LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VIKTOR MAMČIC
ACETILSALICILO RŪGŠTIES, KAPTOPRILIO IR
HIDROCHLORTIAZIDO MIŠINIO TYRIMAS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. Augusta Ževžikovienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr., Ramunė Morkūnienė Data:
ACETILSALICILO RŪGŠTIES, KAPTOPRILIO IR
HIDROCHLORTIAZIDO MIŠINIO TYRIMAS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovė Recenzentas Doc. Augusta Ževžikovienė
Data: Data: Darbą atliko Magistrantas Viktor Mamčic Data: Kaunas, 2018
TURINYS
SANTRAUKA ...5
SANTRUMPOS...7
SĄVOKOS ...8
ĮVADAS ...9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo paplitimas ... 11
1.1.1 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo paplitimas Lietuvoje .. 11
1.1.2 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo Baltijos šalyse palyginimas. ... 13
1.2 Bendros žinios apie tiriamas vaistines medžiagas ... 16
1.2.1 Acetilsalicilo rūgštis... 16 1.2.2 Kaptoprilis ... 16 1.2.3 Hidrochlortiazidas ... 17 1.3 Farmakologinis veikimas ... 18 1.3.1 Acetilsalicilo rūgštis... 18 1.3.2 Kaptoprilis ... 18 1.3.3 Hidrochlortiazidas ... 18 1.4 Apsinuodijimų reiškiniai ... 19 1.4.1 Acetilsalicilo rūgštis... 19 1.4.2 Kaptoprilis ... 19 1.4.3 Hidrochlortiazidas ... 20
1.5 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido tyrimas ESC metodu ... 20
1.5.1 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 21
1.5.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti acetilsalicilo rūgštį, kaptoprilį bei hidrochlortiazidą. ... 21
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
2.1 Tyrimo objektas ir metodika ... 24
2.1.1 Tyrimo objektas ... 24
2.1.2 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas skysčių chromatografijos metodu... 24
3. REZULTATAI IR APTARIMAS ... 27
3.1.1 Kolonėlės pasirinkimas ... 27
3.1.2 Eliuento pasirinkimas ... 27
3.1.3 Eliuento tekėjimo greičio pasirinkimas... 27
3.2 Pritaikyto efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija ... 28
3.2.1 Metodo specifiškumas... 28
3.2.2 Metodo preciziškumas ... 31
3.2.3 Metodo tiesiškumas ... 34
3.2.4 Tiriamųjų medžiagų aptikimo bei nustatymo ribos. ... 36
3.3 Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu... 36
3.3.1 Kokybinė vaistinių preparatų analizė. ... 36
3.3.2 Kiekybinė vaistinių preparatų analizė ... 39
4. IŠVADOS... 40
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
SANTRAUKA
ACETILSALICILO RŪGŠTIES, KAPTOPRILIO IR
HIDROCHLORTIAZIDO MIŠINIO TYRIMAS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
V. Mamčic magistro baigiamasis darbas / mokslinė vadovė doc. Augusta Ževžikovienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Analizinės
ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2018.
Tyrimo tikslas: Parinkti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, tinkančią acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio komponentų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui ir ją pritaikyti šių medžiagų nustatymui tabletėse.
Tyrimo metu iškelti uždaviniai: modifikuoti ir pritaikyti literatūros šaltiniuose publikuotas ESC metodikas acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui. Validuoti acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio kokybinio ir kiekybinio įvertinimo metodiką. Pritaikyti validuotą ESC metodiką acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui tabletėse.
Darbo metu buvo taikytos, modifikuojamos ir optimizuojamos įvairios ESC metodikos. Tinkanti metodika buvo validuota ir pritaikyta acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei
hidrochlortiazido mišinio komponentų nustatymui tabletėse.
Rezultatai: sukurta ESC metodika, kurioje eliuentas yra acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas (50:50, v/v). Metodika buvo validuota ir sėkmingai pritaikyta acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio tabletėse kiekybiniam ir
kokybiniam nustatymui.
Išvados: Sukurta ESC metodika, tinkanti acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio tabletėse nustatymui.
SUMMARY
ANALYSIS OF ACETYLSALICYLIC ACID, KAPTOPRIL AND
HYDROCHLORTHIAZIDE MIXTURE BY LIQUID
CHROMATOGRAPHY
Viktor Mamčic. Master's thesis/Scientific supervisor doc. Augusta Ževžikovienė. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and
Toxicological Chemistry Departament. Kaunas, 2018.
The aim of this work was to select an effective liquid chromatographic method, suitable for the qualitative and quantitative assessment of the components of acetylsalicylic acid,
captopril and hydrochlorothiazide mixture and to apply it to the determination of these substances in tablets.
In order to achieve our goal we have set ourselves tasks: to modify and apply ESC methodology for the separation as well as qualitative and quantitative assessment of components of the acetylsalicylic acid, captopril and hydrochlorothiazide mixture. To validate the qualitative and quantitative evaluation of the mixture of acetylsalicylic acid, captopril and
hydrochlorothiazide. To apply a validated ESC method for the qualitative and quantitative assessment of acetylsalicylic acid, captopril and hydrochlorothiazide in tablets.
During the work, various ESC techniques were applied, modified and optimized. The proper methodology has been validated and adapted to determine the components of
acetylsalicylic acid, captopril, and hydrochlorothiazide mixture in tablets
Results: An ESC methodology was developed, in which the eluent is acetonitrile and an aqueous solution of 0.1% trifluoroacetate (TFA) acid (50:50, v / v). The methodology was validated and successfully applied for the quantitative and qualitative determination of acetylsalicylic acid, captopril, and hydrochlorothiazide in tablets.
Conclusions: An ESC methodology for the determination of acetylsalicylic acid, captopril, and hydrochlorothiazide in tablets had been developed.
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija.
PSO – pasaulinė sveikatos organizacija.
PDA – fotodiodų matricos detektorius.
UV – ultravioletinė spinduliuotė.
ATC - Anatominė-Terapinė-Cheminė vaistų klasifikacija.
AKFI – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitorius.
RT – analitės sulaikymo laikas.
SĄVOKOS
Antiagregantas – vaistas, kuris mažina krešėjimo faktorių aktyvumą ir pasižymi kraujo krešėjimą mažinančiu poveikiu.
Angiotenzinas – oligopeptidinis hormonas, kuris sukelia vazokonstrikciją ir arterinio kraujo spaudimo padidėjimą.
Ciklooksigenazė – fermentas, kuris dalyvauja prostaglandinų sintezėje (skatina uždegimo procesą).
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių ligos yra viena iš aktualiausių problemų pasaulyje. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis nuo šių ligų 2012 metais mirė 17,5 milijonų žmonių, kas sudaro apie 31 proc. visų mirties atvejų pasaulyje. Todėl labai svarbi tinkama širdies ir kraujagyslių ligų profilaktika bei efektyvus, savalaikis ir kryptingas gydymas [32].
Dažniausiai pasitaikanti širdies ir kraujagyslių liga yra hipertenzija [32]. Pirmo pasirinkimo vaistų grupė šios ligos gydymui yra tiazidiniai diuretikai. Konkretaus šios grupės atstovo pasirinkimą sąlygoja kaina bei vaisto saugumas. Vienas iš saugiausių ir pigiausių tiazidinių diuretikų yra hidrochlortiazidas [10,33,34]. Jeigu diuretikai yra neefektyvūs arba pacientas negali jų vartoti, skiriamas kitas vaistas. Antro pasirinkimo vaistų grupė hipertenzijos gydymui yra angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai (AKFI) [10]. Lietuvoje dažnai vartojamas yra kaptoprilis, kuris padeda greitai ir efektyviai sumažinti kraujo spaudimą ir koreguoti hipertenzijos priepuolius. Gydytojai, be minėtų vaistų, taip pat dažnai skiria kraują ir kraujodarą veikiančius vaistus. Dažniausiai yra skiriama acetilsalicilo rūgštis, nes tai yra vienas iš pigiausių ir efektyviausių antiagregantų [2,3,4,31].
Lietuvoje visų trijų paminėtų vaistų vartojimas kartu yra labai dažnas [2,3]. Pacientai gali jų perdozuoti, gali pasireikšti sąveikos ir apsinuodijimai, o sunkiausiais atvejais ištikti mirtis [6,16,25,34]. Dėl šios priežasties būtina kuo skubiau įvertinti acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido kiekį. Vaistinių preparatų analizė dažniai atliekama taikant efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą [5]. Atliekant literatūros analizę neaptikta ESC metodikos, tinkančios acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortizido mišinio nustatymui. Analizės metodų stoka lėmė tyrimo objektų pasirinkimą, o darbo metu buvo siekiama parinkti tinkamą ESC metodiką acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui ir ją pritaikyti šių medžiagų nustatymui tabletėse.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:Parinkti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, tinkančią acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio komponentų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui ir ją pritaikyti šių medžiagų nustatymui tabletėse.
Darbo uždaviniai:
1. Modifikuoti ir pritaikyti literatūros šaltiniuose publikuotas ESC metodikas acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui.
2. Validuoti acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio kokybinio ir kiekybinio įvertinimo metodiką.
3. Pritaikyti validuotą ESC metodiką acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui tabletėse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo
paplitimas
Siekiant įvertinti vaistų suvartojimą remiamasi PSO atstovaujamų organizacijų sukurta ATC-DDD metodologija. Remiantis šia metodologija, vaistai klasifikuojami pagal anatominę-terapinę-cheminę (ATC) klasifikaciją, o jų suvartojimas pateikiamas vidutinės terapinės paros dozės skaičiumi, tenkančiu tūkstančiui gyventojų per dieną (DDD) [36].
1.1.1 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo
paplitimas Lietuvoje
Lietuvos vaistų suvartojamumo duomenis kaupia VVKT (Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba). Remiantis 2016m. duomenimis, daugiausiai suvartojama širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų (C grupė pagal ATC klasifikaciją) [2]. C grupei priklauso 2 tiriamieji vaistai: kaptoprilis ir hidrochlortiazidas [30,33].
Acetilsalicilo rūgštis 100 mg priklauso kraują ir kraujodarą veikiantiems vaistams (B grupė pagal ATC) [29]. Minėtos grupės vaistų suvartojimas yra 6 vietoje [2]. B ir C ATC grupės yra glaudžiai tarpusavyje susijusios, nes kartu su širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiais vaistais dažnai vartojami ir kraują bei kraujodarą veikiantys vaistai [10].
Per paskutinius 5 metus širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų suvartojimas nežymiai padidėjo (3,3%), tačiau nuo 2014 iki 2015 metų C grupės vaistų suvartojimas šiek tiek mažėjo, o 2015 ir 2016 metais praktiškai nepasikeitė. B grupės vaistų suvartojimas padidėjo 20,36%, 2015-2016 metais augimo tendencija išliko (3,87%), nepaisant to, kad 2014-2015 metais B grupes vaistų suvartojimas sumažėjo 0,17% (1 lentelė) [3].
Acetilsalicilo rūgštis 100 mg priklauso kraują ir kraujodarą veikiantiems vaistams. Tai salicilo rūgšties darinys. Jis priskiriamas prie trombocitų agregaciją slopinančių vaistų (B01AC pagal ATC klasifikaciją) [29]. Lietuvoje dažniausiai vartojami 2 šios grupės vaistai: acetilsalicilo rūgštis 100 mg bei klopidogrelis. Kitų vaistų (pvz. tikagreloro) suvartojimas nesiekia 1 DDD
/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną [2]. Klopidogrelio suvartojimas 2016m. 8,194 DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną, kas yra 6,36 karto mažiau, nei acetilsalicilo rūgšties 100 mg suvartojimas. Remiantis 2012 – 2016 metų statistikos duomenimis galima teigti, kad
acetilsalicilo rūgšties 100 mg suvartojimas lyginant su 2012 metais padidėjo 8,8% , tačiau vis dar yra mažesnis, nei 2014 metais (2 lentelė) [3].
Kaptoprilis - vienas iš pirolidino darinių, pagal ATC klasifikaciją priklausantis C grupei. Tai grynas AKFI (C09A pagal ATC klasifikaciją) [30,31]. Lietuvoje daugiausiai suvartojama šiai grupei priklausančio perindoprilio ir ramiprilio, atitinkamai 29,074 ir 28,272 DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną. Trečias pagal suvartojimą zofenoprilis, o ketvirtas kaptoprilis [2]. Kaptoprilio suvartojimas per 5 metus praktiškai nepasikeitė. 2016 metais jo suvartota tik 2,93% daugiau, nei 2012 metais (3 lentelė) [3].
1 lentelė. C ir B grupės vaistų suvartojimas 2012 – 2016 metais Lietuvoje [3].
ATC kodas Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną
C Širdies ir kraujagyslių sistemą veikiantys vaistai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai 2016 metai 425,466 438,911 451,853 439,557 439,536 B Kraują ir kraujodarą veikiantys vaistai 69,221 73,886 80,349 80,215 83,317
2 Lentelė. Acetilsalicilo rūgšties 100 mg suvartojimas 2012 – 2016 metais Lietuvoje [3].
ATC kodas Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną
B01AC06 Acetilsalicilo rūgštis
(DDD 1 tabletė) metai 2012 2013 metai 2014 metai 2015 metai 2016 metai 47,525 49,683 52,313 51,116 52,098
3 Lentelė. Kaptoprilio suvartojimas 2012 – 2016 metais Lietuvoje [3]. ATC kodas Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną
C09AA01 Kaptoprilis (DDD 50 mg) 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai 2016 metai 10,569 10,82 11,016 10,762 10,879
Hidrochlortiazidas taip pat priklauso C grupei pagal ATC klasifikaciją, tai tiazidinis diuretikas (C03A pagal ATC klasifikaciją) [33,34]. Lietuvoje nevartojami kitokie tiazidiniai diuretikai, o hidrochlortiazido suvartojimas yra nedidelis. Kita vertus, hidrochlortiazidas plačiai naudojamas kombinaciniuose vaistuose. Pavyzdžiui 2016 metais nebivololio+hidrochlortiazido kombinazijos suvartojimas buvo apie 32 kartus didesnis, nei gryno hidrochlortiazido, o
angiotenzino II antagonistų+hidrochlortiazidų derinių suvartojimas beveik 100 kartų viršijo gryno hidrochlortiazido suvartojimą (4 lentelė) [2,3].
4 Lentelė. Hidrochlortiazido ir jo derinių suvartojimas 2012 – 2016 metais Lietuvoje [2,3].
ATC kodas
Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną
C03AA03 Hidrochlorotiazidas (DDD 25 mg) 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai 2016 metai 0,131 0,128 0,127 0,134 0,147 C07BB12 Nebivololis+Hidrochlorotiazidas 2,236 3,45 4,667 4,887 4,656 CO9DA01 Losartanas+Hidrochlorotiazidas (DDD 1 tabletė) 2,873 2,275 1,802 1,518 1,277 CO9DA03 Valsartanas+Hidrochlorotiazidas (DDD 1 tabletė) 7,794 8,805 9,050 8,365 8,441 CO9DA06 Kandesartanas+Hidrochlorotiazidas (DDD 1 tabletė) - - 0,189 0,623 1,709 CO9DA07 Telmisartanas+Hidrochlorotiazidas (DDD 1 tabletė) 1,123 1,838 2,751 2,679 2,393 CO9DA08 Olmesartanas+Hidrochlorotiazidas (DDD 1 tabletė) 0,445 0,491 0,500 0,523 0,538
1.1.2 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido vartojimo Baltijos
šalyse palyginimas.
Siekiant didesniu mastu įvertinti acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido
suvartojimą, buvo įvertinti kitų šalių duomenys. Latvijos ir Estijos ekonomika yra artimiausia Lietuvai, todėl yra racionalu analizuoti ir lyginti tiriamųjų vaistų suvartojimą Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje siekiant įvertinti vaistų suvartojimo tendencijas ir skirtumus.
2015m. duomenimis Latvijoje acetilsalicilo rūgštis yra plačiausiai naudojamas vaistas. Jo vartojimas nuo 2010 iki 2013 metų augo, o paskutiniais metais beveik nesikeičia. Estijoje
acetilsalicilo rūgšties suvartojama mažiau. 2015 metais jos suvartota apie 4,5 karto mažiau, nei Latvijoje, tačiau šio vaisto suvartojimas Estijoje nuo 2010 iki 2014 metų padidėjo beveik 53% (5 lentelė) [4].
5 lentelė. Acetilsalicilo rūgšties suvartojimas 2010-2015 metais Latvijoje ir Estijoje [4]. ATC
kodas
Pavadinimas Šalis DDD /1000 gyventojų/per dieną
B01AC06 Acetilsalicilo rūgštis (DDD 1 tabletė) 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai Latvija 52.57 62.52 64.61 66.85 66.36 66.20 Estija 9.91 11.53 13,87 14.64 15.16 14.55
AKFI inhibitoriai yra daugiausiai vartojama Estijoje vaistų grupė, o Latvijoje ši grupė užima antrą vietą pagal suvartojimą po antitrombinių vaistų, tačiau šios grupės atstovas kaptoprilis yra mažai vartojamas abejose valstybėse. Jo suvartojimas nesiekia 1 DDD/1000 gyventojų/per dieną. Be to, per 2010-2015 metų laikotarpį kaptoprilio suvartojimas Estijoje sumažėjo net 2,44 karto (6 lentelė) [4].
6 lentelė. Kaptoprilio suvartojimas 2010-2015 metais Latvijoje ir Estijoje [4]. ATC
kodas
Pavadinimas Šalis DDD /1000 gyventojų/per dieną
C09AA01 Kaptoprilis (DDD 50 mg) 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai Latvija 1.02 1.01 0.99 0.99 0.96 0.98 Estija 0.22 0.17 0.15 0.13 0.11 0.09
Hidrochlortiazido suvartojimas Estijoje ir Latvijoje nuolat mažėja. Per 2010-2015 metų laikotarpį jo suvartojimas Latvijoje sumažėjo 39,29 %, o Estijoje 52,2 %. Kita vertus, mišinių, kurių sudėtyje yra hidrochlortiazido, vartojimas per 6 metus Latvijoje padidėjo 2,66 karto, o Estijoje 1,5 karto (7 lentelė) [4].
Taigi, 2015 metais acetilsalicilo rūgšties daugiausiai buvo suvartota Latvijoje. Lietuvoje jos vartojama 22,78% mažiau, o Estijoje acetilsalicilo rūgšties suvartojimas yra 4,53 karto mažesnis, nei Latvijoje ir 3,5 karto mažesnis, nei Lietuvoje. Kaptoprilis yra dažnai vartojamas AKFI Lietuvoje, tačiau kitose Baltijos šalyse jis praktiškai nebevartojamas. Grynas
suvartojimas neviršija 1 DDD/1000 gyventojų/per dieną, o Estijoje suvartojama šiek tiek daugiau. Kita vertus, hidrochlortiazido mišinių su AKFI ar nebivololiu suvartojama žymiai daugiau. Lietuvoje ir Estijoje hidrochlortiazidų mišinių suvartojama praktiškai po lygiai, o Latvijoje jų vartojama šiek tiek mažiau (1 diagrama) [2,3,4]
7 lentelė. Hidrochlortiazido ir jo mišinių suvartojimas 2010-2015 metais Latvijoje ir Estijoje [4].
1 diagrama. Acetilsalicilio rūgšties, kaptoprilio, hidrochlortiazido ir hidrochlortiazido mišinių suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2015 metais [2,3,4]
10 20 30 40 50 60 70
Acetilsalicilo rūgštis Kaptoprilis Hidrochlortiazidas Hidrochlortiazido mišiniai Lietuva Latvija Estija
ATC kodas
Pavadinimas Šalis DDD /1000 gyventojų/per dieną
C03AA03 Hidrochlorotiazidas (DDD 25 mg) 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai Latvija 0.84 0.78 0.72 0.65 0.58 0.51 Estija 5.50 4.41 4.17 3.66 3.18 2.72 C07BB12 CO9DA01 CO9DA03 CO9DA06 CO9DA07 CO9DA08 Hidrochlortiazidas mišiniuose Latvija 4.49 5.41 7.02 9 10.81 11.97 Estija 11.6 13.36 16.1 16.86 16.77 17.69
1.2 Bendros žinios apie tiriamas vaistines medžiagas
1.2.1 Acetilsalicilo rūgštis
Empirinė formulė: C9H8O4. Molekulinė masė: 180,157 g/mol.
IUPAC pavadinimas: 2-acetiloksibenzenkarboksirūgštis.
Savybės: bespalviai arba balti kristalai arba balti kristaliniai milteliai. Drėgmėje medžiaga palaipsniui hidrolizuojasi į acto ir salicilo rūgštis. Lydymosi temperatūra 135 °C, mažai tirpsta vandenyje, gerai etanolyje, chloroforme ir eteryje.
Sinonimai: 2-acetoksibenzoinė rūgštis, salicilo rūgšties acetatas, acetilsalicilo rūgštis [29]. Prekiniai (firminiai) pavadinimai, registruoti Lietuvoje: acetilsalicilo rūgštis
SANITAS, Aspirin Cardio, Aspirin, Thrombo Ass, Provapirin, Hjertamagnyl, Alka-Seltzer, Ascard, Acetylsalicylic acid Grindeks, Heartisan ir kiti [1].
Vaisto forma: tabletės.
Dozės: Nuo 75 iki 500 mg per parą [29].
Empirinė formulė: C9H15NO3S. Molekulinė masė: 217,29 g/mol.
IUPAC pavadinimas: (2S)-1-[(2S)-2-metil-3-sulfanilpropanoil] pirolidon-2-karboksi rūgštis.
Savybės: balti polimorfiniai kristalai. Lydymosi temperatūra 106 °C. Medžiaga labai gerai tirpsta vandenyje, metanolyje, etanolyje ir chloroforme [30].
Prekiniai (firminiai) pavadinimai, registruoti Lietuvoje: CaptoHEXAL, Kaptopril [1]. Vaisto forma: tabletės
Dozės: Nuo 12,5 iki 50 mg per parą [31].
1.2.3 Hidrochlortiazidas
Empirinė formulė: C7H8ClN3O4S2. Molekulinė masė: 297,74 g/mol.
IUPAC pavadinimas: 6-chlor-3,4-dihidro-2H-1,2,4-benzotiadiazin-7-sulfonamid-1,1-dioksidas.
Savybės: balti kristaliniai milteliai, lydymosi temperatūra 273 - 275 °C. Beveik netirpsta vandenyje, chloroforme ir eteryje. Mažai tirpsta etanolyje ir acetone, gerai
dimetilformamide ir natrio hidroksido tirpale. Sinonimai: Chlorosultiadilas [33].
Prekiniai (firminiai) pavadinimai, kurie registruoti Lietuvoje: Hypothiazid [1]. Vaisto forma: tabletės.
1.3 Farmakologinis veikimas
1.3.1 Acetilsalicilo rūgštis
Acetilsalicilo rūgštis yra nesteroidinis vaistas nuo uždegimo. Acetilsalicilo rūgštis slopina prostaglandinų (uždegimo mediatorių) bei tromboksano sintezę blokuodama fermentą
ciklooksigenazę (COX) [28,35]. Vaistas pasižymi priešuždegiminiu, nuskausminamuoju bei antipiretiniu poveikiu ir yra plačiai vartojamas kaip skausmą bei temperatūrą mažinanti medžiaga [2,3,4]. Acetilsalicilo rūgštis taip pat pasižymi trombocitų agregaciją slopinančiu poveikiu [7]. Priešuždegiminis, nuskausminamasis ir antipiretinis poveikis pasireiškia suvartojus 500 mg acetilsalicilo rūgšties. Mažomis dozėmis (75-325 mg) acetilsalicilo rūgštis naudojama širdies ir kraujagyslių ligų profilaktikai [17]. 2012 metais mokslininkai įrodė, kad 75-100 mg acetilsalicilo rūgšties nuolatinis vartojimas mažina tikimybę susirgti pieno liaukų ar storosios žarnos vėžiu [27].
1.3.2 Kaptoprilis
Kaptoprilis yra AKFI. Jis slopina angiotenzino I konvertaciją į angiotenziną II.
Angiotenzino II kiekio mažėjimas sąlygoja aldosterono kiekio sumažėjimą. Dėl to pasireiškia vazodilatacija, mažėja širdies apkrova ir spaudimas [8]. Kaptoprilis vartojamas hipertenzijos ir lėtinio širdies nepakankamumo gydymui. Ilgalaikis kaptoprilio vartojimas mažina miokardo hipertrofijos pasireiškimo tikimybę, gerina miokardo kraujotaką, slopina trombocitų agregaciją, sąlygoja Na+ kiekio miokardo ląstelėse sumažėjimą [22]. 2013 metais buvo publikuotas
straipsnis, kuriame mokslininkai įrodė, kad ilgalaikis kaptoprilio vartojimas slopina Parkinsono ligos progresavimą [26].
1.3.3 Hidrochlortiazidas
Hidrochlortiazidas yra tiazidinis diuretikas [33]. Tiazidiniai diuretikai yra pirmo pasirinkimo vaistai hipertenzijos gydymui. Tokį pasirinkimą sąlygoja didelis efektyvumas ir
maža kaina. Hidrochlortiazidas mažina Na+ reabsorbciją Gentlio kilpoje, blokuoja karboanhidrazę proksimaliniame nefrono kanalėlyje, gerina K+ išskyrimą su šlapimu. Hidrochlortiazidas mažina kraujo spaudimą netiesiogiai. Spaudimas mažėja dėl to, kad dėl diuretinio poveikio mažėja cirkuliuojančio kraujo tūris. [12,34]
1.4 Apsinuodijimų reiškiniai
1.4.1 Acetilsalicilo rūgštis
Apsinuodijimai acetilsalicilo rūgštimi gali sukelti didelį pavojų sveikatai, sunkiais
atvejais - mirtį. Saugi acetilsalicilo rūgšties dozė suaugusiam žmogui yra 4 gramai per parą [11]. Skiriami 3 apsinuodijimo tipai: lengvas, vidutinis ir labai sunkus. Lengvas apsinuodijimas gali pasireikšti suvartojus 150 mg/kg acetilsalicilo rūgšties ir yra nepavojingas. Jis pasireiškia tokiais simptomais kaip pykinimas, vėmimas, pilvo skausmai, mieguistumas bei galvos svaigimas. Vidutiniško apsinuodijimo metu, kai suvartojama 150-300 mg/kg acetilsalicilo rūgšties, didėja temperatūra, pasireiškia hiperventiliacija, ausų spengimas, galimas lengvas sąmonės aptemimas. Sunkaus apsinuodijimo atveju, kai suvartota 300-500 mg/kg acetilsalicilo rūgšties, galimi ryškūs sąmonės sutrikimai (delyras, haliucinacijos, koma), traukuliai, plaučių edema ir mirtis. Mirtis dažniausiai įvyksta dėl plaučių nepakankamumo [13,16]. Acetilsalicilo rūgšties perdozavimas buvo viena didelio mirtingumo priežasčių 1918 metų gripo pandemijos metu. Siekiant malšinti gripo simptomus gydytojai 1918-1919 metų gripo pandemijos metu skirdavo didelius kiekius acetilsalicilo rūgšties savo pacientams (8-30 g. per dieną vienam žmogui) nežinodami, kad tokios dozės gali būti mirtingos [25]. Ypač jautrūs apsinuodijimui yra vaikai, tačiau šiandien vaikų apsinuodijimų praktiškai nepasitaiko, kadangi acetilsalicilo rūgštis vaikams neskiriama. Suaugusiųjų apsinuodijimų taip pat mažėja, nes per paskutinį šimtmetį yra sukurta labai daug naujų NVNU ir analgetikų [18, 24].
Kaptoprilis yra gerai toleruojamas vaistas [15]. Kaptoprilio maksimali paros dozė yra 450 mg, tačiau gydymas pradedamas nuo mažų dozių (25-50 mg per dieną) [31]. Perdozavimas pasitaiko labai retai, kadangi vienoje tabletėje paprastai būna tik 25-50 mg, o tablečių skaičius pakuotėje neviršija 20. Vis dėlto apsinuodijimai kaptopriliu gali sukelti sveikatos problemas, o sunkiais atvejais - mirtį. Skiriamas ūmus ir lėtinis apsinuodijimai. Ūmaus apsinuodijimo atveju mažėja arterinis kraujospūdis, pasireiškia ortostatinė hipotenzija, stiprus galvos svaigimas ir pusiausvyros sutrikimas. Galima plaučių edema, kvėpavimo sutrikimai, mirtis. Ūmaus
apsinuodijimo metu taikomas simptominis gydymas, į veną leidžiamas priešnuodis – naloksonas. Taikant tikslingą gydymą galima išgelbėti pacientus, suvartojusius iki 1 gramo vaisto [6].
Lėtiniai apsinuodijimai pasireiškia dažniau, kadangi vaistas dažnai skiriamas vartoti kursais, o ne nuolat [31]. Lėtinio apsinuodijimo metu gali pasireikšti pykinimas, vėmimas, hiperventiliacija, skrandžio opos, bendras silpnumas ir uždegiminiai procesai virškinimo trakte. Lėtiniai
apsinuodijimai nėra pavojingi ir gydomi koreguojant farmakoterapiją [6,31].
1.4.3 Hidrochlortiazidas
Maksimali hidrochlortiazido paros dozė yra 100 mg [34]. Vaistas yra gerai toleruojamas, jo apsinuodijimo reiškiniai būna lengvi. Nustatyta, kad per os vartojamo hidrochlortiazido LD50 yra 2g/kg, todėl mirties atvejų apsinuodijus hidrochlortiazidu kol kas nenustatyta [9]. Lengvo apsinuodijimo hidrochlortiazidu požymiai yra hipokalemija,
hipochloremija, hiponatremija ir dehidratacija (dėl pernelyg didelės diurezės). Taip pat gali pasireikšti pykinimas, vėmimas, arterinio spaudimo sumažėjimas, troškulys ir bendras silpnums. Sunkesniais atvejais pasireiškia poliurija, metabolinė alkalozė, kepenų nepakankamumas, šokas, sąmonės pritemimas. 2017 metais vokiečių mokslininkai nustatė, kad nuolatinis
hidrochlortiazido vartojimas 9 proc. didina riziką susirgti odos arba lūpų vėžiu [23].
1.5 Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio ir hidrochlortiazido tyrimas ESC
metodu.
1.5.1 Efektyvioji skysčių chromatografija
Pirmą kartą chromatografiją 1900 metais panaudojo rusų mokslininkas M. Cvetas. Jis naudojo kolonėlę, užpildytą kalcio karbonatu (dalelių dydis 50-100 µm). Tirpiklis tyrimo metu judėjo žemės traukos jėgos pagalba, todėl analizė užtrukdavo 8-9 valandas. Per šimtmetį skysčių chromatografijos metodikos ir su šiuo metodu susijusios technologijos labai pažengė: sorbento dalelių dydis sumažėjo iki mažiau, nei 1 µm, analizės laikas iki 10-20 minučių, o
ultraefektyviosios skysčių chromatografijos atvejų analizė trunka 1-2 minutes [5,14].
Skysčių chromatografija šiandien yra vienas plačiausiai naudojamų metodų medžiagų kiekybinei, kokybinei analizei, jų atskyrimui bei gryninimui. Šis metodas yra tikslesnis bei žymiai informatyvesnis, nei kitas plačiai naudojamas metodas – plonasluoksnė chromatografija. Dujų chromatografija yra ne mažiau tikslus metodas, tačiau šiuo metodu gali būti analizuojamos ne visos medžiagos. Medžiagos, analizuojamos dujų chromatografija turi būti termostabilios ir lakios, o skysčių chromatografijoje gali būti analizuojamos visos medžiagos [5].
1.5.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos
identifikuoti acetilsalicilo rūgštį, kaptoprilį bei hidrochlortiazidą.
Atlikus literatūros analizę nebuvo rasta metodikos, tinkamos acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio analizei skysčių chromatografijos metodu. Nuspręsta tokią sistemą sukurti remiantis literatūroje pateiktomis atskirų medžiagų analizės metodikomis.
Yra sukurtos kelios metodikos acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido identifikavimui skysčių chromatografijos metodu. 8 lentelėje pateikiamos galimos sistemos. Duomenys gauti tiriant atskiras medžiagas [19,20,21].
Visose sistemose buvo naudojamas identiškas sorbento tipas – C18 silikagelis, kurio dalelių dydis 5 μm. Naudotų kolonėlių ilgis 125 ar 250 mm, skersmuo nuo 4 iki 4,6 mm [19,20,21]. Remiantis pateikta informacija, acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei
hidrochlortiazido mišinio analizei gali tikti 125-250mm kolonėlės, kurių skersmuo 4-4,6mm. Dalelių dydis turi būti ne didesnis, kaip 5 μm, o sorbento tipas – C18 silikagelis.
Acetilsalicilo rūgštis HX ir HZ sistemose nustatoma esant pH = 3 ir 3,3. Sistemoje HAA kaptoprilis nustatomas esant pH = 3,8. HAX ir HAY sistemose, kurių pagalba nustatoma
acetilsalicilo rūgštis ir hidrochlortiazidas, naudojamas trietilamino buferis. Visose sistemose kaip vienas iš eliuentų naudojamas acetonitrilas [19,20,21]. Renkant eliuentus tiriamųjų medžiagų mišinio nustatymui reikia į tai atsižvelgti. Vienas iš eliuentų gali būti acetonitrilas, o kitas eliuentas turi reguliuoti pH tyrimo metu. Tai gali būti trietilamonio fosfato buferinis tirpalas, sieros, fosforo rūgštis ir t.t.
Eliuentų tėkmės greitis nurodytas literatūroje taip pat skiriasi. HX, HY ir HAA sistemose jis yra 1 ml/min, o HZ, HAX ir HAY sistemose tėkmės greitis yra 0,6 ml/min [19,20,21].
Sistemoje, kuri bus panaudota acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido mišinio analizei, eliuento tėkmės greitis turi būti ne mažesnis, kaip 0,6 ml/min.
Kuriant naują tiriamojo mišinio chromatografavimo sistemą jau aprašytų literatūroje atskirų medžiagų sistemų pagrindu, racionalu atsižvelgti ir į detektorių. Visose sistemose buvo naudojamas fotodiodų matricos detektorius (PDA) [19,20,21], todėl šis detektorius tinka acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido nustatymui.
Daugelyje paminėtų sistemų naudojamas gradientinis eliuavimas [19,20,21]. Atliekant tiriamojo mišinio analizę, racionalu pradėti būtent nuo tokio eluavimo tipo.
Analizuojant literatūroje pateiktų HX, HY, HY, HAX, HAY, HAA sistemų panašumus ir skirtumus bei remiantis aukščiau aprašytomis išvadomis nuspręsta tyrimą pradėti naudojant C18 125 mm ilgio ir 4 mm skersmens kolonėle, nes ši kolonėlė yra trumpiausia iš literatūroje
paminėtų. Naudojant tokią kolonėlę analizė vyksta greičiau, nei naudojant 250 mm kolonėlę. Pasirinktas tėkmės greitis 0,6 ml/min, nes taip yra mažiau apkraunamas slėgį chromatografijos metu sukeliantis siurblys. Eliuentai buvo renkami kuo paprastesni, kad kuo didesniame skaičiuje
laboratorijų galima būtų atlikti analizę. Kaip pradiniai eliuentai buvo pasirinktas acetonitrilas ir fosfatinis buferis.
8 lentelė. Galimos metodikos acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido kokybinei ir kiekybinei analizei skysčių chromatografijos metodu [19,20,21]
Sistema Acetilsalicilo rūgštis Kaptoprilis Hidrochlortiazidas
HX RT 8,3 min RT 8,1 min RT 7,8 min
HY RT 6,8 min RT 6,6 min RT 6,4 min
HZ RT 2,7 min RT 2,1 min RT 2,2 min
HAX RT 5,2 min - RT 5,1 min
HAY RT 4,4 min - RT 4 min
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo objektas ir metodika
2.1.1 Tyrimo objektas
Tyrimo metu buvo tiriamos “Aspirin cardio 100 mg” (Bayer), “Hypothiazid 25 mg” (Sanofi) ir “Kaptopril Krka 50 mg” (KRKA) tabletės. Visos tabletės yra registruotos Lietuvoje ir buvo nupirktos visuomenės vaistinėse. Standartinės medžiagos: acetilsalicilo rūgštis (Sigma-Aldrich, JAV), hidrochlortiazidas (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV), kaptoprilis (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV).
2.1.2 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas skysčių chromatografijos metodu
Įranga
Kiekybiškai bei kokybiškai vertinant standartines medžiagas bei tablečių tirpalus buvo naudojami chromatografai Waters 2695 ir Waters e2695 su fotodiodų matricos detektoriais (Waters 996 ir Waters 2998). Tyrimo metu buvo naudojama kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 1,7 µm.
Tirpikliai
Standartinių bei tiriamųjų tirpalų ruošimui buvo naudojamas 70% etanolis. Eliuentai buvo ruošiami naudojant acetonitrilą (99,9%), trifluoracto rūgštį (99,0%), išgrynintą vandenį, metanolį (99,9%) bei fosforo rūgštį (99,0%).
Standartiniai tirpalai
Visi standartiniai tirpalai buvo ruošiami tirpinant medžiagas 70% etanolyje. Kokybiniam nustatymui pagaminti 0,1 mg/ml tirpalai, kiekybiniam - 10 tirpalų, kurių koncentracija nuo 0,1 mg/ml iki 0,00001 mg/ml.
Tiriamieji tirpalai
Visi tiriamieji tirpalai buvo paruošti iš vaistų, kurie buvo įsigyti Lietuvos vaistinėse. Kokybiniam bei kiekybiniai tyrimui buvo paruošti 0,1 mg/ml tirpalai.
Acetilsalicilo rūgšties tiriamasis tirpalas buvo gaminamas iš vaistinio preparato „Aspirin cardio“ 100 mg stiprumo tablečių (Bayer). 1 tabletė pasveriama (svoris 0,135g) ir disperguojama grūstuvėje iki tol, kol pasiekiamas tolygus dispersiškumas. 1 mg gautų miltelių, perkeliamas į 10 ml tikslaus tūrio kolbą ir skiedžiamas iki 10 ml 70% etanolio tirpalu. Gautas tirpalas
filtruojamas naudojant PVDF filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Tokiu būdu paruoštas acetilsalicilo rūgšties tirpalas naudojamas tolimesniuose tyrimuose siekiant nustatyti acetilsalicilo rūgštį kiekybiškai bei kokybiškai.
Hidrochlortiazido tiriamasis tirpalas buvo gaminamas iš vaistinio preparato „Hypothiazid“ 25 mg stiprumo tablečių (Sanofi). 1 tabletė pasveriama (svoris 0, 129 g) ir disperguojama grūstuvėje iki tol, kol pasiekiamas tolygus dispersiškumas. 1 mg gautų miltelių, perkeliamas į 10 ml tikslaus tūrio kolbą ir skiedžiamas iki 10 ml 70% etanolio tirpalu. Gautas tirpalas perkeliamas į ultragarso vonelę ir veikiamas ultragarsu 15 minučių, o po to filtruojamas naudojant PVDF filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Gautas hidrochlortiazido tirpalas buvo
naudojamas tolimesniuose tyrimuose siekiant nustatyti hidrochlortiazidą kiekybiškai bei kokybiškai.
Kaptoprilio tiriamasis tirpalas buvo gaminamas iš vaistinio preparato „Kaptopril Krka“ 50 mg stiprumo tablečių (KRKA). 1 tabletė pasveriama (svoris 0,3257 g) ir disperguojama grūstuvėje iki tol, kol pasiekiamas tolygus dispersiškumas. 1 mg gautų miltelių, perkeliamas į 10 ml tikslaus tūrio kolbą ir skiedžiamas iki 10 ml 70% etanolio tirpalu. Gautas tirpalas
filtruojamas naudojant PVDF filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Pagamintas kaptoprilio tirpalas buvo naudojamas tolimesniuose tyrimuose siekiant nustatyti kaptoprilį kiekybiškai bei kokybiškai.
Detektorius
Tyrimui buvo pasirinktas fosfolipidų matricos detektorius (PDA). Šio detektoriaus pagalba galima nustatyti mėginio ultravioletinės šviesos absorbcijos maksimumus visame UV šviesos diapazone. Tai lemia tikslų analičių identifikavimą, ypač jei vertinamas ne tik UV spektras, bet ir sulaikymo laikas. Tai vienas plačiausiai naudojamų detektorių skysčių chromatografijoje dėl savo tikslumo, patikimumo bei santykinai mažos kainos [5].
Metodika
Paruošti tiriamieji tirpalai maišomi lygiais santykiais. Sumaišytas tirpalas yra tiriamas naudojant aukščiau aprašyta įrangą. Tyrimo metu naudojami eliuentai - acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas (0,5ml:500ml). Naudojamas gradientinis eliuavimas (9 lentelė).
9 lentelė. Eliuento sudėties kitimas laiko atžvilgiu.
Chromatografavimo laikas (min)
Eliuento tekėjimo greitis (ml/min)
TFA 0,1% (A) Acetonitrilas (B)
00:00 1 98,0 2,0
1:00 1 98,0 2,0
20:00 1 2,0 98,0
23:00 1 2,0 98,0
24:00 1 98,0 2,0
Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min
3. REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo optimizavimas
3.1.1 Kolonėlės pasirinkimas
Buvo išbandytos įvairios kolonėles siekiant parinkti tinkamiausią. Analizė buvo atliekama naudojant „Waters“, „Supelco“ bei „ACE“ kolonėles, kurių ilgis nuo 15 iki 25
centimetrų, vidinis diametras nuo 4 iki 4,6mm, o sorbento dalelių dydis nuo 1,7 iki 5 µm. Visose kolonėlėse naudoto sorbento tipas – silikagelis C18. Eksperimentiniu būdu buvo parinkta
kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm), kurios pagalba tiriamosios medžiagos atskiriamos geriausiai. Naudojant trumpesnę kolonėlę tiriamosios medžiagos neatsiskirdavo, pikai
persidengdavo, chromatograma gaudavosi neinformatyvi. Naudojant kolonėles, kurių sorbento dalelių dydis 5 µm, medžiagos atsiskirdavo, bet naudojant identišką kolonėlę su mažesniu sorbento dalelių dydžiu (1,7 µm) buvo pasiektas geresnis smailių simetriškumas.
3.1.2 Eliuento pasirinkimas
Siekiant identifikuoti tiriamas vaistines medžiagas, standartinių tirpalų mišinys buvo chromatografuojamas naudojant skirtingos sudėties eliuentus. Analizę atlikti buvo bandoma panašia, kaip literatūroje nurodyta HX sistema, tačiau pakankamas tiriamųjų medžiagų atskyrimas nebuvo pasiektas. Kaptoprilio bei acetilsalicilo rūgšties pikai chromatogramoje susiliedavo, o hidrochlortiazido pikas gaudavosi per daug platus. Buvo nuspręsta pakeisti tirpiklių sistemą į acetonitrilą bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninį tirpalą (0,5ml:500ml). Naudojant tokią eliuentų sistemą buvo pasiektas labai geras medžiagų atskyrimas, smailių simetriškumas bei optimalus smailių plotis.
Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min yra optimalus. Išbandžius kitus eliuento tekėjimo greičius (0,4 ml/min, 0,6 ml/min, 0,8 ml/min, 1,5 ml/min, 2 ml/min) nustatyta, kad tiriamųjų medžiagų atsiskyrimas yra blogesnis, nei kai tekėjimo greitis yra 1 ml/min.
3.2 Pritaikyto efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija
Eksperimentų metu nustatyta ir optimizuota efektyviosios skysčių chromatografijos sistema, skirta kokybiniam bei kiekybiniam mūsų tiriamųjų medžiagų nustatymui buvo validuota pagal sekančius parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, kokybinio aptikimo ribą bei kiekybinio nustatymo ribą.
3.2.1 Metodo specifiškumas
ESC metodo specifiškumas analizuojamoms medžiagoms įrodomas lyginant
analizuojamų medžiagų sulaikymo laikus ir UV spektrus su literatūroje pateiktais analizuojamų medžiagų UV spektrais ir sulaikymo laikais. Specifiškumo vertinimo metu buvo nustatyti standartinių medžiagų sulaikymo laikai bei UV spektrai, o pastarieji palyginti su literatūroje pateiktais duomenimis. Sulaikymo laikai nebuvo lyginami, kadangi chromatografavimo metodika yra nauja, o literatūroje nėra duomenų apie acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido sulaikymo laikus, jei chromatografavimas atliekamas darbe aprašoma metodika.
1. Pateikiama acetilsalicilo rūgšties standarto chromatograma (1 pav.). Joje matyti, kad acetilsalicilo rūgšties sulaikymo laikas – 12,126 min
1 pav. Acetilsalicilo rūgšties standarto chromatograma.
2. Gautas acetilsalicilo rūgšties UV spektras lyginamas su literatūroje pateiktu spektru (2 pav.).
2 pav. Acetilsalicilo rūgšties UV absorbcijos spektras: a) Gautas chromatografavimo ir analizės PDA detektoriumi metu b) Pateiktas mokslinėje literatūroje “Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“.
3. Pateikiama kaptoprilio standarto chromatograma (3 pav.). Joje matyti, kad kaptoprilio sulaikymo laikas – 10,797 min.
3 pav. Kaptoprilio standarto chromatograma A
4. Gautas kaptoprilio UV spektras lyginamas su literatūroje pateiktu spektru.
4 pav. Kaptoprilio UV absorbcijos spektras: a) Gautas chromatografavimo ir analizės PDA detektoriumi metu b) Pateiktas mokslinėje literatūroje “Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“.
5. Pateikiama hidrochlortiazido standarto chromatograma (5 pav.). Joje matyti, kad hidrochlortiazido sulaikymo laikas – 9,640 min.
5 pav. Hidrochlortiazido standarto chromatogrma
6. Gautas hidrochlortiazido UV spektras lyginamas su literatūroje pateiktu spektru (6 pav.).
31
6 pav. Hidrochlortiazido UV absorbcijos spektras: a) Gautas chromatografavimo ir analizės PDA detektoriumi metu b) Pateiktas mokslinėje literatūroje “Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“.
Remiantis pateiktais duomenimis galima teigti, kad metodas yra specifiškas nustatomoms medžiagoms ir yra tinkamas kokybiškai nustatyti acetitilsalicilo rūgštį, kaptoprilį bei
hidrochlortiazidą.
3.2.2 Metodo preciziškumas
Siekiant įvertinti sukurtos metodikos preciziškumą buvo vertinamas rezultatų
pakartojamumas ir atkuriamumas. Pakartojamumas (angl. Repeatability) apibūdina rezultatų tikslumą analizuojant mėginį tą pačią dieną, nekeičiant chromatografavimo sąlygų. Šio rodiklio įvertinimui analizė buvo pakartota 5 kartus tą pačią dieną.
Pateikiamos atkartojamumo tyrimo metu gautos chromatogramos (7 pav.)
B A
7 pav. Atkartojamumo tyrimo metu gautos chromatogramos
Chromatogramos buvo įvertintos pagal variacijos koeficientą (angl. RSD) sulaikymo laikui, smailės plotui ir aukščiui. Įvertinimo rezultatai pateikiami lentelėje (10 lentelė).
10 lentelė: Analičių pakartojamumo variacijos koeficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui bei aukščiui
Tiriamoji medžiaga RSD dydis (%)
Sulaikymo laikui Smailės plotui Smailės aukščiui
Acetilsalicilo rūgštis 0,0 1,1 2,8
Kaptoprilis 0,1 0,6 0,7
Hidrochlortiazidas 0,1 0,6 0,8
Lentelėje matyti, kad variacijos koeficientas neviršija 5%, todėl chromatografavimo rezultatų atkartojamumas yra priimtinas.
Atkuriamumas (angl. Reproducibility) apibūdina rezultatų tikslumą tyrimą atliekant tomis pačiomis sąlygomis, bet skirtingomis dienomis. Vertinant atkuriamumą, buvo atlikta 10 bandymų dviem skirtingomis dienomis.
Pateikiamos atkuriamumo tyrimo metu gautos chromatogramos.
8 pav. Atkuriamumo vertinimo metu gautos chromatogramos
Chromatogramos buvo įvertintos pagal variacijos koeficientą (angl. RSD) sulaikymo laikui, smailės plotui ir aukščiui. Įvertinimo rezultatai pateikiami žemiau (11 lentelė).
11 lentelė: Analičių atkuriamumo variacijos koeficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui bei aukščiui
Tiriamoji medžiaga RSD dydis (%)
Sulaikymo laikui Smailės plotui Smailės aukščiui
Acetilsalicilo rūgštis 0,0 1,1 2,8
Kaptoprilis 0,1 0,8 0,9
Lentelėje matyti, kad variacijos koeficientas neviršija 10%, todėl chromatografavimo rezultatų atkartojamumas yra priimtinas.
3.2.3 Metodo tiesiškumas
Darbo metu buvo kurta metodika tinkanti ne tik tiriamųjų medžiagų identifikavimui, bet ir jų koncentracijos nustatymui, todėl buvo vertinamas metodikos tiesiškumas (angl. Linearity). Tiesiškumo vertinimui buvo sudarytos acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido kalibracinės kreivės, kurios buvo įvertintos pagal koreliacijos koeficientą (9,10,11 pav.).
9 pav. Acetilsalicilo rūgšties kalibracinė kreivė
Kaip matyti iš pateiktų kalibracinių kreivių, visoms analizuojamoms medžiagoms yra tiesinė analitės koncentracijos ir kreivės ploto priklausomybė, tinkama kiekybiniam nustatymui.
Pateikiamos kalibracinių kreivių charakteristikos: (12 lentelė)
12 lentelė. Analizuojamų medžiagų kalibracinių kreivių charakteristikos. Analizuojama medžiaga Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis
Acetilsalicilo rūgštis 0.999796 Y=3.12e+0.06x -6.55e+0.03
Kaptoprilis 0,999567 Y=4,78e+0.09x -4.58e+0.05
Hidrochlortiazidas 0,999632 Y=3.22e+0.07x -7.63e+0.03
Visų analičių koreliacijos koeficientai yra didesni nei 0,999, todėl metodika yra tinkama kiekybiniam nustatymui.
3.2.4 Tiriamųjų medžiagų aptikimo bei nustatymo ribos.
Gautos aptikimo bei kiekybinio nustatymo ribų reikšmės pateikiamos 13 lentelėje. 13 lentelė. Acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido aptikimo bei kiekybinio nustatymo ribos
Medžiaga LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml)
Acetilsalicilo rūgštis 0,542 1,81
Kaptoprilis 0,621 2,07
Hidrochlortiazidas 0,493 1,63
3.3 Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Darbo metu buvo sukurta ir validuota chromatografavimo metodika, kuri tinka
acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei acetilsalicilo rūgšties nustatymui. Parinkta metodika buvo pritaikyta tiriamųjų tirpalų, paruoštų iš acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido tablečių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui.
Visos mūsų tiriamos medžiagos buvo identifikuojamos pagal sulaikymo laiką, lyginant jį su atitinkamų standartinių medžiagų sulaikymo laiku bei pagal UV absorbcijos spektrus, lyginant juos su literatūroje pateiktais duomenimis.
Pateikiama tiriamojo mišinio chromatograma (12 pav.)
12 pav. Tiriamųjų tablečių tirpalų mišinio chromatograma. 1 – hidrochlortiazidas, 2 – kaptoprilis, 3 – acetilsalicilo rūgštis.
Visos medžiagos yra identifikuojamos. Tiriamųjų medžiagų pikai nesusilieja, jų atsiskyrimas geras. Chromatogramoje galime matyti priemaišą, kurios sulaikymo laikas apie 14 min, tačiau ji tiriamųjų medžiagų nustatymui netrukdo.
Palyginami tyrimo metu gauti UV absorbcijos spektrai su literatūros duomenimis (13 pav.). 1 1 a 2 a 3 a 3 2
13 pav. Tyrimo metu gautų UV absorbcijos spektrų palyginimas su literatūroje pateiktais spektrais. 1 – hidrochlortiazido tablečių tirpalo analizės metu gautas UV absorbcijos spektras, 1a – literatūroje pateiktas hidrochlortiazido UV absorbcijos spektras. 2 – kaptoprilio tablečių tirpalo analizės metu gautas UV absorbcijos spektras, 2a – literatūroje pateiktas kaptoprilio UV absorbcijos spektras. 3 – acetilsalicilo rūgšties tablečių tirpalo analizės metu gautas UV absorbcijos spektras , 2a – literatūroje pateiktas kaptoprilio UV absorbcijos spektras.
Iš paveiksliuko matyti, kad visi spektrai sutampa su literatūroje nurodytais spektrais. Analičių ir standartų sulaikymo laikai skiriasi labai nedaug, todėl galima teigti, kad sukurta chromatografavimo metodika tinkama hidrochlortiazido, kaptoprilio bei acetilsalicilo rūgšties mišinio kokybiniam nustatymui tabletėse
3.3.2 Kiekybinė vaistinių preparatų analizė
Norint patikrinti sukurtos metodikos tinkamumą tiriamųjų medžiagų kiekybinei analizei, buvo nustatomas tiriamųjų medžiagų kiekis.
Kiekio nustatymui buvo paruoštas atskiras tiriamųjų medžiagų tablečių mišinys. Mišinys buvo chromatografuojamas, o pagal anksčiau sudarytas kalibracinės kreives bei absorbcijos maksimumus buvo nustatomas acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei
hidrochlortiazido kiekis.
Gauti rezultatai pateikiami žemiau (15 lentelė).
15 lentelė. Tiriamųjų tablečių kiekybinio tyrimo rezultatai.
Medžiaga Tyrimo metu gautas
kiekis, mg Pakuotės lapelyje nurodytas kiekis, mg Paklaida Hidrochlortiazidas 25 25 1,48% Kaptoprilis 48 50 4,21% Acetilsalicilo rūgštis 98 100 1,76%
Veikliųjų medžiagų kiekis ištirtose tabletėse atitinka Europos farmakopėjos (Ph.Eur.) reikalavimus ir neviršija nustatytos veikliosios medžiagos kiekio svyravimo normos (+/- 5 proc).
4. IŠVADOS
1. Parinkta sistema, kurioje eliuentas yra acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas. Acetilsalicilo rūgštis, kaptoprilis bei hidrochlortiazidas buvo identifikuoti pagal sulaikymo laikus ir UV šviesos absorbcijos spektrus. Siekiant tiriamas medžiagas įvertinti kiekybiškai, buvo sudarytos kalibracinės kreivės.
2. Atliekant sukurtos metodikos validaciją buvo nustatyta, kad metodika yra tinkama acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido nustatymui.
3. Validuota ESC metodika buvo pritaikyta acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido, išskirtų iš tablečių mišinio, kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui. Gauti sulaikymo laikai ir UV spektrai yra identiški standartinių medžiagų sulaikymo laikams ir UV spektrams, o kiekybinio tyrimo metu gauti rezultatai atitinka vaistų gamintojo pakuotės lapelyje nurodytus duomenis.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Tyrimo metu pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kuri tinka mišinio sudaryto iš acetilsalicilo rūgšties, kaptoprilio bei hidrochlortiazido nustatymui. Metodika gali būti taikoma identifikuojant tablečių, rastų nusikaltimo vietoje, veikliąsias
medžiagas ir jų kiekį.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Vaistai [Prieiga per internetą]. VAPRIS. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta: https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications
2. Vaistų suvartojimas Lietuvoje 2016 m [Prieiga per internetą]. VVKT. 2018 [cituojama pagal 2018 m. sausio 27 d.]. Gauta: http://www.vvkt.lt/Ataskaitos
3. Vaistų suvartojimo 2012-2016 m. ataskaita [Prieiga per internetą]. VVKT. 2018 [cituojama pagal 2018 m. sausio 27 d.]. Gauta: http://www.vvkt.lt/lit/Parengta-vaistu-suvartojimo-2015-m-ataskaita/1547
4. Trijų Baltijos šalių vaistų suvartojimo statistika [Prieiga per internetą]. VVKT. 2018 [cituojama pagal 2018 m. sausio 27 d.]. Gauta: http://www.vvkt.lt/lit/Triju-Baltijos-aliu-vaistu-suvartojimo-statistika/926
5. Alali-Heravi M, Parastar H. Recent trends in application of multivariate curve resolution approaches for improving gas chromatography–mass spectrometry analysis of essential oils. Talanta. 2011;85(2):835-849.
6. Avci A, Yilmaz A, Celik M, Demir K, Keles F. Successful Treatment of Suicide Attempt by Megadose of Propafenone and Captopril. Cardiovascular Toxicology. 2013;13(3):230-233.
7. Botting R. Vane’s discovery of the mechanism of action of aspirin changed our understanding of its clinical pharmacology. Pharmacological Reports. 2010;62(3):518-525.
8. Camargo A, Ianzer D, Guerreiro J, Serrano S. Bradykinin-potentiating peptides: Beyond captopril. Toxicon. 2012;59(4):516-523.
9. Chadha R, Bhandari S, Khullar S, Mandal S, Jain D. Characterization and Evaluation of Multi-Component Crystals of Hydrochlorothiazide. Pharmaceutical Research.
2014;31(9):2479-2489.
10. Chobanian A. The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention,
Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. The JNC 7 Report, JAMA. 2003;289(19):2560.
11. Chyka P, Erdman A, Christianson G, Wax P, Booze L, Manoguerra A et al. Salicylate poisoning: An evidence-based consensus guideline for out-of-hospital management. Clinical Toxicology. 2007;45(2):95-131.
12. Duarte J, Cooper-DeHoff R. Mechanisms for blood pressure lowering and metabolic effects of thiazide and thiazide-like diuretics. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 2010;8(6):793-802.
13. Fertel B, Nelson L, Goldfarb D. The underutilization of hemodialysis in patients with salicylate poisoning. Kidney International. 2009;75(12):1349-1353.
14. Guillarme D, Ruta J, Rudaz S, Veuthey J. New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches. Analytical and
Bioanalytical Chemistry. 2009;397(3):1069-1082.
15. Irvin J, Viau J. Safety profiles of the angiotensin converting enzyme inhibitors captopril and enalapril. The American Journal of Medicine. 1986;81(4):46-50.
16. Juurlink D, Gosselin S, Kielstein J, Ghannoum M, Lavergne V, Nolin T et al. Extracorporeal Treatment for Salicylate Poisoning: Systematic Review and
Recommendations From the EXTRIP Workgroup. Annals of Emergency Medicine. 2015;66(2):165-181.
17. Krasopoulos G, Brister S, Beattie W, Buchanan M. Aspirin “resistance” and risk of cardiovascular morbidity: systematic review and meta-analysis. BMJ.
2008;336(7637):195-198.
18. Litovitz T, Klein-Schwartz W, White S, Cobaugh D, Youniss J, Omslaer J et al. 2000 Annual Report of the American Association of Poison Control Centers Toxic Exposure Surveillance System. The American Journal of Emergency Medicine. 2001;19(5):337-395.
19. Moffat A.C, Osselton M.D, Widdop B editors. Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons. Fourth edition. London:Pharmaceutical press.; 2011. p.924-926
20. Moffat A.C, Osselton M.D, Widdop B editors. Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons. Fourth edition. London:Pharmaceutical press.; 2011. p.1493-1496
21. Moffat A.C, Osselton M.D, Widdop B editors. Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons. Fourth edition. London:Pharmaceutical press.; 2011. p.1038-1039
22. Moore T, Crantz F, Hollenberg N, Koletsky R, Leboff M, Swartz S et al. Contribution of prostaglandins to the antihypertensive action of captopril in essential hypertension. Hypertension. 1981;3(2):168-173.
23. Pedersen S, Gaist D, Schmidt S, Hölmich L, Friis S, Pottegård A. Hydrochlorothiazide use and risk of nonmelanoma skin cancer: A nationwide case-control study from Denmark. Journal of the American Academy of Dermatology. 2018;78(4):673-681.e9. 24. Rodgers G. The Effectiveness of Child-Resistant Packaging for Aspirin. Archives of
Pediatrics & Adolescent Medicine. 2002;156(9):929.
25. Starko K. Salicylates and Pandemic Influenza Mortality, 1918–1919 Pharmacology, Pathology, and Historic Evidence. Clinical Infectious Diseases. 2009;49(9):1405-1410. 26. Sonsalla P, Coleman C, Wong L, Harris S, Richardson J, Gadad B et al. The angiotensin
converting enzyme inhibitor captopril protects nigrostriatal dopamine neurons in animal models of parkinsonism. Experimental Neurology. 2013;250:376-383.
27. Thun M, Jacobs E, Patrono C. The role of aspirin in cancer prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 2012;9(5):259-267.
28. VANE J. Inhibition of Prostaglandin Synthesis as a Mechanism of Action for Aspirin-like Drugs. Nature New Biology. 1971;231(25):232-235.
29. Aspirin [Prieiga per internetą]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2244#section=Top
30. Captopril [Prieiga per internetą]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/44093
31. Capoten, Captoril (captopril) dosing, indications, interactions, adverse effects, and more [Prieiga per internetą]. Reference.medscape.com. 2018 [cituojama pagal 2018 m.
balandžio 7 d.]. Gauta: https://reference.medscape.com/drug/capoten-captoril-captopril-342315#0
32. Cardiovascular diseases (CVDs) [Prieiga per internetą]. World Health Organization. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/
33. Hydrochlorothiazide [Prieiga per internetą]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3639#section=Top
34. Hydrochlorothiazide - FDA prescribing information, side effects and uses [Prieiga per internetą]. Drugs.com. 2018 [cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta:
https://www.drugs.com/pro/hydrochlorothiazide.html
35. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1982 [Prieiga per internetą]. Nobelprize.org. 2018 cituojama pagal 2018 m. balandžio 7 d.]. Gauta:
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1982/ 36. WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology [Prieiga per
internetą]. Guidelines for ATC classification and DDD assignment, 2018. Oslo. [cituojama pagal 2018 m. sausio 27 d.] gauta:
