LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA
ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Asta Balčiūnaitė
ANTIKŪNŲ PRIEŠ ERITROCITŲ ANTIGENUS DAŢNIS
PACIENTŲ GYDYTŲ ERITROCITŲ TRANSFUZIJOMIS GRUPĖJE
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Erika Skrodenienė
2
Turinys
Santrauka ... 4
Summary ... 6
Interesų konfliktas ... 8
Etikos komiteto leidimas ... 9
Santrumpos ... 10
Įvadas ... 11
Darbo tikslas ... 12
Darbo uţdaviniai ... 12
1. Literatūros apţvalga ... 13
1.1 Kraujo grupių antigenai ir antikūnai ... 13
1.1.1 Kraujo grupių antigenai ... 13
1.1.2 Kraujo grupių antikūnai ... 16
1.2 Eritrocitų antigenų sistemos ... 19
1.2.1 ABO sistema ... 19 1.2.2 Rh sistema ... 21 1.2.3 Kell sistema ... 23 1.2.4 Duffy sistema ... 24 1.2.5 Kidd sistema ... 25 1.2.6 Lewis sistema ... 25 1.2.7 MNS sistema ... 26 1.2.8 Lutheran sistema ... 27 1.2.9 Xg sistema ... 27 1.2.10 P sistema ... 27
2. Tyrimo apimtis ir metodai ... 29
2.1 Tyrimo apimtis ... 29
2.1.1 Pacientų charakteristika ... 29
2.2 Tyrimų metodika ... 30
2.2.1 Tyrimų atlikimo metodika ... 30
2.2.1.1 Kraujo paėmimas ir pristatymas į laboratoriją ... 30
2.2.1.2 Mėginių paruošimas ... 30
2.2.1.3 ABO kraujo grupės ir RhD nustatymas stulpeliniu metodu ... 30
2.2.1.4 RhD ir silpno D nustatymas ... 32
3
2.2.1.6 Atrankinis antikūnų nustatymas (netiesiogine Kumbso reakcija) stulpeliniu metodu .... 33
2.2.1.7 Antikūnų identifikavimas stulpeliniu metodu ... 34
2.3 Statistinė duomenų analizė ... 34
3. Tyrimų rezultatai ... 35
3.1 ABO kraujo grupių ir RhD faktoriaus pasiskirstymas... 35
3.2 Antikūnų prieš eritrocitų antigenų daţnis tarp lyčių ... 35
3.3 Antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnis tarp amţiaus grupių ... 37
3.4.1 Rh sistema ... 38 3.4.2. Kell sistema ... 39 3.4.3 Duffy sistema ... 40 3.4.4 Kidd sistema ... 41 3.4.5 Lewis sistema ... 42 3.4.6 MNS sistema ... 42 3.4.7 Lutheran sistema ... 43 3.4.8 P ir Xg sistemos ... 44 4. Duomenų apibendrinimas ... 45 Išvados ... 48 Literatūra ... 49 Kitos publikacijos ... 59 Priedai ... 60
4
Santrauka
Magistro darbo autorius – Asta Balčiūnaitė
Magistro darbo pavadinimas – Antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnis pacientų gydytų eritrocitų transfuzijomis grupėje.
Darbo tikslas. Nustatyti antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnį pacientų gydytų eritrocitų transfuzijomis grupėje. Tikslui pasiekti buvo išsikelti uţdaviniai:
1. Nustatyti pacientų ABO kraujo grupių ir Rh faktoriaus daţnį.
2. Nustatyti sąsajas tarp antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnio ir lyties, pacientų gydytų eritrocitų transfuzijomis grupėje.
3. Nustatyti sąsajas tarp antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnio ir pacientų amţiaus.
4. Įvertinti antikūnų prieš įvairius eritrocitų antigenus daţnį pacientų, kuriems nustatyti antikūnai prieš eritrocitų antigenus grupėje.
Tyrimo medţiaga ir metodai. Tyrime analizuoti 2641 paciento: 1432 (54,22 proc.) vyrų ir 1209 (45,78 proc.) moterų duomenys. Pacientų amţius buvo nuo 0 iki 100 metų (amţiaus vidurkis 56,68±23,8 metai). Moterų amţiaus vidurkis buvo 59,07±24,20, o vyrų 54,67±23,39 metų, p<0,001. Antikūnai buvo nustatyti 304 (11,5 proc.) pacientams. Visiems pacientams buvo atlikti imunohematologiniai tyrimai (atrankinis tyrimas antikūnams nustatyti ir antikūnų identifikacija). Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „SPSS for Windows 21.0“ ir „Microsoft Office Excel 2010“ statistinių programų paketus.
Tyrimo rezultatai. O kraujo grupė nustatyta 37,5 proc., A kraujo grupė – 37,2 proc., B kraujo grupė – 18,3 proc., AB – 7,0 proc. pacientų. RhD+ nustatyta 81,3 proc., o RhD– buvo nustatyta 18,7 proc. pacientų. Tirtiems pacientams daţniausiai buvo nustatyti antikūnai prieš Rh sistemos antigenus – 8,9 proc., prieš Kell – 4,2 proc., o prieš Lutheran – 3,5 proc., p=0,001. Iš antikūnų prieš Rh sistemos antigenus daţniausiai buvo nustatyti anti–Cw, anti–D ir anti–E, atitinkamai 6,1, 4,2 ir 3,0 proc., p=0,001. Antikūnai prieš Cw, D ir E antigenus daţniau nustatyti moterims nei vyrams. Moterims
antikūnai prieš Cw
antigeną nustatyti 4,3 proc., o vyrams 1,8 proc., p=0,001; antikūnai prieš D antigeną nustatyti 3,1 proc. moterų ir 1,1 proc. vyrų, p=0,001; antikūnai prieš E antigeną nustatyti 1,9 proc. moterų ir 1,1 proc. vyrų, p=0,001. Antikūnai prieš Kell sistemos antigenus, taip pat daţniau nustatyti moterims nei vyrams, 1,6 proc. moterų ir 0,5 proc. vyrų turėjo antikūnus prieš K antigeną, p=0,001. Antikūnus prieš Kpa
antigeną moterys turėjo 1,4 proc., o vyrai 0,9 proc., p=0,012. Antikūnai 4,3 karto daţniau nustatyti suaugusiems nei vaikams. Iš pacientų, kuriems buvo teigiamas atrankinis antikūnų tyrimas, vyrams daţniau nei moterims nustatyti antikūnai prieš Duffy, Kidd ir Lewis eritrocitų antigenų sistemas, atitinkamai, 8,2 ir 2,4 proc., 7,2, ir 0,5 proc., 20,6, ir 7,7 proc.
5 Išvados. 1. ABO kraujo grupės ir Rh faktoriaus daţnis atitinka pasiskirstymą bendroje populiacijoje.
2. Antikūnai prieš eritrocitų antigenus: anti–Cw, anti–D, anti–E, anti–K, anti–Kpa, anti–Lua daţniau nustatyti moterims nei vyrams.
3. Antikūnai prieš eritrocitų antigenus 4,3 karto daţniau nustatyti suaugusiems nei vaikams. 18–45 metų amţiaus pacientams daţniau nustatyti antikūnai prieš Rh ir Lutheran sistemų antigenus.
4. Antikūnai prieš Kidd, Duffy ir Lewis kraujo grupių sistemų antigenus daţniau nustatyti vyrams, kuriems buvo nustatyti antikūnai nei moterims.
6
Summary
Author of The Master's Degree – Asta Balčiūnaitė
Title of master degree – Antibodies against red cell antigens observed in the patients treated with red blood cell transfusion group.
Aim of the study. The detection of antibodies to erythrocyte antigens frequency in patients treated with red blood cell transfusion group. In order to achieve it was to move ahead:
1. Identify patients ABO blood and Rh factor frequency.
2. To determine the relationship between antibodies to red cell antigens frequency and sex of patients treated with red blood cell transfusion group.
3. To determine the relationship between antibodies to red cell antigens frequency and patient age.
4. Rate of antibodies against various erythrocyte antigens frequency in patients with antibodies to red cell antigens group.
Materials and methods. The study analyzed 2,641 patients: 1,432 (54,22 percent) men and 1,209 (45,78 percent) women's. Patients ranged in age from 0 to 100 years (mean age 56,68±23,8 years). Women's average age was 59,07±24,20 and men 54,67±23,39 years, p<0,001. Antibodies identified 304 (11,5 percent) patients. All patients were performed immunohematology tests (screening test to identify antibodies and antibody identification). Statistical analysis was performed using SPSS 21,0 for Windows and Microsoft Office Excel 2010 statistical software packages.
Results of the study. O blood group found 37,5 percent, A blood group – 37,2 percent, B blood group – 18,3 percent, AB – 7,0 percent. RhD+ found 81,3 percent and RhD were determined by 18,7 percent. Examined patients were generally positive for antibodies to the Rh system antigens – 8,9 percent, against Kell – 4,2 percent, and against the Lutheran – 3,5 percent, p=0,001. The antibodies against the Rh antigen were generally detection of anti–CW anti–D and anti–E, by 6,1 percent, 4,2 percent and 3,0 percent, p=0,001.Antibodies against CW, D, and E antigens often found in women than in men. Antibodies against Cw antigen in woman found by 4,3 percent, and 1,8 percent in men., p=0,001. Antibodies against the D antigen found 3,1 percent in women and 1,1 percent in man, p=0,001. Antibodies against the E antigen found 1,9 percent in women and 1,1 percent in men, p=0,001. Antibodies against Kell system antigens are also more likely to identify women than men. 1,6 percent of women and 0,5 percent of men had antibodies to antigen K, p=0,001. Antibodies against the antigen Kpa was found 1,4 percent in woman and 0,9 percent in men, p=0,012. Antibodies are 4,3 times more often in adults than in children.Pacient who are positive antibody screening test, are more likely men than women to identify antibodies against Duffy, Kidd and Lewis erythrocyte antigen systems, respectively, 8,2 and 2,4 percent, 7,2 and 0,5 percent, 20,6 and 7,7 percent.
7 Conclusions. 1. ABO blood group and Rh factor corresponds to the frequency distribution of the general population.
2. Detection of antibodies to erythrocyte antigens: anti–Cw, anti–D, anti–E, anti–K, anti–Kpa, anti–Lua more often found in women than in men.
3. Antibodies to red cell antigens 4,3 times more often in adults than in children. 18–45 year-old patients are more positive for antibodies to the Rh antigens and Lutheran systems.
4. Antibodies against Kidd, Duffy and Lewis blood group antigens systems often identify men who were positive for antibodies than in women.
8
Interesų konfliktas
9
Etikos komiteto leidimas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Bioetikos centras Leidimo Nr.: BEC – LMB(M) – 219
10
Santrumpos
Ag – antigenas
Ak – antikūnas
C – pastovus imunoglobulinų regionas
CL – lengvosios imunoglobulinų grandinės pastovaus regiono domenas
Ctl – kontrolė
H Ig
– sunkioji imunoglobulinų grandinė – imunoglobulinas
ISBT – (angl. International Society of Blood Transfusion), tarptautinė organizacija kraujo perpylimo klausimais
L – lengvoji imunoglobulinų grandinė
Rh – Rezus kraujo grupių sistema
Rh (D) – Rezus faktorius D
Rh (D+) – Rezus faktorius D teigiamas Rh (D-) – Rezus faktorius D neigiamas V – kintantis imunoglobulinų regionas
VL – lengvosios imunoglobulinų grandinės kintamo regiono domenas
11
Įvadas
Šiuolaikinės medicinos paţanga ir pasiekimai lemia didesnį pacientų išgyvenamumą sergant sunkiomis ligomis. Sveikatos būklę gali pagerinti ir eritrocitų transfuzijos, kurios naudojamos kaip vienas iš gydymo metodų (1–3). Neišvengiamai, vis daţniau taikant šį gydymo metodą, susiduriama su daugkartinės eritrocitų transfuzijos problema. Pirmosios kraujo transfuzijos pradėtos taikyti dar XVII amţiuje. Dėl eritrocitų agliutinacijos, didţioji dalis tokių bandymų baigdavosi mirtimi. Mokslininkai nestokodami nei laiko, nei lėšų stengėsi išsiaiškinti nesėkmingų transfuzijų prieţastis (1, 4).
XX amţiaus pradţioje Karl Landsteiner aprašė pirmuosius ABO kraujo grupių antigenus, atlikęs agliutinacijos reakcijas. Dabar yra ţinomos 36 eritrocitų antigenų sistemos, kurias sudaro daugiau nei 600 eritrocitų antigenų (5). Kraujo transfuzijų metu į organizmą patekę jam svetimi antigenai gali sukelti specifinių antikūnų sintezę arba jau esančių antikūnų specifines reakcijas. Norint, kad transfuzija būtų sėkminga, būtina nustatyti antikūnus, atsiradusius prieš kliniškai svarbius eritrocitų antigenus ir galinčius sukelti potransfuzines hemolizines reakcijas (6). Svarbiausios kraujo grupių sistemos yra ABO, Rh, Kell. Antikūnai prieš Kidd, Duffy, Lutheran, MNS, Lewis, Xg, P sistemas įprastai veikia silpnai, bet sukelia uţdelstas potransfuzines komplikacijas (7–9).
Tarptautinė organizacija kraujo perpylimo klausimais (ISBT) įvardino ir pripaţino reikšmingomis 33 kraujo grupių antigenų sistemas (6). Didţiausią įtaką transfuzijoms turinčią ABO kraujo grupių sistemą sudaro keturios kraujo grupės – O, A, B ir AB. ABO kraujo grupių antigenai yra laikomi svarbiausiais transfuzinėje medicinoje (10). Antikūnai prieš šios sistemos antigenus, esantys kraujo serume, vadinami agliutininais, o antigenai, esantys eritrocitų membranoje – agliutinogenais (4, 7). Rh antigenų sistema dėl didelio imunogeniškumo nenusileidţia ABO kraujo grupių sistemai (11). Kitų kraujo grupių eritrocitų antigenai, taip pat turi įtakos hemotransfuzijoms, todėl atliekant kraujo transfuzijas yra siekiama suderinti kuo daugiau kraujo grupių antigenų (12).
Eritrocitų transfuzijos yra nepakeičiamas gydymo metodas pacientams, sergantiems hematoonkologinėmis, onkologinėmis ir kitomis lėtinėmis ligomis. Transfuzijų saugumui ir potransfuzinių reakcijų sukeliamų problemų sprendimui yra skiriama daug dėmesio (13, 14).
12
Darbo tikslas
Nustatyti antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnį pacientų gydytų eritrocitų transfuzijomis grupėje.
Darbo uţdaviniai
1. Nustatyti pacientų ABO kraujo grupės ir Rh faktoriaus daţnį.
2. Nustatyti sąsajas tarp antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnio ir lyties pacientų gydytų eritrocitų transfuzijomis grupėje.
3. Nustatyti sąsajas tarp antikūnų prieš eritrocitų antigenus daţnio ir pacientų amţiaus. 4. Įvertinti antikūnų prieš įvairius eritrocitų antigenus daţnį pacientų, kuriems nustatyti antikūnai prieš eritrocitų antigenus grupėje.
13
1. Literatūros apţvalga
1.1 Kraujo grupių antigenai ir antikūnai
1.1.1 Kraujo grupių antigenai
Antigenai (gr. anti – prieš, genos – kilmė) – tai medţiagos, kurios turi svetimos genetinės informacijos ir kurios, patekusios į organizmą, sukelia specifines imunines, humoralines ir ląstelines reakcijas (1, 2).
Tam tikrų medţiagų sugebėjimas suţadinti antikūnų sintezę ar kitaip pasireiškiančias specifines imunines reakcijas, vadinamas – antigeniškumu. Imunogeniškumas – tai antigeno sugebėjimas specifiškai sąveikauti su antikūnais. Ši savybė prasminga efektorine prasme: imuninės reakcijos ar imuninio atsako biologinė esmė – organizmui svetimos medţiagos atpaţinimas ir pašalinimas. Antigeno imunogeniškumui turi įtakos: 1) antigeno molekulinė masė; 2) cheminė sudėtis; 3) antigeno dozė ir patekimo kelias (15). Antigeno savybė, pasireiškianti jo sugebėjimu specifiškai sąveikauti, vadinama – antigeniniu specifiškumu. Specifiškumą sąlygoja antigeno molekulės dalis, vadinama antigenine determinante (epitopu), galinti nekovalentiškai jungtis su antikūno tam tikra molekulės dalimi – paratopu (15–19).
Pagal antigeniškumą ir imunogeniškumą antigenai skirstomi į visaverčius ir nevisaverčius. Visaverčiai antigenai sugeba sukelti specifinių antikūnų gamybą ir reaguoja su jais tiek in vivo, tiek in vitro. Jiems priklauso daugelis gyvūninės, augalinės, mikrobinės kilmės baltymų, kai kurie polisacharidai bei baltymų, polisacharidų ir lipidų junginiai, vadinami kompleksiniais antigenais.
Eritrocitų antigenai yra eritrocitų membranų struktūros dalis. Pagal cheminę struktūrą tai baltymai, glikoproteinai ar lipoproteinai (15, 20). Eritrocitų antigenai gali sukelti imunines humoralines ar ląstelines reakcijas, kai patenka į organizmą, kuris neturi šių antigenų (pavyzdţiui, perpylus netapačios kraujo grupės eritrocitų) ir juos atpaţįsta kaip svetimus. Pasigaminę prieš šiuos antigenus antikūnai atakuoja eritrocitus – eritrocitai sensibilizuojami. Sensibilizuoti eritrocitai yra fagocituojami ar hemolizuojami (20–23).
Pagal pasiskirstymą tam tikrų biologinių rūšių ir individų organizme antigenams būdinga: 1) rūšinis specifiškumas: antigenų ypatybės, būdingos konkrečios biologinės rūšies individams; 2) grupinis specifiškumas: antigenų ypatybės, būdingos tam tikrai grupei individų biologinės rūšies viduje (pavyzdţiui, ţmogaus eritrocituose yra ABO antigenų sistema); 3) heterogeninis specifiškumas: antigeninis specifiškumas, susijęs su tuo, kad individai, priklausantys įvairioms biologinėms rūšims, turi tapačių antigenų (15).
14 Genai, atsakingi uţ eritrocitų antigenų sintezę yra išsidėstę viename ar keliuose chromosomų lokusuose. Daţniausiai eritrocitų antigenai yra paveldimi pagal Mendelio dėsnius. Kraujo grupių antigenai priklauso polimorfinėms sistemoms, kurios genetiškai viena nuo kitos nepriklausomos ir koduojamos atitinkamų genų. Šie genai turi alelius, kurie gali būti homozigotiniai arba heterozigotiniai abiejuose chromosomų porų haplotipuose. Nuo šių alelių priklauso eritrocitų antigenų ekspresija: dominantinė, recesyvinė arba kodominantinė (1).
Eritrocitų antigenai padeda išlaikyti ląstelės vientisumą. Antigenai būdami eritrocitų membranų struktūrine dalimi, per membranas perneša anijonus (Diego sistemos antigenai), vandenį (Colton sistemos antigenai), yra citokinų receptoriai ar adhezijos molekulės (Duffy, Lutheran, Landsteiner–Wiener sistemų antigenai), gali transportuoti šlapalą (ABO, Kidd eritrocitų sistemų antigenai). Kraujo grupių antigenai yra reikšmingi hemolizinės naujagimių ligos išsivystymui. Nustatytos sąsajos tarp paveldimų ligų ir kraujo grupių (1, 11, 18). O kraujo grupės atstovai daţniau, nei kitų kraujo grupių asmenys, turi von Wilebranto faktoriaus stoką. Taip pat manoma, kad ABO kraujo grupės turi įtakos pasireiškiant vainikinių širdies arterijų ligoms, venų trombozei ar net skrandţio vėţiui (24). Klinikinė eritrocitų antigenų sistemų ar kraujo grupių svarba priklauso nuo antigeno imunogeniškumo, aloantikūnų daţnio ir jų koncentracijos. Antigenų antigeniškumą lemia antigenų kiekis eritrocito membranoje, antigeno dydis, ţmogaus imuninė sistema, ligos, vartojami vaistai (20).
Šiuo metu yra nustatytos 33 kraujo grupių antigenų sistemos. Aprašyti daugiau kaip 600 antigenų. Iš jų klasifikuota, pagal Tarptautinės organizacijos kraujo perpylimo klausimais (ISTB) rekomendacijas, daugiau kaip 300 antigenų esančių ant eritrocitų. Nepriklausomi antigenai yra rūšiuojami į skirtingas kraujo grupes (1 lentelė). Remiantis ISTB reikalavimais, 30 kraujo grupių yra ţymimos nuo ISTB 001 iki ISTB 030. Antigenų ir antikūnų charakterizavimas (2 lentelė), jų struktūros nustatymas ir genetinė analizė padeda įvertinti specifinių reakcijų pasireiškimą organizme (4, 6, 17, 18, 25–27).
1 lentelė. Kraujo grupių antigenų sistemos pagal ISTB (27)
Numeris pagal ISTB Sistemos pavadinimas Sistemos numeris Chromosoma, kurioje aptinkamas 001 ABO ABO 9 002 MNS MNS 4 003 P P1 22 004 Rh RH 1 005 Lutheran LU 19 006 Kell KEL 7 007 Lewis LE 19 008 Duffy FY 1
15 009 Kidd JK 18 010 Diego DI 17 011 Yt YT 7 012 Xg XG X 013 Scianna SC 1 014 Dombrock DO 12 015 Colton CO 7 016 Landsteiner – Weiner LW 19 017 Chido/Rogers CH/RG 6 018 H H 19 019 Kx XK X 020 Gerbich GE 2 021 Cromer CROM 1 022 Knops KN 1 023 Indian IN 11 024 Ok OK 19 025 Raph RAPH 11
026 John Milton Hagen JMH 15
027 I I 6
028 Globiside GLOB 3
029 Gill GIL 9
030 Rh – associated glycoprotein RHAG 6
Pagal ISBT kiekvienos kraujo grupės antigenui priskiriamas šešių skaitmenų skaičius. Pirmieji trys skaitmenys reiškia kraujo grupę (pvz., ABO yra 001, Rh – 004), o paskutinieji trys skaitmenys nurodo kokia tvarka buvo atrasti antigenai. Pavyzdţiui, ABO kraujo grupių sistemos A antigenas rastas pirmiausiai, todėl jo numeris bus 001.001. B antigenas rastas truputį vėliau, todėl jo numeris bus 001.002 (2 lentelė) (18, 28).
2 lentelė. Pagrindiniai kraujo grupių sistemų antigenai (28)
Antigeno numeris Sistemos numeris pagal ISTB Sistemos simbolis pagal ISTB Antigenų skaičius sistemoje 001 002 003 004 005 006 007 008 009 001 ABO 4 A B A, B A1 002 MNS 44 M N S s U He Mia Mc Vw 003 P 5 P1 004 RH 56 D C E c e f Ce Cw Cx
005 LU 21 Lua Lub Lu3 Lu4 Lu5 Lu6 Lu7 Lu8 Lu9
006 KEL 30 K k Kpa Kpb Ku Jsa Jsb
007 LE 6 Lea Leb Leab LebH ALeb BLeb
008 FY 6 Fya Fyb Fy3 Fy4 Fy5 Fy6
009 JK 2 Jka Jkb
16 011 YT 2 Yta Ytb 012 XG 2 Xga CD99 013 SC 7 Sc1 Sc2 Sc3 Rd STAR 014 DO 5 Doa Dob Gya Hy Joa 015 CO 3 Coa Cob Co3 016 LW 7 LWa LWab LWb 017 CH/RG 7 Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 Ch5 Ch6 WH 018 H 1 H 019 XK 1 Kx
020 GE 9 Ge2 Ge3 Ge4 Wb Lsa Ana Dha GEIS
021 CROM 14 Cra Tca Tcb Tcc Dra Esa IFC WESa WESb
022 KN 8 Kna Knb McCa SI1 Yka McCb SI2 SI3
023 IN 2 Ina Inb 024 OK 1 Oka 025 RAPH 1 MER2 026 JMH 1 JMH 027 I 1 I 028 GLOB 1 P 029 GIL 1 GIL
1.1.2 Kraujo grupių antikūnai
Antikūnai – tai baltymai savitai reaguojantys su antigenais, kurie sukelia šių antikūnų atsiradimą. Organizmas reaguodamas į jam svetimus eritrocitų membranose esančius antigenus pradeda sintetinti antikūnus. Antikūnai yra pagrindinė plazmos γ globulinų frakcijos dalis. Antikūnai, norint juos atskirti nuo kitų baltymų, dar vadinami imunoglobulinais. Imunoglobulinai yra glikoproteinai, kuriuose angliavandenių yra nuo 2 iki 14 proc. Imunoglobulinai sudaro apie 20 proc. plazmos baltymų. Imunoglobulinus po stimuliacijos antigenu sintetina plazminės kraujo ląstelės, kurios išsivysto iš B limfocitų (15, 19). Antikūnai prieš eritrocitų antigenus yra IgM ir IgG, rečiau – IgA klasės (20).
Pagrindinis struktūrinis imunoglobulinų molekulės vienetas yra Y formos monomeras, sudarytas iš dviejų porų polipeptidinių grandinių. Viena pora grandinių turi dvigubai daugiau aminorūgščių, todėl jos vadinamos sunkiosiomis grandinėmis (H). Lengvosios grandinės (L) yra maţesnės molekulinės masės. Keturios grandinės vienoje molekulėje yra laikomos nekovalentinių disulfidinių (-S-S-) jungčių. Kiekvienoje imunoglobulinų molekulėje polipeptidinė grandinė turi kintamąjį regioną (V) ir pastovųjį (C) regioną (1 pav.) (15, 27).
Domenai yra globulinės struktūros, kurios susiformuoja polipeptidinės grandinės erdvėje. Kiekvienas domenas yra apribojamas -S-S- jungtimi. Vieną domeną sudaro 100–110 aminorūgščių. Lengvoji grandinė sudaryta iš dviejų domenų: CL (pastovaus regiono domenas) ir VL (kintamo regiono
domenas). Sunkiojoje grandinėje yra suformuojamas tik vienas domenas – VH. Domenų skaičius
17 aktyviuosius centrus – paratopus – struktūras, kurios jungiasi su antigenų molekulių antigeninėmis determinantėmis – epitopais (9, 15, 19).
Antikūnų molekulės turi 3 fragmentus. Du identiški fragmentai yra vadinami Fab fragmentais. Jie turi aktyvųjį antikūnų centrą, todėl gali reaguoti su antigenu. Trečiasis fragmentas nereaguoja su antigenu ir yra vadinamas Fc fragmentu. Jis atlieka efektoriaus funkcijas (1 pav.) (15, 19).
1 pav. Imunoglobulinų struktūros schema
Yra skiriamos penkios imunoglobulinų klasės: IgG, IgM, IgE, IgD ir IgA (3 lentelė). Kiekviena imunoglobulinų klasė pasiţymi skirtingomis savybėmis ir funkcijomis. IgM yra pirmasis imunoglobulinas, kuris atsiranda, kaip organizmo atsakas į infekcijas. IgM padidėjimas rodo ūmią infekcinės ligos fazę (29). IgG kiekis pradeda didėti po mėnesio, nuo infekcijų pradţios ir rodo uţsitęsusią lėtinę ar persirgtą infekciją. IgG yra vienintelis imunoglobulinas pereinantis placentą (30). IgE yra svarbus nustatant alergines reakcijas (31). IgD randamas B limfocitų membranoje ir siejamas su autoimuniniais procesais (32). IgA atlieka apsaugines funkcijas. Jis apsaugo odą ir gleivines nuo patogeninių veiksnių (33).
3 lentelė. Imunoglobulinų klasės ir pagrindinės funkcijos (34)
Imunoglobulinų klasė Savybės Struktūra
IgM Natūraliai atsirandantys imuniniai
antikūnai, nustatomi ūmios infekcijos metu
IgG Gamina kraujo plazmos ląstelės.
Vienintelis imunoglobulinas galintis pereiti placentą
Fab fragmentas
18
IgE Dalyvauja alerginėse reakcijose,
padidėja esant parazitinėms infekcijoms
IgD B limfocitų membranos dalis.
Aktyvuoja bazofilus ir putliąsias ląsteles
IgA Randamas, gleivėse, ašarose, seilėse,
motinos piene. Saugo nuo pakartotinai patenkančių patogenų
Antikūnai klasifikuojami pagal kilmę, reakcijos su antigenais ypatumus ir kitas savybes (1, 20). Pagal antikūnų kilmę – yra skiriami: natūralūs antikūnai ir imuniniai antikūnai. Plazmoje esantys įprasti tam organizmui antikūnai, susidarantys ne po kraujo perpylimo ar nėštumo, o susiformavę evoliuciškai yra vadinami natūraliais antikūnais. O kraujo grupės kraujyje yra antikūnai prieš A antigeną (anti–A) ir antikūnai prieš B antigeną (anti–B), A kraujo grupė turi antikūnus prieš B antigeną (anti–B), o B kraujo grupė – antikūnus prieš A antigeną (anti–A). Daţniausiai tai IgM klasės antikūnai, kurie dėl didelės molekulinės masės nepereina placentos (20).
Imuniniai antikūnai susidaro kaip atsakas į svetimus eritrocitų antigenus perpilant kraują, patekus vaisiaus eritrocitų antigenams į motinos kraują gimdymo metu ar nutraukus nėštumą. Pavyzdţiui, antikūnai prieš Rh sistemos antigenus: antikūnai prieš D antigeną (anti–D), antikūnai prieš E antigeną (anti–E), antikūnai prieš C antigeną (anti–C), antikūnai prieš c antigeną (anti–c), antikūnai prieš K antigeną (anti–K), antikūnai prieš Jk antigeną (anti–Jk) ir kiti (20, 35).
Antikūnams reaguojant su atitinkamais eritrocitų antigenais vyksta eritrocitų agliutinacija. IgG ir IgM klasės antikūnai skiriasi pagal sąveiką su antigenais. Eritrocitai yra įelektrinti neigiamai, todėl stumia vienas kitą ir agliutinaciją daţniau sukelia didesnės IgM molekulės. Antikūnai, kurie geba suformuoti jungtis tarp eritrocitų yra vadinami agliutinuojančiais arba pilnaisiais. Neagliutinuotieji arba nepilnieji antikūnai, gali jungtis su eritrocitų antigenais, bet patys nesugeba suformuoti stabilių agliutinatų. Tai grindţiama silpnesniu polinkiu jungtis prie antigeno, dėl nedidelio molekulinės masės dydţio ir koncentracijos. Nepilnieji antikūnai yra šiltieji, nes su eritrocitų antigenais reaguoja 37°C temperatūroje ir priklauso IgG klasei (20, 27, 36).
Antikūnai, kurie pasigamina, kai organizmą veikia svetimi kraujo grupių antigenai, tos pačios rūšies individo, vadinami aloantikūnais (1, 37, 38). Aloantikūnai paprastai atsiranda po kraujo perpylimų ar nėštumo (36). Aloantikūnai yra šiltieji ir priklauso IgG1 ir IgG3 poklasiams. Aloantikūnai atsirandantys natūraliai, be stimuliacijos, tai anti–A, anti–B, anti–E, anti-Cw
, anti–K, anti-Fya, anti-Lua (39). Šie antikūnai priklauso IgM klasei (40).
Antikūnai, kurie susidaro prieš savo eritrocitų antigenus vadinami autoantikūnais. Daţniausiai jų atsiradimą lemia biologiniai ir cheminiai (vaistai) veiksniai. Autoantikūnai gali atsirasti kaip
19 pagrindinės ligos komplikacija. Autoantikūnai yra šiltieji, IgG klasės. Dauguma autoantikūnų yra specifiški Rh sistemos antigenams, ypatingai e antigenui (35, 40).
1.2 Eritrocitų antigenų sistemos
1.2.1 ABO sistema
ABO kraujo grupių sistema yra pati svarbiausia ir buvo atrasta pirmoji. Ši sistema vaidina didţiausią vaidmenį transfuzinėje praktikoje. Landsteiner atlikęs eksperimentus su eritrocitais ir plazma pastebėjo, kad tarp skirtingų ţinomų eritrocitų ir kraujo plazmos vyksta agliutinacijos reakcijos. 1901 metais Karl Landsteiner pirmasis aprašė ABO kraujo grupių sistemą. Kraujo grupes pavadino pirmosiomis abėcėlės raidėmis A, B ir C (41). Vėliau C kraujo grupė buvo pervadinta į O (nėra antigenų). 1902 metais Von Dekastel ir Sturli atrado ketvirtąją kraujo grupę ir ją pavadino AB. 1907 metais Janski nepriklausomai nuo Landsteiner nustatė kraujo grupes, jas pavadindamas romėniškais skaitmenimis I, II, III, IV. Iki 1928 metų romėniški kraujo grupių pavadinimai išliko populiarūs Europoje ir Amerikoje, bet dėl pavojaus susimaišyti, 1982 metais ISBT pasiūlė naudoti didţiųjų raidţių nomenklatūrą – O, A, B, AB (17, 27).
A kraujo grupė turi antikūnus prieš B antigeną, B kraujo grupė turi antikūnus prieš A antigeną, O kraujo grupė turi antikūnus prieš A ir prieš B antigenus, o AB kraujo grupė antikūnų neturi. ABO kraujo grupės nustatomos kambario temperatūroje maišant paciento eritrocitus su monokloniniais antikūnų serumais. ABO kraujo grupių tipavimui naudojami monokloniniai serumai su anti–A ir anti–B, ir A ir B kraujo grupių standartiniai eritrocitai, stebimos agliutinacijos reakcijos (4 lentelė) (27).
4 lentelė. ABO kraujo grupių nustatymas agliutinacijos reakcijomis (+ – įvykusi agliutinacijos reakcija, - – neįvykusi agliutinacijos reakcija) (17)
Kraujo grupė Monokloniniai serumai Standartiniai eritrocitai
anti–A anti–B anti–AB A B Ctl
O + + + - - -
A - + + + - -
B + - + - + -
AB - - - + + -
Kraujo grupių daţnumas priklauso nuo skirtingo genetinio fondo. Labiausiai paplitusi yra O kraujo grupė. AB kraujo grupė – pati rečiausia (17, 42). ABO kraujo grupių paplitimas Baltijos šalyse pateiktas 5 lentelėje, o tarp skirtingų rasių ţmonių 6 lentelėje.
20 5 lentelė. ABO kraujo grupių paplitimas Baltijos šalyse (9)
Kraujo grupė Paplitimas (proc.)
Lietuva Latvija Estija
O 40 32 34
A 34 37 36
B 20 24 23
AB 6 7 8
6 lentelė. ABO kraujo grupių paplitimas (43–46)
Kraujo grupė Paplitimas (proc.)
Europoje Azijoje Afrikoje
O 43 39 53
A 40 33 24
B 12 23 20
AB 5 5 3
ABO kraujo grupių sistemos stipriausi imunogenai yra A ir B antigenai. Šių antigenų daugiausiai yra eritrocitų ir kraujagyslių endotelio ląstelių membranose, rečiau pasitaiko ištirpusių kraujo plazmoje (20). ABO antigenai paveldimi pagal genus (47), kurie turi tris skirtingus alelius: IA, IB ir i. Jie lemia ABO kraujo grupes (7 lentelė) (48, 49). A ir B antigenai atsiranda penkioliktą vaisiaus vystymosi savaitę, o galutinai susiformuoja tarp dviejų ir ketverių vaiko gyvenimo metų (17).
7 lentelė. Antigenų paveldimumas (48)
Antigenas Alelis
A IA
B IB
O i
Dėl skirtingų antigenų savybių A ir B kraujo grupės yra suskirstytos į pogrupius. A kraujo grupė skirstoma į: A1, A2, A3, Ax ir Am. 80 proc. ţmonių turi A1 antigeną, 20 proc. – A2. Kiti A
antigeno pogrupiai pasireiškia labai retai. A1 būdingesnis centrinei Europos daliai, o A2 –
Skandinavijai (50). B kraujo grupė skirstoma į: B, B3, Bx, Bm, Bw, Bv. Stipriausias yra B antigenas, kitos B antigeno subgrupės pasitaiko retai (49).
Antikūnai prieš ABO sistemos antigenus susiformuoja natūraliai, be eritrocitų antigenų stimuliacijos. Antikūnai prieš A antigeną (anti–A) ir antikūnai prieš B antigeną (anti–B) paprastai priklausi IgM klasei. Šie antikūnai daţniausiai yra šaltieji, nes su eritrocitų antigenais reaguoja 4–27°C
21 temperatūroje, tačiau jų reakcijos su antigenais temperatūra gali siekti ir +37°C. Anti–A ir anti–B gali priklausyti IgG klasei, šie antikūnai sukelia naujagimių hemolizinę ligą. Antikūnų sukeltas konfliktas įprastai nekoreliuoja su jų titru. Naujagimiai nesintetina imunoglobulinų, todėl anti-A ir anti-B nėra aptinkama gimimo metu. Ţymus antikūnų titras pasiekiamas 3–6 mėnesių amţiaus. Su amţiumi antikūnų kiekis maţėja. Anti–A koncentracija daţniau yra didesnė nei anti–B (20, 51).
Anti–A turi O ir B kraujo grupės ţmonės. Anti–A pasireiškia funkcionaliai pasidalijęs į du komponentus: anti–A1, kuris reaguoja tik su A1 antigenu, bet nereaguoja su A2 ir anti–Acommon, kuris
reaguoja ir su A1, ir su A2. Anti–A1 antikūnai yra naudojami atskirti A1 ir A2 antigenus. Anti–B
antikūnų turi O ir A kraujo grupės ţmonės. Taigi, O kraujo grupę turinčių ţmonių serume yra kartu tam tikrais kiekiais anti–A ir anti–B. Anti–H yra silpnas, šaltyje reaguojantis antikūnas. Jį kraujo serume turi A1 ir A1B antigenus turintys ţmonės. Šio antikūno didelė ekspresija aptinkama pas
ţmones, kurie turi Bombėjaus fenotipą. Tai labai retas fenotipas, kuriam būdingas dviejų hh genų paveldėjimas, dėl kurio asmenys neturi A ir B antigenų, ir antikūnų prieš A ir B antigenus (17, 19, 52).
1.2.2 Rh sistema
P. Levin ir R. E. Stetson 1939 metais pirmieji nustatė Rh kraujo grupių sistemą. Rh eritrocitų antigenų sistema yra antroji pagal reikšmingumą kraujo grupių sistema po ABO. Ji yra svarbi kraujo transfuziologijoje, naujagimių hemolizinės ligos išsivystymui. Ţmonės turintys D antigeną yra vadinami (RhD+), o ţmonės, kurie neturi RhD antigeno laikomi (RhD-). 85 proc. ţmonių turi D antigeną, likę 15 proc. jo neturi. RhD- daţniausiai nustatomas kaukaziečiams ir europiečiams, net 15– 17 proc., RhD- asmenų Afrikoje yra tik 5 proc. (17).
RHD ir RHCE yra du genai koduojantys Rh baltymus. RHD koduoja D antigeną, o RHCE koduoja CE antigenus ir jų skirtingas kombinacijas: ce, cE, Ce ar CE. Esant RHD geno delecijai įprastai pasireiškia RhD- fenotipas, todėl RhD- asmenys turi tik RHCE geną. (53, 54).
Rh D antigenas yra paveldimas autosominiu dominantiniu būdu. Rh faktoriaus buvimą galima nustatyti iš genetinio modelio, kuriame vyrauja D ir d aleliai. Asmenys turintys dominantinę homozigotą (DD) ar heterozigotą (Dd) bus RhD+. Individai, kurie turi receyvinę homozigotą (dd) bus RhD-. Vaisius vieną RhD geną paveldės iš motinos, o kitą iš tėvo, nepriklausomai nuo ABO kraujo grupių (17).
R. A. Fischer ir R. Raice, A. S. Wiener, ir R. E. Rosenfield sukūrė skirtingus Rh sistemos antigenų ţymėjimus. R. A. Fischer ir R. Raice terminologija yra naudojama daţniausiai apibūdinant Rh sistemos antigenus. Pagal šių autorių pasiūlytą DCE terminologiją Rh sistema susideda iš artimai susijusių genų ar alelių: D išsidėstęs pirmame lokuse, C ir c antrame, E ir e trečiame lokuse. Originali A. S. Wiener nomenklatūra yra sudėtingesnė ir nebevartojama. Rh0 reiškia D geną, r – genai, kurie
22 nekoduoja Rh0, indeksu nurodomi aleliai. R. E. Rosenfield terminologijos principas yra kiekvienam
antigenui priskirti numerį (8 lentelė) (17).
8 lentelė. Rh sistemos antigenų žymėjimas remiantis skirtingų autorių nomenklatūra (17)
Antigenai
Fisher – Race Wiener Rosenfield
D Rh0 1
C rh’ 2
E rh’’ 3
c hr’ 4
e hr’’ 5
Rh faktorius tampa ypatingai reikšmingas, kai nėščia RhD- moteris, o vaisius turi RhD+. Tada Rh faktorius veikia kaip antigenas ir sukelia motinos organizme antikūnų sintezę, pasireiškiančią stipriomis imuninėmis reakcijomis. Tokios pačios imuninės reakcijos pasireiškia, kai RhD- asmeniui yra perpilamas RhD+ kraujas. Organizme ima gamintis antikūnai, kurie sukelia eritrocitų agliutinaciją, o vėliau ir hemolizę (17).
Rh kraujo grupių sistema turi penkis pagrindinius antigenus: D, C, c, E, e (20). Svarbiausias Rh sistemos antigenas yra D. Jis yra kliniškai reikšmingiausias, dėl stiprių antigeninių savybių. D antigenas ekspresuoja ne maţiau 30 epitopų išsidėsčiusių išilgai ekstraląstelinių RHD baltymų. Amino rūgščių pasikeitimas nepašalina D antigeno, bet galimi epitopų praradimai dėl kurių formuojasi skirtingi D antigeno variantai. Egzistuoja trys pagrindinės D antigeno grupės: silpnas D (DW
) ir D variantai, iš kurių daţniausias DIV
(17, 55–57).
Be D antigeno klinikiniu poţiūriu dar reikšmingi yra C, E, c, e antigenai. Didesnis kiekis C antigeno yra ekspresuojamas azijiečių, o afrikiečiams pasireiškia rečiau. Genas RHCE koduoja nedidelį daţnumą turinčius Cw
ir Cx antigenus. Cw daţniau pasireiškia negu Cx (11, 17, 58, 59). Antigenas c yra antras po D antigeno, pagal imunogeniškumą (20). E ir e antigenai pasireiškia maţesniu imunogeniškumu negu D antigenas. Rh sistemos antigenų daţnumas pateikiamas 9 lentelėje (17, 60, 61).
9 lentelė. Rh sistemos antigenų paplitimas (60, 61)
Antigenai Paplitimas (proc.)
Europoje Indijoje Azijoje Afrikoje
D 85 95 99 92
C 70 70 93 27
c 80 85 47 96
E 30 15 39 22
23 Antikūnai prieš Rh sistemos antigenus (anti–Rh) yra imuniniai antikūnai susidarę nėštumo metu ar supylus netapatų kraują. Šie antikūnai daţniausiai yra IgG klasės ir praeina placentos barjerą (20). IgG Rh sistemos antikūnai geriausiai reaguoja 37°C temperatūroje (16). Kartais anti–E ir anti–Cw gali atsirasti natūraliai ir būti IgM klasės. Visi antikūnai prieš Rh sistemos antigenus sukelia naujagimių hemolizinę ligą (17, 18, 20, 62).
Antikūnai prieš D antigeną (anti–D) yra kliniškai svarbiausi, nes susidaro 85 proc. ţmonių po sąveikos su D antigenu. Po pirmojo nėštumo RhD- motina, jei pagimdė RhD+ naujagimį, būna sensibilizuota antikūnais prieš D antigeną (anti-D). Sekančio nėštumo metu, anti–D lengvai praeina placentą ir atakuoja RhD+ naujagimio D eritrocitų antigeną. Naujagimių hemolizinę ligą anti-D daţnai sukelia kartu su anti–C ir anti–E (17).
Antri pagal klinikinę reikšmę ir imunogeniškumą svarbiausi yra antikūnai prieš c antigeną (anti-c). Anti–c yra atsakingi uţ lėto tipo potransfuzines hemolizines reakcijas. Po imunizacijos anti–c pakankamai greitai išnyksta. Įprastai anti–c veikia kartu su anti–E. Komplikacijos dėl anti–c antikūnų gali būti panašios į sukeliamas anti–D. Toliau pagal daţnumą seka antikūnai prieš E antigeną. Dėl neţinomų prieţasčių, kartais šie antikūnai gali susiformuoti natūraliai, tada jie bus IgM klasės. Kliniškai svarbūs būna, tik tie anti-E antikūnai, kurie pasireiškia kartu su anti–c (17, 63).
C antigenas yra silpnas imunogenas, todėl antikūnai prieš C antigeną (anti–C), po transfuzijų, atsiranda retai. Anti–C veikia kartu su anti–D ar anti–c. Anti–C kaip ir anti–e retai sukelia naujagimių hemolizinę ligą (64). Anti–e yra šiltieji autoantikūnai. Anti–e veikia su anti–C antikūnais (65). Anti– Cw gali sukelti ūmią naujagimių hemolizinę ligą. Po transfuzijų anti–Cw atsiranda retai, dėl maţo Cw antigeno daţnio populiacijoje (66).
1.2.3 Kell sistema
Pirmasis 1946 metais buvo aprašytas K antigenas, kuris rastas pas moterį pavarde Kelleher, todėl visa sistema pavadinta Kell sistema. 1957 metais rasti kiti Kell sistemos antigenai: Kpa
, Kpb ir K0
(67, 68). Antigenas Jsa aprašytas 1958 metais, nustačius, kad pacientui John Sutter pasigamino antikūnai prieš minėtą antigeną. Priešingas antigenas Jsb
rastas 1963 metais. Abu šie antigenai 1965 metais įtraukti į Kell kraujo grupių sistemą. Kell sistemai taip pat priklauso daţnai nustatomas K11 antigenas ir retai sutinkamas K17 antigenas, dar vadinamas Wka antigenu. Jie nustatyti 1974 metais (69). Kpc antigenas retai nustatomas, Kell sistemai priskirtas 1979 metais (70). Iš viso Kell kraujo grupių sistemai priklauso 24 antigenai. Kell kraujo grupių sistema yra trečia pagal daţnumą po ABO ir Rh, kuri gali sukelti sunkias komplikacijos po hemotransfuzijų (17, 71 ).
Kell antigenai randami ne tik eritrocituose, bet ir mieloidinės eilės ląstelėse. Kell sistemai būdinga penkios grupės alelių, kurie ekspresuoja didelio ir maţo daţnio antigenus. Kell antigenų
24 pasireiškimas skiriasi skirtingų ţmonių populiacijose. 9 proc. baltosios rasės ţmonių turi K antigeną ir tik 2 proc. juodosios rasės ţmonių nustatomas K antigenas. Jsa antigeną turi 20 proc. juodosios rasės ţmonių, bet tarp baltaodţių labai retas. Kpa
antigenas yra aptinkamas tik pas baltosios rasės ţmones, (72) Kpc – tik pas azijiečius. Abu šie antigenai paveldimi labai retai (17, 71).
Kell sistema gali turėti retą K0 fenotipą. Šiam fenotipui būdinga tai, kad ant eritrocitų nėra
Kell sistemos antigenų. Asmenys su šiuo fenotipu pradeda sintezuoja anti–K, kai yra susiduriama su bet kokiais Kell sistemos antigenais. Šie antikūnai gali sukelti sunkias potransfuzines reakcijas, todėl pacientams turintiems K0 fenotipą yra rekomenduojama perpilti tik K0 fenotipo kraują. Kartais anti–K
antikūnai gali susiformuoti natūraliai, daţniausiai patekus mikobakterinei infekcijai. Antikūnai pranyksta pasišalinus infekcijai (17, 73–75).
Antikūnai prieš Kell sistemos antigenus yra IgG klasės, daţniausiai IgG1 izotipo. Jų sukeliamos hemolizės stiprumas daţnai nekoreliuoja su nustatytu antikūnų titru. Imunizacija vyksta jau po vienos antigeno dozės. Anti–K rečiau sukelia naujagimių hemolizinę ligą, negu anti–D. Anti–k pasireiškia labai retai (17, 20, 73).
1.2.4 Duffy sistema
1950 metais buvo aprašyta Duffy kraujo grupių sistema. Kutbush su kolegomis atlikę daugybines transfuzijas, hemofilija sergančiam pacientui, aptiko antikūnus prieš Fya antigenus. Duffy buvo paciento pavardė, todėl visa kraujo grupių sistema pavadinta jo pavarde (76). 1951 metais, nustatytas Fyb antigenas (77). 1971 metais nėščios moters kraujyje, kuriai buvo atliktos transfuzijos, nustatytas Fy3 antigenas. 1973 metais nustatyti Fy4 ir Fy5 antigenai (78), o 1987 metais Fy6 antigenas. Kliniškai reikšmingi yra tik Fya, Fyb ir Fy3 antigenai (17).
Duffy antigeno trūkumas eritrocituose formuoja atsparumą maliarijos pernešėjui Plassmodium vivax. Taigi Fy(a-b-) alelis yra naudingas ţmonėms tuose kraštuose, kur maliarija yra stipriai paplitusi. Šis fenotipas labai daţnas tarp juodosios rasės ţmonių. Jį turi apie du trečdaliai populiacijos. Priešingai, tarp Azijos gyventojų šis fenotipas nustatomas labai retai (79, 80).
Fy3 ir Fy4 antigenai yra labai daţni bendroje ţmonių populiacijoje. Fy3 antigeno neturi ţmonės, kurių fenotipas yra Fy(a-b-). Juodosios rasės ţmonės, kurie turi Fy(a-b-) fenotipą, turi ir Fy4 antigeną, o baltosios rasės ţmonės atvirkščiai turintys šį retą fenotipą Fy(a-b-) Fy4 antigeno neturi (17).
Tarp skirtingos rasės ţmonių skiriasi Duffy sistemos eritrocitų antigenų ir fenotipų daţniai. Fya antigeno daţnis tarp baltaodţių yra 61–68 proc., tarp juodaodţių – 6–23 proc., o tarp azijiečių 94– 98 proc. Fyb antigenas būdingas 79–93 proc. baltaodţių, 11–33 proc. juodaodţių ir tik 6–4 proc. azijiečių. Kinijos gyventojai turi maţiausią Fyb
25 beveik 100 proc. Vakarų Afrikos gyventojų neturi nei Fya, nei Fyb antigeno, nes dėl Fy*B geno mutacijos ant eritrocitų nėra Duffy glikoproteino (14, 84).
Antikūnai prieš Fya
antigeną (anti–Fya) yra labiau paplitę negu anti–Fyb. Šie antikūnai yra IgG tipo, galintys sukelti silpną naujagimių hemolizinę ligą. Baltosios rasės ţmonių organizmuose anti–Fy3 sukelia stiprias imuninias reakcijas, o juodaodţių organizmuose pasireiškia silpnai arba visai nepasireiškia. Anti–Fy3 sukelia vidutinio stiprumo naujagimių hemolizinę ligą (17, 85, 86).
1.2.5 Kidd sistema
Kidd kraujo grupių sistema, susideda tik iš dviejų antigenų. 1951 metais pirmasis aprašytas antigenas buvo Jka. Šiam antigenui specifiniai antikūnai rasti moters, vardu Kidd, serume, kurios kūdikis sirgo naujagimių hemolizine liga. 1953 metais aprašytas Jkb
antigenas. Fenotipas Jk(a-b-) aprašytas tik 1959 metais. Jis nustatytas pasireiškus potransfuzinėms reakcijoms po kraujo perpylimo (17, 87).
Kidd kraujo grupės antigenai dalyvauja šlapalo pernešime. Todėl ţmonių, turinčių Jk(a-b-) fenotipą, šlapalo transportas yra nepakankamas, šlapalo koncentracija nėra visiškai kontroliuojama. Šis fenotipas yra labai retas, daţniausiai pasireiškia suomiams, Polinezijos gyventojams (17, 88, 89).
Kidd antigenų sistemą sudaro Jka ir Jkb antigenai. Antigenų deriniai sudaro būdingus fenotipus: Jk(a+b+), Jk(a-b-), Jk(a-b+), Jk(a+b-) (90). Jka ir Jkb antigenams būdingas panašus paplitimas tarp baltosios rasės ţmonių. Juodosios rasės ţmonėms yra daţnesnis Jka
negu Jkb (17). Antikūnai prieš Jka
ir Jkb daţniausiai sukelia uţdelsto tipo hemolizines potransfuzines reakcijos, retai sukelia naujagimių hemolizinę ligą. Kidd sistemos antikūnai priklauso IgG klasei. Anti–Jka daţnai nustatomas vienas, o anti–Jkb įprastai su kitų eritrocitų antigenų sistemų antikūnais. Šių antikūnų titras per trumpą laiką maţėja, todėl prieš transfuziją gali būti nebenustatomi. Tačiau perpylus eritrocitus su tam tikru antigenu pakartotinai, sukeliamas anamnestinis atsakas ir didėjant antikūnų titrui, įvyksta hemolizė (14, 91, 92).
1.2.6 Lewis sistema
Lewis kraujo grupių sistema nustatyta 1946 metais, po to, kai dviejų donorų kraujyje nustatyti antikūnai prieš Lea
antigeną (anti–Lea). Leb aprašytas po dvejų metų – 1948. Lewis kraujo grupių sistemą iš viso sudaro šeši antigenai. Pagrindiniai antigenai yra Lea
ir Leb, kurie lemia būdingus fenotipus: Le(a+b-), Le(a-b+), Le(a-b-) ir Le(a+b+) (93, 94).
Antikūnai prieš Lea
antigeną (anti–Lea) yra daţni, natūraliai atsirandantis dėl imuninės stimuliacijos. Daţnai anti–Lea yra randamas kartu su anti–Leb. Antikūnai prieš Lea antigeną priklauso
26 IgM klasei, bet gali būti ir IgG klasės. Anti–Lea nesukelia naujagimių hemolizinės ligos jei yra IgM tipo ir nepraeina placentos (17, 95).
Antikūnai prieš Leb
antigeną (anti–Leb) yra taip pat paplitę ir nustatomas serume pacientų, kurių fenotipas yra Le(a+b-). Anti–Leb
yra IgM klasės, reaguoja kambario temperatūroje ir aktyvuoja komplementą. Visi Lewis kraujo grupių sistemos antikūnai retai sukelia naujagimių hemolizinę ligą (17, 94).
1.2.7 MNS sistema
MNS yra antroji pagal atradimo laiką kraujo grupių sistema. Iš viso ši kraujo grupių sistema apima 46 antigenus, bet svarbiausi yra penki antigenai: M, N, S, s, U (10 lentelė). 1927 metais Landsteiner ir Levine pranešė nustatę M ir N antigenus. Valsh ir Montgomer 1947 metais aprašė S antigeną. Vėliau, 1951 metais Levine nustatė s antigeną, o Veinver 1953 atrado U antigeną (101).
10 lentelė. Svarbiausių MNS sistemos antigenų paplitimas (101)
MNS sistemos antigenai Baltoji rasė, proc. Juodoji rasė, proc.
M 72 75
N 78 74
S 88 93
s 57 30
U 99,9 99
Antikūnai prieš M antigeną (anti–M) linkę reaguoti šaltoje aplinkoje. Šie antikūnai gali būti randami serume ir tiems ţmonėms, kuriems niekada neatliktos transfuzijos ar moterims neturėjusioms nėštumų. Anti–M yra daţnas antikūnas, todėl manoma, kad jis susiformuoja natūraliai, nes yra nustatomas vaikams, kurie niekada neturėjo transfuzijų. Anti–M antikūnai gali būti IgG ir IgM klasės. Įprastai anti–M ir anti–N nesukelia potransfuzinių komplikacijų. Anti–N priklauso imunoglobulinų IgM klasei. Šie antikūnai neaktyvuoja komplemento. Daţniausiai anti–N susiformuoja asmenims, kurių eritrocitų fenotipas yra M+N-. Anti–M ir anti–N nėra kliniškai reikšmingi (12, 102).
Antikūnai prieš S antigeną (anti–S) ir antikūnai prieš s antigeną (anti–s), susiformuoja tik po transfuzijų ar nėštumų. Jie priklauso IgG klasei, geriausiai reaguoja 37°C temperatūroje. Labai retai anti–S gali priklausyti IgM klasei. Šie abu antikūnai yra kliniškai reikšmingi, nes gali sukelti potrasfuzines komplikacijas. Anti–U yra labai reti antikūnai. Jie būdingi asmenims, kurie turi S-s-U fenotipą. Toks fenotipas būdingas Afrikos amerikiečiams. Anti–U yra kliniškai reikšmingi, nes gali sukelti potransfuzines komplikacijas ir naujagimių hemolizinę ligą (12, 17, 102, 103).
27
1.2.8 Lutheran sistema
Lutheran kraujo grupių sistema buvo aprašyta, nustačius antikūnus, vilklige sergančiam pacientui, kuriam buvo atliekamos nuolatinės transfuzijos. Ši kraujo grupių sistema pavadinta kraujo donoro vardu, dėl antigenų, kurie skatino susidaryti antikūnus. 1956 metais aprašytas Lub
antigenas. Lu(a-b-) buvo pirmasis fenotipas, nustatytas ţmogui ir aprašytas 1961 metais. Šį fenotipą nustatė Kravford tyręs savo paties kraują. 1971 metais buvo nustatytas Lu4 antigenas. Autoriai, randantys naujus antigenus nusprendė juos ţymėti skaičiais (104). Po metų, 1972 nustatyti dar keturi antigenai: Lu5, Lu6, Lu7 ir Lu8 (105). Dabar Lutheran kraujo grupių sistemą sudaro 21 antigenas, kurie ţymimi nuo Lu1 iki Lu21. Paskutinis, Lu21 antigenas aprašytas 2004 metais (17, 106–108).
Nepaisant to, kad Lutheran kraujo grupių sistemą sudaro 21 antigenas, svarbiausi iš jų yra Lua
ir Lub, dar kitaip vadinami Lu1 ir Lu2 (109). Antikūnai prieš Lua antigeną (anti–Lua) yra daţniausiai aptinkami kaip šalčio agliutininai. Daţniausiai jie priklauso IgM klasei, bet retais atvejais gali priklausyti IgG klasei. Anti–Lub yra taip pat stebimi, kaip šalčio agliutininai. Jie daţniau sukelia potransfuzines komplikacijas negu Lua. Naujagimių hemolizinės ligos Lutheran kraujo grupės sistemos antikūnai nesukelia (17).
1.2.9 Xg sistema
Xg kraujo grupių sistema susideda iš dviejų antigenų: Xga
ir CD99. Xg yra vienintelė kraujo grupių sistema, kurios genetiniai lokusai išsidėstę X chromosomoje. 1961 metais nustatytas Xga
antigenas, kuris pirmiausiai priskirtas Xg sistemai. Jis nustatytas pas asmenį, kuriam ilgą laiką atliekamos transfuzijos. Xga antigeno galimi fenotipai yra ţymimi Xg(a+) ir Xg(a-) (110, 111).
Xga antigeno daţnesnis paplitimas stebimas moterims. Xga antigenas būdingas 66 proc. vyrų ir net 89 proc. moterų. Anti–Xga yra priskiriamas IgG klasei. Kartais šie antikūnai stebimi kaip natūraliai atsirandantis. Anti–Xga
nesukelia naujagimių hemolizinės ligos ar sunkių potransfuzinių komplikacijų (17, 112–114).
1.2.10 P sistema
1927 metais eksperimentuodami su gyvūnais Lansteiner ir Levine nustatė antigeną ir jį pavadino P antigenu. Vėliau rastas P1 antigenas. Antigenas P2, atrastas 1951 metais (96). 1959 metais
nustatytas naujas antigenas, kuris pavadintas P1k (97). 1972 metais nustatyti anti–P2k (98).
Yra penki P kraujo grupės sistemos antigenai: P, P1, P2, P1k ir P2k. P1 yra labiausiai paplitęs.
28 ţmonių. P1 antigeno nebuvimas lemia Pk antigenų atsiradimą. Jei asmenys neturi P, P1 ir Pk antigenų,
tada anti–P, anti–P1 ir anti–Pk atsiranda, kaip natūraliai susidarantys antikūnai (99, 100).
Antikūnai prieš P1 antigeną (anti–P1) yra labiausiai paplitęs iš visų P sistemos antikūnų. Anti–
P1 priklauso IgM klasei, įprastai reaguoja šaltyje. Šie antikūnai nesukelia naujagimių hemolizinės
ligos, retai gali sukelti potransfuzines komplikacijas. Autoantikūnai prieš P yra susijęs su autoimunine hemolizine anemija vadinama, paroksizmine šalčio hemoglobinurija. Anti–P dviejų fazių antikūnai, kurie prisijungia prie eritrocitų, aktyvuoja komplementą ir vystosi sunki intravaskulinė hemolizė. Autoantikūnai prieš P antigenus įprastais testais nėra nustatomi, tam yra naudojamas Landsteiner testas (17).
29
2. Tyrimo apimtis ir metodai
2.1 Tyrimo apimtis
Tyrime retrogradiškai analizuoti 2641 paciento gydyto eritrocitų transfuzijomis nuo 2010 iki 2014 metų, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Kauno klinikų ligoninėje, tyrimų duomenys. Iš viso aprašyti 1432 vyrai ir 1209 moterys.
Tyrimui atlikti išduotas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Bioetikos centro leidimas. Leidimo Nr. BEC–LMB(M)-219 (1 priedas).
2.1.1 Pacientų charakteristika
Tyrime dalyvavo nuo 0 iki 100 metų (vidurkis 56,68±23,8 metai) amţiaus pacientai. Moterų amţiaus vidurkis buvo 59,07±24,20, vyrų 54,67±23,39 metai, p<0,001. Pacientai suskirstyti į dvi amţiaus grupes: vaikus ir suaugusius. Vaikų grupei priklausė pacientai iki 18 metų amţiaus, o suaugusiems priskirti pacientai nuo 18 iki 100 metų amţiaus. Vaikų grupei priskirti 276 (10,5 proc.) pacientai, o suaugusiųjų grupei – 2365 (89,5 proc.) pacientai. Suaugę pacientai buvo suskirstyti dar į 3 amţiaus grupes: 18–45 metų amţiaus pacientai, 46–59 metų amţiaus pacientai ir 60–100 metų amţiaus pacientai. Tiriamųjų pacientų (vyrų ir moterų) amţiaus ir lyties skirstinys pavaizduotas 11 lentelėje.
11 lentelė. Tiriamųjų pacientų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes
Amţiaus grupės, metai Pacientai, n (proc.) Vyrai, n (proc.) Moterys, n (proc.) χ 2 p 0–17 (vaikai) 276 (10,5) 154 (10,5) 122 (10,1) 0,66 0,42 18–100 (suaugę) 2365 (89,5) 1278 (89,9) 1087 (89,2) 0,31 0,57 18–45 357 (13,5) 213 (14,9) 144 (11,9) 4,92 0,02 46–59 510 (19,3) 308 (21,5) 202 (16,7) 9,69 0,002 60–100 1498 (56,7) 755 (52,7) 745 (61,6) 21,2 0,001
30
2.2 Tyrimų metodika
Tyrimai buvo atlikti LSMU ligoninės Kauno klinikų, Laboratorinės medicinos klinikos, Hematologijos ir bendrosios citologijos laboratorijoje, pagal standartines tyrimų metodikas, naudojamas laboratorijoje.
Visiems pacientams stulpeliniu metodu buvo nustatyta: ABO sistemos kraujo grupės, RhD faktorius, atrankinis antikūnų nustatymas netiesiogine Kumbso reakcija. Pacientams, kuriems buvo nustatyti Ak atrankiniu tyrimu, buvo atliktas antikūnų identifikavimas.
2.2.1 Tyrimų atlikimo metodika
2.2.1.1 Kraujo paėmimas ir pristatymas į laboratoriją
Imunohematologiniams tyrimams veninis kraujas buvo paimtas į vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantu EDTA. Mėgintuvėliai su pacientų krauju buvo pristatyti į laboratoriją per 1,5 val. nuo paėmimo. Tyrimai buvo atliekami iš karto.
2.2.1.2 Mėginių paruošimas
Kraujo ėminiai buvo centrifuguoti 10 minučių (1000×g greičiu), naudojama centrifuga „Labofuge 400e“ (Vokietija). Hemolizuoti, drumsti (lipemija, mikrobinis uţterštumas) ar su fibrino krešuliais mėginiai, tyrimui nebuvo naudojami. Po centrifugavimo, plazma Pastero pipete buvo atskirta į vienkartinį plastikinį mėgintuvėlį. Ant eritrocitų susidariusi leukocitų plėvelė buvo nusiurbta Pastero pipete ir išmesta į indą, skirtą infekuotoms atliekoms. Eritrocitų masė uţpilta 2–3 ml 0,9 proc. natrio chlorido tirpalu ir centrifuguojama 1 min. (1000×g). Po centrifugavimo susidariusi skystoji dalis nusiurbta Pastero pipete į indą, skirtą infekuotoms atliekoms. Eritrocitų plovimas atliekamas tris kartus. Mėginiai, reagentai ir laboratorinės priemonės laikomos kambario temperatūroje. Iš nuplautų eritrocitų buvo ruošiama 5 proc. eritrocitų suspensija. 5 proc. eritrocitų suspensija gauta 25 µl nuplautų eritrocitų praskiedus 500 µl maţos joninės jėgos buferiniu tirpalu ID – Diluent 2.
2.2.1.3 ABO kraujo grupės ir RhD nustatymas stulpeliniu metodu
Metodo esmė yra hemagliutinacijos reakcija gelio stulpelyje. Naudojama DiaClon ABO/D+ Reverse Grouping (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija) kortelė. Kortelės mėgintuvėliai uţpildyti buferio terpėje polimerizuotu dekstranu ir reagentais. A mikromėgintuvėlis uţpildytas monokloniniais anti–A. B mikromėgintuvėlis – anti–B, D(VI-) – anti–D. Kontrolės (Ctl.)
31 mikromėgintuvėlyje yra tik buferinis tirpalas. Į kortelės mikromėgintuvėlius (A, B, D(VI-), Ctl) buvo lašinta po 10 µl paciento 5 proc. eritrocitų suspensijos. Į A1 mikromėgintuvėlį buvo lašinta 50 µl A1 standartinių eritrocitų ID–DiaCell ABO – A1 (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija). Į B mikromėgintuvėlį buvo lašinta 50 µl B standartinių eritrocitų ID–DiaCell ABO – B (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija). Į mikromėgintuvėlius A1 ir B buvo įlašinta po 50 µl paciento plazmos. Kortelė buvo 10 minučių centrifuguojama, centrifugoje „Dianafuge“ (Ispanija). Tuoj pat po centrifugavimo vertinamos hemagliutinacijos reakcijos intensyvumas pliusais (12 lentelė ir 2 pav.), ir interpretuojami rezultatai. Nustatoma ABO kraujo grupė (13 lentelė) ir RhD antigenas (14 lentelė).
12 lentelė. Hemagliutinacijos reakcijos vertinimas
Neigiamas - Eritrocitų sluoksnis kolonėlės dugne, likusioje mikromėgintuvėlio dalyje agliutinacijos nėra.
Teigiamas +/- Agliutinacija reta, smulkiagranulinė, apatinėje mikromėgintuvėlio dalyje. 1+ Silpna, smulkiagranulinė agliutinacija mikromėgintuvėlyje.
2+ Smulkiagranulinė agliutinacija arba vidutinio dydţio granulės visame mėgintuvėlyje.
3+ Vidutinio dydţio granulės viršutinėje mikromėgintuvėlio dalyje.
4+ Agliutinavusių eritrocitų sluoksnis viršutinėje mikromėgintuvėlio dalyje.
Dviguba
populiacija (DP)
Dviguba populiacija (eritrocitų sluoksnis mikromėgintuvėlio viršuje ir apačioje.
32 13 lentelė. ABO kraujo grupių nustatymas
Tiesioginis ABO nustatymas Atvirkštinis ABO nustatymas
ABO grupė Mikromėgintuvėliai A B Ctl. A1 B – – – + + O + – – – + A – + – + – B + + – – – AB 14 lentelė. Rh D nustatymas Mikromėgintuvėliai D (VI-) Ctl. RhD faktorius 3+, 4+ – RhD+ +/–, 1+, 2+ – RhD+ silpnas – – RhD-
+/–, 1+, 2+ rezultato išraišką (silpną agliutinacijos reakciją) gali lemti silpni antigenai, todėl nustačius silpną agliutinacijos reakciją buvo atliktos silpno antigeno patvirtinimo tyrimas.
2.2.1.4 RhD ir silpno D nustatymas
Silpno D nustatymui buvo naudojama ID kortelė Anti–D (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija). Ši kortelė uţpildyta polikloniniais anti–D antikūnais suspenduotais gelyje. Į švarų plastikinį mėgintuvėlį buvo sulašinta 0,5 ml maţos joninės jėgos ID – Diluent buferio ir 50 µl 5 proc. eritrocitų suspensija. Inkubuota kambario (18–25°C) temperatūroje 10 minučių. Nuo naudojamų mikromėgintuvėlių buvo nuimama aliuminė folija ir pridėta 10 µl eritrocitų suspensijos. ID – kortelė dedama į ID – centrifugą “Dianafuge” (Ispanija) ir centrifuguojama 10 min.
Reakcijos intensyvumas vertintas (2 pav.) pliusais ir interpretuojami rezultatai (15 lentelė).
15 lentelė. Rh D reakcijų vertinimas
Reakcijos vertinimas
++++ ± iki +++ –
33
2.2.1.5 Autokontrolės atlikimas
Metodas pagrįstas hemagliutinacijos reakcija gelio stulpelyje. Agliutinacijos reakcija vyksta tarp paciento eritrocitų antigenų ir jo serume esančių antikūnų.
Į LISS/Coombs (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija) plokštelės mikromėgintuvėlį buvo lašinta 50 µl švelniai homogenizuotos paciento 5 proc. eritrocitų suspensijos ir 25 µl paciento plazmos. Kortelė su mikromėgintuvėliais uţpildytais buferinio tirpalo terpėje polimerizuotu dekstranu, kuris sumaišytas su ţmogaus antiglobulinu. Kortelė buvo inkubuota 37°C temperatūroje „DG THERM“ (Ispanija) inkubatoriuje 15 min. Po to kortelė buvo centrifuguojama 10 min. „DG Gel Dianafuge“ (Ispanija) centrifugoje ir vertinti rezultatai.
Įvykusių hemagliutanacijos reakcijų intensyvumas buvo vertinamas pliusais (12 lentelė). Jei agliutinacija LISS/Combs kortelės mikromėgintuvėlyje neįvyko, autokontrolė neigiama, reiškia, kad paciento plazmoje nėra antikūnų prieš jo paties eritrocitus. Autokontrolė buvo laikoma teigiama, jei agliutinacija LISS/Combs kortelės mikromėgintuvėlyje įvyko, reiškia, kad paciento plazmoje yra antikūnų prieš jo paties eritrocitus.
2.2.1.6 Atrankinis antikūnų nustatymas (netiesiogine Kumbso reakcija) stulpeliniu metodu
Vienam paciento mėginio tyrimui buvo naudojami penki LISS/Coombs (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija) kortelės mikromėgintuvėliai: pirmasis – autokontrolei, kiti keturi antikūnams nustatyti. LISS/Coombs kortelė sudaryta iš šešių mikromėgintuvėlių uţpildytų buferinio tirpalo terpėje polimerizuotu dekstranu, kuris sumaišytas su ţmogaus antiglobulinu. Tyrimui naudojami ID–DiaCell (I, II, III buteliukai) su standartiniais eritrocitais, kiekviename buteliuke po 10 ml O kraujo grupės 0,8 proc. eritrocitų suspensijos (trijų kraujo donorų) (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija). Į atitinkamai paţymėtus (I, II, III) mikromėgintuvėlius buvo sulašinta 50 µl D– DiaCell (I, II, III) standartinių eritrocitų suspensijos ir po 25 µl paciento plazmos. Kortelė inkubuota 37°C temperatūroje, „DG THERM“ inkubatoriuje (Šveicarija), 15 minučių. Po to kortelė buvo centrifuguota 10 minučių ir vertinti rezultatai.
Hemagliutinacijos reakcijos intensyvumas vertintas pliusais (12 lentelė). Netiesioginės Kumbso reakcijos rezultatai interpretuojami kartu su autokontrole. Jie pateikti 16 lentelėje.
34 16 lentelė. Hemagliutinacijos reakcijos vertinimas su autokontrole
Netiesioginė Kumbso reakcija Autokontrolė Interpretacija
– – Antikūnai nenustatyti
+ – Aloantikūnai nustatyti
– + Autoantikūnai nustatyti
+ + Autoantikūnai ir aloantikūnai nustatyti
2.2.1.7 Antikūnų identifikavimas stulpeliniu metodu
Jei atrankiniu tyrimu buvo nustatyti antikūnai, jie buvo identifikuojami. Antikūnų identifikavimas buvo grįstas jų sąveika su ţinomos antigeninės sudėties eritrocitais. Tyrimui naudoti ID–Panel (I–XI) reagentai, O kraujo grupės 0,8 proc. standartinių eritrocitų suspensijos buferiniame tirpale su konservantais (BioRad Madical Diagnostics GmbH, Šveicarija). Į vienuolika LISS/Combs kortelės mikromėgintuvėlių buvo sulašinta po 50 µl švelniai homogenizuotos standartinių eritrocitų suspensijos. LISS/Coombs kortelė sudaryta iš šešių mikromėgintuvėlių uţpildytų buferinio tirpalo terpėje polimerizuotu dekstranu, kuris sumaišytas su ţmogaus antiglobulinu. Į visus vienuolika mikromėgintuvėlių buvo sulašinta 25 µl paciento plazmos. Inkubuota 37 °C temperatūroje „DG THERM“ inkubatoriuje (Šveicarija), 15 min. Po to LISS/Coombs kortelės buvo centrifuguotos 10 min „DG Gel Dianafuge“ (Ispanija) centrifugoje ir vertinti rezultatai.
Hetagliutinacijos reakcijų intensyvumas vertintas pagal 12 lentelę. Agliutinacijos reakcijų rezultatai buvo suţymėti „ID – Dia Panel“ (BioRad Medical Diagnostics GmbH, Šveicarija) darbo protokole (2 priedas). Pagal instrukciją uţpildţius protokolą nustatomi antikūnai prieš daţniausius eritrocitų sistemų antigenus.
2.3 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojantis „SPSS Windows 21.0“ ir „Microsoft Office Excel 2010“ statistinėmis programomis.
Kolmogorov–Smirnov testu nustatyta ar kiekybinių dydţių skirstinys normalusis. Kiekybiniai kintamieji nebuvo pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį (Gauso dėsnį), todėl jų palyginimui naudotas neparametrinis kriterijus. Kokybinių poţymių skirstinių nepriklausomumui patikrinti naudotas χ² kriterijus, tikimybių palyginimui – z kriterijus. Dviejų nepriklausomų imčių kiekybinių kintamųjų palyginimui naudotas neparametrinis Mann – Whitney kriterijus. Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp grupių apibrėţtas, jei reikšmingumo lygmuo p<0,05.
35
3. Tyrimų rezultatai
3.1 ABO kraujo grupių ir RhD faktoriaus pasiskirstymas
Visiems tiriamiesiems (N=2641) pacientams buvo nustatyta ABO kraujo grupė ir RhD. Kraujo grupių daţnis tarp lyčių nesiskyrė, p>0,05. Kraujo grupių daţnis pateiktas 17 lentelėje.
17 lentelė. Kraujo grupių pasiskirstymas tarp lyčių
Kraujo grupė Lytis Iš viso, N=2641 n (proc.) Vyrai, N=1432 n (proc.) Moterys, N=1209 n (proc.) O 554 (38,7) 436 (36,1) 990 (37,5) A 520 (36,3) 463 (38,3) 983 (37,2) B 257 (17,9) 226 (18,7) 483 (18,3) AB 101 (7,1) 84 (6,9) 185 (7,0)
RhD+ nustatytas 81,3 proc. (n=2147) tiriamųjų pacientų. RhD– nustatytas 18,7 proc. (n=494) pacientų, p=0,02. RhD+ daţnis tarp vyrų ir moterų nesiskyrė, p>0,05, atitinkamai 82,9 ir 79,4 proc.
3.2 Antikūnų prieš eritrocitų antigenų daţnis tarp lyčių
Iš visų tirtų pacientų, antikūnai prieš eritrocitų antigenų sistemas, nustatyti 11,5 proc. (304/2641) tiriamųjų. Antikūnai daţniau buvo nustatyti moterims nei vyrams, atitinkamai 17,1 proc. (207/1209) moterų ir 6,8 proc. (97/1432) vyrų, p<0,001. Vienam pacientui galėjo būti nustatyti antikūnai prieš kelių eritrocitų sistemų antigenus.
Visiems tiriamiesiems pacientams (N=2641) buvo nustatyti antikūnai prieš devynių eritrocitų antigenų sistemų antigenus. Tirtiems pacientams daţniausiai nustatyti antikūnai prieš: Rh sistemos antigenus – 8,9 proc. (234/2641), Kell sistemos antigenus – 4,2 proc. (111/2641) ir Lutheran sistemos antigenus – 3,5 proc. (93/2641), p=0,001 (18 lentelė). Iš antikūnų prieš Rh sistemos antigenus, daţniausiai nustatytas anti–Cw
, anti–D ir anti–E, atitinkamai 6,1 proc. (162/2641), 4,2 proc. (112/2641) ir 3,0 proc. (78/2641), p=0,001. Antikūnus prieš Cw, D ir E antigenus daţniau turėjo moterys nei vyrai, atitinkamai 4,3 proc. (114/1209), 3,1 proc. (83/1209) ir 1,9 proc. (50/1209), p=0,001. Vyrai antikūnus prieš Cw
antigeną turėjo 1,8 proc. (48/1432), antikūnus prieš D antigeną 1,1 proc. (29/1432) ir antikūnus prieš E antigeną – 1,1 proc. (28/1432), p=0,001
Iš antikūnų prieš Kell sistemos antigenus, daţniau buvo nustatyti anti–K ir anti–Kpa
, atitinkamai 2,1 proc. (56/2641), 2,3 proc. (60/2641), p=0,001. Šie antikūnai daţniau nustatyti moterims
36 nei vyrams. Anti–K nustatyti 1,6 proc. (42/1209) moterų ir 0,5 proc. (14/1432) vyrų, p=0,001. Anti– Kpa nustatyti 1,4 proc. (37/1209) moterų ir 0,9 proc. (23/1432) vyrų, p=0,002.
Iš antikūnų prieš Lutheran sistemos antigenus daţniausiai nustatyti antikūnai prieš Lua
antigeną (anti–Lua
) – 3,4 proc. (90/2641). Moterims jis nustatytas daţniau nei vyrams, atitinkamai 2,1 proc. (56/1209) ir 1,3 proc. (34/1432), p=0,001.
18 lentelė. Antikūnų prieš eritrocitų antigenų sistemų antigenus dažnis
Kraujo grupių sistema
Antikūnai N=2641 Iš viso, n (proc.) Vyrai, N=1432 n (proc.) Moterys, N=1209 n (proc.) χ2 p Rh Anti–Rh 234 (8,9) 74 (2,8) 160 (6,1) 52,82 0,001 Anti-D 112 (4,2) 29 (1,1) 83 (3,1) 37,81 0,001 Anti-CW 162 (6,1) 48 (1,8) 114 (4,3) 42,05 0,001 Anti-C 31 (1,2) 11 (0,4) 20 (0,8) 4,44 0,35 Anti-E 78 (3,0) 28 (1,1) 50 (1,9) 10,87 0,001 Anti-c 4 (0,2) 2 (0,1) 2 (0,1) 0,03 0,86 Anti-e 5 (0,2) 3 (0,1) 2 (0,1) 0,07 0,79 Kell Anti–Kell 111 (4,2) 31 (1,2) 80 (3,0) 32,27 0,001 Anti-K 56 (2,1) 14 (0,5) 42 (1,6) 19,68 0,001 Anti-Kpa 60 (2,3) 23 (0,9) 37 (1,4) 6,24 0,012 Anti-k 2 (0,1) 1 (0,05) 1 (0,05) 0,14 0,91 Anti-Kpb 1 (0,05) 1 (0,05) 0 (0,0) 0,85 0,36 Anti-Jsa 10 (0,4) 4 (0,2) 6 (0,2) 0,82 0,37 Anti-Jsb 3 (0,1) 2 (0,05) 1 (0,05) 0,19 0,67 Duffy Anti–Duffy 13 (0,5) 8 (0,3) 5 (0,2) 0,28 0,59 Anti-Fya 6 (0,2) 3 (0,1) 3 (0,1) 0,04 0,84 Anti-Fyb 8 (0,3) 6 (0,2) 2 (0,1) 1,39 0,24 Kidd Anti–Kidd 8 (0,3) 7 (0,25) 1 (0,05) 3,58 0,58 Anti-Jka 6 (0,2) 5 (0,15) 1 (0,05) 2,05 0,15 Anti-Jkb 3 (0,1) 3 (0,1) 0 (0,0) 2,54 0,11 Lewis Anti–Lewis 36 (1,4) 20 (0,8) 16 (0,6) 0,02 0,87 Anti-Lea 36 (1,4) 20 (0,8) 16 (0,6) 0,03 0,87 Anti-Leb 3 (0,15) 1 (0,05) 2 (0,1) 0,53 0,47 MNS Anti–MNS 17 (0,6) 7 (0,3) 10 (0,4) 1,17 0,28 Anti-M 13 (0,5) 7 (0,3) 6 (0,2) 0,001 0,98 Anti-N 2 (0,1) 1 (0,05) 1 (0,05) 0,14 0,91 Anti-S 9 (0,3) 5 (0,2) 4 (0,1) 0,01 0,94 Anti-s 1 (0,05) 1 (0,05) 0 (0,0) 0,85 0,36 Lutheran Anti–Lutheran 93 (3,5) 36 (1,4) 57 (2,2) 9,35 0,002 Anti-Lua 90 (3,4) 34 (1,3) 56 (2,1) 10,15 0,001 Anti-Lub 3 (0,15) 2 (0,1) 1 (0,05) 0,19 0,67 Xg Anti-Xga 4 (0,2) 2 (0,1) 2 (0,1) 0,03 0,87 P Anti-P1 2 (0,1) 1 (0,05) 1 (0,05) 0,01 0,91
