MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
AKVILĖ KARALIŪNAITĖ
RESVERATROLIO ĮVERTINIMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. Dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
RESVERATROLIO ĮVERTINIMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Dr. Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas
Data
KAUNAS, 2016 Darbą atliko
Magistrantė Akvilė Karaliūnaitė Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Stilbenai augaluose, jų svarba ... 11
1.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai ... 11
1.3. Cheminės resveratrolio savybės ... 11
1.4. Trans-resveratrolio biosintezė augaluose ... 12
1.5. Stilbenų modifikacijos augaluose ... 13
1.6. Resveratrolio poveikis sveikatai ... 14
1.6.1. Resveratrolio poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 14
1.6.2. Resveratrolio vaidmuo vėžio gydyme ... 15
1.6.3. Neuroprotekcinės resveratrolio savybės ... 16
1.6.4. Resveratrolio vaidmuo diabeto gydyme ... 16
1.6.5. Resveratrolio vaidmuo pratęsiant gyvenimo trukmę ... 16
1.7. Resveratrolio absorbcija, metabolizmas, bioprieinamumas ... 17
1.7.1. Absorbcija ... 17
1.7.2. Metabolizmas ... 17
1.7.3. Biologinis prieinamumas ... 18
1.8. Analitinių metodų taikymas resveratrolio nustatymui ... 19
1.9. Trans-resveratrolio kiekio įvairavimas komerciniuose vynuose ... 22
1.10. Resveratrolio kiekio įvairavimas maisto papilduose ... 23
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
2.1. Tyrimo objektas ... 24
2.1.1. Tyrimui naudotų maisto papildų sudėtis ... 24
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 25
2.2.1. Tyrimui naudota įranga ... 25
2.2.2. Tyrimui naudoti reagentai ... 25
2.2.3. Tyrimo sąlygos ... 25
2.2.5. Mėginių paruošimas analizei ... 26 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27 3.1. Metodikos validacija... 27 3.1.1. Metodikos specifiškumas ... 27 3.1.2. Tiesiškumas ... 29 3.1.3. Glaudumas (preciziškumas) ... 30
3.1.4. Trans-resveratrolio aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ) ribos ... 32
3.2. Resveratrolio maisto papildų ir vyno pavyzdžių analizės rezultatai ... 32
3.2.1. Kokybinis trans-resveratrolio įvertinimas ... 32
3.2.2. Kiekybinis trans-resveratrolio įvertinimas ... 33
3.2.3. Deklaruojamo ir nustatyto trans-resveratrolio kiekio procentinė išraiška ... 36
3.2.4. Trans-resveratrolio kiekio maisto papilduose deviacijos reikšmės ... 37
3.2.5. Trans-resveratrolio kiekio komerciniame raudonajame vyne analizės rezultatai ... 38
4. IŠVADOS ... 40
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
SANTRAUKA
Akvilės Karaliūnaitės magistro baigiamasis darbas. Vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. - Kaunas.
Pastaraisiais metais biocheminiai ir medicininiai resveratrolio tyrimai parodė daug potencialių biologinių poveikių žmogaus sveikatai, tokių kaip antioksidacinis aktyvumas, priešgrybelinis poveikis, fitoestrogeninis efektas, priešuždegiminis aktyvumas ar netgi priešvėžinis aktyvumas [74]. Taigi natūralu, kad rinkoje atsiranda vis daugiau resveratrolio produktų, kadangi maisto papildų rinka su kiekviena diena vis plečiasi, o naujai sukuriamų maisto papildų kiekis nuolat auga, tačiau deja, maisto papildų kontrolė praktiškai neegzistuoja. Todėl svarbu sukurti tikslias, greitas ir efektyvias metodikas, kurios padėtų užtikrinti į rinką teikiamų resveratrolio preparatų kokybę ir pagerintų kontrolę.
Darbo tikslas: kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti trans-resveratrolį, rinkoje esančiuose preparatuose ir komerciniame raudonajame vyne.
Uždaviniai: pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką resveratrolio maisto papilduose ir vyne analizei, ją validuoti; įvertinti ir palyginti realų trans-resveratrolio kiekį maisto papilde su deklaruojamu ant pakuotės; nustatyti trans-trans-resveratrolio kiekį komerciniame raudonajame vyne.
Tyrimo metodas: resveratrolio preparatų ir vyno kokybinei ir kiekybinei analizei pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas su fotodiodų matricos detekcija. Tirpiklių sistema: A: acetonitrilas- acto rūgštis- vanduo (20:2:78 v/v), B: acetonitrilas- acto rūgštis- vanduo (90:2:8v/v). Kolonėlė termostatuojama 25 °C temperatūra, mobilios fazės tekėjimo greitis 1,0 ml/min.
Trans-resveratrolio aptikimui naudojamas 305,0 nm šviesos bangos ilgis.
Rezultatai: Validuojant metodiką tiesiškumas įrodytas kreivių koreliacijos koeficientais (>0,99). Rezultatų glaudumas pagrįstas tuo, kad pakartojamumo ir atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis buvo <5 proc. Atlikus kokybinius maisto papildų ir komercinio vyno tyrimus, trans-resveratrolis identifikuojamas lyginant standartinio tirpalo ir analizuojamų mėginių sulaikymo trukmes, bei UV šviesos spektrų atitikimus. Atlikus kiekybinį tyrimą nustatyta, kad tik trys maisto papildai iš šešių atitinka ant pakuotės deklaruojamą trans-resveratrolio kiekį. Dviejuose tirtuose vynuose trans-resveratrolį pavyko nustatyti kiekybiškai (0,001 mg/ml; 0,003 mg/ml).
SUMMARY
In recent years, biochemical and medical studies of resveratrol showed a lot of potential biological effects on human health, such as antioxidant activity, antifungal effects, anti-inflammatory activity, or even anti-cancer activity [74]. It is evident that dietary supplements market is constantly growing and new products are entering it everyday. Unfortunately, the dietary supplements control practically does not exist. Therefore, it is important to create a precise, fast and efficient methods that would assure the quality of these pharmaceuticals.
Aim of the study: to perform a qualitative and a quantitive assey of dietary supplements and red commercial wines to determine trans-resveratrol using high performance liquid chromatography (HPLC).
Objectives of the study: to determine high-performance liquid chromatography (HPLC) method of trans-resveratrol in dietary supplements and wine analysis, perform validation of HPLC method; evaluate and compare the actual amount of trans-resveratrol in the dietary supplements to the one, which is declared on the packaging; evaluate the amount of trans-resveratrol in red commercial wines.
Method: high-performance liquid chromatographic (HPLC) methodwith diode array detection of analysis of trans-resveratrol in dosage forms and wines was developed and validated. The separation was carried out using ACE C18, 250 x 4,6 mm chromatographic column using gradient elution (solvent A: acetonitrile – acetic acid – water 20:2:78 v/v, respectively, solvent B: acetonitrile – acetic acid – water 90:2:8 v/v, respectively). The column was thermostated at 25ºC, flow rate was 1,0 ml/min., injection volume 10 µl, detection of trans-resveratrol was performed at 305 nm wavelength.
Results and discussion: the method of quantitative analysis of trans-resveratrol was validated with regard to its specificity, precision, accuracy and linearity. It was clearly established that there was a presence of trans-resveratrol in all analyzed dosage forms of dietary supplements, but only three out of the sixbrands had near label values. Only two out of ten wines had significant values of
SANTRUMPOS
4CL – 4-kumarato CoA ligazė Akt – baltymo kinazė B
Bax baltymas – apoptozę sukeliantis baltymas Bcl-2 – antiapoptozinis baltymas
BSTFA – bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamidsas C4H – cinamato 4-hidroksilazė
COX – ciklooksigenazė
eNOS – endotelinė azoto monoksido sintazė EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ERK – ekstraląstelinė signalu reguliuojama kinazė ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
FDA – JAV Maisto ir Vaistų Administracijos Agentūra (angl. Food and Drug Administration) FoxO – transkripcijos faktorius, reguliuojamas insulino/ PI3K/ Akt signaliniu keliu
HEK 293 – žmogaus embriono inkstų ląstelės 293 HO-1 – hemo oksigenazė 1
ICH – tarptautinė komisija, sprendžianti techninių reikalavimų dėl žmonėms skirtų farmacinių produktų suderinamumo klausimus (angl. The International Council for Harmonisation of Technical
Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)
LoD – aptikimo riba (angl. limit of detection) LoQ – nustatymo riba (angl. limit of quantification) Map kinazė – mitogeno aktyvuota proteinkinazė MnSOD – mangano superoksido dismutazė MTL – mažo tankio lipoproteinai
NFκB – baltymų kompleksas, kontroliuojantis DNR transkripciją, citokinų gamybą ir ląstelės gyvavimą
p53 – transkripcijos faktorius, reguliuojantis ląstelės ciklą PAL – fenilalanino amoniako liazė
PBEF – nikotinamido fosforiboziltransferazė
SIRT1 – fermentas, deacetilinantis baltymus, kurie turi įtakos ląsteliniam reguliavimui (reakcijos į stresorius, ilgaamžiškumas)
ĮVADAS
Kasdienės dietos papildymas iš maisto gautais fitocheminiais junginiais ne tik tapo savaime suvokiamu įpročiu savo sveikata besirūpinantiems vartotojams, tačiau ir galingu įrankiu rinkodaros tikslais. Pasaulinė maisto papildų rinka auga greičiau nei dauguma kitų sektorių maisto pramonėje ir įkūnija kultūrinę ir mokslinę hibridizaciją tarp maisto ir vaistinių preparatų [75]. Tokio tipo reiškiniai, turėtų būti kruopščiai nagrinėjami, siekiant užkirsti kelią mistifikacijai ir sukčiavimui ir norint išvengti nepagrįstų lūkesčių, kurie būtų žalingi tiek vartotojui, tiek rinkai.
Marketingo tyrimai aiškiai parodė augantį susidomėjimą sveikatingumo skatinimo produktais su biologiškai aktyviomis sudėtinėmis dalimis, gautomis iš augalų. Tačiau riba tarp maisto papildų ir vaistinių preparatų ne visuomet aiškiai suvokiama vartotojui [76]. Pavyzdžiui, dauguma maisto papildų yra pateikiami tokių farmacinių formų kaip tabletės ar kapsulės todėl vartotojui netiesiogiai yra įteigiama preparato kokybė ir efektyvumas. Panašų efektą iššaukia ir sveikatingumo teiginiai ar panaši informacija ant maisto papildo pakuotės. Dėl šių aspektų vartotojas dažnai patiki, jog maisto papildas yra ne vaistinis preparatas, todėl turi mažiau šalutinių poveikių, tačiau vartotojas taip pat skatinamas manyti, jog maisto papildo kokybė ir gamyba atitinka aukštus farmacinius reikalavimus [76-78]. Tačiau, teisinis pagrindas vaistiniams preparatams ir maisto papildams skiriasi daugelyje šalių. Nors ir norėtųsi tikėti, kad maisto papildai atitinka aukštą farmacinių preparatų kokybę, tačiau nėra jokių Europos teisinių aktų apibrėžiančių tuos pačius standartus vaistiniams preparatams ir maisto papildams.
Pastaruoju metu išaugo susidomėjimas antioksidantais, tokiais kaip stilbenai, neturinčiais vitamininio aktyvumo. Vienas iš pagrindinių stilbenų – resveratrolis (3,5,4’trihidroksi-trans-stilbenas)atlieka svarbų vaidmenį žmogaus patologijų, tokių kaip širdies ir kraujagyslių ligų, neurodegeneracinių sutrikimų ar karcinogenezės, prevencijoje [79-81].
Apibendrinus mokslinę literatūrą, rasta daug resveratrolio kiekio nustatymo metodikų įvairiose augalinėse žaliavose ar komerciniuose vynuose, tačiau tik keliuose straipsniuose yra kiekybiškai tiriami resveratrolio maisto papildai ir vertinamas jų kiekis, lyginant su gamintojų deklaruojamu kiekiu ant maisto papildo pakuotės.
Dėl didesnio antioksidacinio aktyvumo ir didesnio gebėjimo sukelti teigiamą farmakologinį efektą, šiam tyrimui pasirinktas trans-resveratrolio izomeras.
Kadangi trans-resveratrolis yra labai polinis junginys ir pasižymi nedideliu lakumu, efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra vienas tinkamiausių. Jei tyrimui būtų pasirinkta dujų chromatografijos metodika, be išankstinių pasiruošimo procedūrų, tikslių rezultatų negautume, dėl didelio resveratrolio poliškumo ir mažo lakumo.
Šio tyrimo tikslas yra pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ir kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti pasirinktus maisto papildus ir raudoną komercinį vyną.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti trans-resveratrolio kiekio įvairavimą, rinkoje esančiuose maisto papilduose ir komerciniame raudonajame vyne.
Uždaviniai:
1. Apžvelgti mokslinę literatūrą apie trans-resveratrolio nustatymą maisto papilduose ir komerciniame vyne.
2. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką trans-resveratrolio maisto papilduose ir vyne kokybinei ir kiekybinei analizei.
3. Validuoti pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką. 4. Įvertinti trans-resveratrolio kiekį pasirinktuose maisto papilduose. 5. Įvertinti trans-resveratrolio kiekį komerciname raudonajame vyne.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Stilbenai augaluose, jų svarba
Stilbenai yra natūralūs fenoliniai junginiai, esantys daugelyje augalų šeimų, įskaitant Vynmedinių (Vitaceae), Sparneninių (Dipterocarpaceae), Gnetum (Gnetaceae), Pušinių (Pinaceae),Pupinių (Fabaceae), Miglinių (Poaceae), Viksvuolinių (Cyperaceae) šeimas. Nors polifenoliai turi didžiulę cheminę įvairovę, stilbenai sudaro gana ribotą molekulių grupę, į kurią įeina
cis- ir trans-pisceidas, cis- ir trans-resveratrolozidas, cis- ir trans-astringinas, cis- ir trans-resveratrolis, trans-pterostilbenas, trans-pinosilvinas. Stilbenams yra priskiriamas fitoaleksinų vaidmuo. Šie
junginiai augaluose susidaro veikiant aplinkos stresinėms sąlygoms, tokioms kaip nepalankios oros sąlygos, vabzdžių, gyvūnų ar patogenų atakos. Taigi, stilbenai atlieka antimikrobinį, repelentinį, antibakterinį, priešgrybelinį vaidmenį [1,2,3].
1.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai
Didžiausią resveratrolio kiekį kaupia Japoninis pelėvirkštis (lot. Fallopia japonica) – 0,524 mg/g, kuris yra naudojamas kaip komercinis resveratrolio šaltinis.Taip pat resveratrolis nustatytas žemės riešutų šaknyse, eglėse, eukaliptuose, šilkmedžio šerdyje, sausose rabarbarų šaknyse, paprastojo apynio spurguose [2,4]. Iš uogų didžiausiomis resveratrolio koncentracijomis pasižymi vynuogės, jose nustatyta resveratrolio koncentracija svyruoja nuo 0,16 iki 3,54 µg/g, džiovintoje vynuogių odelėje randamas apie 24 µg/g, mėlynėse – ~32 ng/g, šilauogėse – ~16 ng/g resveratrolio kiekis. Riešutai taip pat kaupia tam tikrą resveratrolio kiekį, pvz., pistacijos 0,09 – 1,67 µg/g, žemės riešutai 0,02 – 1,92 µg/g, termiškai apdoroti žemės riešutai ~ 5,1 µg/g. Tačiau, didžiausios jo koncentracijos yra randamos vynuose ir vynuogių sultyse. Raudonųjų vynuogių sultyse ~ 0,5 mg/l, baltųjų vynuogių sultyse ~ 0,05 mg/l, spirituotame vyne < 0,1 mg/l, baltuosiuose vynuose <0,1–2,1 mg/l, o pats didžiausias resveratrolio kiekis randamas raudonajame vyne 0,1 – 14,3 mg/l [5].
1.3. Cheminės resveratrolio savybės
Resveratrolis egzistuoja keliose izomerinėse formose: cis-resveratrolis ir trans-resveratrolis [6]. Tiek cis- tiek trans- izomeras gali būti randami laisva forma arba susijungę su gliukoze– cis- ir
trans-piscedai (1 pav.) [7]. Trans-forma izomerizacijos metu virsta cis-izomeru, veikiant
milteliai yra stabilūs prie 75 % drėgmės ir 40 °C temperatūros ore. Resveratrolio kiekis taip pat išlieka stabilus ir po fermentacijos saugant ilgą laiką, tiek vynuogių odelėse, tiek jų išspaudose [9].
1 pav. Cheminė trans- ir cis-resveratrolio ir jo gliukozidų (pisceidų) struktūra [10]
1.4. Trans-resveratrolio biosintezė augaluose
Stilbenų fitoaleksinai susiformuoja iš fenilalanino dalyvaujant fenilalanino amonio liazei (PAL), paskutiniu etapu gautą junginį katalizuojant stilbeno sintaze (STS). STS priklauso trečio tipo poliketidų sintazės fermentų šeimai. Ši fermentų klasė atsakinga už pakartotines kondensacijos reakcijas su malonil-CoA [11,12]. STS pagamina paprastus stilbenų fitoaleksinus viena fermentine reakcija su pradiniu cinamono rūgšties darinio kofermento A-esteriu (trans-resveratrolio atveju – P-kumaroil-CoA) ir trimis malonil-CoA molekulėmis [13]. Yra trys, viena po kitos sekančios kondensacijos reakcijos su malonil-CoA. Šios reakcijos sąlygoja tarpinio tetraketido žiedo užsidarymą.Taip pat, reakcijos metu susidaro 4 molekulės anglies dioksido ir 4 vienetai CoA, tai trans-resveratrolio sintezę padaro negrįžtamuoju procesu (2 pav.)[14].
Trans-resveratrolio sintezę pagreitina grybelinės infekcijos, UV spinduliuotė ir kitos nepalankios aplinkos sąlygos [15]. Trans-resveratrolio koncentracija maksimumą pasiekia maždaug po 24 valandų paveikus stresoriumi ir sumažėja po 42 – 72 valandų dėl stilbeno oksidazės aktyvacijos [16,17]. Trans-resveratrolis (3,5,4’trihidroksi-trans-stilbenas) Trans-pisceidas (trans-resveratrol-3-O-β-gliukozidas) Cis-resveratrolis (3,5,4’trihidroksi-cis-stilbenas) Cis-pisceidas (cis-resveratrol-3-O-β-gliukozidas)
2 pav. Trans-resveratrolio biosintezė [12]
1.5. Stilbenų modifikacijos augaluose
Trans-resveratrolis yra prekursoriaus molekulė ir gali dalyvauti įvairiose reakcijose augalų
ląstelėse, pvz., metoksilinimo, oligomerizacijos ar glikozilinimo (3 pav.) [18].Taip pat dalyvauja izomerizacijos (cis- ir trans- formos) ar izoprenilinimo reakcijose, kurių metu susidaro arachidinas-3 [19]. Glikozilinimas yra dažna antrinių augalų metabolitų modifikacija ir karbohidrato fragmento prisijungimas gali pakeisti hidrofiliškumą, stabilumą ir natūralių produktų biologinį aktyvumą [20].
Stresu indukuotas resveratrolio O-metiltranferazės genas (ROMT), neseniai buvo klonuotas iš vynmedžių lapų, užsikrėtusių pūkuotąja miltlige (P. Vitocola). Atitinkamas fermentas galėjo transformuoti resveratrolį į jo dimetilintą darinį tiek in vitro, tiek in planta. Iš vynuogių gauto resveratrolio sintezės genasbuvo ekspresuotas tabake, todėl transgeniniai tabako augalai tapo atsparūs kekeriniam puviniui (Botrytis cinerea), kuris yra linkęs pastoviai šį augalą infekuoti [21].
3 pav. Trans-resveratrolis yra pradinė molekulė, kuri gali būti konvertuota į pisceido, pterostilbeno ar viniferinų molekules, glikozilinimo, metoksilinimo ar oligomerizacijos reakcijų metu
1.6. Resveratrolio poveikis sveikatai
Pastaruoju metu stilbenai, o ypač resveratrolis ir jo dariniai, yra vertinami už poveikį gydant širdies ir kraujagyslių sistemos ligas, vėžinius susirgimus ar neurologinius sutrikimus, tai pat vertinami kaip labai stiprūs antioksidantai [22-24].
Resveratrolis pirmą kartą buvo išskirtas M. Takaoko iš stambiažiedžio čemerio ( lot.
Veratrum grandiflorum) 1939 metais [26]. Vėliau jo buvo rasta japoninėje plačialapėje rūgtyje (lot. Polygonum cuspidatum, dabartinis pavadinimas – japoninis pelėvirkštis (lot. Fallopia japonica)). Nuo
1992 metų susidomėjimas resveratroliu pradėjo augti, kai buvo iškelta hipotezė, kad vynas, kuriame yra resveratrolio, gali turėti apsauginį poveikį širdies ir kraujagyslių sistemai [2].
1.6.1. Resveratrolio poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Pirmiausiai resveratrolis buvo identifikuotas, kaip biologiškai aktyvus junginys, atsakingas už ,,Prancūziškąjį paradoksą“, kuris reiškia, jog šiaurės prancūzai, net ir vartodami riebų ir kaloringą maistą, turintį daug sočiųjų riebalų rūgščių, rečiau serga širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis, nei tikėtasi [27]. Iš pradžių tyrimai buvo sutelkti į resveratrolio sąveiką su kraujagyslių endoteliu ir
trombocitais, darant poveikį jų agregacijos reakcijoms. Resveratroliui priskiriami tokie kardioprotekciniai poveikiai, kaip antiaterogeninis poveikis, gebėjimas sumažinti žalos sunkumą po miokardo infarkto taip pat teigiamas poveikis kraujo lipidų kiekiui [25,28].
Nors paminėti širdies ir kraujagyslių sistemos apsauginiai poveikiai buvo priskiriami trans-resveratrolio antioksidaciniam pajėgumui, dabartiniai moksliniai tyrimai susitelkia į jo gebėjimą reguliuoti endogeninių antioksidantų fermentų ekspresiją, COX uždegiminio aktyvumo slopinimą ir azoto oksido signalizacijos ir vazodilatacijos skatinimą, aktyvuojant azoto oksido sintazę [28].
Tyrimuose dažniausiai minimi kardioprotekciniai poveikiai apima apsaugą nuo išemijos, reperfuzijos ar vazodilatacijos [29].
Arterijose, išskirtose iš sveikų vyrų riebalinio audinio, trans-resveratrolis skatina atsipalaidavimą ir to pasekoje vazodilataciją, net ir mikromolinėmis koncentracijomis [30].
2005 metais atliktame tyrime, panašius poveikius parodė išgrynintas raudonojo vyno polifenolinių junginių ekstraktas, kuris sukėlė žasto arterijos vazodilataciją išemine širdies liga sergantiems vyrams [31].
Ilgalaikis resveratrolio papildų (pagamintų iš vynuogių ekstrakto) vartojimas mažina uždegiminių žymenų įvairovę žmonėms, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis [32].
Molekuliniai mechanizmai, pagrindžiantys šiuos poveikius širdies ir kraujagyslių sistemai, apima trans-resveratrolio sąveikas su kardiomiocitais; azoto oksido signalizacijos moduliaciją kraujagyslių endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelėse, reguliuojant azoto oksido sintazės izoformas.
1.6.2. Resveratrolio vaidmuo vėžio gydyme
1997 metais atliktų tyrimų metu, paskelbta, kad paviršinis resveratrolio naudojimas leido išvengti odos vėžio vystymosi pelėms, kurios buvo veikiamos karcinogenais. Nuo to laiko, publikuota daug resveratrolio priešvėžinių tyrimų su gyvūnų modeliais. Tiriant resveratrolio priešvėžinį efektyvumą su gyvūnų modeliais stebimas nedidelis efektyvumas, dėl žemo resveratrolio biologinio prieinamumo. Didžiausias resveratrolio priešvėžinis aktyvumas stebimas, kai jis tiesiogiai gali kontaktuoti su vėžiniu susirgumu, pvz., odos ar virškinamojo trakto vėžys. Kitais atvejais, efektyvumas yra abejotinas, nors tyrimuose naudojamos ir didelės jo dozės[33].
Tyrimųmetu resveratrolis demonstruoja efektyvumą visose trijose karcinogenezės proceso fazėse – iniciacijos, vystymosi ir progresavimo. Eksperimentiniai tyrimai ląstelių kultūrose leidžia nuspėti daug resveratrolio farmakologinių poveikių mechanizmų, tokių kaip transkripcijos faktoriaus NFκB moduliacija [34], CYP450 sistemos izofermento CYP1A1 slopinimas [35], androgeninių
veiksmų pakitimai, COX fermentų ekspresijos ir aktyvumo pakitimai. Tiriant vėžinių ląstelių kultūrų linijas įrodyta, kad resveratrolis sukelia apoptozę [36].
In vivo tyrimai parodė persodintų auglių augimo sulėtėjimą [37-42].
1.6.3. Neuroprotekcinės resveratrolio savybės
2008 metais paskelbtame tyrime teigiama, kad resveratrolio papildų vartojimas žymiai sumažino aterosklerotinių plokštelių susidarymą gyvūnų smegenyse, kurios yra Alzheimerio ir kitų neurodegenaracinių ligų komponentas [43]. Pelėse, gavusiose tam tikras resveratrolio dozes per os, žymiai sumažėjo plokštelių susidarymas pagumburyje (-90%), stuburo smegenyse (-89%), medialinėje galvos smegenų žievėje (-48%).
Teoriškai, žmonėms, vartojantiems resveratrolį per os, gali sumažėti ateroskletorinių plokštelių susidarymas, susijęs su senėjimo pokyčiais smegenyse [44].
1.6.4. Resveratrolio vaidmuo diabeto gydyme
Tyrimo metu, buvo siekiama įvertinti resveratrolio gydomąjį potencialą tiriant angliavandenių apykaitos fermentų aktyvumą diabetu, sukeltu streptozocin-nikotinamidu, sergančiose žiurkėse. 30 dienų žiurkės per os gaudavo 5 mg/kg resveratrolio dozę. Gauti rezultatai rodo reikšmingą ( p<0,05 ) gliukozės kiekio ir glikozilinto hemoglobino kiekio sumažėjimą kraujyje, taip pat reikšmingą ( p<0,05 ) insulino kiekio padidėjimą kraujo plazmoje.
Pakitusi angliavandenių apykaitos fermentų veikla diabetu sergančių žiurkių kepenyse ir inkstuose, po resveratrolio vartojimo, grįžo prie beveik įprastinių normų ( p<0,05 ). Gauti rezultatai buvo lyginami su rezultatais, pavartojus standartinio antidiabetinio vaisto gliklazido.
Šie, tyrimais įrodyti moduliaciai poveikiai angliavandenių apykaitos fermentams, žada platų resveratrolio panaudojimą gydant diabetą ateityje [45].
1.6.5. Resveratrolio vaidmuo pratęsiant gyvenimo trukmę
2003 metais paskelbtoje publikacijoje teigiama, kad resveratrolis reikšmingai prailgino
prailgino ir kirmėlės Caenorhabditis elegansir vaistinės muselės Drosophila melanogaster gyvenimo trukmes [47].
2006 metais gyvenimo trukmės tyrimas buvo atliktas su žuvimi Nothobranchius furzeri, turinčia vidutinę 9 savaičių gyvenimo trukmę. Tyrimo rezultatai parodė, kad maksimali resveratrolio dozę gyvenimo trukmę prailgino 56 %, lyginant su kontroline žuvimi [48].
Kalbant apie maisto papildų vartojimą – 200 mg dozė yra laikoma žemiausia efektyvia paros doze, remiantis pirmaisiais klinikiniais tyrimais atliktais su žmonėmis ar tyrimais su gyvūnais [49-51].
1.7. Resveratrolio absorbcija, metabolizmas, bioprieinamumas
1.7.1. AbsorbcijaCheminė resveratrolio struktūra sąlygoja prastą tirpumą vandenyje (< 0,05 g/ml). Ši savybė veikia ir resveratrolio absorbciją. Norint padidinti resveratrolio tirpumą, gali būti naudojamas etanolis ar kiti organiniai tirpikliai.
Hidroksilo grupių, turinčių alifatines molekules, esterinimas taip pat gali būti naudojamas kaip įrankis norint padidinti resveratrolio absorbciją žarnyne ir ląstelinį pralaidumą. Pvz., resveratrolio molekulės acetilinimas gali padidinti jo absorbciją, nesumažindamas aktyvumo [52,53]. Žarnyne resveratrolis absorbuojamas pasyvios difuzijos būdu arba suformuodamas kompleksus su membranų transportiniais baltymais, pvz., integrinais. Po patekimo i kraujotaką resveratrolis gali būti randamas trijų skirtingų formų; grynas, gliukuronido ar sulfato formos.Laisvas resveratrolis gali jungtis su plazmos baltymais albuminais ar mažo tankio lipoproteinais (MTL) [54].
Pastarieji in vitro tyrimai parodė, kad daugiau nei 90 % laisvo trans-resveratrolio jungiasi su žmogaus plazmos lipoproteinais. Šis procesas taip pat buvo pastebėtas ir in vivo, kai polifenoliniai junginiai buvo nustatyti iš sveikų savavanorių kraujo mėginių izoliuotuose mažo tankio lipoproteinuose (MTL) [55].
1.7.2. Metabolizmas
II fazės resveratrolio metabolizmas vyksta kepenyse. Dėl enterohepatinio transporto tulžyje, galimas tam tikrų ciklų grįžimas į plonąjį žarnyną [56]. Be to, trans-resveratrolis yra pajėgus sukelti savo patie metabolizmą, didindamas II fazės kepenų detoksikuojančių fermentų aktyvumą [57]. Trans-resveratrolio metabolizmo metu susidaro konjuguoti sulfatai ir gliukuronidai (4 pav.), kurie išsaugo tam tikrą trans-resveratrolio biologinį aktyvumą [58]. Taip pat susidaro penki skirtingi metabolitai
šlapime: resveratrolio monosulfatas, dvi resveratrolio monogliukuronido izomerinės formos, monosulfato dihidroresveratrolis ir monogliukuronido dihidroresveratrolis [59].
Kiti, su maistu gauna flavanoidai, tokie kaip kvercetinas, gali inhibuoti resveratrolio sulfatinimą ir gliukuronidaciją kepenyse ir dvylikapirštės žarnos audiniuose, ir taip padidinti resveratrolio biologinį prieinamumą [60].
4 pav. Trans-resveratrolio metabolitai
1.7.3. Biologinis prieinamumas
Resveratrolis pasižymi lipofilinėmis savybėmis, dėl šių priežasčių gali būti pasiekta didelė absorbcija. Tačiau, svarbu paminėti, jog resveratrolio absorbcija gali skirtis priklausomai nuo vartojamo maisto [61]. Žemas biologinis resveratrolio prieinamumas yra veiksnys, galintis sumažinti jo efektyvumą. Nors in vitro tyrimai rodo didelį ir biologiškai naudingą resveratrolio efektyvumą ląstelėms, nors yra žinoma, jog jo pasiskirstymas audiniuose yra gana mažas. Todėl in vitro tyrimai turėtų būti interpretuojami atsargiai, kai norima šiuos rezultatus ekstrapoliuoti in vivo tyrimuose.
Tačiau, nors biologinis prieinamumas yra žemas, resveratrolis rodo ir in vivo efektyvumą. Tai būtų galima paaiškinti sulfatų ir gliukuronidų virtimu atgal į resveratrolį tiksliniuose organuose, pvz., kepenyse [60,62]. Kitas paaiškinimas galėtų būti resveratrolio metabolitų enterohepatinė recirkuliacija ir vėlesnis jų susijungimas plonojoje žarnoje ir reabsorbcija [63]. Galiausiai, in vivo efektai, galėtų būti paaiškinti resveratrolio metabolitų aktyvumu.
Cis-formos virtimas gliukuronidu yra greitesnis procesas nei trans-izomero ir trunka 5-10
1.8. Analitinių metodų taikymas resveratrolio nustatymui
Susidomėjimas resveratroliu davė pradžią įvairių analitinių metodų vystymuisi, ypač jo nustatymui vyne. Metodai, sukurti resveratrolio nustatymui, dažniausiai yra tinkami trans-formos analizei. Abiejų izomerų nustatymui metodikų yra ženkliai mažiau. Tokie mėginio paruošimo būdai, kaip skysčių-skysčių ar kietafazė ekstrakcija, paprastai yra reikalingi prieš chromatografinį atskyrimą, dėl sudėtingos vyno matricos. Tačiau tokios mėginių paruošimo procedūros yra sudėtingos ir užima daug laiko, taip pat reikalingi dideli tirpiklių ir mėginių kiekiai. Kaip alternatyva yra naudojama kietafazė mikroekstrakcija, kurios metu mėginio paėmimas, jo ekstrakcija, koncentravimas ir bandinio įvedimas apsiriboja vienu žingsniu. Šio metodo naudojimas sąlygoja daug privalumų, tokių kaip supaprastintas mėginio paruošimas, padidėjęs patikimumas, selektyvumas, jautrumas ir sumažėjęs analizės laikas ir išaidos.
Kiekybiniam resveratrolio nustatymui dažnai taikomi tokie metodai, kaip efektyvioji skysčių chromatografija su UV detekcija, ESC su fluorescencine detekcija, ESC su elektrochemine detekcija ar ESC su masių spektro detekcija [64].
Dujų chromatografijos taikymas, resveratrolio nustatymui itališkuose raudonuose vynuose
Dar 1996 metais publikuotame straipsnyje, mokslininkai tyrimui pasirinko 25 skirtingų metų ir skirtingų vyndarių vyno pavyzdžius.
Prieš analizę buvo vykdoma kietafazė vyno mėginių ekstrakcija. Kaip vidinis standartas buvo pasirinktas heksakozanas. 1 ml vyno ekstrakto buvo pridėta 100 µl heksakozano standartinio tirpalo ir džiovinta azoto srautu. Resveratrolis buvo silinamas su 100 µl bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamidu (BSFTA) 60 minučių vandens vonelėje, 60°C temperatūroje. Pasiruošimo metu, ekstraktai buvo apsaugoti nuo šviesos, siekant apriboti trans-resveratrolio izomerizaciją į cis-formą.
Trans-resveratrolio pikas identifikuojamas, remiantis standarto heksakozano sulaikymo laiku,
gautu iš duomenų bazės. Tyrimui naudotas HRGC 5300 Mega Series dujų chromatografas. Detekcijai naudotas liepsnos jonizacijos detektorius (300°C). Kapiliarinė kolonėlė Crossbond SE-52 25 m ilgio, 0,25 mm vidinio skermens. Kolonėlėje palaikoma 200 – 290 °C temperatūra. Atsiskyrimo santykis 1:5. Kaip pernešančios dujos naudotas vandenilis, tėkmės greitis 0,6 ml/min. 5 pav. pavaizduota tipiška cis- ir trans-resveratrolio chromatograma. Gauti resveratrolio kiekai vyne varijavo nuo 0,64 iki 3,00 mg/l [65].
5 pav. Cis- ir trans-resveratrolio chromatograma, gauta dujų chromatografijos analizės metu [65]
Resveratrolio raudonajame vyne nustatymas, atliekant kietafazę ekstrakciją su derivatizacija ir taikant daugiamatę dujų chromatografiją
2008 metais Jungtinių Amerikos Valstijų mokslininkai, trans-resveratrolio nustatymui sukūrė naują metodą, kadangi vyne trans-resveratrolio koncentracijos yra labai mažos ir šis polinis junginys pasižymi menku lakumu, dėl šių priežasčių junginį sunku išskirti ir dujų chromatografinėje kolonėlėje atskirti, nenaudojant derivatizacijos. Šiame tyrime aprašomas trans-resveratrolio nustatymo metodas buvo išvystytas naudojant kietafazę mikroekstrakciją ir derivatizaciją silinimo metodu. Siekant tobulesnio junginių atskyrimo panaudota daugiamatė dujų chromatografija su masių spektro detekcija (GS-MS).
Analizei buvo naudojama daugiamatė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos sistema su dvejomis kolonėlėmis. Nepolinė priekolonėlė 12 m ilgio, 0,53 mm vidinio skersmens, 1µm plevelės storio, su 5%fenilmetilpolisiloksano stacionaria faze.Kita naudota kolonėlė buvo vidutiniškai polinė 30 m ilgo, 0,53 mm vidinio skersmens lydyto kvarco kapiliarinė kolonėlė padengta 50% fenilmetilpolisiloksano stacionaria faze,1µm plevelės storio.
Nesančios dujos – helis. Helio tėkmės greitis 35 ml/min, oro srauto tėkmės greitis 350 ml/min. Pagalbinių dujų – azoto, tėkmės greitis 10 ml/min.
Kaip buvo minėta anksčiau, trans-resveratrolis yra labai polinis junginys, o jo lakumas mažas,
cis-resveratrolio atveju – poliškumas yra mažesnis, nei trans-formos [64]. Derivatizacija gali padidinti
bei detekciją. Yra trys skirtingos derivatizacijos procedūros, kurios taikomos kietafazėje mikroekstrakcijoje. Tai yra tiesioginė derivatizacija, derivatizacija ant kietafazės mikroekstrakcijos pluošto ir derivatizacija dujų chromatografo injektoriaus angoje [66].
Šiame tyrime naudota derivatizacija ant kietafazės mikroekstrakcijos pluošto. Derivatizuojantis reagentas resveratroliui –bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamidu (BSTFA). Silinimas ant pluošto atliktas iškart po tiesioginės kietafazės mikroekstrakcijos. Vėliau pluoštas su išekstrahuotais junginiais, įskaitant resveratrolio izomerus, perkeliamas į 4 ml talpos sandarų buteliuką, kur yra veikiamas derivatizacijos reagentu (BSTFA) garų fazėje. Po 20 minučių derivatizacijos, pluoštas ištraukiamas su adata ir nedelsiant talpinamas į dujų chromatografo injetoriaus angą prie 208 ºC temperatūros 10 minučių. 6 pav. pateiktacis- ir trans-resveratrolio-BSTFA junginių atsiskyrimo chromatograma.
6 pav. Tyrimo metu gauta resveratrolio izomerų chromatograma [64]
Koncentracijų intervale nuo 10 ng/l iki 5 mg/l nubrėžta kalibracinė kreivė ir gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos koeficientu R=0,9996. Vidutinis trans-resveratrolio atkuriamumas raudonajame vyne buvo 83,6±5,6 %.
Tyrimui buvo pasirinkti 6 raudonojo vyno pavyzdžiai. Juose trans-resveratrolio koncentracija svyravo nuo 12,72 iki 851,9 µg/l [64].
Trans-resveratrolio kiekio įvertinimas augaliniuose ekstraktuose ir įvairiose farmacinėse formose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu
Išvystytas ir validuotas paprastas, jautrus ir tikslus efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas, kiekybiniam trans-resveratrolio nustatymui iš Polygonum cuspidatum šaknų sausojo ekstrakto ir tablečių ir kapsulių farmacinių formų.
Atskyrimas atliktas ant aliumininių plokštelių, padengtų stacionaria faze – silikageliu. Judančioji fazė susidarė iš chloroformo – etilacetato – skruzdžių rūgšties (2,5:1:0,1). Densitometrinė
trans-resveratrolio analizė atlikta prie 313 nm šviesos bangos ilgio. Tokia tirpiklių sistema lėmė ryškią
trans-resveratrolio dėmę (Rf reikšmė 0,40 ± 0,03).
Gautas geras (koreliacijos keoficientas 0,9989) tiesinės regresijos santykis tarp piko ploto ir koncentracijos (koncentracijų intervale [0,5 µg/dėmėje – 3,0 µg/dėmėje]). Aptikimo riba 9 ng/dėmėje, o nustatymo riba 27 ng/dėmėje.
Ant silikagelio plokštelės buvo užlašintas tikslus 5µl tiriamojo mėginio kiekis. Gautas kiekis lyginamas su standarto trans-resveratrolio. Tyrimo rezultatai pateikiami 1.11 skyriuje [67].
1.9. Trans-resveratrolio kiekio įvairavimas komerciniuose vynuose
2015 metais Gruzijoje atlikto tyrimo metu, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ištirti 26 raudoni komerciniai vynai iš kelių skirtingų Gruzijos regionų, Čekijos, Prancūzijos, Italijos ir Austrijos. Tyrimui buvo parinkti Pinot Noir (n=5), Cabernet Sauvignon (n=7), Cabernet Moravia (n=2), Seperavi (n=9), Saperavi ir Saperavi Budeshuriseburi vynuogių mišinio (n=2), Alexandrouli (n=1) vynuogių veislių vynai. Rezultatai, atitinkantys atlikto tyrimo kriterijus (vynuogės rūšis, regionas) pateikiami 1 lentelėje.
Apibendrinant visą tyrimą, buvo nustatyta jog didžiausiu trans-resveratrolio kiekiu pasižymi Centrinėje Europoje kultivuojamų vynuogių vynai – 5,22 ± 2,65 µg/ml. Vakarų Europoje užaugintų vynuogių vynai turi mažesnę trans-resveratrolio koncentraciją, t.y. 2,88±1,63 µg/ml. O mažiausią koncentraciją turi Gruzijoje kultivuojamų vynuogių vynai – 1,56 ±1,53 µg/ml [68].
1 lentelė. Trans-resveratrolio koncentracija tirtuose vynuose
Vynuogės rūšis Kilmė/ regionas Trans-resveratrolio koncentracija µg/ml
Saperavi, 2004 Kakheti regionas, Gruzija 0,34
Saperavi, 2006 Kakheti regionas, Gruzija 1,14
Saperavi, 2007 Kakheti regionas, Gruzija 0,8
Saperavi, 2009 Kakheti regionas, Gruzija 0,32
Saperavi, 2010 Kakheti regionas, Gruzija 1,24
2011 metais Gruzijoje atliktame tyrime, Saperavi vynuogių veislės odelėje buvo nustatytas net 6,67 mg/100 g trans-resveratrolio kiekis. Tirtuose Kindzmarauli buveinėje augančių Saperavi vynuogių odelių mėginiuose buvo nustatytas 3,52 mg/100 g kiekis [69].
1.10. Resveratrolio kiekio įvairavimas maisto papilduose
2005 metais, Indijoje atlikti tyrimo metu, efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu buvo tirti 5 resveratrolio preparatai.
Tirtuose mėginiuose nustatytas trans-resveratrolio kiekis nežymiai skyrėsi, nuo deklaruojamo ant maisto papildo pakuotės. Tabletėse kiekis svyravo nuo 93,9 %iki 94,65 %, o kapsulėse nuo 94,3 % iki 97,0 %. Atsižvelgiant į tyrimo rezultatus, galima daryti išvadą, kad visi tirti produktai buvo kokybiški [67, 70].
2012 metais, Italijoje atlikto kiekybinio tyrimo metu, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, nustatytas trans-resveratrolio kiekis keturiolikoje maisto papildų.Tyrimo imtis apima tiek gryno resveratrolio kapsules, tiek sudėtines formuluotes, su standartizuotais trans-resveratrolio kiekiais. Šio tyrimo metu buvo nustatyta, kad tik penki iš keturiolikos resveratrolio maisto papildų turėjo artimas reikšmes Geros Gamybos Praktikos (GGP) reikalavimuose nustatytoms aktyviosios medžiagos kiekio reikšmėms (95,0 – 105,0 %). Trys iš penkių papildų buvo autorizuoti JAV Maisto ir Vaistų Administracijos Agentūros (FDA) ir gaminami pagal GGP reikalavimus. 4 produktai buvo šiek tiek už reglamentuojamo intervalo ribų (83,0 – 111 %). 3 produktuose nustatytas trans-resveratrolio kiekis pateko į 8,0 – 64,0% intervalą, o dviejuose produktuose nustatytas trans-resveratrolio kiekis, buvo žemiau aptikimo ribos (LoD) [71].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Maisto papildų analizei buvo naudoti šie resveratrolio papildai: Resveratrol 200 µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija), Resverasor 200 µg/tab., Soria Natural (Ispanija), Your vitality Resveratrol 100 mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva), Evelor 50 mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija), VIVI Line 24 mg/kaps., OlainFarm (Latvija), Resveratrol 100 mg/kaps., Swanson Health Products (JAV). Vyno analizei naudoti devyni skirtingų gamintojų Lietuvos rinkai teikiami komerciniai ir vienas namų gamybos vynas: Sangiovese/Montepulciano (Les Grands Chais, 2014, Prancūzija), Cabernet sauvignon (Calvet Reserve Bordeaux 2012, Prancūzija), Tempranillo (Torrelavit, 2013, Ispanija), Cabernet sauvignon (Concha x Toro, 2014, Čilė), Tempranillo (Freixenet, 2013, Ispanija), Garnacha (Torres, 2013, Ispanija), Saperavi (Tbilvino, Kindzmarauli, 2013, Gruzija), Voruta (Lietuva), Aronijų vynas (Lietuva), naminis vynuogių vynas (Lietuva).
2.1.1. Tyrimui naudotų maisto papildų sudėtis
Resveratrol 200 µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija).Sudėtis: 2,5 mg vynuogių ekstrakto, kuriame 200 µg trans-resveratrolio, sorbitolis, riebalų rūgščių magnio druskos.
Resverasor 200 µg/tab., Soria Natural (Ispanija).Sudėtis: 450 mg sausų Vitis vinifera sėklų ir odelių sulčių, kuriose 200 µg trans-resveratrolio, ryžių krakmolas, mikrokristalinė celiuliozė.
Your vitality Resveratrol 100 mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva).Sudėtis: trans-resvertarolio, gauto iš Polygonum cuspidatum šaknų sausojo ekstrakto 100 mg, vynuogių sėklų ekstraktas, mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas, želatina, vanduo.
Evelor 50 mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija).Sudėtis: 50 mg trans-resveratrolio, gauto iš Polygonum cuspidatum šaknų sausojo ekstrakto, laktozė, sojų pupelių milteliai, kukurūzų krakmolas, silicio dioksidas, magnio stearatas, želatina.
VIVI Line 24 mg/kaps., OlainFarm (Latvija).Sudėtis: 24 mg trans-resveratrolio, gauto iš
Polygonum cuspidatum šaknų sausojo ekstrakto, mėlynių ekstraktas, kakavos ekstraktas,
žaliosios arbatos ekstraktas, Vitis vinifera sėklų ekstraktas 32 mg, kvercetinas, likopenas, želatina.
Resveratrol 100 mg/kaps., Swanson Health Products (JAV).Sudėtis: trans-resveratrolio (gauto iš Polygonum cuspidatum šaknų sausojo ekstrakto) 100 mg, magnio stearatas, silicio dioksidas, mikrokristalinė celiuliozė, želatina.
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
2.2.1. Tyrimui naudota įrangaTyrimui naudota chromatografinė sistema ,,Waters Alliance 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi ,,Waters 996‘‘. Kolonėlė ACE C18, 250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, porų dydis 5 µm. Ekstrakcijos kasetės ,,Oasis HLB 1cc “ (30 mg, Waters Corporation, Milford, JAV).
2.2.2. Tyrimui naudoti reagentai
Tyrimui naudotas standartizuotas trans-resveratrolis (≥98%, Alfa Aesar, JAV). Metanolis (≥99,9%, Sigma-Aldrich, Vokietija), acetonitrilas (99,8%, Sigma-Aldrich, Vokietija), acto rūgštis (≥99%, Sigma Aldrich, Vokietija). Dejonizuotas vanduo paruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema ,,Millipore“ (JAV).
2.2.3. Tyrimo sąlygos
Binarinis gradientas susidarė iš tirpiklių: A: acetonitrilas - acto rūgštis - vanduo (20:2:78 v/v) ir B: acetonitrilas - acto rūgštis - vanduo (90:2:8 v/v). Gradientinio eliuento sudėties kitimas pateikiamas 2 lentelėje.
2 lentelė. Gradientinio eliuento sudėties kitimas
Laikas (min) Judančioji fazė A (proc. v/v) Judančioji fazė B (proc. v/v)
8 100 → 90 0 → 10 12 90 → 85 10 → 15 10 85 → 70 15 → 30 5 70 → 50 30 → 50 50 50 → 0 50 → 100 2 0 100
Kolonėlė termostatuojama 25 °C temperatūra. Mobilios fazės tekėjimo greitis: 1,0 ml/min. Injekcijos tūris: 10 µl.
Detekcija: trans-resveratrolio aptikimui naudojamas 305,0 nm šviesos bangos ilgis. Sulaikymo laikas: apie 13 min
Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) programinė įranga.
2.2.4. Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas iš standartizuoto trans-resveratrolio (≥98%). Pasverta (tikslus kiekis) 20 mg. Milteliai suberti į 10 ml matavimo kolbą, tirpinami 5 ml metanolio ir skiedžiami distiliuotu vandeniu iki žymos. Paruoštas etaloninis tirpalas supilamas į tamsaus stiklo buteliuką ir laikomas šaldytuve.
2.2.5. Mėginių paruošimas analizei
2.2.5.1. Maisto papildų mėginių paruošimas: kapsulės
Vienos kapsulės turinys suberiamas į 100 ml tūrio matavimo kolbutę. Tirpinamas 30 ml metanolio ir skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 100 ml žymos. Tirpalas filtruojamas per membraninius 0.45 µm porų skersmens filtrus. Imamas 1 ml šio paruoštos tirpalo ir skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 10 ml žymos. Paruoštas tirpalas tiesiogiai analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.2.5.2. Maisto papildų mėginių paruošimas: tabletės
Tabletės susmulkinamos grūstuvėlėje. Atsveriamas tikslus 3 tablečių svoris (n=3). Disperguotos tabletės suberiamos į 100 ml tūrio matavimo kolbutę. Tirpinamos 30 ml metanolio ir skiedžiamos distiliuotu vandeniu iki 100 ml žymos. Paruoštas tirpalas filtruojamas per membraninius 0.45 µm porų skersmens filtrus ir tiesiogiai analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.2.5.3. Vyno mėginių paruošimas
Kietafazės ekstrakcijos kasetės ,,Oasis HLB“ pirmiausiai kondicionuojamos 1 ml metanolio ir išplaunamos 5 ml distiliuoto vandens ir išdžiovinamos oro srove. Vynai analizuojami iškart po butelio atidarymo. 5 ml vyno mėginys leidžiamas į ekstrakcijos kasetes. Veikliosios medžiagos išplaunamos 1 ml metanolio. Gautas tirpalas skiedžiamas iki tikslaus tūrio (1 ml). Paruoštas tirpalas tiesiogiai analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Metodikos validacija
Metodikos validacijai atlikti, naudoti šie parametrai:
Specifiškumas (angl. Specificity)
Tiesiškumas (angl. Linearity)
Glaudumas (preciziškumas). Glaudumą sudaro pakartojamumo (angl. Repeatability) ir atkartojamumo (angl. Reproducibility) parametrai
Aptikimo (angl. LoD – limit of detection) ir nustatymo (angl. LoQ – limit of quantification) ribos
3.1.1. Metodikos specifiškumas
Norint įrodyti metodikos specifiškumą lyginamos tiriamųjų ir etaloninių tirpalų chromatogramos, vertinami sulaikymo laikai ir UV šviesos absorbcijos spektrai. 7 pav. pateikta etaloninio resveratrolio tirpalo chromatograma. 3 lentelėje pateikiami etaloninio trans-resveratrolio tirpalo duomenys. 4 lentelėje pateiktos trans-trans-resveratrolio sulaikymo trukmės skirtinguose preparatuose ir vyno mėginiuose.
3 lentelė. Etaloninio trans-resveratrolio tirpalo sulaikymo laikas, plotas po kreive, koncentracija Piko pavadinimas Sulaikymo laikas
(min)
Plotas Koncentracija (mg/ml)
Trans-resveratrolio
etalonas
13,719 35130376 0,440
7 pav. Etaloninio trans-resveratrolio tirpalo chromatograma
Trans-resveratrolio
sulaikymo laikas 13,719 min.
4 lentelė. Trans-resveratrolio sulaikymo trukmės skirtinguose mėginiuose
Mėginio pavadinimas Sulaikymo trukmė (min)
Resveratrol 200 µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija) 13,202 Resverasor 200 µg/tab., Soria Natural (Ispanija) 13,226 Your vitality Resveratrol 100 mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva) 13,205 Evelor 50 mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija) 13,196
VIVI Line 24 mg/kaps., OlainFarm (Latvija) 13,209
Resveratrol 100 mg/kaps., Swanson Health Products (JAV) 13,209 Sangiovese/Montepulciano (Les Grands Chais, 2014, Prancūzija) 13,226 Cabernet sauvignon (Calvet Reserve Bordeaux, 2012, Prancūzija) 14,502
Tempranillo (Torrelavit, 2013, Ispanija) 13,226
Cabernet sauvignon (Concha x Toro, 2014, Čilė) 13,115
Tempranillo (Freixenet, 2013, Ispanija) 13,473
Garnacha (Torres, 2013, Ispanija) 14,901
Saperavi (Kindzmarauli, 2013, Gruzija) 13,226
Voruta (Lietuva) 14,218
Aronijų vynas (Lietuva) 14,756
Naminis vynuogių vynas (Lietuva) 14,101
Vidurkis 13,624
Lyginant etalono trans-resveratrolio ir mėginių sulaikymo trukmes (13,719 ir 13,624 min.), darome išvadą, jog jie sutampa.
Taip pat lyginami etalono ir tiriamosios medžiagos UV šviesos absorbcijos spektrai. Palyginimui pasirinkti etaloninio trans-resveratrolio, Vivi Line maisto papildo ir Calvet Reserve Bordeaux (Merlot/Cabernet sauvignon, 2012, Prancūzija) vyno spektrai (8-10 pav.).
9 pav. Vivi Line OlainFarm maisto papildo UV šviesos absorbcijos spektras
10 pav. Calvet Reserve Bordeaux (Cabernet sauvignon, 2012, Prancūzija) vyno UV šviesos absorbcijos spektras
Kadangi sutampa etalono ir tiriamųjų preparatų sulaikymo trukmės ir UV absorbcijos spektrai, galime teigti kad specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.
3.1.2. Tiesiškumas
Tiesiškumas buvo vertinamas analizuojant skirtingų koncentracijų trans-resveratrolio standartinius tirpalus intervale nuo 0,00391 mg/ml iki 0,125 mg/ml. Kalibracinės kreivės lygtis Y=7,974971e+0,07. Gauta tiesinė priklausomybė su koreliacijos keoficientu R=0,999945 (Žr. 5 lentelę). 11 pav. pateikiama kalibracinė kreivė.
5 lentelė. Etaloninio trans-resveratrolio tirpalo tiesiškumo parametrai Analitė Sulaikymo laiko
vidurkis Kereliacijos keoficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Trans-resveratrolis 14,498 0,999945 Y=7,974971e+0,07 0,00391-0,125
11 pav.Trans-resveratrolio kalibracinė kreivė
Kalibracinės kreivės koreliacijos keoficientas ˃0,99. Tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas
3.1.3. Glaudumas (preciziškumas)
Metodo glaudumui (preciziškumui) įvertinti apskaičiuotas rezultatų, gautų analizės metu, pakartojamumas bei atkuriamumas. Pakartojamumas (angl. Repeatability) parodo rezultatų tikslumą analizę atliekant tą pačią dieną tokiomis pačiomis sąlygomis. Pakartojamumo tyrimui penkis kartus injekuotas trans-resveratrolio etalonas (12 pav.). Atkuriamumas (angl. Reproducibility) išreiškia rezultatų tikslumą esant toms pačioms analizės sąlygoms per ilgesnį laiko tarpą, t.y. dvi skirtingas dienas (13 pav.). Pakartojamumas ir glaudumas įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Santykinis standartinis nuokrypis, dar vadinamas variacijos koeficientu (angl. RSD) – tai standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykis, kuris yra išreikštas procentais. SSN vertė nėra tiksliai apibrėžta, tačiau kiekybinio tyrimo atveju turėtų būti ≤5 proc. Trans-resveratrolio analičių sulaikymo laikas pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimuose kito nuo 13,719 min. iki 13,734 min. ir nuo 13,719 min. iki 13,868 min., atitinkamai (6,7 lentelės). Analičių SSN ir sulaikymo laikui, ir smailės plotui neviršijo aukščiau nurodytos 5 proc. normos kiekybiniam tyrimui.
12 pav. Trans-resveratrolio pakartojamumas
6 lentelė. Analizuojamų etaloninių trans-resveratrolio tirpalų pakartojamumo variacijos keoficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė
Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Trans-resveratrolis 0,0 1,8
7 lentelė. Analizuojamų etaloninių trans-resveratrolio tirpalų atkuriamumo variacijos keoficientas sulaikymo laikui ir smailės plotui
Analitė
Santykinis standartinis nuokrypis (proc.) Sulaikymo laikui Smailės plotui
Trans-resveratrolis 0,5 4,0
3.1.4. Trans-resveratrolio aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ) ribos
Aptikimo riba (angl. LoD – limit of detection) – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, tačiau nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Remiantis ICH gairėmis, vertinant aptikimo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 3 arba 2:1.
Nustatymo riba (angl. LoQ – limit of quantification) – tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose. Vertinant nustatymo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 10:1 (8 lentelė).
8 lentelė. Trans-resveratrolio aptikimo ir nustatymo ribos
LoD (µg/ml) LoQ (µg/ml)
Trans-resveratrolis 0,125 0,419
3.2. Resveratrolio maisto papildų ir vyno pavyzdžių analizės rezultatai
Darbe siekiama įvertinti įvairių resveratrolio preparatų kiekybnę sudėtį ir ją palyginti su deklaruojama ant maisto papildo pakuotės. Taip pat įvertinti trans-resveratrolio kiekį raudonajame komerciniame vyne.
3.2.1. Kokybinis trans-resveratrolio įvertinimas
Eksperimentinių tyrimų metu, pagal sulaikymo laikus ir spektrų atitikimus identifikuotas junginys trans-resveratrolis. Trans-resveratrolio standartinių tirpalų sulaikymo laikų vidurkis 13,498 min. Trans-resveratrolio sulaikymo laikai pateikti 4 lentelėje. Sulaikymo laikas varijavo nuo 13,196 iki 14,901 min.
Iš 9 tirtų komercinių raudonųjų Lietuvos rinkai tiekiamų vynų, (7 Europos, 2 Lietuvos, 1 Pietų Amerikos vyndarių) ir 1 namų gamybos raudonųjų vynuogių vyno – trans-resveratrolis nustatytas visuose dešimt mėginių ir jo kiekis viršija aptikimo ribą, kuri yra 0,125 µg/ml.
Visi šeši tyrimui pasirinkti maisto papildai taip pat atitiko kokybinio tyrimo parametrus ir visuose preparatuose nustatytas trans-resveratrolis, atsižvelgiant į analitės sulaikymo laiką bei spektro atitikimą, lyginant su standartiniu trans-resveratrolio tirpalu.
3.2.2. Kiekybinis trans-resveratrolio įvertinimas
Trans-resveratrolio tirpalų paruošimas kalibracinei kreivei sudaryti
Mėginiuose esančio trans-resveratrolio kiekui nustatyti parinktas gradavimo grafiko metodas. Atsverta 1,25 mg (tikslus svoris) trans-resveratrolio miltelių ir ištirpinta 5 ml metanolio ir praskiesta distiliuotu vandeniu iki 10 ml žymos (tirpalas F). Kalibracinei kreivei sudaryti atlikti standartinio tirpalo F skiedimai (9 lentelė). 1 ml tirpalo F skiedžiamas 1 ml metanolio ir vandens mišiniu, gaunamas tirpalas E. Kiti tirpalai D, C, B ir E skiedžiami analogiškai. Trans-resveratrolio kalibracinė kreivė nubrėžta per 6 taškus.
9 lentelė. Standartinių tirpalų ruošimas kalibracinės kreivės sudarymui
Tirpalas A Tirpalas B Tirpalas C Tirpalas D Tirpalas E Tirpalas F Koncentracija
(mg/ml)
0,00391 0,007813 0,015625 0,03125 0,0625 0,125
Trans-resveratrolio kiekio nustatymas maisto papilduose
Tyrimui pasirinkti šeši maisto papildai, savo sudėtyje turintys trans-resveratrolio. Deklaruojamas trans-resveratrolio kiekis papilduose varijuoja nuo 0,2 mg iki 100 mg.
Maisto papildas: Resveratrol 200µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija)
14 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas Resveratrol 200µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija) preparate.
14 pav. Resveratrol 200µg/tab., Yves Ponroy (Prancūzija) maisto papildo chromatograma
Maisto papildas: Resverasor200µg/tab., Soria Natural (Ispanija)
15 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas Resverasor 200µg/tab., Soria Natural (Ispanija) preparate.
15 pav. Resverasor 200µg/tab., Soria Natural (Ispanija) maisto papildo chromatograma Maisto papildas: Your vitality Resveratrol 100mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva)
16 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas Your vitality Resveratrol 100mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva) preparate.
16 pav. Your vitality Resveratrol 100mg/kaps., Gamtos namai (Lietuva) maisto papildo chromatograma
Maisto papildas: Evelor 50mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija)
17 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas Evelor 50mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija) preparate.
17 pav. Evelor 50mg/kaps., Agetis supplements LTD (Graikija) maisto papildo chromatograma
Maisto papildas: VIVI Line 24mg/kaps., OlainFarm ( Latvija)
18 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas VIVI Line 24mg/kaps., OlainFarm ( Latvija) preparate.
18 pav. VIVI Line 24 mg/kaps., OlainFarm ( Latvija) maisto papildo chromatograma
Maisto papildas: Resveratrol 100mg/kaps, Swanson Health Products (JAV)
19 pav., chromatogramoje pateiktas trans-resveratrolio pikas ir sulaikymo laikas Resveratrol 100mg/kaps, Swanson Health Products (JAV) preparate.
19 pav. Resveratrol 100mg/kaps, Swanson Health Products (JAV) maisto papildo chromatograma
3.2.3. Deklaruojamo ir nustatyto trans-resveratrolio kiekio procentinė išraiška
10 lentelė. Maisto papildų analizės rezultatai Maisto papildas Deklaruojamas kiekis 1
kaps./tab. Nustatytas kiekis 1 kaps./tab. Procentinė dalis Resveratrol, Yves Ponroy, Prancūzija 200 µg 99,8 µg 49,9 % Resverasor, Soria Natura, Ispanija 200 µg 200 µg 100 %
Your vitality, Gamtos namai, Lietuva
Evelor, Agetis supplements, Graikija 50mg 47,5 mg 95,0 % ViviLine, OlainFarm, Latvija 24 mg 10,2 mg 42,5% Resveratrol, Swanson Health Products, JAV
100 mg 97,5 mg 97,5 %
3.2.4. Trans-resveratrolio kiekio maisto papilduose deviacijos reikšmės
11 lentelė. Trans-resveratrolio deviacijos reikšmės maisto papilduose
Maisto papildas Deviacija,%
Resveratrol, Yves Ponroy, Prancūzija -50,1
Resverasor, Soria Natura, Ispanija 0
Your vitality, Gamtos namai, Lietuva -56,8
Evelor, Agetis supplements, Graikija -5,0
ViviLine, OlainFarm, Latvija -57,5
Resveratrol, Swanson Health Products, JAV -2,5
Atlikus, pasirinktų maisto papildų, kiekybinį tyrimą nustatyta, kad trans-resveratrolio kiekis juose, lyginant su gamintojų deklaruojamu ant maisto papildo pakuotės, viename iš papildų nesiskiria, dviejuose papilduose skiriasi mažiau kaip 5 %, trijuose – skiriasi daugiau kaip 50 % (11 lentelė).
2005 metais, Indijoje atliktame resveratrolio papildų tyrime nustatyta, kad visuose penkiuose tirtuose papilduose resveratrolio kiekis nežymiai skyrėsi nuo deklarruojamo ant maisto papildo pakuotės. Keturiuose mėginiuose iš penkių, resveratrolio kiekis skyrėsi ~6 % (5,35 %–6,1 %), o viename mėginyje tik 3 % [69,70].
2012 metais, Italijoje atlikto resveratrolio preparatų tyrimo metu iš keturiolikos maisto papildų tik penki preparatai turėjo artimas reikšmes GGP reikalavimuose nustatytoms aktyviosios medžiagos kiekio reikšmėms (95 – 100 %), keturi produktai buvo šiek tiek už reglamentuojamo intervalo ribų (83,0 – 111 %), trijuose produktuose nustatytas trans-resveratrolio kiekis pateko į 8,0 – 64,0 % intervalą, o dviejuose produktuose nustatytas trans-resveratrolio kiekis, buvo žemiau aptikimo ribos (LoD) [71].
Mūsų tyrime gauti kiekybinės analizės rezultatai, kardinaliai nesiskiria nuo užsienio šalyse atliktų resveratrolio papildų tyrimų rezultatų, kadangi maisto papildams gaminti buvo naudojamos tos pačios žaliavos kaip ir mūsų pasirinktuose preparatuose (Polygonum cuspidatum šaknų sausasis ekstraktas ar Vitis vinefera odelių ir sėklų sausasis ekstraktas). Analizuojant maisto papildų tyrimų
rezultatus, pastebima tendencija, kad dauguma resveratrolio papildų yra kokybiški ir jų kiekis viršija 90 %, lyginant su deklaruojamu ant maisto papildo pakuotės.
3.2.5. Trans-resveratrolio kiekio komerciniame raudonajame vyne analizės rezultatai
12 lentelė. Komercinio raudonojo vyno analizės rezultatai
Vyno/vynuogės rūšis Gamintojas Nustatytas trans-resveratrolio kiekis
Saperavi Gruzija 0,001 mg/ml
Cabernet sauvignon Prancūzija 0,003 mg/ml
Tempranillo1 Ispanija Pėdsakai
Tempranillo2 Ispanija Pėdsakai
Sangiovese Italija Pėdsakai
Cabernet sauvignon Čilė Pėdsakai
Garnacha Ispanija Pėdsakai
Naminis vynuogių Lietuva Pėdsakai
Voruta Lietuva Pėdsakai
Aronijų Lietuva Pėdsakai
Iš 9 tirtų komercinių raudonųjų vynų, tiekiamų Lietuvos rinkai (7 Europos, 2 lietuviškų, 1 Pietų Amerikos vyndarių) ir 1 namų gamybos raudonųjų vynuogių vyno – trans-resveratrolio kiekis viršija aptikimo ribą, kuri yra 0,125 µg/ml. Kiekybiškai jis nustatomas tik dviejuose mėginiuose.
Viename iš tyrimui pasirinktų vynų - 2013 metų derliaus Kindzmarauli arealo vyne, pagamintame iš Saperavi rūšies vynuogių, būdingų Kakheti regionui Gruzijoje nustatytas 0,001 mg/ml
trans-resveratrolio kiekis. 2008 metais Gruzijoje atliktame to paties 2004 metų derliaus vyno tyrime
buvo nustatyta 1,15 mg/ml trans-resveratrolio koncentacija [80]. Lyginant su mūsų gautais rezultatais,
trans-resveratrolio kiekis 2004 metų derliaus vyne buvo daugiau nei 1000 kartų didesnis, nei tirtame
2013 metų derliaus vyne, kuris tiekiamas Lietuvos rinkai.
2015 metais atliktame Seperavi vynuogių rūšies (Kakheti regionas, Gruzija) vyno tyrime
trans-resveratrolio koncentracija svyravo nuo 0,32 iki 1,24 µg/ml [67]. Rezultatai ženkliai nesiskiria,
nuo gautų mūsų tyrimo metu (~ 1 µg/ml).
0,003 mg/ml trans-resveratrolio koncentacija nustatyta Cabernet sauvignon, 2012 metų derliaus prancūziškame vyne.
2010 metais, Serbijoje atliktame Cabernet sauvignon vyno tyrime, nustatytos trans-resveratrolio koncentracijos svyruoja nuo 0,18 mg/ml iki 1,69 mg/ml [81]. Ir mūsų gautus rezultatus viršija nuo 60 iki 550 kartų.
Resveratrolio kiekis vyne dažnai priklauso nuo daugybės faktorių, tokių kaip tų metų derliaus kokybė, oro sąlygos, vynmedžių ligos ir kt. Todėl, mūsų manymu, lyginti resveratrolio kiekį vyne, kai skiriasi bent vienas iš kintamųjų, tokių kaip metai, šalis, regionas, nėra tikslinga ir reikalinga.
4. IŠVADOS
1. Apžvelgta mokslinė literatūra apie trans-resveratrolio nustatymą maisto papilduose ir komerciniuose vynuose.
2. Pasirinkta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika yra paprasta, specifinė ir tiksli. Metodika yra tinkama naudoti trans-resveratrolio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui maisto papilduose ir vyne.
3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika validuota atsižvelgiant į tokius kriterijus, kaip specifiškumas, tiesiškumas ir glaudumas, kuris pagrįstas pakartojamumo ir atkuriamumo santykiniais standartiniais nuokrypiais. Apskaičiuota trans-resveratrolio aptikimo riba 0,125 µg/ml, o nustatymo – 0,419 µg/ml.
4. Iš šešių pasirinktų maisto papildų, tik trys papildai (Resverasor, Soria Natura, Ispanija; Resveratrol, Swanson Health Products, JAV; Evelor, Agetis supplements, Graikija) atitiko kiekį, deklaruojamą ant maisto papildo pakuotės.
5. Ne visi vynai, iš dešimties pasirinktų, turi kiekybiškai reikšmingą trans-resveratrolio kiekį, kuris turėtų teigiamą poveikį žmogaus sveikatai. Kiekybiškai trans-resveratrolį pavyko nustatyti dviejuose vynuose, jo koncentracija svyravo nuo 0,001 mg/ml iki 0,003 mg/ml. Kituose aštuoniuose vynuose nustatyti tik trans-resveratrolio pėdsakai.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Išvystyta atranki, jautri ir tiksli efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kurią galima pritaikyti naujų, į rinką išleidžiamų resveratrolio preparatų kiekybiniam įvertinimui.
2. Rekomenduojama ištirti augalines žaliavas, kaupiančias antocianus, tokias kaip mėlynės, spanguolės, bruknės ir kt. ir įvertinti jose besikaupiantį resveratrolio kiekį.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Erdman J, Balentine D, Arab L, Beecher G, Dwyer J, Folts J et al. Flavonoids and Heart Health: Proceedings of the ILSI North America Flavonoids Workshop, May 31–June 1, 2005, Washington, DC. The Journal of Nutrition [Internet]. 2007 [cited 17 May 2016];137(3):718S-737S. Available from: http://jn.nutrition.org/content/137/3/718S.full.
2. Baur J,Sinclair D. Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence. Nature Reviews Drug Discovery. 2006;5(6):493-506.
3. Jeandet P, Delaunois B, Conreux A, Donnez D, Nuzzo V, Cordelier S et al. Biosynthesis, metabolism, molecular engineering, and biological functions of stilbene phytoalexins in plants. BioFactors. 2010;36(5):331-341.
4. Parage C, Tavares R, Rety S, Baltenweck-Guyot R, Poutaraud A, Renault L et al. Structural, Functional, and Evolutionary Analysis of the Unusually Large Stilbene Synthase Gene Family in Grapevine. PLANT PHYSIOLOGY. 2012;160(3):1407-1419.
5. Dudley J, Das S, Mukherjee S, Das D. Retraction notice to: Resveratrol, a unique phytoalexin present in red wine, delivers either survival signal or death signal to the ischemic myocardium depending on dose [J Nutr Biochem 20;2009:443–52]. The Journal of Nutritional
Biochemistry. 2012;23(7):852.
6. Moreno A, Castro M, Falqué E. Evolution of trans- and cis-resveratrol content in red grapes (Vitis vinifera L. cv Mencía, Albarello and Merenzao) during ripening. Eur Food Res Technol. 2007;227(3):667-674.
7. Mattivi F, Reniero F, Korhammer S. Isolation, Characterization, and Evolution in Red Wine Vinification of Resveratrol Monomers. J Agric Food Chem. 1995;43(7):1820-1823.
8. Lamuela-Raventos R, Romero-Perez A, Waterhouse A, de la Torre-Boronat M. Direct HPLC Analysis of cis- and trans-Resveratrol and Piceid Isomers in Spanish Red Vitis vinifera Wines. J Agric Food Chem. 1995;43(2):281-283.
9. Prokop J, Abrman P, Seligson A, Sovak M. Resveratrol and Its Glycon Piceid Are Stable Polyphenols. Journal of Medicinal Food. 2006;9(1):11-14.
10. Romero-Pérez A, Ibern-Gómez M, Lamuela-Raventós R, de la Torre-Boronat M. Piceid, the Major Resveratrol Derivative in Grape Juices. J Agric Food Chem. 1999;47(4):1533-1536.
11. Austin M, Noel J. The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Nat Prod Rep. 2002;20(1):79-110.
12. Yu O, Jez J. Nature’s assembly line: biosynthesis of simple phenylpropanoids and polyketides.
