir kraujagyslių funkcionavimą. Flavonoidai gali apsaugoti nuo miokardo išemijos ir reperfuzijos, auglių, oksidacino streso sukeliamos ţalos ir senėjimo [8].

Taip pat vaisiai vartojami radiacijos paţeidimams, burnos uţdegimams ir skrandţio opoms gydyti [20].

Svarbiausios farmakologinės šaltalankių aliejaus savybės: maţina uţdegimą ir skausmą, pasiţymi dezinfekcinėmis savybėmis ir skatina audinių regeneraciją [23].

1. 6. Oksidacinis stresas ir antioksidantai, jų nustatymo metodai

Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas ir antioksidantai tapo daţniausiai naudojamais terminais, kalbant apie ligų mechanizmus, nes oksidacinio streso poveikis ţmogaus sveikatai tapo rimta problema. Patyrus stresą, ţmogaus organizme susidaro daugiau reaktyviųjų deguonies formų (ROS) (pvz.: peroksido anijonų radikalai, hidroksilo radikalai ir vandenilio peroksidas), maţiau fermentinių antioksidantų (superoksido dismutazė (SOD), gliutationo peroksidazė (GPx), katalazė) ir nefermentinių antioksidantų (askorbo rūgštis, tokoferolis, glutationas, karotenoidai, flavonoidai). Dauguma radikalų in vivo susidaro iš reaktyvių deguonies formų (ROS) ar reaktyvių azoto formų. ROS laisvųjų radikalų sudėtyje yra deguonis, pvz.: superoksido (O2•¯), hidroksilo (OH•), alkoksilo (RO•),

peroksilo (ROO•) ir hidroperoksilo (ROOH•). Reaktyvios azoto formos yra laisvieji azoto oksido radikalai (NO•), azoto dioksidas (NO2•) ir stiprus oksidantas peroksinitritas (ONOO¯) [1–3].

kurie, atstatydami paţeistą audinį, taip pat išskiria laisvuosius radikalus. Sportuojantys asmenys turėtų vartoti antioksidantus, kad išvengtų oksidacinio streso fizinio krūvio metu [1].

Buvo nustatytas fermentas – superoksido dismutazė (SOD), kuris katalizuoja laisvąsias deguonies formas į vandenilio peroksidą, pagal šią lygtį:

Jeigu yra pakankamas kiekis katalazės fermento, tai tuoj pat H2O2 suskils į vandenį ir deguonį.

Reaktyvioms deguonies formoms priklauso du junginiai: ir OH•, kurie yra laisvieji radikalai, turintys po vieną nesuporuotą elektroną. H2O2 nėra laisvasis radikalas, tačiau katalazės trūkumas gali

sukelti OH• laisvųjų radikalų formavimąsi. Oksidacinio streso ir ypač laisvųjų radikalų atsiradimui įtakos turi leukocitai, dalyvaujantys uţdegiminiame procese, kurie taip pat skatina kenksmingų laisvųjų radikalų susidarymą. Šios susidariusios reaktyvios deguonies formos įvairiais būdais ţaloja audinius: DNR paţeidimai, mitochondrijų kvėpavimo funkcijos pablogėjimas, tiesioginis parenchiminis sutrikimas [24].

Manoma, kad oksidacinis stresas yra susijęs su šiomis organizmo problemomis ir ligomis: imuninės sistemos susilpnėjimas, padidejusi rizika susirgti infekcinėmis ligomis, vėţys, cukrinis diabetas (nuo insulino priklausantis ir ne nuo insulino priklausantis), autoimuninės ligos (reumatoidinis artritas, ankilozinis spondilitas), įvairios kvėpavimo takų ligos, akių ligos (kataraktos ir tinklainės paţeidimas, kuris atsiranda dėl su amţiumi susijusios geltonosios dėmės degeneracijos), koronarinės širdies ligos, neurodegeneraciniai sutrikimai (Alzheimerio liga, Parkinsono liga), šizofrenija [4, 25, 26].

Antioksidantai – tai junginiai, kurie neleidţia susidaryti arba neutralizuoja jau susidariusius laisvuosius radikalus, uţkerta kitų molekulių oksidaciją, slopindami grandininės reakcijos oksidacijos pradţią arba sklidimą. Antioksidantai atlieka svarbų vaidmenį, apsaugant organizmą nuo oksidacinio streso ţalos, slopindami arba atidėdami oksidacinius procesus. Dėl šios prieţasties pastaraisiais metais buvo labai susidomėta šiais junginiais ir atlikta daug tyrimų, norint įsitinkinti jų veikimu [4,6].

Antioksidantai gali būti klasifikuojami įvairiai, atsiţvelgiant į veikimo mechanizmą, jie gali būti skirstomi į pirminius antioksidantus, sinergistinius ir antrinius antioksidantus. Kai kurios medţiagos pasiţymi antioksidantiniu poveikiu: askorbo rūgštis, tokoferoliai, kai kurie fermentai, karotenoidai ir biologiškai aktyvūs augaliniai fenoliai [4].

ţmogaus sveikatai. Viena iš fitomedţiagų kategorijų yra fenoliniai junginiai, kurie pasiţymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis ir laisvųjų radikalų surišimo geba, slopina fermentus, atsakingus uţ ROS atsiradimą [6, 27].

Daţniausiai antioksidantiniam aktyvumui ekstraktuose nustatyti naudojami metodai yra ABTS•+ ir DPPH•. Šie metodai pasiţymi puikiu atkuriamumu pagal tam tikras bandymo sąlygas, taip pat parodo reikšmingų skirtumų reakcijose su antioksidantais. DPPH laisvajam radikalui (DPPH•) nereikia specialaus paruošimo, o ABTS radikalo katijonas (ABTS•+) pagaminamas fermentų arba cheminių reakcijų pagalba. Kitas svarbus dalykas, kad ABTS•+ galima ištirpinti vandeninėje ir organinėje terpėse, kuriose gali būti išmatuojamas antioksidantinis aktyvumas dėl hidrofilinės ir lipofilinės junginių prigimties mėginiuose. DPPH gali būti ištirpinamas tik organinėse terpėse, ypač gerai tirpsta etanolyje. Taip pat antioksidantiniam aktyvumui nustatyti yra naudojamas geleţies redukcijos jėgos (FRAP) metodas, kuris pagrįstas trivalentės geleţies analogų redukcija. Rūgštinėje terpėje antioksidantai redukuoja Fe3+ tripiridil-s-triazino Fe(TPTZ)3+ į intensyviai mėlynos spalvos Fe2+ (TPTZ)2+ kompleksą [28].

Šie visi metodai daţniausiai naudojami siekiant nustatyti tiriamų ekstraktų anktioksidantinį aktyvumą. Ruošiant ekstraktus šiems tyrimams, ekstrahentai gali būti įvairūs: etanolis, etanolis/vanduo, acetonas/vanduo, metanolis/vanduo ir kt. [29].

1.7. Fenoliai junginiai

Fenoliniai junginiai – augalų antriniai metabolitai, t.y. pentozės fosfato, šikimato, fenilpropanoido dariniai, ir yra ţinoma daugiau kaip 8000 įvairių struktūrų. Šie junginiai vieni iš plačiausiai paplitusių biologiškai aktyvių junginių grupių ir yra labai svarbūs augalų fiziologijai ir morfologijai t.y. atlieka svarbų vaidmenį augalų augimo, dauginimosi procese, apsaugant juos nuo ligų sukėlėjų ir kenkėjų. Taip pat šie junginiai vaisiams ir darţovėms suteikia spalvas ir juslines savybes [4, 30].

2 lentelė. Fenolinių junginių klasės, kurios aptinkamos augaluose [30, 31].

Klasė Struktūra Kaupiantys augalai Pavyzdţiai

Paprastieji fenoliai, benzokvinonai

C6 Meškauogės Katecholis, hidrochinonas,

rezorcinolis.

Hidroksibenzoinės rūgštys C6-C1 Vingiorykštės p-hidroksibenzoinė rūgštis,

salicilo rūgštis Acetofenonai, fenilacto

rūgštys

C6-C2 Dumbliai p-hidroksifenilacto rūgštis

Hidroksicinamono rūgštys

C6-C3

Dauguma augalų Kavos rūgštis, ferulino rūgštis

Fenilpropanoidai Gvazdikmedţiai Eugenolis, myristicinas

Kumarinai Citrusiniai vaisiai Umbeliferonas, eskuletinas,

skopolinas

Chromonai Gvazdikmedţiai Eugeninas

Naptokvinonai C6-C4 Riešutmedţiai Juglonas

Ksantonai C6-C1-C6 Mangai Mangostinas, mangiferinas

Stilbenai

C6-C2-C6

Vynuogės Resveratrolis

Antrakvinonai Alavijas Emodinas

Flavonoidai, izoflavonoidai

C6-C3-C6 Dauguma augalų Kvercetinas, kemferolis ir kt.

Lignanai, neolignanai (C6-C3)2 Forzicijos, stirakai Pinoresinolis

Biflavonoidai (C6-C3-C6)2 Ginkmedţiai Agatisflavonas, bilobetinas

Ligninai (C6-C3)n Eleuterekokai Eleuterozidai

Kondensuoti taninai (C6-C3-C6)n Mėlynės Katechinas

Iš pateiktų klasių fenolinės rūgštys, flavonoidai ir taninai yra laikomi pagrindiniais mitybos fenoliniais junginiais [30].

Jie daţniausiai aptinkami vaistiniuose augaluose, prieskoniuose, darţovėse, vaisiuose ir įvairiose sėklose. Šie junginiai priklauso natūralių antioksidantų grupei ir turi teigiamą poveikį ţmogaus sveikatai. Jie gali apsaugoti nuo ţalingo reaktyviųjų deguonies formų poveikio, daugiausia nuo deguonies laisvųjų radikalų. Fenoliniai junginiai pasiţymi priešalerginiu, antiaterogeniniu, priešuţdegiminiu, antimikrobiniu, antitrombiniu, širdį ir kraujagysles apsaugančiu ir vazodilataciniu poveikiu [30, 32].

metu, reagentas reaguoja tik su fenoliniais junginiais, turinčiais kvinoninę struktūrą, dėl to šiuo metodu nustatoma maţiau fenolinių junginių [27, 32, 33].

Flavonoidai yra labiausiai paplitę polifenoliniai junginiai, kurie daţniausiai aptinkami valgomuose augaluose, ypač darţovėse ir vaisiuose. Skirtingose augalo dalyse kaupiama fenolinių junginių koncentracija skiriasi (3 lentelė) [31, 34].

3 lentelė. Santykinė fenolinių junginių koncentracija augalų organuose [31]

Audinys Santykinė koncentracija

Vaisiai Cinamono rūgštys > katechinai ≅ leukoantocianinai (flavan-3,4-dioliai) > flavonoliai

Lapai Flavonoliai ≅ cinamono rūgštys > katechinai ≅ leukoantocianinai

Ksilema Katechinai ≅ leukoantocianinai > flavanoliai > cinamono rūgštys

Ţievė Tokia pat seka kaip ir ksilemos, tik koncentracijos yra didesnės

Flavonoidai yra maţos molekulinės masės junginiai, sudaryti iš 15 anglies atomų, išsidėsčiusių C6-C3-C6 konfigūracijoje. Šių junginių struktūrą sudaro 2 aromatiniai ţiedai A ir B, kurie sujungti 3

anglies atomų tilteliu, susidarant heterocikliniam ţiedui C (3 pav.) [30].

3 pav. Bendra flavonoidų struktūrinė formulė [30]

Identifikuota daugiau kaip 4000 flavonoidų, kurie suskirstyti į kelis pogrupius. Trys flavonoidų klasės yra plačiai paplitusios ir kiekybiškai dominuoja: flavanoliai, flavonoliai, antocianinai, tačiau nėra pagrindiniai junginiai vaisiuose. Šios grupės vaisiams yra svarbūs junginiai oligomerinėse ir polimerinėse formose kaip proantocianidinai ar kondensuoti taninai [34].

Flavonoidai skirstomi į 4 grupes pagal modelį, apimantį eritrocitų membranos ţalos lygį, kurį sukelia lipidų peroksidacija ir padidėjęs pasyvus kalio jonų pralaidumas po superoksido dismutazės blokavimo:

kemferolis, naringeninas, apigeninas, naringinas.

 Junginiai, kurie didina deguonies laisvųjų radikalų ţalingą poveikį, pvz.: delfininas, miricetinas, kvercetinas.

 Junginiai, kurie priklausomai nuo koncentracijos gali pasiţymėti priešingomis savybėmis, pvz.: katechinas, morinas, floretinas

 Neaktyvūs junginiai: floridzinas, rutinas [31].

Tyrimai in vitro ir in vivo parodė, kad flavonoidai turi naudingų biologinių savybių, kurios gali atlikti svarbų vaidmenį ţmogaus sveikatai. Šie junginiai yra potencialūs antioksidantai, metalo chelatoriai ir pasiţymi lipidų peroksidacijos slopinimu.

Flavonoidai ţmogaus organizmą apsaugo nuo laisvųjų radikalų ţalingo poveikio, remiantis šiais mechanizmais:

 Tiesiogiai prisijungia reaktyviąsias deguonies formas (ROS);  Antioksidantinių fermentų aktyvinimas;

 Metalo chelatinimas;

 α-tokoferolio radikalų redukcija;  Oksidazių slopinimas;

 Oksidacinio streso, kurį sukelia azoto oksidas, sumaţinimas;  Šlapimo rūgšties padidinimas;

 Maţos molekulinės masės antioksidantų antioksidantinių savybių padidinimas [35].

Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad daţnas flavonoidų vartojimas yra susijęs su maţesne rizika susirgti lėtinėmis ligomis pvz.: širdies ir kraujagyslių ligomis [34].

1.8. Askorbo rūgštis

Askorbo rūgštis (vitaminas C) yra šešių anglies atomų laktonas, kuris yra sintezuojamas daugumos ţinduolių kepenyse iš gliukozės. Tačiau ţmogaus organizmas negamina vitamino C, nes neturi fermento, kuris svarbus šiai sintezei. Dėl šios prieţasties ţmonės turi pakankamai gauti vitamino C su maistu arba vartoti maisto papildus, kurių sudėtyje yra vitamino C [36].

Dauguma susirgimų, kuriuos, manoma, sukelia arba paspartina oksidacinis stresas, taip pat yra susiję su maţa vitamino C koncentracija kaujo plazmoje ir audiniuose. Daţniausiai tokias prooksidantines sąlygas sukelia rūkymas ir cukrinis diabetas. Taip pat vitamino C koncentracija organizme gali sumaţėti esant miokardo paţeidimui, ūminio pankreatito, infekcijų ir kitų susirgimų atveju [36].

Atlikti tyrimai parodė, kad askorbo rūgštis gali sumaţinti astmos, obstrukcinės plaučių ligos, širdies ir kraujagyslių ligų bei vėţio riziką. Taip pat pasiţymi gana dideliu gebėjimu surišti laisvuosius radikalus ir apsaugo nuo lipidų peroksidacijos [38].

1.9. Literatūros apţvalgos apibendrinimas

Šaltalankių vaisiai pasiţymi įvairiomis gydomosiomis savybėmis dėl jų sudėtyje esančių biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip: askorbo rūgštis, fenoliniai junginai, flavonoidai ir kt. Dėl šių junginių buvimo, šaltalankių vaisai pasiţymi antioksidantiniu ir imunomoduliaciniu veikimu.

Apibendrinant, galima teigti, kad lyginant iš skirtingų vietovių surinktų vaisių fitochemines sudėtis, gali būti nustatyti reikšmingi askorbo rūgšties ir bendro cukraus kiekybiniai skirtumai. Vaisių minkštimo aliejaus ir sėklų fitocheminė sudėtis priklausomai skiriasi nuo daugelio veiksnių: vaisių dydţio, rūšies, geografinės vietovės, klimato sąlygų, derliaus nuėmimo laiko ir ekstrakcijos metodų [8, 19, 20].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu tirta 10 dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides L.) veislių:  „Avgustinka‟  „Botaničeskaja‟  „Botaničeskaja Liubitelskoje‟  „Julia‟  „Nivelena‟  „Hibrid perčika‟  „Otradnaja‟  „Trofimovskaja‟  „Podarok sadu‟  „Vorobjevskaja‟

Vaisių pavyzdţiai buvo surinkti LAMMC Sodininkystės ir darţininkystės instituto kolekcijoje. Tyrimai buvo atlikti su pasirinktų veislių švieţiais vaisiais.

2.2. Naudoti reagentai

Ekstraktų gamybai buvo naudojamas 96,3 proc. V/V etanolis (,,Stumbras”, Lietuva). Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma – Aldrich, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (Sigma – Aldrich, Vokietija), natrio karbonatas (Na2CO3) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija), ledinė acto rūgštis 99,8

proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija), aliuminio chlorido heksahidratas (AlCl3×6H2O) (Fluka, Vokietija),

heksametilentetraminas (Lachema, Čekija), kvercetino dihidratas (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija), 2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin-6-sulfo rūgšties) diamonio druska (ABTS) (Alfa Aesar, Vokietija), kalio persulfatas (K2S2O8) (Alfa Aesar, Vokietija), geleţies chlorido heksahidratas

(FeCl3×6H2O) (Sigma – Aldrich, Vokietija), koncentruota druskos rūgštis (37 proc.) (konc. HCl)

(Sigma – Aldrich, Vokietija), 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) (Alfa Aesar, Vokietija), natrio acetatas (NaCH3COO) (Sigma – Aldrich, Vokietija), troloksas (Acros Organics, JAV).

2.3. Naudota aparatūra

2.4. Tiriamųjų mėginių paruošimas

Kiekvieno šaltalankių veislių vaisių mėginio atsveriamas tikslus svėrinys (apie 5 g), kuris po to yra homogenizuojamas grūstuvėje. Homogenizuota ţaliava uţpilama 25 ml 70 proc. V/V etanoliu ir paliekama parai tamsioje vietoje. Gautas maceratas filtruojamas per popierinį filtrą į rudo stiklo buteliukus, kurie buvo laikomi tamsioje, vėsioje vietoje.

2.5. Tyrimo metodai

2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriškai, naudojant Folin – Ciocalteu metodą.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas: imama 1 ml tiriamojo ekstrakto, sumaišoma su 5 ml darbinio Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 1 val. spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 765 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis, tik vietoj 1 ml tiriamojo ekstrakto pilama 1 ml 70 proc. V/V etanolio [39].

Etaloniniai galo rūgšties tirpalai buvo ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoj tiriamųjų ekstraktų buvo pilami 5 ţinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai (0,01 mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,075 mg/ml; 0,1 mg/ml). Išmatavus galo rūgšties ţinomų koncentracijų tirpalų absorbcijas, sudaryta kalibracinė kreivė (4 pav.).

4 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

ţaliavos ir apskaičiuojamas pagal šią formulę:

GAE=c×V/m, mg/g

c – galo rūgšties koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;

m – tikslus atsvertas ţaliavos kiekis g.

2.5.2. Bendro flavonoidų junginių kiekio nustatymas

Suminis flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriškai ir išreikštas rutino ekvivalentu. Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 10 ml matavimo kolbutę įpilant 0,4 ml tiriamojo ekstrakto, 4 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,2 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Praėjus 30 min., įpilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki ţymės, sumaišoma. Tirpalo absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 407 nm bangos ilgiui.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 10 ml matavimo kolbutę įpilant 0,4 ml tiriamojo ekstrakto, 4 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,2 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir praskiedţiant išgrynintu vandeniu iki ţymės.

Etaloninis rutino tirpalo tiriamasis ir palyginamasis tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, tik vietoje 0,4 ml tiriamojo ekstrakto įpilama 0,4 ml etaloninio rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,0125 g rutino tirpinant 20 ml 70 proc. V/V etanolyje. Pagaminami 5 ţinomos koncentracijos rutino tirpalai (0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,063 mg/ml; 0,031 mg/ml; 0,016 mg/ml). Nustačius rutino ţinomų koncentracijų tirpalų absorbcijas, sudaryta kalibracinė kreivė (5 pav.).

Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) gramui ţaliavos ir apskaičiuojamas pagal šią formulę ir rezultatas išreiškiamas mg/g.

RE=c×V/m, mg/g.

c – rutino koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;

m – tikslus atsvertas ţaliavos kiekis g.

2.5.3. Askorbo rūgšties nustatymas

Tikslus švieţių ir susmulkintų vaisių svėrinys (2,5 g) uţpilamas 25 ml išgryninto vandens. Po 10 min. maceratas sumaišomas ir nufiltruojamas per popierinį filtrą.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas į kolbą įpilus 0,5 ml vandenilio chlorido rūgšties 20 g/l tirpalo, 0,5 ml gautos ištraukos ir 6,5 ml išgryninto vandens.

Pagamintas tirpalas titruojamas mikrobiurete, titrantu naudojant natrio 2,6-dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalą, kol jis nusidaţo blyškia roţine spalva, neišnykstančia 10 sek.

2.5.4. Laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas ABTS metodu

Paruošiamas 2 mM koncentracijos motininis ABTS tirpalas, atsveriant ABTS miltelių ir ištirpinant distiliuotame vandenyje. Į gautą tirpalą pridedama kalio persulfato, mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje 16 val.

Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedţiant motininį ABTS tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, esant bangos ilgiui 734 nm. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas paimant 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir pridedant 20 μl tiriamojo ekstrakto. Paruoštas mišinys 1 val. laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis [39].

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui ţaliavos. Apskaičiuojama pagal šią formulę:

TEABTS=c×V/m, μmol/g

m – tikslus atsvertas ţaliavos kiekis g.

Tiriamuosiuose ekstraktuose esantys antioksidantinių junginių aktyvumas vertinamas pagal standartinį antioksidantą troloksą. Pagaminami 5 ţinomų koncentracijų trolokso tirpalai ir, nustačius jų absorbcijos dydţius, sudaryta kalibracinė kreivė (6 pav.).

6 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS metodu

2.5.5. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu

Naudojant FRAP metodą, ruošiami šie reagentai:

1. 300 mM acetatinis buferis: atsveriama 3,1 g natrio acetate, suberiama į 1000 ml matavimo kolbą, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedţiama distiliuotu vandeniu iki ţymės (pH 3,6).

2. 40 mM druskos rūgšties tirpale tirpinami atsverti TPTZ milteliai ir gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas. 3. Atsveriamas tikslus geleţies (III) chlorido heksahidrato kiekis ir ištirpinamas distiliuotame vandenyje. Gaunamas 20 mM geleţies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.

Darbinis FRAP reagentas ruošiamas, sumaišant 1, 2 ir 3 reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geleţies (III) chlorido heksahidrato tirpalo).

Tiriamasis tirpalas ruošiamas: paimama 3 ml darbinio FRAP reagento ir pridedama 20 μl tiriamojo ekstrakto. Paruoštas mišinys 1 val. laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 593 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj tiriamojo ekstrakto pilama tirpiklio.

TEFRAP=c×V/m, mg/g

c – trolokso koncentracija μM, nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris L;

m – tikslus atsvertas ţaliavos kiekis g.

Išmatavus standartinio antioksidanto – trolokso ţinomos koncentracijos tirpalų absorbcijas, buvo sudaryta kalibracinė kreivė (7 pav.).

7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP metodu

2.6. Fenolinių junginių nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Efektyvioji skysčių chromatografijos analizė atlikta ,,Water 2695 Alliance” su ,,Waters 2998” fotodiodų matricos detektoriumi. Bandiniai buvo injekuojami automatiniu injektoriumi. Chromatografinis skirstymas atliktas, naudojant 5-μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4.6 mm) kartu su 5-μm ACE C18 prieškolone 25 °C temperatūroje. Judri fazė sudaryta iš 1 proc. (v/v) skruzdţių rūgšties tirpalo (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Parinktas optimalus linijinis gradientas (4 lentelė). Tirpiklio tėkmės greitis – 1 mL/min, injekuojamo pavyzdţio tūris - 10 μL.

4 lentelė. Judrių fazių gradiento kitimas

Laikas, min Tirpiklis A, proc. (V/V) Tirpiklis B, proc. (V/V)

0 90 10

0-20 90-85 10-15

20-30 85 15

Chromatografinės smailės identifikuotos lyginant sulaikymo laikus bei spektrus su standartų smailėmis ir spektrais (λ = 200-600 nm). Kiekybinei analizei sudarytos kalibracinės kreivės gautos injekuojant ţinomų koncentracijų (2.5-100 μg/ml) skirtingus standartinius tirpalus.

2.7. Duomenų statistinis vertinimas

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas H. rhamnoides L. veislių vaisių

ekstraktuose.

Tyrimo metu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis 10 šaltalankių veislių įvairavo nuo 0,60±0,02 mg GAE/g iki 1,65±0,01 mg GAE/g. Didţiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas „Julia‟ veislės vaisių ekstrakte t.y. 1,65±0,01 mg GAE/g. Labai panašus fenolinių junginių kiekis nustatytas „Hibrid perčika‟ ir „Podarok sadu‟ veislių pavyzdţiuose (atitinkamai 1,11±0,03 mg GAE/g ir 1,12±0,04 mg GAE/g). „Vorobjevskaja‟ veislės vaisių etanoliniai ekstraktai pasiţymėjo vidutiniu fenolinių junginių kiekiu t.y. 0,96±0,02 mg GAE/g. Maţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „Botaničeskaja‟ veislės vaisiuose (0,60±0,02 mg GAE/g). Gauti duomenys pateikti 8 paveiksle.

Mūsų atlikto tyrimo rezultatai yra maţesni nei kitų autorių atliktų tyrimų rezultatai. P. Stratil ir kt. (2006, Čekijos Respublika) atlikto tyrimą, kuriame buvo nustatytas ir palygintas bendras fenolinių junginių kiekis įvairiuose liofilizuotuose vaisiuose (šaltalankių, aronijų, slyvų ir kt.). Bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas šaltalankio vaisiuose buvo 15,8 mg GAE/g, t.y. apie 15 kartų daugiau, lyginant su mūsų tyrimo metu nustatytu vidutiniu fenolinių junginių kiekiu [32].

8 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis skirtingų šaltalankių veislių vaisiuose

GAE/g; t.y. 14.42 mg GAE/g [20]. Tam įtakos galėjo turėti vaisių laikymo ir tiriamųjų ekstraktų paruošimo sąlygos, geografinė padėtis, klimato sąlygos.

Siekiant įvertinti šaltalankių vaisių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą pasirinktose šaltalankių veislėse, buvo sudaryta klasterinės analizės dendrograma, remiantis euklidiniu atstumu (9 pav.).

9 pav. Šaltalankių vaisiuose kaupiamo bendro fenolinių junginių kiekio priklausomybė nuo veislės

1 – ‘Vorobjevskaja’; 2 – ‘Julia’; 3 - ‘Nivelena’; 4 – ‘Trofimovskaja’; 5 – ‘Otradnaja’; 6 – ‘Hibrid perčika’; 7 – ‘Podarok sadu’; 8 – ‘Botaničeskaja’; 9 – ‘Avgustinka’; 10 – ‘Botaničeskaja

Liubitelskoje’.

Dendrogramoje matomi du pagrindiniai klasteriai (9 pav.). Pirmas klasteris skirstomas į du pogrupius (1a ir 1b). Pirmosios grupės pirmajam pogrupiui (1a) priklauso „Vorobjevskaja‟, „Trofimovskaja‟, „Hibrid perčika‟, „Podarok sadu‟ ir „Botaničeskaja Liubitelskoje‟ veislės, kurios pasiţymi vidutiniu suminiu fenolinių junginių kiekiu. Pirmajam b pogrupiui priklauso „Nivelena‟, „Otradnaja‟, „Botaničeskaja‟ ir „Avgustinka‟ veislės. Šių veislių vaisiuose buvo nustatytas maţesnis fenolinių junginių kiekis nei pirmiojo pogrupio (1a). Antrai klasterinei grupei priklauso tik viena „Julia‟ veislė, kurios vaisiai kaupia didţiausią bendrą fenolinių junginių kiekį.

3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Tirtuose šaltalankių veislių vaisių ekstrakuose flavonoidų kiekis svyravo nuo 0,21±0,01 RE/g iki 0,61±0,01 RE/g (10 pav.). Didţiausiu flavonoidų kiekiu pasiţymi „Podarok sadu‟ ir „Julia‟ veislių vaisių mėginiai (atitinkamai 0,61±0,01 RE/g ir 0,57±0,01 RE/g). Maţiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Botaničeskaja‟ veislės vaisiuose – 0,21±0,01 RE/g t.y. 2,9 karto maţiau uţ „Julia‟ veislės vaisiuose kaupiamą flavonoidų kiekį.

O. Rop ir kt. (Čekijos Respublika, 2012 m.) atliko tyrimą su šešių šaltalankių veislių vaisiais. Dvi iš šių veislių tirtos ir mūsų atlikto tyrimo metu t.y. „Trofimovskaja‟ ir „Botaničeskaja‟. Nustatytas bendras flavonoidų kiekis šių veislių vaisiuose buvo 7,97±0,75 RE/g ir 4,79±0,54 RE/g. Čekijos universiteto sode surinkti vaisai kaupia daug didesnį flavonoidų kiekį nei Lietuvoje augančios veislės [40].

2006 m. Indijoje R. Arimboor ir kt. atlikto tyrimo metu nustatytas bendras flavonoidų kiekis buvo 5,75 RE/g . Šis kiekis yra taip pat didesnis nei mūsų tyrimo metu nustatyti kiekiai [41].

Geografinė padėtis, dirvoţemis, kuriame augo augalai, klimato sąlygos galėjo turėti įtakos šiems nustatytiems skirtingiems flavonoidų kiekiams.

10 pav. Bendras flavonoidų kiekis skirtingose šaltalankių veislėse

Šiam pogrupiui būdingas vidutinis flavonoidų kiekis. Antrojoje klasterinėje grupėje yra dvi veislės: „Nivelena‟ ir „Botaničeskaja‟, kurių vaisiai kaupia maţiausią fenolinių junginių kiekį.

11 pav. Šaltalankių vaisiuose kaupiamo flavonoidų kiekio priklausomybė nuo veislės

1 – ‘Vorobjevskaja’; 2 – ‘Julia’; 3 - ‘Nivelena’; 4 – ‘Trofimovskaja’; 5 – ‘Otradnaja’; 6 – ‘Hibrid perčika’; 7 – ‘Podarok sadu’; 8 – ‘Botaničeskaja’; 9 – ‘Avgustinka’; 10 – ‘Botaničeskaja

Liubitelskoje’.

Atlikus vieno faktoriaus dispersinę analizę (ANOVA), nustatyta, kad flavonoidų kiekio skirtumai skirtinguose šaltalankių veislių vaisių mėginiuose yra statistiškai reikšmingi (P<0,01).

3.3. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas

Atlikus tyrimą nustatyta, kad askorbo rūgšties kiekis tirtose šaltalankio veislėse įvairavo nuo 0,18±0,002 proc. iki 0,84±0,01 proc. (12 pav.). Didţiausią askorbo rūgšties kiekį kaupia „Julia‟ veislės vaisiai – 0,84±0,01 proc., o maţiausiu askorbo rūgšties kiekiu pasiţymėjo „Botaničeskaja‟ veislės vaisių ekstraktas t.y. 0,18 proc. Vidutinis askorbo rūgšties kiekis nustatytas „Vorobjevskaja‟ veislės vaisiuose – 0,44±0,002 proc.

12 pav. Askorbo rūgšties kiekis skirtingose šaltalakių veislėse

O. Rop ir kt. (Čekijos Respublika, 2012 m.) atliktame tyrime buvo ištirtas askorbo rūgšties kiekis skirtingose šaltalankių veislių vaisiuose. Dvi iš pasirinktų veislių taip pat buvo „Trofimovskaja‟ ir „Botaničeskaja‟ Šių veislių vaisiuose atitinkamai buvo nustatyta 5,51 proc. ir 4,10 proc. askorbo rūgšties t.y. 11,7 karto daugiau nei Lietuvoje augančios „Trofimovskaja‟ veislės ir beveik 20 kartų daugiau nei „Botaničeskaja‟ veislės vaisiuose. [40]. Šiam dideliam askorbo rūgšties kiekio skirtumui įtakos galėjo turėti geografinė padėtis ir skirtingos tirtų veislių vaisių ekstraktų ekstrakcijos sąlygos, nes šio tyrimo metu švieţi vaisiai buvo homogenizuojami ir iš jų pagaminami ekstraktai, kurie buvo laikomi 4°C.

N. Jeppsson ir kt. (Švedijos universitetas, 2000 m.) taip pat atlikto askorbo rūgšties kiekio nustatymo tyrimą, kuriame buvo tiriami šaltalankių „Otradnaja‟, „Prozratnaja‟, „Gibrid Pertjik‟, „Aromatnaja‟, „Soljnjetnaja‟ veislių vaisiai. Šio tyrimo metu buvo nustatyta, kad askorbo rūgšties kiekis „Otradnaja‟ veislės vaisiuose yra 1,5 proc. t.y. 2,7 karto daugiau nei Lietuvoje augančios veislės. Lyginant šį skirtumą su Turkijoje atlikto tyrimo metu gautais rezultais, skirtumas nėra toks didelis [42].

13 pav. Šaltalankių vaisiuose kaupiamo askorbo rūgšties kiekio priklausomybė nuo veislės

1 – ‘Vorobjevskaja’; 2 – ‘Julia’; 3 - ‘Nivelena’; 4 – ‘Trofimovskaja’; 5 – ‘Otradnaja’; 6 – ‘Hibrid perčika’; 7 – ‘Podarok sadu’; 8 – ‘Botaničeskaja’; 9 – ‘Avgustinka’; 10 – ‘Botaničeskaja

Liubitelskoje’.

3.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

Vertinant tyrimo rezultatus, kurie yra pateikti 14 pav., matoma, kad antioksidantinio aktyvumo reikšmės įvairavo nuo 1,90±0,002 μmol TE/g iki 6,90±0,004 μmol TE/g švieţių vaisių. Maţiausia laisvųjų radikalų surišimo geba pasiţymi „Botaničeskaja‟ veislės vaisiai – 1,90±0,002 μmol TE/g, o „Julia‟ veislės vaisių ekstrakte nustatytas antioksidantinis aktyvumas yra didţiausias - 6,90±0,004 μmol TE/g. Taip pat dideliu laisvųjų radikalų surišimu pasiţymi ir „Podarok sadu‟ veislės vaisių ekstraktai – 6,79±0,001 μmol TE/g. „Hibrid perčika‟ veislės vaisiai pasiţymi vidutiniu antioksidantiniu aktyvumu – 4,50±0,002 μmol TE/g. „Julia‟ veislės vaisiams būdingas 3,63 karto didesnis antioksidantinis aktyvumas nei „Botaničeskaja‟veislės vaisiams. „Julia‟ veislės vaisių antioksidantinis aktyvumas yra didţiausias, nes ši veislė kaupia didţiausius kiekius biologiškai aktyvių junginių (fenolinių junginių, flavonoidų, askorbo rūgšties).

su mūsų tyrimo metu nustatyto šaltalankių veislių vaisių antioksidantinio aktyvumo reikšmių vidurkiu [39].

14 pav. Skirtingų šaltalankių veislių antioksidantinis aktyvumas ABTS metodu

Norint įvertinti koreliacinio ryšių stiprumą tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų, askorbo rūgšties kiekio ir antioksidantinio aktyvumo, nustatyto ABTS metodu, buvo apskaičiuoti Spirmeno koreliacijos koeficientai. Atlikus statistinę analizę, nustatyta stipri koreliacija tarp šaltalankio veislių vaisių ekstrakte nustatyto bendro fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (rs=0,988,

P<0,01). Nustatytas vidutinis koreliacijos ryšys tarp flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo (rs=0,758, P<0,05). Stiprus koreliacinis ryšys nustatytas tarp askorbo rūgšties kiekio ir antiradikalinio

aktyvumo galios (atitinkamai rs=0,976, P<0,01).

3.5. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Įvertinus redukcinį aktyvumą skirtingų veislių vaisių ekstraktuose, gauti rezultatai svyravo nuo 5,45±0,002 μmol TE/g iki 13,80±0,01 μmol TE/g (15 pav.). Didţiausiu redukciniu aktyvumu pasiţymi „Julia‟ veislės vaisių etanoliniai ekstraktai – 13,80±0,01 μmol TE/g, o maţiausiu - „Botaničeskaja‟ veislės vaisiai 5,45±0,002 μmol TE/g t.y. 2,53 karto maţesnis antioksidantinis aktyvumas nei „Julia‟ veislės vaisių. „Botaničeskaja‟ veislės vaisiams būdingas maţiausias antioksidantinis aktyvumas dėl to, kad kaupia maţiausius veikliųjų junginių kiekius.

15 pav. Skirtingų šaltalankių veislių antioksidantinis aktyvumas FRAP metodu

Norint įvertinti šaltalankių vaisių antioksidantinio aktyvumo įvairavimą pasirinktose šaltalankių veislėse, buvo sudaryta klasterinės analizės dendrograma (16 pav).

16 pav. Šaltalankio vaisių antioksidantinio aktyvumo priklausomybė nuo veislės

1 – ‘Vorobjevskaja’; 2 – ‘Julia’; 3 - ‘Nivelena’; 4 – ‘Trofimovskaja’; 5 – ‘Otradnaja’; 6 – ‘Hibrid perčika’; 7 – ‘Padarok sadu’; 8 – ‘Botaničeskaja’; 9 – ‘Avgustinka’; 10 – ‘Botaničeskaja

Liubitelskoje’.

„Trofimovskaja‟, „Hibrid perčika‟, „Padarok sadu‟ veislės priklauso antram a pogrupiui, kuriams taip pat būdingas vidutinis antioksidantinis aktyvumas. Antram b pogrupiui priklauso tik viena „Julia‟ veislė, kurios vaisiai pasiţymi didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu, nes šios veislės vaisiai kaupia daugiausiai biologiškai aktyvių junginių.

Apskaičiavus Spirmeno koeficientus, nustatyta stipri koreliacija tarp šaltalankio veislių vaisiuose nustatyto bendro fenolinių junginių kiekio ir redukcinio aktyvumo (rs= 0,915, P<0,01).

Nustatytas vidutinis koreliacijos ryšys tarp flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo (rs= 0,600,

P<0,05). Stiprus koreliacinis ryšys nustatytas tarp askorbo rūgšties kiekio ir geleţies jonų redukcijos antioksidantinės galios (rs= 0,952, P<0,01).

Remiantis nustatytais koreliacijos koeficientais, galima teigti, kad didėjant bendram fenolinių junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekiui, taip pat didėja ir antioksidantinis aktyvumas.

3.6. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė ESC metodu.

Atlikus fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę šaltalankių veislių vaisiuose ESC metodu, gauti duomenys pateikti 5 lentelėje.

Iš 5-os lentelės matyti, kad didţiausią galo rūgšties kiekį kaupia „Botaničeskaja‟ veislės vaisiai (14,16 µg/g), o maţiausią - „Hibrid perčika‟ (6,49 µg/g). Didţiausias katechino kiekis nustatytas „Julia‟ ţaliavos ekstrakte (177,60 µg/g), o maţiausias – „Botaničeskaja‟ ir „Botaničeskaja Liubitelskoje‟ veislių ekstraktuose (atitinkamai 37,48 µg/g ir 35,20 µg/g). Kvercetin-3-O-rutinozido daugiausia nustatyta „Trofimovskaja‟ ekstrakte (280,04 µg/g), o maţiausia – „Julia‟vaisių ekstrakte (99,37 µg/g). Didţiausiu kvercetin-3-O-gliukozido kiekiu pasiţymi „Avgustinka‟veislės vaisiai (32,51 µg/g), o maţiausiu kiekiu – „Julia‟ (19,54 µg/g). „Nivelena‟ veislės vaisiuose nustatytas didţiausias kiekis izoramnetin-3-O-gliukozido (195,0 µg/g), o maţiausias – „Julia‟ ir „Vorobjevskaja‟ veislių vaisių ekstraktuose (atitinkamai 89,19 µg/g ir 91,41 µg/g). Maţiausią kvercetino kiekį kaupia „Julia‟ veislė (2,68 µg/g), o didţiausią - „Avgustinka‟ veislė (5,09 µg/g). Maţiausias izoramnetino kiekis nustatytas „Julia‟ veislės vaisių ekstrakte (3,58 µg/g), o didţiausias – „Padarok sadu‟ ir „Botaničeskaja‟ ekstrakte (atitinkamai 8,05 µg/g ir 8,51 µg/g).

17 pav. Šaltalankių vaisių ekstraktuose nustatytų fenolinių junginių chromatogramos

1. Galo rūgštis; 2. Katechinas; 3. Kvercetin-3-O-rutinozidas; 4. Kvercetin-3-O-gliukozidas; 5. izoramnetin-3-O-rutinozidas; 6. Izoramnetin-3-O-gliukozidas; 7. Kvercetinas; 8. Izoramnetinas.

C. Chen ir kt. (Kinija, 2007) tyrė švieţių šaltalankių vaisių, kurie buvo surinkti iš skirtingų augimviečių, sudėtį ESC metodu. Tyrimo metu nustatyta 12 junginių: kvercetin-3-O-soforozido-7-O-ramnozidas, kemferol-3-O-soforozido-7-O-kvercetin-3-O-soforozido-7-O-ramnozidas, izoramnetin-3-O-soforozido-7-O-kvercetin-3-O-soforozido-7-O-ramnozidas, izoramnetin-3-O-gliukozid-7-O-ramnozidas, kvercetin-3-O-rutinozidas, kvercetin-3-O-gliukozidas, izoramnetin-3-O-rutinozidas, izoramnetin-3-O-gliukozidas, katechinas, kemferol-7-O-ramnozidas, kemferolis ir izoramnetinas. Lyginant junginių kiekius, kurie buvo nustatyti ir mūsų tyrimo metu, pvz.: kvercetin-3-O-rutinozido, buvo nustatyta 58 µg/g, kvercetin-3-O-gliukozido – 67 µg/g, izoramnetin-3-O-rutinozido – 850 µg/g, izoramnetin-3-O-gliukozido – 134 µg/g, izoramnezido – 18 µg/g [43].

IŠVADOS

1. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis tirtuose šaltalankių veislių vaisiuose varijavo nuo 0,60±0,02 mg GAE/g iki 1,65±0,01 mg GAE/g. Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas „Julia‟ veislės vaisių ekstrakte (1,65±0,01 mg GAE/g). Maţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „Botaničeskaja‟ veislės vaisiuose (0,60±0,02 mg GAE/g).

2. Flavonoidų kiekis tirtose šaltalankio veislėse įvairavo nuo 0,21±0,01 RE/g iki 0,61±0,01 RE/g. Didţiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Padarok sadu‟ ir „Julia‟ veislių vaisiuose (atitinkamai 0,61±0,01 RE/g ir 0,57±0,01 RE/g). Taip pat „Julia‟ veislės vaisiai pasiţymi didţiausiu askorbo rūgšties kiekiu (0,84±0,01 proc.). Maţiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Botaničeskaja‟ veislės vaisiuose – 0,21±0,01 RE/g.

3. Didţiausias šaltalankių veislių vaisiuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS ir FRAP metodais buvo „Julia‟ ţaliavos ekstrakte (atitinkamai 6,90±0,003

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis atlikto tyrimo rezultatais, Lietuvos klimato sąlygomis tinkamiausia auginti „Julia‟ veislę, kurios vaisiuose nustatyti didţiausi fenolinių junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekiai, dėl šios prieţasties vaisiai pasiţymi didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Urso M.L, Clarkson P.M. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation. Toxicology. 2003;189:41–54.

2. McCord J.M. The evolution of free radicals and oxidative stress. Am J Med. 2000;108:652–9. 3. Cooper C.E, Vollaard N.B.J, Choueiri T, Wilson M.T. Exercise, free radicals and oxidative

stress. Biochem Soc Trans. 2002;30:280–5.

4. Hurtado-Fernández E, Gómez-Romero M, Carrasco-Pancorbo A, Fernández-Gutiérrez A. Application and potential of capillary electroseparation methods to determine antioxidant phenolic compounds from plant food material. J Pharm Biomed Anal. 2010;53:1130–60.

5. Papuc C, Diaconescu C, Nicorescu V. Antioxidant activity of sea buckthorn (Hippophae

rhamnoides) extracts compared with common food additives. Rom Biotechnol Lett.

2008;13(6):4049–53.

6. Bal L.M, Meda V, Naik S.N, Satya S. Sea buckthorn berries: A potential source of valuable nutrients for nutraceuticals and cosmoceuticals. Food Res Int. 2011;44(7):1718–27.

7. Navasaitis M. Dendrologija. p.691–2nd ed. Vilnius: Margi raštai; 2004.

8. Suryakumar G, Gupta A. Medicinal and therapeutic potential of Sea buckthorn (Hippophae

rhamnoides L.). J Ethnopharmacol. 2011;138(2):268–78.

9. Sun K, Chen X, Ma R, Li C, Wang Q, Ge S. Molecular phylogenetics of Hippophae L. (Elaeagnaceae) based on the internal transcribed spacer (ITS) sequences of nrDNA. Plant Syst Evol. 2002;235:121–34.

10. Jia D.R, Abbott R.J, Liu T.L, Mao K.S, Bartish I.V., Liu J.Q. Out of the Qinghai-Tibet Plateau: Evidence for the origin and dispersal of Eurasian temperate plants from a phylogeographic study of Hippophaё rhamnoides (Elaeagnaceae). New Phytol. 2012;194:1123–33.

11. Bekker N.P, Glushenkova A. I. Components of certain species of the Elaeagnaceae family. Chem Nat Compd. 2001;37(2):97–116.

12. Pop R.M, Weesepoel Y, Socaciu C, Pintea A, Vincken J.P, Gruppen H. Carotenoid composition of berries and leaves from six Romanian sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) varieties. Food Chem. 2014;147:1–9.

13. Geetha S, Sai Ram M, Singh V, Ilavazhagan G, Sawhney RC. Anti-oxidant and immunomodulatory properties of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides)-an in vitro study. J Ethnopharmacol. 2002;79:373–8.

15. Geetha S, Ram M.S, Mongia S.S, Singh V, Ilavazhagan G, Sawhney R.C. Evaluation of antioxidant activity of leaf extract of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) on chromium(VI) induced oxidative stress in albino rats. J Ethnopharmacol. 2003;87:247–51. 16. Lim S.R, Go E.B, Go G, Shin H.S, Sung J.S. Antioxidative mechanisms of sea buckthorn fruit

extract in mouse embryonic fibroblast cells. Food Sci Biotechnol. 2013;22:197–204.

17. Negi P.S, Chauhan A.S, Sadia G.A., Rohinishree Y.S, Ramteke R.S. Antioxidant and antibacterial activities of various seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed extracts. Food Chem. 2005;92:119–24.

18. WHO. Fructus Hippophaёs recens. WHO monographs on medicinal plants commonly used in the Newly Independent States (NIS). 2010;(Geneva):187–97.

19. Tian C, Nan P, Chen J, Zhong Y. Volatile composition of Chinese Hippophae rhamnoides and its chemotaxonomic implications. Biochem Syst Ecol. 2004;32:431–41.

20. Zadernowski R, Naczk M, Czaplicki S, Rubinskiene M, Szałkiewicz M. Composition of phenolic acids in sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) berries. JAOCS, J Am Oil Chem Soc. 2005;82:175–9.

21. Gutiérrez L.F, Ratti C, Belkacemi K. Effects of drying method on the extraction yields and quality of oils from quebec sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seeds and pulp. Food Chem. 2008;106:896–904.

22. Yang B. Sugars, acids, ethyl β-d-glucopyranose and a methyl inositol in sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) berries. Food Chem. 2009;112:89–97.

23. Li T.S.C, Schroeder W.R. Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.): A multipurpose plant. Horttechnology. 1996;6(4):370–80.

24. Andreoli T.E. Free radicals and oxidative stress. Am J Med. 2000;108:650–1.

25. Temple N.J. Antioxidants and disease: more question than answers. Nutr Res. 2000;20(3):449– 59.

26. Surveswaran S, Cai Y.Z, Corke H, Sun M. Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants. Food Chem. 2007;102:938–53.

27. Fu L, Xu Bo-T, Xu X-R, Gan R-T, Zhang Y, Xia E-Q, Li H-B. Antioxidant capacities and total phenolic contents of 62 fruits. Food Chem. 2011;129:345–50.

28. Wojdyło A, Oszmiański J, Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 2007;105:940–9.

30. Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food Chem. 2006;99:191–203. 31. Robards K, Prenzler P.D, Tucker G, Swatsitang P, Glover W. Phenolic compounds and their

role in oxidative processes in fruits. Food Chem. 1999;66:401–36.

32. Stratil P, Klejdus B, Kubáň V. Determination of phenolic compounds and their antioxidant activity in fruits and cereals. Talanta. 2007;71:1741–51.

33. Blainski A, Lopes G.C, De Mello J.C.P. Application and analysis of the folin ciocalteu method for the determination of the total phenolic content from limonium brasiliense L. Molecules. 2013;18:6852–65.

34. Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Meier C, Kähkönen M, Heinonen M, Hopia A. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. J Appl Microbiol. 2001;90:494–507.

35. Procházková D, Boušová I, Wilhelmová N. Antioxidant and prooxidant properties of flavonoids. Fitoterapia. 2011;82(524):513–23.

36. Padayatty S.J, Katz A, Wang Y, Eck P, Kwon O, Lee J-H. Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention. J Am Coll Nutr. 2003;22:18–35.

37. Smirnoff N, Wheeler G.L. Ascorbic acid in plants: biosynthesis and function. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2000;35(4):291–314.

38. Gutzeit D, Baleanu G, Winterhalter P, Jerz G. Vitamin C content in sea buckthorn berries (Hippophae rhamnoides L.) and related products: A kinetic study on storage stability and the determination of processing effects. J Food Sci. 2008;73(9):615–20.

39. Varshneya C, Kant V, Mehta M. Total phenolic contents and free radical scavenging activities of different extracts of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) pomace without seeds. Int J Food Sci Nutr. 2012;63:153–9.

40. Rop O, Ercişli S, Mlcek J, Jurikova T, Hoza I. Antioxidant and radical scavenging activities in fruits of 6 sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) cultivars. Turkish J Agric For. 2014;38:224–32.

41. R. Arimboor, V. Venugopalan K.S. Integrated processing of fresh Indian sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) berries and chemical evaluation of products. J Sci Food Agric. 2006;10:100-103.

42. Jeppsson N, Gao X. Changes in the contents of kaempherol, quercetin and L-ascorbic acid in sea buckthorn berries during maturation. J Sci Food Agric 2000;9:17–22.

44. Michel T, Destandau E, Elfakir C. On-line hyphenation of centrifugal partition chromatography and high pressure liquid chromatography for the fractionation of flavonoids from Hippophae

PRIEDAI