MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MONIKA KARALIŪNAITĖ
KSANTOHUMOLIO IR IZOKSANTOHUMOLIO ANALIZĖ
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU
APYNIŲ PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas: Prof. Dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė Data
KSANTOHUMOLIO IR IZOKSANTOHUMOLIO ANALIZĖ
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU
APYNIŲ PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas
Prof. Dr. Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas
Data
KAUNAS, 2019
Darbą atliko
Magistrantė Monika Karaliūnaitė Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Paprastasis apynys (Humulus lupulus L.) ... 10
1.2. Apynio spurgų cheminė sudėtis ... 10
1.3. Ksantohumolis ir izoksantohumolis ... 11
1.4. Ksantohumolio gavimo šaltiniai ... 13
1.5. Ksantohumolio absorbcija, biopraeinamumas, metabolizmas ... 14
1.6. Ksantohumolio poveikis sveikatai ... 15
1.7. Izoksantohumolio poveikis sveikatai ... 18
1.8. Analitinių metodų taikymas ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymui ... 19
1.9. Alaus kartumo nustatymas ... 19
1.10. Apynių cheminiai tyrimai Lietuvoje ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tiriamasis objektas ... 21
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 22
2.2.1. Tyrimui naudojama įranga ... 22
2.2.2. Tyrimui naudoti reagentai ... 22
2.2.3. Chromatografavimo sąlygos ... 22
2.2.4. Etaloninio tirpalo paruošimas ... 23
2.2.5. Mėginių paruošimas analizei ... 23
2.3. Alaus kartumo vienetų nustatymas, taikant spektrofotometrinį metodą ... 23
2.3.1. Įranga...23
2.3.2. Reagentai ... 23
2.3.3. Mėginių paruošimas ... 24
2.4. Statistinė duomenų analizė ... 24
3. REZULTATAI ... 25
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija ... 25
3.1.1. Metodikos specifiškumas ... 25
3.1.3. Glaudumas ... 29
3.1.4. Ksantohumolio ir izoksantohumolio aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ) ribos ... 31
3.2. Apynių produktų ir alaus tyrimo rezultatai ... 31
3.2.1. Kokybinis ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymas ... 32
3.2.2. Kiekybinis ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymas ... 32
3.2.3. Ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio apynių produktuose tyrimo rezultatai ... 37
3.3. Kartumo vienetų (IBU) apskaičiavimas ... 38
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39
5. IŠVADOS ... 42
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
SANTRAUKA
Monikos Karaliūnaitės magistro baigiamasis darbas „Ksantohumolio ir izoksantohumolio analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu apynių produktuose“. Vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.
Moteriško žiedyno spurgas (Humulus lupulus L.), gerai žinoma kartinanti alų medžiaga, seniai vartojama liaudies medicinoje. Šiuo metu Lietuvoje apynius galime aptikti tik aluje ir apynių spurgų arbatoje, todėl tikėtina, jog daugiausiai ksantohumolio, gauname geriant alų. Didėjant Indian Pale Ale (IPA) stiliaus alaus vartojimui, daugiau suvartojame ir šios bioaktyvios medžiagos. Ksantohumolis atlieka svarbų vaidmenį žmogaus patologijų, tokių kaip širdies kraujagyslių ligų, karcinogenezės, kaulų ligų prevencijoje. Pasižymi priešbakterinėmis savybėmis ir hipoglikeminiu aktyvumu.
Darbo tikslas: kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį rinkoje esančiame IPA stiliaus aluje, apynių spurgų arbatoje bei granulėse.
Uždaviniai: pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ksantohumolio ir izoksantohumolio kokybinei ir kiekybinei analizei IPA stiliaus aluje ir apynių produktuose; ją validuoti; įvertinti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį aluje ir apynių, turinčiuose produktuose; apskaičiuoti alaus kartumo vienetus, palyginti su deklaruojamu ant etiketės bei nustatyti koreliaciją tarp IBU ir ksantohumolio, izoksantohumolio kiekio aluje.
Tyrimo metodas: kokybinei ir kiekybinei analizei pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas su fotodiodų matricos detekcija. Tirpiklių sistema: A – 0,1% trifluor- acto rūgštis, B – acetonitrilas. Kolonėlėje palaikoma 25 °C temperatūra, mobilios fazės tekėjimo greitis 1,0 ml/min. ksantohumolis nustatytas prie 363 nm šviesos bangos ilgio, izoksantohumolis – prie 288 nm šviesos bango ilgio.
Rezultatai: validuojant metodiką tiesiškumas įrodytas kreivių koreliacijos koeficientais (>0,99). Rezultatų glaudumas pagrįstas tuo, kad pakartojamumo ir atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis buvo <5 proc. Atlikus kokybinius alaus ir apynių produktų tyrimus, ksantohumolis ir izoksantohumolis identifikuojamas lyginant standartinio tirpalo ir analizuojamų mėginių sulaikymo trukmes bei UV spektrų atitikimus. Atlikus kiekybinį tyrimą nustatytas ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio intervalas aluje, atitinkamai: 0,015–1,075 µg/ml ir 0,095–3,342 µg/ml. 2 iš 9 alaus rūšių ksantohumolis nebuvo aptiktas. Apynių granulėse aptiktas ksantohumolio kiekis - 145, 986 µg/ml, izoksantohumolio - 6,122 µg/ml. Apynių spurgų arbatoje, atitinkamai – 10,170 µg/ml ir 1,969 µg/ml. Įrodyta koreliacija tarp ksantohumolio ir IBU pagal Pirsono koreliacijos koeficientą ir gautas statistiškai reikšmingas rezultatas. Tuo tarpu koreliacijos tarp IBU ir izoksantohumolio nėra.
SUMMARY
The female inflorescences of the hop plant is well known as bittering agent of beer and has been used in the traditional medicine. Currently, in Lithuania beer is the most important dietary source of xanthohumol. Because of increasing popularity of the IPA style beer, we also consume more of this bioactive substance. In recent years xanthohumol plays an important role in the prevention of human pathologies, such as cardiovascular, carcinogenesis and bone diseases. It also has anti-bacterial properties and hypoglycemic activity.
Aim of the study: to perform a qualitative and a quantitive assey of IPA style beers, hop pellets and hop tea to determine xanthohumol and isoxanthohumol using high performance liquid chromatography (HPLC).
Objectives of the study: to determine high-performance liquid chromatography (HPLC) method of xanthohumol and isoxanthohumol in different hops products; to perform validation of HPLC method; to evaluate the amount of xanthohumol and isoxanthohumol in different hops products: commercial and unpasteurized Indian Pale Ale beers, hop pellets and hop tea; evaluate and compare the actual amount of the IBU to the one, which is declared on the label of beer; to determine the correlation between the IBU and xanthohumol, isoxanthohumol content in the samples of beer.
Method: high-performance liquid chromatographic (HPLC) method with diode array detection of analysis of xanthohmol and isoxanthohumol in different hops products was developed and validated. The separation was carried out using gradient elution (solvent A: 0,01% trifluoroacetic acid, B: acetonitrile. The column was thermostated at 25 ºC, flow rate was 1,0 ml/min., injection volume 10 µl, detection of xanthohumol and isoxanthohumol was performed at 305 nm and 288 nm wavelength, respectively.
Results and discussion: the method of quantitative analysis of xanthohumol and isoxanthohumol was validated with regard to its specificity, precision, accuracy and linearity. It was clearly established that there was a presence of xanthohumol and isoxanthohumol in all analyzed hops products. Amount of xanthohumol and isoxanthohumol in different beers varies from 0,015 to 1,075 µg/ml and from 0,095 to 3,342 µg/ml, respectively. Hop pellets and hop tea had significant values of xanthohumol: 145, 986 µg/ml and 10,170 µg/ml, respectively. The correlation was determined between xanthohumol and IBU (p ≤ 0,05). Meanwhile, there was no correlation between IBU and isoxanthumol.
SANTRUMPOS
6-PN – 6-prenilnaringeninas8-PN – 8-prenilnaringeninas AKT – proteino kinazė B
AUC – plotas po koncentracijos ir laiko kreive (angl. area under the curve)
CETP – cholesterolio esterio transferazės proteinas
Cmax – maksimali koncentracija kraujo plazmoje
DMX – demetiloksantohumolis DTL – didelio tankio lipoproteinai
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas HCV – hepatito C virusas
HSV – Herpes simplex virusai
IBU – tarptautiniai alaus kartumo vienetai (angl. International Bittering Units) IPA – Indiškas šviesus alus (angl. India Pale Ale)
ICH – tarptautinė komisija, sprendžianti techninių reikalavimų dėl žmonėms skirtų farmacinių produktų suderinamumo klausimus (angl. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)
IQ – 2-amino-3-metilimidazo [4,5-f] chinolinas IX – izoksantohumolis (angl. isoxanthoumol)
SC-MS / MS – skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija LH – liuteinizuojantis hormonas
LoD – aptikimo riba (angl. limit of detection) LoQ – nustatymo riba (angl. limit of quantification) MTL – mažio tankio lipoproteinai
MX-1 – krūties vėžio ląstelių linija PI3K – fosfoinozito 3-kinazė
RANKL – branduolio faktoriaus kapa-B receptoriaus aktyvatorius (angl. receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand)
UV – Ultravioletiniai spinduliai
XN – ksantohumolis (angl. xanthohumol) ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas
ĮVADAS
Alus – tai mažai promilių turintis alkoholinis gėrimas, pagamintas iš salyklo (70–80 proc.) ir apynių (20–30 proc.). Tai yra labiausiai vartojamas alkoholio tipas pasaulyje. Remiantis 2017 m. alaus statistika, Lietuvoje šiais metais suvartota 221300 l alaus. Žmogui tenka 88 l per metus [72]. Alaus istorija susiformavo dar Mesopotamijoje (4000 m. Pr. Kr.). Pirmą kartą alus buvo gaminamas iš natūraliai fermentuotos duonos. Tuo metu šis gėrimas buvo labai svarbus maisto produktas kasdienėje mityboje ir žmonės žinojo, jog jis turi tam tikrą terapinį poveikį [73].
Šiandien alaus gaminimo industrijoje apynių spurgai yra plačiai naudojami, kaip medžiaga, suteikianti kartumą ir pasižyminti aromatizuojančiomis savybėmis. Taip pat apyniai jau ilgą laiką naudojami įvairiais medicininiais tikslais. Tarp visų biologiškai aktyvių medžiagų, esančių apynyje, daugiausia dėmesio yra skiriama prenilintiems flavonoidams. Apynių spurguose labiausiai paplitęs prenilflavonoidas yra ksantohumolis. Jis sudaro apie 82–89 proc. apynio prenilintų flavonoidų [74]. Tačiau aludariai susiduria su problema, nes verdant alų ksantohumolis, kaip ir visos a-rūgštys, izomerizuojasi, o ksantohumolio izomeras nėra toks biologiškai aktyvus, kaip jo pirmtakas.
Susidomėjimas ksantohumolio poveikiu sveikatai pradėjo augti dar 1913 metais, kai buvo iškelta hipotezė, jog minimalus šio gėrimo vartojimas yra susijęs su reikšmingu širdies ir kraujagyslių ligų mažėjimu [22]. Nuo to laiko atlikta nemažai ikiklinikinių tyrimų, kurie įrodo alaus naudą sveikatai, ypač ligų prevencijai, kurios yra susijusios su netinkama gyvensena. Šios ligos apima 2 tipo cukrinį diabetą, hiperlipidemiją, arterinę hipertenziją, osteoporozę, ir daugelį vėžio rūšių [73].Deja, nors klinikiniai tyrimai vyksta, didžioji dalis rezultų dar nėra publikuoti, daugiausiai atlikta ikiklinikinių tyrimų su gyvūnais.
Šiuo metu Lietuvoje vienintelis ksantohumolio šaltinis yra alus ir apynių spurgų arbata, todėl tai ir lėmė tyrimo objekto pasirinkimą, kadangi šalies rinkoje nėra standartizuoto ksantohumolio ekstrakto ar maisto papildų. Apyniai maisto pailduose yra tik viena iš sudedamųjų dalių, šie preparatai vartojami esant miego sutrikimams, nerimui, taip pat virškinimui gerinti. Bet identifikavus ksanto- humolį, atsiranda naujos apynių indikacijos, kurios aprašomos šiame darbe.
Kol kas nėra nustatyta efektyvi ksantohumolio dozė, todėl negalime įvardinti kokį terapinį poveikį žmogaus sveikatai gali daryti alus. Todėl pirmiausiai, reikia ištirti ar aluje po gamybos proceso išlieka šios biologiškai aktyvios medžiagos. Bet kokiu atveju alus negali būti traktuojamas kaip vaistinis preparatas, kuris turi terapinį poveikį. Todėl nauji preparatai Lietuvos rinkoje būtų alternatyva alui.
Šio tyrimo tikslas yra pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ir kokybiškai bei kiekybiškai ištirti pasirinktus komercinius ir nepasterizuotus IPA stiliaus alaus rūšis bei apynių spurgų produktus: arbatą bei granules.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį rinkoje esančiame IPA stiliaus aluje, apynių spurgų arbatoje bei granulėse.
Uždaviniai:
1. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ksantohumolio ir izoksantohumolio kokybinei ir kiekybinei analizei skirtinguose apynių produktuose.
2. Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.
3. Įvertinti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį pasirinktos rūšies aluje, apynių spurgų arbatoje ir granulėse.
4. Apskaičiuoti alaus kartumo vienetus ir palyginti su deklaruojamu ant etiketės, įvertinti koreliaciją tarp ksantohumolio, izoksantohumolio kiekio ir alaus kartumo vienetų.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Paprastasis apynys (Humulus lupulus L.)
Paprastasis apynys (Humulus lupulus L.) yra kanapinių šeimos augalas (Cannabaceae L.). Ši apynių rūšis yra paplitusi Vidurio Europoje, Pietų Amerikoje, Pietų Afrikoje ir Australijoje [1]. Jis yra dvinamis, daugiametis vijoklinis augalas, užaugantis iki 6 m aukščio. Šaknis vertikali, mėsinga, išleidžianti ilgus horizontalius ūglius. Stiebas briaunotas, šiurkštus, apaugęs kabliškais dygliais. Lapai 8–15 cm ilgio, priešiniai, su 3–5 skiautėmis, širdies formos pamatais, dantyti, su prielapiais. Kuokeliniai žiedai yra maži, žaliai balsvi ar gelsvai žali, susitelkę pažastiniuose ar viršutiniuose šluoteliniuose žiedynuose. Piesteliniai žiedai kankorėžio formos, susitelkę trumpakotėse varpose. Žydi birželio– rugpjūčio mėnesiais. Auga miškuose, krūmuose, dažniausiai upių, upelių, ežerų pakrančių krūmuose, derlingame dirvožemyje. Paplitęs visoje Lietuvos Respublikoje. Veisiamos kultūrinės plantacijos. Vaistinė žaliava – sudžiovinti apynių spurgai [2, 3].
1.2. Apynio spurgų cheminė sudėtis
Pagrindinės apynio spurgų sudedamosios dalys yra kartumynai (15–30 proc.), esantys moteriškojo apynio spurgo dervose (1 pav). Šios dervos yra skirstomos į kietąsias ir minkštąsias (2pav.). Lipofilinės minkštosios dervos sudarytos iš α-rūgščių (5–13 proc.). Tai gali būti α-humulenas, kohumulenas ir jų analogai. Taip pat dervos sudarytos iš β-frakcijos (5–8 proc.), kuri skirtoma į β-rūgštis (lupulonas, kolupulonas ir jų analogai) ir į necharakterizuotas minkštąsias dervas, kurios sudaro 2–7 proc. Kietoji derva sudaryta iš hidrofilinės frakcijos (3–5 proc.), tai kietosios a, b, δ, e-dervos. b-dervas sudaro ksantohumolis, kurio kiekis svyruoja nuo 0,3 ik 1,5 proc. [4].
1pav. Moteriško žiedyno spurgai (A); apynių spurgų derva, besikaupianti pažiedžiuose (B) [4]
2 pav. Apynių spurgų dervų klasifikacija [5]
Apyniai gali kaupti eterinius aliejus, kurie sudaro 0,3–1,0 proc., daugiausiai monoterpenų ir seskviterpenų, tokių kaip β-kariofilenas, farnezenas, humulenas ir β-mircenas. Savo sudėtyje turi 5 proc. rauginių medžiagų, 0,3 proc. antocianų, 10–15 proc. mineralų, 3–4 proc. gliukozės, izovalerijono rūgšties esterio valerolio [6].
Polifenoliniai junginiai yra dar viena didelė biologiškai aktyvių antrinių metabolitų grupė, kuri sudaro nuo 3 proc. iki 6 proc. sausos apynių spurgų masės. Apyniuose, esančius polifenolius galima padalinti į 4 grupės: flavonoliai, flavan-3-olai, fenolio karboksirūgštys (benzenkarboksirūgšties ir cinamono rūgšties dariniai) ir kiti fenoliniai junginiai (prenilflavonoidai, stilbenoidai). Tačiau labiausiai tiriama polifenolių grupė yra prenilflavonoidai, dėl stipraus biologinio aktyvumo. Pagrindiniai apynių prenilflavonoidai yra ksantohumolis, izoksantohumolis, desmetilksantohumolis, 6- ir 8-prenilnarin- geninas (8-PN). Daugiausiai aptinkamas prenilflavonoidas yra ksantohumolis (XN) [7, 8].
1.3. Ksantohumolis ir izoksantohumolis
Ksantohumolis (3-[3,3-dimetilalil]-2,4,4-trihidroksi-6-metoksichalkonas) yra struktūriškai paprastas prenilfavonoidas (3 pav.). Tai yra biologiškai aktyvi medžiaga, kuri aptinkama moteriškajame žiedyne, jo koncentracija svyruoja nuo 0,3 iki 1,5 proc. Ši medžiaga yra apynio dervų sudedamoji dalis ir aptinkama jaunų lapų apačioje, esančiuose plaukeliuose – trichomose.
XN molekulę sudaro atviros grandinės flavonoidai, kurių grandinėje yra du aromatiniai A ir B žiedai. Nustatyta, kad chalkono molekulėje esanti prenilo grupė yra atsakinga už biologinį aktyvumą.
Bendras dervų kiekis (15–30%) Bendras minkštųjų dervų kiekis (10–25%) a-rūgštys (5–13%) Humulonai Kohumulonai Analogai β-frakcija (5–15%) β-rūgštys (3–8%) Lupulonai Kolupulonai Analogai Necharakterizuotos minkštosios dervos(2–7%) a-minkštosios dervos β-minkštosios dervos Bendras kietųjų dervų kiekis (3–5%) a-kietosiosios dervos β-kietosios dervos Ksantohumolis (0,3–1,5%) δ-kietosios
XN A žiedo pakeitimas prenilo ir -OCH3 grupėmis padidina lipofiliškumą ir suteikia molekulei didesnį afinitetą biologinėms membranoms [9].
Izoksantohumolis (4,7-dihidroksi-5-metoksi-8-prenilflavonas) yra ksantohumolio ciklizacijos produktas. Molekulės dalis yra sudaryta iš heterociklinio flavono, turi dvi hidroksilo grupes ir vieną prenilo. Jis yra randamas kartu su ksantohumoliu ir 8-prenilnaringeninu apyniuose ir apynių likučiuose, kurie lieka po ekstrahavimo su superkritiniu anglies dioksidu. Šis ekstraktas yra naudojamas alaus pramonėje. Būtent apynių virimo metu, vyksta XN izomeracija į izoksantohumolį (IX) (4 pav.). Reakcija vyksta, esant 100 °C temperatūrai [10]. Vadinasi, jo kiekis apynių produktuose, priklauso nuo to kokiomis sąlygomis gaminamas ekstraktas [11].
3 pav. Cheminė ksantohumolio ir izoksantohumolio struktūra [11]
4 pav. Ksantohumolio virtimas izoksantohumoliu [10]
Prenilflavanoidų biosintezė. Pirmasis etapas – chalkonų sintezė (5 pav.) Ji prasideda, kai p-kumarolis KoA kondensuojasi su trimis malonilo KoA molekulėmis, tarpininis produktas yra chalkono naringeninas. Ši reakcija katalizuojama chalkonų sintetazės. Daugelio flavonoidų biosintezė vyksta fermentiniu tetrahidroksichalkono konversijos būdu į flavanoną (2S)-aringeniną, veikiant chalkono izomerazei. Ši izomerizacija taip pat vyksta ne fermentacijos būdu, jog būtų gaunamas (2R)- ir (2S)-naringenino enantiomerinis mišinys. Tačiau ksantohumolio atveju, prenilinimas ir A žiedo metilinimas,
Izoksantohumolis (4,7-dihidroksi-5-metoksi-8-prenilflavonas) Ksantohumolis (3-[3,3-dimetilalil]-2, 4, 4- trihidroksi-6-metoksichalkonas) Ksantohumolis Izoksantohumolis
slopina flavanono susidarymą ir nukreipia flavonoidų biosintezę į specializuotą metabolinę šaką. Kai A žiedas prenilinimas su dimetilalilo difosfatu (DMAPP) susidaro desmetilksantohumolis, kuris vėliau metilinamas 6-hidroksilo grupėje, jog susidarytų ksantohumolis [12].
5 pav. Ksantohumolio biosintezės schema [12]
1.4. Ksantohumolio gavimo šaltiniai
Alus yra vienas iš pagrindinių ksantohumolio šaltinių. Bet dėl terminio alaus apdorojimo, visos a-rūgštys izomerizuojasi, o ksantohumolio izomeras izoksantohumolis nėra toks biologiškai aktyvus, kaip jo pirmtakas. Komerciniame aluje yra vidutiniškai apie 0,2 µg/ml ksantohumolio. Norint padidinti ksantohumolio išeigą alaus gamybos proceso metu, yra atliekamos kelios modifikacijas: ksantohumoliu praturtintų apynių produktų ir specialaus salyklo naudojimas, griežta temperatūros kontrolė. Kadangi
p-kumarolis KoA Chalkono sintetazė
sintetazė Malonilas KoA
Chalkono naringeninas
Aromatinė preniltransferazė
Desmetilksantohumolis
O-metiltransferazė
ksantohumolis yra labiau lipofilinis, dėl šios priežasties ši medžiaga turi daugiau bioaktyvumo nei kiti alaus polifenoliai [13].
Pasak straipsnių autorių, komerciniame aluje (ypač lager stiliaus) randami labai maži šio junginio kiekiai 0,14–0,21µg/ml. Ksantohumolio kiekis aluje yra proporcingas jo kartumui, kuo kartesnis alus, tuo junginio daugiau. Todėl iki 1,2 µg/ml yra randama IPA, Porter ir Stout tipo aluje, dėl didesnio apynių kiekio. Todėl būtų tikslinga tirti būtent tą alų, kurio kartumo vienetų rodiklis yra virš 30, nes atsiranda didesnė tikimybė jame aptikti ksantohumolį [14, 15].
Vienintelis augalinis preparatas, kurį galima įsigyti Lietuvos vaistinėse yra apynių spurgų arbata. Užsienio rinkoje galima rasti kelis ksantohumolio maisto papildus. Vienas iš jų – Jungtinėje Karalystėje gaminamas standartizuotas apynių ekstraktas, kurio sudėtyje yra 10 proc. ksantohumolio. Šio maisto papildo cheminė sudėtis: apynių ekstraktas 200 mg, iš kurių 20 mg sudaro XN. Deja, Lietuvoje jo įsigyti negalima [16].
1.5. Ksantohumolio absorbcija, biopraeinamumas, metabolizmas
2015 m. atliktas tyrimas, kurio metu buvo siekta nustatyti prenilflavonoidų dozės koncentracijas žmogaus organizme. Tiriamieji gavo vienkartinę 20, 60 arba 180 mg XN dozę. Ksantohumolio ir jo metabolitų, izoksantohumolio (IX), 8-prenilnaringenino (8PN) kiekis plazmoje buvo matuojamas SC-MS/MS. Po analizės paaiškėjo, jog plazmoje aptikti tik XN ir IX. Didžiausia ksantohumolio koncentracija (Cmax) buvo pasiekta, vartojant didžiausią 180 mg dozę. Plotas po
koncentracijos kraujo plazmoje ir laiko kreive (AUC) buvo 863 ± 388 h × μg/l, taip pat vartojant didžiausią ksantohumolio dozę. Vidutinis XN pusinės eliminacijos periodas buvo 20 val. 60 ir 18 val. Tyrimo metu, padarytos išvados, jog ksantohumolis pasižymi dvifaze abosorbcija [17].
Dėl mažo XN biologinio praeinamumo žmogaus organizme buvo atlikta nemažai tyrimų, siekiant ištirti faktinę XN koncentraciją ir farmakokinetiką kepenyse ir žarnyno ląstelėse. Svarbu, tai jog XN gali kauptis žarnyno ląstelėse ir prisijungti prie ląstelėje, esančių baltymų. Tyrimo tikslas buvo įvertinti kaip žarnyno pralaidumas gali daryti įtaką ksantohumolio biologiniam praeinamumui. Naudota Caco-2 ląstelių linija, ji yra kilusi iš epitelio gaubtinės ir tiesiosios žarnos adenokarcinomos ir gali lengvai diferencijuotis į plonosios žarnos ląsteles. Šis modelis yra standartinė priemonė prognozuojant vaistų absorbciją žarnyne ir pasiskirstymą [18]. Specifinis XN prisijungimas prie citozolinių baltymų žarnyno epitelio ląstelėse gali daryti neigiamą įtaką biologiniam aktyvumui in vivo. Apytiksliai apie 70 proc. ksantohumolio buvo rasta Caco-2 ląstelių apikalinėje pusėje, o 93 proc. intracelulinio ksantohumolio buvo lokalizuota citozolyje. Vadinasi, ksantohumolis yra linkęs kauptis Caco-2 ląstelėse ir tai gali daryti neigiamą įtaką biopraeinamumui žmogaus organizme [19].
Žmogaus ir pelių kepenų mikrosomose ksantohumolis gali būti biotransformuojamas į gliukuronidus, hidroksilintus ir ciklinius metabolitus. Tyrimo metu, kuomet buvo naudojamos žmogaus kepenų mikrosomos, paaiškėjo, jog prenilmetilo grupės hidroksilinimas yra pagrindinis oksidacinio metabolizmo būdas, kurio metu susidaro hidroksilinti XN ir IX metabolitai. IX gali būti O-demetilinamas žmogaus kepenų citochromo P450 arba žarnyno mikrobiotos fermentų pagalba, susidarant 8-PN, o tai yra labai svarbu atsižvelgiant į poveikį žmogaus organizmui. Vadinasi, XN gali būti paverčiamas skrandyje į IX, kuris biotransformuojamas į 8-PN (6 pav.). Taip pat gali vykti tiesioginė metabolinė konversija į demetiloksantohumolį (DMX), kuris vėliau paverčiamas į 6-prenilnaringeniną (6-PN) arba į 8-PN [11, 20]. Tyrimų metu su pelėmis, kuomet jos vartojo ksantohumolį 1000 mg/kg kūno svoriui, išmatose aptikti 22 metabolitai, tačiau 89 proc. XN išliko nepakitęs žarnyno trakte, likę 11proc. – tai minėti metabolitai. Dėl šių galimų XN biotransformacijų, kai kurie metabolitai gali prisidėti prie platesnio XN biologinio aktyvumo, o tai ypač aktualu naujų vaistų kūrimui [20].
6 pav. Prenilflavonoidų biotransformacija žmogaus organizme [21]
1.6. Ksantohumolio poveikis sveikatai
Pastarąjį dešimtmetį prenilflavonoidai, o ypač ksantohumolis ir jo dariniai, atlieka svarbų vaidmenį patologijų, tokių kaip širdies kraujagyslių ligų, karcinogenezės, kaulų ligų prevencijoje. Pasižymi priešbakterinėmis savybėmis ir hipoglikeminiu aktyvumu, dėl to ksantohumolis tapo daugelio tyrimų šaltiniu [22]. Pirmą kartą ksantohumolis buvo išskirtas iš apynių mokslininkų Frederiko Powero, Franko Tutino ir Haroldo Rogersono 1913 metais [23]. Susidomėjimas šia veikliąja medžiaga pradėjo augti, kai buvo iškelta hipotezė, jog minimalus alkoholinių gėrimų vartojimas yra susijęs su reiškmingu širdies ir kraujagyslių ligų sumažėjimu [24].
Metabolinis sindromas. Tai yra rizikos veiksnių grupė, kuriai būdingas nutukimas, aukštas kraujospūdis, didelis gliukozės kiekis kraujyje, mažas didelio tankio lipoproteino cholesterolio (DTL) kiekis ir didelis trigliceridų kiekis. Eksperimentiniai tyrimai parodė, jog ksantohumolis gali susilpninti kelis metabolinio sindromo veiksnius, kurie aprašyti žemiau [25]. 2016 m. atliktas Oregono Valstijos Universiteto tyrimas nustatė specifinį ksantohumolio kiekį, kuris pagerino kai kuriuos laboratorinių
gyvūnų metabolinio sindromo žymenis ir sumažino svorio didėjimą. Tai atveria naują požiūrį į nutukimą, cholesterolio ir padidėjusios gliukozės kiekių mažinimą. Šiame ikiklinikiniame tyrime laboratorinėms pelėms buvo skiriamos daug riebalų turinčios dietos ir skirtingos ksantohumolio koncentracijos. Buvo lyginamos pelės, kurios vartojo placebą ir didžiausią ksantohumolio koncetraciją. Po tyrimo paaiškėjo, jog mažo tankio cholesterolio sumažėjo 80 proc., gliukozės – 42 proc., IL-6 uždegiminio biomarkerio lygis – 78 proc. Kadangi pelės vis dar augo ir buvo maistingai šeriamos – jos priaugo svorio, bet, kurios vartojo ksantohumolį – 22 proc. svėrė mažiau. Tad ksantohumolio vartojimas gali padidinti deguonies suvartojimą ir medžiagų apykaitos greitį. Šių studijų tęsimas galėtų užtikrinti metabolinio sindromo gydymą mažomis sąnaudomis. Tyrimo metu buvo naudota dozė 60 mg kūno svoriui per dieną. Tai atitinka žmogaus ekvivalentinę dozę – 350 mg per dieną 70 kg sverančiam asmeniui, šis kiekis prilygsta maždaug 2000 l alaus. [26].
Prevencija hiperlipidemijai. Didelio tankio lipoproteinų (DTL) cholesterolio kiekis koreliuoja su mažesne aterosklerozės rizika. Cholesterolio esterio transferazės proteino (CETP) slopinimas sukelia DTL cholesterolio didėjimą [27]. 2012 m. atliktame tyrime, buvo pastebėta, jog ksantohumolis inhibuoja CEPT mišriame nekonkurenciniame slopinimo režime, o struktūros ir aktyvumo tyrimas, įrodė, jog chalkono ir prenilo grupė yra būtinos šių cheminių procesų lėtinimui [28]. Ksantohumolio inhibicija prieš endogeninį CETP aktyvumą buvo patvirtinta in vivo tyrimais. CEPT slopinimo metu, XN mažina cholesterolio kaupimąsi aterogeniniuose regionuose. Taip pat buvo nustatyta, jog ksantohumolis stabdo aterosklerozinės plokštelės susidarymą [29]. Didelį vaidmenį aterosklerozinių plokštelių susidaryme lemia mažio tankio lipoproteinų (MTL) oksidacija. XN daro įtaką antioksidaciniam aktyvumui ir taip slopina MTL oksidaciją. Taigi, ksantohumolis apsaugo žmogaus MTL nuo oksidacijos. Ši biologiškai aktyvi medžiaga veikia lipidų apykaitą ir užkerta kelią širdies ir kraujagyslių ligoms. Taip pat be tiesioginio antioksidacinio aktyvumo, XN skatina apsauginius mechanizmus ląstelėse ir yra pajėgus įveikti cheminių medžiagų arba chirurginių procedūrų sukeltą oksidacinį stresą [30].
Poveikis hipoglikeminis aktyvumui. 2013 m. atlikto tyrimo metu buvo įrodyta, jog ksantohumolis gali daryti įtaką gliukozės koncentracijai plazmoje. Didelė XN dozė (16,9 mg/kg) turėjo teigiamą poveikį kūno svoriui ir gliukozės metabolizmui nutukusioms pelėms. Tai vienas iš įrodymų, kad XN gali būti skirtas metabolinio sindromo gydymui [31]. Vartojant XN sumažėjo gliukozės ir trigliceridų koncentracija KK-Ay rūšies pelėse. Paaiškėjo, jog sumažėjo riebalinio audinio, vandens suvartojimas, taip pat padidėjo baltymo adiponektino koncentraciją, kuris dalyvauja lipidų apykaitoje. Taigi ksantohumolis spartina gliukozės metabolizmą ir mažina diabeto riziką KK-Ay pelėse [32]. 2015 m. buvo tiriami cukriniu diabetu sergantys gyvūnai, XN pagalba buvo mažinamas uždegimas ir oksidacinis stresas, o tai pagerino sudėtingą cukrinio diabeto sukeltą pakitusių kraujagyslių susiformavimą akyse [33, 34].
Ksantohumolio vaidmuo vėžio gydyme. Pastaraisiais metais daugelio tyrimų rezultatai įrodė, jog ksantohumolis gali užkirsti kelią vėžio plitimui, taip pat dalyvauti jo gydyme. Tyrimų metu ksantohumolis demonstruoja efektyvumą visose trijose karcinogenezės proceso fazėse – iniciacijos, vystymosi ir progresavimo [35]. XN veikia mutacijas, kurias per maistą sukelia mutagenas 2-amino-3-metilimidazo [4,5-f] chinolinas (IQ). Tyrimo metu naudojant Salmonella-mikrosomų tyrimo sistemą ir žmogaus hepatomos HepG2 ląsteles, XN apsaugojo IQ sukeltą DNR pažeidimą. Šie mechanizmai susiję su žmogaus citochromo P450 1A2 (CYP1A2) metaboliniu IQ aktyvacijos slopinimu ir IQ metabolitų prisijungimu prie DNR ir baltymų [36]. Kraujagyslių išvešėjimas turi įtaką auglio augimui ir metastazavimui. Taigi naviko angiogenezės slopinimas yra perspektyvi vėžio terapijos ir prevencijos strategija. Taip pat vienas iš pagrindinių ksantohumolio priešvėžinio aktyvumo mechanizmų – ši biologiškai aktyvi medžiaga veikia endotelio ir kraujagyslių ląsteles ir lėtina naviko naujų kraujagyslių formavimąsi. Ikiklinikinio tyrimo metu paaiškėjo, jog XN slopina kraujagyslių naviko augimą in vivo. Vartojant XN (1 mg/g kūno svorio) 14 dienų SCID pelėms, turinčioms žmogaus MX-1 krūties naviko ksenografus, 30 proc. sumažėja naviko sukelta neovaskuliarizacija. Be to, be tiesioginio poveikio kraujagyslių ląstelėms, XN slopina angiogeninių faktorių gamybą kasos karcinomos ląstelėse ir blokuoja su kasos vėžiu susijusį angiogenezę [37]. Stiprus XN angiogeninis aktyvumas rodo, kad XN gali būti naudingas slopinant angiogenezę [38]. Daugelis mokslinių tyrimų įrodė, kad XN slopina vėžinių ląstelių proliferaciją ir skatina jų apoptozę, jis sukelia daugelio rūšių vėžio ląstelių apoptozę, pvz.: žmogaus prostatos vėžio, leukemijos, kiaušidžių vėžio, kepenų ląstelių karcinomos, krūties karcinomos [39].
Priešbakterinės savybės. Naujų antimikrobinių medžiagų aptikimas vyksta jau daugelį metų. Tačiau naujai sukurti vaistai įgyja vis didesnį atsparumą. Todėl natūralios medžiagos išsiskirtos iš augalų, ypač prenilflavonoidai, gali lemti platesnį pasirinkimą ir turėti mažesnį atsparumą. Tyrimuose nustatyta, jog ksantohumolis slopina žmogaus imunodeficito viruso sukeltą citopatinį efektą. Taip pat XN inhibuoja ŽIV-1 replikaciją periferinėse kraujo mononuklearinėse ląstelėse. Vadinasi, ksantohumolis gali būti naudojamas kaip naujas ir inovatyvus chemoterapinis agentas kovoti su ŽIV-1 infekcija. Be ŽIV, XN slopina herpeso virusus (HSV-1, HSV-2) taip pat – hepatito C virusą (HCV)[40]. 2013 m. atlikti tyrimai įrodė, jog ksantohumolis turi poveikį prieš Staphylococcus aureus ir Streptococcus mutans bakterijas. XN slopina Staphylococcus aureus padermių, kurių minimalios inhibicijos koncentracijos intervalas yra 15,6–62,5 µg/ml, augimą [41].
Ksantohumolio vaidmuo tromboembolijos gydyme. Tyrimai parodė, kad ksantohumolis turi antitrombocitinį aktyvumą, slopindamas PI3-kinazės/Akt signalinius kelius, taip pat tromboksano A2 formavimąsi [42]. Ksantohumolis slopina eritrocitų apoptozę, kurią inicijuoja oksidacinis stresas ir energijos išeikvojimas in vitro. Kadangi šios negyvos ląstelės yra cirkuliuojančiame kraujyje ir trukdo įpastinei mikrocirkuliacijai, šis naujas XN gali būti pritaikytas anemijos, mikrocirkuliacijos ir
koaguliacijos sutrikimų prevencijai ar gydymui. Dėl šios priežasties manoma, jog ksantohumolis gali turėti itin didelį potencialą ateityje, gydant tromboembolijos ligas [43, 44].
Poveikis kaulų ligai - osteoporozei. Kaulinio audinio atkūrimas yra dinamiškas procesas, kurį apima pusiausvyra tarp kaulų susidarymo ir kaulų rezorbcijos. Jau nuo 1997 m. buvo nustatyta, jog ksantohumolis turi stiprų slopinamąjį poveikį kaulų rezorbcijos procesui [45]. Ksantohumolis, priklausomai nuo dozės, stimuliuoja osteogeninio žymens geno ekspresiją. Nustatyta, jog branduolio faktoriaus kapa – B receptoriaus aktyvatorius (RANKL) atlieka svarbų vaidmenį osteoklastų formavime ir kaulų rezorbcijoje. Tyrimų metu paaiškėjo, jog XN slopina RANKL sukeltą tartrato rūgšties fosfatazės aktyvumą, daugiasluoksnį osteoklastų, rezorbcijos – duobių susidarymą ir turi įtakos osteoklastų genų ekspresijai osteoklastogenezės metu. Taigi, XN gali būti vartojamas kaulų ligų prevencijai [46].
1.7. Izoksantohumolio poveikis sveikatai
Kaip jau buvo minėta anksčiau, ksantohumolis, veikiant temperatūrai, yra paverčiamas į izoksantohumolį, dėl šios priežasties aluje jo yra kelis kartus daugiau nei XN. Pagrindinis dėmesys izoksantohumoliui skiriamas – kaip stipriam proestrogenui, bet pats IX nėra biologiškai aktyvus. Atlikus tyrimus, paaiškėjo, jog IX yra 8-prenilnaringenino šaltinis, nes būtent izoksantohumolis yra metabolizuojamas iki 8-PN žarnyno mikrobiotoje, vykstant O-demetilinimo reakcijai (7 pav.). Taigi izoksantohumolis yra 8-prenilnaringenino prekursorius [47, 48].
7 pav. Izoksantohumolis metabolizuojamas iki 8-prenilnaringenino [48]
Izoksantohumolio estrogenins poveikis. Šiandien moterys vis dažniau ieško alternatyvų pakaitinei hormonų terapijai ir renkasi augalinius maisto papildus, kurių sudėtyje yra apynių [49]. Tyrimo in vivo metu buvo nustatyta, jog didelė 8-PN dozė (68,4 mg/kg) turėjo estrogeninį poveikį. Ši dozė turėjo įtaką liuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) sumažėjimui, prolaktino serumo koncentracijos stimuliavimui [50]. Vadinasi, toliau tęsiami tyrimai su žmonėmis, įrodytų, jog moterys gali naudoti apynius, kaip alternatyvą hormonų terapijai [51].2016 m. atliktas placebu kontroliuojamas atsitiktinės imties tyrimas, kuriame dalyvavo 120 moterų, jos priklausė
40–60 metų amžiaus grupei. Tai moterys, kurioms pasireikšdavo karščio bangos, ankstyvosios menopauzės metu. Pacientės vartojo 500 mg džiovintų apynių ektrakto tablečių, kuriose buvo 100 µg fitoestrogeno – 8-PN ir tokią pačią placebo dozę. Gydymas truko 90 dienų. Šio tyrimo metu buvo pastebėtas statistiškai reikšmingas apynių veiksmingumas, palengvinant ankstyvos menopauzės simptomus [52].
1.8. Analitinių metodų taikymas ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymui
Susidomėjimas ksantohumoliu davė pradžią įvairių analitinių metodų vystymuisi, net tik apyniuose, bet ypač jo nustatymui aluje. Kiekybiniam ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymui dažnai taikomi tokie metodai, kaip efektyvioji skysčių chromatografija su UV detekcija, ESC su fluorescencine detekcija, ESC su elektrochemine detekcija arba ESC su masių spektro detekcija. Jautriausias metodas yra ESC su masių spektrometrija, populiariausias ir pigiausias – ESC su UV [53]. Efektyvioji skysčių chromatografija su UV detekcija yra anksčiausiai pradėtas ir dažniausiai naudojamas analizės metodas. Šis metodas palyginus su ESC masių spektro detekcija, pasižymi mažu jautrumu, todėl reikalauja didesnio mėginio grynumo [54]. Jei mėginys toks nėra, pailgėja atskyrimo laikas. Palyginus su kitais apynių prenilflavonoidais, UV detekcija labiausiai tinka ksantohumoliui, kuris turi stiprią absorbciją, esant 370 nm bangos ilgiui. Bet siekiant pagerinti metodo selektyvumą, tyrimuose naudojami diodų matricos detektoriai. Šis metodas taikomamas junginiams, išskirtiems iš augalų. Tai yra jautrus ir gana paprastas būdas [55–57].
2010 m. Dhooghe ir kiti pasiūlė naują būdą kiekybiniam prenilflavanoidų nustatymui naudojant ESC-UV. Vietoje kalibracinių kreivių, kurias ruošdavo iš anksto paruoštų ksantohumolio standartų, autoriai naudojo naringeniną ir kvercetiną kaip antrinį kalibracinį standartą ksantohumolio kiekiui nustatyti. Pirminės ir antrinės kalibracinės absorbcijos kreivės turi būti labai arti [58].
Taip pat gali būti pritaikytas plonasluoksnės chromatografijos metodas. Šio eksperimento metu buvo tirtas ksantohumolio kiekis aluje, metodas tinkamas šiam tyrimui ir jis pakankamai jautrus [59].
1.9. Alaus kartumo nustatymas
Alaus kartumas yra vienas iš pagrindinių skonio kokybės komponentų. Alaus virimo metu iš apynių spurgų ekstrahuojasi izohumulonai arba izo -a- rūgštys ir suteikia alui kartų skonį, jie matuojami tarptautiniais kartumo vienetais (angl. IBU - International Bitterness Units). b-rūgštys, kurios randamos minkštoje apynių dervoje, taip pat gali prisidėti prie alaus kartumo. Galutinis produkto IBU priklauso nuo apynių kiekio ir rūšies. Salyklo rūšis gali padaryti nežymią įtaką alaus skoniui.
Siekiant išlaikyti kokybės pastovumą, kartumas yra griežtai kontroliojamas. Nors skirtingi alaus tipai turi skirtingas IBU vertes, bet dažniausiai svyruoja nuo 1 iki 100. Bendras analizės metodas yra alaus ekstrakcija į izooktaną ir matavimas, esant 275 nm bangos ilgiui UV-spektrofotometru. Spektrofotometrija yra plačiai naudojamas alaus analizės metodas, nes jis yra veiksmingas ir patogus [60, 61].
1.10. Apynių cheminiai tyrimai Lietuvoje
Nuo 2017 m. VDU Botanikos sode atidaryta unikali Baltijos šalyse apynių mokslinė kolekcija. Ją sudaro 25 paprastojo apynio (Humulus lupulus L.) pavyzdžiai. Ši kolekcija yra tyrimų objektas bei studijų bazė ne tik Lietuvos, bet ir užsienio institucijų mokslininkams. Paprastojo apynio kolekcijos kūrimas ir moksliniai tyrimai VDU Kauno botanikos sode pradėti beveik prieš šimtą metų, 1924–1949 m. tyrinėjimų mokslinis vadovas prof. dr. Kazimieras Grybauskas tyrė kultūrinių apynių veisles iš įvairių Europos šalių, siekė nustatyti jų tinkamumą auginti Lietuvos klimato sąlygomis [62]. Šiuo metu pradėti ir tęsiami apynių spurgų cheminių savybių tyrimai.
2004 m. K. Obelevičius ir R. Venskutonis ištyrė Paprastojo apynio veislių derlingumą ir spurgų eterinio aliejaus cheminę sudėtį. Viso spurguose identifikuoti 62 eterinio aliejaus komponentai [3].
2018 m. Ž. Stanius, O. Ragažinskienė, A. Maruška, V. Kaškokienė, M. Dūdėnas, K. Obelevičius ištyrė ksantohumolio kiekį Lietuvos apynių (Humulus lupulus L.) veislėse. Tai pirmasis tyrimas šalyje, kurio metu buvo identifikuojamas ksantohumolis. Šio tyrimo tikslas – įvertinti ir palyginti ksantohumolio koncentraciją Paprastojo apynio augalų lapuose ir spurguose, esančiuose VDU Kauno botanikos sode, kadangi nėra duomenų apie ksantohumolio kiekį Lietuvos apynių veislėse. Ksanthumolio koncentracija spurgų mėginiuose svyravo nuo 0,1821–0,2136 proc. sausos medžiagos masės, koncentracija lapuose buvo iki 84 kartų mažesnė [63].
Atlikta literatūros analizė, kurioje įrodytas ksantohumolio terapinis poveikis žmogaus sveikatai, apžvelgti tyrimai, kurie vykdomi, ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatytmui skirtinguose apynių produktuose. Kadangi pastaruoju metu susidomėjimas šia veikliąja medžiaga auga, dėl naujų apynių indikacijų, tiriama vienintelių apynių produktų, esančių Lietuvoje, kiekybinė ir kokybinė analizė, tai kartus alus, apynių spurgų arbata bei apynių granulės. Ištyrus kartų alų, būtų nustatyta, ar po alaus gamybos proceso, išlieka ši biologiškai aktyvi medžiaga, ar izoksnatohumolio kiekis yra didesnis nei ksantohumolio, o IX nėra toks biologiškai aktyvus, kaip jo pirmtakas.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tiriamasis objektas
Atsitiktinai pasirinkti komerciniai alūs, kuriems nustatytas vienas bendras kriterijus – IPA stilius, tačiau skirtingų gamintojų ir šalių (1–7 mėginiai). Taip pat du nepasterizuoto alaus mėginiai. Pirmasis nefiltruotas alus buvo pasirinktas iš Kauno restorano – alaus daryklos (8 mėginys). Antrasis – iš Pakruojo rajono, Rozalimo kaimo (9 mėginys). Svarbu žinoti, jog nepasterizuotas kartus alus nėra populiarus Lietuvos rinkoje, todėl buvo tirti tik šie du alaus mėginiai. Tyrimui pasirinkta apynių spurgų arbata, nes tai vienintelis apynių preparatas, esantis Lietuvos vaistinėse. Ir apynių granulės, kurios naudojamos, verdant vieną iš nepasterizuotų alaus mėginių (8 mėginys), įvertinti skirtumą, kiek biologiškai aktyvios medžiagos lieka aluje po gamybos proceso.
Tyrimui naudotos apynių arbatos sudėtis: apynių spurgai (Lupuli flos L.) –100 proc. Pagaminta Lietuvoje. Apynių granulės, naudojamos nepasterizuoto alaus gamybai, pagamintos iš Amarillo apynių rūšies, jas sumalus ir supresavus. Lentelėje žemiau, nurodyti komercinio ir nepasterizuoto alaus parametrai (1 lentelė).
1 lentelė. Tiriamųjų mėginių apibūdinimas. Alaus
mėginio nr.
Šalis Alk. tūris Apynių rūšis Kartumo
vienetai 1. Lietuva 6 proc. Casade, Citra, Centennial, Chinook apyniai 45 IBU
2. Lietuva 6 proc. Equinox, Chinook, Casade,
Magnum apyniai 38 IBU
3. Lietuva 5,7 proc. nenurodyta 30 IBU
4. Prancūzija 6 proc. nenurodyra 30 IBU
5. Dž. Britanija 6,2 proc. Chinook, Columbus apyniai Pasific Jade, Cascade, 40 IBU 6. Švedija 5,8 proc. Magnum, Amarillo, Cascade, Galaxy apyniai 38 IBU
7. Dž. Britanija 5,5 proc.
Centennial, Citra, Amarillo, Apollo, Chinook, Kohatu
apyniai 43 IBU
8. Lietuva 6,8 proc. Amarillo apyniai Nenurodytas
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
2.2.1. Tyrimui naudojama įranga
Tyrimui naudota chromatografinė sistema ,,Waters Alliance 2695” su fotodiodų matricos detektoriumi ,,Waters 996‘‘.
2.2.2. Tyrimui naudoti reagentai
Tyrimui naudotas standartizuotas ksantohumolis (≥96 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija) ir izoksanto- humolis (≥99 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija). Metanolis (≥99,9 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija), acetonitrilas (99,8 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija), 0,1 proc. trifluoracto rūgštis (≥99 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija), skruzdžių rūgštis (≥99.85 proc. Sigma- Aldrich, Vokietija).
2.2.3. Chromatografavimo sąlygos
Binarins gradientas susidarė iš tirpiklių: A – 0,1 proc. trifluoracto rūgštis, B – acetonitrilas. Eliuento sudėties kitimas pateikiamas 2 lentelėje.
2 lentelė. Gradientinio eliuento sudėties kitimas
Laikas (min) Judančioji fazė A (proc. v/v) Judančioji fazė B (proc. v/v)
0 100 → 65 0 → 35
25 65 → 25 35 → 75
28 25 → 5 75 → 95
33 5 → 5 95 → 95
35 5 → 65 95 → 35
Kolonėlė: ACE C18, porų dydis 3 μm, 150 mm ilgio, 3,0 mm skersmens. Kolonėlėje palaikoma temperatūrva: 25 °C.
Mobilios fazės tekėjimo greitis: 1,0 ml/min. Injekcijos tūris: 10 µl.
Detekcija: ksantohumolis nustatytas prie 363 nm šviesos bangos ilgio, izoksantohumolis – prie 288 nm šviesos bango ilgio.
Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) programinė įranga.
2.2.4. Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloniniai tirpalai buvo ruošiami iš standartizuotų ksantohumolio (≥96 proc.) ir izoksantohumolio (≥99 proc.). Pasverta (tikslus kiekis) 20 mg. Milteliai suberti į 10 ml matavimo kolbą, tirpinami 5 ml metanolio ir skiedžiami distiliuotu vandeniu iki žymos. Paruošti etaloniniai tirpalai supilami į tamsaus stiklo buteliukus.
2.2.5. Mėginių paruošimas analizei
Alaus mėginiai. Prieš tyrimą alus laikomas, esant 4 °C temperatūrai šaldytuve. Tiriamieji mėginiai tiriami iškart atidarius alaus buteliuką. Kiekvieno alaus mėginio paimama 20 ml ir naudojant 20 min ultragarso vandens vonelę pašalinama alaus puta. Naudojamas rotacinis garintuvas, alaus mėginiams sukoncentruoti, esant 60 °C temperatūrai. Po koncentracijos, mėginiai laikomi kambario temperatūroje, jog atvėstų. Pilama 4 ml tirpiklio metanolio. Mėginys perkeliamas į ultragarso vonelę ir ekstrahuojamas dar 15 min. Po ultragarso, mėginiai filtruojami per membraninius 0,45 µm porų skersmens filtrus. Paruoštas tirpalas tiesiogiai analizuojamas ESC.
Apynių spurgų arbata ir apynių granulės.1 g apynių granulių smulkinama grūstuvėje, gauti milteliai sijojami per 20 nr. sietą. 0,5 g miltelių ektrahuojama su 50 ml metanolio/skruzdžių rūgštimi (99:1 v/v). Mišinys veikiamas ultragarsu 30 min. Po centrifugacijos ekstraktas filtruojamas per membraninius 0,25 µm porų skersmens filtrus. Ekstraktas perkeliamas į mėgintuvėlį ir analizuojamas ESC. Apynių spurgų paruošimas analizei –analogiškas.
2.3. Alaus kartumo vienetų nustatymas, taikant spektrofotometrinį metodą
2.3.1. Įranga
Tyrimui naudotas spektrometras – Halo DH-20 UV-Vis Dinamika GmbH (Šveicarija). Tiriama, kai UV šviesos bangos ilgis yra 275 nm. Naudojama stačiakampė kvarcinio stiklo kiuvetė; kiuvetės absorbuojančiojo sluoksnio storis – 1 cm.
2.3.2. Reagentai
Izooktanas (2,2,4-trimetilpentanas), druskos rūgštis (37 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija). Dejonizuo-tas vanduo paruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema ,,Millipore“.
2.3.3. Mėginių paruošimas
2 ml alaus mėginys parūgštinamas 200 ml 6 N druskos rūgštimi. Vykdoma ekstrakcija su 4 ml izooaktanu. Alus ir izooktanas yra emulsuojami intensyviu maišymu. Maišoma, kol gaunama emulsija. Šis maišymas leidžia ekstrahuoti rūgštį į organinę fazę. Tirpalas centrifuguojamas ir analizuojamas tik supernatantas – viršnuosėdinis skystis.
2.4. Statistinė duomenų analizė
Statistinė dumenų analizė atlikta „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) kompiuterinėmis programomis. Apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir 10 proc. paklaida. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas taikant Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA.
3. REZULTATAI
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija
Metodo validacijai atlikti, naudoti šie parametrai: • Specifiškumas (angl. Specificity)
• Tiesiškumas (angl. Linearity)
• Glaudumas. Šį parametrą sudaro pakartojamumo (angl. Repeatability) ir atkartojamumo (angl. Reproducibility) parametrai
• Aptikimo (angl. LoD – limit of detection) ir nustatymo (angl. LoQ – limit of quantification) ribos
3.1.1. Metodikos specifiškumas
Parametras įrodo, jog šia metodika galima vienareikšmiškai įrodyti analitės buvimą. Parametrui įvertinti yra lyginamos tiriamųjų ir etaloninių tirpalų chromatogramos, vertinami sulaikymo laikai ir UV spektrai. 8 pav. pateikta etaloninių ksantohumolio ir izoksantohumolio tirpalų chromatogramos. 3 lentelėje pateiktos ksantohumolio ir izoksantohumolio tirpalų sulaikymo trukmės skirtinguose apynių produktuose ir alaus mėginiuose.
3 lentelė. Ksantohumolio ir izoksantohumolio sulaikymo trukmės skirtinguose mėginiuose
Mėginio pavadinimas ir šalis
Ksantohumolio sulaikymo trukmė (min) Izoksantohumolio sulaikymo trukmė (min) Alus 1, Lietuva 21,161 10,518 Alus 2, Lietuva 21,051 10,521 Alus 3, Lietuva 21,038 10,488 Alus 4, Prancūzija 21,079 10,508 Alus 5, Dž. Britanija 21,057 10,493 Alus 6, Švedija 21,076 10,498 Alus 7, Dž. Britanija 21,036 10,483
Nepasterizuotas alus 8, Lietuva 21,061 10,486
Nepasterizuotas alus 9, Lietuva 21,026 10,495
Apynių granulės 21,043 10,488
Apynių arbata 21,049 10,503
Vidurkis 21,062 10,498
Lyginant etalono ksantohumolio ir mėginių sulaikymo trukmes, darome išvadą, jog jie sutampa. Lyginant etalono izoksantohumolio ir mėginių sulaikymo trukmes, darome išvadą, jog jie taip pat sutampa.
Lyginami etalono ir tiriamosios medžiagos UV šviesos absorbcijos spektrai. Palyginimui pasirinkti etaloninių ksantohumolio (9 pav.), izoksantohumolio (10 pav.) bei alaus mėginio nr. 1 spektrai (11 pav.).
9 pav. Etaloninio ksantohumolio tirpalo UV šviesos absorbcijos spektras
11 pav. Nr. 1 alaus mėginio UV šviesos absorbcijos spektras
Kadangi sutampa etalono ir tiriamųjų mėginių sulaikymo trukmės ir UV absorbcijos spektrai, galime teigti kad specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.
3.1.2. Tiesiškumas
Ksantohumolio ir izoksantohumolio tiesiškumas buvo vertinamas analizuojant skirtingų koncentracijų standartinius tirpalus intervale. Ksantohumolio nuo 0,54297 µg/ml iki 17,375 µg/ml. Kalibracinės kreivės lygtis Y = 8,3179x + 0,03. Gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos keoficientu R2 = 0,9999 (žr. 5 lentelę). 12 pav. pateikiama kalibracinė kreivė.
Izoksantohumolio – nuo 0,74219 µg/ml iki 23,75 µg/ml. Kalibracinės kreivės lygtis Y = 15,5988x + 0,03. Gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos keoficientu R2 = 0,9999 (žr. 4 lentelę).
13 pav. pateikiama kalibracinė kreivė.
4 lentelė. Ksantohumolio ir izoksantohumolio tiesiškumo parametrai
Analitė Koreliacijos keoficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (µg/ml) Ksantohumolis R2 = 0,9999 Y = 8,3179x + 0,03 0,54297–17,375 Izoksantohumolis R2 = 0,9999 Y = 15,5988x + 0,03 0,74219–23,75
12 pav. Ksantohumolio kalibracinė kreivė
Ksantohumolio kalibracinės kreivės koreliacijos keoficientas ˃0,9999. Tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas.
13 pav. Izoksantohumolio kalibracinė kreivė
Izoksantohumolio kalibracinės kreivės koreliacijos keoficientas ˃0,9999. Tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas.
3.1.3. Glaudumas
Metodo glaudumui įvertinti apskaičiuotas rezultatų, gautų analizės metu, pakartojamumas bei atkuriamumas. Pakartojamumas (angl. Repeatability) parodo rezultatų tikslumą, analizę atliekant tą pačią dieną tokiomis pačiomis sąlygomis. Pakartojamumo tyrimui penkis kartus injekuoti ksantohumolio ir izoksantohumolio etalonai (14 ir 15 pav.). Atkuriamumas (angl. Reproducibility) išreiškia rezultatų tikslumą, esant toms pačioms analizės sąlygoms per ilgesnį laiko tarpą – dvi skirtingas dienas (16 ir 17 pav.). Pakartojamumas ir atkuriamumas įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). SSN– tai standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykis, kuris yra išreikštas procentais. Santykinio standartinio nuokrypio vertė kiekybinio nustatymo atveju turi būti ≤5 proc.
Ksantohumolio analičių sulaikymo laikas pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimuose kito, atitinkamai, nuo 21,038 min. iki 21,066 min. ir nuo 21,032 min. iki 21,066 min. Izoksantohumolio analičių sulaikymo laikas pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimuose kito, atitinkamai, nuo 10,455 min. iki 10,479 min. ir nuo 10,455 iki 10,479 min.
Tiek ksantohumolio, tiek izoksantohumolio analičių SSN ir sulaikymo laikui, ir smailės plotui neviršijo nurodytos 5 proc. normos kiekybiniam tyrimui. (5, 6 lentelės)
15 pav. Izoksantohumolio pakartojamumas
5 lentelė. Analizuojamų etaloninių ksantohumolio ir izoksantohumolio tirpalų pakartojamumo variacijos keoficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Ksantohumolis 0,1 0,2
Izoksantohumolis 0,1 0,1
17 pav. Izoksantohumolio atkuriamumas
6 lentelė. Analizuojamų etaloninių ksantohumolio ir izoksantohumolio tirpalų atkuriamumo variacijos keoficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Ksantohumolis 0,1 0,2
Izoksantohumolis 0,1 0,2
3.1.4. Ksantohumolio ir izoksantohumolio aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ)
ribos
Aptikimo riba (angl. LoD – limit of detection) – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, tačiau nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Remiantis ICH gairėmis, vertinant aptikimo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 3 arba 2:1.
Nustatymo riba (angl. LoQ – limit of quantification) – tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose. Vertinant nustatymo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 10:1 (7 lentelė) [64].
7 lentelė. Ksantohumolio ir izoksantohumolio aptikimo ir nustatymo ribos
Analitė LoD (µg/ml) LoQ (µg/ml)
Ksantohumolis 0,07 0,19
Izoksantohumolis 0,09 0,22
3.2. Apynių produktų ir alaus tyrimo rezultatai
Darbe siekiama įvertinti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį skirtinguose alaus mėginiuose ir apynių produktuose: granulėse ir arbatoje.
3.2.1. Kokybinis ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymas
Eksperimentinių tyrimų metu, pagal sulaikymo laikus ir spektrų atitikimus identifikuoti junginiai ksantohumolis ir izoksantohumolis. Visuose mėginiuose buvo rastos šios dvi medžiagos. Jų sulaikymo laikai pateikti 4 lentelėje.
3.2.2. Kiekybinis ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatymas
Etanolinių tirpalų paruošimas kalibracinei kreivei sudaryti. Šiam tyrimui buvo pasirinktas gradavimo grafiko metodas, nustatyti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekį alaus ir apynių produktų mėginiuose.
Pasverta 17,375 mg ksantohumolio miltelių, kurie ištirpinti 5 ml metanolio ir praskiesti distiliuotu vandeniu iki 10 ml žymos (tirpalas F). Kalibracinei kreivei sudaryti atlikti standartinio tirpalo F skiedimai (8 lentelė). 1 ml tirpalo F skiedžiamas 1 ml metanolio ir vandens mišiniu, gaunamas tirpalas E. Kiti tirpalai D, C, B ir E skiedžiami analogiškai. kalibracinė kreivė nubrėžta per 6 taškus. Izoksantohomolio kalibracinei kreivei pasverta 23,75 mg. Etaloninis tirpalas tirpalas ruošiamas analogiškai.
8 lentelė. Standartinių tirpalų ruošimas kalibracinės kreivės sudarymui Tirpalas A Tirpalas B Tirpalas C Tirpalas D Tirpalas E Tirpalas F XN koncentracija (mg/ml) 0,54297 1,08594 2,17188 4,34375 8,6875 17,375 IX koncentracija (mg/ml) 0,74219 1,48438 2,9688 5,9375 11,875 23,75
Ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekis nustatymas aluje. Tyrimui pasirinkti 9 skirtingi kartūs alūs, kurių sudėtyje tikimasi aptikti tam tikrą kiekį ksantohumolio ir izoksantohumolio. Žemiau pateiktos alaus ksantohumolio ir izoksantohumolio chromatogramos, kuriose aptinkami didžiausi ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekiai.
Alus: nr. 2, Lietuva. 18 pav. chromatogramoje pateiktas ksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nr.2 (Lietuva) aluje.
18 pav. Nr. 2 alaus mėginio chromatograma
19 pav. chromatogramoje pateiktas izoksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nr. 2 (Lietuva) aluje.
19 pav. Nr. 2 alaus mėginio chromatograma
Alus: nr. 5, Dž. Britanija. 20 pav. chromatogramoje pateiktas ksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nr. 5 (Dž. Britanija) aluje.
21 pav. chromatogramoje pateiktas izoksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nr. 5 (Dž. Britanija) aluje.
21 pav. Nr. 5 alaus mėginio chromatograma
Alus: nepasterizuotas nr. 8, Lietuva. 22 pav. chromatogramoje pateiktas ksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nepasterizuotame nr. 8 (Lietuva) aluje.
23 pav. chromatogramoje pateiktas izoksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas nepasterizuotame nr. 8 (Lietuva) aluje.
23 pav. Nr. 8 alaus mėginio chromatograma
Ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio nustatymas apynių arbatoje ir granulėse. Analizuojamos apynių granulės ir apynių spurgų arbata. Žemiau pateiktos šių produktų ksantohumolio ir izoksantohumolio chromatogramos, kuriose aptinkami didžiausi ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekiai.
Apynių spurgų arbata, Lietuva. 24 pav. chromatogramoje pateiktas ksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas „apynių spurgų arbatoje (Lietuva).
24 pav. Apynių spurgų arbatos chromatograma
25 pav. chromatogramoje pateiktas izoksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas apynių spurgų arbatoje (Lietuva).
25 pav. Apynių spurgų arbatos chromatograma
Restorano – alaus daryklos apynių granulės, naudojamos alaus gamybai. 26 pav. chromatogramoje pateiktas ksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas restorano – alaus daryklos apynių granulėse.
26 pav. Apynių granulių chromatograma
27 pav. chromatogramoje pateiktas izoksantohumolio pikas ir sulaikymo laikas restorano – alaus daryklos apynių granulėse.
27 pav. Apynių granulių chromatograma
3.2.3. Nustatyto ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio aluje ir apynių
produktuose tyrimo rezultatai
9 lentelė. Alaus mėginių ir apynių produktų tyrimo rezultatai
Produktai, sudėtyje turintys
apynių Ksantohumolio kiekis(µg/ml)
Izoksantohumolio kiekis (µg/ml) Alus nr. 1, Lietuva 0,205 0.095 Alus nr. 2, Lietuva 0,990 3,342 Alus nr. 3, Lietuva 1,075 1,884 Alus nr. 4, Prancūzija 0,096 0,462 Alus nr. 5, Dž. Britanija 0,562 4,997
Alus nr. 6, Švedija neaptikta 0,260
Alus nr. 7, Dž. Britanija 0,022 1,296
Nepasterizuotas alus nr. 8,
Lietuva 0,015 0,819
Nepasterizuotas alus nr. 9,
Lietuva neaptikta 0,600
Apynių spurgų arbata,
Lietuva 10,170 1,969
3.3. Kartumo vienetų (IBU) apskaičiavimas
Darbe siekiama įvertinti alaus kartumo rodiklį ir palyginti su deklaruojamu kiekiu ant alaus etiketes. Kuo didesnis IBU, tuo daugiau alaus sudėtyje yra apynių. Todėl šio tyrimo metu ieškomas ryšys tarp IBU vertės ir ksantohumolio bei izoksantohumolio kiekio aluje. IBU apskaičiavimui, naudota ši formulė: IBU = A275 nm ´ 50. A275 – alaus absorbcija, esant 275 nm bangos ilgiui. 10 lentelėje pateiktas deklaruojamas IBU kiekis ant alaus etiketės ir tyrimo metu apskaičiuotas IBU kiekis pagal anksčiau nurodytą formulę. Tyrimo metu abosorbcija matuojama tris kartus ir išvedamas vidurkis. Galima tyrimo paklaida ± 10 proc.
10 lentelė. Alaus mėginių kartumo vienetų kiekis
Eil. nr Mėginio pavadinimas Deklaruojamas IBU kiekis Nustatyto IBU kiekio vidurkis Paklaida ± 10 proc.
1. Alus nr. 1, Lietuva 45 39 ± 3,9 proc.
2. Alus nr. 2, Lietuva 38 45 ± 4,5 proc.
3. Alus nr. 3, Lietuva 30 39 ± 3,9 proc.
4. Alus nr. 4, Prancūzija 30 30 ± 3 proc.
5. Alus nr. 5, Dž. Britanija 40 49 ± 4,9 proc.
6. Alus nr. 6, Švedija 38 37 ± 3,7 proc.
7. Alus nr. 7, Dž. Britanija 43 32 ±3,2 proc.
8. Nepasterizuotas alus nr. 8, Lietuva nenurodyti 20 ±2 proc. 9. Nepasterizuotas alus nr. 9, Lietuva nenurodyti 35 ± 3,5 proc.
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Ksantohumolio ir izoksantohumolio kokybinis tyrimas. Iš 7 tirtų komercinių Lietuvos rinkai tiekiamų alaus rūšių ir 2 gyvo alaus pavyzdžių – ksantohumolis nustatytas 7 alaus mėginiuose. 5 iš 9 alaus mėginių ksantohumolis viršija aptikimo ribą, kuri yra 0,07 µg/ml. Izoksantohumolis nustatytas visuose alaus mėginiuose ir jo kiekis viršija aptikimo ribą, kuri yra 0,09 µg/ml. Apynių spurgų granulės ir arbata viršijo aptikimo ribas ir visuose tirtuose mėginiuose buvo nustatytas ksantohumolis ir izoksantohumolis, atsižvelgiant į analitės sulaikymo laiką bei spektro atitikimą, lyginant su standartiniais tirpalais.
Ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekybinis tyrimas. Iš 7 tirtų komercinių Lietuvos rinkai tiekiamų alaus rūšių ir 2 gyvo alaus pavyzdžių, ksantohumolio kiekis 5 alaus mėginiuose viršija nustatymo ribą, kuri yra 0,19 µg/ml. Izoksantohumolio kiekis nustatytas 6 iš 7 alaus mėginiuose, jo kiekis viršija nustatymo ribą, kuri yra 0,22 µg/ml. Taip pat apynių spurgų granulės ir arbata viršijo nustatymo ribas.
11 lentelė pateikta ksantohumolio ir izoksantohumolio nustatytų kiekių intervalas tirtame aluje. 11 lentelė. Ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekių intervalai alaus mėginiuose
Ksantohumolio kiekio intervalas
(µg/ml) 0,015–1,075
Izoksantohumolio kiekio intervalas
(µg/ml) 0,095–3,342
Apžvelgti užsienio tyrimai, kurių metu ištirta alaus cheminė sudėtis (žr. 12 lentelę). Remiantis šiais tyrimais sudarytas ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio intervalas [65–68].
12 lentelė. Mokslinių tyrimų metu nustatyti ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekio intervalai aluje
Ksantohumolio kiekio intervalas
(µg/ml) 0,002–1,2
Izoksantohumolio kiekio intervalas
(µg/ml) 0,04–3,44
Lyginant su anksčiau atliktais moksliniais tyrimais, šio darbo rezultatai atitiko ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekius. Šių biologiškai aktyvių medžiagų buvo rasta tiek kiek ir tikėtasi.
Didžiausias ksantohumolio kiekis aptiktas nr. 3 (Lietuva) aluje. Ksantohumolio kiekis – 1,075 µg/ml, izoksantohumolio kiekis – 1,884 µg/ml. Izoksantohumolio yra 1,75 karto daugiau. Nr. 2 (Lietuva) aluje ksantohumolio – 0,990 µg/ml, izoksantohumolio – 3,342 µg/ml. Izoksantohumolio yra 3,4 karto
daugiau. Nr. 5 (Dž. Britanija) aluje nustatytas ksantohumolio kiekis – 0,592 µg/ml. Izoksantohumolio – 4.997 µg/ml. Izoksantohumolio yra 8,9 karto daugiau. Tai didžiausi medžiagų kiekiai nustatyti šiame tyrime.
2016 m. „Thermo Fisher Scientific“ tyrime buvo tirti keturi skirtingi IPA stiliaus alaus mėginiai. Izoksantohumolio kiekis viršijo ksantohumolio kiekį nuo 2,7 iki 4,2 karto. Dviejuose iš keturių alaus pavyzdžių, ksantohumolis nebuvo aptiktas, o izoksantohumolio kiekis 0,3–0,8 µg/ml [69].
2018 m. Japonijoje atliktame tyrime, izoksantohumolio kiekis trijuose alaus mėginiuose buvo didesnis nei ksantohumolio nuo 7,4 iki 20 kartų [70]. Šių tyrimų rezultatai įrodo, jog izoksantohumulio kiekis aluje yra visada didesnis nei ksantohumolio. Tai patvirtino ir šio darbo analizuojamų alaus mėginių rezultatai.
Kadangi šiame darbe buvo analizuojamos tiek lietuviškos, tiek užsienietiškos alaus rūšys, procentiškai palyginami ksantohumolio ir izoksantohumolio kiekiai. (30 ir 31 pav.).
30. pav. Ksantohumolio kiekio procentinė lyginamoji skritulinė diagrama lietuviškose ir užsienietiškose alaus rūšyse
31. pav. Izoksantohumolio kiekio procentinė lyginamoji skritulinė diagrama lietuviškose ir užsienietiškose alaus rūšyse
72% 28%
Ksantohumolio kiekio vidurkis lietuviškame ir užsienietiškame aluje
Lietuviškas alus Užsienietiškas alus
43% 57%
Izoksantohumolio kiekio vidurkis lietuviškame ir užsienietiškame aluje
Nustatyta, jog didesnis ksantohumolio kiekis yra būtent lietuviškame aluje, o izoksantohumolio – užsienietiškame. Taigi skirtingas alaus gamybos procesas gali daryti įtaką biologiškai aktyvių medžiagų kiekiui. [71].
Nors buvo tikimasi, jog nepasterizuotame aluje, nei komerciniame bus didesnis kiekis biologiškai aktyvios medžiagos, hipotezė nepasiteisino. Kadangi komercinis alus apdorojamas dideliu karščiu, tokiu būdu prailginant produkto galiojimo laiką. Be to nepasterizuotas alus yra nefiltruojamas, o tai gali teigiamai paveikti apynių išeigą. Restorano – alaus daryklos nepasterizuotame nr. 8 aluje rasta tik 0,015 µg/ml ksantohumolio. Bet izoksantohumolio kiekis žymiai didesnis – 0,819 µg/ml. Vadinasi, alaus gaminimo metu, vyksta sparti izomeracija.
Nepasterizuotame nr. 9 aluje ksantohumolio kiekis nenustatytas, o izoksantohumolio – 0,6 µg/ml. Galima numanyti, jog dėl specifinės alaus gaminimo technologijos – vyksta izomerizacija. Šiuo metu tyrimų su nepasterizuotu alumi nėra, analziuojami tik komerciniai alūs [10].
Itin didelis ksantohumolio kiekis nustatytas apynių granulėse – 145,986 µg/ml. Izoksan- tohumolio kiekis – 6,122 µg/ml. Šios apynių granulės yra dedamos verdant nepasterizuotą nr. 8 alų. Tuo tarpu aluje rastas kiekis tik 0,015 µg/ml. Ksantohumolio kiekis 23,8 karto didesnis už izoksantohuolio. Todėl šis ksantohumolio kiekio skirtumas, skirtinguose apynių produktuose, įrodo, kokią įtaką daro alaus gamybos procesas, kurio metu XN virsta IX. Tad šių bologiškai aktyvių medžiagų kiekį gali paveikti temperatūriniai pokyčiai, fermentacija ir filtracija alaus gamybos metu [10].
Apynių arbatoje nustatytas 10,170 µg/ml ksantohumolio kiekis ir 1,969 µg/ml izoksan- tohumolio kiekis. Bet būtina atsižvelgti, jog arbata yra užpilama karštu vandeniu ir tai gali inicijuoti ksantohuumolio izomerizaciją. Šiame mėginyje ksantohumolio kiekis 5,1 karto didesnis nei izoksantohumolio. Tyrimo metu buvo tirta tik apynių spurgų žaliava. Moksliniai tyrimai su arbata ir granulėmis nepublikuoti.
Taip pat buvo lyginami alaus kartumo vienetai, nurodyti ant etiketės ir apskaičiuoti tyrimo metu. Nr. 1 alaus etiketėje deklaruojamas IBU yra 45, ištyrus – 39. Alaus nr. 2 IBU – 38, nors tyrimo metu paaiškėjo, jog jis yra didesnis, nei tvirtina gamintojas – 45. Būtent šiame aluje ir aptiktas didelis ksantohumolio kiekis. Nepasterizuoto alaus gamintojai etiketėse nerašo IBU kiekio, bet nustatyti alaus kartumo vienetų kiekiai nėra dideli – nr. 8 alaus IBU 20. Tai mažiausias kartumo vienetų rodiklis visuose tirtuose aluose. Nr. 9 alaus – 35 IBU. Kadangi IBU žymi apynių internsyvumą, buvo tikėtasi, jog tai turės įtaką ksantohumolio kiekiui aluje. Koreliacija tarp ksantohumolio ir IBU apskaičiuota pagal Pirsono koreliacijos koeficientą (r=0,681), tai statistiškai reikšmingas rezultatas (p≤0,05). Tuo tarpu koreliacijos tarp IBU irizoksantohumolio nėra. Vadinasi, kuo didesnis kartumo vienetų skaičius nurodomas etikėteje, tuo didesnė tikimybė, jog tos rūšies aluje bus didesnis kiekis apynių, o tai turi įtaką ir ksantohumolio kiekiui.
