LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Akvilė Surgailytė
Šmalenbergo viruso paplitimas ir epidemiologiniai tyrimai
atrajotojų populiacijoje
The prevalence of Schmallenberg virus and
epidemiological studies in the ruminant population
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Algirdas Šalomskas
2
DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šmalenbergo viruso paplitimas ir epidemiologiniai tyrimai atrajotojų populiacijoje“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROSAPŽVALGA ... 9 1.1. Viruso charakteristika ... 91.1.1. Viruso klasifikacija ir filogenezė ... 9
1.1.2. Viruso taksonomija ir genomo organizacija ... 9
1.1.3. Viruso replikacija ... 12
1.2. Šmalenbergo viruso tarprūšinis pasiskirstymas ... 12
1.3. Viruso perdavimo būdai ... 13
1.4. Šmalenbergo viruso paplitimas ... 14
1.5. Šmalenbergo ligos charakteristika ... 14
1.5.1. Patogenezė ... 14
1.5.2. Klinikiniai požymiai ... 15
1.5.3. Patologiniai anatominiai požymiai ... 16
1.5.4. Diagnostika ... 16
2. TYRIMOMETODAIIRMEDŽIAGA ... 18
2.1. Mėginių surinkimas ... 18
2.2. Šmalenbergo viruso antikūnų tyrimo metodas ... 18
2.3. Statistinė duomenų analizė ... 19
4
SANTRAUKA
Šmalenbergo ligos paplitimas ir epidemiologiniai tyrimai atrajotojų populiacijoje Akvilė Surgailytė
Magistro baigiamasis darbas
Darbo tikslas: nustatyti Šmalenbergo ligos paplitimą atrajotojų populiacijoje. Tyrimai atlikti 2014 -2016 metų laikotarpyje, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje. Darbo apimtis: 38 lapai, 9 lentelės, 5 paveikslėliai, panaudota 61 literatūros šaltinis.
2014- 2016 metų laikotarpiu skirtinguose Lietuvos regionuose surinkti galvijų (n=664), avių (n=28) ir elnių (n=53) kraujo mėginiai serologiniams tyrimams Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu. Mėginiai ištirti komerciniu netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) testu (IDvet) ir 2014 metais nustatytas 16,73 proc. serologiškai teigiamų galvijų paplitimas tirtoje populiacijoje, tai yra daugiau, lyginant su 2016 metais atliktu tyrimu, kurio metu nustatytas 1,72 proc. Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu teigiamų galvijų paplitimas. Galvijų populiacijoje nustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų susidarymo ir tirtų amžiaus grupių bei Lietuvos regionų: didžiausias teigiamų mėginių skaičius nustatytas pirmaveršių ir karvių amžiaus grupėse, bei Lietuvos pietvakariniuose regionuose. Avių populiacijoje nustatytas 35,71 proc. antikūnų paplitimas, elnių – 32,08 proc. paplitimas. Tiek avių, tiek elnių populiacijoje nenustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų susidarymo ir amžiaus grupių dėl mažos mėginių imties, tačiau duomenys, gauti iš elnių mėginių, leidžia įtarti elnių kaip viruso rezervuaro laukinėje faunoje vaidmenį. Nepriklausomai nuo gyvūno rūšies 2014 metais nustatytas 16,73 proc. serologiškai teigiamų atrajotojų paplitimas, o 2016 metais – 11,8 proc. Didžiausas teigiamų mėginių skaičius nustatytas avių tarpe (35,71 proc.), mažiausias nustatytas galvijų tarpe (12,8 proc.).
5
SUMMARY
The prevalence of Schmallenberg virus and epidemiological studies in the ruminant population
Akvilė Surgailytė Master‘s Thesis
The aim of the study was to determine the prevalence of Schmallenberg virus (SBV) infection in the ruminant population of Lithuania. The study was carried out during the period 2014-2016 at the Department of Veterinary Pathobiology of the Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences and the National Institute of Food and Veterinary Risk Assessment Institute. Thesis consists of 38 pages, 9 tables, 5 figures and 61 references.
Blood samples were collected from cattle (n = 664), ovine (n = 28) and reindeer (n = 53) in different regions of Lithuania during the period of 2014 - 2016 and tested for Schmallenberg virus antibodies. Samples were tested with the commercial indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test (IDvet). In year 2014 16,73% of bovine population had antibodies against Schmallenberg virus, whereas in year 2016 only 1,72% of population had antibodies against virus. In the bovine population, there was a causal relationship between the generation of antibodies and the studied age groups and regions of Lithuania: the highest number of positive samples were found in the heifers and cows population, as well as in the southwestern regions of Lithuania. 35,71% of sheep population had antibodies against Schmallenberg virus, as well as 32,08% of deer population. However, there is no association between antibodies and age groups due to the small sample in the sheep and deer population, but data from deer samples suggests that the role of deer as a virus reservoir in wildlife. Regardless of the species of the animal, in year 2014 the prevalence of serologically positive ruminants was 16,73%, and in year 2016 - 11.8%. The highest number of positive samples was found in sheep (35.71%), the lowest was found among cattle (12.8%).
6
SANTRUMPOS
̊C – laipsniai Celsijaus angl. - angliškai
CNS – centrinė nervų sistema
EDTA – dinatrio etilendiamino-tetraacetatas IFA (ELISA) – imunofermentinė analizė Lent. – lentelė
n – mėginių (imties) skaičius ORF – atviro nuskaitymo seka
PGR – polimerazės grandininė reakcija PI – patikimumo intervalas
proc. – procentai
7
ĮVADAS
2011 metų vasaros gale ir rudenio pradžioje, šiaurės vakarų Vokietijos ir Nyderlandų suaugusių pieninių galvijų bandose pastebėti karščiavimo požymiai ir sumažėjusi pieno produkcija (1). Nyderlanduose keletoje atvejų buvo nustatyti silpni viduriavimo požymiai (2). Mėlynojo liežuvio virusas sukelia panašius klinikinius simptomus, todėl buvo baiminamasi 2006 - 2008 metų laikotarpyje vykusio ligos protrūkio pasikartojimo. Stebėtinai, iš klinikinus simptomus turinčių galvijų mėginių nebuvo išskirtas nė vienas žinomas patogenas (3). 2011 metų lapkričio mėnesį, Frydricho Lioflerio institute, Vokietijoje ištirti 3, netoli Šmalenbergo miesto (šiaurės Reinas- Vestfalija) esančio galvijų ūkio, kliniškai sergančių galvijų kraujo mėginiai ir nustatyta naujo viruso RNR. Virusas pavadintas Šmalenbergo miesto vardu (4).
Lyginamoji genetinė analizė parodė, kad šis naujai atrastas virusas turi panašių savybių su
Orthobunyavirus genties virusais (Akabane ir Aino virusais). Nors SBV virusas identifikuotas tik
2011 metų vėlų rudenį, SBV Europoje pasirodė ankščiau: 2011 metų vasaros laikotarpyje Belgijoje sugautų Culicoides spp. mašalų galvų nustatyta SBV teigiama atvirkštinės transkripcijos polimerazinės grandinės reakcija (5) ir buvo nustatyta viruso cirkuliacija mažiausiai 3 Italijos provincijose nuo 2011 metų rugsėjo mėnesio pradžios (6). Nuo 2011 metų iki dabar, SBV viruso geografinis pasiskirstymas didėja ir užima beveik visas Europos valstybes.
Galvijai, avys, ožkos – pagrindiniai viruso rezervuarai. Teigiami serologiniai tyrimai taip pat nustatyti ir elniuose, briedžiuose, muflonuose, danieliuose, raudonuosiuose elniuose, stirnose, dėmėtuosiuose elniuose ir laukiniuose šernuose, keletoje atvejų šunyse ir alpakose (7). SBV infekcija minimaliai arba limituotai pažeidžia infekuoto gyvūno sveikatą, tačiau sukelia reprodukcijos sutrikimų. Remiantis skirtingų Europos šalių pateiktais duomenimis, SBV infekuotų gyvūnų sergamumas ir mirtingumas mažesnis nei 3 proc. (1). SBV virusą turinčios avių ir galvijų bandos atitinkamai sudaro 6,6 proc. ir 4 proc. lyginant su visomis bandomis priklausomai nuo regiono. Tačiau, sunku tiksliai nustatyti viruso paveiktas bandas ir įvertinti ligos sukeliamus ūkinių gyvūnų industrijos ekonominius nuostolius, kadangi tikėtina, jog dauguma ligos atvejų nenustatyti ir neregistruoti (8).
8
paplitimo mastą šalies atrajotojų ūkiuose, kartu efektyviau skiriant diagnostines priemones bei efektyvų prevencinių priemonių praktikinį pritaikymą ir taip sumažinti ūkiui virusinės ligos padarytus nuostolius.
Darbo tikslas: nustatyti Šmalenbergo ligos virusų paplitimą atrajotojų populiacijoje. Darbo uždaviniai:
1. Imunofermentinės analizės metodu ištirti Šmalenbergo virusui specifinius antikūnus Lietuvos atrajotojų populiacijoje.
2. Išanalizuoti Šmalenbergo viruso specifinių antikūnų paplitimą skirtingose atrajotojų amžiaus grupėse.
9
1.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.Viruso charakteristika
1.1.1.Viruso klasifikacija ir filogenezėRemiantis filogenetinės analizės duomenimis, Šmalenbergo virusas priklauso Bunyraviridae šeimos Orthobunyavirus genčiai, Simbu serogrupei (11). Orthobunyavirus genčiai priklausantys virusai turi neigiamo poliariškumo RNR genomą, sudarytą iš didelio (L), vidutinio (M) ir mažo (S) segmentų. Tarp šiai genčiai priklausančių virusų genetiniai pasiskirstymai įvyksta natūraliai, kurių metu atsiranda naujos virusų padermės su pakitusiomis biologinėmis savybėmis (12).
Siekiant nustatyti SBV genominį tapatumą, ištirtos 9 Simbu serogrupei priklausančių virusų L, M ir S segmentų sekos: Shamonda, Peaton ir Sango virusų, priklausančių Shamondas virus rūšiai; Douglas ir Sathuperi virusų, priklausančių Sathuperi virus rūšiai; Aino ir Shuni virusų, priklausančių Shuni virus rūšiai; Sabo virusų, priklausančių Akabane virus rūšiai ir Simbu virusų, priklausančių Simbu virus rūšiai. Papildomai buvo naudojama duomenų bazėje turima informacija apie Akabane ir Oropouche virusų genetinę seką. Nustatytas Šmalenbergo viruso N nukleoproteino sekos tapatumas kitiems virusas varijavo nuo 69,8 proc. (69,9 proc. animorūgščių tapatumas su Oropouche virusu) iki 97,7 proc. (100 proc. aminorūgščių tapatumas su Shamonda virusu). Šmalenbergo viruso L segmento genetinės sekos panašumas Oropouche virusui buvo mažiausias (60,4 proc. nukleotidų ir 57,5 proc. aminorūgščių tapatumas), Shamonda virusui – didžiausias (92,9 proc. nukleotidų ir 98,4 proc. aminorūgščių tapatumas). Viruso M segmento genetinės sekos panašumas Sathuperi virusui buvo didžiausias (82,1 proc. nukleotidų ir 90,1 proc. aminorūgščių tapatumas), Shamonda virusui – mažiausias (48,2 proc. nukleotidų ir 36,5 proc. aminorūgščių tapatumas). Šmalenbergo viruso genomo segmentų tyrimas rodo, kad virusas priskiriamas Sathuperi
virus rūšiai ir galimai yra Shamonda viruso pirmtakas (13).
1.1.2.Viruso taksonomija ir genomo organizacija
Bunyaviridae šeimai priklauso keli šimtai virusų, kurie paplitę Azijoje, Afrikoje ir
10
Šmalenbergo apvalkalėtasis virusas (1 pav.) turi viengubos, segmentuotos grandinės neigiamo poliariškumo RNR genomą, kuris sudarytas iš trijų segmentų: mažojo (S) segmento , turinčio 702 nukleotidų (233 aminorūgščių) seką, vidutiniojo (M) , turinčio 4212 nukleotidų (1403 aminorūgščių) seką ir didžiojo (L) segmento, turinčio 6765 nukleoditų (2254 aminorūgščių) seką.
Neigiamo poliariškumo RNR 5‘ ir 3‘ galuose dėstosi netrasliuojami regionai (ang.
untranslated region (UTR)) ir S segmente viena persidengianti atviro nuskaitymo seka (angl. open reading frame (ORF)) (16). Viruso L segmentas koduoja nuo RNR priklausančią RNR polimerazę,
M segmentas koduoja proteiną, kuris veikia kaip dviejų glikoproteinų Gn ir Gc bei nestruktūrinio proteino NSm pirmtakas. S segmentas koduoja N nukleoproteiną ir ORF esantį nestruktūrinį NSs proteiną (17).
N nukleoproteinas inkapsuliuoja visus tris RNR genominius segmentus, sudarydamas ribonukleoproteininius kompleksus, kuriuose L polimerazės kopijos dalyvauja viruso RNR transkripcijoje ir replikacijoje. N nukleoproteinas dažniausiai aptinkama dalelė tiek viruse, tiek infekuotose ląstelėse ir naudojamas Šmalenbergo ligos serologiniuose ir molekuliniuose tyrimuose
1 pav. Schematinė Orthobunyavirus genties viruso ir Šmalenbergo viruso antigeninė struktūra (22). (A) Orthobunyavirus genties apvalkalėtieji virusai su 2 glikoproteinais (Gn ir Gc) ir 3
11
(18). SBV nukleoproteino (N) protomeras (2 pav.) sudarytas iš dviejų domenų (N-terminalinis domenas ir C-terminalinis domenas) ir dviejų laisvų rankų (N-terminalinė ranka ir C-terminalinė ranka) su linkiu.
N-terminalinis domenas sudarytas iš 19-127 radikalų, kurie formuoja penkias α spirales (nuo α1 iki α5) ir dvi antiparalelines β gijas (β1 ir β2). C-terminalinis domenas sudarytas iš 128-213 radikalų, kurie formuoja šešias spirales (nuo α6 iki α11). Lanksčioji N-terminalinė ranka ( nuo 1 iki 18 radikalų) ir C-terminalinė ranka (nuo 214 iki 230 radikalų) išsitiesia tolyn nuo proteino kūno. Kaip ir kiti neigiamo poliariškumo RNR virusų nukleoproteinai , tarp N ir C-terminalinių domenų esanti ertmė pasižymi aukšta teigiama poliarizacija, kas leidžia daryti prielaidą jog tai genominė RNR prisitvirtinimo vieta (19). Apvalkalėlio Gn ir Gc glikoproteinai formuoja heterodimerus, spyglio formos projekcijas, kurios dalyvauja receptorių atpažinime ir susijungime. SBV Gc glikoproteino N-terminalinė zona turi daugiafunkcinį regioną, kuris galimai dalyvauja šeimininko ląstelės imuninio atsako slopinime, receptorių atpažinime ir viruso replikacijoje (20).
Nestruktūrinis NSm proteinas kartu su Gn ir Gc glikoproteinais randamas Goldžio komplekse ir manomai dalyvauja kaip pagalbiniai proteinai viruso surinkime ir morfogenezėje šeimininko ląstelėje. Nors tiksli NSm funkcija kol kas nėra žinoma, manoma, jog jis dalyvauja viruso struktūrų surinkime ir morfogenezėje, bei galimai sąveikauja su NSs nestruktūriniu proteinu (21).
S segmento ORF koduojamas nestruktūrinis NSs proteinas manomai veikia kaip interferono ir šeimininko ląstelių proteinų sintezės antagonistas, dalyvauja transliacijos, apoptozės ir viruso polimerazės aktyvumo reguliavime biologiniuose vektoriuose.
2 pav. Šmalenbergo viruso nukleoproteino protomerinė struktūra (19). Nukleoproteinas N
12
1.1.3.Viruso replikacija
SBV virusas atrastas ganėtinai nesenai, kas lemia tikslių duomenų, apibūdinančių pilno viruso ciklo šeimininko ląstelėje molekulinę schemą, trūkumą. Kadangi Šmalenbergo virusas priklauso Burnyaviridae šeimai, remiantis sukaupta informacija galima teigti, kad viruso replikacijos ciklas vyksta tik šeimininko ląstelės citoplazmoje. Šmalenbergo virusas yra apvalkalėtasis, kurio genomą dengia apvalkalo glikoproteinai Gn ir Gc (21). Replikacijos ciklas prasideda viruso apvalkalėlio glikoproteinų dimerams Gn ir Gc prisijungus prie tam tikrų šeimininko ląstelės receptorių ir endocitozės būdu patenkant į citoplazmą. Pakitus pH inicijuojama viruso apvalkalėlio glikoproteinų modifikacija – apvalkalas susijungia su endosomų membranomis ir RNR išskiriama į citoplazmą. Prasideda pirminė transkripcija, kurios metu produkuojama informacinė RNR (iRNR).
Nuo RNR priklausoma RNR polimerazė L (arba L proteinas) būtina viruso replikacijos iniciacijai. Pastaroji prisitvirtina prie 5‘ genomo galo ir sintetina 10-18 nukleotidų seką, kuri naudojama kaip viruso transkripcijos iniciacijos pradmenys. Dėka šeimininko ląstelės ribosomų transliacijos metu susintetinami viruso proteinai (22).
Iš laisvųjų nukleotidų, viruso polimerazė L sintetina laisvas viruso genomo kopijas – antigenomus, kurie bus naudojami kaip RNR naujų virusų genomų produkcijai. Naujai susintetinti genomai RNR kaupiami šeimininko ląstelės Goldi komplekse, kuriame sąveikauja su nukleoproteino (N) C- terminaliniu domenu. Susiformavęs virusas pašalinamas per Goldi komplekso modifikuotą membraną pumpuravimo būdu. Šiuo atveju manoma, kad M-segmento išskiriamas NSm nestruktūrinis proteinas sąveikaudamas su Goldi kompleksu dalyvauja viruso pašalinime iš Goldi komplekso, bei transportavime iki ląstelės membranos ir pašalinime egzocitozės (arba pumpuravimo būdu) (22).
1.2.Šmalenbergo viruso tarprūšinis pasiskirstymas
Šmalenbergo viruso antigenai ir RNR pirmiausia išskirti iš kliniškai sergančių galvijų, avių ir ožkų, atitinkamai išskirti ir antikūnai iš infekcija persirgusių gyvūnų (4). Teigiami SBV serologiniai tyrimai nustatyti Vokietijos, Belgijos, Lenkijos, Ispanijos, Švedijos ir Airijos laukinėje faunoje: briedžiuose (Alces alces), muflonuose, danieliuose, raudonuosiuose elniuose, stirnose, dėmėtuose elniuose ir laukiniuose šernuose (1, 11, 23-27). Mažesnis serologinis paplitimas laukiniuose gyvūnuose lyginant su domestikuotomis ūkinių gyvūnų rūšimis leidžia daryti perdavimo poveikio (angl. spill-over effect) nuo laukinių gyvūnų naminiams prielaidą. SBV transmisijos ciklas laukinių gyvūnų populiacijoje galimai svarbus viruso išgyvenamumui žiemos sezonu ir naujų infekcijų atsiradime viruso vektorių sezono metu (7).
13
priklausančioje alpakoje taip pat nustatyti Šmalenbergo viruso antikūnai, kai tuo tarpu lamų serologiniai tyrimai buvo neigiami (23, 28).
Švedijoje vienam šuniui nustatyti Šmalenbergo viruso antikūnai (29). 2013 metais Prancūzijoje publikuotas Šmalenbergo viruso RNR aptikimas 15 dienų amžiaus šuniukų, gimusių su neurologiniais sutrikimais (ataksija, kreivakaklyste), galvos smegenų mėginiuose ir teigiami serologiniai kalių tyrimai (30). Remiantis atliktais tyrimais, šunys turi būti vertinami kaip Šmalenbergo virusui imli rūšis. Arkliai, pelės, laukiniai mėsėdžiai, naminės kiaulės ir vištos remiantis serologiniais tyrimais ar eksperimentinėmis infekcijomis nelaikomos Šmalenbergo viruso rezervuarinėmis rūšimis (24, 28). Kol kas nėra duomenų apie viruso sukeltą infekciją žmonėms (31).
1.3.Viruso perdavimo būdai
Dauguma Bunyraviridae šeimai priklausančių virusų perduodami per vektorius, šiuo atveju nariuotakojus (uodus, mašalus, erkes). Remiantis atliktais tyrimais, nustatyta, kad virusai, priklausantys Simbu serogrupei, dažniausiai platinami Culicoides spp. mašalų, taip pat Aedes ir
Culex genties uodų ir keletos skirtingų rūšių erkių (22). Šiaurės Europoje SBV pagrindiniai plitimo
vektoriai yra Culicoides obsoletus, Culicoides scoticus ir Culicoides chiopterus rūšių mašalai (1, 32). Belgijoje, Prancūzijoje ir Lenkijoje Culicoides dewulfi, Culicoides pulicaris, Culicoides
nubeculosus ir Culicoides punctatus galimai dalyvauja viruso transmisijoje (23, 31, 32). Lietuvoje Culicoides obsoletus labiausiai paplitusi kraujasiurbių smulkiųjų mašalų rūšių grupė (33).
Viruso plitimas per uodus mažai ar visai nėra reikšmingas (34), taip pat per Simuliidae šeimos muses (28). Šmalenbergo viruso atsiradimas, plitimas ir išliekamumas Europoje tiesiogiai priklauso nuo viruso Culicoides spp. vektorių epidemiologinių faktorių (temperatūros, vėjo, sausros, metų laiko, taip pat imlių gyvūnų laikymo sąlygų (ar gyvūnai laikomi lauke, ar uždarose patalpose) ir antiparazitinio gydymo, profilaktikos (35).
Atliktų tyrimų duomenimis, Šmalenbergo viruso RNR rasta bulių spermoje ir eksperimentiškai infekuotų bulių ingvinaliniuose limfiniuose mazguose (36-38). Tačiau viruso perdavimo apvaisinimo metu svarba nežymi, nes virusas identifikuotas mažiau nei 6 proc. tirtuose spermos mėginiuose, nustatyta maža viruso RNR koncentracija tirtuose spermos mėginiuose. Kol kas nėra duomenų apie viruso plitimą lytiniu keliu.
14
1.4.Šmalenbergo viruso paplitimas
Šmalenbergo virusas laikomas pirmuoju Europoje, 2011 metų rugsėjį Šiaurės Reino - Vestfalijoje, Vokietijoje aptiktu Simbu serogrupės virusu (4). 2011 metų rugpjūčio mėnesį registruotos pirmosios ūmios SBV infekcijos, tų pačių metų gruodį Nyderlanduose užregistruotos viruso sukeltos negyvų vaisių deformacijos. 2010 metų pavasarį ir 2011 metų vasarą surinkti Belgijos, Vokietijos ir Prancūzijos galvijų serumo mėginiai nustatyti seronaigiami Šmalenbergo virusui (40, 41).
2011 - 2012 metų vektorių transmisijos sezonu, infekcija paplito šiaurės - vakarų Europoje, įskaitant Belgiją, Daniją, Prancūziją, Italiją, Liuksemburgą, Ispaniją, Turkiją ir Jungtinę Karalystę. 2012 metų žiemą, Vokietijos epideminėje zonoje nustatyti 98 proc. seroteigiamų atrajotojų. Iki 2013 metų balandžio, Šmalenbergo infekcija identifikuota Austrijoje, Belgijoje, Čekijoje, Danijoje, Estijoje, Suomijoje, Prancūzijoje, Vengrijoje, Vokietijoje, Airijoje, Italijoje, Latvijoje, Liuksemburge, Nyderlanduose, Lenkijoje, Slovėnijoje, Ispanijoje, Švedijoje, Jungtinėje Karalystėje, Šveicarijoje, Norvegijoje ir Kroatijoje. Nuo 2011 metų rugsėjo iki 2013 metų balandžio Europoje laboratoriniais tyrimais patvirtintų SBV infekuotų galvijų, avių ir ožkų bendras skaičius siekė daugiau nei 8000. 2013 metais, naujai infekuotų galvijų, avių ir ožkų bandų skaičius sumažėjo, tačiau buvo registruoti suaugusių gyvūnų ūmių infekcijų ir vaisių, su įgimtomis deformacijomis (artrogripozės - hidrocefalijos sindromu) atvejai. Tyrimas leido teigti, kad virusas tuo metu vis dar cirkuliuoja Europoje (28). 2013 metais Mozambike galvijų, avių ir ožkų kraujo mėginiuose nustatyti Šmalenbergo virusui specifiniai antikūnai (42). Turkijoje 2006 - 2013 metų retrospektyvinės analizės metu nustatyti virusui specifiniai antikūnai paskerstų galvijų kraujo mėginiuose (43). Galimai Šmalenbergo infekcija pasklido iš Pietų Afrikos į Turkiją ar atvirkščiai, tačiau ši hipotezė dar turi būti patvirtinta tolimesniais tyrimais.
1.5.Šmalenbergo ligos charakteristika
1.5.1.PatogenezėŠmalenbergo virusas rastas eksperimentiškai infekuotų galvijų ir avių blužnyje ir limfiniuose mazguose. Atitinkamai, virusas limfoidiniuose audiniuose persistavo mažiausiai 5 savaites ir mažiausiai 10 dienų (44). Virusas aptiktas eksperimentiškai infekuotų avių plaučiuose, kai tuo tarpu kiaušidės ir centrinė nervų sistema (CNS) nebuvo pažeistos.
15
neuronų infekcijos ar virusų sukeltų vaskuliarinių pažeidimų, galima pirminė ar antrinė nervinio audinio nekrozė. Pilnai išsivysčiusią imuninę sistemą (ėriukams imuninė sistema pilnai susiformuoja iki 50 gestacijos paros, veršeliams iki 73 gestacijos paros) turintiems vaisiams, dėl imuninio atsako galimai išsivysto encefalitas. Tiek interferonų produkcija placentos audinyje, tiek vaisiaus kraujo - smegenų barjeras yra svarbūs viruso transmisijoje ir vaisiaus vystymuisi.
Infekuotiems vaisiams nustatytas nugaros smegenų motorinių šakelių, ypač ventrolateralinio mazgo neišsivystimas dėl neuronų aksoninių ataugų ar smegenų kamieno branduolio aplazijos. Dėl nugaros smegenų ventralinių ragų hipoplazijos galimos skeleto raumenų malformacijos, artrogripozė ir stuburo malformacijos. SBV replikacija miocituose/mioblastuose galimai sukelia skeleto raumenų pažeidimus (45).
1.5.2.Klinikiniai požymiai
Suaugusiems galvijams, SBV infekcija asimptominė ar pasireiškia nespecifiniais kelias dienas trunkančiais požymiais: anoreksija, karščiavimas, viduriavimas, sumažėjęs pieno primilžis (4). 6 proc. galvijų, 3 proc. avių ir 1 proc. ožkų pasireiškia ūmi su klinikiniais požymiais virusinė infekcija, todėl turėtų būti įvertinta subklinikinė ligos eiga (46).
Transplacentinė infekcija pasireiškia abortais, vaisių mumifikacijomis, negyvais jaunikliais (3 pav.)
3 pav. Intrauterinės Šmalenbergo viruso infekcijos sukelti teratogeniniai veršelio pažeidimai (46).
16
Esant infekcijai gimusiems jaunikliams nustatomos skeleto deformacijos (kifozė, lordozė, skoliozė, kreivakaklystė), galvos kaukuolės neišsivystymas (makrocefalija, brachygnathia inferior ), taip pat įvairios galvos smegenų malformacijos (hidrocefalija, encefalomaliacija, cerebrinė hipoplazija, smegenų kamieno hipoplazija).
Didžiausia viruso sukeltų abortų ar vaisiaus išsigimimų dalis nustatyta galvijų ir avių gestacijos pagaiboje. SBV in utero infekcija siejama su vaisiaus absorbcija ankstyvajame gestacijos periode. Intrauterinė viruso transmisija siejama su sveikų ar morfologiškai išsivysčiusių, gimusių gestacijos termino pabaigoje, jauniklių depresija, aklumu, ataksija, raumenų atonija (46). Remiantis tyrimais, nustatytas ožkų didesnis atsparumas viruso infekcijai ir teratogeniniam poveikiui lyginant su galvijais ir avimis (45).
Šmalenbergo infekcijos poveikis karvių, avių ir ožkų vaisingumui nėra žinomas. Vokietijoje ligos epideminiu laikotarpiu atlikti tyrimai parodė padidėjusį sėklinimo indeksą galvijų bandose ir leidžia teigti, kad infekcija neigiamai paveikia galvijų reprodukciją.
1.5.3.Patologiniai anatominiai požymiai
Šmalenbergo viruso sukeltos vaisių ar naujagimių patologijos pavadintos artrogripozės - hidrocefalijos sindromu. Infekuotiems veršeliams, avių ir ožkų jaunikliams makroskopiškai nustatytos skeleto deformacijos (skoliozė, lordozė, kifozė, kreivakaklystė), galvos deformacijos (plokščiagalvystė, makrocefalija ir brachygnathia inferior) ir skeleto raumenų hipoplazija. Virusas pažeidžia CNS, sukeldamas hidrocefaliją, cefalomaliaciją, mikrocafaliją, cerebrinę hipoplaziją, smegenų kamieno hipoplaziją (45). Periferiniuose organuose ir placentoje makroskopinių pažeidimų nenustatyta, išskyrus atelektuotas plaučių skiltas, dėl krūtinės ląstos deformacijų.
Mikroskopiškai nustatyta baltosios ir/ar pilkosios smegenų masės displazija, galvos smegenų skilvelių diliatacijos (hidrocefalija, cefalomaliacija) (47). Smegenų pažeidimai pasireiškia smegenų žievės granuliacinio sluoksnio sumažėjimu ir Purkinje ląstelių netekimu, mikroglioze, hemosiderioze ir mineralizacija. Uždegiminiai CNS pažeidimai (encefalitas, meningoencefalitas, encefalomielitas, poliomielitas) dažniau pasireiškia in utero infekuotiems ėriukams ir ožiukams, lyrinant su veršeliais. Nustatytas mažesnis neuronų kiekis dorsaliniame ir ventraliniame nugaros smegenų raguose bei ventralinės ir dorsalinės baltosios masės suplonėjimas. Artrogripozės paveiktų galūnių raumeniniame audinyje nustatytas didesnis kiekis fibrozinio ir riebalinio tolygiai pasiskirsčiusio tarp raumeninių skaidulų audinio (47).
1.5.4.Diagnostika
17
Šmalenbergo viruso RNR diagnozuojama PGR pagalba, naudojami viremiškų imlių gyvūnų kraujo su EDTA ar kraujo serumo mėginiai, naudojami abortuotų ar neišsivysčiusių ėriukų ar veršelių galvos smegenų mėginiai. Viruso RNR taip pat aptinkama infekuotų gyvūnų placentoje, mekonijume, čiobrialiaukėje, limfiniuose mazguose ir blužnyje. Šmalenbergo ligos patvirtinimui gali būti naudojamas naujagimio prekolostrinis kraujo serumas, kraujas paimtas iš širdies ar krūtinės ląstos skysčiai ir atlikti viruso neutralizacijos ar imunofermentinės analizės (ELISA) testai antikūnų nustatymui. Epidemiologiniuose tyrimuose dažniausiai naudojami komerciniai imunofermentine analize (ELISA) paremti testai. Tačiau serologiniai tyrimai nėra tikslūs dėl galimo kryžminio reaktyvumo su kitu Simbu serogrupei Orthobunyavirus genčiai priklausančiu virusu, kas gali lemti klaidingai teigiamus tyrimo rezultatus. Galimai infekuotų gyvūnų kraujo serumas gali būti naudojamas RNR izoliacijai naudojant žiurkėno jauniklio ląsteles (BHK-21), beždžionių ir kiaulių inkstų ląstelės (atitinkamai VERO ar SK-6 ląstelės), taip pat vabzdžių (KC) ląsteles (48).
18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Mėginių surinkimas
2014 metais tyrimui surinkti 490 galvijų kraujo serumo mėginiai. Mėginiai surinkti iš 9 skirtingų Lietuvos rajonų: Panevėžio, Kalvarijų, Jonavos, Šiaulių, Kėdainių, Pakruojo, Šalčininkų, Marijampolės, Šakių. Medžiaga serologiniams tyrimams buvo renkama iš 12 įvairių Lietuvos galvijų ūkių. 2016 metais surinkti 1174 galvijų, 28 avių ir 53 elnių kraujo serumo mėginiai. Mėginiai surinkti iš 9 skirtingų Lietuvos rajonų: Pasvalio, Zarasų, Ukmergės, Kauno, Molėtų, Raseinių, Telšių, Kėdainių ir Vilniaus. Atsitiktinės atrankos būdu mėginiai buvo surinkti iš įvairaus amžiaus, lyties ir veislės gyvūnų grupių. Iš surinktų 1174 galvijų kraujo mėginių serologiniams tyrimams 1000 mėginių buvo surinkti iš Mažeikių rajone įsikūrusios veršelių supirkimo įmonės, kuri superka 1 – 2 mėnesių amžiaus veršelius. Kraujo mėginiai iš šios įmonės nebuvo įtraukti į tyrimą dėl mažos antikūnų prieš Šmalenbergo virusą aptikimo galimybės šioje amžiaus grupėje ir siekiant išvengti skaičiavimo paklaidos. Surinkta informacija apie kiekvieno atrajotojo, iš kurio buvo imamas mėginys, lytį, amžių ir rajoną. Surinkti serologiniai mėginiai suskirstyti į 4 amžiaus grupes: galvijai suskirstyti į 6 – 12 mėnesių, 12 – 24 mėnesių amžiaus grupės, pirmaveršių (1 – 4 metų amžiaus) bei karvių (nuo 4 metų ir vyresnės) amžiaus grupes. Avys suskirstytos į 3 amžiaus grupes: 6-12 mėnesių amžiaus, 12-24 mėnesių bei 24 mėnesių ir vyresnės amžiaus grupes. Elnių tirta populiacija nesuskirstyta į amžiaus grupes, nes visi tiriamieji buvo vienodo amžiaus. Serologiniams IFA tyrimams kraujas imtas iš jungo venos (v. jugularis) ar uodegos venos (v.
coccygea) į vakuuminius mėgintuvėlius be antikoagulianto.
2.2. Šmalenbergo viruso antikūnų tyrimo metodas
Šmalenbergo ligos viruso antikūnai buvo nustatyti kraujo serumo imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Surinkti kraujo mėginiai laboratorijoje buvo centrifuguojami ir gauti serumo mėginiai sužymėti ir užšaldyti –20 ̊C temperatūroje iki tolimesnių tyrimų. Kraujo serologiniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje.
Serologiniams galvijų kraujo serumo tyrimams dėl antikūnų prieš Šmalenbergo virusą naudoti komerciniai standartizuoti IFA diagnostiniai rinkiniai (ID Screen® Schmallenberg virus; IDvet, Prancūzija). Šiuo testu buvo ištirti galvijų, avių ir elnių kraujo mėginiai, tačiau gali būti taikomas ir kitų gyvūnų serumo ar kraujo plazmos tyrimams SBV antikūnų atžvilgiu (50).
19
rekombinantiniu SBV nukleokapsidės baltymo antigenu užpilamos kraujo serumo mėginiu. Serume esant antikūnams prieš Šmalenbergo virusą, pastarieji reaguoja su duobutėse esančiu antigenu, sudarydami antigeno – antikūno kompleksą. Vėliau naudojamas SBV nukleoproteino – HRP konjugatas, kuris susijungia su kompleksu, sudarydamas antigeno – antikūno - konjugato kompleksą. Plokštelių duobutės išplaunamos ir supilamas chromogeninis substrato tirpalas, kuris, veikiamas konjugato, skyla ir po 90 minučių vertinama spalvinė reakcija. Susidariusios spalvos intensyvumas tiesiogiai proporcingas antikūnų kiekiui kraujo serumo mėginyje. Vertinamas susidarusios spalvos optinis tankis, kuris yra nustatomas spektrometru 450nm bangos ilgio šviesos pagalba.
2.3. Statistinė duomenų analizė
20
3. TYRIMŲ REZULTATAI
2014 metų duomenimis 82 iš 490 tirtų galvijų kraujo serologinių mėginių (16,73 proc.; 95 proc. PI: 13,7 - 20,3) nustatyti teigiami Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu. Teigiamų SBV antikūnų atžvilgiu tirtų galvijų skaičius skirtinguose Lietuvos rajonuose svyravo nuo 5,0 proc. iki 28,89 proc. (1 lent.). 2014 metais teigiamų galvijų kraujo serologinių mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta visuose tirtuose Lietuvos rajonuose: Panevėžio, Kalvarijų, Jonavos, Šiaulių, Kėdainių, Pakruojo, Šalčininkų, Marijampolės ir Šakių rajonuose. Didžiausias teigiamų kraujo serologinių mėginių skaičius nustatytas Šakių, Marijampolės bei Šalčininkų rajonuose, kur visų tirtų galvijų teigiami kraujo serologiniai mėginiai SBV atžvilgiu sudarė daugiau nei ¼ visų tirtų mėginių (atitinkamai: 28.89 proc., 95 proc. PI: 20,5 – 39,0; 28.75 proc., 95 proc. PI: 20,0 – 39,5; 25,00 proc., 95 proc. PI: 14,2 – 40,2). Mažiausias teigiamų kraujo serologinių mėginių skaičius nustatytas Panevėžio, Kalvarijų bei Jonavos rajonuose, kur visų tirtų galvijų teigiami kraujo serologiniai mėginiai SBV atžvilgiu pasiskirstė po lygiai (po 5,0 proc., 95 proc. PI: 1,4 – 16,5) (1 lent.). Nustatytų teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai tarp skirtingų Lietuvos rajonų statistiškai patikimi (p<0,05), todėl galvijų tarpe egzistuoja ryšys tarp antikūnų prieš Šmalenbergo viruso susidarymo ir Lietuvos rajono.
1 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą galvijų kraujo serumo mėginiuose paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2014 metais.
Rajonas Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%] Panevėžio 2/ 40 5,00 [ 1,4 – 16,5] Kalvarijų 2/ 40 5,00 [ 1,4 – 16,5] Jonavos 2/ 40 5,00 [ 1,4 – 16,5] Šiaulių 3/ 40 7,50 [ 2,6 – 19,9] Kėdainių 4/ 40 10,00 [ 4,0 – 23,1] Pakruojo 10/ 80 12,50 [ 6,9 – 21,5] Šalčininkų 10/ 40 25,00 [ 14,2 – 40,2] Marijampolės 23/ 80 28,75 [ 20,0 – 39,5] Šakių 26/ 90 28,89 [ 20,5 – 39,0] Iš viso 82/ 490 16,73 [ 13,7 – 20,3]
21
2 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą galvijų kraujo serumo mėginiuose paplitimas tarp skirtingų amžiaus grupių 2014 metais.
Amžiaus grupė Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%]
6-12 mėn. 8/ 125 6,4 [ 2,1 – 10,7]
12-24 mėn. 15/ 119 12,6 [ 6,6 – 18,6]
Pirmaveršės 25/ 122 20,5 [13,3 – 27,7]
Karvės 34/ 124 27,4 [19,6 – 35,3]
Iš viso 82/ 490 16,73 [ 13,7 – 20,3]
2014 metų duomenimis didžiausias galvijų kraujo serologinių teigiamų mėginių skaičius 6 - 12 mėnesių amžiaus grupėje nustatytas Šakių bei Pakruojo rajonuose, kur atitinkamai 3 iš 25 (12,0 proc., 95 proc. PI: 4,2 – 30,0) bei 2 iš 20 (10,0 proc., 95 proc. PI: 2,8 – 30,1) tirtų mėginių buvo teigiami SBV antikūnų atžvilgiu. Mažiausiai, po 1 teigiamą mėginį, nustatyta Panevėžio, Kalvarijų ir Marijampolės (atitinkamai 10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4; 10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4; 5,0 proc., 95 proc. PI: 0,9 – 23,6) rajonuose (3 lent.). 6 - 12 mėnesių amžiaus grupėje nei vienas SBV antikūnų atžvilgiu teigiamas mėginys nenustatytas Jonavos, Šiaulių, Kėdainių ir Šalčininkų rajonuose. Nustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų prieš Šmalenbergo viruso susidarymo 6 -12 mėnesių ir pirmaveršių (1 – 4 metų amžiaus) bei tarp 6 -12 mėnesių ir karvių amžiaus grupių (p <0,05).
Didžiausias galvijų kraujo serologinių teigiamų mėginių skaičius 12 - 24 mėnesių amžiaus grupėje nustatytas Marijampolės ir Šakių rajonuose, kur atitinkamai 6 iš 20 (30,0 proc., 95 proc. PI: 14,5 – 51,9) bei 3 iš 19 (15,8 proc., 95 proc. PI: 5,5 – 37,6) tirtų mėginių buvo teigiami SBV antikūnų atžvilgiu (3 lent.). 12 -24 mėnesių amžiaus grupėje nei vienas Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu teigiamas mėginys nenustatytas Panevėžio, Kalvarijų, Jonavos ir Šiaulių rajonuose. Nustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų prieš SBV susidarymo 12 -24 mėnesių ir karvių amžiaus grupių (p <0,05).
Pirmaveršių amžiaus grupėje didžiausias galvijų kraujo serologinių teigiamų mėginių skaičius nustatytas Marijampolės ir Šalčininkų rajonuose, kur atitinkamai 10 iš 20 (50,0 proc., 95 proc. PI: 29,9 – 70,1) bei 4 iš 10 (40,0 proc., 95 proc. PI: 16,8 – 68,7) tirtų mėginių buvo teigiami SBV antikūnų atžvilgiu. Mažiausiai, 1 teigiamas mėginys, nustatytas Šiaulių (10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4) rajone (3 lent.). Šioje amžiaus grupėje nei vienas Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu teigiamas mėginys nenustatytas Panevėžio, Kalvarijų ir Jonavos rajonuose.
22
Marijampolės ir Šalčininkų rajonuose, kur atitinkamai 14 iš 24 (58,3 proc., 95 proc PI: 38,8 – 75,5) bei 4 iš 10 (40,0 proc., 95 proc. PI: 16,8 – 68,7) tirtų mėginių buvo teigiami Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu. Mažiausiai, po 1 teigiamą mėginį, nustatyta Panevėžio, Kalvarijų ir Kėdainių (atitinkamai 10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4; 10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4; 10,0 proc., 95 proc. PI: 1,8 – 40,4) rajonuose (3 lent.).
3 lent. Skirtingų amžiaus grupių seroteigiamų galvijų paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2014 metais. Rajonas Amžiaus grupės 6-12 mėn. 12-24 mėn. Pirmaveršės Karvės Teigiam i mėginia i/ tirti mėginia i Nustatyt as paplitim as (proc.) [PI 95%] Teigiam i mėginia i/ tirti mėginia i Nustatyt as paplitim as (proc.) [PI 95%] Teigiam i mėginia i/ tirti mėginia i Nustatyt as paplitim as (proc.) [PI 95%] Teigiam i mėginia i/ tirti mėginia i Nustatyt as paplitim as (proc.) [PI 95%] Panevėžio 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] Kalvarijų 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] Jonavos 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 2/ 10 20 [ 5,7 – 51,0] Šiaulių 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] 2/ 10 20 [ 5,7 – 51,0] Kėdainių 0/ 10 0 [ 0 – 28,7] 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] 2/ 10 20 [ 5,7 – 51,0] 1/ 10 10 [ 1,8 – 40,4] Pakruojo 2/ 20 10 [ 2,8 – 30,1] 3/ 20 15 [ 5,2 – 36,0] 2/ 20 10 [ 2,8 – 30,1] 3/ 20 15 [ 5,2 – 36,0] Šalčininkų 0/ 10 0 [ 0 – 27,8] 2/ 10 20 [ 5,7 – 51,0] 4/ 10 40 [ 16,8 – 68,7] 4/ 10 40 [ 16,8 – 68,7] Marijampol ės 1/ 20 5 [ 0,9 – 23,6] 6/ 20 30 [ 14,5 – 51,9] 10/ 20 50 [ 29,9 – 70,1] 6/ 20 30 [ 14,5 – 51,9] Šakių 3/ 25 12 [ 4,2 – 30,0] 3/ 19 15,8 [ 5,5 – 37,6] 6/ 22 27,3 [ 13,2 – 48,2] 14/ 24 58,3 [ 38,8 – 75,5] Iš viso 8/ 125 6,4 [ 3,3 – 12,1] 15/ 119 12,6 [ 7,8 – 19,8] 25/ 122 20,5 [ 14,3 – 28,5] 34/ 124 27,4 [ 20,3 – 35,9] 2016 metų duomenimis 3 iš 174 tirtų galvijų kraujo serologinių mėginių (1,72 proc., 95 proc. PI: 0,6 – 4,9) nustatyti teigiami Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu (4 lent.). Teigiamų SBV antikūnų atžvilgiu tirtų galvijų skaičius skirtinguose Lietuvos rajonuose svyravo nuo 0 proc. iki 100 proc. Teigiamų galvijų kraujo serologinių mėginių SBV antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta 2 iš 7 tirtų
23
nustatyti teigiami Šmalenbergo viruso atžvilgiu (100 proc., 95 proc. PI: 20,7 – 100) (4 lent.). Nustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų prieš SBV susidarymo ir Lietuvos rajonų (p <0,05).
4 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą galvijų kraujo serumo mėginiuose paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2016 metais.
Rajonas Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai
Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%] Pasvalio 2/30 6,67 [1,8 – 21,3] Zarasų 1/1 100 [20,7 – 100] Ukmergės 0/15 0 [0 – 20,4] Kauno 0/14 0 [0 – 21,5] Molėtų 0/12 0 [0 – 24,3] Raseinių 0/4 0 [0 – 49] Telšių 0/98 0 [0 – 3,8]. Iš viso 3/174 1,72 [0,6 – 4,9]
Didžiausias 2016 metais tirtų teigiamų kraujo serologinių mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu galvijų tarpe nustatytas pirmaveršių amžiaus grupėje (1,56 proc., 95 proc. PI: 0,4 – 5,5). Nenustatytas nei vienas teigiamas mėginys iš 16 tirtų serologinių mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu 12- 24 mėnesių amžiaus grupėje (5 lent.). Nustatytas priežastinis ryšys tarp antikūnų prieš SBV susidarymo ir amžiaus grupės (p <0,05).
5 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą galvijų kraujo serumo mėginiuose paplitimas tarp skirtingų amžiaus grupių 2016 metais.
Amžiaus grupė Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai
Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%]
6-12 mėn. - -
12-24 mėn. 0/16 0 [0 – 19,4]
Pirmaveršės 2/ 128 1,56 [ 0,4 – 5,5]
Karvės 1/30 3,3 [ 0,6 – 16,7]
Iš viso 3/ 174 1,72 [0,6 – 4,9]
24
6 lent. Skirtingų amžiaus grupių seroteigiamų galvijų paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2016 metais.
2016 metų duomenimis 10 iš 28 tirtų avių kraujo serologinių mėginių (35,71 proc., 95 proc. PI: 20,7 – 54,2) nustatyti teigiami Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu. Teigiamų SBV antikūnų atžvilgiu tirtų avių skaičius skirtinguose Lietuvos rajonuose svyravo nuo 0 proc. iki 50,0 proc. (7 lent.) 2016 metais teigiamų avių kraujo serologinių mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta Kėdainių bei Vilniaus rajonuose. Didžiausias teigiamų kraujo serologinių mėginių skaičius nustatytas Vilniaus rajone, kur visų tirtų avių teigiami kraujo serologiniai mėginiai SBV atžvilgiu sudarė pusę visų tirtų mėginių (50,0 proc., 95 proc. PI: 23,7 – 76,3). Raseinių rajone teigiamų mėginių nenustatyta. Nustatytų teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai tarp skirtingų Lietuvos rajonų statistiškai nepatikimi (p >0,05).
7 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą avių kraujo serumo mėginiuose paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2016 metais.
Rajonas Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai
Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%]
Kėdainių 5/17 29,41 [13,3 – 53,1]
Vilniaus 5/10 50 [23,7 – 76,3]
Raseinių 0/1 0 [0 – 79,3]
Iš viso 10/28 35,71 [20,7 – 54,2]
25
Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu Vilniaus ir Kėdainių rajonuose (8 lent.). 24 ir daugiau mėnesių amžiaus grupėje nenustatytas nei vienas SBV antikūnų atžvilgiu teigiamas mėginys.
8 lent. Skirtingų amžiaus grupių seroteigiamų avių paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2016 metais.
2016 metų duomenimis Mažeikių rajone 17 iš 53 tirtų elnių kraujo serologinių mėginių (32,08 proc., 95 proc. PI: 21,1 – 45,5) nustatyti teigiami Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu (9 lent.). Visi tirti elniai buvo vienodo amžiaus – 5 metų, todėl nebuvo įvertintas Šmalenbergo viruso užsikrėtimų dažnio pasiskirstymas tarp skirtingų elnių amžiaus grupių.
9 lent. Teigiamų antikūnų prieš Šmalenbergo virusą elnių kraujo serumo mėginiuose paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose 2016 metais.
Rajonas Teigiami mėginiai/ tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95%]
Mažeikių 17/53 32,08 [21,1 – 45,5]
Iš viso 17/53 32,08 [21,1 – 45,5]
Nepriklausomai nuo gyvūno rūšies, 2014 metais atlikto tyrimo metu nustatytas didesnis Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu teigiamų mėginių skaičius (16,73 proc., n=82 teigiami mėginiai iš 490 tirtų) lyginant su 2016 metais atlikto tyrimo rezultatais (11,8 proc., n=30 teigiamų mėginių iš 255 tirtų) (4 pav.).
26
4 pav. Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu teigiamų ir neigiamų mėginių pasiskirstymas 2014 bei 2016 metais.
2014 bei 2016 metų duomenimis didžiausias skaičius teigiamų mėginių SBV antikūnų atžvilgiu nustatyta avių tarpe (35,71 proc., n=10 iš 28 tirtų mėginių) bei elnių tarpe (32,08 proc., n=17 iš 53 tirtų mėginių), mažiausias skaičius teigiamų mėginių nustatytas galvijų tarpe (12,8 proc., n=85 iš 664 tirtų mėginių) (5 pav.).
27
4. REZULTATŲ APTARIMAS
2014 metų galvijų kraujo serologinių tyrimų Šmalenbergo viruso atžvilgiu metu nustatytas 16,73 proc. (p<0,05) teigiamų mėginių paplitimas. Lyginant su 2013 metais atliktų tyrimų (10) duomenimis (42,41 proc.), seroteigiamų galvijų skaičius sumažėjo. Tuo tarpu kaimyninėje Lenkijoje (51) nustatytas 34,2 proc., didesnis seroteigiamų galvijų Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu paplitimas. Panašūs rezultatai gauti lyginant seroteigiamų galvijų paplitimą skirtinguose šalių regionuose: tiek Lietuvoje, tiek Lenkijoje didžiausias seroteigiamų galvijų Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu nustatytas pietvakarių regionuose (pietvakarių Lietuvoje, Šakių rajone nustatytas 28,89 proc. paplitimas, Marijampolės – 28,75 proc., Šalčininkų – 25,0 proc. paplitimas (p<0,05), tuo tarpu Lenkijos žemutinėje Silezijos vaivadijoje nustatytas 92,3 proc., o vakarų Pamario vaivadijoje nustatytas 80,9 proc. seroteigiamų galvijų paplitimas). Lyginant su tyrimo metu gautais rezultatais, Serbijos šiaurinėje dalyje nustatytas mažesnis (13,45 proc.) SBV seroteigiamų galvijų skaičius (52), kai tuo tarpu Rumunijos rytinėje dalyje nustatytas didesnis (22,65 proc.) paplitimas (53). Tais pačiais metais Vokietijoje atliktuose tyrimuose nustatytas 1,02 proc. SBV antikūnų atžvilgiu teigiamų mėginių paplitimas galvijų bandose (54). Skirtingai nei šio tyrimo metu gauti rezultatai, didžiausias seroteigiamų galvijų skaičius nustatytas centrinėje Vokietijos dalyje: Hamburgo srityje nustatytas 2,73 proc. teigiamų mėginių, Turingijos regione – 1,87 proc. Kitose vakarų Europos valstybėse, lyginant su šio tyrimo metu gautais duomenimis, 2014 metais nustatytas mažesnis seroteigiamų mėginių skaičius: Anglijos pietinėje dalyje nustatytas 2,5proc. (55), o Nyderlanduose – mažesnis nei 1 proc. SBV paplitimas galvijų bandose (54). Remiantis skirtingais vakarinės, centrinės bei rytų Europos valstybių rezultatais, galime teigti, kad galimai taikytos skirtingos prevencinės priemonės (vakcinacija, insekticidinės (lempos, purkštuvai) priemonės ir pan.) ar pastarosios visiškai netaikytos, bei galvijai laikomi skirtingomis sąlygomis (ganomi ganyklose ar laikomi ūkiniuose pastatuose). Dėl skirtingo seroteigiamų galvijų regioninio pasiskirstymo neatmetama skirtingo valstybių klimato įtaka Šmalenbergo viruso vektorių paplitimui ir išliekamumui (35).
28
pasiskirstymą 2014 metais pietvakariniuose Lietuvos regionuose dėl didesnio vektorių paplitimo per aktyvųjį sezoną. Tačiau 2016 metais gauti prieštaringi rezultatai: aukščiausia temperatūra nustatyta pietinėje Lietuvos dalyje, kai tuo tarpu daugiausia SBV seroteigiamų galvijų nustatyta šiauriniuose regionuose. Tokie rezultatai galimai gauti dėl mažos tiriamųjų imties bei mažo mėginių regioninio pasiskirstymo.
2014 metų duomenimis antikūnai prieš Šmalenbergo virusą nustatyti visose tirtose amžiaus grupėse galvijų populiacijoje: didžiausias teigiamų kraujo serologinių mėginių SBV antikūnų atžvilgiu galvijų tarpe nustatytas karvių (nuo 4 metų ir vyresnės) amžiaus grupėje (27,4 proc.) Marijampolės bei Šakių – pietvakariniuose Lietuvos rajonuose, mažiausias – 6 - 12 mėnesių amžiaus grupėje (6,4 proc.). 2016 metų tyrimo metu taip pat daugiausiai teigiamų kraujo serologinių mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu nustatyta pirmaveršių (1 – 4 metų amžiaus) (1,56 proc.) ir karvių (nuo 4 metų ir vyresnės) (0,1 proc.) amžiaus grupėse, tačiau teigiamų mėginių nebuvo nustatyta vidutiniškai jaunesnių nei 1 metai amžiaus grupėje. Panašūs rezultatai gauti ir kitose Europos šalyse (57, 58), kur daugiausia serologiškai teigiamų mėginių buvo nustatyta pirmaveršių (1 – 4 metų amžiaus) ir vyresnių galvijų tarpe. Seroteigiamų galvijų skaičius skirtingose amžiaus grupėse statistiškai nesiskyrė jaunesnių nei 12 mėnesių amžiaus grupėje. Remiantis statistinės analizės metu gautu patikimu ryšiu tarp amžiaus grupių ir serologiškai teigiamų galvijų paplitimo bei moksliniais duomenimis galima teigti, kad SBV infekcijai imlesni vyresnėms nei 1 metai amžiaus grupėms priskiriami galvijai.
Tyrimo duomenimis serologiškai teigiamų mėginių Šmalenbergo viruso antikūnų atžvilgiu daugiau nustatyta avių populiacijoje (35,71 poc.) lyginant su galvijų (1,72 proc.) populiacija. Panašūs rezultatai gauti Turkijoje: tyrimo metu nustatytas 39,8 proc. SBV paplitimas avių ir 24,5 proc. serotegiamų mėginių paplitimas galvijų populiacijose (43), tačiau Rumunijoje (53) atlikto tyrimo metu daugiau nustatyta SBV seroteigimų galvijų (22,65 proc.) nei avių (5,67 proc.). Didesnis teigiamų mėginių skaičius avių populiacijoje galimai nustatytas dėl vektorių Culicoides
pulicaris dažnesnio maitinimosi avių krauju (59) ir didesnės rizikos užsikrėsti virusu, nors
Lietuvoje vyraujantiems Culicoides obsoletus būdingas dažnesnis maitinimasis galvijų krauju (60). Dėl mažos mėginių imties iš riboto Lietuvos regionų kiekio sunku daryti išvadas apie viruso paplitimą avių populiacijoje bei skirtinguose Lietuvos regionuose.
29
30
IŠVADOS
1. 2014 - 2016 metais galvijų populiacijoje nustatytas 12,8 proc. Šmalenbergo viruso antikūnų paplitimas, avių – 35,71 proc., elnių – 32,08 proc.
2. 2014 – 2016 metais galvijų populiacijoje daugiausiai SBV teigiamų mėginių nustatyta karvių (nuo 4 metų ir vyresnių) amžiaus grupėje (22,73 proc.), avių populiacijoje – 6-12 mėnesių amžiaus grupėje (50,0 proc.).
3. 2014 metais SBV teigiamų mėginių daugiausia nustatyta pietvakarių Lietuvoje (Šakių rajone, 28,89 proc.).
31
REKOMENDACIJOS
1. Atsižvelgiant į atlikto tyrimo rezultatus, kurie rodo Šmalenbergo viruso cirkuliaciją tiek naminių (galvijų, avių), tiek laukinių (elnių) atrajotojų populiacijoje, rekomenduojama toliau atlikti detalesnius SBV serologinius tyrimus Lietuvos ūkiuose ir laukinių gyvūnų populiacijoje bei viruso paplitimo tarp vektorių tyrimus, siekiant įvertinti ligos epidemiologiją.
2. Rekomenduojama atlikti reguliarius kontrolinius serologinius tyrimus ūkiuose, kuriuose nustatyti seroteigiami atrajotojai, ne rečiau, kaip vieną kartą per metus.
32
PADĖKA
33
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kameke D., Doreen W., Bernd H., Walburga L., and Helge K.. Schmallenberg Virus in Germany 2011–2014: Searching for the Vectors. Parasitology Research 115 (2016): 527–34;
2. Peperkamp N. H., S. J. Luttikholt, R. Dijkman, J. H. Vos, K. Junker, S. Greijdanus, M. P. Roumen, et al. Ovine and Bovine Congenital Abnormalities Associated With Intrauterine Infection With Schmallenberg Virus. Veterinary Pathology 52, no. 6 ( 2015): 1057–66;
3. Beer M., F. J. Conraths, and W. H. M. van der Poel. Schmallenberg Virus - a Novel Orthobunyavirus Emerging in Europe. Epidemiology and Infection 141, no. 1 ( 2013): 1–8; 4. Hoffmann B., Matthias S., Dirk H., Jungblut H., Holsteg M., Horst S., Eschbaumer M., et al.
Novel Orthobunyavirus in Cattle, Europe, 2011. Emerging Infectious Diseases 18, no. 3 ( 2012): 469–72;
5. De Regge, N., I. Deblauwe, R. De Deken, P. Vantieghem, M. Madder, D. Geysen, F. Smeets, B. Losson, T. van den Berg, and A. B. Cay. Detection of Schmallenberg Virus in Different Culicoides Spp. by Real-Time RT-PCR. Transboundary and Emerging Diseases 59, no. 6 (2012): 471–75;
6. Goffredo M., Monaco F., Capelli G., Quaglia M., Federici F., Catalani M., Montarsi F., et al. Schmallenberg Virus in Italy: A Retrospective Survey in Culicoides Stored during the Bluetongue Italian Surveillance Program. Preventive Veterinary Medicine 111, no. 3–4 (rugsėjo 1, 2013): 230–36;
7. Larska M., Michał K. K., Kęsik-Maliszewska J., and Rola J. Cross-Sectional Study of Schmallenberg Virus Seroprevalence in Wild Ruminants in Poland at the End of the Vector Season of 2013. BMC Veterinary Research 10 (gruodžio 21, 2014);
8. European Food Safety Authority (EFSA). Schmallenberg Virus: Analysis of the Epidemiological Data. EFSA Supporting Publications 9, no. 11 (lapkričio 1, 2012);
9. Milius J., Lukauskas K., Tamošiūnas V. Išlaidos galvijų virusinių ligų tyrimams Lietuvoje 2000– 2004 metais. Veterinarija ir zootechnika. 2005. T. 31 (53). P. 37–42;
10. Tamašauskaitė S., Buitkuvienė J., Šalomskas A. Šmalenbergo viruso serologinis paplitimas Lietuvoje. Jaunieji mokslininkai – žemės ūkio pažangai pranešimų tezės. 2015, P.49;
11. Linden A., Desmecht D., Volpe R., Wirtgen M, Gregoire F., Pirson J., Paternostre J., et al. Epizootic Spread of Schmallenberg Virus among Wild Cervids, Belgium, Fall 2011. Emerging Infectious Diseases 18, no. 12 ( 2012): 2006–8;
34
13. Al K. V. Goller et. Schmallenberg Virus as Possible Ancestor of Shamonda Virus. Emerging Infectious Disease Journal. Vol. 18, No. 10 (2012) ;
14. Ganter M., Eibach R., and Helmer C.. Update on Schmallenberg Virus Infections in Small Ruminants. Small Ruminant Research, Special Issue: Keynote lectures of the 8th International Sheep Veterinary Congress, 118, no. 1 (gegužės 1, 2014): 63–68;
15. Carpenter S., Groschup M. H., Garros C., Luiza Felippe-Bauer M., and Bethan V. Purse. Culicoides Biting Midges, Arboviruses and Public Health in Europe. Antiviral Research 100, no. 1 ( 2013): 102–13;
16. Esteves F., Mesquita J. R., Nóbrega C., Santos C., Monteiro A., Cruz R., Vala H., and Coelho A. C.. Epidemiology and Emergence of Schmallenberg Virus Part 1: Origin, Transmission and Differential Diagnosis. 2016, 10.5772/64741;
17. Coupeau D., Claine F., Wiggers L., Kirschvink N., and Muylkens B. In Vivo and in Vitro Identification of a Hypervariable Region in Schmallenberg Virus. The Journal of General Virology 94, no. Pt 6 ( 2013): 1168–74;
18. Doceul V., Gouzil J., Vitour D., and Zientara S. Schmallenberg Virus. In ELS. John Wiley & Sons, Ltd, 2015;
19. Dong H., Ping L., Elliott R. M., and Dong C. Structure of Schmallenberg Orthobunyavirus Nucleoprotein Suggests a Novel Mechanism of Genome Encapsidation. Journal of Virology 87, no. 10 ( 2013): 5593–5601;
20. Hulst M., Kortekaas J., Hakze-van der Honing R., Vastenhouw S., Cornellissen J., Maanen K., Bossers A., Harders F., Stockhofe N., and Poel W. Genetic Characterization of an Atypical Schmallenberg Virus Isolated from the Brain of a Malformed Lamb. Virus Genes 47, no. 3 ( 2013): 505–14;
21. Varela M., Schnettler E., Caporale M., Murgia C., Barry G., McFarlane M., McGregor E., et al. Schmallenberg Virus Pathogenesis, Tropism and Interaction with the Innate Immune System of the Host. PLOS Pathogens 9, no. 1 (vasario 10, 2013): e1003133;
22. Doceul V., Lara E., Sailleau C., Belbis G., Richardson J., Bréard E., Viarouge C., et al. Epidemiology, Molecular Virology and Diagnostics of Schmallenberg Virus, an Emerging Orthobunyavirus in Europe. Veterinary Research 44, no. 1 (2013): 31;
23. Larska M., Krzysiak M., Smreczak M., Mirosław P. Polak, and Żmudziński J. P.. First Detection of Schmallenberg Virus in Elk (Alces Alces) Indicating Infection of Wildlife in Białowieża National Park in Poland. The Veterinary Journal 198, no. 1 (spalio 1, 2013): 279–81;
35
25. Malmsten A., Malmsten J., Blomqvist G., Näslund K., Vernersson C., Hägglund S., Dalin A. M., Ågren E. O., and Valarcher J. F. Serological Testing of Schmallenberg Virus in Swedish Wild Cervids from 2012 to 2016. BMC Veterinary Research 13 (balandžio 4, 2017);
26. Graham D. A., Gallagher C., Carden R. F., Lozano J. M., Moriarty J., and Ronan O’Neill. A Survey of Free-Ranging Deer in Ireland for Serological Evidence of Exposure to Bovine Viral Diarrhoea Virus, Bovine Herpes Virus-1, Bluetongue Virus and Schmallenberg Virus. Irish Veterinary Journal 70 (gegužės 12, 2017);
27. Barrett D., More S. J., R. O’Neill, Bradshaw B., Casey M., Keane M., McGrath G., and Sammin G. Prevalence and Distribution of Exposure to Schmallenberg Virus in Irish Cattle during October 2012 to November 2013. BMC Veterinary Research Vol.11 (spalio 20, 2015);
28. Helmer C., Eibach R., Humann‐Ziehank E., Tegtmeyer P. C., Bürstel D., Mayer K., Moog U., et al. Seroprevalence of Schmallenberg Virus Infection in Sheep and Goats Flocks in Germany, 2012–2013. Veterinary Medicine and Science 2, no. 1 (2016): 10–22;
29. Wensman J. J., Blomqvist G., Hjort M., and Holst B. S.. Presence of Antibodies to Schmallenberg Virus in a Dog in Sweden. Journal of Clinical Microbiology 51, no. 8 (2013): 2802–3;
30. Sailleau C., Boogaerts C., Meyrueix A., Laloy E., Bréard E., Viarouge C., Desprat A., et al. Schmallenberg Virus Infection in Dogs, France, 2012. Emerging Infectious Diseases 19, no. 11 (2013): 1896–98;
31. Ducomble T., Wilking H., Stark K., Takla A., Askar M., Schaade L., Nitsche A., and Kurth A. Lack of Evidence for Schmallenberg Virus Infection in Highly Exposed Persons, Germany, 2012. Emerging Infectious Diseases 18, no. 8 (2012): 1333–35;
32. Regge N. D., Madder M., Deblauwe I., Losson B., Fassotte C., Demeulemeester J., Smeets F., Tomme M., and Cay A. B.. Schmallenberg Virus Circulation in Culicoides in Belgium in 2012: Field Validation of a Real Time RT-PCR Approach to Assess Virus Replication and Dissemination in Midges. PLOS ONE 9, no. 1 (vasario 23, 2014): e87005;
33. Bernotienė R. Culicoides obsoletus grupės smulkiųjų mašalų fauna, sezoninis skraidymo aktyvumas ir įvairovė Lietuvoje. Naujos ir retos Lietuvos vabzdžių rūšys. 2010, 22 tomas, 5-10 psl.;
34. Wernike K., Jöst H., Becker N, Chanasit J. S., and Beer M. Lack of Evidence for the Presence of Schmallenberg Virus in Mosquitoes in Germany, 2011. Parasites & Vectors 7 (rugpjūčio 29, 2014);
36
36. Schulz C., Wernike K., Beer M., and Hoffmann B. Infectious Schmallenberg Virus from Bovine Semen, Germany. Emerging Infectious Diseases 20, no. 2 (2014): 338–40;
37. Kęsik-Maliszewska J., and Larska M. Detection of Schmallenberg Virus RNA in Bull Semen in Poland. Polish Journal of Veterinary Sciences 19, no. 3 (rugsėjo 1, 2016): 655–57;
38. Ponsart C., Pozzi N., Bréard E., Catinot V., Viard G., Sailleau C., Viarouge C, et al. Evidence of Excretion of Schmallenberg Virus in Bull Semen. Veterinary Research 45, no. 1 (2014): 37; 39. Wernike K., Eschbaumer M., Schirrmeier H., Blohm U., Breithaupt A., Hoffmann B., and Beer
M. Oral Exposure, Reinfection and Cellular Immunity to Schmallenberg Virus in Cattle. Veterinary Microbiology 165, no. 1–2 (liepos 26, 2013): 155–59;
40. Wernike K., Holsteg M., Saßerath M., and Beer M. Schmallenberg Virus Antibody Development and Decline in a Naturally Infected Dairy Cattle Herd in Germany, 2011–2014. Veterinary Microbiology 181, no. 3 (gruodžio 31, 2015): 294–97;
41. De Regge N., Madder M., Deblauwe I., Losson B., Fassotte C., Demeulemeester J., Smeets F., Tomme M., and Cay A. B. Schmallenberg Virus Circulation in Culicoides in Belgium in 2012: Field Validation of a Real Time RT-PCR Approach to Assess Virus Replication and Dissemination in Midges. PLoS ONE 9, no. 1 (vasario 23, 2014);
42. Blomström A. L., Stenberg H., Scharin I., Figueiredo J., Nhambirre O., Abilio A. P., Fafetine J., and Berg M. Serological Screening Suggests Presence of Schmallenberg Virus in Cattle, Sheep and Goat in the Zambezia Province, Mozambique. Transboundary and Emerging Diseases 61, no. 4 (rugpjūtis 2014): 289–92;
43. Azkur A. K., Albayrak A., Risvanli A., Pestil Z., Ozan E., Yılmaz O., Tonbak S., et al. Antibodies to Schmallenberg Virus in Domestic Livestock in Turkey. Tropical Animal Health and Production 45, no. 8 (November 1, 2013): 1825–28;
44. Martinelle L., Poskin A., Pozzo F. D., Regge N. D., Cay B., and Saegerman C. Experimental Infection of Sheep at 45 and 60 Days of Gestation with Schmallenberg Virus Readily Led to Placental Colonization without Causing Congenital Malformations. PLOS ONE 10, no. 9 (rugsėjo 29, 2015): e0139375;
45. Bayrou A. C. et. Natural Intrauterine Infection with Schmallenberg Virus in Malformed Newborn Calves . Emerging Infectious Disease Journal, Vol. 20, No. 8 (2014);
46. Agerholm Jørgen S., Hewicker-Trautwein M, Peperkamp K., and Windsor P. A.. Virus-Induced Congenital Malformations in Cattle. Acta Veterinaria Scandinavica 57 (spalio 24, 2015): 54; 47. Luttikholt S., Veldhuis A., Brom R., Moll L., Lievaart-Peterson K., Peperkamp K., Schaik G.,
37
48. Loeffen W., Quak S., Boer-Luijtze E., Hulst M., Poel W., Bouwstra R., and Maas R. Development of a Virus Neutralisation Test to Detect Antibodies against Schmallenberg Virus and Serological Results in Suspect and Infected Herds. Acta Veterinaria Scandinavica 54 (rugpjūčio 7, 2012): 44;
49. Dubov N. M. E.. Fenner's Veterinary Virology 5th Edition. 2016 lapkritis 16. 420- 421 psl.; 50. ID Screen® Schmallenberg virus Indirect Multi-species (prieiga per internetą). (Žiūrėta 2017m.
lapkričio 22 d.) Prieinama: https://www.id-vet.com/produit/id-screen-schmallenberg-virus-indirect-multi-species/;
51. Larska M., Kęsik-Maliszewska J., and Kuta A. Spread of Schmallenberg Virus Infections in the Ruminants in Poland between 2012 and 2013. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy 58, no. 2 (2014): 169–176;
52. Bojkovski J., Vasic A., Bugarski D., Zdravković N., Vakanjac S., Kaba J., Mihail C., et al. Schmallenberg Virus Antibodies Detected in Dairy Cows in the Republic of Serbia. Bulgarian Journal of Agricultural Science 21 (4), (spalio 1, 2015): 916–18;
53. Danes D., Baraitareanu S., Gurau M. R., Dan M., Bartoiu A., Moldovan H., Danes M. Preliminary results of Schmallenberg virus serosurveillance in Romania. Advances in Environmental Technology and Biotechnology, 112-116;
54. Afonso A., Abrahantes J. C., Conraths F., Veldhuis A., Elbers A., Roberts H., Stede Y. V., Méroc E., Gache K., and Richardson J. The Schmallenberg Virus Epidemic in Europe-2011-2013. Preventive Veterinary Medicine 116, no. 4 (rugsėjo 15, 2014): 391–403;
55. Stokes J. E., Baylis M., and Duncan J. S. A Freedom from Disease Study: Schmallenberg Virus in the South of England in 2015. The Veterinary Record 179, no. 17 (rugsėjo 29, 2016): 435; 56. Lietuvos hidrometeorologijos tarnyba prie Aplinkos ministerija. 2016 metų veiklos ataskaita Nr.
TP12-2. (prieiga per internet). (Žiūrėta 2017 m. lapkričio 28 d.). Prieinama: http://www.meteo.lt/documents/20181/119832/veiklos_ataskaita_2016/cefadef6-bb5d-4d2a-aa15-c5eb85a072be
57. Veldhuis A. M. B., Schaik G., Vellema P., Elbers A. R. W., Bouwstra R., Heijden M. H. J. F., and Mars M. H. Schmallenberg Virus Epidemic in the Netherlands: Spatiotemporal Introduction in 2011 and Seroprevalence in Ruminants. Preventive Veterinary Medicine 112, no. 1–2 (rugsėjo 1, 2013): 35–47;
58. Elbers Armin R.W., Stockhofe N., and Poel W. H. M.. Schmallenberg Virus Antibodies in Adult Cows and Maternal Antibodies in Calves. Emerging Infectious Diseases 20, no. 5 (2014): 901–2; 59. Thompson G. M., Jess M., Gordon A. W., and Murchie A. K.. Sticky-Trapping Biting Midges
38
60. Bessell P. R., Auty H. K., Searle K. R., Handel I. G., Purse B. V., and Bronsvoort B. M. C. Impact of Temperature, Feeding Preference and Vaccination on Schmallenberg Virus Transmission in Scotland. Scientific Reports 4 (2014): 5746;
