Kanabinoidų įvertinimas dujų chromatografijos metodu Lietuvoje auginamų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolėje

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

LINAS LUKOŠIUS

Kanabinoidų įvertinimas dujų chromatografijos metodu

Lietuvoje auginamų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolėje

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Kanabinoidų įvertinimas dujų chromatografijos metodu

Lietuvoje auginamų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolėje

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Darbo vadovas:

Prof. Liudas Ivanauskas

Darbą atliko: Magistrantas Linas Lukošius

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Cannabis sativa L. botaninė charakteristika ... 12

1.2. Cannabis sativa L. cheminė charakteristika ... 13

1.2.1. Kanabinoidų cheminė klasifikacija ... 14

1.3. Kanapių skirstymas pagal chemotipą ... 14

1.4. Kanabinoidų klasifikacija ... 15

1.5. Kanabinoidų nustatymo metodai ... 17

1.6. Kanabinoidų receptoriai ... 17

1.6.1. CB1 receptoriai ... 17

1.6.2. CB2 receptoriai ... 18

1.7. Kanabinoidų farmakologinės savybės ... 18

2. TYRIMO METODIKA ... 21 2.1. Tyrimo objektas ... 21 2.2. Reagentai ... 21 2.3. Aparatūra ... 22 2.4. Tyrimų eiga ... 22 2.5. Tyrimų metodika ... 23

2.5.1. Tiriamojo mėginio ruošimas ... 23

2.5.1.1. Nuodžiūvis ... 23

2.5.1.2. Ekstraktų ruošimas ... 23

2.5.2. Kanabinoidų kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos metodu ... 23

2.6. Statistinė duomenų analizė ... 26

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Skirtinguose Lietuvos regionuose surinkti sėjamųjų kanapių žolės mėginiai ... 27

3.3. Kanabidiolio, kanabigerolio bei tetrahidrokanabinolio idenifikavimas sėjamųjų kanapių

ekstraktuose ... 28

3.4. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekybinis įvertinimas sėjamųjų kanapių „Finola“ veislės, vyriškos ir moteriškos giminės ... 29

3.4.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 29

3.4.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 30

3.4.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 31

3.4.4. Suminis kanabinoidų kiekis ... 32

3.5. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekio įvertinimas sėjamųjų kanapių veislėse, rinktose Panevėžio rajone, Upytės kaime ... 33

3.5.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 33

3.5.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 34

3.5.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo nustatymas ... 35

3.5.4. Suminis kanabinoidų kiekis ... 36

3.6. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekio įvertinimas sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislėje ... 37

3.6.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo įvertinimas ... 37

3.6.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo įvertinimas ... 38

3.6.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo įvertinimas ... 39

3.6.4. Suminis kanabinoidų kiekis Cannabis sativa L. “Futura 75” veislėje skirtinguose rajonuose ... 40

3.7. Bendras visų Cannabis sativa L. veislių iš skirtingų regionų kanabinoidų kiekis ... 41

4. IŠVADOS ... 43

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45

7. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 48

SANTRAUKA

Lino Lukošiaus magistro baigiamasis darbas, darbo vadovas: prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tyrimo objektas: Sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.) priklausanti kanapinių (Cannabaceae) šeimai. Kanapių sudėtyje yra molekulinių komponentų, vadinamų, kanabinoidais. Du iš jų yra ypatingi. Tai tetrahidrokanabinolis (THC), veikiantis žmogaus psichiką, ir kanabidiolis (CBD) - šį poveikį mažinantis. Sėjamoji kanapė pasižymi mažu THC, bet dideliu CBD kiekiu. Europos Sąjungoje leidžiama auginti sėjamųjų kanapių veisles su žemu (ne daugiau kaip 0,2 %) kanabinoido tetrahidrokanabinolio (THC) kiekiu. Šiame darbe buvo tirtos 7 sėjamųjų kanapių veislės, surinktos iš skirtingų Lietuvos regionų.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje kultivuojamų skirtingų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) veislių antžeminėje dalyje esančių kanabinoidų kiekybinę sudėtį.

Darbo uždaviniai: surinkti sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminę dalį, ją išdžiovinti ir paruošti mėginius eksperimentiniams tyrimams; dujų chromatografijos analizės metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti kanabinoidų kiekio įvairavimą sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose, rinktuose įvairiuose Lietuvos regionuose; nustatyti šių junginių kiekio pasiskirstymą skirtingose sėjamųjų kanapių veislių mėginiuose.

Tyrimų rezultatai: dujų chromatografijos metodu pagal sulaikymo laiką buvo identifikuoti pagrindiniai kanabinoidai - kanabidiolis, tetrahidrokanabinolis, kanabigerolis. Suminis šių pagrindinių kanabinoidų kiekis, skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose, įvairavo nuo 51,81 µg/ml iki 734,45 µg/ml. Didžiausi kanabidiolio ir kanabigerolio kiekiai nustatyti “Futura 75” veislės žolės mėginiuose, rinktuose Anykščių rajone, Viešintų kaime, atitinkamai 678,31 ± 46,83µg/ml ir 36,87 ± 8,04 µg/ml. Mažiausias kanabidiolio kiekis nustatytas „Felina 32“ veislės žolės mėginyje, rinktame Panevėžio rajono, Upytės kaime –46,21 ± 4,78 µg/ml. Mažiausias kanabigerolio kiekis nustatytas „Virtus Rugo“ veislės žolės mėginyje (4,58 ± 2,37 µg/ml). Didžiausias tetrahidrokanabinolio kiekis nustatytas Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime rinktos moteriškos giminės sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose – 24,76 ± 4,47 µg/ml, mažiausias šio junginio kiekis nustatytas “Felina 32” veislės mėginyje (0,43 ± 0,12 µg/ml).

SUMMARY

The object of the research is industrial hemp (Cannabis sativa L.), which belongs to the Cannabaceae family. Hemp contains molecular components named cannabinoids, two of which have special qualities. Tetrahydrocannabinol (THC), which affects the human psyche, and Cannabidiol (CBD), which works to reduce its effects. Industrial hemp is characterized by its low amount of THC and high amount of CBD. The European Union allows for the cultivation of varieties of industrial hemp with a low (no more than 0,2 %) content of tetrahydrocannabinol. Seven hemp varieties collected from different regions of Lithuania were studied in this research.

The aim of this research is to analyze the quantitative composition of cannabinoids found in the aerial parts of varieties of industrial hemp (Cannabis sativa L.) grown in Lithuania.

To reach the aim, the following objectives were formulated: to collect the aerial parts of the industrial hemp (Cannabis sativa L.), to dry them, and to prepare samples for experimental analysis; using the gas chromatography method, to identify and qualitatively evaluate the variations in cannabinoid content in samples of industrial hemp collected from various regions of Lithuania; to determine the distribution of the quantity of these compounds in industrial hemp samples of different variety.

The results of the research: using the gas chromatography method, based on retention time, three main cannabinoids were identified: cannabidiol, tetrahydrocannabinol, cannabigerol (CBD – 10.97 min., THC – 20.46 min., CBG – 20.70 min.). The overall distribution of these main cannabinoids, which were collected from samples of industrial hemp grass from different regions of Lithuania, varied from 51.81µg/ml to 734.45 µg/ml. The highest quantities of cannabidiol and cannabigerol were found in samples of the “Futura 75“ variety of grass, which were collected from the village of Viešintai, district of Anykščiai, 678.31 ± 46.83µg/mland 36.87 ± 8.04 µg/mlrespectively. The lowest amount of cannabidiol was found in a sample of the “Felina 32“ variety of grass (4.21 ± 4.78 µg/ml), which was harvested from the village of Upytė, district of Panevėžys. The lowest amount of cannabigerol was found to be in samples of the “Virtus Rugo“ variety of grass (4.58 ± 2.37 µg/ml). The highest amount of tetrahydrocannabinol was found in female samples of industrial hemp collected from the village of Kadrėnai, district of Kupiškis, - 24.76 ± 4.47µg/ml, while the lowest quantity of this compound was found in a sample of the “Felina 32“ – 0.43± 0.12 µg/ml.

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovui prof. Liudui Ivanauskui už vertingus patarimus ir konsultacijas. Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros doktorantui Mindaugui Marksai už nuoširdžią pagalbą, patarimus, atliekant tyrimus ir analizuojant turimus duomenis. UAB „Agropro“, UAB „Inovatyvūs sprendimai”, “Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centrui”, taip pat dr. Elvyrai Gruzdevienei, LAMMC Upytės bandymų stoties mokslo darbuotojai už pagalbą renkant sėjamųjų kanapių žaliavas.

SANTRUMPOS

CBD – kanabidiolis (angl. cannabidiol) CBDA - kanabinolinė rūgštis

CBG – kanabigerolis (angl. cannabigerol) CBGA - kanabigerolinė rūgštis

DC – dujų chromatografija

THC – tetrahidrokanabinolis (angl. tetrahydrocannabinol) THCA - Δ9-tetrahidrokanabinolinė rūgštis

R 2 – regresijos koeficientas

ĮVADAS

Sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.) yra vienmetis žolinis augalas, kilęs iš Centrinės Azijos, priklausantis magnolijūnų (Magnoliophyta) genčiai bei kanapinių (Cannabaceae) šeimai ir yra laikoma viena seniausių augintų žinomų žmonijai sukultūrintų augalų. Kanapės buvo naudojamos įvairiais tikslais, kaip tekstilės pluošto, kuro šaltinis, audinių, virvių ar drobės gamyboje bei liaudies medicinoje. Iš sėklų gaminamas aliejus buvo naudojamas kosmetikos pramonėje [1].

Manoma, kad vieni pirmųjų kultūrinių augalų dabartinėje Lietuvos teritorijoje buvo kanapės ir soros. Kanapė nuo senų laikų buvo naudota Lietuvoje pluoštui gaminti, vaistams ir maistui, todėl nenuostabu kad ji minima ir tautosakoje.

Kanapių gydomųjų savybių panaudojimas pirmą kartą paminėtas 2700 metų prieš Kristaus gimimą, kai Kinijos gydytojai ją naudojo maliarijai, reumatiniams skausmams, kai kurioms infekcinėms ligoms gydyti, taip pat kaip anestetiką. Europoje kanapės medicininiais tikslais pradėtos vartoti XIX amžiaus viduryje. Įvertinę Indijos gydytojų sukauptas žinias, britų gydytojai pradėjo aktyviai kanapes naudoti kaip analgetiką, apetitą skatinančią, vėmimą sukeliančią priemonę bei kaip antispazminį ir priešuždegiminį poveikį turinčią medžiagą [2][3].Tuo metu, kelios farmacijos įmonės pardavinėdavo kanapių ekstraktus ir tinktūras, kurias gydytojai išrašydavo esant skausmui, astmai, taip pat kaip nervus raminančius vaistus. Vis dėlto, kanapių vartojimas gydymo tikslais visiškai išnyko XX amžiaus viduryje. Pagrindinė to priežastis buvo kintamas kanapių ekstraktų stiprumas, nenuspėjamas atsakas bei nepageidaujamų poveikių, tokių kaip nerimas, atsiradimas [4]. Tam įtakos turėjo psichiką veikiančios kanapių sudedamosios medžiagos, kurių pagrindinė buvo – tetrahidrokanabinolis (THC) [5].

Be tetrahidrokanabinolio (THC) kanapių sudėtyje yra daugiau kaip 400 junginių, tarp jų bent 70 kanabinoidų, kurie padeda gydyti tam tikras ligas arba lengvina jų simptomus [6],[7]. Kanabinoidai gali slopinti vėmimą, veikti kaip apetito stimuliatorius sekinančioms ligoms gydyti (vėžys, AIDS), kaip analgetikai ar išsėtinei sklerozei, nugaros smegenų traumoms, Tourett’o sindromui, epilepsijai ir glaukomai gydyti [8].

Tetrahidrokanabinolis, tiksliau delta-9-tetrahidrokanabinolis (Δ9_{-THC) yra svarbiausia} kanapės augalo Cannabis sativa L. sudedamoji dalis. Šis junginys yra vienintelis psichoaktyvus kanapių junginys, naudojamas farmacijos kompanijų gaminant vaistus, kaip „Marinol“– receptinį vaistą, kuris didina apetitą ir mažina skausmą, pykinimą ir vėmimą pacientams sergantiems vėžiu.

Didžiosios Britanijos kompanijos „GW Pharmaceuticals“ gaminamas vaistas „Sativex“ burnos gleivinės purškalas, kurio pagrindiniai iš kanapių išskirti THC ir CBD kanabinoidai, vartojamas išsėtinės sklerozės sukeliamiems spazmams ir raumenims atpalaiduoti. Šis vaistas

registruotas daugelyje pasaulio šalių, tame tarpe ir Europoje[9],[10].

Šio tyrimo objektas yra Lietuvoje UAB „Agropro“, “Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro” ir UAB “Inovatyvūs sprendimai” kultivuojamos Cannabis sativa L. antžeminės dalies tyrimas. Sėjamųjų kanapių augalinė žaliava buvo surinkta skirtingų veislių iš įvairių Lietuvos regionų.

Darbo tikslas: Nustatyti kanabinoidų kiekio įvairavimą Lietuvoje kultivuojamų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativaL.) žolėje.

Darbo rezultatai buvo pristatyti 7-ojetarptautinėje konferencijoje - “Science and practice 2016”, kuri vyko 2016 m. spalio 20-21 dienomis Kaune (1 priedas).

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje kultivuojamų sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies kanabinoidų kiekybinę sudėtį.

Darbo uždaviniai:

1. Dujų chromatografijos metodu identifikuoti pagrindinius kanabinoidus – kanabidiolį, tetrahidrokanabinolį ir kanabigerolį sėjamųjų kanapių (Canabis sativa L.) žolės mėginiuose. 2. Nustatyti kanabinoidų kiekio įvairavimą sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose, surinktuose

skirtingose Lietuvos regionuose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Cannabis sativa L. botaninė charakteristika

1pav. Sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.)

Sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.)yra vienmetis žolinis augalas, kilęs iš Centrinės Azijos, priklausantis magnolijūnų (Magnoliophyta) genčiai bei kanapinių (Cannabaceae) šeimai.

Tai vienmetis, paprastai dvinamis, vėjo apdulkinamas augalas, kurio vyriški ir moteriški žiedai auga ant skirtingų augalų viršūnių, tačiau selekcijos būdu išvestos veislės su abiejų lyčių žiedais ant vieno augalo. Dvinamių kanapių pasėliuose kartais pasitaiko ir tokių augalų, ant kurių yra abiejų lyčių žiedai. Auga atvirose, saulėtose vietose bei reikalauja daug maistinių medžiagų ir vandens.

Augalas gali užaugti iki 5 metrų aukščio per 4-6 mėnesių laikotarpį. Vegetacijos metu, vyriškus ir moteriškus augalus atkirti yra sunku, nes lytis anatomiškai nesiskiria, kol jie nepradeda žydėti, tačiau po sužydėjimo vyriški ir moteriški augalai skiriasi [11].

Stiebas status, tiesus, plaukuotas, gali užaugti iki 5 metrų. Lapai sudėtiniai, pirštuoti, lapeliai siauri.

Vyriški augalai turi mažai lapų yra gana aukšti ir liekni, o moteriški turi daugiau lapų, o jų stiebai yra trumpesni ir storesni [12]. Kanapių lapija yra gana gausi, sudaro apie 24-25 % viso augalo masės. Vaisiai šviesiai pilkos-rusvos spalvos, dažniausiai margas mažas riešutas, kuriame yra 2 sėklaskiltės, turinčios maždaug 30-35 % riebalų ir apie 20 % baltymų. Kanapių sėklų dydis labai įvairus. Riešutėlis gali būti 2,5-3 mm ilgio, 2-4 mm pločio. Sėklose yra 30-35 % aliejaus.[13]

Dvinamių kanapių skirtingų lyčių augalų žydėjimo laikas skiriasi – pirmi pražysta moteriški žiedai, o vėliau – priklausomai nuo tipo – po 2-10 dienų pražysta vyriški[14].

Kanapės žiedai sutelkti į žiedynus – šluoteles. Vyriški žiedai turi 5 gelsvai-žalsvus 5 mm ilgio žiedlapius, kurie išsidėstę aplink 5 kuokelius su dulkinėmis. Vienas vyriškas augalas gali išauginti iki 30-40 gramų žiedadulkių. Moteriški žiedai - gana smulkus, sutelkti kompaktiškuose žiedynuose. Moterišką žiedą sudaro žaliu apvalkalėliu (iš 5 suaugusių lapelių) apgaubta mezginė, turinti piestelę, kurios purka padengta smulkiais žiedadulkių gaudikliais.

Vyriški augalai po žydėjimo nustoja augti, pageltonuoja ir gana greit mirštą. Moteriški augalai toliau tęsia augimą ir tampa didesni bei stipresni, kol jų nenužudo šaltis [15].

2 pav. Vyriški (kairėje) ir moteriški (dešinėje) sėjamųjų kanapių žiedynai Nuotrauka: Z. Jankauskienės

1.2.Cannabis sativa L. cheminė charakteristika

Cannabis sativa L. žolėje nustatyta maždaug 489 žinomų junginių, iš kurių 70 yra kanabinoidai. Kanabinoidai yra pagrindinės biologiškai aktyvios kanapių medžiagos, savo sudėtyje turinčios 21 anglies atomą[16], [17].

Cannabis sativa L. taip pat yra randama 120 terpenų, 50 angliavandenilių, 34 cukrų ir giminingų junginių, 27 azoto junginių, 25 ne kanabinoidiniai fenoliai, 23 riebalų rūgštys, 23 flavonoidai, 20 rūgščių, 18 aminorūgščių, 13 ketonų, 13 esterių ir laktonų, 12 aldehidų, 11 baltymų, fermentų ir glikoproteinų, 11 steroidų, 7alkoholiai, 1 vitaminas ir 2 pigmentai[16].

1.2.1.Kanabinoidų cheminė klasifikacija

Kanabinoidai – kanapių augale randamos cheminės medžiagos. Plačiausiai žinomi 4 kanabinodai:

1. THC - Δ9_{-tetrahidrokanabinolis (veikiantis psichiką; 9 tipai)} 2. CBG – kanabigerolis (pirmasis atrastas kanabinoidas; 6 tipai); 3. CBD – kanabidiolis (7 tipai)

4. CBC – kanabichrominas (5 tipai)

Be šių keturių kanabinoidų, dar yra randama per 70 kanabinoidų tipų. Kanabinoidai gali būti suskirstyti į 10 pagrindinių struktūrinių tipų. Visi kiti junginiai, kurie netelpa į pagrindinį tipą yra sugrupuoti kaip įvairūs (11 grupė). Kanabigerolio grupė (7 žinomi junginiai), kanabichromeno grupė (5 žinomi junginiai), kanabidiolio grupė (7 žinomi junginiai), Δ9 -tetrahidrokanabinolio grupė (9 žinomi junginiai), Δ8_{-tetrahidrokanabinolio grupė (2 žinomi} junginiai), kanabiciklolio grupė (3 žinomi junginiai), kanabinolio (7 žinomi junginiai), kanabinodiolio grupė (2 žinomi junginiai), kanabitriolio grupė (9 žinomi junginiai), įvairus (14 žinomų junginių)[18],[19],[16].

Mokslininkai E. Small ir H.D. Beckstead pirmieji sistemingai tyrė kanapes ir bandė jas sugrupuoti pagal randamą kanabinoidų sudėtį. Apibendrinant daugelio autorių tyrimus, didžiausias dėmesys buvo skirtas dviem kanabinoidams – tai neigiamai veikiančiam žmogaus psichiką Δ9-tetrahidrokanabinoliui (THC) bei šį poveikį mažinančiam kanabidioliui (CBD). Pagrindinių kanabinoidų struktūrinės formulės nurodytos 3 paveikslėlyje.

THC CBD CBG

3 pav. Pagrindinių kanabinoidų formulės (pagal E. Russo, G.W. Guy, 2006)

1.3.Kanapių skirstymas pagal chemotipą

Pagal Δ9-tetrahidrokanabinolio (THC) ir kanabidiolio (CBD) kiekį kanapės skirstomos į tris chemotipus. Kanabinoidų koncentracijos kanapių chemotipuose pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Kanabinoidų koncentracijos skirtinguose kanapių chemotipuose

Tipas THC kiekis CBD kiekis Poveikis

Narkotinio tipo 1-20 % 0,01-0,16 % Veikia psichiką, iš jų gaminami narkotikai –

marihuana ir hašišas. Vidutinio tipo 0,3-1,0 % 0,9-7,3 % Neveikia arba šiek tiek

gali veikti psichiką. Pluoštinio tipo <0,3 % 1,0-13,6 % Psichikos neveikia, iš

tokių kanapių gaminamas pluoštas,

maistinis aliejus.

Pluoštinio tipo kanapėse psichiką veikiančio THC yra labai mažai, o psichikos neveikiančio CBD būna beveik dvigubai daugiau (THC ir CBD santykis būna mažesnis nei 1,0 (0,11-0,66). Narkotinio tipo kanapėse dažnai būna 5-20% THC, o CBD kiekis labiau kinta - nuo nulio iki dažniausiai 5 %.

Kanabidiolis (CBD) paprastai yra pirminis sėjamosios kanapės kanabinoidas ir antrinis dažniausiai paplitęs kanabinoidas narkotinio tipo kanapių augaluose. Sėjamojoje kanapėje CBD koncentracija svyruoja nuo 0,5 iki 2 %. Daugumoje šalių ūkininkams leidžiama auginti kanapes su dideliu CBD ir žemu THC koncentracijos kiekiu. Europos Sąjungoje, pluoštinio tipo kanapėse auginamose pramoniniais tikslais, THC kiekis negali viršyti 0,2 %. Be to, šių kanapių auginimas privalo būti kontroliuojamas[14].

1.4.Kanabinoidų klasifikacija

Cannabis sativa L. nustatoma daugiau kaip 70 junginių vadinamų kanabinoidais. Pagrindinė kanabinoidų struktūros savybė yra karboksilo grupė; ši grupė yra lengvai prarandama dėl kanabinoidų sudėtyje esančio fenolinio žiedo, kanabinoidų džiovinimo ar šildymo metu, paliekant dekarboksilinta formą iš skirtingų kanabinoidų. Būtent dėl šio dekarboksilinimo, kuris konvertuoja Δ9-tetrahidrokanabinolinę rūgštį į Δ9 tetrahidrokanabinolį (THC), kanabinoidai gerai žinomi dėl savo svaiginančių ir psichotropinių poveikių. Visi kanabinoidai esantys kanapėje yra susintetinti ir randami rūgščioje formoje [20].

Kanabinoidai yra gaunami iš augalo metabolizmo būdu karboksirūgščių forma. Pagal fitochemines savybes kanabinoidai gali būti skirstomi į tris grupes: rūgštiniai kanabinoidai, neutralūs kanabinoidai ir dirbtiniai (angl.artifacts) kanabinoidai. Didžiausią kanabinoidų dalį sudaro žaliavoje esantys rūgštiniai kanabinoidai. Ryšys tarp pagrindinių kanabinoidų rastų kanapėje nurodytas 4 paveikslėlyje. Rodyklės nurodo kanabinoidų perėjimą iš vienos fitocheminės grupės į kitą.

4 pav. I - kanabinoidai gaunami iš augalo biosintezės metu; II- kanabinoidai gaunami dekarboksilinimo būdu iš rūgštinių kanabinoidų; III- skilimo produktai, veikiant kanabinoidus

UV, oksiduojant ar izomerizuojant

Rūgštinę kanabinoidų grupę apima daug struktūrų. Dideliais kiekiais rūgštinės struktūros kanabinoidų randama narkotinio tipo kanapėje, daug mažiau jų aptinkama sėjamojoje kanapėje. Rūgštiniams kanabinoidams priskiriami tetrahidrokanabinolinė rūgštis (THCA), kanabinolinėrūgštis (CBDA), kanabigerolinė rūgštis (CBGA) ir kanabichromeninė rūgštis. Šios rūgštys dekarboksilinimo būdu gali būti paverčiamos į neutralius junginius: delta-9-tetrahidrokanabinolį (THC), kanabidiolį (CBD), kanabigerolį (CBG) ir kanabichromeną (CBC)[20],[21]. Kanabinoidų dekarboksilinimo metu rūgštiniai kanabinoidai paverčiami į jų neutralias formas. THCA pavertimas į THC nurodytas kaip pavyzdys. Šis dekarboksilinimas pavaizduotas 5 paveikslėlyje [9].

5 pav. THCA dekarboksilinimas į THC

Skilimo produktų kiekis daugiausia priklauso nuo įvairių sąlygų visais galimo žaliavos tyrimo ar naudojimo etapais: augalo auginimo, derliaus nuėmimo, apdorojimo, džiovinimo ir laikymo[22]. THC gali skilti į CBN ir delta-8-THC, o THCA gali skilti iki CBNA. Ilgai laikomoje žaliavoje CBN galima rasti itin dideliais kiekiais. Iš delta-9-THC vyksta izomerizacija į delta-8-THC. Kanabinoidų CBL ir CBLA atsiradimą iš CBC ir CBCA įtakoja UV spindulių poveikis, kuris daro įtaka dvigubų jungčių susijungimui molekulėje (4 pav.) [9].

1.5.Kanabinoidų nustatymo metodai

Maksimaliam jautrumui, atrankumui ir efektyvumui pasiekti yra parenkami skirtingi analizės metodai. Kanabinoidų kokybinei ir kiekybinei analizei naudojami įvairūs analizės metodai, tačiau dažniausiai ir plačiausiai taikoma dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija ir plonasluoksnė chromatografija. Dėl kanapių sudėtingos cheminės sudėties, kanabinoidų analizei dažniausiai taikomi dujų chromatografijos ar efektyviosios skysčių chromatografijos metodai kartu su masių spektrometrija, dėl to padidėja metodo jautrumas, selektyvumas, galima identifikuoti labai mažus junginių kiekius.

Dujų chromatografija dažniausiai būna sujungta su liepsnos jonizacijos arba masių spektrometrijos detektoriais, todėl galima atlikti kanabinoidų kokybinį ir kiekybinį nustatymą su labai aukšta rezoliucija. Rūgštinių kanabinoidų nustatymui būtina atlikti derivatizaciją (pvz., sililinimą arba metilinimą) [23].

Plonasluoksnės chromatografijos metodu galima atskirti mišinyje esančius junginius, nustatyti jų kiekį bei tapatybę. Metodas greitas, selektyvus ir pasižymi dideliu jautrumu[24],[25].

1.6.Kanabinoidų receptoriai

Kanabinoidų farmakologinis poveikis priklauso nuo jų sąveikos su kanabinoidų receptoriais, esančiais ant ląstelių paviršiaus skirtingose vietose centrinėje nervų sistemoje. Moksliniai tyrimai rodo, jog kanabinoidų receptorių aktyvumas slopina adenilatciklazę, kuris stabdo ATP virtimą cikliniu AMP (cAMP). Tokie patys receptoriai buvo nustatyti ir gyvūnuose (žinduoliuose, paukščiuose, žuvyse ir ropliuose). Kanabinoidai veikia daugiausiai sąveikaudami su konkrečiais receptoriais, kurie yra žmogaus smegenų ląstelėse, tai – CB1 ir CB2.

1.6.1. CB1 receptoriai

CB1 receptorių yra daugiausiai nervų ląstelių smegenyse bei stuburo smegenyse, tačiau jų galima rasti ir kai kuriuose periferiniuose organuose ir audiniuose, pavyzdžiui blužnyje, baltuosiuose kraujo kūneliuose, endokrininėse liaukose, virškinimo trakte ir šlapimo takuose[26].

Daugiausia CB1 receptorių yra smegenyse (smegenėlėse, hipokampo ir pirminio jutimo stuburo smegenų vietose), todėl kanabinoidai turi poveikį atminties procesams bei skausmo reguliavimui. Stimuliuojant CB1 receptorius sukeliamas farmakologinis poveikis panašus į marihuanos poveikį psichikai. Smegenų kamiene kanabinoidų receptorių yra mažai. Tai paaiškina, kodėl kanapių vartojimas nėra susijęs su staigia mirtimi, pavyzdžiui kvėpavimo slopinimu [27].

1.6.2. CB2 receptoriai

CB2 receptorių daugiausia yra baltosiose kraujo ląstelėse, tonzilėse, blužnyje, imuninės sistemos ląstelėse [28]. Imuninės ląstelės taip pat turi CB1 receptorių, nors jų yra mažiau nei CB2. Imuninėje sistemoje viena svarbiausių kanabinoidų receptorių funkcijų yra citokinų išskyrimo reguliavimas. Selektyvūs CB2 receptorių antagonistai tampa vis labiau populiarūs moksliniuose tyrimuose, dėl jų galimo priešuždegiminio ir priešvėžinio poveikio [29].

1.7.Kanabinoidų farmakologinės savybės

Moksliniai ir klinikiniai tyrimai pabrėžia kanabinoidų, kaip vaistinės medžiagos potencialą plataus ligų spektro gydyme. Kanabinoidai gali būti vartojami gydant artritą, diabetą, alkoholizmą, ūminį skausmą, šizofreniją, depresiją, išsėtinę sklerozę, esant potrauminio streso sindromui, kai kurias antibiotikams atsparias infekcijas, epilepsiją ir kitus neurologinius sutrikimus [30].

Kanapės, kaip skausmą malšinančios medžiagos, naudojamos tūkstančius metų. Mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad kanabinoidai gali būti vartojami skausmui malšinti. Nustatyta, kad THC, CBD bei CBG blokuoja serotonino išskyrimą[31]. Tyrimai rodo, jog tetrahidrokanabidiolis buvo skiriamas pacientams sergantiems Viduržemio jūros karštine su ūmiais pasikartojančiais skausmais. THC šiems ligoniams padėjo sumažinti skausmą [32]. Tačiau tik THC, bet ir kiti kanabinoidai potencialiai gali turėti įtakos gydant įvairių rūšių skausmą. Atliktais tyrimais nustatyta, jog THC derinys su ne psichiką veikiančiu kanabinoidu CBD turi didesni aktyvumą nei skiriamas vienas THC [33]. Vaistas „Sativex“ burnos ir gerklės purškalas, kurio veikliosios medžiagos yra CBD ir THC, yra veiksmingas gydant išsėtinės sklerozės neuropatinį skausmą. „Sativex“ yra pirmasis kanapių pagrindu pagamintas bei registruotas receptinis vaistas[34].

Kanabinoidai taip pat gali didinti apetitą. Atlikti du dvigubai akli placebo kontroliuojami klinikiniai tyrimai parodė, jog per burną vartojamas THC stimuliuoja apetitą ir padeda gydyti lėtinį svorio praradimą, kuris atsiranda, sergant įvairioms vėžio stadijoms. Klinikiniame tyrime dalyvavo 139 svorio netekę pacientai, sergantys AIDS. Tyrimo metu šiems pacientams buvo skirtas geriamas THC. Lyginant su placebu, THC padidino ligonių apetitą po 4-6 savaičių gydymo. Pacientams, kurie vartojo THC, svoris stabilizavosi, o placebą vartojusių žmonių svoris ir toliau krito [35].

Kanabinoidai pasireiškia antiemetiniu poveikiu. Chemoterapija vėžiu segantiems ligoniams dažnai sukelia pykinimą, vėmimą, kurie gali būti ilgi bei sunkūs. Daug kontroliuojamų klinikinių tyrimų buvo atliktaslopinant pykinimą ir vėmimą, ir siekiant nustatyti, kokios medžiagos geriausiai slopina šiuos simptomus. Vienas tokių – nabilonas. Tai sintetinis THC analogas. Ši veiklioji medžiaga geriamos farmacinės formos buvo skirta klinikinių tyrimų metu. 15 kontroliuojamų klinikinių tyrimų

metu 600 pacientams buvo skirtas šis kanabinoidas. Tyrimo metu nabilono poveikis buvo lygintas su placebu arba vėmimą mažinančiu vaistu. Rezultatai parodė, kad nabilono poveikis buvo daug geresnis, gydant pykinimą bei vėmimą, atsiradusį chemoterapijos metu gydant vėžį. Gauti geri rezultatai paskatino Kanados vaistų agentūrą “HealthCanada” registruoti nabiloną kaip vaistą “Cesamet” pavadinimu[36].

Kanabinoidų, kaip priešvėžinės medžiagų savybės šiuo metu yra tiriamos įvairiuose akademinių tyrimų centruose JAV bei kitose šalyse. CBD poveikis buvo pastebėtas, gydant Alzhaimerio ligą. Tam, kad ištirti CBD neuroprotekcines savybes, buvo atliktas iki klinikinis tyrimas, kurio metu kiaulių jaunikliai, kuriems buvo taikytas hipoksinis-išeminis smegenų traumos modelis. Po 30min. dalis tiriamųjų jauniklių buvo gydoma 1 mg/kg kūno masės CBD, dalis CBD ir 1 mg/kg kūno masės CB2 receptorių antagonistu. CBD skyrimas apsaugojo smegenis nuo oksidacinio streso, uždegimo ir kitų kenksmingų pokyčių[37].

Epilepsija pasireiškia apie 1 % pasaulio gyventojų. Manoma, kad 20-30 % epilepsija segančių žmonių traukuliai nėra tinkamai kontroliuojami, vartojant įprastinius vaistus[38]. Kanabidiolis pasirodė perspektyviausias tyrimuose su gyvūnais. Jis pasižymėjo stipriu traukulius slopinančiu ir minimaliu

neurotoksiniu poveikiu. CBD antiepilepsinis veikimas buvo tirtas, naudojant in vitro elektrofiziologinį ir in vivo (100 mg/kg kūno masės) gyvūnų traukulių modelį. CBD pašalino epilepsijos poveikį in vitro ir sumažino traukulių sunkumą in vivo[39].

Mokslininkai nustatė, kad kanabidiolis taip pat yra veiksmingas, gydant išsėtinę sklerozę. Atliktas viengubai aklas placebo kontroliuojamas tyrimas, kurio metu vaistas „Sativex“ burnos ir gleivinės purškalas (veiklioji medžiaga nabiksimolis, kuriame THC ir CBD santykis 1:1) 12 savaičių buvo vartojamas po 48 papurškimus per dieną (vienoje dozėje yra 4,7mg THC, 4,5mg CBD ir 0,04g etanolio). Iš 572 pacientų dalyvavusių šiame tyrime, 271 pagerėjo savijauta. Pacientams smarkiai sumažėjo spazmai, o skausmo skalės vidurkis krito per 3,01 – nuo 6,91 iki 3,9. Taip pat buvo įrodytas vaisto pranašumas prieš placebą[40].

Nustatyta, kad CBD taip pat pasižymi antipsichozinėmis savybėmis bei žymus CBD poveikis buvo rastas vėžio gydymo studijose. Naudojant metastazavusių krūties vėžio ląstelių pelių modelį, CBD sumažino krūties vežio ląstelių agresyvumą, slopindamas atsakingo baltymo už vėžį išsivystymą. Tai leidžia manyti, kad CBD yra pirmasis netoksiškas egzogeninis faktorius, kuris gali žymiai slopinti metastazavusias krūties vėžio ląsteles, padedantis sumažinti naviko agresyvumą. Naudojant CBD netolimoje ateityje gali būti pasiekta reikšmingų rezultatų, išvengiant nepageidaujamų šalutinių poveikių, susijusių su standartiniu gydymu [41],[42].

Per pastaruosius 15 metų pasiektas progresas, padedantis suprasti kanabinoidų pažangą gydant įvairias ligas. Klinikinių tyrimų metu buvo išsiaiškinta, kad kanabinoidai pasižymi plačiu

gydomuoju poveikiu, slopinant vėmimą ir pykinimą, kaip apetito stimuliatoriai, segant organizmą sekinančiomis ligomis (vėžiu ir AIDS), analgetikai, gydant išsėtinę sklerozę, epilepsiją. Tačiau remiantis turimais duomenimis, reikia tiksliai įvertinti, kada ir kokio tipo kanabinoidas yra tinkamiausias, siekiant padidinti kiekvieno preparato teigiamą poveikį ir sumažinti nepageidaujamų reakcijų tikimybę.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Šio tyrimo objektas yra Lietuvoje UAB „Agropro“, “Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro” ir UAB “Inovatyvūs sprendimai” kultivuojamos Cannabis sativa L. antžeminės dalies tyrimas. Sėjamosios kanapės skirtingų veislių žolės mėginiai buvo rinkti įvairiuose Lietuvos regionuose (2 lentelė).

2 lentelė. Sėjamosios kanapės žaliavos rinkimas Lietuvos regionuose

Veislė Regionas Metai

Finola Telšių raj., Kaunatavos k. 2016

Finola Anykščių raj., Viešintų k. 2016

Finola Kupiškio raj.,Kadrėnų k. 2016

Felina 32 Panevėžio raj.,Upytės k. 2016

Monoica Panevėžio raj., Upytės k. 2016

KC Dora Panevėžio raj., Upytės k. 2016

Secuieni Jubileu Panevėžio raj., Upytės k. 2016

Virtus Rugo Panevėžio raj., Upytės k. 2016

Futura 75 Šakių raj. Kriūkų k. 2016

Futura 75 Anykščių raj., Viešintų k. 2016

Futura75 Rokiškio raj., Panemunėlis 2016

2.2. Reagentai

Visiems atliktiems tyrimams buvo naudojami šie reagentai:

• Metanolis (≥99,8 % Sigma-Aldrich, Izraelis)

• Chloroformas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV)

• Tetrahidrokanabinolis ( ≥99 % Pharm, Vokietija)

• Kanabigerolis (92%Broomfield, JAV)

2.3. Aparatūra

Analizė atlikta su Shimadzu (SHIMADZU GC-2010 PLUS, Japonija) dujų chromatografu. Naudota Rxi – 5MS kolonėlė, kurios ilgis 30m, vidinis diametras 0,25mm, nejudančios fazės storis 0,25µm. Injekuojama 1µl, injektoriaus temperatūra 290 oC, liepsnos jonizacijos detektoriaus temperatūra (angl. FID) 330oC.Analizei naudotos helio dujos.

Nuodžiūviui nustatyti buvo naudojamas drėgmės analizatorius KernandSohn, DBS-60-3 (Balingen, Vokietija).

Ekstrakcijos buvo atliktos ultragarso bangų vonelėje BioSonic UC100 (Mavajai, JAV).

Vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistema.

Žaliavos smulkinimui naudotas IKA A11 Basic (Vokietija) smulkinimo aparatas.

Augalinės žaliavos svėrimui buvo naudotos Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija) svarstyklės.

Naudotos automatinės pipetės (Eppendorf Research, JAV).

2.4. Tyrimų eiga

Surinktos sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavos kokybė buvo įvertinta analizuojant žaliavos nuodžiūvį. Nustačius, kad žaliava yra kokybiška, buvo pradėti gaminti sėjamųjų kanapių ekstraktai. Kanabinoidų kiekis ekstraktuose analizuojamas naudojant dujų chromatografijos metodą. Tyrimo eiga pavaizduota 6 paveikslėlyje.

6pav. Tyrimų eigos schema

Cannabis sativa L. žaliava • Kokybės vertinimas • Nuodžiūvio nustatymas Ekstrakcija • Sėjamųjų kanapių ekstraktų ruošimas Dujų chromatografija • Kanabinoidų identifikavimas • Kanabinoidų kiekio nustatymas

2.5. Tyrimų metodika

2.5.1. Tiriamojo mėginio ruošimas

2.5.1.1. Nuodžiūvis

Pirmas žingsnis - tiriamosios žaliavos nuodžiūvio įvertinimas. Žaliavos nuodžiūvis – tai masės sumažėjimas, kuomet išgaruoja drėgmė ir lakieji junginiai. Tai vienas iš žaliavos kokybę apibūdinančių rodiklių. Jis nustatomas džiovinant žaliavą iki pastovios masės ir skaičiuojamas masės procentais (m/m). Nuodžiūvis buvo apskaičiuotas, naudojant drėgmės analizatorių. Atsvertas 1g susmulkintos sėjamųjų kanapių žaliavos buvo subertas ant analizatoriaus lėkštutės. Kiekviena žaliava buvo džiovinama nuo 6 iki 8 minučių, esant 103 °C temperatūrai. Atlikus analizę, sėjamojoje kanapėse nuodžiūvis atitiko M. ElSholy (2013 m.) reglamentuojamas maksimalaus nuodžiūvio kiekio leistinas ribas, kurios neturi viršyti 15 % [43].

2.5.1.2.Ekstraktų ruošimas

Šviežia augalinė žaliava turi būti išdžiovinta kambario temperatūroje kelias dienas arba turi būti džiovinama esant 70 °C temperatūrai iki tol, kol lapai taps trapūs. Augalo antžeminė̇ dalis - lapai ir stiebai buvo nuskinti nuo išdžiovinto augalo ir sudėti į maišyklę IKA A11 basic (Vokietija). Stiebai prieš smulkinimą buvo sulaužomi rankomis iki mažesnio dydžio, kad smulkinimas būtu efektyvesnis. Smulkinimas vyko apie 5-7 minutes iki tol, kol žaliava virto į smulkius miltelius. Susmulkinta žaliava buvo sudėta į popierinius maišelius ir paženklinta.

Ekstrakcija buvo atliekama remiantis Igno Popos magistriniu darbu [44]. Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,2 g (0,001 g tikslumu) atsvertos orasausės susmulkintos sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolės. Ekstrakcijai buvo naudotas metanolio ir chloroformo mišinys, santykiu 9:1 (t/t). Atsverta susmulkinta žaliava per piltuvėlį buvo supilama į 10 ml tūrio kolbutę ir užpilamas ekstrakcijos tirpikliu iki žymos. Kolbutė buvo užkemšama kamšteliu, gerai supurtoma ir 30 minučių dedama į ultragarso bangų vonelę. Gautas ekstraktas buvo filtruojamas per membraninį filtrą 0,45 porų dydžio. Paruošti ekstraktai supilami į tamsaus stiklo buteliukus su kamščiais. Ekstraktų mėginiai buvo paženklinti eilės numeriais ir analizuoti dujų chromatografijos metodu. Ekstrakcija buvo atliekama po 3 kartus naudojant skirtingus žaliavos mėginius.

2.5.2.Kanabinoidų kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos

metodu

Pagrindinių kanabinoidų, t.y. kanabidiolio (CBD), tetrahidrokanabinolio(THC) ir

kanabigerolio (CBG) ir kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui buvo pasirinktas dujų chromatografijos metodas. Naudotos dujos nešėjos – helis. Dujų chromatografo ir analizės specifika pateikiama 3 lentelėje.

3 lentelė. Dujų chromatografinės analizės sąlygos

Pradinė kolonėlės temperatūra keliama palaipsniui: nuo 80 oC iki 250 oC 10 oC/min, nuo 250oC iki 310 oC30 oC/min ir palaikoma 7 min. Bendras vieno bandinio analizės laikas 20 min.

Kanabinoidų kokybinei analizei atlikti apskaičiuoti sulaikymo indeksai kiekvienam komponentui atskirai. CBD, THC ir CBG koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal gradavimo grafiką, naudojant CBD, THC ir CBG standartinius tirpalus. Kalibracinis kanabinoidų grafikas sudaromas iš 5–7 skirtingų tirpalo koncentracijų. Kanabidiolio, kanabigerolio ir tetrahidrokanabinolio standartinių tirpalų koncentracijų priklausomybė nuo chromatografinių smailių plotų pavaizduota 7, 8 ir 9 pav.

Parametras Reikšmė

Kolonėlė Rxi-5MS

Kolonėles ilgis 30 m ilgio

Kolonėlės diametras 0,25 m

Nejudančios fazės storis 0,25 µm

Injekcijos temperatūra 290 oC

Kolonėlės temperatūra 80 oC

Injekcijos režimas Split 1:20

Eliuentai 1 – metanolis; 2 - chloroformas

Eliuentų santykis 1 – 90 %; 2 – 10 %

Tėkmės greitis 1,2 ml/min

7 pav. Kanabidiolio kalibracinė kreivė

Gautos kanabigeroliokalibracinės kreivės funkcija: y = 684,418 * x – 2542,12;

čia:

y – chromatografinės smailės plotas,

x – kanabigerolio koncentracija išreikšta mg/ml.

8 pav. Kanabigerolio kalibracinė kreivė

Gautos kanabidiolio kalibracinės kreivės funkcija: y = 722,183 * x – 1812,26;

čia:

y – chromatografinės smailės plotas,

x – kanabidiolio koncentracija išreikšta mg/ml.

R2_=0,9999562 R2_=0,9999729

Gautos tetrahidrokanabinolio kalibracinės kreivės funkcija: y = 725,674 * x – 306,154;

čia:

y – chromatografinės smailės plotas,

x – tetrahidrokanabinolio koncentracija mg/ml.

9 pav. Tetrahidrokanabinolio kalibracinė kreivė

Kanabidiolio, kanabigerolio ir tetrahidrokanabinolio tapatybė nustatyta pagal sulaikymo laiką kolonėlėje. Minėti parametrai lyginami su CBD, CBG, THC standartinių mėginių duomenimis.

2.6. Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV)ir „SPSS 20“ (IBM, JAV) programomis. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Skirtinguose Lietuvos regionuose surinkti sėjamųjų kanapių žolės mėginiai

Tyrimams naudota sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolės mėginiai buvo renkami septyniuose skirtinguose Lietuvos regionuose. Daugiausiai žaliavos mėginių buvo surinkta Panevėžio rajone - 5, po 1 žaliavos mėginį surinkta Šakių bei Kauno rajonuose (10 pav.).

10 pav. Skirtingose kultivavimo vietose rinktos sėjamųjų kanapių augalinės žaliavos

3.2. Nuodžiūvio kiekio įvertinimas

Nustatyta, kad visose sėjamųjų kanapių žaliavų mėginiuose nuodžiūvis neviršijo 15 % žaliavos masės, t.y. maksimalią leidžiamą nuodžiūvio kiekio reikšmę, kurią reglamentuoja M. ElSholy ir kt. (2013 m.). Sudžiovintos žaliavos žiedai bei lapai buvo tamsiai žalios spalvos, stiebai žalsvos, rudos, vaisiai – pilkos/rusvos spalvos. Tiriamuose augalinės žaliavos mėginiuose nustatyti nuodžiūvio kiekio rezultatai pateikiami 4 lentelėje.

0 1 2 3 4 5 6 Anykščių raj. Viešintų k. Telšių raj. Kaunatavos k. Kupiškio raj. Kadrėnų k Rokiškio raj. Panemunėlis Panevėžio raj. Upytės k. Šakių raj. Kriūkų k. S ėj am ų jų k an ap ių s k ai či u s Regionas

4 lentelė. Nuodžiūvio kiekis tiriamojoje žaliavoje skirtingose veislėse bei regionuose

Veislė Regionas Metai Nuodžiūvio kiekis

Finola Telšių raj., Kaunatavos k. 2016 5,82 % ±0,25%

Finola Anykščių raj., Viešintų k. 2016 5,28 % ± 0,31%

Finola Kupiškio raj., Kadrėnų k. 2016 5,59 % ± 0,28%

Felina 32 Panevėžio raj. Upytės k. 2016 5,99 %±0,43%

Monoica Panevėžio raj., Upytės k. 2016 6,39 %±0,37%

KC Dora Panevėžio raj., Upytės k. 2016 5,69 %±0,32%

SecuieniJubileu Panevėžio raj., Upytės k. 2016 6,59 %±0,41%

Virtus Rugo Panevėžio raj., Upytės k. 2016 6,57 %±0,29%

Futura 75 Šakių raj.,Kriūkų k. 2016 5,99 %±0,33%

Futura 75 Anykščių raj., Viešintų k. 2016 6,09 %±0,42%

Futura 75 Rokiškio raj., Panemunėlis 2016 6,20 %±0,25%

Tyrimo rezultatai parodė, kad surinkta ir išdžiovinta žaliava yra tinkama tolimesnei analizei.

3.3. Kanabidiolio, kanabigerolio bei tetrahidrokanabinolio idenifikavimas

sėjamųjų kanapių ekstraktuose

Dujų chromatografijos metodu pagal sulaikymo laiką sėjamųjų kanapių žaliavoje buvo identifikuoti trys pagrindiniai kanabinoidai – kanabidiolis (CBD), kanabigerolis (CBG) bei tetrahidrokanabinolis (THC). 11 paveiksle pateikti sėjamųjų kanapių ekstrakto mėginio, taip pat CBD, THC ir CBG standartinių tirpalų dujų chromatografijos identifikavimo tyrimų duomenys. THC ir CBG standartinių tirpalų dujų chromatografijos identifikavimo tyrimų duomenys.

11 pav. I – CBD, THC ir CBG standartintinio tirpalo chromatograma; II – Futura 75 veislės, surinktos Šakių raj. THC ekstrakto chromatograma; III - Futura 75 veislės, surinktos Šakių raj. CBD ekstrakto chromatograma; IV - Futura 75 veislės, surinktos Šakių raj. CBG ekstrakto chromatograma

Sulaikymo laikas

Ekstrakto mėginys Standartas

THC 20,47 min 20,46 min

CBD 19,98 min 19,97 min

CBG 20,70 min 20,70 min

3.4. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekybinis

įvertinimas sėjamųjų kanapių „Finola“ veislės, vyriškos ir moteriškos giminės

3.4.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas

Kanabidiolio (CBD) kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finola” veislės žolės mėginiuose, surinktuose 2016 m. iš skirtingų Lietuvos regionų. Gauti duomenis parodė, jog

didžiausias kanabidiolio kiekis buvo nustatytas Telšių rajone, Kaunatavos kaime sėjamųjų kanapių moteriškos giminės augalinėje žaliavoje (118,16± 23,2µg/ml). Mažesni kiekiai nustatyti Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime, vyriškoje giminėje (109,25±19,2µg/ml). Mažiausias kanabidiolio kiekis nustatytas Anykščių rajone, Viešintų kaime moteriškos giminės augalinėje žaliavoje (59,52±5,14µg/ml). Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, jog skirtingose kultivavimo vietose rinkti Cannabis sativa L. augalinės žaliavos mėginiai kaupia ženkliai skirtingus kanabidiolio kiekius, nes skirtumas tarp nustatyto didžiausio ir mažiausio kiekio buvo 1,98 karto. Kanabidiolio kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių žolėje pavaizduotas 12 pav.

12 pav. Kanabidiolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finola” veislės žolės mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos regionų 2016 metais (n=3)

3.4.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo nustatymas

Kanabigerolio (CBG) kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finola” veislės žolės mėginiuose, surinktuose 2016 m. iš skirtingų Lietuvos regionų. Didžiausias kanabigerolio kiekis nustatytas Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime surinktoje sėjamųjų kanapių moteriškos giminės augalinėje žaliavoje (6,28 ± 1,86µg/ml). Mažesni kiekiai nustatyti Telšių rajone, Kaunatavos kaime sėjamųjų kanapių vyriškos giminės bei Anykščių rajone, Viešintų kaime moteriškos giminės augalinėje žaliavoje, atitinkamai 4,93 ± 1,16µg/ml ir 5,85 ± 1,91µg/ml. Mažiausi CBG kiekai nustatyti Viešintų kaime, vyriškos giminės rinktoje žaliavoje – 5,22 ± 1,22 µg/ml ir Telšių rajono,

0 20 40 60 80 100 120 140 Viešintų k. Vyr. g. Viešintų k. Mot. g. Kadrėnų k. Vyr. g. Kadrėnų k. Mot. g. Kaunatavos k. Vyr. g. Kaunatavos k. Mot. g. K an ab id iol io k ie k is µ g/ m l Vietovė

Kaunatavos kaime moteriškos giminės rinktoje žaliavoje (4,93 ± 1,11 µg/ml). Kanabigerolio kiekio įvairavimas auginėje žaliavoje pavaizduotas 13 paveikslėlyje.

13 pav. Kanabigerolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finola” veislės žolės mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos regionų 2016 metais (n=3)

3.4.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo nustatymas

Tetrahidrokanabidiolio kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finolos” veislės žolės mėginiuose, surinktuose 2016 m. iš skirtingų Lietuvos regionų. Nustatytas tetrahidrokanabinolio kiekis svyravo nuo 3,64± 1,07µg/ml iki 24,76± 4,47µg/ml. Didžiausias tetrahidrokanabinolio kiekis nustatytas Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime moteriškos giminės rinktoje sėjamųjų kanapių augalinėje žaliavoje buvo 24,76 ± 4,47 µg/ml, vyriškoje – 21,69 ± 4,21 µg/ml. Mažiausi tetrahidrokanabinolio kiekiai nustatyti Anykščių rajono, Viešintų kaime rinktoje moteriškos ir vyriškos giminės žaliavoje ir Telšių rajono, Kaunatavos kaime rinktoje moteriškos giminės žaliavoje, atitinkamai 6,34 ± 2,07 µg/ml, 4,17 ± 1,65 µg/ml ir 3,64 ± 1,07µg/ml. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimas augalinėje žaliavoje pavaizduotas 14 paveikslėlyje.

0 1 2 3 4 5 6 7 Viešintų k. Vyr. g. Viešintų k. Mot. g. Kadrėnų k. Vyr. g. Kadrėnų k. Mot. g. Kaunatavos k. Vyr. g. Kaunatavos k. Mot. g. K an ab ige rol io k ie k is µ g/ m l Vietovė

14 pav.Tetrahidrokanabinolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių “Finola”veislės žolės mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos regionų 2016 metais (n=3)

3.4.4. Suminis kanabinoidų kiekis

Suminis kanabinoidų CBD, CBG ir THC kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. „Finola“ veislės žolės mėginiuose, rinktuose 2016 metais skirtinguose Lietuvos regionuose. Susumavus gautus rezultatus, bendras pagrindinių trijų kanabinoidų kiekis suvestas į diagramą (15 pav.). Gauti duomenis parodė, jog didžiausias kiekis nustatytas Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime, vyriškos giminės žaliavoje (135,991 µg/ml). Taip pat didelis kiekis nustatytas Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime, moteriškos giminės žaliavoje (132,563 µg/ml). Panašūs kiekiai nustatyti ir Telšių rajone, Kaunatavos kaime, vyriškoje ir moteriškoje giminėje, atitinkamai – 125,99 µg/ml ir 126,42 µg/ml. Mažiausi kiekiai nustatyti Anykščių rajone, Viešintų kaime auginamoje sėjamojoje kanapėje. Vyriškoje bei moteriškoje giminėje nustatyti 84,122 µg/ml bei 71,704 µg/ml. Išanalizavus ir susumavus tyrimų duomenis, galima daryti išvadą, jog Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime kultivuojama Cannabis sativa L. „Finola“ veislė kaupė didžiausius kanabinoidų kiekius. Nustatytas suminis kanabinoidų kiekis sėjamųjų kanapių žolėje pavaizduotas 15 paveikslėlyje.

0 5 10 15 20 25 30 Viešintų k. Vyr. g. Viešintų k. Mot. g. Kadrėnų k. Vyr. g. Kadrėnų k. Mot. g. Kaunatavos k. Vyr. g. Kaunatavos k. Mot. g. T et rah id rok an ab id iol io k ie k is µ g/ m l Vietovė

15 pav. Kanabinoidų suminis kiekis (µg/ml) “Finola” veislės Cannabis sativa L. žolės mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos regionų 2016 metais (n=3)

3.5. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekio įvertinimas

sėjamųjų kanapių veislėse, rinktose Panevėžio rajone, Upytės kaime

3.5.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas

Kanabidiolio kiekio įvairavimas Cannabissativa L. skirtingų veislių žolės mėginiuose, rinktuose 2016 m. Panevėžio rajone, Upytės kaime. Gauti duomenis parodė, jog didžiausias kanabidiolio kiekis (232,40 ± 33,73µg/ml) nustatytas „Secuieni Jubileu“ veislėje. Mažesnis CBD kiekis nustatytas „Monoica“ ir „KC Dora“ veislėse, atitinkamai – 178,75 ± 27,76µg/ml ir 149,06± 23,81µg/ml. Mažiausias kanabidiolio kiekis nustatytas „Felina 32“ veislėje– 46,21 ± 4,78µg/ml. Įvertinus rezultatus galima teigti, jog skirtingos veislės augalinės žaliavos mėginiai kaupia gana ženkliai skirtingus CBD kiekius, nors visos veislės buvo kultivuojamos toje pačioje vietoje, vienodomis sąlygomis. Gauti rezultatai pavaizduoti 16 paveikslėlyje.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Anykščių raj. Viešintų k. Vyr. g. Anykščių raj. Viešintų k. Mot. g. Kupiškio raj. Kadrėnų k. Vyr. g. Kupiškio raj. Kadrėnų k. Mot. g. Telšių raj. Kaunatavos k. Vyr. g. Telšių raj. Kaunatavos k. Mot. g. K ie k is m k g/ m l

16 pav. Kanabidiolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių skirtingų veislių žolės mėginiuose, surinktuose Panevėžio raj., Upytės kaime 2016 metais (n=3)

3.5.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo nustatymas

Kanabigerolio kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. skirtingų veislių žolės mėginiuose, rinktuose 2016 m. Panevėžio rajone, Upytės kaime. Įvertinus kanabigerolio kitimą, galima teigti, jog didžiausias kanabigerolio kiekis buvo nustatytas „Secuieni Jubileu“ veislėje (9,53 ± 3,07µg/ml). Mažesnis CBG kiekis nustatytas „KC Dora“ veislėje – 7,77 ± 2,76µg/ml. Mažiausi kanabigerolio kiekiai nustatyti sėjamųjų kanapių „Virtus Rugo“ ir „Monoica“ veislės žolės mėginiuose, atitinkamai 4,58± 2,37µg/ml ir 4,63 ± 2,76µg/ml. Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, jog produktyviausia veislė yra „Secueni Jubileu“, kadangi kanabigerolio kiekiai joje buvo nustatyti didžiausi. Gauti rezultatai pavaizduoti 17 paveikslėlyje.

0 50 100 150 200 250 300

Felina 32 Monoica KC Dora Secuieni

Jubileu Virtus Rugo

K an ab id iol io k ie k is µ g/ m l Veislė Panevėžio raj., Upytės k.

17 pav. Kanabigerolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių skirtingų veislių žolės mėginiuose, surinktuose Panevėžio raj., Upytės kaime 2016 metais (n=3)

3.5.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo nustatymas

Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. skirtingų veislių žolės mėginiuose, rinktuose 2016 m. Panevėžio rajone, Upytės kaime. Apskaičiavus tetrahidrokanabinolio kiekio kitimą skirtingose veislėse, nustatyta, jog THC kiekis buvo ženkliai didesnis „Secuieni Jubileu“ veislėje (6,14 ± 2,37µg/ml). „KC Dora“ veislėje nustatytas THC kiekis buvo 3,65± 1,34µg/ml. Šiek tiek mažiau tetrahidrokanabinolio nustatyta „Virtus Rugo“ bei „Monoica“ veislėse, atitinkamai 3,07± 1,28µg/ml ir 2,87 ±1,45 µg/ml. Mažiausias iš visų Panevėžio rajono, Upytės kaimo surinktų sėjamųjų kanapių veislių THC kiekis nustatytas „Felina 32“ veislėje (0,43 ±0,12 µg/ml).

Įvertinus gautus rezultatus, nustatyta, kad surinktuose Cannabis sativa L. įvairių veislių žaliavos mėginiuose, tetrahidrokanabinolio kiekis skiriasi net 14 kartų. Gauti duomenys pavaizduoti 18 paveikslėlyje. 0 2 4 6 8 10 12

Felina 32 Monoica KC Dora Secuieni

Jubileu Virtus Rugo

K an ab ige rol io k ie k is µ g/ m l Veislė Panevėžio raj., Upytės k.

18 pav. Tetrahidrokanabidinolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių skirtingų veislių žolės mėginiuose, surinktuose Panevėžio raj., Upytės kaime 2016 metais (n=3)

3.5.4. Suminis kanabinoidų kiekis

Suminis kanabinoidų CBD, CBG ir THC kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. skirtingų veislių žolės mėginiuose, rinktuose 2016 m. Panevėžio rajone, Upytės kaime. Apskaičiavus bendrą kanabinoidų kiekį Cannabis sativa L. žaliavoje, rezultatai suvesti į diagramą (19 pav.). Gauti duomenys parodė, jog didžiausias kanabinoidų kiekis nustatytas „Secuieni Jubileu“ veislėje (248,06 µg/ml). Mažesni rezultatai nustatyti „Monoica“ veislėje (186,24µg/ml). „KC Dora“ veislėje kanabinoidų kiekis buvo 160,48 µg/ml, o „Virtus Rugo“ – 108,73µg/ml. Mažiausias kanabinoidų kiekis nustatytas „Felina 32“ veislėje – 46,21µg/ml.

Atlikus duomenų analizę, įvertintos skirtingų veislių Cannabis sativa L. žaliavos kanabinoidų koncentracija. Išanalizavus ir susumavus visus duomenis galime daryti išvadą, jog didžiausias kanabinoidų kiekis nustatytas „Secuieni Jubileu“ veislėje, kuris 4,7 karto buvo didesnis nei mažiausią kanabinoidų kiekį kaupiančioje „Felina 32“ veislėje. Apibendrinant, galima teigti, jog skirtingos veislės augalinės žaliavos mėginiai kaupia gana ženkliai skirtingus kanabinoidų kiekius, nors visos veislės buvo kultivuojamos toje pačioje vietoje, vienodomis sąlygomis.

0 1 2 3 4 5 6 7

Felina 32 Monoica KC Dora Secuieni

Jubileu Virtus Rugo K ie k is µ g/ m l Veislė Panevėžio raj., Upytės k.

19 pav. Suminis CBD, CBG ir THC kanabinoidų kiekis (µg/ml) skirtingose veislėse Panevėžio raj., Upytės kaime, 2016 metais (n=3)

3.6. Kanabidiolio, kanabibgerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekio įvertinimas

sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislėje

3.6.1. Kanabidiolio kiekio įvairavimo įvertinimas

Kanabidiolio kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, rinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais. Apskaičiavus kanabidiolio kiekį, rezultatai suvesti į diagramą (20 pav). Gauti duomenis parodė, jog didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas Anykščių rajono, Viešintų kaime rinktoje sėjamųjų kanapių žolėje (678,31± 46,83µg/ml). Šakių rajono, Kriūkų kaime rinktoje žaliavoje nustatytas kanabidiolio kiekis buvo 311,51± 23,85 µg/ml. Mažiausias CBD kiekis nustatytas Rokiškio rajone, Panemunėlyje rinktame žaliavos mėginyje (224,59 ± 19,04 µg/ml). Apibendrinus gautus rezultatus, galima teigti, jog skirtingose kultivavimo vietose rinkti Cannabis sativa L. augalinės žaliavos mėginiai kaupia skirtingus CBD kiekius, nes nustatytas skirtumas tarp rasto didžiausio ir mažiausio kiekio buvo 3 kartai. Gauti rezultatai pavaizduoti 20 paveikslėlyje. 0 50 100 150 200 250 300

Felina 32 Monoica KC Dora Secuieni

Jubileu Virtus Rugo

K ie k is µ g/ m l Veislė Panevėžio raj., Upytės k.

20 pav. Kanabidiolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais (n=3)

3.6.2. Kanabigerolio kiekio įvairavimo įvertinimas

Kanabigerolio kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, rinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais. Iš pateiktos diagramos (21 pav.) galima matyti, kad kaip ir kanabidiolio kiekio nustatyme, taip ir čia, pagal nustatytą kanabigerolio kiekį, Anykščių rajone, Viešintų kaime kultivuojama „Futura 75“ veislė kaupia didžiausią kanabigerolio kiekį. Šiame regione kultivuojamoje žaliavoje nustatytas CBG kiekis buvo 36,87± 8,04 µg/ml, o tai yra didžiausias kiekis tarp visų šiame darbe tirtų Cannabis satia L. augalinės žaliavos CBG mėginių. Mažiausi CBG kiekiai nustatyti Rokiškio rajone, Panemunėlyje ir Šakių rajono, Kriūkų kaime rinktuose žaliavos mėginiuose, atitinkamai – 10,59± 3,91µg/ml ir 12,10± 6,04 µg/ml. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 K an ab id iol io k ie k is µ g/ m l Futura 75 Šakių raj. Anykščių raj Rokiškio raj.

21 pav. Kanabigerolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais (n=3)

3.6.3. Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimo įvertinimas

Tetrahidrokanabinolio kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, rinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais. Didžiausias tetrahidrokanabinolio kiekis nustatytas Anykščių rajono, Viešintų kaime rinktoje sėjamųjų kanapių žolėje (19,27 ± 5,95µg/ml). Ženkliai mažesni THC kiekiai nustatyti Šakių rajone, Kriūkų kaime ir Rokiškio rajono, Pamenunėlyje rinktuose sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose, atitinkamai 7,88 ± 3,49 µg/ml ir 6,16 ± 2,93µg/ml. Gauti rezultatai pavaizduoti 22 paveikslėlyje.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 K an ab ige rol io k ie k is µ g/ m l Futura 75 Šakių raj. Anykščių raj Rokiškio raj.

22 pav. Tetrahidrokanabinolio kiekio (µg/ml) įvairavimas sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose 2016 metais (n=3)

3.6.4. Suminis kanabinoidų kiekis Cannabis sativa L. “Futura 75” veislėje

skirtinguose rajonuose

Suminis kanabinoidų CBD, CBG ir THC kiekio įvairavimas Cannabis sativa L. „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, rinktuose 2016 m. skirtinguose Lietuvos regionuose. Apskaičiavus ir susumavus bendrą kanabinoidų kiekį Cannabis sativa L. augalinės žaliavos mėginiuose, rezultatai suvesti į diagramą (23 pav.). Gauti duomenis parodė, kad nustatytas suminis CBD, CBG ir THC kanabinoidų kiekis įvairiuose regionuose rinktuose sėjamųjų kanapių žolės mėginiuose gana ženkliai skiriasi. Didžiausias kanabinoidų kiekis nustatytas Anykščių rajono, Viešintų kaime žolės mėginiuose (734,45 µg/ml). Mažesni kanabinoidų kiekiai nustatyti Šakių rajono, Kriūkų kaime ir Rokiškio rajone, Panemunėlyje rinktuose žolės mėginiuose, atitinkamai 331,49 µg/ml ir 241,34 µg/ml.

Įvertinus gautus rezultatus galima teigti, kad skirtingose kultivavimo vietose rinkti Cannabis sativa L. augalinės žaliavos mėginiai kaupia ženkliai skirtingus kanabinoidų kiekius, nes nustatytas skirtumas tarp rasto didžiausio ir mažiausio kiekio buvo 3,04 karto.

0 5 10 15 20 25 T et rah id rok an ab in ol io k ie k is µ g/ m l Futura 75 Šakių raj. Anykščių raj Rokiškio raj.

23 pav. Suminis CBD, CBG ir THC kanabinoidų kiekis (µg/ml) sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislės mėginiuose, rinktuose skirtinguose rajonuose 2016 metais (n=3)

3.7. Bendras visų Cannabis sativa L. veislių iš skirtingų regionų kanabinoidų

kiekis

Apskaičiavus bendrą kanabinoidų kiekį, rezultatai suvesti į diagramą (24 pav.).

24 pav. Kanabinoidų kiekis nustatytas sėjamųjų kanapių veislėse, rinktose skirtinguose Lietuvos regionuose(n=3) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 K ie k is µ g/ m l Futura 75 Šakių raj. Anykščių raj Rokiškio raj. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Finola Finola Finola Felina 32 Monoica KC Dora Secuieni Jubileu

Virtus Rugo

Futura 75 Futura 75 Futura 75

K an ab in oi d ų k ie k is µ g/ m l Veislė Finola Finola Finola Futura 75 Futura 75 Futura 75

Gauti duomenis parodė, jog didžiausias kanabinoidų kiekis nustatytas „Futura 75“ veislėje, kuri buvo užauginta Anykščių rajono, Viešintų kaime (734,45 µg/ml). Šios veislės nustatytas kanabinoidų kiekis buvo daug didesnis nei kitų veislių. Mažesnis kanabinoidų kiekis nustatytas „Futura 75“ veislėje Šakių rajono, Kriūkų kaime rinktoje žaliavoje (331,49 µg/ml). Mažiausi kiekiai nustatyti „Virtus Rugo“ (108,727 µg/ml) bei „Felina 32“ (51,81µg/ml) veislėse, kurios abi buvo kultivuojamos Panevėžio rajone, Upytės kaime. Apibendrinus rezultatus galima teigti, jog skirtingose augimo vietose rinktos augalinės žaliavos mėginiai kaupia ženkliai skirtingus kanabinoidų kiekius. Skirtumas tarp didžiausios ir mažiausios reikšmės yra 14,1 karto. Todėl galima daryti išvadą, kad rinkimo vieta ir veislė turi įtakos bendram kanabinoidų kiekiui.

4. IŠVADOS

1. Dujų chromatografijos metodu sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolės mėginiuose pagal sulaikymo laiką buvo identifikuoti visi trys tirti pagrindiniai kanabinoidai: kanabidiolis, kanabigerolis ir tetrahidrokanabinolis.

2. Dujų chromatografijos metodu nustatyta, kad suminis pagrindinių kanabinoidų kiekis, skirtinguose Lietuvos regionuose surinktoje sėjamųjų kanapių žolėje bei skirtingose veislėse įvairavo nuo 51,81 µg/ml („Felina 32“ veislėje, Panevėžio rajonas, Upytės kaimas) iki 734,45µg/ml („Futura 75“ veislėje, Anykščių rajonas, Viešintų kaimas). Nustatyti statistiškai reikšmingi (p<0,05) rezultatai. 3. Tyrimų metu nustatyta, kad „Finola“ veislės moteriškos giminės žaliavoje didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas Telšių rajono, Kaunatavos kaime rinktoje žaliavoje (118,16 ± 23,2µg/ml). Kanabigerolio ir tetrahidrokanabinolio didžiausi kiekiai nustatyti Kupiškio rajono, Kadrėnų kaime rinktoje sėjamųjų kanapių moteriškos giminės žaliavoje, atitinkamai 6,28 ± 1,86µg/ml ir 24,76 ± 4,47 µg/ml (p<0,05).

4. Įvertinus kanabinoidų kiekio įvairavimą sėjamųjų kanapių „Futura 75“ veislės žolės mėginiuose, nustatyta, kad didžiausi kanabidiolio, kanabigerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekiai nustatyti Anykščių rajone, Viešintų kaime rinktoje žaliavoje, atitinkamai 678,31± 46,83µg/ml, 36,87 µg/ml ± 8,04 µg/ml ir 19,27 ± 5,95µg/ml (p<0,05).

5. Įvertinus Panevėžio rajono, Upytės kaime surinktų skirtingų sėjamųjų kanapių veislių augalinę žaliavą, nustatyta, kad didžiausius kanabidiolio, kanabigerolio ir tetrahidrokanabinolio kiekius kaupė “Secueini Jubileu” veislė, atitinkamai 232,40 ± 33,73 µg/ml, 9,53 ± 3,07 µg/ml ir 6,14 ± 2,37 µg/ml (p<0,05).

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis atliktu tyrimu, buvo nustatyta, jog “Futura 75” veislė užauginta Anykščių rajone, Viešintų kaime sukaupė didžiausią kanabinoidų kiekį Cannabis sativa L. žaliavoje, todėl šią veislę yra rekomenduojama auginti tuo atveju, jeigu žaliavoje reikalingas didelis kanabinoidų kiekis.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Andre CM, Hausman J-F, Guerriero G. Cannabis sativa: The Plant of the Thousand and One Molecules. Front Plant Sci, 2016.

2. Piluzza G, Delogu G, Cabras A, Marceddu S, Bullitta S. Differentiation between fiber and drug types of hemp (Cannabis sativa L.) from a collection of wild and domesticated accessions. Genet Resour Crop Evol. 2013;60(8):2331–42.

3. Shevyrin VA, Morzherin YY. Cannabinoids: Structures, effects, and classification. Russ Chem Bull. 2015;64(6):1249–66.

4. Zuardi AW, Crippa JAS, Hallak JEC, Moreira FA, Guimarães FS. Cannabidiol, a Cannabis sativa constituent, as an antipsychotic drug. Vol. 39, Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2006. p. 421–9.

5. Mechtler K, Bailer J, De Hueber K. Variations of 9-THC content in single plants of hemp varieties. Ind Crops Prod. 2004;19(1):19–24.

6. Ashton CH. Pharmacology and effects of cannabis: A brief review. Vol. 178, British Journal of Psychiatry. 2001. p. 101–6.

7. Whiting PF, Wolff RF, Deshpande S, Di Nisio M, Duffy S, Hernandez A V, et al.

Cannabinoids for medical use a systematic review and meta-analysis. 2015;313(24):2456. 8. Ben Amar M. Cannabinoids in medicine: A review of their therapeutic potential. Vol. 105,

Journal of Ethnopharmacology. 2006. p. 1–25.

9. Hazekamp A. Cannabis Review. Cannabis Review. 2009. 98 p.

10. Vermersch P. Sativex (tetrahydrocannabinol + cannabidiol), an endocannabinoid system modulator: basic features and main clinical data. Expert Rev Neurother. 2011;11:15–9. 11. Craker LE, Gardner Z. The Botany of Cannabis. In: The Pot Book: A Complete Guide to

Cannabis. 2010. p. 35–43.

12. Balick MJ, Clarke RC. Marijuana Botany. An Advanced Study: The Propagation and Breeding of Distinctive Cannabis. Brittonia. 1982;34:140.

13. Callaway JC. Hempseed as a nutritional resource: An overview. In: Euphytica. 2004. p. 65– 72.

14. Jankauskienė Z, Gruzdevienė E. Physical parameters of dew retted and water retted hemp (Cannabis sativa L.) fibres. Zemdirbyste-Agriculture. 2013;100(1):71–80.

15. Turner C, Elsohly M, Boeren E. Constituents of Cannabis sativa - a Review of the natural constituents. J Nat Prod [Internet]. 1979;45(2):169–233.

16. ElSohly MA, Slade D. Chemical constituents of marijuana: The complex mixture of natural cannabinoids. In: Life Sciences. 2005. p. 539–48.