MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MILDA STATKAITYTĖ
MAISTO PAPILDŲ, TURINČIŲ VALGOMŲJŲ ČESNAKŲ (ALLIUM
SATIVUM L.) SAUSŲJŲ EKSTRAKTŲ, TYRIMAS EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
MAISTO PAPILDŲ, TURINČIŲ VALGOMŲJŲ ČESNAKŲ (ALLIUM
SATIVUM L.) SAUSŲJŲ EKSTRAKTŲ, TYRIMAS EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas
Data
Recenzentas
Darbą atliko
Magistrantė
Vardas, pavardė, parašas
Milda Statkaitytė
Data
Data
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Allium sativum L. botaninė charakteristika ... 11
1.2 Cheminė Allium sativum L. charakteristika ... 11
1.2.1 Fizikocheminės OSJ savybės ir jų metabolizmas ... 12
1.3 Valgomųjų česnakų ekstraktai ... 14
1.4 OSJ, esančių Allium sativum L., farmakologinis poveikis ... 15
1.4.1 OSJ vaidmuo vėžio gydyme ... 15
1.4.2 OSJ poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 15
1.4.3 OSJ antimikrobinis poveikis ... 16
1.4.4 OSJ priešuždegiminis ir antioksidantinis poveikis ... 16
1.4.5 OSJ biologinis prieinamumas ... 17
1.5 Metodai, taikomi OSJ kokybinėje ir kiekybinėje analizėje ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1 Tyrimo objektas ... 20
2.1.1 Tirtų maisto papildų sudėtis ... 20
2.2 Tyrimo metu naudota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 21
2.2.1 Cheminiai reagentai ... 21
2.2.2 Aparatūra ... 22
2.2.3 Tyrimo sąlygos ... 22
2.2.4 Etaloninio tirpalo paruošimas ... 22
2.2.5 Mėginių paruošimas analizei ... 23
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24
3.2 Maisto papildų, turinčių valgomųjų česnakų sausųjų ekstraktų, kiekybinis įvertinimas ... 29
4. IŠVADOS ... 35
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 36
M. Statkaitytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas
Pavadinimas: Maisto papildų, turinčių valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) sausųjų ekstraktų, tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
Raktiniai žodžiai: Allium sativum, valgomieji česnakai, organiniai sieros junginiai, efektyvioji skysčių chromatografija, ESC, maisto papildai.
Tyrimo tikslas: taikant ESC metodą kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti pasirinktus Lietuvos ir Lenkijos vaistinėse parduodamus maisto papildus, sudėtyje turinčius valgomųjų česnakų (Allium
sativum L.) sausųjų ekstraktų.
Tyrimo uždaviniai: taikant ESC metodiką identifikuoti organinius sieros junginius, esančius pasirinktų maisto papildų sudėtyje. Taikant ESC metodiką įvertinti identifikuotų junginių kiekį, esantį valgomųjų česnakų sausajame ekstrakte, ir palyginti jį skirtinguose maisto papilduose. Palyginti nustatytą organinių sieros junginių kiekį su kiekiu, deklaruojamu gamintojo ant maisto papildų pakuočių.
Tyrimo objektas ir metodai: Skirtingose Europos šalyse pagaminti 7 maisto papildai, kurių sudėtyje yra sausojo česnakų ekstrakto, notifikuoti Lietuvoje ir Lenkijoje ir parduodami šių šalių vaistinėse. Mėginiai analizei buvo paruošti dviem būdais: slopinant fermentą alinazę ir jį aktyvinant. Kokybinė ir kiekybinė organinių sieros junginių analizė atlikta taikant ESC metodą. Naudota tirpiklių sistema: A – natrio-divandenilio fosfato dihidratas ir 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska, B – acetonitrilas, natrio-divandenilio fosfato dihidratas ir 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska. Kolonėlė termostatuota prie 38 °C temperatūros, mobilios fazės tekėjimo greitis 0,4 ml/min. Detekcijai naudotas 208 nm UV šviesos bangos ilgis.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Maisto papilduose, turinčiuose valgomųjų česnakų ekstrakto, buvo identifikuoti šie junginiai: (-)-L-aliinas, SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla slopinant fermentą alinazę ir SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla ir alicinas aktyvinant alinazę. Iš 7 pasirinktų maisto papildų tik 2 turėjo atitinkamą chromatografinį profilį. Nustatyti alicino ir aliino kiekiai neatitinka maisto papildų (MP3 ir MP6) gamintojų deklaruojamų kiekių ant pakuotės. GLUAlCs kiekis atitinka 95,24% (slopinant alinazę) ir 97% (aktyvinant alinazę) ant MP3 nurodytos reikšmės.
Title: Analysis of food supplements containing garlic (Allium sativum L.) dry extract using high-performance liquid chromatography (HPLC) method.
Key words: Allium sativum, garlic, organic sulfur compounds, high performance liquid chromatography, food supplements.
Aim: to qualitatively and quantitatively evaluate food supplements containing garlic (Allium sativum L.) dry extract sold in Lithuanian and Polish pharmacies using high HPLC method.
Objectives: to identify organic sulfur compounds in the contents of food supplements using HPLC. To evaluate quantity of identified compounds using HPLC and compare determined quantities of identified compounds in different food supplements. To compare determined quantities of organic sulfur compounds with quantities declared by manufacturer on the labels.
Object and method: 7 food supplements containing garlic dry extract sold in Lithuanian and Polish pharmacies from different European manufacturers. The samples were prepared in two ways: by inhibiting and activating enzyme alliinase. Qualitative and quantitative analysis of organic sulfur compounds was performed using HPLC method. As eluent A was used the mixture of sodium dihydrogen phosphate dehydrate, 1-heptanesulfonic acid sodium salt monohydrate and as eluent B - the mixture of acetonitrile, sodium dihydrogen phosphate dehydrate and 1-heptanesulfonic acid sodium salt monohydrate. The column was thermostated at 38 ºC, the flow rate of 0,4 ml/min was used. Detection was performed at 208 nm wavelength UV-light.
Results and conclusions:
After inhibiting the enzyme alliinase, (-)-L-Alliin, SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla were identified. After activating alliinase, allicin (diallyl thiosulfinate) was identified as well. The results show that only 2 supplements out of 7 comply with the requirements of chromatographic profiles. Determined amounts of allicin and alliin do not comply with the data provided on a label of food supplement-3 and 6. Determined amount of GLUAlCs complies with 95,24% (by inhibiting alliinase) and 97% (by activating alliinase) amount provided on the label of food supplement-3.
SANTRUMPOS
DADS - dialildisulfidas DATS - dialiltrisulfidas
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija GLUAlCs - γ-glutamil-S-alil-L-cisteinas
GLUPeCs - γ-glutamil-S-(trans-1-propenil)-L-cisteinas GLUPheAla - γ-glutamilfenilalaninas
IL - interleukinas
JAV - Jungtinės Amerikos Valstijos
LSMU - Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MP - maisto papildas
OSJ – organiniai sieros junginiai SAC - S-alil-L-cisteinas
TNF-α - navikų nekrozės faktorius alfa UV - ultravioletinės šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Šiomis dienomis susidomėjimas maisto papildais tiek Europos, tiek JAV šalyse vis didėja [1]. Pacientai gali rinktis iš didėlės įvairovės skirtingų papildų formų – tablečių, kapsulių, miltelių, lašų, gėrimų, kuriuos neretai gali įsigyti ne tik vaistinėse, bet ir maisto parduotuvės ar prekybos centruose [1,2]. Maisto papildų sudėtyje dažniausiai randama įvairių vitaminų, mineralų, aminorūgščių, angliavandenių, riebalų rūgščių, skaidulinių medžiagų ar jų derinių, taip pat tam tikrų augalų dalių ar augalinių ekstraktų [1].
Valgomasis česnakas (Allium sativum L.) – vienas iš seniausiai pasaulyje kultivuojamų augalų, naudojamas kasdieniniame gyvenime ne tik kulinarijoje, bet ir medicininiams tikslams [3]. Teigiamas valgomųjų česnakų poveikis žmogaus sveikatai pastebimas jau tūkstančius metų, o Allium
sativum L. priskiriamas vieniems iš labiausiai ištyrinėtų vaistinių augalų ir dėl savo terapinių savybių
yra pripažįstamas visame pasaulyje [4,5,6]. Nuomonė, jog česnakų vartojimas artimai susijęs su geros sveikatos būklės palaikymu, plačiai paplitusi Vakarų šalyse, todėl neretai maisto papildų, sudėtyje turinčių valgomųjų česnakų, yra parduodama ne mažiau nei populiariausių receptinių vaistų [7]. Dėl naudingų ir gydomųjų valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių savybių sveikatos specialistai dažnai rekomenduoja įvairius maisto papildus, savo sudėtyje turinčius skirtingų valgomųjų česnakų formų [6,8]. Tokie maisto papildai turi savų privalumų: jų lengva rasti ir įsigyti įvairiose šalyse, dažniausiai parduodami už pacientams prieinamą kainą [6,8].
Česnakų skiltelėse ir jų ekstraktuose nustatomi šimtai cheminių medžiagų, tačiau jų farmakologinis poveikis dažniausiai siejamas su česnakų sudėtyje esančiais organiniais sieros junginiais (OSJ) [9,10]. Atlikta nemažai mokslinių tyrimų, kuriuose pastebėta, jog valgomųjų česnakų OSJ būdingas širdies ir kraujagyslių sistemos ligų ir vėžio riziką mažinantis veikimas, antimikrobinis poveikis bei antioksidantinės ir priešuždegiminės savybės [3,11].
Visgi prekyboje randamuose maisto papilduose OSJ profiliai yra nevienodi [12]. Valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių OSJ turinys kinta tiek kultivavimo, tiek sandėliavimo metu, gamybos metu česnakai apdirbami skirtingais būdais, dėl šios priežasties galutiniuose produktuose gali būti nustatomos skirtingos biologiškai aktyvios medžiagos ar jų kiekiai [12,13]. Nors maisto papildai su valgomųjų česnakų ekstraktais šiomis dienomis yra plačiai vartojami, visgi juose esantys bioaktyvūs junginiai yra beveik neanalizuojami [14]. Todėl pritaikius tinkamą metodiką svarbu šiuose maisto papilduose identifikuoti OSJ (pavyzdžiui, aliiną) ir atlikti jų kiekybinę analizę, tam kad būtų užtikrinta maisto papildų kokybė ir jos kontrolė [13,15,16].
Ankstesnio tyrimo, atlikto LSMU Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje, metu buvo kokybiškai ir kiekybiškai vertinami maisto papildai, turintys valgomųjų česnakų miltelių, bei valgomųjų česnakų skiltelių ištraukos [17], todėl šis tyrimas buvo atliekamas kaip tęstinis praėjusios
analizės darbas, kurio tikslas – taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti pasirinktus Lietuvos ir Lenkijos vaistinėse parduodamus maisto papildus, turinčius valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) sausųjų ekstraktų.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: taikant efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti pasirinktus Lietuvos ir Lenkijos vaistinėse parduodamus maisto papildus, turinčius valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) sausųjų ekstraktų.
Darbo uždaviniai:
1. Taikant ESC metodiką identifikuoti organinius sieros junginius, esančius pasirinktų maisto papildų sudėtyje.
2. Taikant ESC metodiką įvertinti identifikuotų junginių kiekį, esantį valgomųjų česnakų sausajame ekstrakte, ir palyginti jį skirtinguose maisto papilduose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Allium sativum L. botaninė charakteristika
Valgomasis česnakas – Allium sativum L. – priklauso česnakinių Alliaceae šeimai, pradėtas kultivuoti centrinėje Azijoje, šiuo metu auginamas visame pasaulyje [4].
Tai vienaskiltis, daugiametis svogūninis augalas, užaugantis iki 1,2 m aukščio [5,7,18]. Jo stiebas tiesus, svogūnas būna 30-60 cm aukščio [19]. Svogūną sudaro apie 4-20 skiltelių, kurias dengia bendra sausa membrana [19]. Apytikslis vienos skiltelės svoris – 1 g [3]. Skiltelė į svogūną išauga plantacijos metu [3]. Svogūnas – tai vienintelė česnako dalis, naudojama gydymo tikslams [3].
Valgomųjų česnakų lapai linijiški, lygūs, plokšti, jų plotis 1-2,5 cm, aukštis 30-60 cm, viršūnė smaili [19]. Lapų dažniausiai būna nuo 4 iki 12 [20]. Žiedai balkšvos arba šviesiai rožinės spalvos, išsidėstę ant žiedynkočio, kylančio tiesiai iš svogūno, kartu jie sudaro skėčio formos žiedyną [3]. Žiedų ilgis – apie 3 mm, žiedynas išauga iki 25 cm [20]. Žiedų skaičius kintantis, jie retai prasiskleidžia, kartais žiedų apskritai nebūna ir augalas nuvysta su pumpurais [19]. Tarp žiedų išsidėstę maži svogūnėliai, kuriais augalas dauginasi [3]. Gamtoje žiedai yra hermafroditai, apdulkinami bičių ir kitų vabzdžių [3]. Sėklų valgomieji česnakai turi retai [19].
Idealiausia valgomuosius česnakus kultivuoti dirvožemyje, kurio pH svyruoja nuo 6 iki 7, vengiant per didelio drėkinimo [3].
1 pav. Valgomasis česnakas (Allium sativum L.)
1.2 Cheminė Allium sativum L. charakteristika
Česnakų svogūnų skiltelėse yra daugiau nei 2000 biologiškai aktyvių medžiagų: lakūs, vandenyje arba riebaluose tirpūs OSJ, eteriniai aliejai, maistinės skaidulos, apie 32% cukrų (fruktozė,
gliukozė, inulinas, arabinozė), flavonoidai ir pektinas [21,22]. Česnakų svogūnų skiltelėse taip pat gausu baltymų, kalcio, magnio, geležies, kalio, cinko, arginino, saponinų, polifenolių ir seleno, randama vitamino A, vitaminų B6 ir B1 bei vitamino C [3]. Jų sudėtyje nustatoma 17 aminorūgščių:
lizinas, histidinas, argininas, asparto rūgštis, treoninas, serinas, glutaminas, prolinas, glicinas, alaninas, cisteinas, valinas, metioninas, izoleucinas, leucinas, triptofanas ir fenilalaninas [23].
1.2.1 Fizikocheminės OSJ savybės ir jų metabolizmas
Allium sativum L. svogūnų skiltelių sudėtyje taip pat identifikuojama apie 100 sieros turinčių
junginių, pasižyminčių farmakologinėmis savybėmis [4]. Jiems priskiriami tiosulfinatai, ajoenai, vinilditiinai ir sulfidai – aliino skilimo produktai [21].
Aliinas (cisteinsulfoksidas) – natūraliai randama nebaltyminė aminorūgštis, kuri veikiant fermentui alinazei yra konvertuojama į aliciną, kuris suteikia būdingą česnakui kvapą [19,21,22]. Chemiškai aliinas yra sintezuojamas į 2 stereoizomerus: L-(+) ir L-(−)-alliiną, tačiau natūraliai aliinas randamas tik (+) formos [24]. Aliinas yra nestabilus aukštesnėje nei 100 °C temperatūroje [12].
Alinazė suskaido aliiną į 2-propensulfeno rūgštį, amoniaką ir piruvo rūgštį [20]. Kai reaguoja dvi sulfeno rūgšties molekulės tarpusavyje, išsiskiria vandens molekulė ir susidaro alicinas [20]. Alicino sintezės reakcija pavaizduota 2 paveiksle [20].
2 pav. Alicino sintezė iš aliino. Modifikuota iš S. M. Shende (2017) [20]
Alinazė – tai fermentas, kuriam būdinga ketvirtinė struktūra [12]. Jis aktyvinamas česnakus smulkinant ar traiškant [11]. Alinazės veikimui optimali temperatūra – 35-37 °C [12]. Šis fermentas yra denatūruojamas karščiu (esant daugiau nei 60 °C alinazė tampa neaktyvi), taip pat pH esant < 3,5 (pvz., skrandyje) ir naudojant nepolinius tirpiklius [4,9].
Alicinas sudaro apie 70-80% bendrojo tiosulfinatų kiekio [4]. Laikoma, jog 1 mg aliino yra ekvivalentiškas 0,45 mg alicino [7]. Alicinas – tai bespalvis, bekvapis, vandenyje tirpus junginys [3]. Jis nestabilus, greitai suyra ir tuomet susiformuoja įvairūs riebaluose tirpūs junginiai kaip tiosulfinatai (dialilsulfidas, dialildisulfidas (DADS), dialiltrisulfidas (DATS)), vinilditiinas ir ajoenai [25]. Alicino skilimo produktai pavaizduoti 3 paveiksle [24].
3 pav. Alicino skilimo produktai. Modifikuota iš B. Dethier (2012) [24]
Be šių lipiduose tirpių junginių česnakų sudėtyje taip pat nustatoma vandenyje tirpių OSJ [26]. Kai česnakų svogūnai yra ekstrahuojami vandeniniu tirpalu, veikiant fermentui γ-glutamiltranspeptidazei γ-glutamil-S-alil-L-cisteinai (GLUAlCs) yra konvertuojami į S-alil-L-cisteinus (SAC) [8,26]. Ši GLUAlCs transformacijos reakcija pavaizduota 4 paveiksle [26].
Česnakų svogūnų ekstraktuose randami SAC ir trans-S-1-propenil-L-cisteinas bei maži kiekiai S-metil-L-cisteino [6,26]. Šie hidrofiliniai junginiai yra stabilūs kietoje būsenoje ar vandeniniame tirpale esant neutralioms ar švelniai silpnai rūgštinėms sąlygoms, bekvapiai, jiems būdingas švelnesnis skonis lyginant su riebaluose tirpiais junginiais [6,26].
1.3 Valgomųjų česnakų ekstraktai
Gaminant maisto papildus naudojamos šviežios, džiovintos ar šalčiu džiovintos valgomųjų česnakų svogūnų skiltelės, jų aliejus ar brandintas ekstraktas [3]. Pačios populiariausios formos, naudojamos maisto papilduose – tai eterinis aliejus ir jo maceratas, česnakų milteliai ir česnakų ekstraktas [3]. Kartais vartojamos česnakų svogūnų sultys, sirupas ar tinktūra, taip pat česnakų piliulės virškinimui gerinti [3].
Česnakų svogūnų skiltelių ekstrakto biologinis aktyvumas priklauso nuo jo paruošimo būdo [4]. Česnakai, naudojami ekstraktams, dažniausiai yra auginami specialiose plantacijose, kur jiems sukuriamos palankios organinės sąlygos [27]. Visos arba susmulkintos česnako skiltelės yra mirkomos išgrynintame vandenyje arba praskiestame etanolyje plieninėse talpyklose įvairius laiko tarpus [27].
Tiek sausi, tiek skysti ekstraktai gali būti gaminami trumpos hidroalkoholinės ekstrakcijos metu [6,9]. Tokie ekstraktai yra išreiškiami kaip sunaudoto česnako skiltelių kiekio ir galutinio produkto tūrio ar svorio vieneto santykis [9]. Gautų ekstraktų cheminė sudėtis ir juose esančių junginių stabilumas dažniausiai yra nepastovus [9]. Hidroalkoholinės ekstrakcijos metu pridedant metanolio ir etanolio lengviau gali būti inaktyvinami alinazės ir peroksidazės izofermentai [6]. Česnakų svogūnų skiltelių ekstraktai taip pat gali būti gaunami garinant, purškimo būdu džiovinant ar liofilizuojant skystą ekstraktą [6]. Norint ekstraktuose išlaikyti lakius junginius dažnai naudojamos azoto dujos arba skystas azotas [6].
Komerciniuose valgomųjų česnakų produktuose esanti paros dozė turėtų būti lygi bent 4000 mg šviežių česnakų (1-2 skiltelėms) [28]. Ši dozuotė atitinka bent 10 mg aliino arba 4000 µg bendrojo alicino potencialo [28]. Suaugusiems dienos dozė yra 2-5 g šviežių česnakų (apytiksliai 1 skiltelė), 0,4-1,2 g sausų miltelių, 2-5 mg aliejaus, 300-1000 mg česnakų ekstrakto arba kitų formų, kuriose yra 2-5 mg alicino [29].
1.4 OSJ, esančių Allium sativum L., farmakologinis poveikis
Moksliniai tyrimai pabrėžia, jog OSJ turi gydomąjį potencialą įvairių ligų gydyme ir profilaktikoje. Manoma, jog česnakų svogūnų skiltelėse esantys OSJ pasižymi priešvėžinėmis, širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiomis, antimikrobinėmis, antioksidantinėmis, priešuždegiminėmis savybėmis [10]. Toliau apžvelgti moksliniai tyrimai, kurie buvo vykdyti analizuojant šiuos poveikius.
1.4.1 OSJ vaidmuo vėžio gydyme
Studijuojant įvairias Allium sativum L. formas buvo pastebėtas priešvėžinis aktyvumas, kuris siejamas su česnakų svogūnų skiltelėse esančiais OSJ [30]. Tyrimų in vitro ir su gyvūnais metu nustatyta, jog šie junginiai mažina navikų pasireiškimo dažnį krūties, kraujo, šlapimo pūslės, storosios žarnos, odos, stemplės ir plaučių vėžio atvejais [31]. Mokslininkai, tirdami gyvūnų modelius pastebėjo, jog SAC lėtina cheminiu būdu sukeltų ir transplantuotų navikų augimą [30]. Tyrimų in vitro rezultatai rodo, kad DADS reikšmingai keičia HeLa žmogaus gimdos kaklelio vėžinių ląstelių augimą ir skatina jų apoptozę [32]. Kadangi česnakų skiltelėse esantys junginiai sugeba slopinti navikų vystymąsi skirtinguose audiniuose, manoma, jog veikimo mechanizmas galėtų būti bendras ląstelinis atsakas (kancerogenų formavimosi ir bioaktyvacijos slopinimas, intensyvesnis DNR atkūrimas ar apoptozė), o ne specifinis audinių pokytis [33].
1.4.2 OSJ poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Gausu mokslinių tyrimų, kurių metu nustatyta, jog česnakų vartojimas turi įtakos kraujospūdžio pakitimams [30]. Vieno tyrimo metu buvo analizuojami lengva hipertenzija sergantys pacientai, kuriems būdingas padidėjęs cholesterolio kiekis, ir nustatyta, jog suvartojant 900 mg česnakų miltelių per dieną, sumažėja diastolinis kraujo spaudimas lyginant su česnakų nevartojančiomis grupėmis [30]. In vivo tyrimų su gyvūnais metu pastebėta, kad skiriant česnakų skiltelių ekstraktą gyvūnams, kuriems būdinga hipertenzija, jų kraujospūdis sumažėjo nuo aukšto iki normalaus [11]. In vitro tyrimų metu patvirtintas česnakų svogūnuose esančių sieros junginių gebėjimas keisti kraujagyslių diametrą: raudonieji kraujo kūneliai konvertuoja česnakų organinius polisulfidus į vandenilio sulfidą, kuris mažomis dozėmis apsaugo širdies audinius [28].
Išanalizavus įvairių tyrimų rezultatus pastebėta, jog česnakams būdingas serumo lipidų kiekį normalizuojantis poveikis [26]. Skirtingų atsitiktinių imčių tyrimų rezultatai rodo, jog česnakų skiltelės
mažina bendrojo cholesterolio kiekį apie 10% ir gerina didelio tankio ir mažo tankio lipoproteinų santykį (HDL/LDL) [30]. Tiriant gyvūnus (triušius, žiurkes, viščiukus, kiaules) pastebėta, kad česnakų ekstraktui būdingas plazmos lipidų ir cholesterolio koncentraciją mažinantis poveikis [26,27]. Virtų česnakų skiltelių analizės ir eksperimentinių tyrimų su žiurkių hepatocitų kultūromis ir žmonių HepG2 ląstelėmis metu nustatyta, kad jie reikšmingai mažina lipogenezę kepenyse – slopina baltymus, kurie dalyvauja cholesterolio ir riebiųjų rūgščių sintezėje [7,26].
1.4.3 OSJ antimikrobinis poveikis
Česnakų svogūnų skiltelėms būdingas platus antimikrobinio aktyvumo spektras prieš įvairias bakterijų, virusų, parazitų, pirmuonių ir grybelių rūšis [28]. Mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad česnakai aktyvūs prieš Staphylococcus, Salmonella, Vibrio, Mycobateria ir Proteus rūšies bakterijas ir tokias bakterijas kaip Shigella dysenteriae, Pseudomnonas aeruginosa, Eshceria coli [10,28]. Tyrimų metu taip pat buvo nustatyta, jog chloroforminiai ir etanoliniai česnakų ekstraktai yra pakankamai efektyvūs prieš meticilinui atsparias Staphylococcus aureus padermes, įrodytas reikšmingas česnakų ekstraktų poveikis prieš steptomicinui atsparias S. aureus ir E. coli padermes skiriant ekstraktą vieną bei kartu su streptomicinu [10,34].
Tyrimų su virusais rezultatai rodo, kad citomegalo, influenza B, 1 ir 2 tipo Herpes simplex, 3 tipo Parainfluenza, Vaccinia, pūslelinio stomatito virusai ir 2 tipo žmogaus rinovirusai yra jautrūs česnakų ekstraktams [10]. Mokslinių analizių metu nustatyta, kad vandeniniai česnakų skiltelių ekstraktai (2-5 mg/ml) slopino Helicobacter pylori proliferaciją, o H. Pylori kolonizacija skrandžio gleivinėje – vienas iš gastritą ir skrandžio vėžį sukeliančių faktorių [33]. Atliekant tyrimus in vitro pastebėta, kad ajoenas slopina ligas sukeliančių grybelių tokių kaip Alternaria sonali, A. tuneissima, A.
tritiana, Alternaria species, Colletotricum species, Curvularia species, Fusarium lini, Fusarium oxysporum, F. semictum, F. udum sporų augimą [20].
1.4.4 OSJ priešuždegiminis ir antioksidantinis poveikis
Įvykdžius česnakų skiltelių ekstrakto analizę in vitro pastebėta, kad jis slopina uždegiminių citokinų tokių kaip navikų nekrozės faktorius alfa (TNF-α), interleukino (IL)-1α, IL-6 ir interferono- gamybą [35]. Tiriant česnakų OSJ poveikį pelių makrofagų ląstelėms nustatyta, kad DATS taip pat slopina IL-10, IL-12, KC ir MCP-1 citokinus [36]. Vertinant DATS poveikį gyvūnų modeliams, kuriuose dirbtinai sukeltas uždegimas, taip pat pastebėtas priešuždegiminis aktyvumas – DATS
slopino lipopolisacharidų sukeltą pelių letenėlių edemą mažindamas IL-6, MCP-1 ir TNF-α kiekius serume [36].
Atliekant mokslinius tyrimus, kuriuose analizuojamas česnakų svogūnų skiltelių farmakologinis poveikis, buvo pastebėtas ir antioksidantinis veikimas. Tyrimų in vivo metu nustatyta, kad pelėms, kurioms buvo skiriama didelį cholesterolio kiekį turinti dieta ir česnakų ekstraktas per os, papildomas česnakų ekstrakto vartojimas padidino antioksidantinių baltymų superoksido dismutazės (SOD) ir gliutationo peroksidazės (GSH-Px) aktyvumą [37]. In vitro įvertinus 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalų surišimo aktyvumą nustatyta, jog metanoliniui ir vandeniniui česnakų ekstraktui būdingas 80-90% antioksidantinis aktyvumas lyginant su askorbo rūgštimi [38]. Atskirai įvertinus OSJ antioksidantinį aktyvumą pastebėta, kad aliinas ir SAC geba surišti hidroksilo radikalus ir yra efektyvūs lyginant su kitais antioksidantais tokiais kaip manitolis, o DADS gali veikti kaip lipidų peroksidacijos terminatorius ir apsaugoti mikrosomų membranas, kai jo koncentracija didesnė nei 2.0 mM [39].
1.4.5 OSJ biologinis prieinamumas
Norint įvertinti aliino biologinį prieinamumą atlikta įvairių bandymų su gyvūnais. Vieno mokslinio tyrimo metu buvo analizuojami pelių modeliai – kiekvienai laboratorinei pelei buvo skiriama 10 mg aliino per os [6]. Analizės metu aliino rasta skrandyje (7,2%), žarnyne (22,4%) ir kepenyse (2,5%), jo skilimo produktų nenustatyta, todėl biologinis prieinamumas buvo laikytas dideliu [6]. Kito tyrimo su gyvūnais rezultatai parodė, jog aliino prieinamumas buvo 16,5% praėjus 4 valandoms, kai buvo suvartota 60 mg/kg aliino per os [6]. Atliekant farmakokinetinius tyrimus su laboratorinėmis žiurkėmis nustatyta, kad aliino absorbcija buvo 60-70% ribose [6]. Skirtingų analizių metu tiosulfinatų (tarp jų ir alicino) nenustatyta, kadangi skrandyje alinazė būtų negrįžtamai slopinama dėl rūgštinių sąlygų ir tiosulfinatai negalėtų susidaryti [40].
Tiriant vandenyje tirpius OSJ žmogaus šlapime po česnakų svogūnų skiltelių suvartojimo buvo nustatyti GLUAlCs metabolitai [41]. Taip pat buvo pastebėta, jog vartojant brandintą česnakų ekstraktą padidėjo SAC koncentracijos plazmoje [41]. SAC taip pat yra nustatomas gyvūnų, kuriems skiriamas SAC, plazmoje, kepenyse ir inkstuose [41].
1.5 Metodai, taikomi OSJ kokybinėje ir kiekybinėje analizėje
Dažniausiai česnakų biologiškai aktyvių OSJ analizei taikoma ESC, dujų chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodai bei biosensoriai [13,42].
Populiariausias iš jų – ESC su ultravioletinės šviesos (UV) detektoriumi, tačiau tyrimai atliekami ir su fotodiodų matricos detektoriumi [13]. Analizėms naudojama tiek normaliųjų fazių, tiek atvirkštinių fazių ESC [13]. Įvairių cheminių tyrimų metu nustatyta, jog ESC yra tinkamas metodas tiek alicino, tiek aliino nustatymui ir matavimui [43]. Taikant ESC galima atskirti kelis mišinyje esančius junginius vienu metu, juos identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti [44,45]. Šio metodo privalumai – greitas ir efektyvus junginių atskyrimas, jautrumas ir pakankamai trumpas mėginių analizės laikas. [45].
Įprastai norint tiksliau atskirti OSJ nuo kitų medžiagų, taikoma prieškolonėlinė derivatizacija arba jonų porų reagentas (pavyzdžiui, natrio heptansulfonatas) [46]. Kai etaloniniai (standartiniai) junginiai negali būti naudojami analizės metu, kartu su ESC yra taikoma UV, elektrocheminė detekcija arba masių spektrometrija [47].
Organiniai ir neorganiniai anijonai dėl savo prigimties negali tinkamai sąveikauti su oktadecil (C18) silikageliu (SiO2), kuris įprastai naudojamas kolonėlėje kaip stacionari fazė [45]. Esant žemoms
pH vertėms pasireiškia joninė OSJ prigimtis, todėl vienas iš efektyviausių būdų juos atskirti – atvirkštinių fazių jonų porų ESC [47]. Analizės metu kaip judrioji fazė taikomas vandeninis-organinis mišinys, kurio sudėtyje yra jonus poruojanti medžiaga [45].
Bene didžiausiais ESC metodo trūkumas nustatant veikliuosius valgomųjų česnakų junginius – tai nepakankama skiriamoji geba, kuri apriboja galimybes identifikuoti aliino pėdsakus mėginiuose arba antraeilius aliino analogus [46]. Taip pat taikant ESC junginių smailės gali likti nepastebėtos dėl galimų sulaikymo laiko pakitimų, todėl didėja tikimybė, kad junginiai liks neidentifikuoti [46]. Naudojant ESC gali likti nenustatyti ir junginiai turintys mažą UV absorbcijos spektrą [46]. Kiekybiškai ESC metodu vertinant OSJ, kai valgomųjų česnakų produktai yra derinami su kitais biologiškai aktyviais junginiais, taip pat gali kilti sunkumų arba netikslumų gaunant rezultatus, kadangi kiti produkte esantys junginiai gali sukelti trukdžių [16].
Pastaraisiais metais stengiamasi plėtoti dar efektyvesnius, greitesnius ir pigesnius metodus, kuriuos taikant būtų galima atlikti OSJ analizę – vis dažniau taikoma ultraefektyvioji skysčių chromatografija, kuri pasižymi didesne geba nei įprasta ESC [46].
Dažnai česnakuose esančių tiosulfinatų skilimo produktų (disulfidų, trisulfidų ir vinilditiinų) nustatymui yra taikoma dujų chromatografija su masių spektrofotometrija [14,16]. Šis būdas turi savo privalumų: pasižymi dideliu jautrumu ir gebėjimu atskirti junginius [46]. Visgi metodas yra vykdomas
aplinkos temperatūroje, todėl yra netinkamas termiškai nestabilių junginių, tokių kaip alicinas, nustatymui, jį taikant galimi klaidingi rezultatai [14,16].
Taip pat sunku išvystyti ir dujų chromatografijos metodą, kuriuo būtų galima nustatyti aliino, SAC ir GLUAlCs kiekį, kadangi šie junginiai negali būti išgarinami normaliomis sąlygomis neatliekant mėginių derivatizacijos [16].
Kiekybiniui OSJ nustatymui taikomi metodai gali būti klasifikuojami į netiesioginius ir tiesioginius [46]. Taikant netiesioginius analizės būdus nustatomi tiosulfinatų skilimo produktai (piruvatas ar amoniakas), tačiau šie metodai nepadeda nustatyti konkrečių tiosulfinatų ar jų kiekio, esančio mėginyje [46]. Pavyzdžiui, plonasluoksnės chromatografijos metu lengva identifikuoti piruvo rūgštį (aliino skilimo produktą), kuri yra laikoma netiesioginiu bendrojo tiosulfinatų kiekio rodikliu, tačiau toks būdas turi mažai specifiškumo, jį taikant neįmanoma nustatyti atskiro konkretaus junginio [48].
Tiesioginiai metodai leidžia nustatyti OSJ dar prieš įvykstant fermentiniui suskaidymui [46]. ESC yra priskiriamas tiesioginiams metodams, todėl yra pranašesnis lyginant su kitomis chromatografijos rūšimis, taikomas žymiai dažniau ir buvo panaudotas šios analizės metu [46].
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Šio tyrimo metu naudoti įvairiose EU šalyse ir Šveicarijoje pagaminti 7 maisto papildai, kurie savo sudėtyje turi sausojo česnakų ekstrakto. 5 iš šių papildų yra notifikuoti Lietuvoje ir jų buvo įsigyta skirtingose Lietuvos vaistinėse, 2 maisto papildai notifikuoti Lenkijoje ir buvo pirkti Lenkijos vaistinėse 2016 - 2017 metais. Tyrimo metu buvo analizuoti šie maisto papildai: Rami širdis (Lietuva), Sveikas kaip ridikas (Lietuva), Cardoval (Šveicarija), Folkepillen (Švedija), Czosnek (Italija), Garlicin (Lenkija), Cardiorelax (ES).
2.1.1 Tirtų maisto papildų sudėtis
Maisto papildų sudėtis yra pateikiama atsitiktine tvarka (nepriklausomai nuo gamintojo):
Maisto papildas Nr. 1. Sudėtis: Crataegus vaisių ekstraktas, magnio oksidas, Allium sativum ekstraktas, emulsiklis mikrokristalinė celiuliozė, Camellia sinesis lapų ekstraktas, lipnumą reguliuojančios medžiagos silicio dioksidas ir riebalų rūgščių magnio druskos, vitaminai B6 ir B1.
Maisto papildas Nr. 2. Sudėtis: magnio oksidas, Crataegus oxyacantha L. vaisių sausasis ekstraktas, želatina, Allium sativum L. sausasis ekstraktas, Valleriana officinalis L. šaknų sausasis ekstraktas, Leonurus cardiaca L. žolių sausasis ekstraktas, lipnumą reguliuojančios medžiagos (celiuliozė, silicio dioksidas, riebalų rūgščių magnio druskos), dažikliai (geležies oksidas ir titano dioksidas), piridoksino hidrochloridas, pteroilmonoglutamo rūgštis, cianokobalaminas.
Maisto papildas Nr. 3. Sudėtis: Allium sativum L. sausasis ekstraktas, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių magnio druskos.
Maisto papildas Nr. 4. Sudėtis: omega-3 milteliai (kukurūzų krakmolas, žuvų taukai (18% EPR (eikozapentaeno rūgšties) ir 12% DHR (dokozaheksaeno rūgšties), vanduo, antioksidantai: tokoferolių koncentruotas ekstraktas, askorbo rūgšties riebalų rūgščių esteriai, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis), raudonosiomis mielėmis fermentuotų ryžių milteliai, želatina, Passiflora incarnata žiedų sausasis ekstraktas, geležies bisglicinatas, cinko gliukonatas,
Allium sativum svogūnėlių sausasis ekstraktas, Crataegus pinnatifida lapų sausasis ekstraktas, Humulus lupulus žiedų sausasis ekstraktas, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, L-askorbo rūgštis
geležies oksidas ir titano dioksidas, pteroilmonoglutamo rūgštis (folio r.), cianokobalaminas (vit.B12).
Maisto papildas Nr. 5. Sudėtis: kalcio karbonatas, dikalcio fosfatas, mikrokristalinė celiuliozė, magnio oksidas, Allium sativum L. ekstr., L-askorbo rūgštis, Citrus aurantium L. vaisių ekstr.,
Curcuma longa L. šakniastiebių ekstr., skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, Urtica dioica L. lapų ekstr., Vaccinium myrtillus L. uogų ekstr., Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.
vaisių ekstr., Equisetum arvense L. žolės ekstr., Trigonella feonum-graecum L. sėklų ekstr., DL-alfa-tokoferilacetatas, cinko oksidas, Oxycoccus macrocarpus (Ait.) Pers. uogų ekstr., geležies fumaratas, riebalų rūgščių magnio druskos, Zingiber officinale Rosco šakniastiebių ekstr.,
Capsicum annuum L. vaisių ekstr., Cucurbita pepo L. sėklų ekstr., nikotinamidas, Vitis vinifera L.
sėklų ekstr., hidroksipropilmetilceliuliozė, natrio selenitas, retinilo acetatas, mangano sulfatas, vario sulfatas, kalcio D-pantotenatas, piridoksino hidrochloridas, cianokobalaminas, riboflavinas, cholekalciferolis, chromo (III) chloridas, pteroilmonoglutamo rūgštis, kalio jodidas, tiamino mononitratas, D-biotinas.
Maisto papildas Nr. 6. Sudėtis: Sausasis Allium sativum L., ekstraktas, lipnumą reguliuojanti medžiaga magnio stearatas.
Maisto papildas Nr. 7. Sudėtis: Rhodiola rosea L. šaknų sausasis ekstraktas, Eleutherococcus
senticosus Rupr. Et Maxim šaknų sausasis ekstraktas, želatina, Echinacea purpurea L. sausasis
ekstraktas, lipnumą reguliuojanti medžiaga celiuliozė, Allium sativum L. sausasis ekstraktas, L-askorbo rūgštis, DL-alfa-tokoferilacetatas, magnio stearatas, dažikliai geležies oksidas ir titano dioksidas, folio rūgštis.
2.2 Tyrimo metu naudota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
2.2.1 Cheminiai reagentai
Visų tyrimo metu naudotų tirpiklių, standartų ir reagentų kokybė atitiko jiems keliamus kokybės reikalavimus ir buvo analitinio švarumo. Buvo panaudoti šie reagentai:
Standartizuotas (±)-L-aliinas (≥90%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
Metanolis (99,9%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
Skruzdžių rūgštis (≥96,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
Natrio - divandenilio fosfato dihidratas (≥99,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
Acetonitrilas (99,8%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
85% fosforo rūgštis (99,99%, Sigma-Aldrich, Vokietija)
Išgrynintas vanduo (paruoštas naudojant vandens gryninimo sistemą ,,Millipore“ (JAV).
2.2.2 Aparatūra
Tyrimo metu buvo naudojamas chromatografas Waters 2695 (Waters Corporation, Milford, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (Waters Corporation, Milford, JAV). Detekcija atlikta bangų ilgiui esant 210 – 400 nm intervale. OSJ atskyrimui buvo panaudota YMC-Triart C18
kolonėlė, kurios ilgis 150 mm, vidinis skersmuo 3,0 mm, sorbentų dalelių dydis 3 μm. Duomenims apdoroti naudota programinė įranga Empower Chromatography Data Software.
2.2.3 Tyrimo sąlygos
Tyrimo sąlygos buvo parinktos remiantis ankstesnės analizės metu naudota ir validuota metodika [17]. Tyrimo metu buvo taikyta dviejų eliuentų (A ir B) gradientinė sistema. Tirpiklį A sudarė natrio-divandenilio fosfato dihidratas (10 mM, 1,56 g) ir 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska (5 mM, 1,1 g) (pH 2,1, gautas naudojant fosforo rūgštį). Tirpiklį B sudarė acetonitrilas, natrio-divandenilio fosfato dihidratas (10 mM, 1,56 g) ir 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska (5 mM, 1,1 g) (50:50, V/V, pH 2,1).
Termostate palaikyta pastovi 38 °C temperatūra. Analizėje naudotas injekcijos tūris – 10 μl. Mobilios fazės tekėjimo greitis – 0,4 ml/min. Detekcijai naudotas 208 nm UV šviesos bangos ilgis. Vieno mėginio analizės trukmė – 30 minučių.
2.2.4 Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloninis tirpalas buvo paruoštas iš standartizuoto (±)-L-aliino (≥90%): buvo pasverta 4,1 mg miltelių, kurie suberti į 10 ml matavimo kolbą ir ištirpinti 5 ml metanolio. Atlikta filtracija per PVDF (0,45 μm) filtrą ir gautas 0,82 mg/ml koncentracijos tirpalas, kuris buvo laikomas šaldytuve.
2.2.5 Mėginių paruošimas analizei
Tiriamieji tirpalai buvo paruošti vykdant literatūroje aprašytą ir ankstesnių tyrimų metu atliktą ekstrakciją [17,47]. Kiekvieno maisto papildo analizei buvo ruošiami du tiriamieji tirpalai: slopinant fermentą alinazę ir aktyvinant alinazę. Mėginių paruošimui naudoti MP kiekiai (priklausomai nuo jose esančio ekstrakto kiekio): 8 kapsulės MP1, 5 kapsulės MP2, 3 kapsulės MP3, 6 kapsulės MP4, 3 tabletės MP5, 3 kapsulės MP6, 8 kapsulės MP7.
Mėginių (MP1-MP7_S) paruošimas fermentą alinazę slopinančiomis sąlygomis: į grūstuvę suberiamas pasirinktas MP kiekis, turinys susmulkinamas. Nustatoma bendra turinio masė, kuri perkeliama į analitinę 20 ml tūrio kolbutę ir ekstrahuojama 10 ml metanolio-vandens (80:20, V/V) + 3 ml 5% skruzdžių rūgšties (norint pasiekti pH <3) tirpalu ne mažiau nei parą laiko kambario temperatūroje. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. Gautas centrifugatas praskiestas santykiu 1:5, maišytas 5 min. ultragarso vonelėje, filtruotas per membraninius 0,45 μm porų skersmens PVDF filtrus ir panaudotas chromatografinei analizei.
Mėginių (MP1-MP7_A) paruošimas fermentą alinazę aktyvinančiomis sąlygomis: į grūstuvę suberiamas pasirinktas MP kiekis, turinys susmulkinamas. Nustatoma bendra turinio masė, kuri perkeliama į analitinę 20 ml tūrio kolbutę ir ekstrahuojama 10 ml išgryninto vandens (pH 6-8) tirpalu ne mažiau nei parą laiko kambario temperatūroje. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. Gautas centrifugatas praskiestas santykiu 1:5, maišytas 5 min. ultragarso vonelėje, filtruotas per membraninius 0,45 μm porų skersmens PVDF filtrus ir panaudotas chromatografinei analizei.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Analizė buvo atlikta siekiant įvertinti kokybinę ir kiekybinę maisto papildų, turinčių valgomųjų česnakų sausųjų ekstraktų, sudėtį. Tyrimų metu buvo naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, validuota ankstesnės analizės metu pagal šiuos parametrus - specifiškumą, tiesiškumą, pakartojamumą, atkartojamumą, aptikimo ribą, nustatymo ribą, remiantis šia metodika parinktos chromatografinės sąlygos [17]. Tyrimo metu buvo analizuojami 7 skirtingi maisto papildai. Analizei iš vieno maisto papildo buvo paruošti 2 mėginiai – slopinant fermentą alinazę ir jį aktyvinant. Slopinant alinazę ekstrakcijai buvo naudojamas metanolio, išgryninto vandens ir skruzdžių rūgšties mišinys, aktyvinant – išgrynintas vanduo. Tyrimui iš viso paruošta 12 tirpalų. Tirpalų chromatografavimas buvo atliekamas tokia tvarka: MP1_S, MP2_S, MP3_S, MP4_S, MP5_S, MP6_S, MP7_S, MP1_A, MP2_A, MP3_A, MP4_A, MP5_A, MP6_A ir MP7_A. Tiriamieji tirpalai buvo analizuojami po du kartus.
3.1 Maisto papildų, turinčių valgomųjų česnakų sausųjų ekstraktų, kokybinis
įvertinimas
Eksperimentinių tyrimų metu identifikuoti 6 junginiai (1 lentelė):
1 lentelė. Organiniai sieros junginiai, identifikuoti mėginiuose
Slopinant alinazę: Aktyvinant alinazę: 1. (-)-L-aliinas 2. S-alil-L-cisteinas (SAC) 3. γ-glutamil-S-alil-L-cisteinas (GLUAlCs) 4. γ-glutamil-S-(trans-1-propenil)-L-cisteinas (GLUPeCs), 5. γ-glutamilfenilalaninas (GLUPheAla) 1. S-alil-L-cisteinas (SAC) 2. γ-glutamil-S-alil-L-cisteinas (GLUAlCs) 3. γ-glutamil-S-(trans-1-propenil)-L-cisteinas (GLUPeCs) 4. γ-glutamilfenilalaninas (GLUPheAla) 5. Alicinas (dialiltiosulfinatas)
(-)-L-aliinas identifikuotas lyginant (-)-L-aliino standartinio tirpalo ir tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikus ir UV šviesos absorbcijos spektrus. SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla ir alicinas buvo identifikuoti pagal jų chromatografinį profilį ir UV šviesos absorbcijos spektrus, aprašytus literatūroje [47,49].
Trečiojo maisto papildo (MP3_S ir MP3_A) chromatogramose pateiktos nustatytų OSJ smailės (5 ir 6 paveikslai). Šio MP mėginiuose buvo identifikuoti 6 junginiai. Nustatytiems junginiams būdingi tokie sulaikymo laikai:
Slopinant alinazę: Aktyvinant alinazę:
(-)-L-aliinas - 9,688 min. SAC - 13,666 min. GLUAlCs - 16,340 min. GLUPeCs - 18,049 min. GLUPheAla - 19,115 min. SAC - 13,618 min. GLUAlCs - 16,274 min. GLUPeCs - 17,981 min. GLUPheAla - 19,039 min. Alicinas - 22,311 min.
5 pav. MP3_S chromatograma (slopinant fermentą alinazę)
6 pav. MP3_A chromatograma (aktyvinant fermentą alinazę)
7 ir 8 paveiksluose pateiktos šeštojo maisto papildo (MP6_S ir MP6_A) chromatogramos ir identifikuotų junginių smailės. Šio MP mėginiuose taip pat buvo identifikuoti 6 junginiai, kuriems būdingi tokie sulaikymo laikai:
Slopinant alinazę: Aktyvinant alinazę: (-)-L-aliinas - 9,687 min. SAC - 13,718 min. GLUAlCs - 16,353 min. GLUPeCs - 18,061 min. GLUPheAla - 19,123 min. SAC - 13,660 min. GLUAlCs - 16,288 min. GLUPeCs - 18,002 min. GLUPheAla - 19,062 min. Alicinas - 22,339 min.
7 pav. MP6_S chromatograma (slopinant fermentą alinazę)
8 pav. MP6_A chromatograma (aktyvinant fermentą alinazę)
Iš 7 tirtų maisto papildų, (-)-L-aliinas buvo nustatytas 2 maisto papildų (MP3 ir MP6) mėginiuose fermentą alinazę slopinančiomis sąlygomis ir jo kiekis viršijo aptikimo ribą, kuri yra 0,275 μg/ml. Šie maisto papildai atitiko kokybinės analizės parametrus, nes jų mėginiuose nustatyto (-)-L-aliino sulaikymo laikai ir UV šviesos absorbcijos spektrai atitiko (-)-L-(-)-L-aliino standartinio tirpalo sulaikymo laiką ir spektrą. Šiuose maisto papilduose taip pat buvo identifikuoti GLUAlCs, GLUPeCs ir GLUPheAla, SAC ir alicinas.
Pagal šiuos rezultatus būtų galima kelti kelias hipotezes: trečiajame ir šeštajame maisto papilduose yra grynas, kokybės reikalavimus atitinkantis valgomųjų česnakų ekstraktas, arba atsižvelgiant į šių maistų papildų sudėtį (juose yra tik sausieji valgomųjų česnakų ekstraktai su pagalbinėmis medžiagomis – sudėtyje nėra kitų vaistinių augalų ekstraktų) ir naudojant šią metodiką valgomųjų česnakų biologiškai aktyvūs junginiai yra geriausiai identifikuojami, kai maisto papildo sudėtyje nėra kitų vaistinių augalų ar jų biologiškai aktyvių medžiagų.
Penktojo maisto papildo mėginyje (MP5) buvo identifikuoti 3 junginiai: GLUAlCs, GLUPeCs ir GLUPheAla. 9 ir 10 paveiksluose pateiktos šio mėginio chromatogramos ir nustatytų junginių smailės. Identifikuotiems junginiams būdingi tokie sulaikymo laikai:
Slopinant alinazę: Aktyvinant alinazę:
GLUAlCs - 16,279 min. GLUPeCs - 18,092 min. GLUPheAla - 19,102 min. GLUAlCs – 16,384 min. GLUPeCs - 17,998 min. GLUPheAla - 19,007 min.
9 pav. MP5_S chromatograma (slopinant fermentą alinazę)
10 pav. MP5_A chromatograma (aktyvinant fermentą alinazę)
Pirmojo maisto papildo mėginiuose (MP1_S ir MP1_A) buvo identifikuotas GLUPeCs, tai matoma 11 ir 12 paveiksluose pateiktoje chromatogramose. Slopinant alinazę šiam junginiui būdingas sulaikymo laikas – 18,002 min, aktyvinant – 17,989 min.
Pirmojo maisto papildo mėginiuose buvo nustatytas 1 biologiškai aktyvus junginys, o penktojo – 3. Atsižvelgiant į tokius rezultatus būtų galima daryti keletą prielaidų: jog šių maisto papildų sudėtyje esančio valgomųjų česnakų ekstrakto kiekiai galimai yra maži, todėl sunku identifikuoti daugiau biologiškai aktyvių medžiagų, arba kitų maisto papildų biologiškai aktyvių medžiagų (kadangi maisto papildai yra sudėtiniai) chromatografiniai profiliai trukdo tiksliai identifikuoti valgomiesiems česnakams būdingus junginius.
11 pav.MP1_S chromatograma (slopinant fermentą alinazę)
12 pav. MP1_A chromatograma (slopinant fermentą alinazę)
Antrojo (MP2_S ir MP2_A), ketvirtojo (MP4_S ir MP4_A) ir septintojo (MP7_S ir MP7_A) maisto papildų mėginiai neturėjo atitinkamo chromatografinio profilio. Kaip pavyzdys pateikta 13 paveiksle pateikta MP2_S chromatograma. Lyginant su 5 ir 7 pav. pavaizduotomis chromatogramomis pastebėta, jog smailės šiuose chromatogramose yra skirtingos.
Kadangi pritaikius šią analizės metodiką valgomųjų česnakų sudėtyje esančių junginių identifikuota nebuvo, tokius rezultatus galėjo nulemti skirtingos priežastys: šiuose maisto papilduose galimai yra labai maži sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto kiekiai, todėl junginius sunku nustatyti, arba maisto papildų sudėtyje nėra valgomųjų česnakų ekstrakto. Dar viena iš galimų priežasčių – šių maisto papildų kompleksiškumas, dėl kurio gautos chromatogramos galėtų būti netikslios, galimi persidengimai chromatogramose ir sunkumai identifikuojant konkrečius junginius. Kita galima priežastis – klaidos ruošiant tiriamuosius mėginius, kurios galėtų lemti klaidingus rezultatus.
13 pav. Chromatogramos, neturinčios atitinkamo chromatografinio profilio, pavyzdys: MP2_S (slopinant fermentą alinazę)
3.2 Maisto papildų, turinčių valgomųjų česnakų sausųjų ekstraktų, kiekybinis
įvertinimas
Kiekybiškai vertinami buvo keturių maisto papildų (MP1, MP3, MP5 ir MP6) mėginiuose identifikuoti junginiai. Šio vertinimo metu buvo panaudota ankstesnio tyrimo metu gauta kalibracinė kreivė, (-)-L-aliino kiekis tiriamuosiuose mėginiuose buvo apskaičiuotas pagal kalibracinės kreivės lygtį: y = 2,08*107
x - 6,24*104, kai y – smailės plotas, x – ieškomos medžiagos kiekis [17]. Kitų identifikuotų junginių kiekis buvo išskaičiuotas pagal (-)-L-aliiną. Tyrimo metu buvo vertinami 4 maisto papildai.
Kokybinio įvertinimo metu dviejuose maisto papilduose (MP3 ir MP6) (-)-L-aliinas buvo identifikuotas tik fermentą alinazę slopinančiomis sąlygomis. Atlikus kiekybinę analizę MP3 sausajame valgomųjų česnakų ekstrakte (-)-L-aliino buvo nustatyta 28,510±0,01 mg/g, MP6 sudėtyje – 12,630±0,02 mg/g. Gauti rezultatai pateikti 14 paveiksle pavaizduotoje diagramoje.
Alicinas MP3 ir MP6 sudėtyje buvo identifikuotas tik alinazę aktyvuojančiomis sąlygomis. Abiejuose mėginiuose nustatyti alicino kiekiai mažesni nei (-)-L-aliino: MP3 ekstrakte nustatyta 5,501±0,02 mg/g, o MP6 – 1,835±0,02 mg/g alicino (14 pav.).
14 pav. (-)-L-aliino ir alicino kiekiai, nustatyti 1 grame sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, esančio MP3 ir MP6 sudėtyje
MP3 ir MP6 esančiuose ekstraktuose taip pat buvo identifikuotas SAC tiek slopinant, tiek aktyvinant alinazę. Slopinant alinazę MP3 sudėtyje nustatytas SAC kiekis 7,860±0,02 mg/g, maisto MP6 – 4,350±0,02 mg/g. Aktyvinant alinazę nustatyti mažesni SAC kiekiai: MP3 ekstrakte 3,490±0,01 mg/g, o MP6 – 2,335±0,03 mg/g (15 pav.).
15 pav. SAC kiekiai, nustatyti 1 grame sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, esančio MP3 ir MP6 sudėtyje
GLUAlCs buvo kiekybiškai vertinamas 3 maisto papildų (MP3, MP5, MP6) sudėtyje esančiuose valgomųjų česnakų ekstraktuose. Slopinant alinazę didžiausias kiekis GLUAlCs nustatytas MP3 sudėtyje – 33,335±0,02 mg/g, mažiausias – 8,305±0,03 mg/g MP5. MP6 esančiame ekstrakte GLUAlCs buvo nustatyta 19,855±0,02 mg/g. Aktyvinant alinazę buvo gauti analogiški rezultatai –
0 5 10 15 20 25 30 MP3 MP6 mg /g (-)-L-Aliinas Alicinas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MP3 MP6 mg /g SAC (slopinant alinazę) SAC (aktyvinant alinazę)
MP3 ekstrakte nustatyta 33,948±0,02 mg/g GLUAlCs, MP5 – 13,375±0,01 mg/g, o MP6 – 18,115±0,03 mg/g. Šie rezultatai palyginti 16 paveiksle pateiktoje diagramoje.
16 pav. GLUAlCs kiekiai, nustatyti 1 grame sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, esančio MP3, MP5 ir MP6 sudėtyje
GLUPheAla taip pat buvo kiekybiškai vertinimas MP3, MP5, MP6 ekstraktuose. Slopinant alinazę didžiausiais kiekis GLUPheAla (28,965±0,01 mg/g) nustatytas MP3 sudėtyje, MP5 nustatyta 19,605±0,03 mg/g, o mažiausias kiekis (11,685±0,03 mg/g) rastas MP6 valgomųjų česnakų ekstrakte. Analogiškai rezultatai ir aktyvinant alinazę – MP3 GLUPheAla nustatyta 29,745±0,02 mg/g ekstrakto, MP5 – 13,180±0,02 mg/g, MP6 – 11,065±0,02 mg/g (17 pav.).
17 pav. GLUPheAla kiekis, nustatytas 1 grame sausojo valgomųjų česnakų, esančio MP3, MP5 ir MP6 sudėtyje
GLUPeCs buvo kiekybiškai nustatytas 4 maisto papilduose (MP1, MP3, MP5, MP6) esančiuose ekstraktuose. Slopinant alinazę GLUPeCs daugiausiai nustatyta MP1 sausajame ekstrakte – 25,015±0,03 mg/g, mažiausiai MP5 ekstrakte – 9,21±0,03 mg/g. MP3 GLUPeCs buvo nustatyta
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Slopinant alinazę Aktyvinant alinazę
mg /g MP3 MP5 MP6 0 5 10 15 20 25 30 35
Slopinant alinazę Aktyvinant alinazę
mg
/g MP3
MP5 MP6
11,645±0,04 mg/g, MP6 – 9,945±0,02 mg/g. Aktyvinant alinazę didžiausias GLUPeCs kiekis taip pat buvo nustatytas MP1 ekstrakte – 24,499±0,03 mg/g, tačiau mažiausias kiekis (9,435±0,02 mg/g) MP6 sudėtyje esančiame sausajame ekstrakte. MP3 GLUPeCs nustatyta 11,730±0,02 mg/g, MP5 – 9,637±0,04 mg/g. Gauti rezultatai pavaizduoti 18 paveiksle esančioje diagramoje.
18 pav. GLUPeCs kiekis, nustatytas 1 grame sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, esančio MP1, MP3, MP5 ir MP6 sudėtyje
Kiekybiškai įvertinus (-)-L-aliino, SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla ir alicino kiekius maisto papilduose esančiuose ekstraktuose buvo apskaičiuotas bendras OSJ kiekis 1 grame ekstrakto slopinant ir aktyvinant alinazę. Slopinant alinazę MP1 nustatyta 25,015±0,01 mg/g, MP3 – 110,315±0,03 mg/g, MP5 – 37,120±0,02 mg/g, o MP6 – 58,465±0,01 mg/g. Aktyvinant alinazę MP1 nustatyta 24,499±0,01 mg/g, MP3 – 84,414±0,03 mg/g, MP5 – 36,185±0,01 mg/g, o MP6 – 42,785±0,04 mg/g. Gauti kiekiai pavaizduoti 19 paveiksle pateiktoje diagramoje.
Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog didžiausi OSJ kiekiai nustatyti MP3 sudėtyje esančiame valgomųjų česnakų ekstrakte, o mažiausi – MP1 sudėtyje. Taip pat didesni kiekiai biologiškai aktyvių medžiagų visuose vertintuose papilduose nustatyti fermentą alinazę slopinančiomis sąlygomis.
Lyginant gautus rezultatus su anksčiau vykdyta analize, kurioje buvo vertinamas OSJ kiekis, esantis maisto papilduose, turinčiuose valgomųjų česnakų miltelių, galima pastebėti, jog MP3 ir MP6 nustatyti didesni OSJ kiekiai negu maisto papilduose su česnakų milteliais (juose nustatyta apie 35-40 mg/g OSJ tiek slopinant, tiek aktyvinant alinazę) [17].
MP3 ir MP6 sudėtyje nustatyti OSJ kiekiai taip pat didesni negu 1 grame šviežios valgomųjų česnakų svogūnų žaliavos (apie 13-17 mg/g) [17]. Remiantis tokiais rezultatais būtų galima daryti prielaidą, jog vartojant maisto papildus, turinčius valgomųjų česnakų sausojo ekstrakto, atitinkančio
0 5 10 15 20 25 30 MP1 MP3 MP5 MP6 mg /g Slopinant alinazę Aktyvinant alinazę
kokybės reikalavimus (MP3 ir MP6 mėginiai atitiko chromatografinius profilius), būtų gaunama didesnė koncentracija OSJ negu vartojant tokį patį kiekį česnakų miltelių arba šviežios žaliavos.
19 pav. Bendras OSJ kiekis, nustatytas 1 grame sausojo valgomųjų česnakų ekstraktuose, esančio maisto papildų sudėtyje
Remiantis gautais rezultatais palygintas konkrečių biologiškai aktyvių medžiagų kiekis, gamintojų deklaruojamas ant MP3 ir MP6 pakuotės ir nustatytas šia ESC metodika maisto papildų mėginiuose.
Kitų maisto papildų gamintojai nenurodė aliino ar kitų OSJ kiekio ant pakuotės, todėl gautų rezultatų palyginti neįmanoma.
MP3 gamintojai teigia, jog 1 kapsulėje yra 200 mg sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, kuriame turėtų būti apie 4 mg alicino, 7 mg aliino ir 7 mg GLUAlCs. Vienoje kapsulėje MP3 nustatyti tokie OSJ kiekiai:
Slopinant alinazę: Aktyvinant alinazę:
(-)-L-aliinas - 5,702±0,02 mg.
GLUAlCs - 6,667±0,03 mg.
GLUAlCs - 6,790±0,01 mg.
Alicinas - 1,100±0,05 mg
Taigi vienoje MP3 kapsulėje nustatyti aliino ir alicino kiekiai yra ženkliai mažesni negu nurodyta ant pakuotės, o GLUAlCs kiekis atitinka 95,24% (slopinant alinazę) ir 97% (aktyvinant alinazę) nurodytos reikšmės. Visgi palyginus šiuos kiekius su anksčiau atliktu tyrimu, kuriame buvo kiekybiškai įvertinti maisto papildai, turintys česnakų miltelių [17], pastebėta, kad aliino ir GLUAlCs kiekiai identifikuoti 1 MP3 kapsulėje yra didesni nei 1 kapsulėje arba tabletėje maisto papildo, turinčio česnakų miltelių.
MP6 gamintojai teigia, jog 3 kapsulėse papildo yra 1,21 g valgomųjų česnakų ekstrakto, kuriame – apie 5,5 mg alicino. Atliktus kiekybinę šio MP analizę, 3 kapsulėse nustatytas alicino kiekis
0 20 40 60 80 100 120 MP1 MP3 MP5 MP6 B endra s kiekis (mg /g )
– 2,202 mg aktyvinant alinazę. Alicino kiekis, nustatytas MP6 kapsulėse, yra apie 2,5 karto mažesnis negu nurodyta ant pakuotės. Svarbu atkreipti dėmesį ir į tai, jog alicino kiekiai nustatyti tiek MP3, tiek MP6 mažesni lyginant su maisto papildais, turinčiais česnakų miltelių [17].
2009 m. JAV buvo atliktas tyrimas, kuriame buvo nustatomas (-)-L-aliino kiekis šviežioje valgomų česnakų skiltelių žaliavoje ir tabletėse su česnakų milteliais taikant atvirkštinių fazių ESC metodą [15]. Tyrimo metu buvo nustatyti tokie aliino kiekiai: 0.361 mg/g ir 0.049 mg/g skirtinguose maisto papilduose [15].
Remiantis kitu 2008 m. JAV atliktu tyrimu, kurio metu buvo analizuojami maisto papildai, nustatyta, jog MP, turinčio česnakų miltelių, sudėtyje buvo 5.2 ± 0.3 mg/g alicino ir 3.3 ± 1.2 mg/g GLUAlCs, o MP, turinčio brandinto česnakų ekstrakto: 0.60 ± 0.11 mg/g SAC ir GLUAlCs 0.82 ± 1.0 mg/g [50].
Šie tyrimai taip pat įrodo, jog sausuose valgomųjų česnakų ekstraktuose įvertinami didesni bendri identifikuotų OSJ kiekiai nei maisto papilduose, į kurių sudėtį įeiną milteliai, išskyrus aliciną, kurio milteliuose nustatoma daugiau.
Taip pat vertinant tiek kokybinius, tiek kiekybinius rezultatus, gautus taikant šią ESC metodiką, reiktų atsižvelgti, jog skirtingi maisto papildų gamintojai naudojo kitokiomis sąlygomis laikomą ir apdorojamą valgomųjų česnakų skiltelių žaliavą, taip pat galėjo skirtis ir sausųjų ekstraktų gamyba. Tai galėtų būti dar viena iš galimų priežasčių, lemianti skirtingus identifikuotus OSJ ar jų kiekius.
4. IŠVADOS
1. Taikant validuotą ESC metodiką maisto papilduose, turinčiuose sausojo valgomųjų česnakų ekstrakto, buvo identifikuoti šie junginiai: (-)-L-aliinas, SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla slopinant fermentą alinazę ir SAC, GLUAlCs, GLUPeCs, GLUPheAla ir alicinas aktyvinant alinazę.
2. Iš 7 pasirinktų maisto papildų tik 2 (MP3 ir MP6) turėjo atitinkamą chromatografinį profilį. 3. Didžiausias kiekis organinių sieros junginių slopinant (110,315 mg/g) ir aktyvinant (84,414
mg/g) alinazę nustatytas MP3 sudėtyje. MP3, MP5 ir MP6 ekstraktuose slopinant alinazę nustatytas didžiausias (-)-L-aliino (12,630-28,510 mg/g) ir GLUAlCs (8,305-33,335mg/g) kiekis, mažiausias – SAC (4,350-7,860 mg/g). Aktyvinant alinazę nustatytas didžiausias GLUAlCs (33,948-13,375 mg/g) ir GLUPheAla (11,065-29,745 mg/g) kiekis, mažiausias – SAC (2,335-3,490 mg/g) ir alicino (1,835-5,501 mg/g).
4. Nustatyti alicino ir aliino kiekiai neatitinka maisto papildų (MP3 ir MP6) gamintojų deklaruojamų kiekių ant pakuotės. GLUAlCs kiekis atitinka 95,24% (slopinant alinazę) ir 97% (aktyvinant alinazę) ant MP3 nurodytos reikšmės.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Pritaikius šią efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ir remiantis atliktos pasirinktų maisto papildų kokybinės ir kiekybinės analizės rezultatais, siekiant suvartoti didesnius biologiškai aktyvių organinių sieros junginių kiekius, siūloma rinktis vienkomponenčius maisto papildus su sausuoju valgomųjų česnakų ekstraktu.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Di Lorenzo C, Ceschi A, Kupferschmidt H, Lüde S, De Souza Nascimento E, Dos Santos A, et al. Adverse effects of plant food supplements and botanical preparations: a systematic review with critical evaluation of causality. Br J Clin Pharmacol, Wiley/Blackwell. 2015;79(4):578–92.
2. Ekor M. The growing use of herbal medicines: issues relating to adverse reactions and challenges in monitoring safety. Front Pharmacol. Frontiers Media SA. 2014;177.
3. Neeraj S, Sushila K, Neeraj D, Milind P, Minakshi P. Garlic: A pungent wonder from nature. Int Res J Pharm. 2014; 5(7):523-9.
4. Singh VK, Singh DK. Pharmacological Effects of Garlic (Allium sativum L.). ARBS Annual Review of Biomedical Sciences. 2008;10:6-26
5. Atashi S, Akbarpour V, Mashayekhi K, Mousavizadeh SJ. Garlic physiological characteristics from harvest to sprouting in response to low temperature. J Stored Prod Postharvest Res. 2011; 2(15):285– 91.
6. Santhosha SG, Jamuna P, Prabhavathi SN. Bioactive components of garlic and their physiological role in health maintenance: A review. Food Bioscience. Elsevier. 2013; 3:59–74.
7. Yun H-M, Ban JO, Park K-R, Lee CK, Jeong H-S, Han SB, et al. Potential therapeutic effects of functionally active compounds isolated from garlic. Pharmacol Ther. Pergamon. 2014;142(2):183–95. 8. Butt MS, Sultan MT, Butt MS, Iqbal J. Garlic: Nature’s Protection Against Physiological Threats. Crit Rev Food Sci Nutr. 2009;49(6):538–51.
9. Staba EJ, Lash L, Staba JE. A Commentary on the Effects of Garlic Extraction and Formulation on Product Composition. J Nutr. Oxford University Press. 2001;131(3):1118S–1119S.
10. Mikaili P, Maadirad S, Moloudizargari M, Aghajanshakeri S, Sarahroodi S. Therapeutic Uses and Pharmacological Properties of Garlic, Shallot, and Their Biologically Active Compounds. Iran J Basic Med Sci. 2013;16:1031–48.
11. Bayan L, Koulivand PH, Gorji A. Garlic: a review of potential therapeutic effects. Avicenna J phytomedicine. Mashhad University of Medical Sciences. 2014;4(1):1–14.
12. Méndez Lagunas LL, Castaigne F. Effect of temperature cycling on allinase activity in garlic. Food Chem. Elsevier. 2008;111(1):56–60.
13. Yoo M, Lee S, Lee S, Seog H, Shin D. Validation of high performance liquid chromatography methods for determination of bioactive sulfur compounds in garlic bulbs. Food Sci Biotechnol. The Korean Society of Food Science and Technology. 2010;19(6):1619–26.
14. Yoo M, Kim S, Lee S, Shin D. Validated HPLC Method and Temperature Stabilities for Oil-Soluble Organosulfur Compounds in Garlic Macerated Oil. J Chromatogr Sci. Oxford University Press. 2014;52(10):1165–72.
15. Apawu AK, Ho C, Wardeska J, Sun P. Reversed – Phase HPLC Determination of Alliin in Diverse Varieties of Fresh Garlic and Commercial Garlic Products. A thesis presented to the faculty of the Department of Chemistry East Tennessee State University. 2009;1-71
16. Zhu Q, Kakino K, Nogami C, Ohnuki K, Shimizu K. An LC-MS/MS-SRM Method for Simultaneous Quantification of Four Representative Organosulfur Compounds in Garlic Products. Food Anal Methods. Springer US. 2016;9(12):3378–84.
17. Gibiežaitė G, Ževžikovas A, Ževžikovienė A, Ivanauskas L, Marksa M, Kubilienė A. Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) miltelių, cheminės sudėties tyrimas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą. Žmogaus ir gamtos sauga. 2017, ASU. p.70–73.
18. Bamaniya B. Morphological and molecular characterization of garlic (Allium sativum L.). Bhagalpur BAU, Sabour; 2016.
19. Singh RK, Hiremath N. Comparative study of Alliin containing different Varieties of Garlics (Allium sativum L.). Int J Sci Res Publ. 2013;3(1):2250–3153.
20. Shende SM, Gogle DP. A review on Therapeutic Application of Garlic (Allium sativum L.) to Human Health Benefit in Various Diseasese. I J R B A T. 2017;V(3):71–6.
21. Majewski M. Allium sativum: facts and myths regarding human health. Rocz Panstw Zakl Hig [Internet]. 2014 [cited 2016 December 12];65(1):1–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24964572
22. Omar SH, Al-Wabel NA. Organosulfur compounds and possible mechanism of garlic in cancer. Saudi Pharm J. Elsevier. 2010;18(1):51–8.
23. Gebreyohannes G, Gebreyohannes M. Medicinal values of garlic: A review. Int J Med Med Sci. 2013;5(9):401–8.
24. Dethier B, Laloux M, Hanon E, Nott K, Heuskin S, Wathelet J-P. Analysis of the diastereoisomers of alliin by HPLC. Talanta. Elsevier. 2012;101:447–52.
25. Zhao Z, Wang W, C G, Wang JX, Zhao H, Gao C, et al. Toxicology Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Organosulfur Compounds from Garlic. J Drug Metab Toxicol. 2013;4(4).
26. Zeng T, Zhang C-L, Zhao X-L, Xie K-Q. The Roles of Garlic on the Lipid Parameters: A Systematic Review of the Literature. Crit Rev Food Sci Nutr. 2013;53(3):215–30.
27. Suvarna Y, Rajagopalan R. Garlic : Nature’s panacea. Asian J Pharm Clin Res 2015;8(3):8-13. 28. Bongiorno PB, Fratellone PM, LoGiudice P. Potential Health Benefits of Garlic (Allium Sativum): A Narrative Review. J Complement Integr Med. 2008; 5(1).
29. Chanda S. Garlic as food, spice and medicine: A perspective. J Pharm Res. 2011;4(6):1857–60. 30. Londhe VP, Gavasane AT, Nipate SS, Bandawane DD, Chaudhari PD. Role of Garlic (Allium
31. Helou L, Harris IM. Garlic. In: Herbal Products [Internet]. Totowa, NJ: Humana Press; 2007, p. 123–49.
32. Nouroz F, Mehboob M, Noreen S, Zaidi F, Mobin T. A Review on Anticancer Activities of Garlic (Allium sativum L.). Middle-East J Sci Res. 2015; 23(6):1145–51.
33. Milner JA. Garlic and Cancer Prevention. In: Bioactive Compounds and Cancer [Internet]. Totowa, NJ: Humana Press. 2010;p. 567–88.
34. Packia Lekshmi NCJ, Gurueswari C, Viveka S. Evaluation of Garlic Extracts Effect on Three MRSA. Int J Biotechnol Bioeng Res. 2011;2(1):45–54.
35. Lee DY, Li H, Lim HJ, Lee HJ, Jeon R, Ryu J-H. Anti-Inflammatory Activity of Sulfur-Containing Compounds from Garlic. J Med Food. 2012;15(11):992–9.
36. You S, Nakanishi E, Kuwata H, Chen J, Nakasone Y, He X, et al. Inhibitory effects and molecular mechanisms of garlic organosulfur compounds on the production of inflammatory mediators. Mol Nutr Food Res. 2013;57(11):2049–60.
37. Al-Numair KS. Hypocholesteremic and Antioxidant Effects of Garlic (Allium sativum L.) Extract in Rats Fed High Cholesterol Diet. Pakistan J Nutr. 2009;8(2):161–6.
38. Meriga B, Mopuri R, MuraliKrishna T. Insecticidal, antimicrobial and antioxidant activities of bulb extracts of Allium sativum. Asian Pac J Trop Med. 2012;5(5):391–5.
39. Chung LY. The Antioxidant Properties of Garlic Compounds: Allyl Cysteine, Alliin, Allicin, and Allyl Disulfide. J Med Food. 2006;9(2):205–13.
40. Amagase H. Clarifying the real bioactive constituents of garlic. J Nutr. 2006 Mar;136(3 Suppl):716S–725S.
41. Percival SS. Aged Garlic Extract Modifies Human Immunity. J Nutr. 2016;146(2):433S-436S. 42. Ichikawa M, Ide N, Yoshida J, Yamaguchi H, Ono K. Determination of Seven Organosulfur Compounds in Garlic by High-Performance Liquid Chromatography. J Agric Food Chem. 2006;54(5):1535–40.
43. Ghani MJA. Determination of Alliin and Allicin in different types Garlic using High Performance Liquid Chromatography. Anal. Biochem. 2010;4(2):1-14.
44. Thammana M. A Review on High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Res Rev J Pharm Anal. 2016;5(2):1–7.
45. Soleimani M, Yamini Y, Mohazab Rad F. A Simple and High Resolution Ion-Pair HPLC Method for Separation and Simultaneous Determination of Nitrate and Thiocyanate in Different Water Samples. J Chromatogr Sci. Oxford University Press. 2012;50(9):826–30.
46. Ramirez DA, Locatelli DA, González RE, Cavagnaro PF, Camargo AB. Analytical methods for bioactive sulfur compounds in Allium: An integrated review and future directions. J Food Compos Anal. Academic Press. 2017;61:4–19.
47. Arnault I, Christidès J., Mandon N, Haffner T, Kahane R, Auger J. High-performance ion-pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin, deoxyalliin, allicin and dipeptide precursors in garlic products using multiple mass spectrometry and UV detection. J Chromatogr A. Elsevier. 2003;991(1):69–75.
48. Gîtin L, Dinică R, Neagu C, Dumitrascu L. Sulfur compounds identification and quantification from Allium spp. fresh leaves. J Food Drug Anal. Elsevier. 2014;22(4):425–30.
49. Fujisawa H, Suma K, Origuchi K, Kumagai H, Seki T, Ariga T. Biological and Chemical Stability of Garlic-Derived Allicin. J Agric Food Chem. 2008; 56(11):4229–35.
50. Lawson LD, Gardner CD. Composition, stability, and bioavailability of garlic products used in a clinical trial. J Agric Food Chem. NIH Public Access. 2005;53(16):6254–61.
