FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VESTA ŠTAUPAITĖ
VAISTŲ NUO SKAUSMO IR UŽDEGIMO MIŠINIO
IŠSKYRIMAS IŠ KRAUJO PLAZMOS IR IDENTIFIKAVIMAS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Lekt. dr. Daiva Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
Data
VAISTŲ NUO SKAUSMO IR UŽDEGIMO MIŠINIO
IŠSKYRIMAS IŠ KRAUJO PLAZMOS IR IDENTIFIKAVIMAS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Darbą atliko Lekt. dr. Daiva Kazlauskienė Vesta Štaupaitė
Data Data
Recenzentas
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
ĮVADAS ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1.Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vartojimo paplitimas ... 10
1.1.1. Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 10
1.1.2. Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas ir palyginimas su Baltijos šalimis .. 11
1.2.Apsinuodijimas nesteroidiniais vaistai nuo uždegimo ir narkotiniais analgetikais ... 13
1.3.Tiriamosios medžiagos ... 14
1.3.1. Paracetamolis ... 14
1.3.2. Naproksenas ... 15
1.3.3. Tramadolio hidrochloridas ... 16
1.4.Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio sąveikos ir nepageidaujamas poveikis ... 17
1.5.Vaistinių medžiagų nustatymas biologinėse terpėse ... 17
1.6.Skysčių – skysčių ekstrakcija ... 18
1.7.Vaistinių medžiagų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 18
1.8.Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 19
1.9.Metodikos validacija ir jos parametrai ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1.Tyrimo objektas ... 21
2.2.Reagentai ... 21
2.3.Įranga ... 21
2.4.1. Etaloniniai tirpalai ... 21
2.4.2. Tiriamųjų tirpalų gamyba ... 22
2.4.3. Skysčių – skysčių ekstrakcija iš kraujo plazmos metodika ... 22
2.4.4. Plonasluoksnės chromatografijos metodika... 23
2.5.Kokybinė analizė efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu... 23
2.5.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 23
2.6.Duomenų apdorojimas ... 24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3.1.Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 25
3.2.Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 27
3.3.Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija... 29
3.3.1. Specifiškumas ... 29
3.3.2. Rezultatų glaudumas ... 30
3.3.3. Tiesiškumas ir ribos ... 32
3.3.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 33
3.4.Preparatų ekstrakcija iš kraujo plazmos ... 34
3.4.1. Ekstrakcija Nr. 1 ... 34
3.4.2. Ekstrakcija Nr. 2 ... 35
3.5.Vaistų mišinio ESC analizės rezultatai po ekstrakcijos iš kraujo plazmos ... 36
4. IŠVADOS ... 38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
SANTRAUKA
VAISTŲ NUO SKAUSMO IR UŽDEGIMO MIŠINIO IŠSKYRIMAS IŠ
KRAUJO PLAZMOS IR IDENTIFIKAVIMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Vestos Štaupaitės magistro baigiamasis darbas „Vaistų nuo skausmo ir uždegimo mišinio išskyrimas iš kraujo plazmos ir identifikavimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu“/ mokslinė vadovė lekt. dr. Daiva Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: paracetamolis, naproksenas, tramadolio hidrochloridas, plonasluoksnė
chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, ekstrakcija, kraujo plazma, validacija.
Tyrimo tikslas: nustatyti tinkamiausias efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ir
plonasluoksnės chromatografijos (PC) sąlygas paracetamolio, naprokseno ir tramadolio mišinio kokybiniam nustatymui kraujo plazmoje ir ESC metodiką validuoti.
Tyrimo uždaviniai: parinkti tinkamiausią PC metodiką paracetamolio, naprokseno ir
tramadolio vaistų mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam nustatymui; parinkti tinkamiausias vaistinių medžiagų mišinio komponentų atskyrimo ir kokybinio nustatymo sąlygas ESC metodu ir atlikti metodikos validaciją; parinkti tinkamiausias skysčių – skysčių ekstrakcijos (SSE) sąlygas vaistų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos; identifikuoti ir nustatyti pracetamolio, tramadolio ir naprokseno kiekį validuota ESC metodika, išskyrus jų mišinį iš kraujo plazmos.
Tyrimo objektas: vaistinės medžiagos (paracetamolis, naproksenas, tramadolio
hidrochloridas) kraujo plazmoje. Anoniminė žmogaus kraujo plazma (iš LSMU KK Kraujo centro).
Tyrimo metodai: plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija,
skysčių – skysčių ekstrakcija.
Išvados: Tinkamiausia plonasluoksnės chromatografijos metodika paracetamolio, naprokseno
SUMMARY
MIXTURE OF DRUG FROM PAIN AND INFLAMMATION
ISOLATION FROM BLOOD PLASMA AND IDENTIFICATION BY HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
V. Štaupaitė Master‘s thesis/ Scientific supervisor PhD. Daiva Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry Department. Kaunas, 2017.
Key words: paracetamol, naproxen, tramadol hydrochloride, thin payer chromatography,
high-performance liquid chromatography, extraction, blood plasma, validation.
Aim: to determine the best conditions of high-performance liquid chromatography method for
drug mixture of paracetamol, naproxen and tramadol, extracted from human plasma for their qualitative determination.
Tasks: to carry out analysis of scientific literature and choose the most appropriate thin layer
chromatography methodology which will be capable to separate and qualitatively evaluate the drug mixture of paracetamol, naproxen and tramadol. To choose the most appropriate high-performance liquid chromatography methodology for drug mixture and validate it. The most appropriate high-performance liquid chromatography methodology which are chosen apply to analysis for drug mixture. To choose the most appropriate liquid-liquid extraction methodology for mixture of drug from human plasma.
Object: blood plasma samples with drug substances: paracetamol, naproxen and tramadol
hydrochloride.
Methods: thin layer chromatography, high-performance liquid chromatography, liquid-liquid
extraction.
Results and conclusions: the most appropriate solvent system have been modified for
SANTRUMPOS
DDD - nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
ICH – tarptautinė harmonizavimo konferencija NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo OA – opioidiniai analgetikai
PC – plonasluoksnė chromatografija PI – pasikliautinasis intervalas
PSO – pasaulinė sveikatos organizacija Rf – sulaikymo rodiklis
R2 – koreliacijos koeficientas SD – standartinis nuokrypis SE – santykinė paklaida
SSN – santykinis standartinis nuokrypis TS – tirpiklių sistema
UV – ultravioletinė šviesa
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti tinkamiausias ESC ir PC sąlygas paracetamolio, naprokseno ir
tramadolio mišinio kokybiniam nustatymui kraujo plazmoje ir ESC metodiką validuoti.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausią PC metodiką paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vaistų mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam nustatymui.
2. Parinkti tinkamiausias vaistinių medžiagų mišinio komponentų atskyrimo ir kokybinio nustatymo sąlygas ESC metodu ir atlikti metodikos validaciją.
3. Parinkti tinkamiausias skysčių – skysčių ekstrakcijos sąlygas vaistų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos.
ĮVADAS
Lietuvoje 2016 metais mirė 41106 žmonės, t.y. 670 asmenų mažiau negu 2015 metais [1]. Mirtingumo išorinės priežastys, kaip pvz.: apsinuodijimai kenksmingomis medžiagomis bei jų poveikis lėmė 419 mirčių per 2016 metus, tuo tarpu apsinuodijimas narkotikais ir psichodisleptikais nusinešė 98 gyvybes ir net 193 asmenys mirtinai apsinuodijo alkoholiu [1]. Higienos instituto sveikatos informacijos duomenimis vien per 2015 metus dėl apsinuodijimo narkotikais, vaistais bei biologinėmis medžiagomis gydyti 3,5 % stanionaro ligonių ir 0,8 % visų ambulatorinių ligonių. Vien tyčinių ir netyčinių apsinuodijimų nenarkotiniais analgetikais, antipiretikais ir antireumatiniais preparatais stacionare buvo gydomi 1,8 % pacientų, o ambulatoriškai – 0,7 %. Apsinuodiję narkotiniais bei psichodisleptikais stacionare gydyti 6,9 % asmenų, o ambulatoriškai – 4,1 % [2].
Dažniausiai asmenys apsinuodija dėl to, kad neturi pakankamai žinių apie vaistų šalutinį poveikį, jų maksimalias paros dozes ar kokių kitų vaistų ar medžiagų negalima vartoti kartu. Daugiausiai apsinuodijama vaistais, kuriuos nesunku įsigyti vaistinėse, kuriems nereikia gydytojo recepto, t.y. paracetamolis, naproksenas, kiti analgetikai, antipiretikai. Tačiau vartojant net ir šiuos vaistus reikia išklausyti vaistininko suteikiamą informaciją apie nereceptinio vaisto šalutinius poveikius ar didžiausią paros dozę.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vartojimo paplitimas
1.1.1.
Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas Lietuvoje
Analgetinių ir antipiretinių vaistų vartojimas bene didžiausias visame pasaulyje [3]. Lietuvoje šios grupės vaistų taip pat parduodama labai daug. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) duomenimis 2016 metais parduota 72273391 vaistų pakuočių, iš jų net 35 % parduota nereceptinių vaistų. Todėl galima teigti, kad Lietuvoje nereceptiniai preparatai (pvz. paracetamolis, naproksenas) populiarūs, dažnai vartojami, nes juos patogu nusipirkti, jiems nereikia gydytojo recepto. Narkotiniams analgetikams, kaip pvz. tramadolis, reikalingas specialus gydytojo receptas, todėl šių vaistų vartojimas ženkliai mažesnis nei vaistų, kuriems receptas nereikalingas.
Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio preparatų vartojimo statistika 2012-2016 metais pateikiama pav. Nr. 1. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis iš mano tirtų medžiagų Lietuvoje daugiausiai suvartojama paracetamolio preparatų, o mažiausiai tramadolio. 2012 metais paracetamolio preparatų suvartojimas siekė 3,029 DDD/1000gyventojų/per dieną, naprokseno 1,951 DDD/1000gyventojų/per dieną, o tramadolio 0,848 DDD/1000gyventojų/per dieną. 2013-2014 metais paracetamolio preparatų populiarumas augo, tuo tarpu naprokseno suvartojimas 2013 metais sumažėjo iki 1,789 DDD/1000gyventojų/per dieną, o 2014 – pakilo iki 2,122 DDD/1000gyventojų/per dieną, tramadolio rodikliai taip pat kilo. 2015 metais paracetamolio rodikliai kilo iki 2,584 DDD/1000gyventojų/per dieną, o 2016 metais vis dar augo iki 2,645 DDD/1000gyventojų/per dieną. Tuo tarpu naprokseno vartojamumas 2016 metais krito iki 1,58 DDD/1000gyventojų/per dieną, o tramadolio populiarumas nuo 2015 metų krito ir 2016 metais siekė 0,896 DDD/1000gyventojų/per dieną [4]. 3.029 1.951 0.848 3.316 1.789 0.859 2.546 2.122 0.919 2.584 2.167 0.909 2.645 1.58 0.896 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Paracetamolis Naproksenas Tramadolis
2012 2013 2014 2015 2016
Taigi, remiantis VVKT duomenimis, galime daryti išvadą, kad paracetamolio vartojamumas Lietuvoje yra didžiausias iš mano tiriamų vaistų, bet per 5 metus jo suvartojimas krito, naprokseno preparatų populiarumo augo, bet pernai metais krito, o tramadolio vartojimas lieka panašus.
1.1.2.
Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas ir palyginimas su Baltijos
šalimis
Siekiant įvertinti paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vaistinių preparatų populiarumą Baltijos šalyse, aprašyti Lietuvos, Latvijos ir Estijos šių vaistų vartojimo duomenys 2013-2015 metais (pav. Nr 2, pav. Nr. 3, pav. Nr. 4).
Paracetamolio preparatų Lietuvoje suvartojimas 2013 metais siekė 3,32 DDD/1000gyventojų/per dieną, Latvijoje 1,91 DDD/1000gyventojų/per dieną, 6,14 DDD/1000gyvetojų/per dieną. Tuo tarpu 2015 metais Lietuvoje paracetamolio preparatų vartojimas sumažėjo ir siekė 2,58 DDD/1000gyventojų/per dieną, o Latvijoje ir Estijoje pakilo, Latvijoje iki 2,02 DDD/1000gyventojų/per dieną, Estijoje iki 6,97 DDD/1000gyventojų/per dieną.
Naprokseno preparatų vartojimo statistika Lietuvoje 2013 m. buvo 1,79 DDD/1000gyventojų/per dieną, Latvijoje tik 0,2 DDD/1000gyventojų/per dieną, Estijoje 0,56 DDD/1000gyventojų/per dieną. Per dvejus metus visų šalių rodikliai kilo ir 2015 metais Lietuvoje naprokseno preparatų populiarumas siekė 2,17 DDD/1000gyventojų/per dieną, Latvijoje 1,57 DDD/1000gyventojų/per dieną, o Estijoje 1,56 DDD/1000gyventojų/per dieną.
3.32 1.91 6.14 2.55 1.75 6.31 2.58 2.02 6.97 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Lietuva Latvija Estija
2013 m. 2014 m. 2015 m.
Tramadolio preparatų vartojimo statistika Baltijos šalyse 2013 metais: Lietuvoje siekė 0,86 DDD/1000gyventojų./per dieną, Latvijoje 1,62 DDD/1000gyventojų./per dieną, Estijoje 1,99 DDD/1000gyventojų./per dieną, 2014 metais Lietuvoje rodiklis pakilo iki 0,92 DDD/1000gyventojų./per dieną, o 2015 metais šiek tiek krito – 0,91 DDD/1000gyventojų./per dieną. 2014-2015 metais Latvijoje šis rodiklis kilo ir 2015 metais siekė 1,67 DDD/1000gyventojų./per dieną, Estijoje 2014 metais naprokseno vartojimas pakilo iki 2,18 DDD/1000gyventojų./per dieną ir 2015 metais liko toks pats.
1.79 0.2 0.56 4.5 2.12 1.27 0.86 2.8 2.17 1.57 1.56 5 0 1 2 3 4 5 6
Lietuva Latvija Estija 4 kategorija
2013 m. 2014 m. 2015 m.
3 pav. Naprokseno suvartojimas Baltijos šalyse 2013-2015 metais
0.86 1.62 1.99 0.92 1.66 2.18 0.91 1.67 2.18 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Lietuva Latvija Estija
2013 m. 2014 m. 2015 m.
Vertinant paracetamolio, naprokseno ir tramadolio preparatų vartojimą 2013-2015 metais Baltijos šalyje galima teigti, kad populiariausias vaistas yra paracetamolis ir Estijoje jis vartojamas ženkliai daugiau lyginant su Lietuva ir Latvija. Naprokseno preparatų vartojimas Lietuvoje buvo didžiausias 2013-2015 metais lyginant su kitomis Baltijos šalimis, tačiau Latvijoje ir Estijoje naprokseno preparatų vartojimas 2014-2015 metais gana stipriai kilo. Tramadolio preparatų daugiausiai suvartoja Estija, o mažiausiai Lietuva, šie rodikliai ženkliai nesikeitė 2013-2015 metais visose Baltijos šalyse [5].
1.2.
Apsinuodijimas nesteroidiniais vaistai nuo uždegimo ir narkotiniais
analgetikais
Dažniausia vaistų grupė, kurią pacientai vartoja, norėdami numalšinti skausmą yra nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU), ypač daug šių vaistų suvartoja vyresnio amžiaus žmonės. Dažniausios NVNU vartojimo priežastys vyresniame amžiuje – osteoartritas (57 %), nugaros skausmas (20 %), reumatoidinis artritas (6 %) ir kitos priežastys (17 %).Skausmas dažniausiai gydomas medikamentiniu būdu, kartu taikant ir nemedikamentines priemones (fizioterapinės procedūros, masažas, judėjimo terapija, psichoterapija ir pan.). Gydant vaistais, dažniausiai remiamasi Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) pasiūlyta skausmo pakopinio gydymo schema, kai silpnas skausmas gydomas NVNU, vidutinio intensyvumo skausmas – NVNU kartu su silpnai veikiančiais narkotiniais analgetikais ir stiprus skausmas – NVNU kartu su stipriai veikiančiais narkotiniais analgetikais. Nepasiekiant laukiamo efekto, analgetikų poveikį galima sustiprinti, skiriant adjuvantą [6]. Dauguma ir mažesnio stiprumo nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo vaistinėse yra parduodami be recepto, todėl žmogus jų gali įsigyti lengvai. Vyrauja klaidinga nuomonė, kad šių vaistų neįmanoma perdozuoti [7]. Tačiau apsinuodijimai NVNU yra dažni klinikinėje praktikoje. Respublikinio toksikologijos centro duomenimis, apsinuodijimai NVNU sudaro apie 3 % visų apsinuodijimų [7].
5 pav.Paracetamolio struktūrinė formulė [40]
Naproksenas priskiriamas prie propiono rūgšties darinių. Aminotransferazių kiekis serume gali padidėti daugiau kaip 4 % pacientams, vartojantiems prailginto atpalaidavimo naprokseno preparatus didelėmis dozėmis. Kliniškai reikšmingi kepenų pažeidimai yra labai reti (apie 1-3 pažeidimus iš 100000 pacientų). Aprašyti keli atvejai, kai didelės naprokseno vartojamos dozės po 12 savaičių vartojimo turėjo įtakos kepenų pažeidimams. Naprokseno toksinio poveikio mechanizmas iki šiol dar nežinomas, bet žinoma, kad naproksenas yra metabolizuojamas per citochromo P450 sistemą ir idiosinkrazinis pažeidimas gali atsirasti dėl toksiško metabolito. Ilgai vartojant šiuos vaistus yra dirginama virškinamojo kanalo gleivinė ir tai gali sukelti kraujavimą, inkstų ir kepenų veiklos sutrikimus, bronchospazmą ir net bronchinę astmą, neutropeniją ir trombocitopeniją. Šie simptomai reti ūminių apsinuodijimų atvejais.
Opioidai – sintetiniai ir pusiau sintetiniai junginiai, veikiantys opioidinius receptorius, vartojami slopinti skausmą, didžiąją dalį apsinuodijimų narkotiniais preparatais sukelia nemedicininės paskirties nelegalių opioidų vartojimas. Opioidinių analgetikų (OA) perdozavimą padeda diagnozuoti tipiški odos pokyčiai – hiperpigmentuoti „takai“ ir randai injekcijų vietose, opinis celiulitas, abscesai, limfangitai, tromboflebitai, juostinė pūslelinė, mikrocirkuliacijos sutrikimai plaštakose ir pėdose dėl padidėjusio histamino išsiskyrimo. Taip pat atsiranda staigus centrinės nervų sistemos slopinimas iki komos, išryškėjusi miozė, kvėpavimo centro sutrikimas. Veiksmingas gydymas apsinuodijus per os – skrandžio plovimas, pirmąsias 2 valandas po apsinuodijimo, derinant su aktyvinta anglimi, taip pat tinkamas opioidų antagonistas – naloksonas [7].
1.3.
Tiriamosios medžiagos
1.3.1.
Paracetamolis
C8H9NO2, Mr=151,2, CAS-103-90-2[8], IUPAC pavadinimas: N-(4-hidroksifenil)acetamidas
[8].
Fizikinės savybės: balti kristalai arba
6 pav. Naprokseno struktūrinė formulė
[41]
„Paracetamol-ACCORD“, „Paracetamol-ACTAVIS“, „Paracetamol-B.Braun“, Genmed“, Kabi“, Panpharma“, Solpharma“, „Paracetamol-ratiopharm“, „Paracetamolis L“, „Paracetamolis-SANITAS“, „Perfalgan“[9].
Paracetamolis greitai absorbuojamas iš virškinamojo trakto, maksimalią koncentraciją plazmoje pasiekia per maždaug 1 valandą po vaisto pavartojimo per os. Didesnės vartojamos dozės absorbuojamos daug lėčiau [10]. Paracetamolio biopraeinamumas yra apie 80 % [11]. Silpnai jungiasi su plazmos baltymais (iki 20 %). Paracetamolio metabolizmas vykdomas kepenyse dėka citochromo P450, kuris apie 5-10 % paracetamolio metabolizuoja į tarpinį metabolitą – N-acetil-p-benzochinoneiminą (NAPQI), kuris yra toksiškas [12][11]. Pagrindiniai eliminacijos būdai: glukuronizacija ir sulfatilinimas, pastarasis neutralizuoja tik terapines dozes, todėl glukuronizacija yra dominuojanti. Apie 50-70 % farmakologinė paracetamolio doze yra glukuronizuojama, o apie 25-35 % vyksta sulfatilinimas. NAPQI jungiasi prie cisteino sulfohidrilinės glutationo (GSH) grupės, taip pat mažomis dozėmis gali prisijungti prie baltymų sulfohidrilo grupių. Dauguma paracetamolio-glutationo skaidoma į merkaptopurino rūgštį ir cisteino konjugatus [11]. Pusinis eliminacijos laikas yra 2 – 4 val. Tik 2 % nemetabolizuoto paracetamolio pasišalina su šlapimu, o 94 % konjugatų su glukuronidu bei sulfatais pasišalina taip pat su šlapimu [10].
Paracetamolis selektyviai slopina ciklooksigenazės COX-1 ir COX-2 fermentų receptorius ir malšina skausmą, šiek tiek stipriau veikia COX-2. Priešuždegiminio poveikio nesukelia [13]. Paracetamolis vartojamas karščiavimui, silpno ir vidutinio skausmo malšinimui.
Lengvam ir vidutiniam skausmo malšinimui paracetamolis vartojamas po 500 mg tabletėmis kas 4 – 6 valandas, maksimali paros dozė 4000 mg. [14].
1.3.2.
Naproksenas
C14H14O3, Mr=230,3, CAS-22204-53-1, IUPAC pavadinimas: (2S)-2-(6-metoksinaftalen-2-il)propanoinė
rūgštis[8].
Fizikinės savybės: Balti kristaliniai milteliai.
Praktiškai netirpsta vandenyje, tirpsta etanolyje santykiu 1:25, chloroforme santykiu 1:15 ir eteriu santykiu 1:40 [8]. Patentuoti pavadinimai Lietuvoje: „EMOX“, „Epromul“, „Etrixenal“, „MOMENDOL“, „Nalgesin S“, „Nalgesin forte“, „Trebexen“[9].
7 pav. Tramadolio struktūrinė formulė [42]
plazmos baltymais susijungia labai stipriai – daugiau nei 99 %. Metabolizuojamas kepenyse, aktyviai pirmojoje metabolizmo fazėje į 6-o-demetilnaprokseno metabolitą, vėliau ir šis metabolitas ir naproksenas antrojoje metabolizmo fazėje yra konjuguojami su glukurono rūgštimi ir sulfatu iki penkių galimų metabolitų konjugatų [15]. Naprokseno pusinis eliminacijos laikas 17,1 val. [16]. Metabolitai išsiskiria su šlapimu 95 % [17].
Naproksenas neselektyviai jungiasi prie COX-1 ir COX-2 receptorių, tačiau labiau slopina COX-1, 5 kartus stipriau nei COX-2 receptorių [18]. Naproksenas vartojamas numalšinti skausmą bei uždegimą dėl reumatinių ligų, taip pat dėl raumenų ir kaulų sistemos pažeidimų, dismenorėjos, dantų ar galvos skausmui mažinti [19].
Naproksenas vartojamas tabletėmis, pradinė dozė 500 mg, palaikomoji 250 mg, kas 6 – 8 valandas arba 500 mg tabletė kas 12 valandų, maksimali pradinė dozė 1250 mg per dieną, vėliau 1000 mg per dieną [20].
1.3.3.
Tramadolio hidrochloridas
C16H25NO2,HCl, Mr=299,8, CAS-22204-88-2, IUPAC pavadinimas: (1R,2R)-2-(dimetilaminometil)-1-(3-metoksifenil)cikloheksanol-1-olis [8].
Fizikinės savybės: balti, kartaus skonio, bekvapiai
kristaliniai milteliai, lengvai tirpsta vandenyje ir etanolyje [8].
Patentuoti pavadinimai Lietuvoje: „MABRON“, „MABRON
RETARD“, „Tramadol-KRKA“, „Tramadol-LANNACHER“, „Tramadol-Vitabalans“, „Tramadolis-SANITAS“, „Tramadolor ID“ [9].
Tramadolį pavartojus per os, absorbuojamas labai greitai, didžiausia koncentracija plazmoje pasiekiama po 2 valandų po pavartojimo. Apie 20 % jungiasi su plazmos baltymais. Tramadolis aktyviai metabolizuojamas kepenyse O- ir N- demetilinimo ir konjugacijos reakcijomis. Demetilinimo reakcija katalizuojama citochromų P450 CYP2D6 ir CYP3A4/CYP2B6 fermentų į atitinkamus O- ir N-demetilintus tramadolius. Pusinis eliminacijos laikas yra 5 – 8 valandos. Apie 90 % tramadolio ir jo metabolitų ekskrecija vyksta per inkstus, o apie 10 % šalinama su išmatomis [21].
Tramadolį vartojant prailginto atpalaidavimo tabletėmis – 100 mg vieną kartą dienoje, maksimali paros dozė 300 mg [24]. Esant vidutiniškam ar vidutiniškai sunkiam skausmui, vartojama greito atpalaidavimo ar burnoje disperguojamas tabletes 50 – 100 mg kas 4 – 6 valandas, maksimali paros dozė 400mg [24].
1.4.
Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio sąveikos ir nepageidaujamas
poveikis
Sąveikos tarp paracetamolio, naprokseno ir tramadolio nėra [25], šiuos vaistus galima vartoti kartu, tik reikia nepamiršti atsižvelgti į paros dozę.
Vidutinio svarbumo sąveika pastebėta tarp vaisto-maisto, t.y. paracetamolio ir kopūstų. Vartojant juos kartu, kopūstai didina acetaminofeno metabolizmą žmogaus organizme, greitėja gliukuronizacija, o tai gali sumažinti paracetamolio efektyvumą [25]. Didelės rizikos reakcija pastebėta tarp paracetamolio ir etanolio, nes ši sąveika didina riziką kepenų toksiškumui. Taip pat vartojant tramadolio hidrochloridą su etanoliu, yra didelis pavojus dėl kvėpavimo centro ir centrinės nervų sistemos slopinimo [25].
Paracetamolis turi nemažai nepageidaujamų poveikių kepenų pažeidimai (kepenų sutrikimai, nekrozė, gelta), virškinimo trakto sutrikimai (hemoragija, pilvo skausmas, diarėja, pykinimas, vėmimas), inkstų pažeidimams, hiperjautrumo reakcijos, bėrimai, niežulys, prakaitavimas, dilgėlinė, širdies sistemos sutrikimai [9][26]. Naprokseno šalutiniai poveikiai apima labai daug sistemų. Dažnai sutrinka virškinimo traktas: rėmuo, pykinimas, vidurių užkietėjimas, viduriavimas, dujų susikaupimas virškinimo trakte, dispepsija, diskomfortas pilve ir epigastriumo srityje. Retai: opinis stomatitas, ezofagitas, gastritas ir pankreatitas. Taip pat gali atsirasti nemiga, depresija, sumišimas bei haliucinacijos, galvos skausmai, svaigulys, regėjimo sutrikimai, ūžimas ausyse, edema, hipertenzija, kepenų sutrikimai – gelta, bėrimas, niežulys, dilgėlinė, inkstų sutrikimai [9]. Tramadolio nepageidaujami poveikiai gali būti pykinimas, vėmimas, vidurių užkietėjimas, mieguistumas, kvėpavimo slopinimas, hipotenzija, alerginės reakcijos bei infekcijos [27].
1.5.
Vaistinių medžiagų nustatymas biologinėse terpėse
kraujas, šlapimas. Pirmasis etapas, nustatant toksines medžiagas, yra tiriamosios medžiagos išskyrimas iš biologinių terpių, naudojant ekstrakcijos metodus. Ekstrakcijos metu mėginys išvalomas ir sukoncentruojamas. Ekstrakcijai naudojami įvairūs analitiniai metodai: kietafazė ekstrakcija, kietafazė mikroekstrakcija, elektrocheminė, skysčių – skysčių ekstrakcija. Chromatografiniai metodai, kurie skirti medžiagoms identifikuoti, analizuoti jas kiekybiškai ir kokybiškai: efektyvioji skysčių chromatografija kartu su ultravioletine (UV) spinduliuote, nustatymas fluorescencija, dujų chromatografija – masių spektrometrija, skysčių chromatografija – masių spektrometrija, plonasluoksnė chromatografija ir spektrofluorometrija [28]. Apsinuodijus paracetamoliu dažniausiai analizei naudojama plazma, kraujas, serumas, šlapimas, motinos pienas, seilės, skrandžio turinys, stiklakūnio skystis, smegenų, inkstų, kepenų, raumenų audiniai bei plaukai. Apsinuodijus naproksenu analizuojama plazma, serumas, šlapimas, sinovinis skystis. Apsinuodijus tramadoliu analizei naudojamas kraujas, plazma, serumas, šlapimas, plaukai, kepenų audinys [8].
1.6.
Skysčių – skysčių ekstrakcija
Skysčių – skysčių ekstrakcija – tai ekstrakcija, kuriai naudojami du tarpusavyje nesimaišantys skysčiai. Dažniausiai viena fazė paprastai būna vanduo, o kita organinis tirpiklis. Ekstrahentas yra parenkamas pagal tris svarbiausius aspektus – medžiagų maišumą, tankį ir tirpumą. Jeigu sumaišius du tirpiklius bet kokiu santykiu jie nesudaro dviejų atskirų fazių, vadinasi, tirpikliai yra besimaišantys. Atsižvelgiant į tankį – jeigu organinis tirpiklis turi didesnį tankį nei vanduo, tai organinio tirpiklio sluoksnis bus viršuje, o jeigu tankis mažesnis nei vandens, tuomet organinis sluoksnis bus viršuje. Nesimaišantys tirpikliai sudaro dvi skirtingas fazes, tačiau jie gali būti dalinai tirpūs vienas kitame, taip gaunamas vieno tirpiklio prisotinimas kitu, todėl parenkant tirpiklį yra labai svarbu atsižvelgti ar tirpikliai nėra tirpūs vienas kitame [29]. SSE atliekama dalomajame piltuve, supylus į jį vandeninį medžiagų tirpalą, organinį tirpiklį ir švelniai jį vartant ir maišant skysčius, šis procesas kartojamas kelis kartus iš eilės, mažomis tirpiklio porcijomis [8]. SSE yra nebrangus ir greitas metodas, tačiau turi ir trūkumų, nes sunaudojami dideli tirpiklių kiekiai bei susiformuoja emulsijos, kurios pablogina ekstrakcijos išgavą.
1.7.
Vaistinių medžiagų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
sluoksniu. Populiariausias sorbentas yra silikagelis. Ant plokštelės užnešus tiriamąsias medžiagas plokštelė įdedama į kamerą, kurioje yra pasirinktas eliuentas (tirpiklis) ar jų sistema. Veikiamas adsorbcinių jėgų eliuentas kyla chromatografine plokštele, kartu skirtingu greičiu keldamas tiriamąsias medžiagas. Medžiagų atskyrimas vyksta dėl skirtingo jų afiniteto judančiosios ir nejudančiosios fazių atžvilgiu [30]. PC metodas yra lengvai atliekamas, paprastas, plačiai pritaikomas, greitas ir atrankus, su juo galima pasiekti tikslų mišinių išskirstymą ir tikslų medžiagų identifikavimą.
1.8.
Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
ESC – fizikocheminis analizės metodas, kurio metu mėginio komponentai pasiskirsto tarp judriosios ir nejudriosios fazių. Šis metodas taikomas ir kokybiniam ir kiekybiniam vaistinių medžiagų nustatymui biologinėse terpėse. Privalumai: atrankus ir jautrus junginių nustatymas, galimybė išvalyti ir sukoncentruoti mėginį. Parenkant chromatografines sistemas ir detektorius tikslas yra kuo labiau sutrumpinti analizės laiką. Jeigu vaisto koncentracija labai maža, tuomet reikalingi jautrūs ir specifiški detektoriai (UV absorbcijos ir fluorescencijos). Vaistinių medžiagų analizei dažniausiai naudojamos atvirkščių fazių silikagelio kolonėlės, judriajai fazei pasirenkami tokia sistema, kuri galėtų atskirti kuo daugiau skirtingų organinių medžiagų [8].
1.9.
Metodikos validacija ir jos parametrai
Įrodymai pagrįsti dokumentais, kad metodas (procesas) vykdomas tam tikromis sąlygomis, gali būti atliekamas efektyviai ir atkartojamai, yra vadinama validacija.
Vertinant efektyviosios skysčių chromatografijos metodo specifiškumą yra gretinamos analičių ir etaloninių tirpalų chromatogramos, chromatografinių smailių sulaikymo laikai. Jeigu analičių ir standartų specifiškumo parametrai sutampa – laikoma, kad metodas yra specifiškas. Pakartojamumas parodo tikslumą tomis pačiomis tyrimo sąlygomis per trumpą laiko intervalą. Pakartojamumas turi būti apskaičiuotas naudojant mažiausiai 6 to pačio mėginio matavimus, naudojant rastų smailių sulaikymo laikus, jų plotų vidurkius ir standartinį nuokrypį, skaičiuojant santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Tarpinis preciziškumas išreiškia įvairias tyrimo variacijas, kaip pvz.: tyrimą skirtingomis dienomis, skirtingus tyrėjus, skirtingą įrangą ir pan. Vaistiniams preparatams santykinis standartinis nuokrypis neturėtų būti didesnis nei 5 % [31].
2.
TYRIMO METODIKA
2.1.
Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – vaistinės medžiagos (paracetamolis, naproksenas, tramadolio hidrochloridas) kraujo plazmoje.
Anonimiški kraujo mėginiai gauti iš LSMU klinikų Kraujo centro, tam buvo gautas Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-FF-09 (Priedas nr. 1).
2.2.
Reagentai
Išgrynintas vanduo, metanolis, etanolis, acetonitrilas, trichlormetanas, natrio hidroksidas, natrio karbonatas, vandenilio chlorido rūgštis, etilo acetatas, amonio hidroksidas (Sigma-Aldrich, Vokietija).
2.3.
Įranga
Vandens gryninimo sistema „Milipore“; ultragarso vonelė „WiseClean“; vibracinė maišyklė „MS2 Minishaker, IKA; centrifūra „Centurion Scientific C2 series“; chromatrografinės plokštelės, padengtos silikagelio sorbciniu sluoksniu; „CAMAG TwinChamber“ kameros; pusiau automatinis mėginių užnešėjas „CAMAG Linomat 5“; vizualizavimo prietaisas „CAMAG TLC Visualize“; programinė įranga „VideoScan“.
2.4.
Kokybinė analizė plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu
2.4.1.
Etaloniniai tirpalai
standartiniai tirpalai, kurių koncentracija atitinka 0,2 mg/ml. Etaloninių medžiagų mišinys buvo ruošiamas sumaišius po 1 ml paruoštų standartinių tirpalų.
2.4.2.
Tiriamųjų tirpalų gamyba
Tiriamiesiems tirpalams paruošti naudojami Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai. Paracetamolio tiriamajam tirpalui naudojamos „Paracetamol Actavis“ 500 mg tabletės. Pusė tabletės (250 mg) grūstuvėje susmulkinama iki vienalytės masės, gauti milteliai perkeliami į 100 ml kolbą ir ištirpinami 50 ml vandens ir 50 ml metanolio mišinyje. Tirpalas sonifikuojamas ultragarso vonelėje „WiseClean“ 15 minučių. Po sonifikacijos tirpalas filtruojamas. Naprokseno tiriamajam tirpalui naudojamos „Nalgesin S“275 mg naprokseno natrio druskos plėvele dengtos tabletės, kuriose yra 251 mg naprokseno. Peiliu nuskutama plėvelė, tabletė susmulkinama grūstuvėje iki vienalytės masės. Milteliai perkeliami į 100 ml kolbą ir ištirpinami 100 ml etanolyje. Tirpalas sonifikuojamas ultragarso vonelėje 15 minučių, po to filtruojamas. Tramadolio hidrochlorido tiriamajam tirpalui naudojamas „Tramadol Krka“ injekcinis tirpalas, koncentracija 100mg/2ml. Tirpalas skiedžiamas 50 ml vandens ir 50 ml metanolio mišinyje. Toliau tiriamieji tirpalai skiedžiami atitinkamais tirpikliais: iš paracetamolio tirpalo paimama 0,4 ml ir praskiedžiama 4,8 ml vandeniu ir 4,8 ml metanoliu; iš naprokseno tirpalo – 0,4 ml ir praskiedžiama iki 10 ml etanoliu; iš tramadolio tirpalo paimama 1 ml ir praskiedžiama 4,5 ml vandeniu ir 4,5 ml metanoliu. Po to tirpalai filtruojami pro „FRISENETTE Q-Max® syringe filtre“ (0,22 μm) membraninį filtrą. Tiriamųjų tirpalų mišiniui pagaminti, kiekvieno tirpalo imama po 1 ml. Pagaminti standartiniai ir tiriamieji tirpalai naudojami ESC ir PC analizėms atlikti.
2.4.3.
Skysčių – skysčių ekstrakcija iš kraujo plazmos metodika
trichlormetano sluoksnis kartu su tiriamosiomis medžiagomis atskiriamas. Ekstrakcija dalomuoju piltuvu kartojama dar du kartus, kad iki galo išsiekstrahuotų reikalingos medžiagos. Surinktas ekstraktas, naudojant azoto srovę, išgarinamas iki sauso likučio, tuomet tirpinamas 1 ml metanolio ir 1 minutę sonifikuojamas ultragarso vonelėje. Tokiu pačiu metodu paruošiamas ir „tuščias“ plazmos mėginys, be vaistinių medžiagų [33]. Paruošti mėginiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.4.4.
Plonasluoksnės chromatografijos metodika
Tirpiklių sistema: etilo acetatas, metanolis, 25 % amonio hidroksido tirpalas.
Ryškiklis: Chromatografinių plokštelių ryškinimui taikyta UV spinduliuotė (254 nm).
Analizė: Tiriamieji tirpalai iš tablečių ir injekcinio tirpalo užnešami ant chromatografinės
plokštelės, greta užnešamas etaloninių vaistinių medžiagų mišinys. Chromatografinė plokštelė įdedama į kamerą, pripildytą atitinkamomis tirpiklių sistemomis. Tirpiklių sistemai pakilus iki 9 cm plokštelė, ši išimama iš kameros ir išdžiovinama. Išdžiūvus plokštelei, susidariusioms vaistinių medžiagų dėmėms ryškinti naudojama UV spinduliuotė ties 254 nm šviesos bangos ilgiu. Apskaičiuojamos tiriamųjų tirpalų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės ir lyginamos su etaloninių tirpalų sulaikymo rodiklio reikšmėmis.
2.5.
Kokybinė analizė efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu
2.5.1.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Įranga: Vaistinių medžiagų nustatymui kraujo plazmoje buvo pasirinktas skysčių
chromatografas „Waters 2695“ bei fotodiodų matricos detektorius „Waters 996“. Analizei atlikti naudota kolonėlė ACE C18, kurios ilgis – 250 mm, vidinis diametras – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5µm.
Tirpikliai: 2,5 M sulfato rūgšties vandeninis tirpalas ir acetonitrilas.
Analizė: Judrioji fazė sudaryta iš vandeninio sulfato rūgšties tirpalo 0,5 ml 2,5 mol/l ir
1 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko
Laikas (min.) Eliuento tekėjimo greitis (ml/min) 2,5 M sulfato rūgšties vandeninis tirpalas – A (%) Acetonitrilas – B (%) 00:00 1,00 98 2 03:00 1,00 98 2 23:00 1,00 2 98 25:00 1,00 2 98 26:00 1,00 98 2
2.6.
Duomenų apdorojimas
Duomenys rinkti ir analizuojami naudojant Microsoft Office Excel 2007, Empower 2,
3.
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1.
Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
Remiantis literatūros šaltiniais [8][35] buvo atrinktos trys tirpiklių sistemos (TS), kurios tiko visoms trims tiriamosios medžiagoms:
1) A – Etilo acetatas – metanolis – 25 % amonio hidroksido tirpalas (85:10:5); 2) B – Metanolis.
3) C – Chloroformas – etanolis (80:20) .
Tiriamieji tirpalai užlašinami ant chromatografinės plokštelės, šalia užlašinamas etaloninių junginių mišinys. Plokštelė dedama į chromatografinę kamerą su atitinkama tirpiklių sistema. Mobiliajai fazei pakilus iki finišo linijos, plokštelė išimama ir išdžiovinama, po to identifikuojama ryškinant:
1) Ultravioletine spinduliuote (UV) ties 254 nm bangos ilgiu; 2) Mandelino reagentu;
3) 5 % geležies chlorido tirpalu.
Apskaičiuojamos jų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės, kurios lyginamos su etaloninių tirpalų Rf reikšmėmis.
Atlikus pirminius bandymus su minėtomis sistemomis, pastebėta, kad sistema, kurioje yra tik metanolis (B), netinkama, nes tramadolio mėginys pakilo kartu su tirpiklių sistemos zona (8 pav.). Atlikus analizę su tirpiklių sistema C, chromatogramoje matėsi, kad tiriamosios medžiagos pakilo iki vienodo lygmens, o mišinio komponentai neatsiskyrė. Tramadolio dėmės visai nesimatė (9 pav.). Dėmei išryškinti buvo naudoti Mandelino reagentas ir 5 % geležies chlorido tirpalai, tačiau dėmė vis tiek neišryškėjo. Atlikus analizę su tirpiklių sistema A ir dėmėms ryškinti panaudojus UV spinduliuotę (254 nm), tiriamųjų junginių bei mišinio dėmės buvo matomos ryškiai (10 pav.).
10 pav. 1 takelis – paracetamolio tiriamasis tirpalas (PT), 2 takelis – naptrokseno tiriamasis tirpalas (NT), 3 takelis – tramadolio tiriamasis
tirpalas (TT), 4 takelis – paracetamolio (PE), naprokseno (NE) ir tramadolio (TE) etaloninių tirpalų mišinys
8 pav. B tirpiklių sistemos chromatograma. 1 takelis – paracetamolio etaloninis tirpalas
(PE), 2 takelis – naprokseno etaloninis tirpalas (NE), 3 takelis – tramadolio
etaloninis tirpalas (TE).
9 pav. C tirpiklių sistemos chromatograma. Pparacetamolis – PT, naproksenas – NT,
2 lentelė. Statistinis tiriamųjų vaistinių medžiagų (paracetamolio, naprokseno, tramadolio) Rf reikšmių vertinimas
Tirpiklių sistema Tiriamoji medžiaga Rf vidurkis Standartinis nuokrypis Pasikliautinasis intervalas
Etilo acetatas – metanolis – 25 % amonio hidroksido tirpalas (85:10:5) Paracetamolis (PT) 0,49 0,01 0,48 – 0,49 Naproksenas (NT) 0,09 0,01 0,09 – 0,10 Tramadolis (TT) 0,75 0,02 0,74 – 0,75
Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad naudota tirpiklių sistema A, sudaryta iš etilo acetato, metanolio ir 25 % amonio hidroksido tirpalo (85:10:5), yra tinkama paracetamolio, naprokseno ir tramadolio bei jų mišinio komponentų kokybiniam nustatymui, nes tirpiklių sistemos atsikartojamumo paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos.
3.2.
Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Remiantis literatūros šaltinių analize [8][35-39] buvo pasirinkta ir modifikuota ESC metodika vaistinių medžiagų mišinio, sudaryto iš paracetamolio, naprokseno ir tramadolio, analizei.
Tyrimų eigoje buvo naudota kitos firmos chromatografinė kolonėlė, jos išmatavimai liko tokie patys, kolonėlės temperatūra iš 40 °C keista į 25 °C, eliuentų sistemoje 2,5 M sulfato rūgtis
acetonitrile pakeista į acetonitrilą.
3 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradientinis kitimas
Laikas (min.) Eliuento tekėjimo greitis (ml/min) 2,5 M sulfato rūgšties vandeninis tirpalas – A (%) Acetonitrilas – B (%) 00:00 1,00 98 2 03:00 1,00 98 2 23:00 1,00 2 98 25:00 1,00 2 98 26:00 1,00 98 2
Atlikus chromatografinę analizę pasirinkta ESC metodika, nustatyti etaloninių medžiagų sulaikymo laikai (11 pav.).
Optimizuotos metodikos tinkamumui įrodyti buvo atliktas validacijos procesas, nustatant šiuos validacinius parametrus: specifiškumą, glaudumą, ribas ir tiesiškumą bei aptikimo ir nustatymo ribas.
3.3.
Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija
Norint taikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką tiriamųjų vaistų mišinio (paracetamolio, naprokseno ir tramadolio) nustatymui iš kraujo plazmos, reikia įrodyti pasirinkto analizės metodo tinkamumą, dėl to atliekama ESC validacija. Remiantis ICH analitinių procedūrų validacijos gairėmis, buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai: specifiškumas, rezultatų glaudumas (pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas), tiesiškumo ribos ir kalibracinė kreivė [31].
3.3.1.
Specifiškumas
Metodikos specifiškumas parodo, kad tiriamasis komponentas yra atskiriamas nuo kitų medžiagų. Norint įvertinti pasirinktos metodikos specifiškumą chromatografuojamas tiriamųjų vaistinių medžiagų mišinys ir lyginamas su standartinių medžiagų smailėmis. Gautos chromatogramos pateiktos 12 pav.
12 pav. a. Tramadolio standartinio metanolinio tirpalo chromatograma, b. Naprokseno standartinio etanolinio tirpalo chromatograma, c. Paracetamolio standartinio metanolinio tirpalo chromatograma, d. Tiriamųjų medžiagų mišinio
Iš pateiktos chromatogramos matyti, kad tiriamųjų medžiagų smailės, sutampa su etaloninių tirpalų smailėmis, pagal sulaikymo laikus.
Taip pat užregistruoti etaloninių ir tiriamųjų medžiagų smailių UV absorbcijos spektrai ir palyginti su literatūroje nurodytais etaloninių vaistinių medžiagų UV šviesos sugerties spektrais (4 lentelė). Tiriamųjų medžiagų analizės metu gauti UV spektrai, pagal sulaikymo laikus, sutampa su etaloninių medžiagų spektrais bei spektrais, pateiktais literatūroje [8], todėl galima teigti, kad pasirinkta ESC metodika atitinka specifiškumui keliamus reikalavimus.
4 lentelė. A. Paracetamolio, naprokseno, tramadolio literatūroje pateikti UV absorbcijos spektrai; B. UV absorbcijos spektrai išmatuoti fotodiodų matricos detektoriumi
3.3.2.
Rezultatų glaudumas
Analitinės metodikos rezultatų glaudumas, rezultatų artumas nustatomas atlikus matavimų seriją, kur naudojamas tas pats mėginys tomis pačiomis analizės sąlygomis [31]. Glaudumas
Tiriamoji medžiaga
A. Literatūroje pateikiami etaloniniai UV absorbcijos
spektrai
B. UV absorbcijos spektrai gauti išmatavus fotodiodų matricos
detektoriumi
Paracetamolis
Naproksenas
nustatomas pagal pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Pakartojamumas apskaičiuojamas, atliekant tomis pačiomis sąlygomis vieną po kito 6 pakartojimus tą pačią dieną, naudojant tą patį vaistinių medžiagų etalonų mišinį. Po to yra apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis (SSN), kuris išreiškiamas procentais smailės plotui ir sulaikymo laikui, jis turi būti ne didesnis nei 5 %.
Tarpinis preciziškumas yra vertinamas analizuojant mėginyje nustatomą komponentą ir atliekant po 6 injekcijas 3 dienas iš eilės anksčiau minėtomis sąlygomis. Pagal gautus rezultatus apskaičiuojami smailių sulaikymo laikų santykiniai standartiniai nuokrypiai (5 lentelė).
5 lentelė. Metodikos glaudumo rezultatai
Preparatas
Tarpinis preciziškumas Pakartojamumas Sulaikymo laiko SSN (proc.) Sulaikymo laiko SSN (proc.) Paracetamolis 0,25 0,215 Naproksenas 0,05 0,05 Tramadolis 0,15 0,145
Apibendrinus rezultatus matome, kad rezultatų pakartojamumas atitinka nustatytus reikalavimus, nes sulaikymo laiko SSN procentine verte neviršija nustatytos ribos (≤ 5 %). Tarpinio preciziškumo rezultatai taip pat atitinka keliamus reikalavimus, nes sulaikymo laiko SSN neviršija normos ribų (≤ 10 %). Atsižvelgiant į šiuo kriterijus, pasirinktų vaistinių medžiagų nustatymui metodika yra tinkama.
3.3.3.
Tiesiškumas ir ribos
Tiesiškumas yra metodo gebėjimas gauti rezultatus, tiesiogiai proporcingus tiriamojo junginio koncentracijai tiriamajame mėginyje [28]. Remiantis tarptautinės harmonizavimo konferencijos (ICH) gairėmis, tiesiškumas turi būti vertinamas pateikus mažiausiai 5 koncentracijos žymas, kartu nurodant minimalius intervalus [29]. Tiesiškumas vertinamas kalibravimo kreivės metodu (15 pav., 16 pav., 17 pav.).
6 lentelė. Kalibravimo kreivių charakteristikos Tiriamoji medžiaga Sulaikymo laikas tR, min Koreliacijos koeficientas R2 Kalibracinės
kreivės lygtis ribos (mg/ml) Tiesiškumo
Paracetamolis 9,475 0,9998 Y = 1,22*10 7x + 7,52*103 0,003 – 0,05 Naproksenas 18,235 0,9997 Y = 9,65*10 6x + 5,30*103 0,003 – 0,05 Tramadolis 12,321 0,9999 Y = 9,19*10 6x + 1,06*103 0,001 – 0,05
Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio kalibraciniai grafikai: paracetamolis nuo 0,003 iki 0,05 mg/ml, naproksenas nuo 0,003 iki 0,05 mg/ml, o tramadolis nuo 0,001 iki 0,05 mg/ml koncentracijos intervaluose. Nustatyti visų korealiacijos koeficientai, atitinkamai 0,9998, 0,9997 ir 0,9999 (6 lentelė), kurie atitinka keliamus reikalavimus didesnės nei 0,99 ir artimos 1 [32]. Galima daryti išvadą, kad ESC metodikos tiesiškumas atitinka visus keliamus reikalavimus. Šis parametras įrodo ESC metodo tiesiškumą tiriant pasirinktus preparatus.
3.3.4.
Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba yra mažiausias tiriamosios medžiagos kiekis, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai įmanoma patikimai nustatyti kiekybiškai. Nustatymo riba yra nustatoma analizuojant
žinomas mėginių koncentracijas, randant mažiausią kiekį medžiagos, kuris gali būti tiksliai ir teisingai vertinamas [31]. Šių parametrų nustatymui atliekami analizės matavimai, esant nedidelei vaistinės medžiagos koncentracijai mėginyje. Vienas iš būdų apskaičiuoti aptikimo ir nustatymo ribas yra šių ribų nustatymas naudojant signalo ir bazinės linijos triukšmo santykį S/N (angl. signal to noise ratio). Junginių aptikimo riba nustatoma, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis yra 3:1, o nustatymo riba vertinama, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis yra 10:1. Šis metodas yra taikomas analitinėms procedūroms, kurių metu pasireiškia bazinės linijos triukšmas [31].
Paracetamolio, naprokseno ir tramadolio aptikimo ir nustatymo ribų rezultatai pateikiami 7 lentelėje.
7 lentelė. Tiriamųjų medžiagų aptikimo ir nustatymo ribos
Tiriamoji medžiaga Aptikimo riba μg/ml Nustatymo riba μg/ml
Paracetamolis 0,0045 0,015
Naproksenas 0,0045 0,015
Tramadolis 0,0015 0,005
Gauti rezultatai parodė, kad tirtų junginių aptikimo ir nustatymo ribos skiriasi. Mažiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra tramadolio, o didžiausios paracetamolio ir naprokseno.
Įvertinus pasirinktas validacijos charakteristikas ir remiantis gautais rezultatais, galime daryti išvadą, kad efektyviosios skysčių chromatografijos metodika yra tinkama paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vaistų mišinio identifikavimui ir kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui. Validuota ESC metodika bus taikoma paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vaistų mišinio kokybiniam nustatymui po ekstrakcijos iš kraujo plazmos.
3.4.
Preparatų ekstrakcija iš kraujo plazmos
3.4.1.
Ekstrakcija Nr. 1
nusodinimui, į jau paruošto plazmos mėginį įpilamas 1,25 ml acetonitrilo tirpalas ir maišoma vibracine maišykle 1 minutę. Po to mėginys centrifuguojamas 5 minutes, 4000 apsisukimų per minutę greičiu. Po centrifugavimo plazma ir kitos dalelės nusėda mėgintuvėlio apačioje, o vandeninis sluoksnis, esantis viršuje, atskiriamas ir išdžiovinamas iki sauso likučio naudojant azoto srovę. Gautas sausasis likutis tirpinamas 1 ml vandens ir 2 ml trichlormetano, ekstrahuojama dalomajame piltuve 5 minutes, piltuvas atsargiai purtomas, po to ramiai paliekamas, kad nusistovėtų ir atsiskirtų tirpiklių sluoksniai. Organinis trichlormetano sluoksnis kartu su tiriamosiomis medžiagomis atskiriamas. Ekstrakcija dalomuoju piltuvu kartojama dar du kartus, kad iki galo išsiekstrahuotų reikalingos medžiagos. Surinktas ekstraktas, naudojant azoto srovę, išgarinamas iki sauso likučio, tuomet tirpinamas 1 ml metanolio ir 1 minutę sonifikuojamas ultragarso vonelėje. Tokiu pačiu metodu paruošiamas ir „tuščias“ plazmos mėginys, be vaistinių medžiagų [33]. Paruošti mėginiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3.4.2.
Ekstrakcija Nr. 2
Atlikta ir dar viena skysčių – skysčių ekstrakcija (SSE) iš kraujo plazmos pagal kitą metodiką [34]. Į 200 µl paracetamolio, naprokseno ir tramadolio tiriamųjų tirpalų mišinį įpilama 0,5 ml 0,1 N natrio hidroksido vandeninio tirpalo ir 0,5 ml 0,1 N natrio karbonato vandeninio tirpalo. Po to įleidžiami 2 ml kraujo plazmos ir papildoma 4 ml ekstrahento trichlormetano. Kraujo plazmos ir tiriamųjų medžiagų mišinys maišomas 5 minutes vibracine maišykle. Po maišymo susidariusios emulsijos ardomos centrifugoje 1 minutę, 3000 apsisukimų per minutę greičiu. Suardžius emulsijas, fazės atskiriamos naudojant dalomąjį piltuvą. Piltuvas atsargiai purtomas, po to ramiai paliekamas, kad nusistovėtų ir atsiskirtų tirpiklių sluoksniai. Organinis sluoksnis kartu su tiriamosiomis medžiagomis atskiriamas ir išgarinamas iki sauso likučio naudojant azoto srovę. Sausas likutis tirpinamas 2 ml praskiestoje vandenilio chlorido rūgštyje, kurios pH 3. Tokiu pačiu metodu paruošiamas ir „tuščias“ plazmos mėginys, be vaistinių medžiagų. Paruošti mėginiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
kad plazma išsivalė švariausiai. Pagrindine ekstrakcijos iš kraujo plazmos metodika naudota ekstrakcija Nr. 1 (18 pav.).
3.5.
Vaistų mišinio ESC analizės rezultatai po ekstrakcijos iš kraujo
plazmos
Atlikus tiriamųjų vaistų mišinio (paracetamolio, naprokseno, tramadolio) ekstrakciją iš kraujo plazmos, junginiai identifikuoti pagal etaloninių junginių mišinio validuotą ESC metodiką.
19 pav. matyti, kad eliuento ir plazmos mėginio be tiriamųjų medžiagų („tuščio mėginio“) chromatogramose nėra papildomų smailių, kurios trukdytų paracetamolio, naprokseno ir tramadolio nustatymui.
18 pav. Kraujo plazmos (be tiriamųjų medžiagų) ekstrakcijos skirtingais ekstrakcijos metodais. A – ekstrakcija Nr. 1 (pirmą kartą), B – ekstrakcija Nr. 2, C – ekstrakcija Nr.
4.
IŠVADOS
1. Tinkamiausia plonasluoksnės chromatografijos metodika paracetamolio, naprokseno ir tramadolio vaistų mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam nustatymui yra naudojant tirpiklių sistemą: etilo acetatas, metanolis ir 25% amonio hidroksidas (85:10:5) ir ryškinant UV spinduliuote (254 nm).
2. Parinktos tinkamiausios efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) sąlygos ir atlikta ESC metodikos validacija, visi validaciniai parametrai atitinka keliamus reikalavimus. Mažiausia aptikimo riba yra tramadolio – 0,0015 μg/ml, kiekybinio nustatymo riba yra 0,005 μg/ml, kalibracinė kreivė yra tiesinė ribose nuo 0,001 iki 0,05 mg/ml, paracetamlio ir naprokseno kalibracinės kreivė yra tiesinės ribose nuo 0,003 – 0,05 μg/ml.
3. Parinkta tinkama skysčių – skysčių ekstrakcijos metodika vaistų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos: tirpikliai acetonitrilas, trichlormetanas, metanolis.
5.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
6.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Higienos instituto Sveikatos informacijos centras. 2017. Mirties priežastys (išankstiniai duomenys). Mirties priežastys (išankstiniai duomenys) 2016.
2. Higienos instituto sveikatos informacijos Sužalojimai ir apsinuodijimai Lietuvoje 2015 m. 2016. 3. Caro, Ester, Rosa M. Marcé, Peter A G Cormack, David C. Sherrington, and Francesc Borrull. 2004. A new molecularly imprinted polymer for the selective extraction of naproxen from urine samples by solid-phase extraction. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in
the Biomedical and Life Sciences 813: 137–143. doi:10.1016/j.jchromb.2004.09.019.
4. Ataskaita apie 2016 metais suvartotus vaistus. VVKT, 2016. Prieiga per internetą: http://www.vvkt.lt/lit/Parengta-vaistu-suvartojimo-2016-m-ataskaita/1759.
5. Seilis A., Gailīte E., Rootslane L., Laius O., Savaikis L., Tomaševič R. 2015. Baltic Statistics on
Medicines 2013–2015. 2nd editio. Riga: Latvian State Agency of Medicines.
6. Sussman, Norman L., and Christopher H. Remien. 2016. The Headache of Acetaminophen Overdose: Getting the N-Acetylcysteine. Clinical Gastroenterology and Hepatology. Elsevier Ltd. doi:10.1016/j.cgh.2016.12.011.
7. Šurkus J., Kajokas T. V. Apsinuodijimas paracetamoliu. Farmacija ir laikas; 2006. Nr. 10. 61– 62. Kaunas.
8. Anthony CM, Osselton MD, Widdop B.; 2011. Clarke’s analysis of drugs and poisons. 4th ed. Vol. 20. UK: Pharmaceutical Press. doi:10.1300/J123v27n02_07.
9. Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registras. VVKT; [žiūrėta 2017-01-13]. Prieiga per internetą: http://extranet.vvkt.lt/paieska/.
10. Biscevic-Tokic, Jasmina, Nedim Tokic, and Elma Ibrahimpasic. 2015. Chromatography as method for analytical confirmation of paracetamol in postmortem material together with psychoactive substances. Acta Informatica Medica 23: 322–325. doi:10.5455/aim.2015.23.322-325.
11. Peper, Jiska S, and Ronald E Dahl. 2015. Time course of acetaminophen-protein adducts and
acetaminophen metabolites in circulation of overdose patients and in HepaRG cells. Vol. 22.
doi:10.1177/0963721412473755.Surging.
12. Banerjee, Sudip, Stepan B. Melnyk, Kimberly J. Krager, Nukhet Aykin-Burns, Lynda G. Letzig, Laura P. James, and Jack A. Hinson. 2015. The neuronal nitric oxide synthase inhibitor NANT blocks acetaminophen toxicity and protein nitration in freshly isolated hepatocytes. Free
Radical Biology and Medicine 89. Elsevier: 750–757.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2015.09.022.
Translocation in Cultured Sensory Neurons with Additive Effects When Coapplied with Paracetamol (Acetaminophen) 2017. Hindawi Publishing Corporation. doi:10.1155/2017/3595903.
14. Micromedex solutions duomenų bazė; [žiūrėta 2017-01-16]. Prieiga per internetą: http://www.micromedexsolutions.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/micromedex2/librarian/C S/4C2C6D/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/B10D 5A/ND_PG/evid.
15. Elsinghorst, Paul W., Martina Kinzig, Michael Rodamer, Ulrike Holzgrabe, and Fritz Sörgel. 2011. An LC-MS/MS procedure for the quantification of naproxen in human plasma: Development, validation, comparison with other methods, and application to a pharmacokinetic study. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life
Sciences 879. Elsevier B.V.: 1686–1696. doi:10.1016/j.jchromb.2011.04.012.
16. Beetge, Estelle, Jeanetta Du Plessis, Douw Gerbrandt Müller, Colleen Goosen, and Francois Janse Van Rensburg. 2000. The influence of the physicochemical characteristics and pharmacokinetic properties of selected NSAID’s on their transdermal absorption. International
Journal of Pharmaceutics 193: 261–264. doi:10.1016/S0378-5173(99)00340-3.
17. Patel, Daxesh P., Primal Sharma, Mallika Sanyal, Puran Singhal, and Pranav S. Shrivastav. 2012. Challenges in the simultaneous quantitation of sumatriptan and naproxen in human plasma: Application to a bioequivalence study. Journal of Chromatography B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences 902. Elsevier B.V.: 122–131.
doi:10.1016/j.jchromb.2012.06.041.
18. Angiolillo, Dominick J, and Steven M Weisman. 2017. Clinical Pharmacology and Cardiovascular Safety of Naproxen. American Journal of Cardiovascular Drugs 17. Springer International Publishing: 97–107. doi:10.1007/s40256-016-0200-5.
19. Jaskovikienė V. Neleiskime skausmui mūsų valdyti. Farmacija ir laikas; 2006. Nr 1: 59–60. 20. Micromedex solutions duomenų bazė; [žiūrėta 2017-01-16]. Prieiga per internetą:
http://www.micromedexsolutions.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/micromedex2/librarian/C S/BC5E0C/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/8B7E 79/ND_PG/evid.
21. David Kaye, Alan, Burton D Beakley, Adam M Kaye, and Alan D Kaye. 2015. Tramadol, Pharmacology, Side Effects, and Serotonin Syndrome: A Review. Pain Physician 18: 395–400.
22. Michaud, K., M. Augsburger, N. Romain, C. Giroud, and P. Mangin. 1999. Fatal overdose of tramadol and alprazolam. Forensic Science International 105: 185–189. doi:10.1016/S0379-0738(99)00118-8.
24. Micromedex solutions duomenų bazė; [žiūrėta 2017-01-16]. Prieiga per internetą: http://www.micromedexsolutions.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/micromedex2/librarian/P FDefaultActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch#.
25. Micromedex solutions duomenų bazė; [žiūrėta 2017-01-14]. Prieiga per internetą: http://www.micromedexsolutions.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/micromedex2/librarian/P FDefaultActionId/evidencexpert.ShowDrugInteractionsResults.
26. Nagai J, Uesawa Y, Shimamura R, Kagaya H. 2016. Characterization of the Adverse Effects Induced by Acetaminophen and Non-steroidal Anti-Inflammatory Drugs based on the Analysis of the Japanese Adverse Drug Event Report Database. Clinical Journal of Pain 0: 24. doi:10.1097/AJP.0000000000000457.
27. Klinikinių tyrimų duomenų bazė Clinical trials.gov; [žiūrėta 2017-01-23]. Prieiga per internetą: https://clinicaltrials.gov/show/NCT00893412.
28. Ansari, Saeedeh, and Majid Karimi. 2017. Novel developments and trends of analytical methods for drug analysis in biological and environmental samples by molecularly imprinted polymers.
TrAC Trends in Analytical Chemistry 89. Elsevier Ltd: 146–162. doi:10.1016/j.trac.2017.02.002.
29. WINEFORDNER, J.D. 2011. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. John
Wiley & Sons, Inc. Vol. 162. doi:10.1016/j.epsl.2011.09.024.
30. Sherma J, Fried B. Handbook of Thin Layer Chromatography. 3rd edition. Easton, Pennsylvania, U.S.A: Marcel Dekker; 2005 [Prieiga per internetą]
https://www.scribd.com/doc/53038655/Sherma-2003-Handbook-of-Thin-Layer-Chromatography.
31. Guideline IHT, Others. 2005. Validation of analytical procedures: text and methodology 1994.
32. Shabir, G a. 2003. Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis. Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conf. J Chromatogr A 987: 57–66. doi:10.1016/S0021-9673(02)01536-4.
33. Valintėlis, L. Vaistų nuo hipertenzijos mišinio analizė kraujo plazmoje chromatografiniais metodais. Magistro baigiamasis darbas. 2016.
34. Dulius, A. Mėginio ruošimo toksikologinėje analizėje metodikų lyginimas: Magistro baigiamasis darbas. 2014; Interneto prieiga: http://vddb.laba.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2014~D_20140618_233528-57573
35. European Pharmacopoeia Vol 2, 7 ed. 2011. p. 2827-2831, 2963-2964, 3450-3452.
36. Rosing, H, V Lustig, F P Koopman, W W ten Bokkel Huinink, and J H Beijnen. 1997. Bio-analysis of docetaxel and hydroxylated metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography and automated solid-phase extraction. Journal of chromatography. B,
37. Khan, Abad, Muhammad I. Khan, Zafar Iqbal, Lateef Ahmad, Yasar Shah, and David G. Watson. 2010. Determination of lipoic acid in human plasma by HPLC-ECD using liquid-liquid and solid-phase extraction: Method development, validation and optimization of experimental parameters. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life
Sciences 878. Elsevier B.V.: 2782–2788. doi:10.1016/j.jchromb.2010.08.022.
38. Meucci, Valentina, Michele Vanni, Micaela Sgorbini, and Luigi Intorre. 2014. Selective and simultaneous determination of NSAIDs in equine plasma by HPLC with molecularly imprinted solid-phase extraction 6: 2147–2158.
39. R. K. Waters, R. D. Jee, D. Marley, R. A. Watt, A. C. Moffat. 1997. The Robustness and Comparability of a Novel Rapid Reversed-phase HPLC Drug-screening Method Compared with Existing Systems. Pharmaceutical Sciences 3: 419–423.
