ELEKTRONINIŲ CIGAREČIŲ SKYSČIŲ CHEMINIS TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KAROLINA STALELIŪNAITĖ

ELEKTRONINIŲ CIGAREČIŲ SKYSČIŲ CHEMINIS TYRIMAS

DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof., dr. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanė Prof., dr. Ramunė Morkūnienė

2018 m. birželio mėn. _ d.

ELEKTRONINIŲ CIGAREČIŲ SKYSČIŲ CHEMINIS TYRIMAS

DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Liudas Ivanauskas 2018 m. birželio mėn. _d. Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Karolina Staleliūnaitė 2018 m. birželio mėn. _d. 2018m. birželio mėn. _d. Kaunas, 2018

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1 Elektroninės ir tradicinės cigaretės palyginimas ... 10

1.2 Elektroninių cigarečių skysčių cheminė sudėtis ... 10

1.3 Elektroninių cigarečių skysčių bei garų cheminis tyrimas ... 13

1.4 Elektroninių cigarečių rūkymo įtaka plaučių funkcijai ... 15

1.5 Elektroninės cigaretės ir priklausomybė rūkymui ... 16

1.6 Dujų chromatografijos metodo pritaikymas elektroninių cigarečių skysčių cheminiam tyrimui 18 2. TYRIMO METODAI IR METODIKA ... 19

2.1 Tyrimo organizavimas ... 19

2.2 Tyrimo objektas ... 19

2.3 Tyrimo medžiagos ir reagentai ... 20

2.4 Naudota aparatūra ... 21

2.5 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 21

2.6 Elektroninių cigarečių skysčių kokybinis tyrimas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu ... 21

2.7 Nikotino kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos metodu su liepsnos jonizacijos detektoriumi ... 22

2.8 Mėginių garinimas (kaitinimas)... 23

2.9 Statistinės analizės metodai ... 23

3. TYRIMO REZULTATAI BEI JŲ APTARIMAS ... 24

3.1 Elektroninių cigarečių skysčių kokybinio tyrimo dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu rezultatai ... 24

3.2 Gamintojo pateiktos elektroninių cigarečių skysčių sudėties palyginimas su identifikuotais junginiais tyrimo metu. ... 31

3.3 Dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi metodikos validacija ... 33

3.3.1 Specifiškumas ... 33

3.3.2 Rezultatų glaudumas ... 34

3.3.3 Tiesiškumas ... 35

3.3.4 Aptikimo ir nustatymo ribos ... 36

3.4 EC skysčių kiekybinio tyrimo dujų chromatografijos su liepsnos jonizacijos detektoriumi metodu rezultatai ... 37

3.5. EC skysčių po garinimo (kaitinimo) kokybinio tyrimo dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu rezultatai ... 39

4. IŠVADOS ... 42

SANTRAUKA

K. Staleliūnaitės magistro baigiamasis darbas, vadovas Prof., dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologijos chemijos katedra. – Kaunas, 2018.

Darbo tikslas: atlikti kokybinę organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose ir kiekybiškai įvertinti nikotiną dujų chromatografijos metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Apžvelgti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie elektroninių cigarečių skysčius. 2. Atlikti kokybinę organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose dujų

chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

3. Įvertinti elektroninių cigarečių skysčių sudėtį (organinių junginių įvairovę) ir palyginti su gamintojo pateikta sudėtimi.

4. Atlikti kiekybinę nikotino analizę elektroninių cigarečių skysčiuose dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi metodu.

5. Įvertinti ar nustatytos nikotino koncentracijos, reikšmingai skiriasi nuo gamintojo pateiktų koncentracijų.

6. Atlikti organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose po kaitinimo elektroninėje cigaretėje ir įvertinti junginių įvairumo skirtumus skysčiuose prieš ir po garinimo (kaitinimo).

Tyrimo objektas: elektroninėms cigaretėms pildyti naudojami skysčiai.

Metodai: dujų chromatografija su liepsnos jonizaciniu detektoriumi bei dujų chromatografija – masių spektrometrija.

Rezultatai ir išvados: Atlikus elektroninių cigarečių skysčių kokybinę analizę dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu buvo identifikuoti 55 skirtingi organiniai junginiai. 32 iš jų yra skonio ir kvapo stiprikliai. Kokybinės organinių junginių analizės metu buvo identifikuoti ne tik maisto priedai, bet ir 23 kiti junginiai. Elektroninių cigarečių skysčių kokybinės analizės po garinimo rezultatai - identifikuota 11 junginių, kurių nebuvo aptikta analizės metu prieš garinimą. Atlikus nikotino kiekybinio nustatymo dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi validaciją, 8 mėginiuose iš 16 buvo identifikuotas nikotinas ir nustatyta jo koncentracija. Vidutinė visų mėginių koncentracija - 139,77 ± 0,103 µg/ml. Nustatyta, kad nikotino koncentracija mėginiuose reikšmingai skiriasi nuo nikotino koncentracijos, kurią pateikia gamintojas (p<0,05). 9 elektroninių cigarečių skysčiai buvo gamintojo pateikti, kaip sudėtyje neturintys nikotino (angl. nicotine free). Viename mėginyje buvo identifikuotas nikotinas ir kiekybiškai įvertinta jo koncentracija - 26,26 ± 0.353 µg/ml.

SUMMARY

Staleliūnaite K. master’s thesis/ supervisor L. Ivanauskas Ph.D., Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas, 2018.

Aim: assess the quality of organic compounds and quantity of nicotine in electronic cigarette liquids using gas chromatography method.

Objectives:

1. Review and systematize scientific literature about electronic cigarette liquids. 2. Assess the quality of organic compounds in electronic cigarette liquids using gas

chromatography – mass spectrometry method.

3. Value the difference between detected composition of electronic cigarette liquids and manufacturer’s provided composition.

4. Assess the quantity of nicotine in electronic cigarette liquids using gas chromatography – flame ionization detection.

5. Determine if the deviation between detected nicotine concentration and manufacturer’s provided concentration is significant.

6. Determine the difference of organic compounds variety in electronic cigarette liquids detected before and after vaping (heating) it in electronic cigarette.

Object: Electronic cigarette liquids used to refill it.

Methods: Gas chromatography – flame ionization detection, gas chromatography – mass spectrometry.

Results and conclusions: During the electronic cigarette liquid quality analysis by gas chromatography – mass spectrometry method were identified 55 various organic compounds. 32 of these compounds are flavouring substances used in food industry. However, during analysis were identified not only food flavouring substances, but also 23 different compounds that don’t have these characteristics. During electronic cigarette liquids quality analysis after vaping it in electronic cigarette, were identified new 11 compounds that weren’t identified before vaping. After the validation of nicotine quantity determination method (gas chromatography with flame ionisation detection) from 16 samples in 8 were identified nicotine and calculated the average concentration of -139,77 ± 0,103 µg/ml. It was found that the difference between manufacturer’s provided nicotine concentration and detected nicotine concentration was significant (p<0,05). 9 electronic cigarette liquids were provided by manufacturer as nicotine free, however in 1 of them nicotine was detected with a concentration of - 26,26 ± 0.353 µg/ml.

SANTRUMPOS

DC – MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija

DC – FID – dujų chromatografija su liepsnos jonizaciniu detektoriumi EC – elektroninė cigaretė

PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija

m/z – molekulinių jonų masių ir jų krūvių santykis FDA – JAV maisto ir vaistų agentūra

KMR – kancerogeninis, mutageninis ir reprotoksinis PG – propilenglikolis

FEV1 – forsuotas iškvėpimo tūris per sekundę

FVC – forsuota gyvybinė plaučių talpa

ICH – Tarptautinė konferencija dėl žmonėms skirtų vaistinių preparatų registracijai taikomų techninių reikalavimų suderinimo

SSN – santykinis standartinis nuokrypis SN – standartinis nuokrypis

ĮVADAS

Tabako cigarečių rūkymas kenkia sveikatai, tačiau rūkančiųjų skaičius, kai kuriose šalyse, pavyzdžiui, Lietuvoje sparčiai auga [63]. Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, 38 proc. vyrų ir 19 proc. moterų Europoje nuolat rūko tabako cigaretes. Apie 16 proc. 30 metų amžiaus ir vyresnių europiečių miršta dėl tabako vartojimo [63]. Tabako gaminiuose esantis alkaloidas nikotinas sukelia priklausomybę, todėl tabako gaminiai yra vartojami nuolat, o tabako gaminiuose esantys kancerogenai bei kitos bioaktyvios medžiagos yra ankstyvų mirčių išsivysčiusiose šalyse priežastis [33].

Šiuo metu labai populiarėja elektroninių cigarečių rūkymas [7, 26]. Daugiausiai elektronines cigaretes (EC) rūkančios žmonių grupės: moterys ir paaugliai [26]. Visuomenėje yra plačiai paplitusi nuomonė, kad elektroninių cigarečių naudojimas nekenkia sveikatai. JAV plaučių asociacija (angl. American lung association) internetinėje svetainėje pateikė informaciją, kad 2009 m. JAV maisto ir vaistų agentūra (FDA) atliko cheminį EC skysčių ir garų tyrimą. Gauti rezultatai - EC garuose yra nedideli kiekiai kancerogeninių ir kitų nuodingų medžiagų, keliančių pavojų inkstų veiklai, nervų ir kvėpavimo sistemoms [65]. Vėliau (2013 m.) EC aerozolio sudėtį išsamiai tyrė JAV Kalifornijos universiteto mokslininkai. Buvo aptiktos neorganinės medžiagos (sidabras, aliuminis, alavas, chromas bei nikelis), kurių koncentracija buvo tokia pati arba didesnė nei tabako cigarečių dūmuose [66].

Rūkant elektronines cigaretes jose nevyksta tabako deginimas, todėl lyginant su tradicinėmis tabako cigaretėmis, jose susidaro mažiau toksinių medžiagų, tačiau įrodymų, kad EC daroma žala sveikatai yra mažesnė negu tabako cigarečių, nepakanka. Aerozolio pavidalu nikotinas ir kitos produkto medžiagos patenka į rūkančiųjų ir šalia esančių žmonių organizmus su oru [7, 66]. Šiuo metu atliekami klinikiniai tyrimai, kurių tikslas įvertinti elektroninių cigarečių poveikį žmonių sveikatai. Deja, tiriamųjų populiacijos santykinai mažos (apie 30 tiriamųjų), todėl rezultatai yra neišsamūs, sunku interpretuoti gautus duomenis. [7, 64].

EC sukurtos 2003 m. Kinijoje, o 2006 m. pasiekė Jungtinių Amerikos Valstijų bei Europos rinkas [3, 25]. Daugumoje Europos šalių EC į prekybą pateko kaip plataus vartojimo prekės be valdžios institucijų reglamentavimo [25].

EC rūkymo žala žmogaus sveikatai yra vertinama atlikus klinikinius tyrimus, tačiau tyrimų rezultatai turėtų praktinės reikšmės tik tuo atveju, jeigu gamintojai užtikrintų EC skysčių kokybę. Kitu atveju, EC skystyje esant įvairioms priemaišoms, rūkymo žala sveikatai priklausytų nuo konkrečios EC skysčio cheminės sudėties. Taigi, mano nuomone, EC skysčių cheminės sudėties kokybinė kontrolė yra svarbus veiksnys, norint nustatyti EC rūkymo žalą sveikatai.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: atlikti kokybinę organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose ir kiekybiškai įvertinti nikotiną dujų chromatografijos metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Apžvelgti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie elektroninių cigarečių skysčius. 2. Atlikti kokybinę organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose dujų

chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

3. Įvertinti elektroninių cigarečių skysčių sudėtį (organinių junginių įvairovę) ir palyginti su gamintojo pateikta sudėtimi.

4. Atlikti kiekybinę nikotino analizę elektroninių cigarečių skysčiuose dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi metodu.

5. Įvertinti ar nustatytos nikotino koncentracijos, reikšmingai skiriasi nuo gamintojo pateiktų nikotino koncentracijų.

6. Atlikti organinių junginių analizę elektroninių cigarečių skysčiuose po kaitinimo elektroninėje cigaretėje ir įvertinti junginių įvairumo skirtumus skysčiuose prieš ir po garinimo (kaitinimo).

Raktiniai žodžiai: elektroninė cigaretė, elektroninių cigarečių skysčiai, nikotinas, dujų chromatografija.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Elektroninės ir tradicinės cigaretės palyginimas

Nobelio premijos laureatas, Vilijamas Ruselis (angl. Bertrand Arthur William Russell) 1991 metais atkreipė dėmesį į ilgalaikę tabako vartojimo žalą ir teigė, kad turi būti sukurtos nikotino įvedimo į organizmą sistemos, kurių vartojimo metu nebūtų deginamas tabakas [18].

2003 metais EC buvo sukurtos, vėliau tobulinamos, kuriamos efektyvesnės, veiksmingesnės bei saugesnės. EC yra sudarytos iš 3 pagrindinių dalių: elemento, talpyklės, į kurią pilamas EC skystis ir kaitinimo elemento, kuris gali būti toje pačioje talpoje kaip ir EC skystis arba atskirtas, priklausomai nuo EC modelio. Skysčio talpyklėje yra įtvirtintas vamzdelis, į kurį patenka susidarę garai. Šiame vamzdelyje esantys garai įtraukiami į plaučius [19,7]. Šiuo metu, EC yra skirstomos į tris kartas, pagal būdingus bruožus. 1 kartos prietaisai išvaizda labiausiai panašūs į tradicines cigaretes, skystis jose negali būti pildomas, todėl cigaretė naudojama tol, kol baigiasi skystis. 2 kartos cigaretės turi didesnį ir galingesnį elementą bei atsiranda galimybė EC skysčius papildyti pačiam vartotojui. 3 kartos prietaisai yra galingiausi, pasiekiama aukščiausia temperatūra (> 300°C), vartotojas gali pasirinkti EC galingumą, keisti temperatūrą [19].

Dažniausiai elektroninės cigaretės yra gaminamos taip, kad imituotų tradicines cigaretes, atitinka jų dydį ir išvaizdą. Pagrindinis skirtumas tarp elektroninės ir tradicinės cigaretės yra tai, kad elektroninių cigarečių rūkymo metu nėra deginamas tabakas [7]. Rūkymo metu skystis esantis cigaretėje kaitinamas >200°C temperatūroje (temperatūra priklauso nuo cigaretės modelio), susidaro aerozolis, kurį vartotojas įkvepia. Tokiu būdu į organizmą garų pavidalu patenka EC skystyje esančios medžiagos [67].

Mokslinėse studijose, kai kurie tyrėjai daro prielaidą , kad EC rūkymas yra mažiau kenksmingas sveikatai negu tradicinių cigarečių rūkymas, tačiau atliktų tyrimų rezultatai yra labai skirtingi ir prieštaringi.

1.2 Elektroninių cigarečių skysčių cheminė sudėtis

EC skysčių sudėtis: propilenglikolis (PG), glicerinas, nikotinas bei skonio ir kvapo stiprikliai [8]. Tokią sudėtį EC skysčių pakuotėje pateikia gamintojai. Norint sužinoti tikslią skysčių sudėtį reikia atlikti cheminį tyrimą. Garinimo metu, skystis yra veikiamas aukšta temperatūra (>200°C), molekulės tampa reaktyvios, todėl neabejotinai EC skysčio sudėtis kinta. Skysčių bei susidariusių garų sudėtis

priklauso nuo EC modelio, nes jie skiriasi kaitinimo elementais (išgaunama temperatūra) bei naudojimo galimybėmis (yra galimybė pasibaigus skysčiui jį papildyti) [7,8,30].

PG ir glicerolis yra dvi pagrindinės sudedamosios medžiagos[8, 30]. Naudojantis IUPAC nomenklatūra, PG yra vadinamas propan-1,2-dioliu. Jo struktūrinė formulė patikta 1 pav.

1 pav. Propilenglikolio struktūrinė formulė [49]

PG yra FDA patvirtintas maisto priedas naudojamas kosmetikos bei vaistų gamyboje kaip tirpiklis ir drėkinamoji medžiaga [8]. Tyrimų metu su gyvūnais buvo nustatyta, kad PG yra sveikatai nekenksmingas junginys ir padaryta prielaida, kad įkvėpti PG garus žmonėms ir net vaikams turėtų būti saugu [30, 45]. Tačiau kitų tyrimų metu buvo įrodyta, kad lėtinis, ilgalaikis PG garų poveikis uždarose patalpose gali pasunkinti ar sukelti rinitą, astmą, egzemą ir kitus alerginius simptomus [30, 10]. Literatūroje yra pateiktos informacijos, kad teatro, kuriame buvo naudojamas garų efektas, žiūrovams atsirado ūmių arba lėtinių plaučių ligų ar pablogėjo plaučių funkcija. Teatre kaip efektas buvo naudojami garai, kurių sudėtyje aptikta PG [30, 58]. Pasak vartotojų, EC rūkymas džiovina gerklę ir burną [30]. Nepaisant to, kad kosmetikoje PG yra naudojamas kaip drėkinamoji medžiaga [8], tyrėjai linkę manyti, kad PG yra medžiaga sukelianti burnos džiūvimą [30, 15, 16, 44].

EC skysčių gamintojai pateikia informaciją, kad skysčių gamybai yra naudojamas iš augalinės žaliavos išgrynintas glicerinas. Junginys yra netoksiškas, tačiau kaitinant aukštoje temperatūroje (260°C - 380°C) sudaro toksinį junginį – akroleiną [68]. Šis junginys buvo aptiktas, kai kurių EC aerozoliuose, tačiau jo kiekis buvo žymiai mažesnis nei tradicinės cigaretės dūmuose [30, 45]. Glicerolio dehidratacija gali vykti 2 skirtingais keliais. 1 kelias: atskyla viena vandens molekulė ir susidaro tarpinis produktas 3-hidroksipropiono aldehidas, vėliau atskyla dar viena vandens molekulė ir gaunamas akroleinas (reakcija pvaizduota 2 pav.) Akroleinas gali prisijungti deguonies arba vandenilio molekulę ir atitinkamai virsti akrilo rūgštimi arba alilo alkoholiu [68].

2 glicerolio dehidratacijos kelias dar vadinamas acetolio keliu, nes šis junginys yra tarpinis reakcijos produktas, kuris susidaro nuo glicerolio atskilus pirmai vadnens molekulei. Vėliau nuo acetolio atskilus anglies monoksidui susidaro acetaldehidas, kuris gali prisijungti deguonies molekulę ir virsti acto rūgštimi (reakcija pavaizduota 3 pav.) [68].

3 pav. Glicerolio dehidratacija 2 (acetolio) keliu [68]

Nikotinas – tabako (lot. Nicotiana tabacum) alkaloidas, priklausomybę sukelianti medžiaga. Junginio struktūroje yra du žiedai: 1-metilpirolidino ir piridino (4 pav. pateikta junginio struktūrinė formulė). Kenksmingų sveikatai medžiagų, kurios į organizmą patenka rūkymo metu, sąraše nikotino nėra. Laikoma, kad junginys dėl stimuliuojamo poveikio nervų sistemai yra rūkymo priežastis [7, 8, 30, 18].

4 pav. Nikotino struktūrinė formulė [49]

Nikotinas nėra stabilus junginys, gali skilti ore (deguonies aplinkoje), šviesos ar didesnės nei 25°C temperatūros poveikyje [69]. Nikotino oksidacijos reakcijos produktas yra nikotino-N-oksidas. Taip pat šis junginys natūraliai kaupiamas tabako lapuose, todėl į tabako produktus gali patekti kaip nikotino priemaiša [70]. Struktūrinė nikotino-N-oksido formulė pateikta 5 pav.

Nikotinas yra nikotininių – cholinerginių receptorių agonistas, kuris sukelia periferinę vazokonstrikciją. Esant didesnei nikotino koncentracijai kraujyje gali būti jaučiama tachikardija, padidėti kraujo spaudimas [18]. Mažos nikotino dozės turi teigiamą stimuliuojamąjį poveikį nervų sistemai, o didelės slopinamąjį [51]. Rūkymo metu didžiausia žala ir rizika sveikatai dėl nikotino kyla nėščių moterų vaisiams ir žindančių moterų vaikams, nes yra slopinamas jų vystymasis ir raida [18]. Pasiekus letalią nikotino koncentraciją kraujo plazmoje, pasireiškia kvėpavimo takų periferinis, Kurarė tipo paralyžius [51].

Nikotino absorbcija ir perėjimas per biologines membranas priklauso nuo aplinkos pH. Nikotinas yra silpna bazė, kurio pKa yra 8.0, tai reiškia, kad esant aplinkos pH 8.0, 50 proc. nikotino yra jonizuotos formos ir 50 proc. nejonizuotos [2]. Per biologines membranas paprastos difuzijos būdu pereina tik nejonizuotos molekulės, todėl mažėjant ar didėjant pH nikotino absorbcija mažės [47]. Nikotino absorbcija burnoje (bukalinė) priklauso nuo susidariusių dūmų pH. Tabako cigarečių dūmų pH būna apie 5.5 - 6.0, o tokiame pH nikotinas yra daugiau jonizuotos formos ir bukalinė absorbcija beveik nevyksta. Rūkant cigarus ir pypkes susidaro didesnį pH turintys dūmai ir nikotinas absorbuojamas iš burnos tiesiai į kraujotaką. Kvėpavimo takais nikotinas patenka į alveoles, iš kurių yra gretai ir gerai absorbuojamas į sisteminę kraujotaką. Taip yra dėl fiziologinio, alveolėse esančio pH (apie 7.4) bei didelio alveolių paviršiaus ploto [2]. Atliktas tyrimas, kurio metu buvo vertinama nikotino absorbcija iš EC garų į sisteminę kraujotaką. Rezultatai buvo lyginami su nikotino absorbcija panaudojus inhaliatorių ir surūkius tradicinę tabako cigaretę. Buvo pastebėta, kad nikotino koncentracijos maksimumas veniniame kraujyje parūkius EC pasiektas po 19,6 min. (greičiau negu po nikotino inhaliacijos, bet lėčiau negu surūkius tradicinę cigaretę). Šie tyrimo rezultatai leidžia manyti, kad iš EC garų nikotinas yra absorbuojamas bukaliniu keliu ( kaip ir naudojant inhaliatorių) bei per plaučių alveoles ( kaip ir rūkant tradicines cigaretes) [50].

Remiantis epidemiologiniais tyrimais, yra nustatyta, kad rūkantieji asmenys rečiau serga Parkinsono liga. Rūkant tabako cigaretes, dūmuose susidaro daugybė medžiagų, tačiau tyrėjai svarsto, kad išvengti judėjimo sutrikimų gali padėti nikotinas. Medžiaga smegenyse stimuliuoja dopaminerginę sistemą, kaip ir vaistas (dopaminas), kuriuo gydoma Parkinsono liga [60].

1.3 Elektroninių cigarečių skysčių bei garų cheminis tyrimas

Šiuo metu Lietuvoje gaminti bei prekiauti elektroninių cigarečių skysčiais bei cigaretėmis galima tik narkotikų, tabako ir alkoholio kontrolės departamento nustatyta tvarka. Įstatyme yra nurodyta, kad gaminant nikotino turintį skystį turi būti naudojamos tik tokios sudedamosios dalys, kurios jas

kaitinant arba jų nekaitinant nėra pavojingos žmogaus sveikatai, išskyrus nikotiną. Skysčių sudėtyje negali būti šių medžiagų: vitaminų arba kitų priedų, kurie sudaro įspūdį, kad elektroninių cigarečių rūkymas yra naudingas ar mažiau kenksmingas sveikatai. Taip pat negali būti kofeino, taurino ir kitų priedų, kurie siejami su energija ir gyvybingumu. Be to, į EC skysčius draudžiama dėti medžiagas, kurios nesudeginto pavidalo turi kancerogeninių, mutageninių ir reprotoksinių (KMR) savybių. 2011 ir 2012 metais Lietuvoje atliktos elektroninių cigarečių skysčių sudėties patikros metu, 91,7 proc. jų neatitiko reikalavimų ir buvo atšaukti iš rinkos [39].

EC skysčių cheminiai tyrimai daugiausiai atliekami dujų chromatografijos metodu, nes nikotinas yra laki medžiaga, o šiuo metodu galima greitai ir tiksliai nustatyti jo bei įvairių priemaišų kiekį [31]. Cheminiai tyrimai gana paprastai ir pigiai atliekami bei gaunami greiti ir tikslūs rezultatai [19]. EC skysčiuose aptinkama daugybė junginių, iš kurių tik apie pusę pavyksta identifikuoti [31, 19, 55]. Mokslininkai atkreipia dėmesį, jog jų studijose neidentifikuotos medžiagos, ateityje turi būti identifikuojamos kitų mokslininkų [31].

Tyrimų metu nustatomos į nikotiną struktūriškai panašios medžiagos: kotininas (nikotino metabolito), miosminas, anatabinas, anabasinas (kiti tabako alkaloidai), kurie galimai pateko į EC skystį kaip nikotino priemaišos [31, 55]. Problemų atsiranda dėl kvapo ir skonio stipriklių, kurie yra patvirtinti, kaip saugūs ir gali būti naudojami maisto pramonėje, tačiau poveikis žmogaus sveikatai, juos paveikus karščiu ir įkvėpus į plaučius, nėra žinomas [19, 23]. Identifikuojama daugybė terpeninių junginių, kitų sintetinių bei natūraliai išgaunamų maisto priedų [31]. 2009 metais JAV maisto ir vaistų agentūra (FDA) atliko 18 skirtingų prekinių ženklų EC skysčių cheminį tyrimą, kurio metu buvo identifikuoti sepcifiniai tabako nitrozaminai. Kito tyrimo metu buvo nustatyta, kad nitrozaminų kiekis EC skysčiuose yra toks pat mažas kaip ir farmaciniuose nikotino produktuose („Nicorette“ inhaliatorius) [19, 27].

Pastebima, kad nikotino koncentracija EC skystyje dažnai neatitinka tos, kuri būna pateikta gamintojo. Skysčiuose be nikotino (angl. nicotine free) dažniausiai nustatomos labai mažos nikotino koncentracijos [55].

Garų tyrimui mokslininkai modeliuoja įvairias rūkymo mašinas, kurios kuo labiau atspindėtų realybę. Didelį dėmesį mokslininkai skiria formaldehido, acetaldehido, akroleino, ksilenų, bei kai kurių siloksanų paieškai. Šios medžiagos yra toksiškos: formaldehidas yra žinomas kancerogenas, acetaldehidas galimai taip pat [31,19]. Jos aptinkamos ne EC skysčiuose, o garuose, nes susidaro kaitinant skystį. Galimai glicerino pirolizės metu susidaro formaldehidas, acetaldehidas bei akroleinas [31]. Įdomu tai, kad didžiausi karbonilinių junginių kiekiai buvo aptikti, garuose iš tų EC skysčių, kuriuose buvo didžiausias kiekis propilenglikolio. Taip pat pastebėta, jog didinant įtampą nuo 3.2 iki 4.8 V (keliant temperatūrą) karbonilų (formaldehido, acetaldehido ir acetono) kiekis garuose didėjo nuo 4 iki 200 kartų. Formaldehido koncentracija aukštoje temperatūroje (>300°C) susidariusiuose EC garuose buvo panaši kaip ir tradicinių tabako cigarečių dūmuose [41]. Kita vertus, kito tyrimo metu padaryta

išvada, kad formaldehido kiekis tabako dūmuose yra apie 9 kartus didesnis, o acetaldehido apie 450 kartų didesnis nei EC garuose. Akroleino tabako dūmuose yra apie 15 kartų daugiau, o tolueno 120 kartų [27].

EC garuose aptinkamos ir šios medžiagos: anglies monoksidas, siloksanai, metalai (kadmis, nikelis, švinas, gyvsidarbis, geležis, aliuminis, sidabras, chromas), fenoliai (tolueno ir ksileno pėdsakai) [19, 27, 61]. EC skysčiai turi tiesioginį kontaktą su kai kuriomis metalo dalimis prietaise, todėl skysčių užterštumas metalais yra beveik neišvengiamas [19]. 9 iš 11 aptiktų metalų EC garuose koncentracija yra tokia pati ar net didesnė nei tradicinės tabako cigaretės dūmuose [61]. Polisiloksanai dažnai naudojami plastiko gamyboje, o EC yra gaminamos iš plastikinių korpusų. Tai paaiškintų siloksanų atsiradimą EC garuose [31]. Labai maži kiekiai acetaldehido, formaldehido, kadmio, nikelio ir švino taip pat buvo aptinkami „Nicorette“ inhaliatoriuose [19].

Tyrimų metu buvo nustatyta, kad ne visi EC skysčių gamintojai laikosi Europos komisijos pateiktų gamybos reikalavimų. 2008 metų tyrime buvo nustatyta 0,17 ng gyvsidabrio EC skysčio 10 ml talpos buteliuke [46]. Kita pavojinga sveikatai medžiaga, kuri buvo identifikuota – aminotadalafilis [6]. Šis junginys yra tadalafilio analogas, fosfodiesterazės-5 inhibitorius. Priešingai nei analogas tadalafilis, medžiaga sukelia arterinę plaučių hipertenziją ir apatinių šlapimo takų disfunkciją [6]. Taip pat EC skysčiuose buvo aptiktas rimonabantas – pirmasis 2006 metais Europoje patvirtintas vaistas viršsvoriui mažinti, kuris po 2 metų buvo atšauktas iš rinkos dėl rimtų psichinių padarinių sveikatai [6].

1.4 Elektroninių cigarečių rūkymo įtaka plaučių funkcijai

2012 metais buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo stebima trumpalaikė EC rūkymo įtaka plaučiams. Tyrime dalyvavo 40, apie 5 metus tradicines cigaretes rūkančių, asmenų. 10 asmenų buvo kontrolinė grupė, kurie nerūkė nieko, o likusieji 30 – eksperimentinė, kurie vietoj įprastų cigarečių rūkė EC (maždaug tais pačiais dažniais kaip tradicinę ir apie 5 min trukmės). Plaučių funkcijai įvertinti buvo matuojamas iškvepiamas azoto oksido kiekis, gyvybinė plaučių talpa, forsuoto iškvėpimo talpa bei kvėpavimo takų varža. Remiantis gautais rezultatais buvo padaryta išvada, kad rūkant EC didėja kvėpavimo takų pasipriešinimas oro tekėjimui. Taip gali nutikti dėl staigaus periferinių kvėpavimo takų diametro sumažėjimo (atsiradusi lokalizuota edema arba susitraukę lygieji raumenys - bronchospazmas). Taip pat stebimas staigus azoto oksidų frakcijos sumažėjas iškvepiant. Dideli azoto oksidų kiekiai tiesiogiai koreliuoja su tabako cigarečių rūkymu, įvairiomis plaučių ligomis, oksidaciniu stresu. Kai kurie tyrėjai mano, kad padidėjusiam kvėpavimo takų pasipriešinimui įkvepiant orą gali turėti įtakos PG, kuris yra pagrindinė EC skysčio sudedamoji dalis. Kai kurių tyrimų metu buvo įrodyta, kad PG gali dirginti kvėpavimo takus, sukelti astmą. EC skysčiuose junginių yra daug, o garinimo metu jų susidaro

dar daugiau, todėl turėtų būti atliekami tolimesni tyrimai, kurių metu būtų nustatyta, kokia EC skystyje ar garuose esanti medžiaga sukelia periferinių kvėpavimo takų diametro sumažėjimą [57].

Kito tyrimo metu buvo nustatyta, kad parūkius EC ir tabako cigaretę kotinino (nikotino metabolito) koncentracija kraujo serume yra labai panaši (60.6 ± 34.3 ir 61.3 ± 36.6 ng/ml atitinkamai). Rūkant pasyviai EC ir tabako cigaretes kotinino koncentracija kraujo serume taip pat yra labai panaši (2.4 ± 0.9 ir 2.6 ± 0.6 ng/ml atitinkamai). Tačiau tiek pasyvus tiek aktyvus EC rūkymas sukelia mažesnius pokyčius plaučiuose negu tabako cigaretės rūkymas. Pokyčių nustatymui buvo matuojamas FEV1/FVC (forsuotas iškvėpimo tūris per sekundę / forsuota gyvybinė plaučių talpa) santykis [34].

1.5 Elektroninės cigaretės ir priklausomybė rūkymui

Remiantis kai kurių atliktų tyrimų rezultatais, teigiama kad EC yra mažiau kenksminga rūkymo alternatyva. Jos dar vadinamos mažos rizikos nikotino produktais – rūkymo pakaitalais. EC rūkymo metu yra atliekami tokie patys rankos judesiai, kaip ir rūkant tradicines cigaretes. Taigi, tiek fiziniu tiek cheminiu aspektais rūkant EC vyksta panašus procesas kaip ir rūkant tradicines cigaretes. Dėl šios priežasties, yra mokslininkų kurie mano, kad EC yra veiksmingesnis būdas mesti rūkyti nei nikotino pleistrai ar guma [21, 17]. Svarbu žinoti kaip kinta nikotino koncentracija kraujyje po garinimo, nes nuo to priklauso nikotino toksinis poveikis ir priklausomybės gydymo galimybės. Nikotino koncentracija kraujyje priklauso ne tik nuo EC skysčio (kuriuose būna skirtingi nikotino kiekiai), bet ir nuo prietaiso naujumo ir efektyvumo [21]. Remiantis tyrimais, rūkant senesnės kartos EC nikotino absorbcija į kraują yra žymiai mažesnė, negu rūkant naujesnės kartos EC. Praėjus 20 minučių po naujos kartos EC garinimo nikotino koncentracija kraujo plazmoje buvo 71.6 proc. didesnė negu po senos kartos EC garinimo [21].

Remiantis kito palyginamojo tyrimo rezultatais, galime teigti, kad rūkant tradicinę tabako cigaretę nikotino koncentracija plazmoje būna žymiai didesnė ir pasiekiama greičiau. Pavyzdžiui, praėjus 5 minutėms po 1 cigaretės surūkymo nikotino koncentracija kraujo plazmoje yra tokia pati (18ng/ml), kaip praėjus 35 minutėms po EC garinimo (garinama 5 minutes) [21, 56].

Kita vertus, svarbi yra vartotojų nuomonė, suvokimas apie EC, bei jų patirtis. Dėl šios priežasties, 2013 metais buvo atliktas socialinis tyrimas. Tiriamiesiems buvo pateikta internetinė apklausa. Tyrime dalyvavo 1347, 18 metų ir vyresni respondentai iš 33 šalių (72 proc. Europiečiai). Apklausos rezultatai rodo, kad vidutinė EC rūkymo trukmė yra 10 mėnesių [12]. Dauguma vartotojų yra patenkinti rūkymo priemone, tik nedaugelis pažymėjo, kad patyrė šalutinių poveikių. Vartotojai, kurie prieš EC rūkydavo tradicines tabako cigaretes, teigė, kad jiems palengvėjo kosulys, kvėpavimas, sumažėjo noras rūkyti. Taigi, vartotojų nuomone, EC garinimas yra daug sveikesnė alternatyva nei tabako cigarečių rūkymas [12, 29, 15]. Respondentai renkasi EC, kaip priemonę mesti rūkyti, nes EC

panaši į cigaretę ir atliekamas tas pats rankos judesys kaip ir rūkant, todėl yra mažinamas potraukis tradicinėms cigaretėms. Vartotojai mano, kad EC garinimas nesukelia nutraukimo sindromo (pasirinkus EC skystį, kuriame yra nikotino). Kitas EC privalumas lyginant su tradicinėmis cigaretėmis yra tai, kad EC garinimas nėra ribojamas viešose vietose, uždarose patalpose. Be to, šis pasirinkimas yra pigesnis nei tabako cigaretės [29, 15]. Būtina atkreipti dėmesį, kad 79 proc. respondentų, kurie prieš pradedant garinti EC, rūkydavo tradicines cigaretes, baiminasi, kad nustojus garinti EC gali vėl atsirasti didelis potraukis rūkyti tradicines cigaretes [15].

2011-2013 metais Naujojoje Zelandijoje buvo atliktas tyrimas, kurio tikslas buvo nustatyti EC efektyvumą, naudojant ją kaip priemonę rūkymui mesti. Tyrimo dalyviai buvo suskirstyti į tris grupes santykiu 4:4:1. Pirmoji grupė rūkė EC, kurios skystyje buvo 16 mg nikotino, antra grupė naudojo 21 mg nikotino pleistrą parai ir trečioji grupė rūkė EC be nikotino (placebas). Pagalbinės priemonės buvo pradėtos vartoti likus 1 savaitei iki rūkymo metimo ir buvo vartojamos 12 savaičių po metimo. Įvertinus rezultatus, reikšmingo skirtumo, tarp priemonių rūkymui mesti, nepastebėta [5]. Iškart po šio tyrimo, tokiu pačiu tikslu buvo atliekamas ir kitas, tačiau rezultatai vėl gi nebuvo džiuginantys, nes reikšmingo skirtumo tarp priemonių rūkymui mesti nepastebėta [26].

2013 metais buvo atliktas dar vienas svarbus tyrimas, kurio metu nustatyta, kad asmuo, norintis visiškai atsisakyti tabako cigarečių ir pereiti prie EC garinimo, turėtų naudoti didelę nikotino koncentraciją (>15mg/ml) turinčius EC skysčius. Tyrime dalyvavę asmenys, kurie vartojo EC skysčius su dideliu nikotino kiekiu, patyrė nesunkius ir laikinus šalutinius poveikius. Nepaisant to, 42 proc. šių dalyvių teigė, kad visiškai atsisakė tabako cigarečių jau per pirmąjį mėnesį [20].

Kita vertus, įdomu ar nevyksta ir priešingas efektas. Galbūt asmenys, kurie pradeda garinti EC ir anksčiau nėra rūkę tabako cigarečių, vėliau yra linkę rūkyti ir tabako produktus: cigaretes, cigarus ar kaljaną. Šiam klausimui išsiaiškinti 2013 metais buvo pradėtas ir 2015 metais baigtas tyrimas, kuriame dalyvavo paaugliai iš Los Andželo ir Kalifornijos aukštųjų mokyklų. Šie paaugliai prisipažino, kad garina EC, bet niekada nėra bandę tabako produktų. Dviejų metų laikotarpyje buvo daromos apklausos ir stebima, kiek paauglių pradėjo rūkyti tabako produktus. Galiausiai buvo padaryta išvada, kad tie, kurie anksti pradėjo rūkyti EC, vėliau bandė rūkyti ar nuolatos rūkė ir tabako produktus. Šios eigos priežastis gali būti ne vien tik paauglystėje pradėta garinti EC, bet ir paauglio polinkis žalingiems įpročiams, socialinės aplinkos spaudimas, auklėjimas bei žinių trūkumas apie rūkymo žalą sveikatai [42].

1.6 Dujų chromatografijos metodo pritaikymas elektroninių cigarečių skysčių

cheminiam tyrimui

Tai yra viena iš chromatografijos rūšių, kur mobili fazė yra dujos. Reikia, kad tiriamoji medžiaga būtų stabili, laki ir sąveikautų su kolonėlėje esančia stacionaria faze bei mobilia faze. Šios sąveikos rezultatas yra skirtingi medžiagų pasiskirstymai tarp dviejų fazių. Tai lemia mėginyje esančių skirtingų junginių išskirstymą. Naudojant masių spektrometriją kaip detektorių atsiranda galimybė medžiagas ne tik išskirstyti, bet ir identifikuoti. Kolonėlės pabaigoje junginiai yra jonizuojami ir įgauna elektrinį krūvį. Dauguma junginių skyla į fragmentus, kurie išskirstomi pagal jų molekulinę masę.

Nikotinas yra lakus junginys, dėl šios fizikinės junginio savybės, kiekybiniam įvertinimui mokslininkai dažnai renkasi dujų chromatografijos metodą. EC skysčio ar garų cheminės sudėties kokybiniam tyrimui atlikti dažnai renkamasi DC – MS [18, 31, 21, 20]. Remiantis Van Demterio (angl. Van Deemter) lygtimi, dujų chromtografijos metodas yra efektyviausias naudojant vandenilio dujas, kaip mobilią fazę, tačiau dėl sprogimo rizikos jos naudojamos retai. Naudojant helio dujas, lyginant su azoto dujomis, greičiau vyksta difuzija, ne taip žymiai mažėja analizės efektyvumas didinant analizės greitį [71].

2. TYRIMO METODAI IR METODIKA

2.1 Tyrimo organizavimas

Pradedant tyrimo darbų organizavimą buvo sudarytas darbų planas. Laikantis numatyto plano, darbai buvo pradėti nuo literatūros apžvalgos. Sukaupus žinių apie tyrimo objektą, apžvelgus, kokie klausimai yra aktualiausi, nustatyta konkreti darbo problema, iškeltas tikslas, suformuoti uždaviniai.

Tyrimui įvykdyti buvo parinktas metodas, mokslinėje literatūroje ieškota ir rasta metodika, kuri buvo validuojama. Tiriamoji dalis buvo atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Farmacijos fakultete, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje 2016 - 2018 metais. Tyrimo metu gauti duomenys buvo apdorojami ir vertinami, vėliau pateikiamos išvados.

2.2 Tyrimo objektas

EC skysčiai: 5 pirkti Ispanijoje, 5 užsakyti internetu ir 6 pirkti Lietuvoje (6 skirtingi gamintojai). EC skysčiai buvo pirkti skirtingų skonių/kvapų, taip pat juose buvo skirtingas kiekis nikotino. Visa informacija apie mėginius pateikta 1 lentelėje.

1 lentelė. Elektroninių cigarečių skysčiai, jų kvapas, nikotino kiekis ir kilmės šalis

Mėginio nr. Nikotino kiekis Skonis/kvapas Kilmės šalis

1 0 mg/ml* Mentolio gaivus Čekija

2 0 mg/ml* Vaisių sulčių Prancūzija

3 3 mg/10ml Be skonio Ispanija

4 0 mg/ml * Kriaušių Prancūzija

5 0 mg/ml* Obuolių Prancūzija

6 12 mg/10ml Ananasų (isp. Pina colada) Vokietija

7 12 mg/10ml Mentolio Ispanija

8 12 mg/10ml „Rugpjūčio septintoji“ Ispanija

9 12 mg/10ml Miško uogų Ispanija

10 6 mg /10ml „Velnio ašaros“ JAV

11 16 mg/10ml Kokoso riešuto Prancūzija

12 0 mg/ml Tabako (angl. Virginia) Jungtinė karalystė 13 0 mg/ml Tabako (angl. silver pack) Jungtinė karalystė

Mėginio nr. Nikotino kiekis Skonis/kvapas Kilmės šalis

14 0 mg/ml Tabako Jungtinė karalystė

15 0 mg/ml Tabako (stipraus) Jungtinė karalystė

16 0 mg/ml Mentolio Jungtinė karalystė

Ispanijoje gamintų EC skysčių pakuotės yra paženklintos pavojingumo simboliu „Toksiška“. JAV gamintojai pažymi EC skystį simboliu „Dirginanti medžiaga“. Vokietijos ir Jungtinės karalystės gamintojai naudoja simbolius, kurie informuoja, kad produktas netinkamas vartoti jaunesniems nei 18 metų amžiaus žmonėms ir nėščioms moterims. Kiti gamintojai taip pat pateikia šią informaciją, bet ne simboliu, o žodžiais.

Jungtinės karalystės elektroninių cigarečių skysčių gamintojai pateikia šiuos įspėjimus ant produkto pakuotės: „Nenaudoti jeigu esate alergiškas propilenglikoliui, laikyti vaikams nepasiekiamoje, sausoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Vengti kontakto su akimis, nustoti naudoti, jeigu pasijutote blogai. Nenuryti, o patekus į burną skalauti vandeniu.“ JAV gamintojai ant EC skysčių pakuotės rašo: „PAVOJINGA! Kontakto metu su oda veikia toksiškai. Laikyti vaikams nepasiekiamoje vietoje. PATEKUS ANT ODOS: nuplauti dideliu kiekiu muilo ir vandens. Pasijutus blogai skambinti į apsinuodijimų kontrolės ir informacijos biurą arba kreiptis į gydytoją.“

Ispanų gamintojai jokių įspėjimų ant EC skysčio pakuotės nepateikia. Apie produkto pavojingumą sveikatai ar aplinkai jie informuoja naudodamiesi Pasauliniu mastu suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (GHS). Visi kodai, kurie atitinka EC skysčio savybes yra sužymėti ant pakuotės. Taigi, ispanų gamintojai pateikia informaciją apie žalą sveikatai profesionaliau ir tiksliau, tačiau vartotojui, neturinčiam žinių apie chemiją tokie įspėjimai yra visiškai neinformatyvūs. Skysčiai žymimi kodais: H301; H411; S1/2; S36/37; S45; S61. Kodų reikšmės: toksinis poveikis nurijus, ir pavojinga vandens gyvūnijai bei augalijai (ilgai trunkantis poveikis).

2.3 Tyrimo medžiagos ir reagentai

Naudotas tirpiklis ir standartas buvo analitinio švarumo. Tirpiklis - metanolis (> 99,9 proc.) gautas iš Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija). (S)-(-)-nikotino (99 proc.) standartas gautas iš Alfa Aesar (Karlsrūjė, Vokietija). EC cigarečių skysčiai: 5 pirkti Ispanijoje, 5 užsakyti internetu ir 6 pirkti Lietuvoje (6 skirtingi gamintojai).

2.4 Naudota aparatūra

Elektroninės svarstyklės ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija), automatinės pipetės „Eppendorf” (Hamburgas, Vokietija).

Visi mėginiai buvo tiriami dujų chromatografijos metodais, naudojant Shimadzu GCMS-QP2010nc Ultra system (Shimadzu, Duisburgas, Vokietija) dujų chromatografą su masių spektrometrijos detektoriumi ir dujų chromatografą su liepsnos jonizaciniu detektoriumi Shimadzu GC – 2010 PLUS, Shimadzu Corporation, Japonija. Prieš tiriant mėginius chromatografiniais metodais, jie buvo skiedžiami metanoliu ir minutei patalpinami į ultragarso vonelę Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Vertheimas, Vokietija).

2.5 Tiriamųjų mėginių paruošimas

Iš kiekvieno EC skysčio buteliuko buvo paimama po 10 µl mėginio ir buvo skiedžiama 1 ml metanoliu. Tada mėginiai buvo gerai supurtomi ir 3 minutes laikomi ultragarso vonelėje. Iš kiekvieno buteliuko buvo imami 3 mėginiai. Taip paruošti mėginiai buvo tiriami dvejais metodais: dujų chromatografijos su masių spektrometrija (kokybiniam EC skysčių nustatymui) bei dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi (kiekybiniam nikotino nustatymui). Kalibracinei kreivei sudaryti buvo naudojamas nikotino standartas, skiestas metanolyje. Buvo gaminami etaloniniai tirpalai, kurių koncentracijų intervalas 50-800 µl/ml. [28].

2.6 Elektroninių cigarečių skysčių kokybinis tyrimas dujų chromatografijos –

masių spektrometrijos (DC-MS) metodu

Kokybinis EC skysčių tyrimas atliktas naudojant DC-MS metodą, nes šiuo metodu galima identifikuoti junginius ir įvairias priemaišas, esančias EC skysčiuose. Naudota 0,25 mm išorinio diametro, 0.25 µm vidinio diametro ir 30 m ilgio kapiliarinė kolonėlė. Stacionari fazė sudaryta iš 5 proc. difenilo ir 95 proc. polisiloksano. Mobili fazė (dujos nešiklės) – helis. Į kolonėlę buvo injekuojama po 1µl mėginio. Injekavimo temperatūra – 280 ºC, pasirinktas visą dujų tūrį į kolonėlę įleidžiantis (angl. splitless) būdas. Analizė atlikta taikant gradientinį temperatūros kitimo metodą (2 lentelė).

2 lentelė. DC-MS metodo gradientinis temperatūros kitimas

Temperatūros kėlimo

greitis (ºC) Temperatūra (ºC) Užlaikymo laikas (min)

- 50,0 2,0

20,0 280,0 2,0

30,0 310,0 4,0

Buvo gautos mėginių DC-MS chromatogramos, kuriose esančios smailės atsipindi įvairių junginių sulaikymo laikus. Junginių fragmentai, susidarę po jonizacijos, buvo identifikuojami pagal molekulinių jonų masių ir jų krūvių santykius. Medžiaga laikoma identifikuota, jeigu masių spektro atitikimas yra 90 ir daugiau procentų.

2.7 Nikotino kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos metodu su liepsnos

jonizacijos detektoriumi

Nikotino kiekybiniam nustatymui buvo naudojamas dujų chromatografijos metodas su liepsnos jonizaciniu detektoriumi. Metodo sąlygos pateiktos 3 lentelėje.

3 lentelė. Analizės sąlygos

Parametras Sąlygos

Kolonėlė ilgis - 30,0 m., vidinis diametras - 0,25 µm.

Stacionari fazė Difenildimetilpolisiloksanas

Nešančios dujos Helis

Injekcijos tūris 1 µl

Injekcijos tipas (angl. Split) 1:5

Tėkmės greitis kolonėlėje 1,26 ml/min

Bendras tėkmės greitis 10,6 ml/min

Injekavimo temperatūra 290,0 °C

Slėgis 99,9 kPa

Analizės metu kolonėlės temperatūra kito, nes buvo naudotas gradientinis temperatūrinis rėžimas (4 lentelė).

4 lentelė. DC-FID metodo gradientinis temperatūros kitimas

Temperatūros kėlimo greitis (ºC/min)

Temperatūra (ºC) Užlaikymo laikas (min)

- 50,0 3,00

20,0 280,0 2,00

30,0 310,0 4,00

Nikotino koncentracija EC skysčiuose apskaičiuota, naudojant kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti buvo naudojami žinomos koncentracijos etaloniniai tirpalai.

2.8 Mėginių garinimas (kaitinimas)

EC skysčių cheminės sudėties pokyčiams, kurie vyksta garinimo metu, įvertinti buvo parenkama 10 (6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16) turimų EC skysčių ir garinama. Kiekvienas mėginys buvo garinamas 5 min, po to EC talpykla išplaunama, kruopščiai išvaloma ir pilamas kitas EC skystis. Garinimui buvo naudota „Joyetech ego aio eco mini“ elektroninė cigaretė, kilmės šalis Kinija. Kaitinimo galvutė – BFHN 0,5 Ω, baterijos talpa 640 mAh, veikimo rėžimu metu naudojama nuolatinė 1,85 V įtampa. Po garinimo visi EC skysčiai buvo tiriami DC – MS metodu. Mėginiai kokybinei analizei buvo ruošiami taip pat kaip ir prieš garinimą (metodas aprašytas 2.5 skyrelyje), o vėliau buvo atliekama kokybinė analizė DC-MS metodu (metodas aprašytas 2.6 skyrelyje).

2.9 Statistinės analizės metodai

Analizės buvo atliktos 2 metodais ir kartotos po 3 kartus. Duomenys buvo apdorojami naudojant Microsoft Office Excel 2013 (JAV). Apskaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai ir santykiniai standartiniai nuokrypiai.

Statistinis reikšmingumas įvertintas naudojant IBM SPSS Statistics for Microsoft Windows. Laikoma, kad p<0,05 yra neatsitiktinis reikšmingumas.

3. TYRIMO REZULTATAI BEI JŲ APTARIMAS

3.1 Elektroninių cigarečių skysčių kokybinio tyrimo dujų chromatografijos –

masių spektrometrijos (DC-MS) metodu rezultatai

Šiuo metodu buvo vertinama junginių įvairovė EC skysčiuose. Mėginiuose esantys junginiai buvo identifikuojami pagal fragmentus, gautus po jonizacijos naudojantis junginių biblioteka. Esant 90 proc. ir didesniam masių spektrų atitikimui laikoma, kad junginys yra atpažintas. Vėliau vertinama produktų kokybė palyginus identifikuotų junginių įvairovę su EC skysčių sudėtimi, kurią ant pakuotės yra pateikęs gamintojas.

6 pav. Nikotino masių spektras

Tiksliam nikotino identifikavimui mėginiuose, pirmiausia buvo atlikta nikotino standarto analizė ir įvertintas nikotino masių spektras (6 pav.). Buvo nustatytas nikotino fragmentų po jonizacijos molekulinių jonų masės ir krūvių santykis (m/z). Smailė ties m/z 133 galimai yra atsakas molekulės, kuri susidaro nuo nikotino atskilus N-CH3 fragmentui (nikotino m/z -162,23, o atskilusio fragmento m/z-

29). Smailė, kurios m/z yra 84 galimai yra 1-metilpiridino molekulės, kuri susidaro atskilus pirolidino žiedui, atsakas.

7 pav. 1 mėginio chromatograma

Pirmojo EC skysčio pakuotėje gamintojo pateikta sudėtis: propilenglikolis, natūralus augalinis glicerinas, sintetinis mentolis. Cheminės analizės metu identifikuoti 6 junginiai (5 lentelė).

5 lentelė. 1 mėginio chromatogramos junginių lentelė

Smailė Sulaikymo laikas (min) Plotas po kreive % Aukštis% Junginio pavadinimas

1 7,146 16,56 22,61 Mentolis 2 7,383 3,63 2,93 Etilmaltolis 3 8,501 74,40 68,18 Nikotinas 4 9,000 2,00 2,52 α -Kedrenas 5 9,067 1,41 1,19 β- Funebrenas 6 10,240 2,00 1,09 Kedrolis

Suintegravus visų smailių plotus, gautus po analizės, nustatyta, kad nikotinas sudaro 74,4 proc. visų junginių kiekio. 16,6 proc. sudaro augalinės kilmės lakus junginys - mentolis. Tai monoterpenas, farmacijoje naudojamas, kaip niežėjimą slopinanti, antiseptinė bei šalčio pojūtį teikianti medžiaga [22]. Literatūroje yra duomenų, kad mentolio inhaliavimas mažina ezofaginio refliukso sukeltą kosulį [46].

Aptiktas sąlyginai nedidelis kiekis seskviterpenų grupei priklausančių junginių – α-kedreno, kedrolio (seskviperpeninis alkoholis) ir β-funebreno. Kartu šie junginiai apima tik 5,41 proc.visų junginių kiekio. Šie junginiai taip pat yra lakūs, juos eteriniame aliejuje kaupia Kedras – pušinių (lot. Pinaceae) šeimos medžių gentis. Kedrenas ir Kedrolis pasižymi kvapą bei skonį stiprinančiomis savybėmis, naudojami maisto pramonėje [49].

Taip pat identifikuotas etilmaltolis. Junginio smailė chromatogramoje pažymėta 2 numeriu. Tai piranonų šeimai priklausantis junginys, turintis saldų skonį bei kvapą [49]. Remiantis GHS pateikta informacija, nurijus (lot. per os) tikėtina ūmi toksinė reakcija. Letali dozė žiurkėms – 0,78 g/kg [54, 24].

8 pav. mėginio nr. 4 chromatograma

EC skysčio nr. 4 chromatograma pateikta 8 pav. Šio skysčio pakuotėje gamintojo pateikta sudėtis yra: propilenglikolis, augalinis glicerinas, sintetinis vanilinas. Tyrimo metu šiame mėginyje buvo identifikuota 15 junginių (6 lentelė).

6 lentelė. 4 mėginio chromatogramos junginių lentelė

Smailė Sulaikymo laikas (min) Plotas po kreive % Aukštis% Junginio pavadinimas

1 4,724 1,06 1,12 1,3-fenilendiaminas 2 5.656 0.92 1,18 Acto rūgštis 3 5.912 10,87 4,53 Korilonas 4 6,122 6,19 6,70 Heksalaktonas 5 6,325 3,60 4,98 1,3-dioksolanas 6 6,688 8,25 7,86 Maltolis 7 8,012 2,94 1,67 Anyžių alkoholis 8 8,412 6,64 5,27 Piperonalis 9 8,552 10,67 12,40 2(3H)- furanonas 10 8,774 3,68 3,53 Kumarinas

Smailė Sulaikymo laikas (min) Plotas po kreive % Aukštis% Junginio pavadinimas 11 8,845 21,95 23,81 Vanilinas 12 9,197 3,20 4,18 1-(3,4-metilenedioksifenil)-1-butan-1-onas 13 9,324 6,89 7,32 Benzaldehidas 14 9,385 8,47 9,09 Fenilacetatas 15 11,085 4,65 5,56 Benzilbenzoatas

Apibendrinant lentelės duomenis, reikėtų atkreiptį dėmesį, kad 9 junginiai (korilonas, hekslaktonas, maltolis, anyžių alkoholis, piperonalis, kumarinas, vanilinas, benzaldehidas ir benzilbenzoatas) iš 15 identifikuotų yra įdėti dėl skonį bei kvapą gerinančių ir stiprinančių savybių. Šios medžiagos nauodojamos maisto pramonėje, kaip maisto priedai. 4 mėginyje šios medžiagos apima 72,06 proc. visų junginių kiekio. Nustatyta, kad didžiausią plotą po kreive užima vanilino smailė -21,95 proc. Pagal GHS pateiktą informaciją, dauguma identifikuotų medžiagų mažiau ar daugiau yra žalingos žmogaus organizmui, kitos – ir gamtai. Dauguma, medžiagų yra toksiškos nurijus (lot. per os), garų pavidalu dirgina kvėpavimo takus. Maždaug pusė šių medžiagų yra alergenai, todėl reikėtų vengti kontakto su oda [37, 52].

Ypač toksiniu poveikiu pasižymi 2 junginiai. Tai yra pirmoji smailė - 1,3-fenilendiaminas ir 5 smailė - 1,3-dioksolanas. Pirmasis junginys greitai ir gerai prasiskverbia pro odą ir patenka į sisteminę kraujotaką. Gresia ūmi intoksikacija nurijus (lot. per os) ar po kontakto su oda. Toksiškas įkvėpus, galimai sukelia lytinių ląstelių mutacijas [24, 38]. Kitas junginys - 1,3-dioksolanas susidaro reaguojant etilenglikoliui su karboniliniais junginiais, pavyzdžiui, formaldehidu. Galimai EC skystyje atsirado kaip tokios reakcijos produktas [40]. Remiantis GHS pateikta informacija, junginys yra degus (3 laipsnis), reaktyvus (antras laipsnis), pavojingas nurijus (lot. per os), sukelia odos dirginimą, rimtą akių dirginimą, galimai sukelia genetinius defektus, mažina vaisingumą bei gali labai pakenkti vaisiui. Degant junginiui susidaro toksiškos dujos, kvėpuojant garais gali pasireikšti svaigulys bei dusulys [24]. Abu šie pavojingi sveikatai junginiai yra naudojami dažų gamyboje [40, 24]. 1,3-fenilendiaminno smailė apima 1,06 proc. plotą, o 1,3-dioksolano smailė daugiau – 3,60 proc. plotą po kreive. Kituose mėginiuose šios medžiagos nebuvo aptiktos.

Iš viso mėginiuose identifikuoti 55 junginiai, kurie buvo klasifikuojami pagal kilmę bei cheminę struktūrą ir pateikti lentelėse (7-9 lentelės). Supratimui apie jų keliamą pavojų sveikatai buvo naudojamasi GHS pateikta informacija.

7 lentelė. Terpeninių junginių pasiskirstymas mėginiuose

Junginių grupė Junginio pavadinimas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1. Monocikliniai monoterpenai 1. Mentolis* + + + 2. Jazmonas* + 3. Izomentolis* + 4. Neomentolis* + 5. Izopulegolis* + 6. Limonenas* + 7. Terpineolis* + 8. P-cimenas* + 9. Eukaliptolis* + + 10. β- jononas + 11. Mentilacetatas* + 2. Bicikliniai seskviterpenoidai 12. α-pinenas + 13. Kamparas +

3. Hemiterpenai 14. Tiglo rūgštis* +

4. Seskviterpenai 15. α-Kedrenas* + 16. Kerdolis* + 17. β-Funebrenas + 5. Acikliniai terpenoidai 18. Izovalerijono rūgštis + + 6. Aromatiniai aldehidai 19.Benzaldehidas* + 20. Vanilinas* + + 21. Piperonalis* + 7. Aromatiniai alkoholiai 22. Anyžių alkoholis* +

7 lentelėje „+“ simboliu sužymėtos medžiagos, kurios tame mėginyje yra identifikuotos. Simbolis „*“ prie junginių pavadinimų reiškia, kad jie yra naudojami maisto pramonėje kaip maisto priedai (skonį bei kvapą gerinančios medžiagos). 7 lentelės duomenys atspindi terpeninių junginių pasiskirstymą tirtuose EC skysčiuose. Mėginiai analizei buvo perkami skirtingų skonių, tam kad būtų galima apžvelgti jų gamybai naudojamų junginių įvairovę, todėl dauguma terpenų buvo aptikti tik viename iš mėginių. Monociklinis monoterpenas mentolis buvo identifikuotas 3 mėginiuose. Aromatinis aldehidas vanilinas, aciklinis terpenoidas izovalerijono rūgštis ir monociklinis monoterpenas

eukaliptolis buvo identifikuoti 2 mėginiuose. Dauguma junginių (17) šioje lentelėje yra kvapo bei skonio stiprikliai. Literatūros duomenimis, vanilinas ir neomentolis yra kvėpavimo takus dirginančios medžiagos [4, 62], o kaitinant tiglinę rūgštį gaunami labai pavojingi korozinių savybių turintys dūmai [8]. Remiantis atliktų tyrimų duomenimis, p-cimenas pasižymi plaučių edemą mažinančiomis savybėmis, taip pat mažina neutrofilų skaičių uždegiminėje srityje [9].

Mėtinio skonio EC skysčiuose beveik visada aptinkamas monociklinis monoterpenas mentolis. Tai yra pagrindinis junginys suteikiantis produktui gaivų mėtų skonį ir kvapą [35].

8 lentelė. Kitų augalinės ir gyvūninės kilmės junginių pasiskirstymas mėginiuose

Junginių grupė Junginio

pavadinimas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1. Piranonai 1. Etilmaltolis* + 2. Maltolis* + + + + + + 2. Alkaloidai 3. Nikotinas + + + + + + + + 3. Kumarinai 4. Kumarinas* + + 4. Laktonai 5. Korilonas* + 5. Flavonoliai 6. Ligustrazinas* + + 6. Alkoholiai 7. Benzilo alkoholis* + + 7. Esteriai 8. Dietilmalonatas* +

8-oje lentelėje pavaizduotas kitų augalinės ar gyvūninės kilmės junginių pasiskirstymas mėginiuose. Augalinės kilmės junginiai mėginiuose pasiskirstę skirtingai. Tabako alkaloidas nikotinas aptiktas 8 mėginiuose. Ligustrazinas (tetrametilpirazinas), benzilo alkoholis ir kumarinas identifikuoti 2 mėginiuose. Piranonų grupės junginys maltolis aptiktas 6 mėginiuose, o etilmaltolis 1. Literatūroje yra duomenų, kad korilonas, benzilo alkoholis, etilmaltolis, maltolis yra medžiagos dirginančios kvėpavimo takus [24, 60, 43, 4, 8].

Remiantis kitais moksliniais darbais, kuriuose buvo atliekama kokybinė didesnės imties EC skysčių analizė, galima teigti, kad vanilinas yra vienas dažniausiai naudojamų junginių EC skysčių kvapui bei skoniui gerinti. Dažnai aptinkamas ir etilvanilinas, nors šiame darbe junginys neidentifikuotas. Taip pat labai gamintojų mėgstamos medžiagos yra piranonų grupės junginiai maltolis bei etilmaltolis, kurie suteikia saldų skonį bei kvapą [35]. Dar vienas dažnai naudojamas junginys -

aromatinis aldehidas piperonalis, kuris suteikia EC skysčiams specifinį heliotropo (agurklinių šeimos augalo) kvapą [35, 11].

9 lentelė. Kitų cheminių junginių pasiskirstymas mėginiuose

Junginių

grupė Junginio pavadinimas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1. Rūgštys 1. Acto rūgštis + + 2. 2-Penteno rūgštis* + 3. Oksirankarboksirūgštis + 4. Izosviesto rūgštis + + 2. Laktonai 5. Heksalaktonas* + 6. 2-Furanonas + + + 3. Eteriai 7. 1,3-Dioksolanas + 4. Esteriai 8. Benzilbenzoatas + 9. Metilacetatas* + 5. Alkoholiai 10. 3-Heksanolis* + 11. Cikloheksanolis* + + 12. 1,3-Dioksolan-4-metanolis + 6. Azolai 13. Izoksazolas + 7. Alkanai 14. Butanas + + + + + + + 15. Propanas + 16. Cikloheksanas + 8. Ketonai 17. 2-cikloheksanonas + 18. 3,3-Dimetoksi-2-butanonas + + + + + 19. Cikloheksan-1,2-dionas* + 20. 2-ciklopenten-1-onas* + 21. Cikloheksanonas + 9. Alkenai 22. Ciklopentenas + 10. Pirazinai 23. Pirazinas* + + 11. Epoksidai 24. 1,4-Epoksicikloheksanas + 12. Aminai 25. 1,3-fenilendiaminas +

9-oje lentelėje junginiai suskirstyti pagal cheminę struktūrą į 12 dalių: rūgštis, laktonus, eterius, esterius, alkoholius, azolus, alkanus, ketonus, alkenus, pirazinus, epoksidus ir aminus. Acto rūgštis [14] ir izosviesto rūgštis aptiktos 2 mėginiuose, kitos rūgštys mėginiuose nesikartoja. Laktonas 2-furanonas aptiktas 3 mėginiuose, o alkoholis cikloheksanolis – 2 mėginiuose. Dažniausiai šioje lentelėje pasikartojantys junginiai yra butanas (alkanas), kuris nustatytas 7 mėginiuose ir 3,3-dimetoksi-2-butanonas (ketonas), kuris identifikuotas 5 mėginiuose. 7 junginiai (2-penteno rūgštis, heksalaktonas, metilacetatas, 3-heksanolis, cikloheksanolis, cikloheksan-1,2-dionas ir 2-ciklopenten-1-onas) yra skonį bei kvapą gerinančios medžiagos.

Literatūroje yra informacijos, kad izosviesto rūgšties garai sukelia kosulį ir paviršutinišką, negilų kvėpavimą [62]. Remiantis literatūra, degant eteriui 1,3-dioksolanui susidaro toksiškos dujos, kvėpuojant garais gali pasireikšti svaigulys bei dusulys [24]. Medžiaga aptikta tik viename junginyje ir apima 3,6 proc. mėginio sudėties. Remiantis tyrimų rezultatais, 2-cikloheksanonas yra labai pavojingas junginys įkvėpus, kaip ir kitų junginių atveju, žala priklauso nuo junginio koncentracijos garuose [24,62]. Kvėpavimo takus dirgina cikloheksan-1,2-dionas, 2-ciklopenten-1-onas ir pirazinas [24].

Mėginiuose identifikuoti 55 skirtingi junginiai, tačiau chromarogramose lieka smailių, kurių identifikuoti nepavyko.

3.2 Gamintojo pateiktos elektroninių cigarečių skysčių sudėties palyginimas su

identifikuotais junginiais tyrimo metu.

Tyrimo metu nustatyta mėginių sudėtis buvo lyginama su ta, kuri pateikta gamintojo ant EC skysčių pakuotės. Gamintojai pateikia EC skysčių sudėtį kaip propilenglikolio ir augalinio glicerolio mišinį, kuriame ištirpintas tam tikras kiekis nikotino bei kvapo ir skonio stipriklio. Dažnai kvapą gerinančios medžiagos nėra identifikuotos, abstrakčiai nurodoma, kad tai yra maistinis aromatas.

9 pav. 16 mėginio chromatograma

16 EC skysčio pakuotėje gamintojas nurodo tokią informaciją apie skysčio sudėtį: augalinis glicerolis, propilenglikolis, mentolio kvapą suteikiančios medžiagos ir kitos skonį bei kvapą gerinančios medžiagos. Nikotino kiekis - 0mg/ml. Mėginio chromatogramoje identifikuotos 8 smailės (9 pav.)

10 lentelė. 16 mėginio chromatogramos junginių lentelė

Smailė Sulaikymo laikas (min) Plotas po kreive % Aukštis% Junginio pavadinimas

1 5,757 5,84 8,19 1,4-Epoksicikloheksanas 2 5,817 5,24 4,72 Ciklopentenas 3 5,847 10,53 8,56 P-cimenas 4 5,926 8,44 10,34 Eukaliptolis 5 6,200 20,67 20,06 Dietilmalonatas 6 7,00 7,65 9,46 Cikloheksanonas 7 7,101 38,48 34,62 Cikloheksanolis 8 8,039 3,15 4,05 Mentilo acetatas

10 lentelėje pateikti junginiai, kurie buvo identifikuoti 16 mėginio chromatogramoje. P-cimenas yra aromatinis monoterpenas, kuris kaupiamas čiobrelių eteriniame aliejuje. Pasižymi

antimikrobinėmis ir antiuždegiminėmis savybėmis [48]. Eukaliptolis taip pat yra monoterpenas. Abu junginiai galimai dedami į EC skysčių sudėtį dėl kvapą bei skonį gerinančių savybių. Taip pat dėl šių savybių dedamas dietilmalonatas, cikloheksanolis ir mentilacetatas (maisto pramonėje junginiai naudojami kaip skonio ir kvapo stiprikliai) [1]. Be paskirties lieka šie junginiai: 7-oksabiciklol-2,2,1-heptanas (1,4-Epoksicikloheksanas), ciklopentenas ir cikloheksanonas. Atsižvelgiant į gamintojo pateiktą sudėtį, šių junginių EC skystyje neturėtų būti. Kartu šios medžiagos sudaro 18,73 proc. visų junginių kiekio šiame mėginyje.

3.3 Dujų chromatografijos su liepsnos jonizaciniu detektoriumi metodikos

validacija

Tiksliam nikotino kiekybės įvertinimui EC skysčiuose būtina metodo validacija. Metodo validacija – tai tam tikrų parametrų vertinimas, metodo tinkamumo nustatymui esant numatytoms sąlygoms [32]. Remiantis Tarptautine konferencija dėl žmonėms skirtų vaistinių preparatų registracijai taikomų techninių reikalavimų suderinimo (ICH), analitinių procedūrų pateiktomis gairėmis, buvo nuspręsta vertinti šiuos parametrus:

1. Specifiškumas

2. Glaudumas: rezultatų pakartojamumas ir rezultatų tarpinis preciziškumas 3. Tiesiškumas

4. Ribos: aptikimo riba ir kiekybinio nustatymo riba

3.3.1 Specifiškumas

Specifiškumas nustatomas lyginant etaloninio tirpalo (pagaminto iš standarto) chromatogramos smailę su tiriamojo. Tiriamo junginio smailė turi būti gerai atsiskyrusi nuo kitų smailių esančių chromatogramoje, nepersidengusi. Etaloninio tirpalo smailės sulaikymo laikas turi sutapti su analizuojamo junginio sulaikymo laiku.

Palyginus standartinio nikotino ir nikotino iš mėginių sulaikymo laiką, nustatyta, kad sulaikymo laikas sutampa - 9,126 min.

3.3.2 Rezultatų glaudumas

Pakartojamumui įvertinti yra skaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis (%SSN), kuris kiekybiniam įvertinimui neturėtų būti didesnis negu 5 proc. Vieno iš tiriamųjų tirpalų analizė buvo atlikta 6 kartus iš eilės, esant toms pačioms sąlygoms (tą pačią dieną, dirbant tam pačiam analitikui, naudojant tą pačią įrangą). Pakartojamumas įvertintas gavus nikotino sulaikymo laikus ir paskaičiavus vidurkį, standartinį nuokrypį (SN) ir %SSN (11 lentelė).

11 lentelė. Nikotino sulaikymo laiko SSN

Analizės nr. Sulaikymo laikas (min.)

1 9,116 2 9,131 3 9,118 4 9,134 5 9,138 6 9,124 Vidurkis 9,126 SN 0,009 % SSN 0,100

Nikotino pakartojamumo SSN yra 0,1 proc. Apibendrinant rezultatus, galima teigti, kad analičių pakartojamumo rezultatai yra geri, nes SSN neviršija 5 proc. Metodika yra tinkama nikotino kiekybiniam nustatymui naudoti.

Tarpiniam preciziškumui įvertinti buvo atliekamos to pačio tiriamojo tirpalo analizės 2 dienas (6 analizės vieną dieną ir 6 - kitą). Buvo gauta 12 sulaikymo laikų ir suskaičiuotas vidurkis, SN ir %SSN. Galima teigti, kad tarpinio preciziškumo rezultatai yra tinkami, nes gautas SSN yra 0,23 proc., o riba yra 10 proc.

3.3.3 Tiesiškumas

Tiesiogiai proporcingų analitinės kiekinei koncentracijai detektoriaus atsako įverčių chromatogramose gavimas yra vadinamas tiesiškumu [53]. Tiesiškumui įvertinti sudaroma kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas R2 _{turi būti ne mažesnis negu 0,98.}

Kiekybiškai nikotinas EC skysčiuose buvo nustatomas dujų chromatografijos su liepsnos jonizacijos detektoriumi (DC-FID) metodu.

10 pav. Nikotino etaloninių tirpalų chromatograma

Standartinis nikotino tirpalas (>99 proc.) buvo naudotas etaloniniams tirpalas gaminti ir kalibracinei kreivei sudaryti. Buvo pagaminti 5 skirtingų, proporcingai didėjančių koncentracijų etaloniniai tirpalai, iš kurių sudaryta kalibracinė kreivė. 10 pav. pavaizduota etaloninių tirpalų chromatograma, kurioje matoma, kaip nikotino smailė didėjant koncentracijoms gražiai persikloja ir kyla į viršų, nes didėja atsako intensyvumas, tuo pačiu ir smailės plotas po kreive. Vidutinis nikotino sulaikymo laikas - 9,127 min.

11 pav. Nikotino kalibracinė kreivė

Nikotino kalibracinės kreivės (11 pav.) determinacijos koficiento (r2_{) reikšmė yra arti vieneto,}

todėl galima teigti, kad kiekybinis nikotino nustatymas EC skysčiuose yra tikslus. Grafiko abscisių ašis – junginio koncentracija, o ordinačių ašis – smailės plotas. Koncentracijų ribos: 50 – 800 µg/ml.

12 lentelė. Kalibracinės kreivės charakteristikos

Junginio pavadinimas Kalibracinės kreivės lygtis Koreliacijos koeficientas (R2₎

Nikotinas f(x)=1659,84*x+104771. 0,9955240

12 lentelėje pateiktos kalibracinės kreivės charakteristikos. Apibendrinant rezultatus galima teigti, kad DC-FID metodas yra tinkamas nikotino kiekybiniam nustatymui.

3.3.4 Aptikimo ir nustatymo ribos

Aptikimo riba – mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti aptiktas analizės metu, o nustatymo riba – mažiausias analitės kiekis, kurį galima tiksliai kiekybiškai įvertinti [36]. Aptikimo ir nustatymo ribos apskaičiuotos lyginant nikotino smailės aukštį su baziniu triukšmu.

13 lentelė. Nikotino aptikimo ir nustatymo ribos

Junginio pavadinimas Aptikimo riba µg/ml Nustatymo riba µg/ml

Nikotinas 2,44 7,39

Nikotino aptikimo ir nustatymo ribos pateiktos 13 lentelėje. Taigi, įvertinus visus 4 kriterijus, galima teigti, kad metodika yra validuota ir tinkama naudoti nikotino kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui.

3.4 EC skysčių kiekybinio tyrimo dujų chromatografijos su liepsnos jonizacijos

detektoriumi metodu rezultatai

Buvo tiriama 16 mėginių, iš kurių 5 buvo užsakyti internetu ir atsiųsti iš Anglijos, kiti 5 pirkti iš Ispanijos ir likę 6 pirkti iš Lietuvoje esančių elektroninių cigarečių parduotuvių. Produktai buvo pagaminti 6 skirtingų gamintojų. 9 EC skysčiuose nebuvo nikotino (angl. nicotine free).

12 pav. 1 mėginio chromatograma

12 pav. pavaizduota 1 mėginio chromatograma, kurioje matosi, kad nikotino smailė yra gerai atsiskyrusi. Vidutinis 16 mėginių nikotino sulaikymo laikas – 9,127 min. (maksimumas – 9,139 min., o minimumas – 9,116 min.), SN – 0,008, o %SSN - 0,083. Pirmame mėginyje aptikta 26,26 ± 0.353 µg/ml nikotino.

13 pav. Nikotino kiekis mėginiuose

Diagramoje (13 pav.) pirmas mėginio stulpelis atspindi gamintojo pateiktą nikotino kiekį, o antrasis analizės metu nustatytą nikotino kiekį. Apskaičiuotas pateiktų koncentracijų vidurkis – 456,25 µg/ml ir nustatytų koncentracijų vidurkis - 139,77 ± 0,103 µg/ml. Nustatytas nikotino kiekis svyruoja nuo 0,00 iki 602,22 ± 0,02 µg/ml. Naudojant SPSS programą apskaičiuota, kad nustatytas nikotino kiekis EC skysčiuose reikšmingai skiriasi, nuo to, kurį pažymi gamintojas (p<0,05). Stebimas reikšmingas ryšys tarp pateiktų didelių koncentracijų (1200 µg/ml, 1600 µg/ml) ir nustatytų žymiai mažesnių koncentracijų.

Buvo tirti 9 mėginiai gamintojo pateikti, kaip sudėtyje neturintys nikotino. 1 iš jų (1 mėginyje) aptiktas nikotinas ir nustatyta jo koncentracija. Vidutinė nikotino koncentracija šiuose mėginiuose – 2,92 ± 0,21 µg/ml, standartinis nuokrypis – 8,75. Likusiuose 8 mėginiuose nikotino neaptikta.

Kitų mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad nikotino kiekis pateiktas gamintojo dažnai neatitinka tikrovės. Pavyzdžiui, iš 10 EC skysčių be nikotino, 7 aptikti nedideli nikotino kiekiai (0,1-15µg/ml) [35]. Literatūroje yra duomenų, kad kai kurie gamintojai nenurodo jokios informacijos apie nikotino kiekį ant EC skysčio pakuotės. 16 tokių EC skysčių buvo tirta ir nustatyta, kad nikotino kiekis juose svyravo 0,1-324 µg/ml [35].

3.5. EC skysčių po garinimo (kaitinimo) kokybinio tyrimo dujų chromatografijos –

masių spektrometrijos (DC-MS) metodu rezultatai

Norint įvertinti EC daromą žalą sveikatai, labai svarbu žinoti ne tik pačių EC skysčių cheminę sudėtį, bet taip pat ir sudėties kintamumą vykstant rūkymo procesui. Junginių reaktyvumas dažnai didėja paveikiant juos karščiu, kas ir vyksta garinimo proceso metu [15]. EC skysčių sudėties kintamumui įvertinti atsitiktine tvarka buvo parinkti 10 iš 16 EC skysčių, kurie buvo pilami į EC prietaisą ir garinami apie 5 min.

14 pav. 10 mėginio chromatograma prieš garinimą (kaitinimą)

10 mėginio chromatogramoje prieš garinimą (kaitinimą) identifikuotos 8 smailės (14 pav.). 1 smailė 3,3-dimetoksi-2-butanonas, 2 - propanas, 3 - limonenas, 4 - benzilo alkoholis, 5 - terpineolis, 6 - maltolis, 7 - nikotinas, ir 8 – oksirankarboskirūgštis.