LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Mindaugas Kirjanovas
Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu
Magistro darbas
Darbo vadovas:
prof. dr. L. Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data:
Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos būdu
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantas
Mindaugas Kirjanovas Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. ĮVADAS ... 7
2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 8
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės. ... 9
3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne ... 10
3.3. Vitamino E metabolizmas ... 11
3.4. Antioksidacinis poveikis ... 13
3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas ... 13
3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika vitaminu E ... 14
3.5. Vitamino E trūkumas ... 16
3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos ... 17
3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai ... 17
3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis ... 18
3.8.1. Receptiniai vaistai ... 18
3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E ... 19
3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas ... 21
3.9. Vitamino E preparatų analizė ... 22
3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių chromatografijos sistema pavyzdžiai ... 22
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ... 25
4.1. Tyrimo objektas ... 25
4.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 25
5. REZULTATAI ... 27
5.1. Metodo validacija ... 27
5.1.2. Tiesiškumas ... 29
5.1.3 Glaudumas ... 30
5.1.4. Tikslumas ... 31
5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai ... 32
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40
7. IŠVADOS ... 42
SANTRAUKA
M. Kirjanovo magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. Dr. L. Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas
Nuolatos plečiantis maisto papildų rinkai ir augant naujai sukuriamų papildų kiekiui būtina sukurti greitas, tikslias ir efektyvias papildų analizės metodikas, norint užtikrinti į rinką tiekiamų farmacinių prepartų kokybę. Vitamino E nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos būdu yra sukurta nemažai įvairių metodikų, tačiau svarbu žinoti, kuri metodika yra efektyviausia būtent vitamino E preparatams.
Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką vaistinių preparatų analizei.
Tyrimo uždaviniai - surinkti ir apibendrinti informaciją apie vitaminą E, jo poveikį organizmui, maisto papildus su tokoferolio acetatu bei jų analizę; optimizuoti metodiką tokoferolio acetato preparatų analizei efektyviosios skysčių chromatografijos būdu ir ją validuoti; atlikti tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) paruošimą analizei įvairiomis ekstrakcijos metodikomis; išanalizuoti gautus duomenis ir padaryti išvadas apie efektyviausias ekstrakcijos metodikas bandinių paruošimui bei skirtumus tarp vaistinio preparato ir maisto papildo analizės.
Metodas – tyrimas atliktas chromatografine sistema su fotodiodų matricos detektoriumi. Mobilioji fazė – metanolis:distiliuotas vanduo (95:5), tekėjimo greitis – 1.2 ml/min, bandinio tūris – 10 µl, trukmė – 14 min, bangos ilgis – 282 nm. Išbandytos preparatų ekstrakcijos metodikos – tirpinimas etanolyje, tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu, muilinimo reakcija ir muilinimo reakcija pridėjus antioksidanto (askobro rūgšties).
Tyrimo rezultatai – geriausias duomenų atkūrimas gautas ištirpinus preparatus etanolyje (1,151 mg/ml tokoferolio acetato tirpalui ir 0.992 mg/ml kapsulėms) bei vykdant ekstrakciją heksanu (atitinkamai 1.193 mg/ml ir 0.787 mg/ml).
SUMMARY
The food supplements market is constantly growing and new products are entering it everyday. In order to assure the quality of these pharmaceuticals it is important to develop methods of analysis which are fast, precise and effective. There are many methods created for the analysis of vitamin E using high-performance liquid chromatography so it is important to know which of them are the most effective for vitamin E food supplements.
The aim – to perform a qualitative and a quantitive assey of tochopherol acetate using high performance liquid chromatography and to find the most effective method of extracting tocopherol acetate from food suplements.
The tasks – to collect and to summarize the data on vitamin E, its effects on human body, on the supplements containing tocopherol acetate and their analysis; to develop a high-performance liquid chromatography method of analysis suitable for the pharmaceuticals containing tocopherol acetate ant to validate it; to perform a tocopherol acetate (a food supplement and a drug) samples preparation using different techniques chosen; to analyze the data collected and to make conclusions about the most effective way of preparing samples for the analysis and about the differences between a drug and a food supplement analysis.
The method – the study was conducted by high-performance liquid chromatography using a photodiode matrix detector. Mobile phase – methanol:purified water (95:5), flow-rate – 1.2 ml/min, injection volume – 10 µl, detection was performed at 282 nm and each run lasted 14 min. Sample preparation – dissolving in ethanol, dissolving in ethanol and extracting in hexane, saponification and saponification adding antioxidants (ascorbic acid) – were tested.
The findings – the best results were reached by dissolving the pharmaceuticals in ethanol (1,151 mg/ml for the tocopherol acetate solution and 0.992 mg/ml for the capsules) and by performing an extraction in hexane (1,193 mg/ml and 0.787 mg/ml respectively).
1. ĮVADAS
Vitaminai – tai būtini ir nepakeičiami junginiai, padedantys pagerti žmonių sveikatą ir gyvenimo kokybę. Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina įvairūs vitaminai, tai viena didžiausių ir plačiausiai vartojamų farmacinių produktų kategorijų. Kochanskienės ir kt (2010) atliktoje Lietuvos vaistinių klientų apklausoje paaiškėjo, jog 100 procentų respondentų per pastaruosius metus vartojo maisto papildus. Dažniausiai buvo vartoti multivitaminų preparatai, tačiau monovitaminų preaparatai vartojami irgi dažnai. Vitamino E preparatus per paskutinius metus vartojo daugiau nei 20 % respondentų [2]. Kadangi tai tikrai svarbi ir labai dažnai vartojama produktų grupė, būtina sukurti patikimas papildų analizės metodikas, kurios leistų greitai, efektyviai ir nebrangiai užtikrinti gaminamų papildų kokybę.
Farmakopėjoje aprašyta tokoferolio acetato analizė naudojant dujų chromatografiją, tačiau efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra labiau paplitęs ir prieinamesnis, todėl svarbu sukurti ir validuoti tokoferolio acetato analizės metodą, kas užtikrintų paprastesnę tokoferolio acetato papildų kontrolę.
Riebaluose tirpių vitaminų preparatuose vitaminai visada būna ištirpinti nedideliame kiekyje aliejaus. Tai kelia papildomų sunkumų analizuojant preparatus, nes aliejinio tirpalo negalima tiesiogiai injekuoti į chromatografijos sistemą. Mokslinėje literatūroje siūloma nemažai skirtingų metodų riebaluose tirpių vitaminų bandiniams ekstrahuoti. Visi jie turi savų teigiamų ir neigiamų savybių, todėl svarbu žinoti, koks paruošimo būdas geriausiai tinka tiriamajai medžiagai, šiuo aveju tokoferolio acetato papildams.
Darbo tikslas
2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslasTyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką vaistinių preparatų analizei.
Darbo uždaviniai
1. Susisteminti mokslinę literatūrą, susijusią su vitaminu E, jo poveikiu organizmui, tokoferolio acetato vaistiniais preparatais bei jų analize.
2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, ją validuoti ir pritaikyti tokoferolio acetato preparatų analizei.
3. Atlikti tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) ekstrakciją įvairiais literatūroje aprašytais metodais.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės.
Vitaminas E buvo atrastas 1922 metais mokslininkų Evans ir Bishop, kurie ištyrė jog jis yra būtinas apsaugoti nėščias žiurkes nuo vaisiaus resorbcijos. (Evans, Bishop, 1922; cit iš Traber, 2007) [63]. Vitamino E poveikiu pasižymi aštuoni struktūra labai panašūs tokoferoliai ir tokotrienoliai, kurie visi yra kilę iš 6- chromanolio. Tokoferoliai ir tokokotrienoliai žymimi graikiškomis raidėmis α-, β-,γ-, δ-. Jie vienas nuo kito skiriasi metilo grupių skaičiumi ir išdėstymu benzolo žiede.[1].
Stipriausiu vitamininiu E aktyvumu pasižymi alfa-tokoferolis. Tai chiralinė molekulė, turinti aštuonis stereoizomerus. Gamtoje randamas RRR-alfa-tokoferolis (chiraliniai anglies atomai yra R-konformacijoje, 2‘ , 4‘ ir 8‘ pozicijose [9], o sintetiškai gaminamas all-rac-alfa-tokoferolis (arba dl-alfa-tokoferolis), visų aštuonių stereoizomerų mišinys [33]. Vitamino E papilduose dažnai vartojami ir tokoferolių acetatų ar sukcinatų esteriai, norint prailginti tokoferolių stabilumą ir preparatų galiojimo laiką. Visi šie junginiai (alfa-tokoferolis, jo acetato ar sukcinato esteris) organizme absorbuojami panašiai [14]. Visi stereoizomerai turi vienodas antioksidantines, bet skirtingas biologines savybes. [9] Tokoferoliai yra bespalviai aliejai, gerai tirpstantys riebaluose ir riebalų tirpikliuose, atsparūs temperatūros poveikiui, tačiau greitai suyra, veikiami ultravioletinės spinduoliuotės [1].
3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne
Visų riebaluose tirpių vitaminų absorbcija yra susijusi su riebalų absorbcija žarnyne. Riebalai yra būtini vitamino E absorbavimu. Jeans ir kt (2004) įrodė, jog vitamino E preparatus vartojant su riebalų turinčiu maistu, vitamino E koncentracija kraujyje būna žymiai didesnė [31].
Be riebalų, riebaluose tirpių vitaminų absorbcijai būtinos tulžies rūgštys ir kasos fermentai. Jų svarbą įrodo vitamino E trūkumas, kuris pasireiškia pacientams, sergantiems cistine fibroze arba cholestatine kepenų liga [42]. Su maistu gauti riebaluose tirpūs vitaminai ištirpsta suvartotuose riebaluose. Tulžies pagalba riebalai yra emulguojami iki micelių. Labai susmulkintos micelės įsiurbiamos. Specifiniai mechanizmai kaip micelėse ištirpęs vitaminas E įsiurbiamas į žarnų enterocitus nėra iki galo ištirti [61]. Atliktas tyrimas in vivo ir in vitro parodė, jog baltymas Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), būtinas cholesterolio absorbcijai, gali transportuoti alfa-tokoferolį [47]. Taip pat tiriamas ir Scavenger receptoriaus B klasės I tipo (SR-BI) poveikis vitamino E pernešimui per enterocitą. Studija parodė, jog žarnyne išskiriami SR-BI kiekiai bent dalinai įtakoja vitamino E pernašą [54].
Enterocito įsiurbtas vitaminas E pakuojamas į chilomikronus ir taip patenka į limfos cirkuliaciją bei yra išnešiojamas po periferinius audinius.
[42]. Tai buvo įrodyta tyrimu su pelėmis, šertomis maistu tik su gama tokoferoliu 550, tai pat gama tokoferoliu 60 ir pėdsakais alfa tokoferolio, taip pat kontroline dieta su mažu kiekiu tokoferolių. Rezultatai parodė, jog nepaisant didelių gama tokoferolių kiekių maiste, kepenys į plazmą sekretavo panašų kiekį alfa ir gama tokoferolių [62]. Jei nebūtų alfa-tokoferolio transporto baltymo, plazmoje būtų buvę žymiai daugiau gama-tokoferolio. Taip pat teigiama, jog alfa tokoferolio transporto baltymo ekspresiją sukelia oksidacinis organizmo stresas bei hipoksija [66]. Kadangi pagrindinis alfa-tokofoerolio poveikis – antioksidacinis, tai laisvųjų radikalų, susidarančių organzime hipoksijos ar oksidacinio streso metu, koncetracijos padidėjimas turėtų aktyvinti alfa tokoferolio transporto baltymo veiklą ir didinti alfa tokoferolio koncentraciją plazmoje. Alfa-tokoferolis yra kepenų sekretuojamas į plazmą kartu su labai-mažo-tankio-lipoproteinais (LMTL) [9]. LMTL yra katalizuojamas lipoproteazės lipazės, suformuojant mažo tankio lipoproteinus (MTL), kurie yra pagrindiniai vitamino E nešėjai į periferinius audinius. Hidrolizės būdu MTL gali būti perkeliami į DTL ir į audinius [42].
3.3. Vitamino E metabolizmas
Mechanizmai, kuriais reguliuojama tokoferolių koncentracija periferiniuose audiniuose, dar nėra iki galo išaiškinti, tačiau iš kelių atliktų tyrimų galima daryti išvadą, jog tokoferolių koncentracija yra reguliuojama. Pirmiausia, dideli pavartoto alfa-tokoferolio kiekiai tik truputį padidina jo koncentraciją plazmoje. Antra, tokoferolio kiekiai audiniuose ir kraujo plazmoje neatsipindi suvartoto tokoferolio kiekio [58].
Tokoferolis turi du metabolinius kelius. Vienas veda į šalutinės grandinės degradaciją prieš tai suskaldžius chromano žiedą o kitas- šalutinės grandinės degradacija išlaikant chromano žiedą [36].
beta-oksidacija. Karboksichromanolai vėliau palaipsniui yra sujungiami su gliukouronatu ir palaipsniui išskiriami į šlapimą [58].
3.4. Antioksidacinis poveikis
3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas
Vitaminas E yra radikalus neautralizuojantis antioksidantas, kuris apsaugo membranas ir plazmos lipoproteinus nuo laisvųjų radikalų. Iš visų vitamino E formų, geriausiu antioksidaciniu poveikiu in vitro pasižymi alfa tokoferolis, nepriklausomai nuo tirpiklio, kuriame vykdoma reakcija [64]. Kai susiformuoja peroksilo radikalai (ROO•), jie 1000 kartų greičiau reaguoja su vitaminu E (vit. E-OH) nei su nesočiosiomis riebiosiomis rūgštimis (RH) [9]. Taip vitaminas E apsaugo membranas ir plazmos lipoproteinus.
Esant vitaminui E peroksilo radikalai reaguoja taip: ROO• + Vit.E-OH → ROOH + Vit. E-O•
Vitamino E neesant, reakcija vykta taip: ROO• + RH → ROOH + R•
R• + O2 → ROO• [9]
Vitamino E radikalų neutralizavimo greitis yra lygus greičio konstantos kE (ji priklauso
nuo radikalų tipo ir reakcijos aplinkos sąlygų), vitamino E koncentracijos ir radikalų koncentracijos sandaugai :
Radikalų neautralizavimo greitis = kE[Vit.E][radikalo]
Radikalų neautralizavimo greitį lemia tirpiklio, kuriame vyksta reakcija, prigimtis. Pavydžiui, jeigu susiformuoja vandenilinės jungtys tarp vitamino e ir tirpiklio, tokio kaip etanolis, reakcija lėtės. Taip pat vitamino E reaktyvumas mažėja membranose, lipoproteinuose ir micelėse, turbūt dėl pasunkinto molekulių judėjimo juose.
Susidaręs vitamino E radikalas vit. E-O• gali reaguoti su kitu radikalu susidarant stabiliems produktams, gali reaguoti su lipidais arba su redukuojančiomis medžiagomis, tokiomis kaip askorbatai. Šiuo būdu regeneruojamas vitamino E kiekis [49]. Svarbiausia yra vitamino E reakcija su vitaminu C. Vyksta reakcija:
Ši reakcija vadinama “Vitamino E perdirbimu”. Jos metu vitamin E antioksidacinį veikimą atstato kiti antikosidantai [9]. Tiesa, vitaminas E yra riebaluose tirpus, o vitaminas C – vandenyje, todėl nėra aišku, ar šis mechanizmas tikrai veikia ir in vivo. Atliktos studijos nevienareikšmiškos. R. Bruno ir kt. (2006) atliktame tyrime nustatyta, jog rūkančių asmenų alfa ir gama tokoferolių kiekis kraujyje sumažėja, tačiau jį pavyksta atsatyti vitamino C papildais [12]. Taip pat buvo tirtas UV sipndulių poveikis alfa tokoferoliui odoje. Nustatyta, jog alfa tokoferolis, absorbavęs UV spindulius, skyla į laisvuosius radikalus bei tai, jog askobro rūgštis padeda atsistatyti vitamino C koncentracijai [34]. Šis „Vitamino E perdirbimas“ svarbus apsaugant mažo tankio lipoproteinus, kuriais dažniausiai ir transportuojamas vitaminas E. VE Kagan ir kt. (1992) atliktame tyrime nustatyta, jog mažo tankio lipoproteinuose askorbatai gali „perdirbti“ vitamino E laisvuosius radikalus į vitaminą E [35]. Vitaminas E, esantis eritrocitų membranose ir kuris saugo jas nuo oksidacinio streso, saugomas jo laisvuosius radikalus verčiant į vitaminą E dviem būdais – fermentiniu NADH – citochromo B5 keliu arba nefermentiniu askorbatų arba dihidrolipoidinės rūgšties keliu [16]. Kita vertus, GW Burton ir kt. (1990) atliktame tyrime su jūros kiaulytėmis nepastebėta tokoferolių koncetracijų skirtumų kraujyje ir audiniuose tarp jūrų kiaulyčių grupių, šertų vienodu kiekiu tokoferolio ir skirtingų kiekių vitamino C dieta. Daroma išvada, jog vitamino E ir vitamino C sąveika svarbi tik in vitro [13].
3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika
vitaminu E
Vitaminas E in vivo apsaugo ląstelių membranas ir plazmos lipoproteidus. Tai gali užkirsti kelią kai kurioms ligoms atsirasti. Yra nustatytas ryšys tarp padidėjusios ląstelinių oksidantų koncentracijos ir pagausėjusios ląstelių mutacijos, sukeliančios vėžį, taip pat radikalų sukeltas pažeidimas ląstelių membranose sukelia lipidų peroksidaciją, kuri sąlygoja laisvųjų radikalų, žalojančių ląsteles, atsiradimą [38].
gaubtinės žarnos vėžio riziką [8]. E Riboli ir R Kaaks atlikta didelės apimties studija EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) atlikta tiriant krūties vėžio rizikos sumažėjimą dėl vartojamų vitamino D, E ir C, nerado reikšmingo vitamino E antivėžinio poveikio, tačiau pastebėtas nedidelis antivėžinis poveikis postmenopauzinėje moterų grupėje [55].
Manoma, jog antioksidantai, tokie kaip vitaminas E, mažindami oksidacinį stresą, užkerta kelią širdies ir kraujagyslių ligoms, taip pat mažina cholesterolio kiekį kraujyje ir mažina riziką aterosklerozei. Su triušiais atliktas tyrimas parodė, jog hipercholesterolemijos širdžiai sukeliamas oksidacinis stresas yra sumažinamas vitamino E pagalba [51]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė, jog vitaminas E apsaugo aortą nuo pažeidimų ir trombų esant padidėjusiam cholesterolio kiekiui kraujyje [37]. Tačiau pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, antioksidantų poveikis, gerinantis ligos eigą, nenustatytas. Y Ye ir kt. (2013) atliktoje didelės apimties meta-analizėje, kurioje buvo apžvelgtos 293 studijos ir tirti 188209 pacientai, buvo nustatyta, jog antioksidantai (vitaminas E, betakarotinas ir vitaminas C) neturi jokios įtakos širdies ir kraujagyslių ligų, tokių kaip miokardo infarktas ar insultas, atsiradimui [29]. Dar daugiau, ER Miller 3rd ir kt. (2005) atlikta meta-analizė net teigia, jog didelės suvartoto vitamino E dozės (daugiau nei 400 UI per dieną) didina ligonių mirtingumą [45]. Tačiau yra ir prieštaringų nuomonių. Yakoot M (2012) savo publikacijoje teigia, jog taikant vitaminą E pacientams, būtina atsižvelgti ne tik į meta-analizes, kurios analizuoja populiacijas, bet ir į individualius pacientus, jų vartojamus vaistus ir galimą antioksidantų naudą [28].
Didelį oksidacinį stresą patiria pacientai, sergantys cukriniu diabetu. Tai lemia plazmoje padidėjęs gliukozės kiekis. Tai sukelia plazmos ir ląstelių glikozilinimą, kuris labiausiai pakenkia kraujagyslių endoteliui. Dėl to diabetu sergantys pacientai patiria daugiau širdies ir kraujagyslių ilgų komplikacijų nei juo nesergantys [24]. Tai, jog sergant diabetu padidėja organizmo oksidacinis stresas, yra įrodyta diabetikams sumažėjusia antioksidantų koncentracija kraujyje [26]. Yra užtektinai mokslinių įrodymų, jog būtų galima teigti, kad vitaminas E sumažina diabeto sukeliamų komplikacijų riziką. Jain AB ir kt. (2012) atliktoje studijoje nustatyta, jog I ir II tipo diabetu sergantiems pacientams, vartojusiems insuliną (I tipo diabetas) arba hipoglikeminius vaistus (II tipo diabetas) ir vitamino E papildus, reikšmingai sumažėjo gliukozės, cholesterolio kiekis kraujyje ir diastolinis kraujo spaudimas, pasireiškė mažiau širdies ir kraujagyslių ligų bei retinopatijos, lyginant su pacientais, vartojusiais tik insuliną (I tipo diabetas) arba tik hipoglikeminius (II tipo diabetas) vaistus [32]. Kita studija įrodo, jog vartojant hipoglikeminius vaistus kartu su vitaminu E labiau sumažinamas oksidacinis stresas ir kraujagyslių pažaida nei vartojant vien tik hipoglikeminius vaistus [57].
antioksidantų lygiai. Buvo nustatyta, jog Alzheimerio liga sergančiųjų antioksidantų lygis kraujyje buvo statistiškai reikšmingai žemesnis nei nesergančiųjų, o oksidantų – aukštesnis [6]. Taigi, tokie antioksidantai kaip vitaminas E turėtų sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga, tačiau atlikti tyrimai ir meta-analizės nevienareikšmės. Li ir kt. (2012) atlikta meta-analizė rodo, jog antioksidantai, ypač vitaminas E, gali sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga [41]. Tačiau A. Isaac ir kt. (2008) atlikta meta-analizė parodė, jog nėra jokio ryšio tarp vitamino E papildų vartojimo ir Alzheimerio ligos prevencijos [43]. Tokius prieštaringus duomenis interpretuodami OB Usoro ir SA Mousa (2010) teigia, jog galbūt neigiamiems gydymo rezultatams įtakos turi tai, jog buvo pacientams buvo skirti vitamino E preparatai, kuriuose yra alfa-tokoferolis. Jis teigia, jog Alzheimerio ligos prevencijai veiksimingiau naudoti visų tokoferolių ir tokotrienolių mišinį [67].
A. Hadžović-Džuvo ir kt. (2011) savo darbe įrodė jog pacientų, sergančių išsėtine skleroze, antioksidantų kiekiai kraujyje irgi būna sumažėję, lyginant su ja nesergančiais. Tai rodo, jog oksidacinis stresas yra svarbus išsėtinės sklerozės patogenezėje ir kad antioksidantai yra svarbūs šios ligos terapijoje. [25] Vitamino E poveikiui išsėtinės sklerozės atsiradimui ištirti atlikta meta-analizė rodo, jog kuo ilgiau buvo vartojami vitamino E papildai, tuo mažesnė buvo sklerozės pasireiškimo rizika [68] Parkinsono liga sergantiems asmenims taip pat nustatytas antioksidantų kiekio kraujyje sumažėjimas, o oksidantų – padidėjimas [15]. Gydymui antioksidantais įvertinti atliktos meta-analizės rodo, jog vitaminas E gali turėti neuroprotekcinį efektą ir sumažinti Parkinsono ligos riziką. M. Etminam ir kt. (2005) atlikta meta-analizė rado ryšį tarp vitamino E, bet ne vitamino C ar A, ir sumažėjusios rizikos sirgti Parkinsono liga [19]. Šį poveikį įrodo ir Y. Myake ir kt. (2011) atlikta studija, rodantį ryšį tarp didesnio vitamino E ir betakaroteno suvartojimo ir mažesnės rizikos sirgti Parkinsono liga [44].
Apibendrinus gautus duomenis galima daryti išvadą, jog vitamino E efektyvumas širdies ir kraujagyslių bei vėžinių susirgimų gydymui ir profilaktikai yra abejotinas, tačiau diabeto bei neurodegeneracinių ligų gydyme ir ypač profilaktikoje jis yra ganėtinai naudingas.
3.5. Vitamino E trūkumas
neurologines disfunkcijas [65]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė, jog vitamino E trūkumas lemia didesnį jų nervingumą [50]. Vitamino E trūkumas pažeidžia ir kitas sritis – rageną [39], mažina kaulų masę [21]. Nėštumo metu, trūkstant vitamino E, gali sutrikti vaisiaus centrinės nervų sistemos vystymasis [46], gali atsirasti hemolizinė mažakraujystė, ypač neišnešiotiems kūdikiams [18].
3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos
Amerikos maisto ir mitybos tarnyba įvertino rekomenduojamas suvartoti alfa tokoferolio paros normas, atsižvelgdama į dirbtinai žmonėms sukeltą vitamino E trūkumą ir ryšį tarp vandenilio peroksido sukeltos eritrocitų lizės ir alfa-tokoferolio koncentracijos plazmoje. Rekomenduojama paros dozė vyrams ir moterims yra 15 mg alfa-tokoferolio [48].
Tyrimas, atliktas su deuteriu pažymėtu alfa-tokoferoliu impregnuotais obuoliais patvirtino, jog esant vidutinei 33% alfa-tokoferolio absorbcijai, reikia apie 15 mg alfa-tokoferolio kasdien, norit pakeisti negrįžtamus jo nuostolius [11].
3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai
3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis
Buvo apžvelgti įvairūs Lietuvos rinkoje esantys vitamino E preparatai arba kompleksiniai preparatai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E. Įvertinta preparatuose naudota vitamino E forma, kitos sudedamosios medžiagos, naudotos pagalbinės medžiagos, vitamino E kiekis. Informacija apie preparatų sudėtį imta iš www.vaistai.lt
3.8.1. Receptiniai vaistai
Lietuvos rinkoje yra šie tokoferolio acetato preparatai, parduodami tik su receptu:
Vitaminas E Medana geriamieji lašai, tirpalas 300mg/ml, 10ml – gamina įmonė „Medana Pharma“. Sudėtis: alfa-tokoferolio acetatas (300 mg/ ml tirpalo), žemės riešutų aliejus.
Vitaminum E HASCO-LEK 100mg kapsulės N30 – gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (100 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpuse: želatina, glicerolis, kochinelo raudonasis.
Vitaminum A+E HASCO - LEK 30000TV/70mg kapsulės N30 - gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: retinolio palmitatas (30000 TV / kapsulėje), visų racematų alfa- tokoferolio acetatas (70 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina, glicerolis.
3.8.2. Nereceptiniai preparatai ir maisto papildai
Vitaminas E 90mg kapsulės N20 – gamina „Mialteks“. Sudėtis: alfa-tokoferilacetatas (90 mg / kapsulėje), augalinis aliejus, maistinė želatina, drėgmę išlaikanti medžiaga glicerolis.
Vitaminas E Dr.Smiths 400mg kapsulės N10x10 – gamina „Cipla Ltd“. Sudėtis: alfa-tokoferolio acetatas (400 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus.
Vitamin E 400 I.U. Highway N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: DL – alfa tokoferilacetatas 400 mg), želatina, sojų aliejus, drėgmę išlaikanti medžiaga – glicerolis.
Vita ES 200mg kapsulės N30 – gamina “Vitabalans oy”. Sudėtis – d-alfa-tokoferolis (200 mg / kapsulėje).
3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina
vitaminas E
Vitaminas A+E GSK 2500TV/50mg kapsulės N30 – gamina „GlaxoSmithKline Pharmaceuticals“. Sudėtis: retinolio acetatas (2500 TV / kapsulėje), visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (50 mg / kapsulėje), oktilo galatas, žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina, glicerolis, išgrynintas vanduo.
Highway Vitamin A+E kapsulės N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: retinilo acetatas (825 mkg / kapsulėje), DL – alfa-tokoferilacetatas (75 mg / kapsulėje), lipnumą reguliuojančios medžiagos: dikalcio fosfatas, silicio dioksidas; stearino rūgštis; magnio stearatas; stabilizatorius: skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė; kapsulę sudaranti medžiaga: želatina. Selezin ACE tabletės N30 – gamina „Walmark“. Sudėtis: laktozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas, talkas,silicio dioksidas; cinko gliukonatas, L-askorbo rūgštis, selenu papildytos mielės, D-alfa-tokoferilacetatas (15 mg / tabletėje), stabilizatoriai: hidroksipropilmetilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė; piridoksino hidrochloridas, retinilo acetatas, dažiklis titano dioksidas, medvilnės sėklų aliejus.
Eunova Direkt 1.5g granulės N20 – gamina „Hemofarm“. Sudėtis: Kalcio karbonatas, sorbitolis, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga natrio citratas, magnio oksidas, L-askorbo rūgštis, užpildai: manitolis, magnio citratas, natrio askorbatas, citrinų rūgštis, kvapiosios medžiagos, BHA , BHT ir askorbilpalmitatas , želatina, gumiarabikas, antioksidantas liuteinas, kukurūzų krakmolas, maltodekstrinas, riebiųjų rūgščių vidutinės grandinės trigliceridai, mono- ir digliceridai, modifikuotas krakmolas, natrio selenatas, nikotinamidas, palmių aliejus, acesulfamas K ir aspartamas, magnio stearatas) ir silicio dioksidas, natrio karboksimetilceliuliozė, retinilo palmitatas, tiamino mononitratas, natrio riboflavin-5-fosfatas, piridoksino hidrochloridas, cianokobalaminas, cholekalciferolis, D-alfa-tokoferilo rūgšties sukcinatas (12 mg / granulėje), fitomenadionas, D-biotinas, kalcio D-pantotenatas, pteroilmonoglutamo rūgštis, cinko citratas.
Jamieson Vita Vim kramtomosios tabletės N60 – gamintojas „Jamieson laboratories“. Sudėtis:
Gliukozė, ortofosforo rūgšties kalcio druskos, lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė celiuliozė, saldiklis manitolis, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, L-askorbo rūgštis, debetinė kvapioji medžiaga (maltodekstrinas, modifikuotas maistinis krakmolas, bevandeniai pieno riebalai, iš dalies hidrintas sojų aliejus), magnio oksidas, augalinė stearino rūgštis, nikotinamidas, augalinis magnio stearatas, braškių kvapioji medžiaga, vaivorų kvapioji medžiaga, lipnumą reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, D-alfa-tokoferilacetatas (16,8 mg / tabletėje), aviečių kvapioji medžiaga, geležies fumaratas, kalcio d- pantotenatas, dažiklis karminas, riboflavinas, piridoksino hidrochloridas, sacharozė, tiamino mononitratas, vario citratas, beta-karotenas, retinilo acetatas, liuteinas (iš didžiojo serenčio (Tagetes erecta) žiedų), pteroilmonoglutamo rūgštis, kalio jodidas, D-biotinas, cianokobalaminas, cholekalciferolis.
3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas
3.9. Vitamino E preparatų analizė
Nors farmakopėjoje aprašytas kiekybinis tokoferolio aceatato nustatymo metodas yra dujų chromatografija [20], jis jau yra kiek pasenęs ir praktikoje dažniausiai naudojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, kuris yra greitesnis ir efektyvesnis
Bandinių paruošimui egzistuoja daugybė įvairių metodikų. Metodikos parinkimas paprastai priklauso nuo bandinių kilmės, priemaišių kiekio ir tipo ir panašių salygų.
Anot Ruperez ir kt. „Išskyrus vitamino E analizę aliejuose, kurie gali būti tiesiogiai injekuoti į efektyviosios skysčių chromatografijos sistemą po ištirpinimo, vitaminas E turi būti ekstrahuotas iš bandinio matricos ir kai kuriais atvejais koncetruojamas“ [65]. Bandinys turi būti paveikiamas organiniu tirpikliu, norint suardyti struktūras, kurios gali būti susijungusios su su tokoferolio acetatu (lipoproteinais, riebalų lašeliais). Beveik visada naudojamas etanolis, tačiau kartais naudojamas ir metanolis [56]. Tokoferolio acetato ekstrakcijai iš matricos naudojami įvairūs tirpikliai- heksanas, heksano – benzeno mišinys, heksano – etilo acetato mišinys, chloroformas, chloroformo – acetono mišinys ir kiti. Dažniausiai naudojamas heksanas, tačiau Qian ir kt. (1998) įrodė, kad kai kuriais atvejais heksanas nėra efektyviausias ir labiau tinka acetono-chloroformo mišinys [52]. Naudojant heksaną kaip ekstrahentą, ir bandinį analizuotant atvirkštinės fazės chromatografijos būdu, būtina tirpiklį pakeisti kitu, poliškesniu. Tai atliekama išgarinant heksaną skysto azoto srove ir išekstrahuotą tokoferolio acetato likutį ištirpinant poliniame tirpiklyje [56]. Kai kuriais atvejais atliekamos saponifikacijos reakcijos, kuomet ištirpintas bandinys ištirpintas organiniame tirpiklyje, kaitinamas su šarmu. Tokiu atveju nesaponifikuoti komponentai, tokie kaip vitaminas E, pereina į organinio tirpiklio fazę, o riebiosios rūgštys, glicerolis ir kitos medžiagos, galinčios trukdyti analizei lieka šarmo fazėje [52]. Temeratūriniai ir cheminiai veiksniai gali suardyti dalį tokoferolio acetato. Sukeliamą ardantį cheminį ir temperatūrinį bandoma sumažinti į tirpalą pridėjus antioksidantų – butilohidroksitolueno, pirogalolio ar askobro rūgšties [56].
3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu pavyzdžiai
sekančio alfa tokoferolio stereoizomerų metilo esterių pavidalu atskyrimo naudojant chiralinę ASCC [33].
Proceso eiga:
Homogenizuoti tiriamąjį pavyzdį šaltame etanolyje ↓
Muilinimo reakcija su KOH esant 80º C ↓
Ekstraktas su heptanu, 10 ml
↓ ↓
100µL tirpalo ištirti bendram Likę 9,9 ml išgarinami naudojant N2 tokoferolio kiekiui naudojant ASCC ↓
alfa-tokoferolių metilo esterių gavimas ↓
Chiralinė ASCC alfa-tokoferolių metilo esteriams
Naudojant šį metodą, alfa tokoferolio stereoizomerai yra atskiriami penkiais pikais. Pirmasis pikas susideda iš keturių 2S izomerų (SSS-, SSR-,SRR-, SRS-), antrasis RSS-, trečiasis RRS -, ketvirtasis RRR-, o penktasis iš RSR-alfa tokoferolio.
H. Iwase (2002) publikacijoje buvo įvertintas vitamino E ir betakaroteno kiekis emulsifikuotuose maisto papilduose, po kietosios fazės ekstrahavimo [27].
Standartinio vitamino E paruošimas: 125 mg buvo iš anksto ištirpinti etanolyje 50 ml matavimo kolboje. 5 ml pradinio tirpalo vėl buvo praskiesti etanolio iki 50 ml matavimo kolboje. 500 µl šio tirpalo buvo vėl praskiesta kolboje iki 50 ml etanolio. 100 µl šio tirpalo buvo praskiesta iki 10 ml etanoliu. Gauta galutinė koncetracija 2,5 µl / 100 ml.
Tiriamojo pavyzdžio paruošimas: 100 ml matavimo kolboje maisto papildas (10 g) buvo ištirpintas 5% vandeniniame natrio sulfato tirpale, kuriame buvo 1 mM etilendiaminetetraacetinės tūgšites dinatrio dihidrato (EDTA). 1 ml šio tirpalo buvo supilti į naudotą Bond Elut C18 kasetę, kuri prieš tai buvo praplauta distiliuotu vandeniu ir etanolio tirpalu.
Eluentu buvo vartotas etanolis, jo buvo sušviršksta po 2 ml, sušvirkštus standartinius tirpalus. Naudotas fluorescencinis detektorius. Kolona 15 cm ilgio ir 0,46 cm skersmens, mobilioji fazė – etanolis ir metanolis (50:50), tekėjimo greitis – 0,6 ml/min, 40ºC.
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA
4.1. Tyrimo objektas
Vaistinio preparato analizei buvo naudotas vitaminas E Medana, geriamieji lašai, 300mg/ml, 10ml – gamintojas „Medana Pharma“ (Lenkija). Maisto papildo analizė atlikta su papildu „Vitaminas E – Mik“, 30 mg/kapsulėje, gamintojas UAB „Minskinterkaps“ (Baltarusija).
4.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Naudotas etalonas
Eksperimentams naudotas standartizuotas α-tokoferolio acetatas (50.8 % acetato), kurį suteikė UAB „Aconitum“ (Lietuva).
Įranga
Eksperimentas buvo atliktas chromatografinė sistema „Waters Alliance 269“5 su fotodiodų matricos detektoriumi. Kolonėlė - ACE C18, 250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, 5μm porų dydžio.
Reagentai
Vartoti reagentai – heksanas, NaOH, metanolis, askobro rūgštis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), 96 % etanolis („Stumbras“, Lietuva). Dejonizuotas vanduo buvo paruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema „Millipore“.
Chromatografavimo sąlygos
Buvo išbandytos kelios mobiliosios fazės ir nustatyta, jog efektyviausiai tokoferolio acetatas iš kolonėlės išplaunamas naudojant metanolio:distiliuoto vandens mišinį santykiu 95:5. Lanina ir kt. (2007) patvirtino, jog metanolinė fazė yra efektyvesnė prieš kitą dažniausiai naudojamą fazę- acetonitrilinę. [41] Mobiliosios fazės tekėjimo greitis buvo 1.2 ml/min, bandinio injekuojamas tūris – 10 µl. Tyrimo trukmė – 14 minučių. Tokoferolio acetato aptikimui buvo naudojama 282 nm banga. Sistemoje buvo palaikoma 25º temperatūra.
Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas iš standartizuoto α-tokoferolio acetato miltelių. Pasvertas tikslus kiekis, 111.00 mg tokoferolio acetato, jis subertas į 25 ml matavimo kolbą ir ištirpintas apytiksliai 15 ml metanolio. Šis tirpalas buvo 15 minučių įdėtas į ultragarso vonelę kol tokoferolio acetatas visiškai ištirpo ir tada praskiestas metanoliu iki 25 mililitrų. Gautas tirpalas buvo nufiltruotas per 0,45 µm membraninį filtrą.
5. REZULTATAI
5.1. Metodo validacija
Validacija atlikta pagal šiuos parametrus:
Specifiškumą
Tiesiškumą
Tikslumą
Glaudumą
Metodo validacija atlikta remiantis Tarptautinės konferencijos techninių reikalavimų, dėl žmonėms skirtų vaistinių preparatų registravimo, suderinamumo klausimais parengtomis gairėmis [60].
5.1.1. Metodikos specifiškumas
Šis parametras parodo, jog metodika galima vienareikšmiškai įrodyti analitės buvimą. Parametrui įvertinti lyginamos tiriamųjų mėginių ir etalonų chromatogramos, įvertinami spektrai ir sulaikymo laikai.
Etaloninio tirpalo chromatograma:
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Tokoferolio acetato etalonas 10.350 2604709 2.255
1 lentelė. Tokoferolio acetato sulaikymo trukmė preparatų mėginiuose Bandinio paruošimo būdas Sulaikymo trukmė, min Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 10.538
Kapsulių tirpinimas etanolyje 10.437 Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant 10.455 Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija
heksanu 10.392
Kapsulių tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 10.430 Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.384 Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.263 Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją
pridėjus askobro rūgšties 10.260
Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją pridėjus
askobro rūgšties 10.246
Vidurkis 10.378
Lygiant etalono ir tiriamųjų preparatų sulaikymo trukmės (atitinkamai 10.321 ir 10.378 minučių) matyti, jog jie sutampa.
Taip pat buvo palyginti etalono ir tiriamosios medžiagos spektrai:
6 pav. Tokoferolio acetato kapsulių UV šviesos absorbcijos spektras
Abu tokoferolio acetato tirpalai turi UV šviesos absorbcijos maksimumą prie 282.3 nm bangos ilgio.
Remiantis tuo, jog sutampa lygintos etalono ir tiriamojo preparato sulaikymo trukmės ir UV absorbcijos spektrai, galima teigti, jog specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.
5.1.2. Tiesiškumas
Tiesiškumas buvo įvertintas analizuojant alfa tokoferolio skirtingų koncentracijų standartus. Koncentracijos buvo nuo 1.69 mg/ml iki 0.02 mg/ml. Gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos koeficientu r = 0,999929
2 lentelė. Analičių kalibracinės kreivės charakteristikos
7 pav. Alfa tokoferolio kalibracinis grafikas
Gautas kalibracinės kreivės koeficientas yra > 0.99, tad tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas.
5.1.3. Glaudumas
Glaudumas nustatomas eilę kartų analizuojant tą patį mėginį. Glaudumas yra įvertinamas nustatant santykinį standartinį nuokrypį (SSN%), kuris yra apskaičiuojamas atsižvelgiant į smailių sulaikymo laikų, smailių plotų vidurkius bei standartinį nuokrypį. SSN neturėtų viršyti 5 procentų. Glaudumą galima įvertinti trimis lygiais - pakartojamumu (tas pats mėginys leidžiamas keletą kartų per trumpą laiko tarpą), tarpiniu preciziškumu (vertinamas atlikus eksperimentus per kelias dienas, dalyvaujant skirtingiems mokslininkams) bei atkuriamumu (vertinamas rezultatų tikslumas tarp skirtingų laboratorijų). Šiame darbe pasirinkta patikrinti pakartojamumą.
8 pav. Penkis kartus pakartota tokoferolio acetato etalono chromatograma
Apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis yra 0.64 %. Tai yra mažiau nei 5% tad glaudumo kriterijus yra tenkinamas.
5.1.4. Tikslumas
5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai
Kadangi darbe siekiama įvertinti įvairių vitamino E bandinių ekstrahavimo metodikų įtaką analizės tikslumui, buvo apžvelgta mokslinė literatūra šia tema ir pasirinkti keli bandinių paruošimo būdai, kurie buvo taikomi ir maisto papildui – kapsulėms, ir vaistiniam preparatui – tirpalui. Taip bus galima palyginti ne tik skirtingų metodikų įtaką analizės efektyvumui, tačiau ir skirtumus tarp bandinio paruošimo iš kapsulių ir iš tirpalo bei skirtumus tarp vitamino E koncentracijos tikslumo maisto papilde ir vaiste. Visų paruoštų tirpalų koncentracija buvo 1.2 mg/ml.
Buvo paruošti ir chromatografu analizuoti tokie tirpalai: 1. Tirpinimas etanolyje
a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje.
Pipete pamatuojamas 0.1 ml aliejinio tirpalo, kuris perkeliamas į 25 ml tūrio kolbą ir ištirpinamas nedideliame kiekyje 96 % etanolio. Pipetė praplaunama etanoliu, kadangi aliejinis tirpalas yra klampesnis ir gali būti likęs prie pipetės vidinių sienelių. Tirpalas šildomas vandens vonelėje, maišomas, vėliau veikiamas ultragarsu 15 minučių. Atvėsinama iki kambario temperatūros, praskiedžiama etanoliu iki 25 mililitrų ribos.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Tokoferolio acetato
tirpalas etanolyje 10.538 1475469 1.151
b. Kapsulių tirpinimas etanolyje.
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę ir užpilama nedideliu kiekiu 96 % etanolio. Kapsulė praduriama ir stengiamasi iš jos išleisti visą viduje esantį aliejinį tirpalą. Toliau tirpalas šildomas vandens vonelėje, veikiamas ultragarsu 15 minučių, atvėsinamas iki kambario temperatūros, perkeliamas į 25 mililtrų matavimo kolbą ir praskiedžiamas etanoliu iki žymos.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių tirpalas etanolyje 10.437 1042217 0.813
10 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje, chromatograma
2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Kapsulių tirpalas etanolyje
kaitinant 10.455 1271626 0.992
11 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje kaitinant, chromatograma
3. Ekstrakcija heksanu
a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Tirpalo ekstrakcija heksanu 10.392 1529782 1.193
12 pav. Tokoferolio acetato aliejinio tirpalo etanolyje, ekstrahuoto heksanu, chromatograma
b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama nedideliu kiekiu etanolio, praduriama ir mechaniškai išspaudžiamas visas joje esantis aliejinis tirpalas. Etanolinis tirpalas nupilamas į mėgintuvėlį, užpilamas antra tiek heksano, o toliau bandinio paruošimas vykdomas kaip ir tirpalo ekstrakcijos su heksanu.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Kapsulių ekstrakcija heksanu 10.430 1007955 0.786
4. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją
Tiriant riebaluose tirpių vitaminų kiekį įvairiose medžiagose efektyviosios skysčių chromatografijos būdu, saponifikacija vykdoma norint visiškai pašalinti visas pašalines medžiagas, riebalus, galinčius trukdyti tiksliai nustatyti vitaminų kiekį. Saponifikacija dažniau taikoma tiriant pašarus [54] ar maisto produktus [3], nes grynus aliejinius tirpalus galima tiesiogiai tirpinti organiniuose tirpikliuose ir injekuoti į chormatografą. Visgi norima patikrinti hipotezę, jog aliejuje ištirpintą tokoferolio acetatą sunkiau ekstrahuoti heksanu, todėl atlikus muilinimo reakciją, kurios metu, reaguojant natrio šarmui su trigliceridais, pastarieji būtų visiškai pašalinti ir iš tokio tirpalo, tokoferolio acetatas būtų ekstrahuojamas žymiai lengviau ir tiksliau.
a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją
0,1 ml aliejinio vitamino E tirpalo ištirpinama 2 ml 96% etanolio. Į tirpalą pridedama apie 2 ml 1M NaOH tirpalo (perteklius, kad reakcija pilnai įvyktų). Tirpalas perkeliamas į saponifikacijai skirtą indelį užtvirtinamu dangteliu. Saponifikacija vykdoma 60 laipsnių vandens vonelėje 10 minučių. Tirpalas atvėsinamas iki kambario tenperatūros ir sumaišomas su 4 ml heksano. Dėl likutinio NaOH fazės gerai atsiskiria todėl papildomai jo pilti nereikia. Tirpalas maišomas vortex aparatu 30 sekundžių. Kruopščiai nusiurbiamas viršutinis heksano sluoksnis ir jis perkeliamas į kitą mėgintuvėlį. Heksanas išgarinamas skystu azotu, o likęs tokoferolio acetato tirpalas ištirpinamas mažame kiekyje etanolio, vėliau perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas iki žymės.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Tirpalo ekstrakcija muilinant 10.384 416100 0.325
b. Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama apie 2 ml etanolio, kapsulė praduriama ir kapsulės turinys mechaniškai išspaudžiamas į etanolį. Į tirpalą įpilama 2 ml 1M NaOH tirpalo ir jis toliau ruošiamas kaip ir aliejinis tirpalas.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Kapsulių paruošimas
muilinant 10.263 967329 0.755
15 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją
5. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją ir pridėjus askobro rūgšties
Vykdant muilinimo reakciją tokoferolio acetatas veikiamas įvairiais cheminiais regentais – alkoholiu, heksanu, azotu, natrio šarmu, taip pat veikiamas karščiu, maišomas vortex prietaisu. Tai gali suardyti dalį tokoferolio acetato molekulių ir iškreipti analizės rezultatus. Todėl kai kurie autoriai (3), atlikdami saponifikacijos reakcijas, prideda antioksidantų. Iškelta hipotezė, jog pridėjus antioksidacinį poveikį turinčių medžiagų, tokoferolio acetato molekulės bus geriau apsaugotos nuo cheminio ir fizikinio ardančio poveikio ir bus gauti tikslesni analizės rezultatai. Kaip antioksidantas pasirinkta askobro rūgštis.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Tirpalo ekstrakcija muilinant
pridėjus askobro rūgšties. 10.260 349782 0.273
16 pav. Tokoferolio acetato tirpalo paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml) Kapsulių ekstrakcija muilinant
pridėjus askobro rūgšties 10.246 556431 0.434
17 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties
3 lentelė. Įvairių tokoferolio acetato prepratų bandinių chromatogramoje gautų smailių plotas ir apskaičiuota koncentracija
Bandinio paruošimo būdas Smailės plotas chromatogramoje Medžiagos koncentracija (mg/ml) Nustatyta koncentracija lyginant su teoriškai apskaičiuota koncentracija (%) 1.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 1475469 1.151 95.52
1.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje 1042217 0.813 67.75
2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas
kaitinant 1271626 0.992 82.67
3.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas
etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 1529782 1.193 99.42
3.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir
tirpalo ekstrakcija heksanu 1007955 0.786 65.5
4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant
muilinimo reakciją 416100 0.325 27.08
4.b. Kapsulių paruošimas vykdant
muilinimo reakciją 967329 0.755 62.92
4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją pridėjus askobro
rūgšties
349782 0.273 22.75
4.b. Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją pridėjus askobro
rūgšties
6. REZULTATŲ APTARIMAS
Visose tiriamųjų mėginių chromatogramose tokoferolio acetato smailė atsiskiria apie 10 minutę. Tačiau vykdant muilinimo reakcijas gaunamos chromatogramos, pavyzdžiui 14 ar 15 pav., turi žymiai daugiau pašalinių smailių, kartais net didesnių už tokoferolio acetato smailę (16 pav.), nei chromatogramos, gautos iš mėginių, paruoštų neatliekant muilinimo reakcijos, pavyzdžiui 9 ar 10 pav.
Visi tirti mėginiai buvo gaminti vienodos koncentracijos (1.2 mg/ml), pagal gamintojo nurodytas preparatų koncentracijas, tačiau chromatografu nustatytos koncetracijos skiriasi nuo 0,273 mg/ ml (16 pav.) iki 1.193 mg/ml (12 pav.). Šius koncentracijų skirtumus nulėmė skirtingi ekstrakcijos metodų efektyvumai.
Atliekant eksperimentus nustatyta, jog efektyviausias metodas tirti aliejinį tirpalą yra jo ištirpinimas etanolyje ir gauto tirpalo ekstrakcija heksanu (12 pav.). Taip paruoštame mėginyje nustatytas didžiausias tokoferolio acetato kiekis, 1,193 mg/ml ir tai sudaro 99.42 % teoriškai apskaičiuotos koncentracijos. Jis yra truputį efektyvesnis nei preparato tirpinimas etanolyje be ekstrakcijos heksanu, nes be ekstrakcijos heksanu gauta koncentracija yra 3.9 % mažesnė nei vykdant ekstrakciją. Efektyviausias metodas kapsulėms tirti – jų ištirpinimas etanolyje kaitinant tirpalą, kad geriau suirtų kapsulės apvalkalas (11 pav.). Taip gauta koncentracija – 0.992 mg/ml ir tai sudaro 82.67 % teoriškai apskaičiuotos koncentracijos. Efektyviausias metodas aliejinio tirpalo analizei – ekstrakcija heksanu – kapsulėms mažiau tinkamas, juo gauta koncentracija buvo 0.786 mg/ml, t.y. 0.206 mg/ml mažesnė nei kapsules kaitinant etanolyje.
Gimano ir kt. (2000) teigia, jog analizuojant aliejinius tokoferolio acetate tirpalus geriausia juos tiesiog ištirpinti organiniame tirpiklyje be ekstrakcijos. Aliejuose esančios priemaiškos nekliudo tokoferolio analizei, be to, neatliekant papildomų procedūrų sutrumpinama analizės trukmė [23]. Tačiau šiame darbe aprašytas eksperimentas įrodo, kad atlikti ekstrakciją heksanu yra verta, nes gaunami tikslesni duomenys.
kapsulėms). Vykdant muilinimo reakciją su askobro rūgštimi, tirpale atsirado nuosėdų, tirpalas nusidažė švelniai oranžine spalva, todėl galima spėti, jog dėl askobro rūgšties priedo mėgintuvėlyje įvyko cheminės reakcijos, suardžiusios dar didesnį kiekį tokoferolio acetato. Muilinimo reakcijos analizuojant tokoferolio acetato preparatus nėra rekomenduotinos, nes užtrunka ilgai, reikalauja daugiau įrenginių ir regentų, o gautas rezultatas būna prastesnis. Tačiau Albala - Hurtado ir kt. (1997 m.) pasiūlyta metodika tokoferolio acetatui nustatyti vykdant saponifikaciją ir pridėjus askobro rūgšties, buvo sėkmingai pritaikyta analizei [3]. Joje saponifikacija buvo atlikta kambario temepratūroje visą naktį, tuo tarpu šiame tyrime saponifikacija atlikta trumpą laiką aukštoje temperatūroje, kas galbūt turėjo įtakos prastiems rezultatams. Būtų galima atlikti tolesnius tyrimus dėl askobro rūgšties naudojimo tokoferolio acetatui apsaugoti, keičiant reakcijos sąlygas ar naudojant kitus tirpiklius, kad neįvyktų jokios cheminės reakcijos.
Lyginant vaistinio preparato ir maisto papildo dozavimo tikslumą nustatyta, jog tiksliau dozuotas yra vaistinis preparatas. Sudarytas grafikas (18 pav.) rodo skirtumus tarp nustatytų vaisto ir maisto papildo koncentracijų naudojant tuos pačius ekstrakcijos būdus (ekstrakcijos būdai vykdant muilinimo reakcijas neįtraukti nes jais nustatyti rezultatai ganėtinai prasti). Nors abu preparatai buvo pagaminti vienodos 1.2 mg/ml koncentracijos pagal gamintojo nurodytas preparatų koncentracijas, vaistinio preparato – tirpalo – koncentracija ir gauta panaši į teoriškai apskaičiuotą, tuo tarpu maisto papilde nustatytas tokoferolio acetato trūkumas. Nors iš visų registruotų vitamino E preparatų dauguma yra maisto papildai, akivaizdu, jog remiantis gautomis išvadomis, maisto papildai yra dozuojami ne taip tiksliai kaip vaistiniai preparatai ir yra tikslinga vartoti vaistinius vitaminų preparatus norit pasiekti geriausio terapinio efekto.
18 pav. Nustatytos tokoferolio acetato vaistinio preparato ir maisto papildo koncentracijos Tirpinimas etanolyje Tirpinimas etanolyje kaitinant Ekstrakcija heksanu
Tirpalas (vaistinis preparatas) 1.151 1.193
Kapsulės (maisto papildas) 0.813 0.992 0.786
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 K o n ce n tr ac ija, m g/ m l
7. IŠVADOS
1. Apžvelgus mokslinę literatūrą,buvo aprašyta vitamino E struktūra, metabolizmas organizme ir jo poveikis, apžvelgti ir apibendrinti Lietuvoje registruoti vitamino E prepratai, taip pat farmakopėjiniai ir nefarmakopėjiniai jų analizės būdai.
2. Paruošta ir validuota metodika, tinkama vitamino E preparatų analizei efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3. Nustatyta, jog efektyviausias būdas aliejinių tirpalų bandinių ekstrakcijai – etanolinio tirpalo ekstrakcija heksanu, o kapsulėms – jų kaitinimas etanolyje.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ivanovienė L, Praškevičius A. Stasiūnienė N, redaktoriai. Biochemija, antras leidimas. Kaunas: Vitae Litera, 2006. p. 173-75
2. Kochanskienė, Ieva, et al. "Suaugusių žmonių maisto papildų vartojimo ypatybės." Lietuvos bendrosios praktikos gydytojas 7-8 (2010).
3. Albala´-Hurtado, S., Novella-Rodri´ guez, S., Veciana-Nogue´ s, M. T., & Mariné-Font, A. (1997). Determination of vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 778(1-2), 243-246.
4. Albanes, Demetrius, et al. "α-Tocopherol and β-carotene supplements and lung cancer incidence in the Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study: effects of base-line characteristics and study compliance." Journal of the National Cancer Institute 88.21 (1996): 1560-1570.
5. Amerikos žemės ūkip departamento maisto produktų duomenų bazė. Žiūrėta 2014-04-29 Prieiga internetu : http://ndb.nal.usda.gov/ndb/nutrients/
6. Arikanoglu, Adalet, et al. "Relationship of cognitive performance with prolidase and oxidative stress in Alzheimer disease." Neurological Sciences (2013): 1-5.
7. Barve A, Khor TO, Nair S and al. Gamma-tocopherol-enriched mixed tocopherol diet inhibits prostate carcinogenesis in TRAMP mice. 2009 April.
8. Bostick, Roberd M., et al. "Reduced risk of colon cancer with high intake of vitamin E: the Iowa Women's Health Study." Cancer research 53.18 (1993): 4230-4237.
9. Bowman B, Russell R, redaktoriai. Present knowledge in nutrition, devintas leidimas, I dalis. Washington DC:International life sciences institute, 2006. p. 211 – 218
10. Brigelius-Flohe, Regina, and Maret G. Traber. "Vitamin E: function and metabolism." The FASEB Journal 13.10 (1999): 1145-1155.
11. Bruno SR, Leonard SW, Park S et al. Human vitamin E requirements assessed with the use of apples fortified with deuterium-labeled α-tocopheryl acetate. Iš American Society for Clinical Nutrition, 2006 February.
12. Bruno, Richard S., et al. "Faster plasma vitamin E disappearance in smokers is normalized by vitamin C supplementation." Free radical biology & medicine40.4 (2006): 689.
14. Cheeseman KH, Holley AE, Kelly FJ, Wasil M, Hughes L, Burton G. Biokinetics in humans of RRR-alpha-tocopherol: the free phenol, acetate ester, and succinate ester forms of vitamin E. 1995 November (online). Žiūrėta 2013-03-20. Prieiga per internetą http://www.ncbi.nlm.nih.gov
15. Chen, Chiung-Mei, et al. "Increased oxidative damage in peripheral blood correlates with severity of Parkinson's disease." Neurobiology of disease 33.3 (2009): 429-435.
16. Constantinescu, Anastasia, Derick Han, and Lester Packer. "Vitamin E recycling in human erythrocyte membranes." Journal of Biological Chemistry268.15 (1993): 10906-10913.
17. Diplock, Anthony T., et al. "Relationship of Tocopherol Structure to Biological Activity, Tissue Uptake, and Prostaglandin Biosynthesisa." Annals of the New York Academy of Sciences 570.1 (1989): 72-84.
18. Dommergues, J. P., and B. Bader-Meunier. "Nutritional anemia in children." La Revue du praticien 39.24 (1989): 2117.
19. Etminan, Mahyar, Sudeep S. Gill, and Ali Samii. "Intake of vitamin E, vitamin C, and carotenoids and the risk of Parkinson's disease: a meta-analysis." The Lancet Neurology 4.6 (2005): 362-365.
20. European Pharmacopoeia, 7th edition, volume 2. Strasbourg: Council of Europe;2011. p. 3104-3110.
21. Fujita, Koji, et al. "Vitamin E decreases bone mass by stimulating osteoclast fusion." Nature medicine 18.4 (2012): 589-594.
22. García-Closas, Reina, et al. "Dietary sources of vitamin C, vitamin E and specific carotenoids in Spain." British Journal of Nutrition 91.06 (2004): 1005-1011.
23. Gimeno, E., et al. "Rapid determination of vitamin E in vegetable oils by reversed-phase high-performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A 881.1 (2000): 251-254. 24. Goldenstein, Hagit, et al. "Patient selection and vitamin E treatment in diabetes
mellitus." Expert Review of Cardiovascular Therapy 11.3 (2013): 319-326.
25. Hadžović-Džuvo, Almira, et al. "Serum total antioxidant capacity in patients with multiple sclerosis." Bosn J Basic Med Sci 11.1 (2011): 33-6.
26. Illison, Vanessa K., et al. "The relationship between plasma alpha-tocopherol concentration and vitamin E intake in patients with type 2 diabetes mellitus."International journal for vitamin and nutrition research. Internationale Zeitschrift fur Vitamin-und Ernahrungsforschung. Journal international de vitaminologie et de nutrition 81.1 (2011): 12.
28. Yakoot, Mostafa. "Vitamin E and Omega-3: What to believe: Observational studies or randomized controlled trials?." Heart Views: The Official Journal of the Gulf Heart Association 13.2 (2012): 66.
29. Ye, Yizhou, Jing Li, and Zhongxiang Yuan. "Effect of Antioxidant Vitamin Supplementation on Cardiovascular Outcomes: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials." PloS one 8.2 (2013).
30. You, Cha-Sook, et al. "Long-chain carboxychromanols are the major metabolites of tocopherols and tocotrienols in A549 lung epithelial cells but not HepG2 cells." The Journal of nutrition 135.2 (2005): 227-232.
31. Yvonne M. Jeanes, Wendy L. Hall, Susan Ellard, Elizabeth Lee and John K. Lodge (2004). The absorption of vitamin E is influenced by the amount of fat in a meal and the food matrix. British Journal of Nutrition, , pp 575-579.
32. Jain AB, and Jain VA. "Vitamin E, Its Beneficial Role in Diabetes Mellitus (DM) and Its Complications." Journal of clinical and diagnostic research: JCDR 6.10 (2012): 1624.
33. Jensen, Søren Krogh, and Charlotte Lauridsen. "Alpha-tocopherol stereoisomers." Vitamins and hormones 76 (2007): 281.
34. Kagan, Valerian E., et al. Recycling of vitamin E in human low density lipoproteins. 1992 March.
35. Kagan, Valerian, et al. "Ultraviolet light-induced generation of vitamin E radicals and their recycling. A possible photosensitizing effect of vitamin E in skin." Free Radical Research 16.1 (1992): 51-64.
36. Kaneko, Kazuyo, et al. "Studies of the metabolism of α-tocopherol stereoisomers in rats using [5-methyl-14C] SRR-and RRR-α-tocopherol."Journal of Lipid Research 41.3 (2000): 357-367. 37. Kirac, Deniz, Yesim Negis, and Nesrin Kartal Ozer. "Vitamin E attenuates homocysteine and
cholesterol induced damage in rat aorta." Cardiovascular Pathology (2013).
38. Klaunig, James E., and Lisa M. Kamendulis. "The role of oxidative stress in carcinogenesis." Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44 (2004): 239-267.
39. Ko, Mei-Lan, et al. "Dietary deficiency of vitamin E aggravates retinal ganglion cell death in experimental glaucoma of rats." Current eye research 35.9 (2010): 842-849.
40. Lanina, Svetlana A., et al. "Comparison of reversed-phase liquid chromatography–mass spectrometry with electrospray and atmospheric pressure chemical ionization for analysis of dietary tocopherols." Journal of chromatography A 1157.1 (2007): 159-170.
42. LODGE, JOHN K., et al. "Physiological factors influencing vitamin E biokinetics." Annals of the New York Academy of Sciences 1031.1 (2004): 60-73.
43. MG Isaac, R. Quinn, and N. Tabet. "Vitamin E for Alzheimer's disease and mild cognitive impairment." Cochrane Database Syst Rev 3 (2008).
44. Miyake, Y., et al. "Dietary intake of antioxidant vitamins and risk of Parkinson’s disease: a case–control study in Japan." European Journal of Neurology 18.1 (2011): 106-113.
45. Miller, Edgar R., et al. "Meta-analysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase all-cause mortality." Annals of internal medicine 142.1 (2005): 37-46.
46. Miller, Galen W., et al. "The α-Tocopherol Transfer Protein Is Essential for Vertebrate Embryogenesis." PloS one 7.10 (2012): e47402.
47. Narushima, Kazuya, et al. "Niemann-Pick C1-like 1 mediates α-tocopherol transport." Molecular pharmacology 74.1 (2008): 42-49.
48. National Research Council. Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium, and Carotenoids . [Žiūrėta 2013-05-27] Washington, DC: The National Academies Press, 2000. Prieiga internetu http://www.nap.edu
49. Niki E. Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and in vivo evidence. Free Radical Biology and Medicine. April 2013. Žiūrėta 2013-04-10. Prieiga per internetą http://www.sciencedirect.com/
50. Okura, Yuki, et al. "Dietary vitamin E deficiency increases anxiety‐related behavior in rats under stress of social isolation." Biofactors 35.3 (2009): 273-278.
51. Prasad, Kailash, et al. "Vitamin E slows the progression of hypercholesterolemia-induced oxidative stress in heart, liver and kidney."Molecular and cellular biochemistry 368.1-2 (2012): 181-187.
52. Qian, H., and M. Sheng. "Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A, D and E and pro-vitamin D< sub> 2</sub> in animal feeds by one-step extraction and high-performance liquid chromatography analysis." Journal of Chromatography A 825.2 (1998): 127-133. 53. Rachieru, D., Duca, R., & Olteanu, M. (2009). Validation of a method to determine vitamin E
(alpha tocopherol) from feed ingredients by HPLC using reversed phase
chromatography. Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicinǎ Veterinarǎ la lucrări ştiinţifice.
Ser Zootehnie, 52, 543-547.
54. Reboul, Emmanuelle, et al. "Scavenger receptor class B type I (SR-BI) is involved in vitamin E transport across the enterocyte." Journal of Biological Chemistry 281.8 (2006): 4739-4745. 55. Riboli, Elio, and Rudolf Kaaks. "The EPIC Project: rationale and study design. European
56. Ruperez, F. J., et al. "Chromatographic analysis of α-tocopherol and related compounds in various matrices." Journal of chromatography A 935.1 (2001): 45-69.
57. Shinde, Sarita N., Vithal N. Dhadke, and Adinath N. Suryakar. "Evaluation of oxidative stress in type 2 diabetes mellitus and follow-up along with vitamin E supplementation." Indian Journal of Clinical Biochemistry 26.1 (2011): 74-77.
58. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Cytochrome P450 ω-Hydroxylase Pathway of Tocopherol Catabolism NOVEL MECHANISM OF REGULATION OF VITAMIN E STATUS." Journal of Biological Chemistry 277.28 (2002): 25290-25296.
59. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Influence of major structural features of tocopherols and tocotrienols on their ω-oxidation by tocopherol-ω-hydroxylase." Journal of lipid research 48.5 (2007): 1090-1098.
60. The international conference on harmonisation of technical requirements for registration for pharmaceuticals for human use. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1). 1996. Prieiga per internetą:
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step 4/Q2_R1__Guideline.pdf
61. Traber M. Mechanisms for the prevention of vitamin E excess. The Journal of Lipid Research. Kovas, 2013.
62. Traber MG, Siddens LK, Leonard SW ir kt. Alpha-tocopherol modulates Cyp3a expression, increases gamma-CEHC production, and limits tissue gamma-tocopherol accumulation in mice fed high gamma-tocopherol diets. 2005 March. Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
63. Traber, Maret G. "Vitamin E regulatory mechanisms." Annu. Rev. Nutr. 27 (2007): 347-362. Žiūrėta 2013-03-20.
64. Traber, Maret G., and Jeffrey Atkinson. "Vitamin E, antioxidant and nothing more." Free Radical Biology and Medicine 43.1 (2007): 4-15.
65. Ueda, Naohisa, et al. "Correlation between neurological dysfunction with vitamin E deficiency and gastrectomy." Journal of the neurological sciences 287.1 (2009): 216-220.
66. Ulatowski L, Dreussi C, Noy N, ir kt. Expression of the α-tocopherol transfer protein gene is regulated by oxidative stress and common single-nucleotide polymorphisms. 2012, October. Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
68. Wang, Hao, et al. "Vitamin E intake and risk of amyotrophic lateral sclerosis: a pooled analysis of data from 5 prospective cohort studies." American journal of epidemiology 173.6 (2011): 595-602.
69. Woodson, Karen, et al. "Serum α-tocopherol and subsequent risk of lung cancer among male smokers." Journal of the National Cancer Institute 91.20 (1999): 1738-1743.
