FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
MONIKA GIRDVAINYTĖ
FAGOMINO IR AMINO RŪGŠČIŲ TYRIMAS GRIKIŲ
SĖKLOSE SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ
SPEKTROMETRIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. Dr. V. Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU
:
Farmacijos fakulteto dekanas:
Data:
FAGOMINO IR AMINO RŪGŠČIŲ TYRIMAS GRIKIŲ
SĖKLOSE SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ
SPEKTROMETRIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. V. Jakštas
Data
Recenzentas Darbą atliko: Magistrantė
Data Monika Girdvainytė 2017.05.25
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai ... 9
1.2. Sėjamųjų grikių paplitimas ... 9
1.3. Sėjamųjų grikių kultivavimas ... 10
1.4. Fitocheminė sėjamųjų grikių sėklų sudėtis ... 10
1.5. Biologinis sėjamųjų grikių sėklų poveikis ... 11
1.6. Azotą turinčių biologinių junginių apžvalga ... 13
1.6.1. Iminocukrūs ir fagominas ... 13
1.6.2. Iminocukrų klasifikacija ... 14
1.6.3. Iminocukrų kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga ... 15
1.6.4. Amino rūgštys ... 18
1.6.5. Amino rūgščių klasifikacija ... 20
1.6.6. Amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
2.1. Tyrimo objektas ... 24
2.2. Naudota aparatūra ... 24
2.3. Naudoti reagentai ... 25
2.4. Ekstraktų ruošimo metodika ... 25
2.5. Standartų paruošimas... 25
2.6. Amino rūgščių ir iminocukrų kokybinė ir kiekybinė analizė sėjamųjų grikių sėklose ... 26
2.7. Duomenų statistinis įvertinimas ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Kokybinis fagomino nustatymas sėjamųjų grikių sėklose... 29
3.2. Kiekybinis fagomino ir AR nustatymas sėjamųjų grikių sėklose ... 29
4. IŠVADOS ... 56
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 57
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 58
7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO REZULTATŲ MOKSLINĖ SKLAIDA ... 65
SANTRAUKA
M. Girdvainytės magistro baigiamasis darbas „Fagomino ir amino rūgščių tyrimas grikių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu“, mokslinis vadovas prof. dr. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Farmakognozijos katedra, Kaunas.
Tyrimo tikslas: Atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.
Uždaviniai: 1) Ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios
žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m. užaugintų penkiolikos sėjamųjų grikių veislių sėklose; 2) Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti fagomino varijavimą grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose; 3) Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti amino rūgščių kiekybinę sudėtį ir jos varijavimą grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose.
Tyrimo objektas: Lietuvoje ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų
penkiolikos sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklos.
Tyrimo metodai: Grikių sėklose esančių azotą turinčių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė
atlikta skysčių chromatografijos – masių spektometrijos metodu.
Išvados: 1) Visų tirtų grikių veislių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos
metodu identifikuotas iminocukrų grupės junginys – fagominas. Taip pat visuose tirtuose mėginiuose identifikuota penkiolika amino rūgščių (l-alaninas, d-serinas, valinas, glicinas, l-argininas, metioninas, l-prolinas, l-lizinas, l-treoninas, fenilalaninas, aspartamo rūgštis, leucinas, l-tirozinas, izoleucinas, glutamo rūgštis); 2) Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyta, kad didesni fagomino kiekiai grikių sėklose sukaupiami grikius auginanat intensyvios žemdirbystės būdu, o daugiausiai fagomino kaupiančios veislės – „Panda“ ir „Kora“; 3) Didžiausi alanino, glicino, l-arginino, l-lizino ir izoleucino kiekiai nustatyti grikių, augintų intensyvios žemdirbystės būdu, sėklose. Ddidžiausi paminėtų amino rūgščių kiekiai nustatyti „Volma“ veislės mėginiuose. Vienintelė amino rūgštis, kurios daugiau nustatyta grikius auginant ekologiškai yra l-tirozinas. L- tirozino daugiausiai nustatyta „Smuglianka“ veislėje. Analizuojant nustatytus d-serino, valino, metionino, prolino, l-treonino, fenilalanino, aspartamo rūgšties, leucino ir glutamo rūgšties kiekius, nebuvo nustatyta priklausomybė tarp tiriamos medžiagos kiekio ir taikytos žemdirbystės sistemos.
SUMMARY
Master thesis of M. Girdvainytė “Evaluation of fagomine and amino acids in common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) seeds“; scientific supervisor prof. dr. V. Jakštas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy, Kaunas.
The aim: To determine qualitive and quantitave composition of fagomine and amino acids in seeds
of fifteen common buckwhat (Fagopyrum esculentum Moench) varieties grown under organic and
conventional farming conditions.
Tasks: 1) To determine qualitive composition of fagomine and amino acids in seeds of fifteen
common buckwheat varieties grown under organic and conventional farming conditions in 2014/2015; 2) To quantitate amounts of fagomine in seeds of different common buckwheat varieties grown under organic and conventional farming conditions in 2014/2015 using liquid chromatography-mass spectrometry; 3) To quantitate amounts of amino acids and to determine it‘s variation in seeds of different common buckwheat varieties grown under organic and conventional farming conditions in 2014/2015 using liquid chromatography-mass spectrometry.
Reserach object: Seeds of fifteen common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)
varieties grown under organic and conventional farming conditions.
Methods: Liquid chromatography-mass spectrometry was used for the qualitative and
quantitative analysis of fagomine and amino acids in common buckwheat seeds.
Conclusions: 1) Iminosugar fagomine and fifteen amino acids (l-alanine, d-serine, valine,
glycine, arginine, methionine, proline, lysine, threonine, phenylalanine, aspartic acid, leucine, l-tyrosine, isoleucine, glutamic acid) were identifiend in seeds of all common buckwheat varieties by using liquid chromatography-mass spectrometry method; 2) Liquid chromatography-mass spectrometry analysis showed that highest amount of fagomine was determined in seeds of „Panda“ and „Kora“ varieties grown under conventional farming conditions; 3) Liquid chromatography-mass spectrometry analysis showed that highest amount of l-alanine, glycine, l-arginine, l-lysine and isoleucine were determined in seeds of „Volma“ variety grown under conventional farming conditions. Only l-tyrosine showed better results uder organic farming conditions, highest amount of l-tyrosine was determined in seeds of „Smuglianka“ variety. Quantitave analysis of d-serine, valine, methionine, proline, l-threonine, phenylalanine, aspartic acid, leucine and glutamic acid showed no dependency between the amount of theese amino acids in buckwheat seed and farming conditions that were applied.
SANTRUMPOS
AR – amino rūgštisCD – cukrinis diabetas DC – dujų chromatografija
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija NAR – nepakeičiama amino rūgštis S.m. – sausa masė
SC-MS – skysčių chromatografija – masių spektrometrija VAB – veislė „Anita Belaruskaja“
VAN – veislė „Anika“
VBD-1 – veislė „Belaruskij deteminant-1“ VBD-2 – veislė „Belaruskij deteminant-2“ VBN – veislė „VB Nojai“
VBV – veislė „VB Vokiai“ VČN – veislė „Čanita“ VKO – veislė „Kora“ VKV – veislė „Kvietka“ VMA – veislė „Mara“ VPA – veislė „Panda“ VSM – veislė „Smuglianka“ VVO – veislė „Volma“ VŽA – veislė „Žaleika“ VŽN – veislė „Žniajarka“
ĮVADAS
Vis didėjant susidomėjimui augalinėmis žaliavomis bei galimu jų panaudojimu maisto ir farmacijos pramonėje ligų prevencijai ar gydymui, atliekami tyrimai, kuriais siekiama nustatyti augaluose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių sudėtį, jų kiekio priklausomybę nuo aplinkos sąlygų bei panaudojimo galimybes.
Sėjamųjų grikių augalinė žaliava (sėklos) kaupia azotą turinčius junginius – iminocukrus ir amino rūgštis. Iminocukrūs – tai hidroksilinti piperidino, pirimidino, indolizidino, pirolizidino ir nortropano dariniai [1]. Dėl glikozidazę slopinančio poveikio iminocukrūs laikomi potencialiais vaistais vėžio ir virusinių infekcijų gydymui, o atsparumo insulinui rizikos mažinimas ir antsvorio kontrolė gali padėti gydyti diabetą [2, 3]. Pirmasis išskirtas šios grupės junginys – fagominas (pirmą kartą buvo išskirtas iš grikių sėklų 1974 m.) [4]. Maistinė grikių vertė daugiausiai susijusi su jų sudėtyje randamais baltymais, kurie yra svarbi bio makromolekulių, atsakingų už įvairias fiziologines funkcijas, grupė [5]. Mitybos požiūriu, svarbiausias grikių aspektas – jų sudėtyje esančios nepakeičiamos AR (NAR), kadangi jos turi anglies skeletą, kurio žmogaus organizmas susintetinti negali, dėl to šių medžiagų gavimas kartu su maisto produktais yra daug svarbesnis, nei nepakeičiamų AR [6]. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) – tai vienmetis, 15 – 80 cm aukščio rūgtinių šeimos augalas [7], kuris gali būti auginamas tiek ekologinės, tiek intensyvios žemdirbystės sąlygomis. Iki šiol nėra sukaupta pakankamai mokslinių žinių apie fagomino bei amino rūgščių kiekybines variacijas skirtingų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sistemomis, sėklose, todėl tikslinga įvertinti šių junginių pasiskisrtymą ir atlikti perspektyviausių veislių atranką. Gauti tyrimų rezultatai leis nustatyti grikių kultivavimui tinkamiausią žemdirbystės sistemą ir veisles, kurios išsiskirtų savo biologine sudėtimi, įvertinti potencialų jų panaudojimą vaistų ar maisto papildų, savo sudėtyje turinčių grikių ekstraktų, gamybai.
Fagomino ir amino r. turinčių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti pasirinktas masių spektrometrijos – skysčių chromatografijos metodas. Analičių skirstymui pagal jų hidrofiliškumą pasirinkta taikyti hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografinę (HILIC) kolonėlę, taikomas gradientinės eliucijos metodas, mobilioji fazė sudaryta iš amonio acetato vandeninio tirpalo (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B).
Darbo tikslas: atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m. užaugintų penkiolikos sėjamųjų grikių veislių sėklose;
2. Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti fagomino varijavimą grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose;
3. Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti amino rūgščių kiekybinę sudėtį ir jos varijavimą grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai
Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) – tai rūgtinių šeimos augalas, kurio aukštis maždaug 20 – 60 cm. Tai vienametis, liepos – spalio mėnesiais žydintis augalas. Jo apyžiedžio spalvos varijuoja nuo baltos iki rožinės, apyžiedis 2 – 3 mm ilgio, žiedai balti, susitelkę stangriose galvutėse. Lapai ieštiški arba strėliški. [7]
Grikių stiebas – maždaug 20 – 60 cm aukščio, šakotas, gali išleisti 10 – 12 šakų. Lapai platūs, širdiški su dviem prielapiais, šaknis liemeninė, gali užaugti iki 80 – 100 cm ilgio, šakota. Stiebo ir šakų viršūnėse yra žiedynai. Ant vieno augalo gali būti iki dviejų tūkstančių žiedų, nors didžioji dalis jų lieka bevaisiai. Pagal žiedų spalvą grikius galima skirti į dvi grupes: rausvus arba gelsvai žalsvus žiedus turintys grikiai. Šių augalų žiedai nevienodi: vieni turi žiedus, kurių kuokeliai yra aukšti, o piestelės – trumpos, kitų augalų kuokeliai žemi, o piestelės ilgos (aukštos). Kad grikiai būtų apvaisinti, žiedadulkės turi patekti nuo žiedų, turinčių aukštus kuokelius, ant žiedų su trumpais kuokeliais. Apvaisinimui padeda vabzdžiai, ypač bitės. Vaisius – trišonis grūdas, kurio spalva varijuoja nuo rusvos iki rudos. Grūdų dydis taip pat nevienodas, 1000 grūdų gali sverti nuo 15 iki 30 gramų [8].
1.2. Sėjamųjų grikių paplitimas
Grikiai laikomi viena jauniausių augalinių kultūrų, Senovės Egiptiečiai grikių dar nepažinojo. Ši kultūra yra kilusi iš Azijos, šiuo metu daugiausiai auginami šiauriniamie pusrutulyje, nors auga visame pasaulyje. Jie buvo ypač svarbūs kaip maisto šaltinis sausringuose ir šaltuose regionuose. Šiuo metu Rusija yra didžiausia grikių augintoja, Kinija užima antrą vietą, joje yra maždaug 10,2 milijonų akrų auginamo ploto, o išauginama produkcija svyruoja nuo 0,6 iki 0,95 milijonų tonų. Lietuvoje grikių sėjama palyginus nedaug, daugiausiai ten, kur dirvos lengvos, ne tokios derlingos – Varėnos, Alytaus, Trakų ir kituose rajonuose. [8, 9]
1.3. Sėjamųjų grikių kultivavimas
Grikiai auga ir mažai derlingose žemėse, nes turi, nors ir negausias, tačiau ilgas ir stiprias šaknis, kurios gali imti maistą iš sunkiai pasiekiamų šaltinių. Šis augalas auga palyginus greitai, eant geroms sąlygoms žydėti pradeda praėjus 25 – 30 dienų nuo sėjos. Vegetacinis periodas trumpas (70 – 85 dienos). Grikių dygimas prasideda esant 7 – 8 ˚C temperatūrai, tačiau esant tokiai temperatūrai dygimas labai lėtas, o daigai labai susiplnėja, todėl optimaliausia 12 – 17 ˚C temperatūra. Grikiai taip pat jautrūs šalnoms, net nedidelė šalna (1 - 1,5˚C žemiau nulio) jau gali jiems pakenkti, o karščiai (daugiau kaip 25˚C) sulaiko augimą, ypač nektaro gamybą, dėl to esant dideliems karščiams grikių nelanko bitės ir jų neapvaisina. Grikiai išgarina daug vandens, kadangi turi didelius lapus ir negausias šaknis, todėl kad jos galėtų augalą aprūpinti pakankamu kiekiu drėgmės, dirvoje šios turi būti gana daug. Palankiausi grikių augimui yra šilti ir lietingi metai. Grikiai gali augti smėlinėse dirvose ar nusausintuose durpynuose, kadangi turi didelį pakantumą rūgščioms dirvoms. Dirvose, kurios turi daug azoto (durpinėse dirvose) grikiai užauga labai dideli, gausiai sulapoja, tačiau turi mažai žiedų, o grūdų – dar mažiau. Tačiau dirvas patręšus fosforo ir kalio trąšomis, galima užauginti didelius derlius [8].
1.4. Fitocheminė sėjamųjų grikių sėklų sudėtis
Daugiausiai sėjamųjų grikių sėklos yra vartojamos kaip maistinė žaliava – miltų, košių, sausainių, alaus ir daugybės kitų produktų gamybai [10, 11]. Apžvelgus atliktus sėjamųjų grikių sėklų fitocheminių tyrimų rezultatus, nustatyta, kad sėklose yra gausus krakmolo bei kitų junginių, tokių kaip baltymai, antioksidantai, mikroelementai ir maistinės skaidulos [12, 13]. Pilnagrūdžiuose grikiuose yra krakmolo, riebalų, lipidų, tirpių angliavandenių, maistinių skaidulų ir kitų medžiagų: flavanoidų (rutino, orientino, kvercetino, viteksino), vitaminų (B1, B2, B3, B5, B6, C), vitamino E (R-tokoferolio), inozitolių (D-chiro-inozitolio), fagopirinų, kurie gali sukelti fotosensibilizaciją, ir kt. [13–15], kurios įvairiai pasiskirsto skirtingose grūdo dalyse [16]. Grikių sėklose randama maždaug 10 – 18% baltymų [17, 18], kurie turi reikšmingą maistinę vertę, kadangi juos gali vartoti ir glitimo netoleruojantys žmonės [10]. Baltymų kiekis grikių sėklose ir miltuose yra panašus ar nežymiai didesnis nei kviečių grūduose ir miltuose, tačiau ženkliai didesnis nei kitose grūdinėse kultūrose (ryžiuose, kukurūzuose). Lyginant su kviečiais, grikiuose randamas panašus arba didesnis visų AR, išskyrus glutamino ir prolino, kiekis [19]. Grikių baltymuose, lyginanat su kitomis grūdinėmis kultūromis, aptinkami didesni lizino ir arginino kiekiai, juose visų amino rūgščių, išskyrus glutamo rūgštį ir proliną, yra daugiau negu kviečiuose [16]. Grikių sėklose taip pat randama iminocukrų (D-fagomino, 1-deoksinojirimicino), dauguma jų paprastai
aptinkami tik egzotinių ar medicininiais tikslais auginamų augalų sudėtyse, tačiau d-fagominas yra vienintelis žinomas iminocukrus, randamas ir tradiciniuose maisto šaltiniuose [20]. Apibendrinus atliktų sėjamųjų grikių sėklų fitocheminės sudėties tyrimų rezultatus, galima teigti, jog grikių sėklos yra reikšmingas AR ir iminocukrų šaltinis.
1.5. Biologinis sėjamųjų grikių sėklų poveikis
Grikiai kelia mokslininkų susidomėjimą dėl savo potencialaus poveikio lėtinių ligų gydymui. Dėl savo unikalios fitocheminės sudėties, jie pasižymi antidiabetiniu, antihipertenziniu, antihiperlipideminiu ir net prebiotiniu, poveikiais, šie poveikiai siejami su grikiuose randamais flavanoidais, fenoliniais junginiais, iminocukrais ir kt. [21–24].
Antidiabetinis poveikis. Cukrinis diabetas (CD) – tai liga, atsirandanti, kai organizmas
nebesugeba tinkamai pašalinti per didelio kraujyje cirkuliuojančio gliukozės kiekio. Ant plonojo žarnyno epitelio yra fermentų (maltazės, sacharazės, izomaltazės), skaidančių valgio metu gautus angliavandenius į monosacharidus, kurie vėliau absorbuojami į kraują. Šie fermentai yra tiesiogiai atsakingi už kraujyje randamą gliukozės kiekį, o jų inhibavimas gali daryti įtaką angliavandenių absorbcijos reguliavimui. Buvo nustatyta, jog daugelis iminocukrų slopina α-glikozidazei specifiškus fermentus (sacharazę, maltazę, izomaltazę) [25, 26], todėl gali sumažinti besivystančio atsparumo insulinui ir viršsvorio atsiradimo riziką [27]. Antidiabetinis aktyvumas buvo įrodytas tiriant laboratorines žiurkes. Žiurkės vartojo sacharozės arba krakmolo tirpalą (1 arba 2 g/kg kūno masės), kartu su atitinkamu tiriamo junginio kiekiu, kontrolinė grupė vartojo tik vandenį. Tiriamųjų junginių (d-fagomino – 1, 2, 4 mg/kg kūno masės; DNJ, miglitolio (N-hidroksietil-DNJ) ir askarbozės – 2mg/kg kūno masės) vandeniniai tirpalai buvo vartojami su skrandžio zondų pagalba. Kraujo mėginiai buvo imami praėjus 0, 15, 30, 45, 60, 90 ir 120 minučių po pavartojimo, buvo vertinamas gliukozės ir insulino kiekis kraujyje. Nustatyta, jog d-fagominas, vartojamas kartu su sacharoze ar krakmolu, mažina gliukozės kiekį kraujyje (poveikis tiesiogiai priklauso nuo pavartoto kiekio), nedidindamas insulino koncetracijos [28].
Antihipertenzinis poveikis. Angiotenziną konvertuojantis fermentas (AKF) atlieka svarbų
vaidmenį renino-angiotenzino sistemoje, kuri reguliuoja kraujo spaudimą. Buvo nustatyta, kad vandeniniai grikių miltų ekstraktai pasižymi AKF inhibuojančiu poveikiu [29]. Šis poveikis įrodytas iš grikių miltelių išskyrus junginį, kuris slopina AKF. Manoma, jog šis junginys yra hidroksilintas nikotianamino darinys, o jo cheminė struktūra – 2-hidroksinikotianaminas. AKF inhibuojantis poveikis nustatytas Kušmano ir Čeungo (angl. Cushman and Cheung) metodu [30]. Išskirtas junginys pasižymėjo
labai stirpiu AKF inhibuojančiu poveikiu: jo IC50 (pusinė maksimali slopinanti koncentracija) - 0.08 μM.
Šimte gramų grikių buvo aptikta 30 mg šio junginio [31].
Antioksidantinis poveikis. Laisvieji radikalai, susidarantys organizme, neigiamai veikia DNR ir
lipidines ląstelių membranų struktūras, taip sukeldami ląstelių senėjimą ir didindami vėžio riziką [32]. Antioksidantinis grikių ekstrakto poveikis buvo įrodytas atliekant tyrimus su DNR. Buvo tiriamas etanolinių grikių ekstraktų antioksidantinis aktyvumas ir apsauginis poveikis prieš DNR pažeidimus, kuriuos sukelia hidroksilo radikalas. Antioksidantinis poveikis nustatinėtas Matsufuji ir Šibamoto (angl.
Matsufuji and Shibamoto) metodu: reakcijos mišiniuose buvo žuvų DNR (0,8 mg / ml), FeCl2 (100 μM),
EDTA (104 μM), H2O2 (1,2 mM), askorbo rūgšties (1,0 mM), įvairios koncentracijos etanolinių grikių
ekstraktų ir kalio fosfato buferio (50 mM, pH 7.4) [33]. Mėginiai inkubuojami vandens vonioje 30°C temperatūroje 10 min, vėliau jie papildyti 1 ml 10% tricloracto ir 1 ml 1,0% tiobarbitūrinės rūgšties, mėginiai pavartomi ir šildomi vandens vonelėje esant 80°C temperatūrai 30 min. Oksidacijos dydis įvertintas apskaičiuojant tirpalo absorbciją. Gauti rezultatai rodo, jog grikių ekstraktai pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu saugant DNR nuo hidroksilo radikalo pažaidos, manoma, jog taip yra dėl geležies chelatinių savybių, dėl kurių jis gali prisijungti hidroksilo radikalą. Teigiama, jog antioksidacinio aktyvumo stiprumas tiesiogiai priklauso nuo fenolinių junginių kiekio grikių ekstraktuose [34].
Antihiperlipideminis poveikis. Antihiperlipidemis grikių aktyvumas buvo įrodytas naudojant
laboratorinį žiurkių modelį. Jo metu žiurkės, pagal nustatytą mitybos racioną, buvo paskirstytos į tris grupes: kontrolinę grupę (KG), kurioje buvusios žiurkės maitinosi standartiniu maistu; didelio riebalų kiekio (DRB) ir didelio riebalų kiekio maistu, papildytu grikių lapų ir žiedų milteliais (DRKG). DRKG grupės žiurkių plazmoje nustatyta bendra riebalų ir trigliceridų koncentracija buvo ženkliai mažesnė, nei kitose grupėse. Kepenų chrolesterolio ir trigliceridų kiekiai DRKG ir KG grupėse buvo panašūs. Taip pat grikių mišinys padidino su išmatomis pasišalinančių trigliceridų ir rūgštinių sterolių kiekį DRKG grupėje. Remiantis gautais rezultatais, manoma, jog teigiamas grikių poveikis kontroliuojant aukštą kepenų ir plazmos lipidų kiekį, žiurkių, kurios buvo maitinamos dideliu riebalų kiekiu pasižyminčia dieta, organizmuose, pasireiškia dėl sinergistinio fenolių ir skaidulinių medžiagų poveikio [35].
Prebiotinis poveikis. Tiriant laboratorines žiurkes nustatyta, jog grikiai pasižymi prebiotiniu
poveikiu. Mokslinio tyrimo metu dvidešimt dvylikos savaičių moteriškos lyties žiurkių atsitiktine tvarka buvo padalintos į dvi grupes: kontrolinė grupė buvo maitinama standartiniu maistu (17 g baltymų, 3 g riebalų, 4 g celiuliozės, 5 g mineralinių medžiagų, 7500 vitamino A veikimo vienetų, 1500 B3 veikimo
vienetų, 30 mg vitamino E ir 30 mg vario), kita grupė buvo maitinama termiškai apdorotais grikiais. Grikiais praturtinta dieta maitintos pelės pasižymėjo reikšmingai (p<0,05) padidėjusiu jų žarnyne esančių lakto ir bifidobakterijų kiekiu lyginant su kontroline grupe; taip pat, kai žiurkės buvo
maitinamos grikiais praturtintu maistu, jų organizmuose sumažėjo bendras ir didelio tankio cholersterolio kiekis [36].
1.6. Azotą turinčių biologinių junginių apžvalga
1.6.1. Iminocukrūs ir fagominas
Iminocukrūs – tai hidroksilinti piperidino, pirimidino, indolizidino, pirolizidino ir nortropano dariniai, kurie buvo aptikti tam tikrose augalų (Polygonaceae, Moraceae, Hyacinthaceae,
Campanulaceae, etc.) šeimose ir mikroorganizmų (Streptomyces, Bacillus, etc) genuose. Nustatytos
skirtingos šių junginių farmakologinės savybės, iš kurių daugiausiai susidomėjimo sulaukia glikozidazę slopinantis poveikis. Iminocukrūs gali konkurencingai slopinti glikozidazę, nes jie geba atkartoti natūralių glikozidazės substratų piranozido ir furanozido tranzicijos stadiją. Dėl to iminocukrai laikomi potencialiais vaistais AIDS, vėžio, virusinių infekcijų gydymui, atsparumo insulinui rizikos mažinimui ir antsvorio kontrolei, kurie gali padėti gydyti diabetą [40–42]. Pirmasis toks junginys 1974 m. išskirtas iš grikių sėklų yra d-fagominas [4].
Natūraliai randami alkaloidai, kurie inhibuoja gliukozidazę, yra skirstomi į penkias struktūrines klases: polihidroksilinti pirolidinai, piperidinai, indolizidinai, pirolizidinai ir nortropanai. Be to, jie randami ir glikozilintose formose. Iminocukrūs taip pat klasifikuojami pagal jų poveikį, blokuojant gliukozidazes: α ir β gliukozidazės, α ir β galaktozidazės ir α manozidazės inhibitoriai [1].
Dėl savo mažos polinės molekulės ir jos panašumo į angliavandenius iminocukrūs yra gerai įsisavinami, tačiau tuo pačiu metu pakankamai skiriasi nuo angliavandenių, todėl yra apsaugoti nuo juos modifikuojančių sistemų, taip pat jie turi cheminį ir biologinį stabilumą. Šios unikalios savybės išskiria iminocukrus ir paverčia juos išskirtine junginių klase naujų vaistų paieškose [43, 44].
Iminocukrūs kaip vaistiniai preparatai buvo pradėti vartoti labai seniai, kadagi jų ekstraktai buvo naudojami liaudies medicinoje, pavyzdžiui, baltojo šilkmedžio (Morus alba) ekstraktas, kuriame yra iminocukrų, naudojamas jau tūkstantį metų [2, 45]. Šiuo metu yra registruoti du iminocukrų vaistiniai preparatai: deoksinojirimicino (DNJ) darinys N-hidroksietil-DNJ, kuris slopina žarnyno disacharidazes ir vėlina po valgio atsirandančią hiperglikemiją, bei N-butil-DNJ, kuris slopina daugelio glikosfingolipidų pirmąją biosintezės stadiją (1 pav.) [2].
1 pav. Registruoti iminocukrų preparatai, susintezuoti iš deoksinojirimicino [2].
1.6.2. Iminocukrų klasifikacija
Iminocukrūs, naturalūs ar sintetinės kilmės, yra maži organiniai junginiai, kurie hidrolizės fazėje imituoja angliavandenius, tačiau savo molekulėse žiedo sistemoje vietoj deguonies turi azoto atomą. Tokie pakeitimai randami ne tik monociklinėse, tačiau ir biciklinėse struktūrose (Pav. 2). Šiuose junginiuose dažniausiai randami hidroksilo grupės pakaitai, tačiau galimi ir daugiau variantų, tokių kaip karboksirūgščių ar amidiniai pakaitai [43].
2 pav. Struktūrinių iminocukrų motyvų, randamų gamtoje, pavyzdžiai [43].
Natūraliai gamtoje randama trijų pagrindinių struktūrinių grupių iminocukrų: piperidino, indolizidino ir nortropano.
1. Piperidino iminocukrūs. 1996 m. buvo isškirtas pirmasis natūralus polihidroksilintas alkaloidas nojirimicinas (NJ) (3 pav.). Jis išskirtas iš Streptomyces filtrato, pasižymėjo α ir β gliukozidazes inaktyvuojančiu poveikiu, ir buvo pirmasis natūralus gliukozės analogas [46].
2. Indolizidino iminocukrūs. Indolizidinai yra bicikliai alkaloidai, kurių struktūroje azapiranozo žiedas sujungtas su pirolidino žiedu N – tilteliu. Pirmasis junginys, izoliuotas 1979 m. – svainsoninas, gautas iš Swainsona canescens lapų (4 pav. ) [2, 45, 46].
4 pav. Indolizidino iminocukrus svainsoninas[46].
3. Notropano iminocukrūs. Tai palyginus nauja polihidroksilintų alkaloidų, kurių sudėtyje yra azopiranozinis žiedas, grupė. Šie junginiai daugiausiai gaunami iš Atropa belladonna ir Convolvulus
arvensis augalų. Notropano iminocukrūs, dar vadinami kalisteginais, biciklinio žiedo dalyje turi
tris –OH grupes (išskyrus kalisteginą N1). Naudojant elektroforezę šie junginiai buvo padalinti į dvi
grupes – A ir B. Pagrindinis A grupės komponentas - kalisteginas A3, o pagrindinai B grupės
komponentai - kalisteginas B1 ir kalisteginas B2 (5 pav.) [46].
5 pav. Notropano iminocukrūs [46].
1.6.3. Iminocukrų kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga
Norint nustatyti iminocukrų tapatybę ir kiekybę, po ekstrakcijos mėginiams reikia tolimesnio atskyrimo žingsnio naudojant aukštos kokybės stacionarias fazes. Tam gali būti naudojama dujų arba skysčių chromatografija [47].
Skysčių chromatografija. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC, angl. high performance
liquid chromatography, HPLC) kombinuojant ją su masių spektrometrine analize (MS, angl. mass spectrometry, MS), kai naudojamas vienas masių spektrometras (ESC-MS) arba keli masių
naudojamais metodais iminocukrų nustatymui. Šie tyrimai apima mėginių atskyrimo, jonizavimo ir aptikimo vienu ar keliais masių spektrometrais, stadijas. Šiam metodui labai svarbus yra chromatografinis atskyrimas, nes masių spektrometrai neatskiria izomerų, išskyrus tuos atvejus, kai informaciją galima gauti iš fragmentacijos modelio, ypač taikant MS/MS metodą [47]. Dėl selektyvumo trūkumo, jei izomerai prieš tai neatskiriami, gauti imunocukrų kiekiai gali būti didesni, nei yra iš tikrųjų. Mėginant azocukrus nustatyti naudojant atvirkštinių fazių skysčių chromatografiją, metodas nepasitvirtino dėl selektyvumo stokos, kurį lemė struktūrinis tiriamų junginių panašumas [48]. Vėliau skysčių chromatografija buvo sėkmingai pritaikyta tiriant DNJ, tyrimui panaudota hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografinė kolonėlė (angl. hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) su TSKgel-amido dervos hidrofiline nejudančia faze, eliuavimui naudotas acetonitrilo ir vandens mišinys, kurio pH 5,5 [49]. HILIC buvo sukurta analizuoti polinius junginius, tokius kaip peptidai, nukleorūgštys ir sudėtingi angliavandeniai, o dabar ji yra sėkmingai taikoma piperidino klasės iminocukrų, tokių kaip DNJ, 2-O-α-d-galaktopiranozil-DNJ (GAL-DNJ) ir d-fagomino atskyrimui vieno tyrimo metu [50]. Atlikus tyrimą, kurio metu buvo lyginamos trys stacionarios HILIC fazės (sulfoalkilbetaino cviterjonų, polihidroksietil-aspartamido ir jungtimi sujungtų etileno hibridų dalelės su trifunkciškai prijungtais amidais (angl. bridged-ethylene hybrid (BEH) particles with a trifunctionally bonded amide)), buvo nustatyta, kad naudojant BEH-amidus gaunami geriausi rezultatai, atsižvelginat į rezoliuciją, smailės plotį ir analizės laiką [51]. Kadangi iminocukrūs jonizuojasi, katijonų mainų dydžio pokytis kai kuriais atvejais taip pat gali duoti geresnių rezultatų. Atlikus tyrimą, dervoje (angl. resin), kuri turi terminalinę karboksimetilo grupę, vyko silpnesnė katijonų kaita ir joje buvo nustatytas didesnis selektyvumas atskiriant d-fagominą nuo jo diastereomerų 3-epi-fagominoir 3,4-di-epi-fagomino, nei HILIC dervoje [52]. Šie tyrimai įrodo, jog anksčiau nustatyti d-fagomino kiekiai grikių žolėje gali būti pervertinti, nes buvo naudojami mažiau selektyvūs atskyrimo metodai [47].
Dujų chromatografija (angl. gas chromatography, GC) taip pat yra taikoma iminocukrų
mišinių skirstymui. Azocukrūs nėra lakūs junginiai, todėl pirmiausiai reikia suformuoti stabilius lakius darinius. DNJ analizuojamas po derivatizacijos su N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoroacetamidu (BSTFA) dalyvaujant trimetilchlorosilanui (TMCS) [53]. Sudėtingesniems mišiniams, kuriuose yra daugiau nei vienas iminocukrus arba kitų susijusių molekulių, reikia ir sudėtingesnių technikų. Oksimacijos ir trimetilsililacijos kombinavimas yra efektyvus atskiriant DNJ, d-fagominą, pipekolinės (angl. pipecolic) rūgšties darinius ir kitus poliolius (angl. polyols), kita vertus, kitų derivatizacijų rezultatai pasižymi mažesne mišinių skiriamąja geba [54]. Visai neseniai tie patys autoriai paskelbė apie patobulintą procedūrą, jos metu injekcijos vietoje reguliuojama temperatūra, tai leidžia gauti geresnę piko formą ir atskyrimą, tuo pačiu sumažinant degradaciją [55].
Atskyrus junginius jų aptikimui gali būti naudojama masių spektrometrija, taip pat kiti detektoriai: išgaruojančios šviesos sklaidos nustatymas, ESC kartu su ultravioletinės spinduliuotės ar fluorescenciniais detektoriais, pulsuojantis emperometrinis detektorius, naudojamas su jonų mainų skysčių chromatografija. Fluoroforinių ir chromoforinių grupių trūkumas iminocukrų struktūroje stabdo nuo tiesioginio spektrofotometrinių detektorių naudojimo [40].
Masių spektrometrija. Šis metodas iminocukrų analizei naudojamas plačiausiai. Po atskyrimo
junginiai yra jonizuojami termopurkštuvu (angl. thermospray, TSI), elektropurkštuvu (angl.
electrospray, ESI), atmosferos slėgio chemine jonizacija (angl. atmospheric-pressure chemical ionization, APCI) arba elektronų smūgine jonizacija (angl. electron impact ionization, EI) [50, 53, 56–
58]. Tuomet jonai gali būti analizuojami skirtingais masių detektoriais, priklausomai nuo to, kokia informacija reikalinga: jonų gaudyklės ir skrydžio laiko detektoriai yra tinkamesni junginiams identifikuoti [59], tuo tarpu kiekybiniam nustatymui naudojami kvadrupolinis ir trigubo kvadrupolio masių detektoriai, kurie padeda gauti tinkamą selektyvumą, jautrumą, tikslumą ir patikimumą [52, 57]. Trigubo kvadrupolio detektoriai antrą kartą suskaido pasirinktus pirminius fragmentus (naudojama MS/MS tyrimų metu), tai palengvina izomerų ir kompleksinių struktūrų identifikavimą. Analizuojant d-fagominą grikių kruopose, buvo naudojamas elektropurkštuvas ir kvadrupolio masių detektorius. Tyrimo metu labai svarbu atidžiai stebėti signalo silpnėjimą, kurį sukelia rišamoji medžiaga, ir jį koreguoti naudojant kitą iminocukrų (DMDP) kaip vidinį etaloną [52]. Atlikus tyrimą, kurio metu, panaudojus kvadrupolio – skrydžio laiko masių spektrometrinį detektorių, analizuoti kompleksiniai mišiniai MS/MS metodu, buvo nustatyti tokie junginiai kaip DNJ, DMJ, HNJ, d-fagominas ir keli glikozilinti junginiai, kurie iki tol niekada nebuvo aptikti [51]. MS gali būti taikoma tiesiogiai augalų audiniams jonizuojant aplinką. Metodas yra greitas ir selektyvus, ir yra taikomas įvairioms gamtinėms medžiagoms fitochemikalų, šiuo atveju iminocukrų, esančių juose, nustatymui [60]. Atlikus tiesioginį šilkmedžių lapų tyrimą realiame laike, naudojant trigubą kvadrupolinį masių detektorių, buvo nustatinėjamas DNJ. Procesas apima nesudėtingą mėginio paruošimą ir greitą MS analizę nenaudojant išankstinės chromatografijos. Rezultatai parodė, kad metodas yra toks pats jautrus ir tikslus kaip įprastinis nustatymas ESC, sujungta su fluorescenciniu detektoriumi [61].
Kiti detektoriai. Iminocukrų analizei gali būti naudojami ne tik MS detektoriai. Garinančios
šviesos sklaidos nustatymas (angl. evaporative light scattering detection, ELSD) yra pusiau universalus aptikimo metodas, kuris gali būti pritaikomas ir azocukrams. Nors metodas yra pakankamai jautrus, kad nustatytų įvairias struktūras, tačiau reikalauja kruopštaus mėginių paruošimo tam, kad būtų išvengta trikdžių. Šis metodas yra labai tikslus, kai naudojamas kartu su ESC, su sąlyga, kad mišinyje esantys junginiai yra atskiriami esant izokratinėms sąlygoms, o sistemos temperatūra atidžiai kontroliuojama; nereikia derivatizacijos, tai leidžia paprastai ir greitai analizuoti daug pavyzdžių. Tačiau metodas nėra
toks jautrus kaip MS, todėl jis negali būti naudojamas esant žemoms analičių koncentracijoms. ELSD buvo naudojamas DNJ [62] analizei. ESC kartu su ultravioletinės spinduliuotės ar fluorescenciniais detektoriais (ESC-UV, ESC-FLD atitinkamai) taip pat taikomi iminocukrų analizei, tačiau kadangi analičių struktūrose trūksta chromoforų, metodui reikalinga derivatizacija [63–65], o išvestinių produktų stabilumas yra kritiškai svarbus. Impulsinis amperometrinis detektorius (angl. pulsed amperometric
detector, PAD) iminocukrų nustatymui naudojamas kartu su jonų mainų skyčių chromatografija.
Metodui reikalingas pokolonėlinis pH reguliavimas prieš mėginiui pasiekiant detektorių [66]. Detektorius yra selektyvus junginiams, savo struktūroje turintiems oksiduojamas funkcines grupes (pvz. hidroksilo grupę), jam taip pat nereikia ankstesnės derivatizacijos. Tačiau šis metodas yra ne toks jautrus ir turi mažesnį atkuriamumą nei anksčiau paminėti metodai.
1.6.4. Amino rūgštys
Amino rūgštys (AR) – tai vieni svarbiausių cheminių struktūrų žemėje. Iš jų sudaryti gyvybiškai svarbūs baltymai ir peptidai, neurotransmiteriai, transporteriai, antibiotikai ir t.t. Visi šie junginiai sudaryti iš α – amino rūgščių, kuriose prie α anglies atomo prisijungusios –COOH ir -NH2 funkcinės
grupės. Prie to paties anglies atomo jungiasi radikalai (išskyrus gliciną, kurio molekulėje prie anglies jungiasi vandenilio atomas), kurie skiria AR vieną nuo kitos [67, 68].
Kiekviena AR pasižymi būdingu poveikiu organizmui: glutamo r. naudojimas plačiai paplitęs maisto pramonėje, ji, dažniausiai natrio druskos formoje, naudojama dėl savo skonį gerinančių savybių, jaučiamas skonis apibūdinamas kaip „umami“ – penktasis skonio pojutis, labai panašus į mėsos arba sultinio aromatą [84]. Grikiuose nustatytas didelis glutamo r. kiekis gali pagerinti jų skonines savybes taip plėsdamas potencialių grikių vartotojų ratą. Tačiau glutamo r. gali ne tik pagerinti produktų skonį, jai taip pat priskiriamos ir antivėžinės, estrogeno trūkumo sukeltos menopauzės simptomus (nutukimo, makšties atrofijos, osteoporozės) stabdančios savybės [85, 86], todėl grikių vartojimas gali sulėtinti šių ligų vystymąsi. Nėra vieningos nuomonės, ar glutamo r. ir jo druskų vartojimas yra saugus, nors JAV Maisto ir Vaistų Administracija (angl. Food and Drug Administration, FDA) priskiria jas prie saugių ingridientų, šiuo metu identifikuotos dvi žmonių grupės, kurios yra jautrios didelėms glutamato dozėms: žmonės, kurie jo netoleruoja, ir sergantieji astma [87]. Laisva glutamo r. yra gausiausiai smegenyse aptinkama AR ir vienas pagrindinių neurotransmiterių žinduolių CNS, tačiau kai jos koncentracija pakyla virš fiziologinių normų, ji tampa toksiška neuronams, turintiems glutamato receptorius [88, 89]. Glutamatas taip pat veikia kaip antioksidantas [90].
Argininas laikomas pusiau nepakeičiama AR, jam priskiriamas kraujagysles atpalaiduojantis (susidaro NO, kuris atpalaiduoja kraujagysles ir gerina cirkuliaciją), žaizdų gijimą spartinantis, imuninę
sistemą palaikantis poveikis [91–93]. Nustatyta, jog jis turi ypač svarbų poveikį makrofagų aktyvacijai, kadangi didina makrofagų jautrumą bakterijų endotoksinams, manoma, jog arginino trūkumas turi įtakos mirtigumui nuo infekcijų šalyse, kuriose paplitęs badas [91]. Kadangi arginino poreikis padidėja infekcijų metu, gali būti naudinga sergant infekcinėmis ligomis vartoti grikių sėklų produktus. Aspartamo r. skatina baltymų, dalyvaujančių nervų sistemos vystymese, sintezę, veikia kaip antioksidantas, neurotransmiteris ir neuromediatorius, pasižymi testosterono kiekį didinančiu poveikiu [94–96]. Dėl testosterono sintezės skatinimo ji naudojama kaip maisto papildas, siekiant greičiau padidinti raumenų masę [97].
AR veikia antioksidantiškai: jų poveikis aiškinamas keliais mechanizmais: AR prisijungia laisvuosius radikalus ir taip juos neutralizuoja [98]; AR, tokios kaip histidinas, sudaro chelatus su metalais, katalizuojančiais hidroperoksidų skilimą į laisvuosius radikalus [99]; AR pasižymi sinergistiniu poveikiu su tokoferoliais ir kitais pirminiais antioksidantais [100]. Be glutamo ir aspartammo r., antioksidaciniu aktyvumu pasižymi sieros turinčios AR [101], tokios kaip metioninas. Jis priklauso nepakeičiamų AR grupei ir esant fiziologinėms sąlygoms efektyviai neutralizuoja beveik visas egzistuojančias oksiduojančias molekules - H₂ O₂ , hidroksilo radikalą, peroksinitritą, chloraminus ir hipochloro rūgštį [101].
Analizuojant fiziologinius procesus, prisidedančius prie glikemijos kontrolės, nustatyta, kad tam tikros AR, naudojamos kaip maisto papildai, pasižymi potencialiu prevenciniu bei ankstyvąjį ir antro tipo diabetą gydančiu poveikiu [102]. AR antidiabetinis poveikis turi keletą mechanizmų, įskaitant jų tiesioginį dalyvavimą gliukozės metabolizme [103], insulino sekrecijos skatinimą [104], jų gebėjimą pagerinti periferinį atsaką į insuliną [105], antioksidacinį poveikį [106], taip pat jų stimuliacinį efektą mitochondrijų biogenezei ir funkcijoms [107]. Šakotos grandinės AR (leucinas, izoleucinas, valinas), be proteinų sintezę skatinančio poveikio [108, 109] taip pat skatina ir insulino išsiskyrimą, dėl šio efekto šakotos grandinės AR gali prisidėti prie glikemijos kontrolės sveikiems ir diabetu sergantiems žmonėms [110]. Iš paminėtų AR, stipriausiu insulino sekreciją skatinančiu poveikiu pasižymi leucinas. Pirmą kartą šis leucino poveikis nustatytas, kai buvo pastebėta, jog leucino papildų vartojimas idiopatinės hipoglikemijos paveiktiems vaikams gali sukelti hipoglikemiją [111]. Leucinas yra reikšmingas insulino sekrecijos skatintojas, net jei kartu su angliavandeniais suvartojama maža jo dozė (3,75 g) [112].
Yra atvejų, kai AR vartojimas turi būti ribojamas, dėl fermentų, reikalingų AR metabolizmui, trūkumo organizme. Esant fermentų trūkumui, pasireiškia padidėjusiu tarpinių metabolitų, kurie tampa toksiški, susidarymas. Dažniausiai pasitaikantis tokio pobūdžio sutrikimas – fenilalanino hidroksilazės trūkumas. Tai autosominis recesyvinis sutrikimas, kuris sukelia netoleranciją su maistu gaunamai nepakeičiamai AR fenilalaninui. Šis sutrikimas pasitaiko maždaug 1 iš 15000 asmenų. Dėl šio fermento trūkumo pasireiškia tokie sutrikimai, kaip fenilketonurija ir hiperfenilalaninemija, todėl reikalingas
nuolatinis fenilalanino kiekio kraujo plazmoje monitoravimas [113]. Šakotos grandinės ketorūgšties karboksilazės, kuri reikalinga izoleucino, leucino ir valino metabolizmui, trūkumas sukelia „Klevų sirupo“ šlapime ligą, kurios būdingiausias požymis – klevų sirupo ar deginto cukraus kvapą turintis šlapimas [114]. Hipermetionemija ir homocistinurija – tai du sutrikimai, kurie gali būti identifikuojami esant padidėjusiam metionino kiekiui. Vienos ar dviejų formų metionino adenosiltransferazės trūkumas gali sukelti hipermetionemiją, o cistationo-β-sintazės trūkumas sukelia dažniau pasitaikantį ir rimtesnį sutrikimą – homocistinuriją [115, 116]. Tirozinemija pasireiškia esant tiroziną katabolizuojančių fermentų trūkumui. Jei liga prasideda dėl citoplazminės tirozino transaminazės nepakankumo, yra II tipo tirozinemija, jei dėl fumarilacetoacetato hidrolazės nepakankamumo – I tipo. I tipo tirozinemija yra dažnesnė. Šią hidrolazę slopina fumarilacetoacetatas; slopinamas tolesnis tirozino skilimas, sumažėja inkstų kanalėlių absorbcija, sutrinka kepenų veikla. Negydomi ligoniai miršta jau pirmaisiais ligos metais [117].
1.6.5. Amino rūgščių klasifikacija
Amino rūgštys, atsižvelgiant į jų radikalo struktūrą, skirstomos į:
1. Turinčios alifatinius R-pakaitus: glicinas, alaninas, valinas, leucinas, izoleucinas (6 pav) [67, 69].
6 pav.Alifatinės AR [67].
7 pav. Ne aromatinės AR, radikale turinčios –SH grupes [67].
3. Rūgščios AR ir jų amidai: asparto rūgštis, asparaginas, glutaminė rūgštis, glutaminas (8 pav) [67, 69].
8 pav . Rūgščios AR ir jų amidai [67].
4. Bazinės AR: argininas, lizinas, histidinas (9 pav) [67, 69].
9 pav. Bazinės AR [67].
5. AR, turinčios aromatinius žiedus: fenilalaninas, tirozinas, triptofanas (10 pav.) [67, 69].
6. Imino rūgštis: prolinas (11 pav) [67, 69].
11 pav. Imino rūgštis [67].
Pagal AR sintezės organizme procesus, jos skirstomos į:
Nepakeičiamas, jų organizmas nesintetina, todėl jas būtina gauti su maistu (leucinas, izoleucinas, lizinas, metioninas, fenilalaninas, treoninas, triptofanas ir valinas) [67, 70].
Pusiau nepakeičiamas (argininas, histidinas), jas organizmas gali sintetinti iš nepakeičiamų AR, tačiau tik tuo atveju, kai šių organizme yra pakankamai [67, 70].
Pekeičiamas AR (asparaginas, sapartamo r., alaninas, glicinas, glutamo r., prolinas, serinas, tirozinas, gliutaminas, cistinas) organizme gali būti susintetinagmos iš kitų junginių [67, 70].
1.6.6. Amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga
Pirmas žingsnis, siekiant tinkamai atskirti ir identifikuoti AR, yra rasti tinkamą ekstrahavimo metodą tam, kad būtų pašalinti nepageidaujami junginiai, pavyzdžiui, polisacharidai, lipidai, fenoliai ir kt.
Dauguma AR analizės metodų apima chromatografijos naudojimą. Ankstyvi metodai, kai buvo naudojama popieriaus chromatografija, buvo tik pusiau kiekybiniai, tačiau davė daug žinių apie AR struktūrą. Šiuo metu šią techniką pakeitė kolonėliniai atskyrimo metodai, juos visus galima suskirstyti į du skyrius: pokolonėlinius ir prekolonėlinius. Pokolonėlinės derivatizacijos metu AR yra atskiriamos kolonėlėje, tuomet jos sumaišomos su derivatizuojančiu reagentu, leidžiama jiems sureaguoti ir produktai siunčiami į detektorių. Šis metodas naudojamas jonų mainų chromatografijai. Dažniausiai derivatizacijai naudojamas ninhidrinas, susidaro violetinės spalvos junginys. Metodo privalumai: reakcijos gali būti automatinės; tikslus kiekybinis nustatymas ir metodo pakartojamumas; kadangi mėginio komponentai atskiriami kolonėlėje prieš reakciją, jie nebūna paveikiami mėginio terpės derivatizacijos reakcijų metu. Metodo trūkumai: sunku naudoti didelio jautrumo analizei; santykinai didelės reagentų sąnaudos; gali būti naudojamas ribotas derivatizuojančių medžiagų kiekis; negalima naudoti greitos atvirkštinių fazių chromatografijos (angl. rapid reversed-phase chromatography)
metodo [71, 72]. Taikant prieškolonėlinę derivatizaciją, AR derivatizuojamos prieš injekciją, vėliau reakcijos produktai atskiriami ir nustatomi. Prieškolonėlinė derivatizacija naudojama dujų ir skysčių bei efektyviajai skysčių chromatografijai. Metodo privalumai: sunaudojamas mažesnis kiekis reagentų; paprastesnė prietaisų konfigūracija; padidėja jautrumas; platus derivatizuojančių reagentų pasirinkimas leidžia išsirinkti reagentą, geriausiai tinkantį detektoriui; galima naudoti greitą atvirkštinių fazių chromatografiją. Metodo trūkumai: derivatizacijos reakcijų efektyvumui gali pakenkti mėginio terpė; reakcijos produktai dažnai būna nestabilūs ir gali daryti įtaką rezultatams [48,49].
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Atliekant analizę šiuo metodu junginiai
mišiniuose atskiriami efektyviausiai, o gaunami rezultatai būna tiksliausi. Atskyrimas galimas dėl UV absorbcijos arba fluorescencijos, tačiau AR dažniausiai neturi chromoforinės grupės, dėl to reikalinga derivatizacija. AR yra labai poliški junginiai, todėl standartinių chromatografinės analizės metodų negalima naudoti be derivatizacijos, kurios pagrindiniai tikslai yra padidinti lakumą, sumažinti reaktyvumą ar pagerinti dominuojančių junginių chromatografinę elgseną. AR atveju, derivatizacijos metu aktyvūs vandenilio atomai pakeičiami į hidroksilo, amino ar sulfhidrilo polines funkcines grupes su nepoliniu fragmentu [75]. Naudojami jonų mainų chromatografijos ir atvirkštinės ESC metodai, tačiau pačiu efektyviausiu išlieka katijonų mainų chromatografija (angl. cation exchange
chromatography, CEC), kartu naudojama buferinė, dažniausiai ličio, sistema ir pokolonėlinė
derivatizacija ninhidrinu. Aptinkant absorbuojama UV šviesa. AR, kurių sudėtyje yra pirminių aminų, išskyrus imino grupės rūgštis, yra violetinės spalvos ir geriausiai absorbuojamos esant 570 nm bangos ilgiui. Imino grupės rūgštys, tokios kaip prolinas, yra geltonos spalvos ir geriausiai absorbuojamos esant 440 nm bangos ilgiui [76]. Jonų / atvirkštinių fazių skysčių chromatografijos – masių spektroskopija (angl. ion pairing reverse phase liquid chromatography coupled with mass spectroscopy,
IPRPLC-MS/MS) metodu AR galima nustatyti nevykdant derivatizacijos, taip sumažėja galimų klaidų, trukdžių,
pašalinių reakcijų tikimybė [77].
Dujų chromatografija – masių spektrometrija yra metodas su idealiai atkartojamu
sulaikymo laiku, procesas taip pat gali būti automatizuotas. Didžiausias metodo trūkumas – galimas kai kurių junginių ar jų darinių termolabilumas esant aukštai temperatūrai.
Masių spektrometrija – vienas efektyviausių metodų, kai siekiama nustatyti junginių
struktūrą. Metodo esmė – jonizacijos šaltinio suformuotų jonų atskyrimas. Taikant šį metodą, galima tiksliai išmatuoti molekulinę junginių masę, pademonstruoti mėginio grynumą. Pagrindinis metodo privalumas – tyrimui reikalingi labai maži pavyzdžio kiekiai. Tačiau tradiciškai naudojami jonizavimo metodai, tokie kaip elektronų smūgio (angl. electron impact) negali būti naudojami AR dėl jų nedidelio lakumo, nepastovaus poliškumo ir molekulinės masės. Lakumas gali būti padidintas derivatizuojant: metilinant ar trifluoroacetilinant [75].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Lietuvoje užsaugintų sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) sėklos, surinktos 2014 – 2015 metais Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo bandymų lauke. Auginta penkiolika grikių veislių: „VB Vokiai“ (VBV), „VB Nojai“ (VBN), „Kora“ (VKO), „Panda“ (VPA), „Anita Belaruskaja“ (VAB), „Smuglianka“ (VSM), „Volma“ (VVO ), „Anika“ (VAN), „Kvietka“ (VKV), „Čanita“ (VČN), „Žaleika“ (VŽA), „Mara“ (VMA), „Žniajarka“ (VŽN), „Belaruskij determinanat-1“ (VBD-1), „Belaruskij determinanat-2“ (VBD-2). Grikiai buvo auginami taikant ekologinę ir intensyvią žemdirbystės sistemas. Ekologiškai augintiems grikiams nebuvo naudojamos jokios trąšos ir kitos papildomos apsaugos priemonės, o intensyvios žemdirbystės būdu augintų grikių laukas prieš sėjant buvo tręštas mineralinėmis azoto, fosforo ir kalio trąšomis. Surinkta žaliava buvo išdžiovinta gerai vėdinant, sausoje, apsaugotoje nuo saulės spindulių vietoje, esant ne aukštesnei nei 50˚C temperatūrai. Išdžiovinta žaliava buvo sufasuota į popierinius maišelius ir laikoma sausoje, tamsioje vietoje. Augalinės žaliavos mėginai buvo auginami, ruošiami ir analitinės priemonės įsigytos remiant LMT (projekto numeris SVE-02/2014).
2.2. Naudota aparatūra
Augalinė žaliava susmulkinta elektriniu smulkintuvu „BOSH MKM6003“ („Bosch“, Vokietija), atsverta elektroninėmis svarstyklėmis „Shimadzu AUW120D“ („SHIMADZU EUROPA GmbH“, Vokietija). Žaliavos nuodžiūvis nustatytas laboratoriniu drėgmės analizatoriumi „Kern DBS 60-3“ („Kern & Sohn GmbH“, VO kietija). Vanduo tyrimams ir ekstraktų gamybai išvalytas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. Ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Ultrasonic Cleaner Set WUC – A06H“ („Witeg Labortechnik GmbH“, Vokietija), centrifugavimas atliktas „Centurion Scientific C2006“ („Centurion Scientific Ltd“, Jungtinė Karalystė) centrifuga. Ekstraktai filtruoti naudojant membraninius švirkštinius 0,22 μm porų dydžio filtrus („Carl Roth GmbH + Co. KG“, Vokietija). Tiriamųjų junginių analizė atlikta su Waters XeVO TQD masių spektrometru („Waters“, JAV) ir Waters Acquity H class skysčių chromatografu („Waters“, JAV). Analičių skirstymas atliktas naudojant hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografinę (HILIC) kolonėlę Merck SeQuant ZIC-HILIC (100Å 3,5 µm, 150 ×2,1 mm) („Merc”, JAV).
2.3. Naudoti reagentai
Tyrimų metu naudoti gradientinio švarumo reagentai: acetonitrilas, amonio acetatas, metanolis, įsigyti iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). Išgrynintas dejonizuotas vanduo paruoštas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. 96 proc. V/V etanolis įsigytas iš „Vilniaus degtinė“ (Lietuva). ESC grynumo standartiniai junginiai: fagominas, argininas, alaninas, aspartamo r., cistinas, glutamo r., glicinas, histidinas, izoleucinas, leucinas, lizinas, metioninas, fenilalaninas, prolinas, serinas, treoninas, tirozinas ir valinas buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). Visi naudoti reagentai buvo >97% grynumo.
2.4. Ekstraktų ruošimo metodika
Prieš atliekant esktraktų paruošimą, buvo įvertinta žaliavos kokybė ir apsikaičiuotas jos nuodžiūvis, buvo nustatyta, jog tyrimui naudojama žaliava atitinka Europos farmakopėjos nuodžiūvio reikalavimus (Europos farmakopėjos 01/2008:20232 straipsnis) ir neviršija 10 proc.
Gaminami etanoliniai ekstraktai. Atsveriama po 0,5 g (±0,01) iki miltelių elektriniu malūnėliu sumaltos augalinės žaliavos, užpilama 4 ml 60% V/V koncentracijos etanoliu, atsargiai išmaišoma. Ekstrajuojama 5 min ultragarso vonelėje. Temperatūra – 25˚C. Vėliau ekstraktai dedami į centrifugą ir centrifuguojami 5 min, apsisukimų greitis – 7500. Gautas ekstraktas nupilamas, tie patys žingsniai kartojami dar du kartus (žaliava vėl ekstrahuojama du kartus, kiekvieną kartą naudojant po 3 ml etanolio). Gauti ekstraktai nupilami į 10 ml kolbutes ir pripilama etanolio iki 10 ml ribos.
Gauti ekstraktai sandariai uždaromi ir laikomi šaldytuve.
2.5. Standartų paruošimas
Standartų tirpalai paruošti iš ESC grynumo standartinių junginių: fagomino, arginino, alanino,
aspartamo r., cistino, glutamo r., glicino, histidino, izoleucino, leucino, lizino, metionino, fenilalanino, prolino, serino, treonino, tirozino ir valino. Standartines medžiagas skiedžiant metanoliu pagaminti skirtingų koncentracijų tirpalai ir nubraižytos kalibracinės kreivės.
2.6. Amino rūgščių ir iminocukrų kokybinė ir kiekybinė analizė sėjamųjų grikių
sėklose
Tiriamųjų junginių analizė buvo atlikta su Waters XeVO TQD masių spektrometru ir Waters Acquity H class skysčių chromatografu. Analičių skirstymui pagal jų hidrofiliškumą pasirinkta taikyti hidrofilinių saveikų skysčių chromatografinę (HILIC) kolonėlę Merck SeQuant ZIC-HILIC (100Å 3,5 µm, 150 ×2,1 mm). Taikomas gradientinės eliucijos metodas. Judri fazė sudaryta iš 50 mM amonio acetato vandeninio tirpalo, kurio pH 4,5 (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Judrios fazės tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Gradientinių sąlygų kitimas pavaizduotas pirmoje lentelėje.
1 lentelė. Judrios fazės gradiento kitimo priklausomybė nuo laiko.
Laikas Proc. A Proc. B
0 min. 20 80 5 min. 20 80 6 min. 35 65 10 min. 50 50 11 min. 50 50 11,2 min. 20 80 15 min. 20 80
Masių spektrometro parametrai: kapiliaro įtampa – 3200 V, jonų šaltinio temperatūra 150°C, eliuento išgarinimo temperatūra - 600°C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 1000 L/val. Kūgio įtampa ir susidūrimo energija nustatoma individualiai pasirinktam tiriamajam komponentui (2 lentelė).
2 lentelė. Tiriamųjų komponentų kūgio įtampa ir susidūrimo energija.
Tiriamasis komponentas Kūgio įtampa (V) Susidūrimo energija (V)
Glicinas 12 6
Alaninas 16 10
Serinas 14 8
Valinas 12 10 Treoninas 38 20 Leucinas 16 10 Aspartamo r. 14 10 Lizinas 14 14 Glutaminas 12 14 Metioninas 14 10 Histidinas 20 16 Fenilalaninas 18 14 Argininas 16 14 Tirozinas 16 16 Cisteinas 28 20 Fagominas 24 14
Fagomino ir AR koncentracijos ekstrakte apskaičiuojama pagal formulę: 𝑐 =𝑎 ∗ V
𝑔 ∗ 100 100 − 𝑛 c – nustatomo junginio kiekis (mkg/g)
a – koncentracija, nustatyta iš kalibracinės kreivės (mkg/ml) ( 3 lentelė) V – visas ekstrakto tūris (ml)
g – atsvertos žaliavos masė (g) n – nuodžiūvis
3 lentelė. Fagomino ir AR kalibracinės lygtys ir regresijos koeficientai.
Nustatoma medžiaga Kalibracinė lygtis Regresijos koeficientas R²
Fagominas 108968x+173,484 0,992 L-Alaninas -1,1316*x²+984,712*x+3397,15 0.969393
Valinas -9.64054 * x² + 4279.17 * x + 8055.17 0.991479 Glicinas -0.0146391 * x² + 69.1053 * x 0.981780 L-Argininas -0.13466 * x² + 651.295 * x + 2834.99 0.989211 DL-Metioninas -22.5945 * x² + 3682.9 * x + 2637.97 0.996907 L-Prolinas -6.40746 * x² + 6380.02 * x 0.970002 L-Lizinas -0.576159 * x² + 777.079 * x + 518.741 0.997997 L-Treoninas -0.263619 * x² + 126.708 * x + 689.755 0.981830 DL-Fenilalaninas -15.4941 * x² + 7079.66 * x + 14059.2 0.994778 DL-Asparto r. -0.00684015 * x² + 46.9189 * x + 571.384 0.987257 DL-Leucinas -0.720899 * x²+ 3298.42 * x 0.941223 L-Cistinas -0.056678 * x² + 175.379 * x + -17.997 0.996692 L-Tirozinas -3.86786 * x² + 1076.77 * x + 2657.97 0.978259 Izoleucinas -45.258 * x² + 8858.56 * x + 4162.99 0.988111 Glutamo r. -0.0175131 * x² + 167.105 * x + 11041.6 0.994022
2.7. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenys statistiškai įvertinti naudojat „IBM SPSS Statistics 20“ („IBM“, JAV) statistinį paketą. Duomenims įvertinti buvo apskaičiuotas tyrimo duomenų aritmetinis vidurkis ir standartinis nuokrypis (SN). Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas naudojant Spirmeno koreliacinį koeficientą. Gautų rezultatų statistinis patikimumas įvertintas naudojant vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA). Atskiros duomenų grupės įvertintos taikant oposteriorinį Turkey kriterijų. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jei p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Kokybinis fagomino nustatymas sėjamųjų grikių sėklose
Sėjamųjų grikių sėklų ekstraktuose SC-MS metodu, lyginant sulaikymo trukmę ir analizuojant jonų chromatogramą, buvo identifikuota šešiolika junginių: fagominas ir penkiolika AR (l-alaninas, d-serinas, valinas, glicinas, l-argininas, metioninas, l-prolinas, l-lizinas, l-treoninas, fenilalaninas, aspartamo r., leucinas, l-tirozinas, izoleucinas, glutamo r.). Standartinio tirpalo ir vieno iš tirtų ekstraktų (veislė ABV) chromatograma pateikta 12 paveiksle.
12 pav. A – standartinio fagomino tirpalo chromatograma. B – ABV veislės grikių sėklų chromatograma.
3.2. Kiekybinis fagomino ir AR nustatymas sėjamųjų grikių sėklose
Atlikus kokybinę fagomino ir AR analizę ir sėjamųjų grikių sėklų ekstraktuose identifikavus fagominą ir penkiolika AR (alaniną, seriną, valiną, gliciną, argininą, metioniną, proliną, liziną, treoniną, fenilalaniną, aspartamo r., leuciną, izoleuciną, tiroziną, glutamo r.) buvo įvertintas šių junginių kiekybinis
pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose.
13 pav. Suminis junginių, rastų sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose, kiekis (mkg/g).
Iš gautų rezultatų matoma, jog grikių sėklose vyraujantis junginys yra glutamo r., grikius auginant ekologiškai, jos daugiausia nustatyta 2015 m. derliuje (10491,60±506,17 mkg/g), o intensyviai – 2014 m. (10491,60±412,16 mkg/g). Kiti du vyraujantys junginiai – l-argininas ir aspartamo r., jų suminiai kiekiai yra atitinkamai 3,43 ir 3,77 kartų mažesni už suminį glutamo r. kiekį. Abiejų paminėtų medžiagų didžiausi kiekiai nustatyti 2014 m. grikius auginant intensyvios žemdirbystės būdu (l-arginino – 3803,57±209,54 mkg/g; aspartamo r. – 171,60±305,26 mkg/g).
Metionino ir glicino grikių sėklose nustatyta mažiausiai. Didžiausias metionino kiekis rastas 2015 m., auginant ekologiškai (33,71±2,91 mkg/g), o glicino – 2014 m., auginant intensyvios žemdirbystės būdu (54,47±4,57 mkg/g).
Kiekvienos AR kiekio, nustatyto grikių sėklose, rezultatai plačiau aptariami tolimesniuose skyriuose.
1. Fagomino kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis, sėklose
Fagomino kiekybinis pasiskirstymas pavaizduotas 14-ame paveiksle.
76 .5 7 45 4. 83 87 .0 6 25 8. 16 43 .2 2 29 41 .2 1 19 .0 0 96 .1 5 19 3. 50 26 1. 47 20 9. 98 27 59 .7 4 26 4. 02 22 1. 31 12 7. 90 10 00 9. 20 10 2. 89 56 9. 64 10 8. 69 29 9. 84 54 .4 7 38 03 .5 7 25 .1 8 11 1. 97 28 1. 08 32 4. 95 24 6. 69 31 71 .6 0 31 3. 69 19 4. 09 15 9. 58 10 69 6. 0 7 94 .4 9 42 5. 79 13 9. 83 31 4. 76 29 .2 1 24 41 .6 1 33 .7 1 11 3. 37 16 7. 02 32 6. 71 23 2. 75 25 05 .9 8 29 3. 69 25 0. 86 14 4. 45 10 49 1. 61 10 1. 56 45 5. 65 10 3. 74 29 5. 87 35 .8 3 27 50 .6 3 30 .0 9 10 2. 38 17 7. 50 27 9. 21 20 3. 37 2416 .3 1 26 7. 23 20 5. 48 14 9. 45 98 00 .6 4 0.00 2000.00 4000.00 6000.00 8000.00 10000.00 12000.00
Suminiai nustatytų junginių kiekio įvairavimai grikių
sėklose (mkg/g)
14 pav. Fagomino kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis sąlygomis, sėklose (n=3). * - statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnis kiekis, lyginant su kita žemdirbystės sistema.
Atlikus kiekybinę analizę, didesni fagomino kiekiai nustatyti intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų grikių veislių sėklose (suminiai fagomino kiekiai: 2014/2015 m. ekologiškai augintoje žaliavoje 76,57±0,89 / 94,49±0,64 mkg/g; 2014/2015 m. intensyvios žemdirbystės būdu augintoje žaliavoje 102,89±0,88 / 101,56±0,66 mkg/g). Fagomino koncentracija ekologinėmis sąlygomis užaugintų grikių veislių sėklose svyruoja nuo 3,19±0,33 iki 7,11±0,75mkg/g, intensyviomis – nuo 5,68±0,59, iki 8,70±0,91mkg/g (14 pav.). Didžiausias fagomino kiekis nustatytas intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų VPA (2014 m.: 8,70±0,91 mkg/g, 2015 m.: 8,45±0,89 mkg/g) veislės sėklose, šie kiekiai yra atitinkamai 22,36 ir 18,85 proc. didenis už 2014 m. ekologineje žemdirbystės sistemoje VAB veislės sėklose nustatytą didžiausią fagomino kiekį (7,11±0,75 mkg/g). Mažiausias fagomino kiekis nustatytas 2014 m. VKV veislės sėklose, augintose ekologiniu būdu (3,19±0,33 mkg/g), o auginant intensyviai, mažiausi fagomino kiekiai rasti VBV veislės sėklose, užaugintose 2015m. (5,68±0,59 mkg/g).
Lyginant gautus rezultatus su kitų mokslininkų gautais rezultatais, tiriamajame darbe grikių sėklose nustatyti mažesni fagomino kiekiai. Ispanijos mokslininkai sėjamųjų grikių (veislė nenurodyta) sėklas, įsigytas Madrido turguje, ekstrahavo 0,1% HCl tirpalu. Ekstraktus ištyrus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu, buvo nustatyta 46,0 ir 54,0 mkg/g fagomino [78]. Tie patys Ispanijos mokslininkai po metų pristatė tyrimą, kurio metu grikių sėklų (veislė nenurodyta) mėginiai buvo ekstrahuojami vandeniu veikiant 10 Mpa slėgiui ir 50˚C temperatūrai, vėliau ekstraktai praskiesti
acetonitrilu (vanduo:acetonitrilas 20:80). Ekstraktus ištyrus SC-MS metodu, grikių sėklose rasta 11,4 mkg/g fagomino [79]. Norint palyginti grikių sėklose nustatyto fagomino kiekius su kituose augaluose randamu kiekiu, analizuoti tyrimai, atlikti su šilkmedžiais. Tiriant baltųjų ir juodųjų šilkmedžių lapų ir uogų mėginius (ekstrahuota 0,1% HCl tirpalu) dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu, baltųjų šilkmedžių lapuose nustatyta nuo 0,12±0,01 iki 0,66±0,09 mg/g, uogose – 0,05±0,00 mg/g fagomino; juodųjų šilkmedžių lapuose – 0,05±0,00 mg/g, vaisiuose – 0,22±0,10 mg/g fagomino [80]. Didžiausiais nustatytas fagomino kiekis Lietuvoje augintuose grikiuose yra 0,008 mg/g (VPA veilsė, 2014 m., auginta ekologiškai) – fagomino kiekiai grikiuose ženkliai mažesni už kiekį šilkmedžiuose.
Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad fagomino kiekis tarp kai kurių grikių veislių skiriais statistiškai reikšmingai (p<0,05). 2014 m. ekologinės žemdirbystės sistemoje statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas nustatytas tarp VKV ir VBN / VKO/ VPA/ VAB/ VVO/ VAN/ VŽA/ VMA/ VŽN/ VBD-1/ VBD-2, VČA ir VAN/ VKO/ VVO/ VAN/ VMA/ VŽN/ VBD-1/ VBD-2 bei VBD-1 ir VAM, o intensyvioje – tarp VBV ir VKO/ VPA, VPA ir VAB/ VAM/ VČA/ VBD-2 bei tarp VBD-2 ir VKO. 2015 m. ekologinės žemdirbystės sistemoje statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp veislių nenustatytas, o auginant intensyvios žemdirbystės būdu nustatytas tarp VPA ir VBV/ VČA/ VŽA. Įvertinus, ar yra statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) toje pačioje veislėje tarp skirtingų žemdirbystės sistemų, statistiškai reikšmingas skirtumas 2014 m. nustatytas VKV, VČA, VPA, VBN, VSM, VŽA, VVO , VKO veislėse, fagomino kiekis jose, auginant intensyvios žemdirbystės būdu, yra atitinkamai 106.94, 86.68, 74.16, 42.62, 36.96, 35.16, 34.34 ir 34.19 proc. didesnis, nei auginant ekologiškai. 2015 m. statistiškai reikšmingas skirtumas tarp žemdirbystės sistemų nenustatytas. Atsižvelgiant į grikių sėklose sukauptą fagomino kiekį, tinkamiausios auginimui yra intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintos VPA ir VKO grikių veislės.
2. L-Alanino kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis, sėklose
15 pav. Alanino kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis sąlygomis, sėklose (n=3). * - statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnis kiekis, lyginant su kita žemdirbystės sistema.
Apžvelgus kiekybinės analizės rezultataus, didesni alanino kiekiai nustatyti intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų grikių veislių sėklose (suminiai alanino kiekiai: 2014/2015 m. ekologiškai augintoje žaliavoje 454,83±5,05 / 425,79±2,73 mkg/g, 2014/2015 m. intensyvios žemdirbystės būdu augintoje žaliavoje 569,64±2,45 / 455,65±3,64 mkg/g). Alanino koncentracija ekologinėmis sąlygomis užsaugintų grikių sėklose svyruoja nuo 18,76±1,97 mkg/g iki 36,07±3,78 mkg/g, o intensyvios žemdirbystės sąlygomis – nuo 24,79±2,60 mkg/g iki 42,90±4,51 mkg/g (15 pav.). Didžiausi alanino kiekiai nustatyti intensyvios žemdirbystės sąlygomis 2014 m. užaugintų VVO (42,90 ±4,51 mkg/g) ir 2015 m. VBN veislės sėklose (39,86±4,19 mkg/g). Nustatyti kiekiai yra atitinkamai 18,94 ir 10,51 proc. didesni už didžiausią ekologinės žemdirbystės būdu augintos VBN veislės sėklose 2014 m. rastą alanino kiekį (36,07±3,79 mkg/g). Mažiausias alanino kiekis nustatytas 2014 m. ekologiniu būdu augintų VKV veislės sėklose (18,76±1,98 mkg/g), o auginant intensyvios žemdirbystės būdu, mažiausi kiekiai rasti VČA veislės sėklose (24,79±2,60 mkg/g).
Panašios krypties mokslinių tyrimų, kuriuose būtų nustatinėjamas laisvų AR kiekis sėjamųjų grikių sėklose, beveik nėra. Lyginant gautus rezultatus su Pietų Korėjos mokslininkų atliktu tyrimu, kurio metu buvo tiriamos grikių sėklos (veislė nenurodyta), užaugintos Pietų Korėjoje, Lietuvoje užaugintuose grikiuose alanino kiekiai buvo mažesni. Pietų Korėjos mokslininkai grikių sėklas, kurios buvo išdžiovintos šaldant, ekstrahavo 3% trichloracto rūgšties tirpalu. Mėginys 1 val. buvo paliktas kambario temperatūroje, veliau centrifuguojamas. Gautas ekstraktas nupiltas ir analizuotas didelės spartos AR analizatoriumi L-8800 (ang. high-speed amino acid analyzer (Hitachi, Japan)). Šio tyrimo
