FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Kipras Pautienius
Benzodiazepinų mišinio, sudaryto iš diazepamo, alprazolamo ir dikalio
klorazepato, tyrimas dujų chromatografijos-masės spektrometrijos metodu ir
kokybinis nustatymas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas: Doc. dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data)
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
Benzodiazepinų mišinio, sudaryto iš diazepamo, alprazolamo ir dikalio
klorazepato, tyrimas dujų chromatografijos-masės spektrometrijos metodu ir
kokybinis nustatymas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas: Doc. dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data) Kaunas, 2017 Darbą atliko Magistrantas Kipras Pautienius Data Recenzentas
Vardas Pavardė Parašas Data
Turinys
SANTRUMPOS ... 7
1. ĮVADAS ... 8
2. Literatūros apžvalga ... 10
2.1. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas ... 10
2.1.1. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 10
2.1.2 Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas Baltijos šalyse ... 11
2.1.3. Apsinuodijimai vaistiniais preparatais Lietuvoje ... 11
2.2. Tiriamos vaistinės medžiagos ... 13
2.2.1 Alprazolamas ... 13
2.2.2 Diazepamas ... 14
2.3.3 Dikalio klorazepatas ... 16
2.4. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kiekybinis ir kokybinis vertinimas dujų chromatografija-masių spektrometrija ... 17
2.5. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinis nustatymas ultraefektyviąja skysčių chromatografija ... 20
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 22
3.1 Tyrimo objektas ir metodika ... 22
3.1.1 Tyrimo objektas ... 22
3.1.2 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu .. 22
3.1.3. Kokybinis vertinimas ultraefektyviąja skysčių chromatografija ... 23
3.2 Rezultatai ir jų aptarimas ... 24
3.2.1. Mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato, kokybinis tyrimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. ... 24
3.2.2. Dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikos validacija ... 26
3.2.3. Vaistinių preparatų analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ... 32
3.2.4 Kiekybinė vaistų mišinio analizė ... 35
3.2.5 Ultraefektyvioji skysčių chromatografijos metodikos parinkimas ... 35
3.2.6. Vaistinių preparatų tyrimas ultraefektyviąja skysčių chromatografija ... 36
5. IŠVADOS ... 38
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
SANTRAUKA
Benzodiazepinų mišinio, sudaryto iš diazepamo, alprazolamo ir dikalio
klorazepato, tyrimas dujų chromatografijos-masės spektrometrijos metodu ir
kokybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kipro Pautieniaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: alprazolamas, diazepamas, dikalio klorazepatas, dujų chromatografija-masių spektrometrija, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, kokybinis ir kiekybinis vertinimas.
Darbo tikslas: Pritaikyti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, mišinio sudaryto iš alprazolamo, diazepam ir dikalio klorazepato kiekybiniam ir kokybiniam įvertinimui.
Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimu objektu pasirinktas vaistinių preparatų alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinys. Tyrimuose naudoti 0,2 mg/ml etaloniniai tirpalai ir jų mišinys. Dujų chromatografijoje-masių spektrometrijoje naudota sistema GCMS-QP2010, mėginiai identifikuoti pagal sulaikymo laikus ir masių spektrus. Parinkta metodika pritaikyta tiriant darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“.
Ultraefektyviosois skysčių chromatografijoje naudotas ultraefektyvusis skysčių chromatografas (UESC) „Waters ACQUITY H UPLC“ su fotodiodų matricos detektoriumi „ACQUITY YPLC PDA eλ“. Parinkta metodika pritaikyta tiriant darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“.
Rezultatai ir išvados: Optimizavus dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodiką, ji pritaikyta vaistinių preparatų „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“ kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui. Ištyrus darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų, gauti tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai atitiko pasikliautinojo intervalo, nustatyto optimizuotai dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikai reikšmes. Optimizuota dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodika yra tinkama atlikti alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinį ir kiekybinį nustatymą.
Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodas buvo taikomas kokybinei vaistinių preparatų „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“ analizei. Ištyrus darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų, gauti tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai atitiko pasikliautinojo intervalo, nustatyto ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikai reikšmes. Nustatyta, kad alprazolamo ir diazepamo sulaikymo laikai labai panašūs, todėl metodika nėra tinkama tiriamųjų medžiagų mišinio
Benzodiazepine mixture of alprazolam, diazepam and dipotassium clorazepate qualitative and quantitative analysis using gas chromatography-mass spectrometry and qualitative analysis
using ultrahigh performance liquid chromatography
Key words: alprazolam, diazepam, dipotassium clorazepate, gas chromatography-mass spectrometry, high performance liquid chromatography, quantitative and qualitative analysis.
Aim: to optimize gas chromatography-mass spectrometry method for quantitative and qualitative analysis of alprazolam, diazepam and dipotassium clorazepate. To optimize ultrahigh performance liquid chromatography for qualitative analysis of alprazolam, diazepam and dipotassium clorazepate.
Object and methods: Benzodiazepine mixture of alprazolam, diazepam and dipotassium clorazepate was chosen as an analysis object. For the qualitative and quantitative analysis the stock solutions of 0,2 mg/ml concentration were used. Gas chromatography-mass spectrometry was performed with system GCMS-QP2010, samples were identified with retention times and mass spectrum. Method was used with pharmaceutical products “Xanax”, “Diazepeks” and “Tranxene”.
UHPLC method was used for the qualitative analysis of alprazolam, diazepam and dipotassium clorazepate. For the analysis chromatographic column „ACQUITY UPLC BEH C18 2,1x50mm (Waters)“ with photo diode array detector „ACQUITY YPLC PDA eλ“.. Method was used with pharmaceutical products „Xanax“, „Diazepeks“ and „Tranxene“.
Results: Optimized GC-MS method was used for quantitative and qualitative analysis of pharmaceutical products „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“. After the analysis of sample solutions, the retention times were almost identical to the retention times that were obtained from stock samples. The optimized GC-MS method is suitable for the qualitative and quantitative analysis.
UHPLC method was used for the qualitative analysis of the pharmaceutical products „Xanax“, „Diazepeks“ ir „Tranxene“. The retention times obtained from the sample solutions were almost identical to the retention times obtained from the stock solutions. Method still needs further development as retention times of alprazolam and diazepam were almost identical.
SANTRUMPOS
DDD – nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
LTVSPĮ – Lietuvos teritorinių visuomenės sveikatos priežiūros įstaigos Rt – sulaikymo laikas
TS – tirpiklių sistema UV – ultravioletinė šviesa
VVKT – Valstybinė Vaistų Kontrolės Tarnyba DC-MS – dujų chromatografija-masių spektrometrija UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija
1. ĮVADAS
Didėjantis vaistų suvartojimas Lietuvoje verčia susimąstyti apie šio reiškinio pasekmes. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis 2014 metais Lietuvoje buvo parduota 72 302 628 vaistinių preparatų pakuočių, iš kurių 39 % buvo nereceptiniai vaistiniai preparatai. Vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per ketverius metus išaugo beveik 20 procentų. Per ketverius metus Lietuvoje benzodiazepinų suvartojamas kiekis išaugo beveik 25 procentais [5]. Nervų sistemą veikiantys vaistai Lietuvoje yra antri pagal suvartojamumą, nusileidžiantys tik širdies ir kraujagyslių sistemą veikiantiems vaistams [3].
Toks tendencingas didėjantis vaistinių preparatų suvartojimas yra tiesiogiai susijęs su apsinuodijimo vaistiniais preparatais rizika. 2012 m. pateiktoje Lietuvos sveikatos apsaugos ministerijos „Žmonių apsinuodijimų, išanalizuotų 2007–2011 metais, lyginamojoje analizėje“ matyti, jog medikamentais per 2011 m. iš viso apsinuodijo 751 žmogus. Iš visų 2011 m. ištirtų apsinuodijimo medikamentais atvejų didžiąją dalį sudarė apsinuodijimai psichotropiniais vaistais [6]. Apsinuodijimai vaistiniais preparatais galimi dėl neteisingai pavartotos vaisto dozės, tyčinio perdozavimo, aplaidumo arba pasireiškusios vaistų sąveikos. Siekiant kaip įmanoma labiau sumažinti apsinuodijimo medikamentais pasekmes reikalingas greitas, atrankus, gebantis identifikuoti kelis junginius vienu metu analizės metodas, kurio pagalba būtų galima lengviau nustatyti apsinuodijimą sukėlusią medžiagą. Greitas ir efektyvus apsinuodijimą sukėlusios medžiagos nustatymas mažina mirties tikimybę ir padeda lengviau nustatyti tikslią mirties priežastį.
Darbe apžvelgiama benzodiazepinų mišinio, sudaryto iš diazepamo, alprazolamo ir dikalio klorazepato, kokybinė ir kiekybinė analizė taikant optimizuotas dujų chromatografijos-masės spektrometrijos bei ultraefektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikas. Pateikiama bei nagrinėjama literatūra, susijusi su tiriamųjų preparatų savybėmis, farmakologiniu poveikiu, jų svarba, apsinuodijimų atvejais, paplitimu Lietuvoje bei užsienyje. Darbo eksperimentinėje dalyje pateikiamos mišinio komponentų atskyrimo, identifikavimo bei kiekybinio nustatymo metodikos taikant dujų chromatografijos-masės spektrometrijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo metodiką.
Darbo tikslas: Parinkti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkančias atlikti alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinį bei kiekybinį vertinimą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodiką, kuri būtų tinkama alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato ir šių medžiagų mišinio kokybiniam ir kiekybiniam vertinimui.
2. Parinkti ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato ir šių medžiagų mišinio kokybiniam vertinimui.
3. Pritaikyti parinktas mišinio tyrimo metodikas diazepamo, alprazolamo ir dikalio klorazepato, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui.
2. Literatūros apžvalga
2.1. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas
2.1.1. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas Lietuvoje
Siekiant įvertinti bei palyginti vaistų suvartojimą tarp įvairių šalių, vietovių ar gydymo įstaigų įprastai remiamasi ATC-DDD metodu, kuris leidžia išanalizuoti ir įvertinti vaistų paskyrimo bei suvartojimo tendencijas. Vaistinių preparatų suvartojimo statistika pateikiama naudojant ATC/DDD metodologiją. Vaistų suvartojimas yra pateikiamas DDD (Pasaulinės sveikatos organizacijos nustatyta vaisto vidutinė terapinė dienos (paros) dozė) skaičiumi, tenkančiu 1000 gyventojų per vieną dieną [5].
Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis 2014 metais Lietuvoje buvo parduota 72 302 628 vaistinių preparatų pakuočių, iš kurių 39 % buvo nereceptiniai vaistiniai preparatai. Vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per ketverius metus išaugo nuo 826 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2010 m.) iki 1065 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2014 m.). 2014 m. Lietuvoje daugiausiai buvo suvartojama širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų – 450,4 DDD/ 1000/ per dieną. Tai 3 kartus daugiau nei antroje vietoje esančių nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimas (149,6 DDD/1000/per dieną) ir trečioje vietoje esančių virškinimo traktą ir metabolizmą veikiančių vaistų suvartojimas (126,1 DDD/1000/per dieną) [5].
Benzodiazepino darinių, pagal ATC klasifikaciją, priskiriamų N05BA pogrupiui, bendras suvartojimas 2010-2016 metais pateikiamas (1 lentelė).
1 lentelė. Benzodiazepino darinių suvartojimas Lietuvoje 2010 – 2016 metais. ATC
KODAS Pavadinimas
DDD/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną
2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai 2016 metai N05BA Benzodiazepino dariniai 36,339 37,099 40,463 41,371 41,604 40,96 40,733 N05BA01 Diazepamas (DDD 10 mg) 5,947 5,843 6,083 5,913 5,738 5,42 5,072 N05BA05 Klorazepato kalio druska
(DDD 20 mg)
0,703 0,710 0,773 0,798 0,772 0,73 0,704
2.1.2. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimas Baltijos šalyse
Siekiant įvertinti alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato vartojimo paplitimą Baltijos šalyse pateikiama diagrama, kurioje lyginami Lietuvos, Latvijos ir Estijos (2013-2015 metų) vaistų suvartojimo duomenys (1 pav.) [4].
Lietuvoje benzodiazepinų darinių suvartojama beveik du su puse karto daugiau nei Latvijoje ar Estijoje.
1 Pav. Benzodiazepinų darinių suvartojimas Baltijos šalyse 2013-2015 metais. 2.1.3. Apsinuodijimai vaistiniais preparatais Lietuvoje
Apsinuodijimai vaistiniais preparatais yra viena dažniausių apsinuodijimo priežasčių Lietuvoje. Remiantis LTVSPĮ duomenimis, 2011 m. užfiksuoti 751 apsinuodijimo medikamentais atvejai, kurie sudarė 41,5 % visų nustatytų apsinuodijimo atvejų. Ištyrus apsinuodijimo aplinkybių pasiskirstymą pagal amžių nustatyta, kad vaikai 2011 m. atsitiktinai žymiai dažniau buvo apsinuodiję įvairiomis medžiagos nei suaugusieji (atitinkamai 26,6% ir 9,7%). Panaši tendencija buvo 2008–2010 m.
Išnagrinėjus tyčinių 2011 m. apsinuodijimų priežastis (2 pav.), nustatyta, kad daugiausia (50,9%) tokių apsinuodijimų įvyksta dėl piktnaudžiavimo įvairiomis medžiagomis, savižudybės
tikslu (4,7% mažiau nei 2010 m.). 2011 m. daugiau fiksuota apsinuodijimo atvejų ar klaidingai panaudojus medžiagą (2,5% atv. daugiau nei 2010 m.) [6].
2 Pav. Tyčinių apsinuodijimo atvejų pasiskirstymas pagal priežastis 2007–2011 m.
Medikamentais per 2011 m. iš viso apsinuodijo 751 žmogus (41,5% visų ištirtų atvejų), o 2010 m. per tą patį laikotarpį – 825 (41,6% visų ištirtų apsinuodijimų). Iš visų 2011 m. ištirtų apsinuodijimo medikamentais atvejų didžiąją dalį sudarė apsinuodijimai psichotropiniais vaistais. Apsinuodijimo atvejų medikamentais pasiskirstymas pateiktas 3 pav. [6].
2.2. Tiriamos vaistinės medžiagos 2.2.1. Alprazolamas
Alprazolamas – benzodiazepinų grupei priskiriamas vaistinis preparatas, pasižymintis nerimą mažinančiomis ir raminamosiomis savybėmis. Vaistas plačiai vartojamas gydyti nerimą ir centrinės nervų sistemos sutrikimus, tokius kaip panikos sutrikimas ir generalizuotas nerimo sutrikimas [12,16]. Lietuvoje alprazolamas registruotas kaip vaistiniai preparatai: „Alprasedon“, „Alprazolam-Grindeks“, „Alprazolam Ingen Pharma“, „Alprazolam Orion“, „Frontin“, „Xanax“, „Zomiren“ [31].
C17H13ClN4 Molekulinė masė - 308,8 g/mol
IUPAC: 8-chlor-1-metil-6-fenil-4H-[1,2,4]tirazolo[4,3-a][1,4]-benzodiazepinas
Savybės. Balti kristaliniai milteliai, dalinai tirpūs alkoholyje ir acetone, gerai tirpūs chloroforme ir dichlormetane, praktiškai netirpūs vandenyje. Miltelių lydimosi temperatūra yra 228-228,5 °C [25].
Farmakologija. Alprazolamas lengvai prasiskverbia pro hematoencefalinį barjerą ir patenka į centrinę nervų sistemą. Nors tikslus benzodiazepinų veikimas nėra žinomas, alprazolamas neselektyviai jungiasi su γ-amino sviesto rūgšties (GABA) receptorių kompleksu [15]. Prisijungęs prie receptorių alprazolamas didina chloro jonų kanalų atsidarymo dažnį taip sukeldamas nervinių ląstelių hiperpoliarizaciją. Alprazolamo farmakologinis poveikis priklauso nuo dozės, naudojant mažas terapines dozes pasireiškia nerimo mažinimo, sedacinis bei raumenis atpalaiduojantis poveikis [18].
Farmakokinetika. Suvartojus įprastą 1 mg alprazolamo dozę, didžiausia vaistinio preparato koncentracija plazmoje susidarė po 1-2 valandų, pusinės eliminacijos periodas nuo 9 iki 16 valandų ir klirensas nuo 0,7 iki 1,5 ml/min/kg. Vartojant per burną apytikriai 90 % alprazolamo absorbuojama ir prijungiama prie plazmos baltymų. Pažymima, jog senyvo amžiaus pacientų klirensas yra mažesnis, metabolizmas - lėtesnis dėl to reikia koreguoti dozes [12,1].
Metabolizmas. Alprazolamas metabolizuojamas kepenyse, jį metabolizuoja P450 3A4 (CYPA3A4) citochromas. Kol kas yra identifikuoti 29 alprazolamo metabolitai, iš kurių pagrindiniai yra 4-hidroksialprazolamas bei alfa-hidroksialprazolamas. Apytiksliai 80 % dozės yra šalinama kartu
su šlapimu, jame yra 11 % nepakitusio alprazolamo, 15 % α-hidroksialprazolamo ir 9 % benzofenono metabolitų. Apytiksliai 7 % dozės yra pašalinamasu išmatomis [14].
Toksinis poveikis. Lyginant alprazolamo perdozavimo toksinį poveikį su kitais benzodiazepinais, pastebėta, jog alprazolamo perdozavimas yra labiau kenksmingas nei kitų benzodiazepinų. Jis pasireiškia dėl centrinės nervų sistemos slopinimo. Mažos alprazolamo dozės sukelia svaigulį, koordinacijos ir regėjimo sutrikimus, raumenų silpnumą. Vartojant labai dideles alprazolamo dozes gali ištikti koma, sunkėja kvėpavimas ir žmogus gali mirti. Tiriant sunkius apsinuodijimus bei mirtinus apsinuodijimo atvejus, žmonių kraujyje papildomai dažnai randama alkoholio bei opiatų metabolitų [16].
Didžiausia kraujyje užfiksuota laprazolamo koncentracija mirties atveju buvo 2,1 mg/l. Apsinuodijimo alprazolamu atveju būtina imtis detoksikacijos priemonių [17]. Alprazolamo perdozavimo ir apsinuodijimų atvejais plačiausiai vartojamas yra flumazenilis [13,17].
2.2.2. Diazepamas
Diazepamas – benzodiazepinų grupei priskiriamas vaistinis preparatas, pasižymintis nerimą bei traukulius slopinančiomis, raminamosiomis, hipnotinėmis savybėmis [22]. Vaistas vartojamas trumpalaikiam nerimo, ypač jei jis pasireiškia kartu su nemiga, gydymui (vaistiniu preparatu gydomi tik sunkūs sutrikimai, sukeliantys bejėgiškumą arba didelę kančią), centrinės ar periferinės nervų sistemos pažeidimams (pvz., cerebrinio paralyžiaus ar traumos) sukelto skeleto raumenų spazmo malšinimui [12]. Lietuvoje diazepamas registruotas kaip vaistiniai preparatai: „Apaurin“, „Diazepam desitin“, „Diazepam polta“, „Diazepeks“, „Relanium“, „Relium“, „Seduxen“ [31].
C16H13ClN2O Molekulinė masė - 284.8 g/mol
Savybės. Balti arba gelsvi sunkiai tirpūs vandenyje, tirpūs etanolyje (1:25), chloroforme (1:2) ir eteryje (1:39). Miltelių lydymosi temperatūra yra 125-126 °C [25]. Diazepamas greitai ir visiškai absorbuojamas iš virškinimo trakto. Išgėrus vaisto, didžiausia jo koncentracija kraujo plazmoje susidaro po 30–90 minučių. Absorbcijos laipsnis didelis (75%). 98–99% diazepamo jungiasi su plazmos baltymais [10]. Diazepamas yra labai tirpus riebaluose; jis lengvai praeina pro hematoencefalinį ir placentos barjerą. Vaisto išsiskiria su motinos pienu. Menamas pasiskirstymo tūris yra 1–2 l/kg [8].
Farmakologija. Diazepamas veikia GABA receptorius, esančius limbinėje sistemoje ir pogumburyje, didindamas chloro jonų kanalų atidarymo dažnį, taip leidžiantis chloro jonų srautą į neuroną ko pasekoje įvyksta ląstelės hiperpoliarizacija [8].
Farmakokinetika. Greitai ir visiškai absorbuojamas iš virškinimo trakto. Isgėrus 20 mg dozę, didžiausia koncentracija plazmoje (maždaug 500 ng/ml) būna po 50-90 min. Absorbcijos laipsnis didelis – 75 %. 99-98 diazepamo jungiasi su serumo baltymais [10]. Diazepamas yra labai tirpus riebaluose, jis lengvai praeina pro hematoencefalinį ir placentos barjerus. Vaistas išsiskiria su motinos pienu [12].
Metabolizmas. Diazepamą kepenys intensyviai skaldo į aktyvius metabolitus N-demetildiazepamą (nordiazepamą) ir N-metiloksazepamą, iš kurių sintetinamas kitas veiklus metabolitas oksazepamas. Šis metabolitas prisijungia prie gliukurono rūgšties. Metabolitai pasižymi farmakologiniu aktyvumu. Nordazepamo ir oksazepamo formavimą katalizuoja citochromo P450 izofermentai CYP2C19 ir CYP3A. Didžioji preparato dalis šalinama su šlapimu metabolitų forma, ne daugiau kaip 25 % rezorbuoto vaisto išskiriama su šlapimu nepakitusia forma. 10 % dozes gali pasišalinti su išmatomis. Pats diazepamas yra ketozolamo ir medazepamo metabolitas [9].
Toksinis poveikis. Perdozavus paprastai pasireiškia centrinės nervų sistemos slopinimas. Lengvais atvejais pasireiškia mieguistumas, konfūzija ir letargijos simptomų, sunkesniais atvejais gali būti ataksija, hipotonija, hipotenzija, kvėpavimo slopinimas, koma (retai). Vaisto vartojant kartu su kitais centrinę nervų sistemą veikiančiais preparatais, ypač alkoholiu, poveikis būna sunkesnis ir, nesuteikus būtinosios pagalbos, gali lemti mirtį. Jei pacientas sąmoningas, reikia sukelti vėmimą (per valandą nuo perdozavimo), jei sąmonė sutrikusi – išplauti skrandį. Gali būti skiriama aktyvintosios anglies. Būtina stebėti kvėpavimą ir širdies veiklą. Centrinės nervų sistemos slopinimui mažinti gali būti vartojama specifinio benzodiazepinų receptorių antagonisto flumazenilio [10,27].
2.3.3. Dikalio klorazepatas
Dikalio klorazepatas - benzodiazepinų grupei priskiriamas vaistinis preparatas. Vaistas vartojamas trumpalaikiam generalizuotam nerimui malšinti. Lietuvoje registruotas kaip vaistinis preparatas „Tranxene“ [31].
C16H11ClN2O3 Molekulinė masė - 314.7 g/mol
IUPAC 7-chlor-2,3-dihidro-2-okso-5-fenil-1H-1,4-benzodiazepin-3-karboksirūgštis Savybės. Klorazepato rūgštis – labai smulkūs ir pūrus balti milteliai, lengvai tirpūs vandenyje, sunkiai etanolyje, beveik netirpūs eteryje ir chloroforme. Vandeniniame tirpale susidaro monokalio druska [25].
Farmakologija. Klorazepato poveikis yra kokybiškai panašus į kitų minėtos grupės junginių poveikį, kurie atpalaiduoja raumenis, šalina nerimą, ramina, migdo, slopina traukulius, sukelia amneziją [1]. Toks poveikis pasireiškia dėl dikalio klorazepato specifinio agonistinio poveikio GABA - OMEGA makromolekulinio receptorių komplekso receptoriams, dar vadinamiems benzodiazepino-l ir benzodiazepino-2 receptoriais (BZD1 ir BZD2), bei chloro kanalų atsidarymo
moduliavimo [29,30].
Farmakokinetika. Virškinimo trakte didžioji dalis (80 %) greitai dekarboksilinama ir virsta demetildiazepamu. Didžiausia šio junginio koncentracija plazmoje būna maždaug po valandos. Daugiau nei 97 % vaistinio preparato jungiasi su serumo baltymais. Dėl metabolizmo intensyvumo ir tolerancijos atsiradimo šios grupės vaistiniams preparatams negalima nustatyti dozės ir veiksmingumo santykio [1].
Metabolizmas. Svarbiausias klorazepato skilimo produktas yra demetildiazepamas [25]. Šis junginys taip pat yra aktyvus, jo pusinės eliminacijos laikas yra ilgesnis nei pirminio junginio, trunka 30-150 valandų. Organizmas hidroksilina demetildiazepamą, paverčia jį kitu aktyviu skilimo produktu, oksazepamu. Pastarasis junginys tampa neaktyviu jį prijungus prie gliukurono rūgšties. Susidaręs vandenyje tirpus junginys iš organizmo šalinamas su šlapimu [32].
Toksinis poveikis. Pavartojus per didelę klorazepato dozę, pagrindinis perdozavimo požymis yra gilus miegas, kartais pereinantis į komą. Nestipriai apsinuodijus atsiranda letargija ir šiek tiek pritemsta sąmonė. Sunkiausiu atveju pasireiškia ataksija, hipotonija, hipotenzija, kvėpavimo
slopinimas, labai retai ištinka mirtis. Jei pacientas kartu su klorazepatu nevartojo kitų psichotropinių vaistinių preparatų ir gydėsi trumpai, prognozė yra palanki [27].
2.4. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kiekybinis ir kokybinis vertinimas dujų chromatografija-masių spektrometrija
Dujų chromatografija su masių spektrometrija - tai chromatografijos metodas, naudojamas dujų ir lakių organinių junginių išskirstymui ir nustatymui pasitelkiant masių spektrometrą. Dujų chromatografo kolonėlėje junginiai yra išskirstomi į atskirus komponentus, o su masių spektrometru jie charakterizuojami kiekvienas individualiai pagal masių spektrą [33].
Masių spektrometriniais detektoriais galima gauti tridimensinius duomenis: užrašoma bendra signalo stiprumo priklausomybė nuo laiko, generuojamas masių spektras bei irimo masių spektras pasirinktam junginiui. Pastarasis suteikia labai vertingos informacijos apie analitę. Iš masių spektro sužinome molekulinę junginio masę, iš irimo masių spektro – struktūrą (identifikuojame junginį), galime nustatyti identifikuojamosios analitės grynumą bei kiekį. Masės spektrometrijos duomenys užtikrina tyrimo patikimumą atliekant tiek kokybinę, tiek kiekybinę analizę [34].
Mokslinės literatūros šaltiniuose yra aprašyta nemažai įvairių dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikų, kurios gali būti taikomos tiriant kokybiškai bei kiekybiškai alprazolamą, diazepamą bei dikalio klorazepatą. Literatūros šaltiniuose pateikiama informacija, jog analizuojant dikalio klorazepatą DC-MS metodu, identifikuojamas ne dikalio klorazepatas, o jo skilimo produktas - nordazepamas. To priežastis aukštoje temperatūroje vykstantis dikalio klorazepato dekarboksilinimas ir dehidratacija, susidarant terminio skilimo produktui - nordazepamui [24,25]. Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons rekomenduoja alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinei ir kiekybinei analizei biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose, naudojant tokias dujų chromatografijos-masių spektrometrijos sistemas [25]:
GA: Kolonėlė: 3% SE-30 arba OV-1 Chromosorb G HP (išplauta rūgštimi ir dimetildichlorosilanu), matmenys – 2m x 2 mm. emperatūra: vidutiniškai nuo 100 iki 300 °C. Nešančios dujos: N2, 45 ml/min. Kapiliarinė kolonėlė: 100 %-dimetil-PSX (X-1) (10-15 m x 0,32 arba 0,53 mm) Nešančios dujos: He, 1 ml/min. Temperatūros programa: 135°C pirmas 4 minutes didinant iki 200 °C, didinant 13°C/min. Nuo 200 °C didinama iki 312 °C , 6°C/min greičiu. Kolonėlė: HP1 (100%-dimetil-PSX) lydyto silicio kapiliaras (12 m X 0.2 mm). Injektorius: 280 °C, „splitless“ būdu. Temperatūros programa: 100 °C 2 minutėms didinant iki 310 °C, 30 °C/min per 8 minutes. Nešančios dujos: He, 1 ml/min. Naudojant šia sistemą diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo indeksai yra atitinkamai 3108, 2556 ir 2618.
GB:
Kolonėlė: 5 % fenil-95% dimetil-PSX (X-5), kapiliaras (20-30 m x 0,2 arba 0,25 mm). Nešančios dujos: He, 1 ml/min. Temperatūros programa: 90 °C 0,7 minutės iki 240 °C keliant 35°C /min, iki 290 °C keliant 8°C /min, iki 325°C keliant 25°C /min. Naudojant šia sistemą alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo indeksai yra atitinkamai 3100, 2426 ir 2457.
GG:
Kolonėlė: 2,5 % OV-17 ant 80-100 tinklelio Chromosorb G, apdirbimas ir išmatavimai kaip ir sistemai GA. Temperatūra: vidutiniškai nuo 100 iki 300 °C. Nešančios dujos: N2, 45 ml/min. Kapiliarinė
kolonėlė: 100 %-dimetil-PSX (X-1) (10-15 m x 0,32 arba 0,53 mm) Nešančios dujos: He, 1ml/min. Temperatūros programa: 135°C pirmas 4 minutes didinant iki 200 °C, didinant 13°C/min. Nuo 200 °C didinama iki 312 °C , 6°C/min greičiu. Kolonėlė: HP1 (100%-dimetil-PSX) lydyto silicio kapiliaras (12 m X 0.2 mm). Injektorius: 280 °C, „splitless“ būdu. Temperatūros programa: 100 °C 2 minutėms didinant iki 310 °C, 30 °C/min per 8 minutes. Nešančios dujos: He 1 ml/min. Naudojant šia sistemą diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo indeksai yra atitinkamai 2940 ir 3125.
Detekcijai naudojama masių spektrometrija, kapiliarinė kolonėlė 30m x 0,25mm x 0,25 μm, temperatūros programa: 110°C (2 min), keliant 15°C /min to 255 °C (1 min); keliant 8°C /min iki 300°C (5 min), atskyrimas 50:1.[25]
Žinynas nacionalinių vaistų agentūrų laborotarijoms, benzodiazepinų identifikavimui ir analizei rekomenduoja sekančia metodiką [21].
Tiriamieji tirpalai: ruošiami metanoliniai 1 mg/ml tirpalai iš tablečių/kapsulių.Kolonėlė: 10-15 m x 0,32 arba 0,53 mm, plėvelės storis 1,5-3 μm. Fazė: lydytas silicis, chemiškai surištas ir tinklinės struktūros metilsilikonas (pvz. : DB-1) Temperatūros programa: 4 minutes temperatūra laikoma iki 135 °C, 13 °C/min didinama iki 200 °C, 6°C/min didinama iki 312 °C. Galutinė temperatūra laikoma dar 6 minutes. Nešančios dujos: He, 1ml/min. Pastovus srautas. Injekavimas. „Split/splitless“, 250-300 °C. Detektorius: Jonizacijos. Režimas: El režimas, 70 eV. Perdavimo linijos temperatūra: 280 °C. Jonų šaltinio temperatūra: 230 °C. Skanavimo parametrai: TIC (SIM jeigu reikalinga), skenavimo diapozonas iki 500 amv.
D. B£ACHUT su kolegomis atlikęs 18 skirtingų benzodiazepinų kokybinę bei kiekybinę analizę dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu, rekomenduoja sekančia metodiką [24]:
HP-5MS kapiliarinė kolonėlė, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm. Injektoriaus temperatūra buvo 250 °C, nešančios dujos - He, dujų tėkmės greitis – 0,6 ml/min. Pagrindinių jonų įrašymas masių
spektre buvo 40-400 amv. Krosnies temperatūros programa: pirminė temperatūra 110 °C, ji buvo palaikoma 2 minutes ir tuomet temperatūra buvo keliama 15°C/min iki pat 255 °C ir toliau keliama 8°C/min iki 300 °C. Galinė temperatūra buvo palaikoma 5 minutes. Visos analizės trukmė 23 minutės. Standartiniai tirpalai injekuoti „split“ metodu (1:50), o tiriamieji mėginiai injekuojami „splitless“ metodu. Tiriamųjų tirpalų injekuojamas tūris - 0,4 μl [24]. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo laikai, pagrindiniai jonai masių spektre, formulė, dalelės masės.
HP-5MS kapiliarinė kolonėlė, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm. Injektoriaus temperatūra buvo 250 °C, Helis buvo pritaikytas kaip nešančios dujos, dujų tėkmės greitis – 0,6 ml/min. Pagrindinių jonų įrašymas masių spektre buvo 40-400 amv. Krosnies temperatūros programa: pirminė temperatūra 110 °C, ji buvo palaikoma 2 minutes ir tuomet temperatūra buvo keliama 15°C/min iki pat 255 °C ir toliau keliama 8°C/min iki 300 °C. Galinė temperatūra buvo palaikoma 5 minutes. Visos analizės trukmė buvo 23 minutės. Standartinių tirpalų injekavimas buvo taikomas „split“ metodu (1:50), o tiriamieji šlapimo mėginiai injekuojami splitless metodu. Tiriamųjų tirpalų injekuojamas tūris - 0,4 μl [24].
Atlikus mokslinės literatūros analizę nerasta metodikos, kuria būtų atliekamas kokybinis ir kiekybinis alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinio tyrimas. Todėl buvo remtąsi literatūroje pateikiamų atskirų medžiagų kokybinio ir kiekybino tyrimo metodikomis, pritaikanti jas mišinio analizei.
Tiriamoji medžiaga
Sulaikymo laikai (min.) Pagrindiniai jonai masių spektrometrijos spektre Formulė Dalelės masė Kapiliarinės kolonėlės HP-35 HP-50+ SPB-Octyl SPB-1 HP5-MS Alprazolamas - - 22.74 16.78 19.47 308, 279, 273, 204, 239 C17H13ClN4 308.08 Diazepamas 21.62 17.56 17.80 13.40 15.02 256, 283, 284, 221 C16H13ClN2O 284.07 Dikalio klorazepatas 23.22 18.80 17.99 13.78 15.59 242, 241, 269, 270, 77 C16H11ClN2O4K2 2408.97
2.5. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinis nustatymas ultraefektyviąja skysčių chromatografija
Ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC) (angl. Ultrahigh-performance liquid chromatography (UHPLC)) – tai chromatografijos metodas, naudojantis kolonėlę, tačiau pasižymintis itin dideliu efektyvumu bei analizės greičiu. Dėl šio pranašumo lyginant su efektyviąja skysčių chromatografija (ESC), UESC tapo viena iš plačiausiai naudojamu analizės metodu, skirtu kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui įvairiuose pramonės srityse. Pagrindiniai skirtumai, dėl kurių ultraefektyvioji skysčių chromatografija pasižymi greitesniu išskirstymu ir geresne skiriamąja geba – trumpos (5 – 20 cm) ir siauro (2 – 6 mm) vidinio skermens plieninės kolonėlės, pripildytos labai nedidelio (2 – 1,8 µm) skersmens nejudrios fazės granulėmis. Taip pat dėl mažų sorbentų dalelių dydžių, atskyrimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu yra efektyvesnis dėl to šis metodas pasižymi didesniu skirstymo efektyvumu ir trumpesniu analizės laiku [25].
Kaip pagrindas kokybiniam alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato tyrimui ultraefektyviąja skysčių chromatografija, naudota efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodika. Buvo analizuojamas ESC metodikos kiekvienai tiriamajai medžiagai atskirai. 4 lentelėje pateiktos ESC metodikos, tinkančios alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinei analizei atlikti.
4 lentelė. Metodikos, tinkamos alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinei analizei.
Atlikus mokslinės literatūros analizę nerasta metodikos, kuria būtų atliekamas kokybinis alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinio tyrimas. Todėl buvo remtasi literatūroje pateikiamų pavienių medžiagų kokybinio tyrimo metodikomis siekiant patobulinti metodiką, jog ji būtų tinkama mišinio identifikavimui.
Metodika Alprazolamo sulaikymo laikas
Diazepamo sulaikymo laikas Dikalio klorazepato sulaikymo laikas
HZ[25] RT 4,0 min RT 8,4 min RT 5,6 min
HAA[25] RT 17,0 min RT 20,3 min RT 18,4 min
HAL[25] RT 6,3 min RT 13,2 min -
HAM[25] - RT 10,3 min -
HAX[25] RT 6,4 min RT 7,7 min -
Metodika HZ
Kolonėlė: C18 LiChrospher 100 Rp-18e (125 × 4,0 mm, 5μm) su prieškolonėle LiChrocart 124 -4. Mobili
fazė: Į 530 ml vandens įpilama 146μl trietilamino ir 750μl fosforo rūgšties. Gautas tirpalas sumaišomas su 470 ml acetonitrilo. Tekėjimo greitis 0,6 ml/min. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius.
Metodika HAA
Kolonėlė: C8 Symmetry (250 × 4,6 mm, 5μm) su prieškolonėlė Symmetry C18 (20 mm). Kolonėlės temperatūra: 30° C. Mobili fazė (A:B) fosfatinis buferis (pH 3,8) – acetonitrilas. Gradientinis eliuavimas: (85:15) 6,5 min pereinant į (65:35) iki 25 min pereinant į (20:80) 3 minutes, grįžtant į pradinę sistemą per 7 minutes.
Metodika HAL
Kolonėlė: C18 Novapak (150 × 4,6 mm, 5μm). Mobili fazė: acetonitrilas: metanolis: 6 mmol/l fosfatinis buferis (pH 5,7) (30:10:60). Tekėjimo greitis: 1,3 ml/min. Detektorius: Fotodiodų matricos detektorius.
Metodika HAM
Kolonėlė C18 (150 × 4,0 mm, 3μm) su C18 prieškolonėle (40 × 4,0 mm, 3 μm). Mobili fazė: vanduo – acetonitrilas (50:50). Tekėjimo greitis: 0,7 ml/min. Detektorius: UV (ƛ = 313 nm).
Metodika HAX
Kolonėlė: Supelcosil LC – DP (250 × 4,6 mm, 5μm). Mobili fazė: acetonitrilas: fosforo rūgštis (0,025% v/v): trietilamino buferis (25:10:5). Tekėjimo greitis: 0,6 ml/min. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius (ƛ = 229 nm).
Metodika HAY
Kolonėlė: LiChrospher 100 RP – 8 (250 × 4,0 mm, 5μm). Mobili fazė: acetonitrilas: fosforo rūgštis (0,025% v/v): trietilamino buferis (60:25:15). Tekėjimo greitis: 0,6 ml/min. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius (ƛ = 229 nm).
Atlikus mokslinės literatūros analizę nerasta metodikos, kuria būtų atliekamas kokybinis alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinio tyrimas. Todėl buvo remtąsi literatūroje pateikiamų pavienių medžiagų kokybinio tyrimo metodikomis siekiant pritaikyti metodiką, jog ji būtų tinkama mišinio kokybinei analizei.
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
3.1. Tyrimo objektas ir metodika 3.1.1. Tyrimo objektas
Siekiant pritaikyti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas kokybiniam ir kiekybiniam alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato įvertinimui, buvo tiriamas šių vaistinių medžiagų mišinys.
3.1.2. Kokybinis ir kiekybinis vertinimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu
Įranga
Kokybiniam ir kiekybiniam mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato, vertinimui buvo naudojama dujų chromatografijos-masių spektrometrijos sistema GCMS-QP2010 (Shimadzu, Japonija). Analizuojami mėginiai buvo identifikuojami pagal sulaikymo laikus ir analizuojant masių spektrus kiekvienai analizuojamos chromatogramos smailei.
Tiriamieji tirpalai
Tiriamieji tirpalai buvo ruošiami iš Lietuvos vaistinėse parduodamų vaistinių preparatų. Tiriamieji alprazolamo (A), diazepamo (D) ir dikalio klorazepato tirpalai buvo ruošiami iš vaistinių preparatų „Xanax“ (Pfizer) 0,5 mg, DIAZEPEKS-GRINDEKS 5mg tablečių ir Tranxene 10 mg kapsulių. Tabletės susmulkintos grūstuvėje iki smulkių miltelių, kapsulė išardyta ir joje esantys milteliai perkelti į 10 ml kolbas. Milteliai buvo tirpinami metanolio ir etilacetato mišinyje (4:6). Gautos suspensijos maišytos ultragarso vonelėje 20 min. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. Centrifugatas vėliau filtruotas pro PVDF filtrą (0,45 μm). Gauti 0,1mg/ml alprazolamo, 1mg/ml diazepamo ir 2 mg/ml dikalio klorazepato tiriamieji tirpalai naudoti chromatografavimui.
Etaloniniai tirpalai
Etaloniniai tiriamųjų medžiagų tirpalai ruošti jų standartus – alprazolamą (Sigma-Aldrich, JAV), diazepamą (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV) ir dikalio klorazepatą (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV) – tirpinant metanolyje. Gauti standartiniai alprazolamo (AE), diazepamo (DE) ir dikalio klorazepato (KE) 0,2 mg/ml koncentracijos tirpalai. Sumaišius po 1 ml etaloninių tirpalų, gautas etaloninis mišinio tirpalas – (ADKE).
Analizė
Dujų chromatografijos sąlygos: kolonėlės temperatūra – 110 °C, injektoriaus temperatūra – 260 °C, injekavimo būdas – „splitless“, spaudimas – 89,5 kPa, kolonėlės srautas – 1,15 ml/min, atskyrimo santykis – 10, temperatūros programa – temperatūra pradedama nuo 110 °C, laikyta 3 min., kelta iki 255 °C, 40 °C/min. (laikyta 3 minutes), toliau kelta iki 300 °C, 8°C/min (laikyta 1 min), galiausiai temperatūra pakeliama iki 320 °C, kuri buvo laikoma 5 minutes. Nešančios dujos – He, 1ml/min. Proceso trukmė – 18 minučių. Chromatografavimui naudoti AE, DE, KE etaloniniai tirpalai, kurių koncentracijos 0,2mg/ml. Gautos chromatogramos analizuojamos Lab Solution GMSS solution Shimadzu programa. Masių spektrometrijos sąlygos pateiktos 5 lentelėje.
5 lentelė. Masių spektrometro sąlygos. Jonų šaltinio temperatūra Interfeiso temperatūra Tirpiklio išleidimo laikas Pradžios laikas Pabaigos laikas Skenavimo greitis Pradinis m/z Galinis m/z 200 °C 280 °C 1.00 min 2.50 min 18.00 min 2000 40.00 400.00
3.1.3. Kokybinis vertinimas ultraefektyviąja skysčių chromatografija Įranga
Vaistinių medžiagų nustatymui panaudotas ultraefektyvusis skysčių chromatografas (UESC) „Waters ACQUITY H UPLC“ su fotodiodų matricos detektoriumi „ACQUITY YPLC PDA eλ“. Naudota chromatografinė kolonėlė „ACQUITY UPLC BEH C18 2,1x50mm (Waters)“, sorbento dalelių dydis 1,7 µm.
Tiriamieji tirpalai
Kokybiniam vertinimui ultraefektyviąja skysčių chromatografija naudoti tie patys tiriamieji tirpalai, kurie buvo naudoti ir dujų chromatografijai-masių spektrometrijai.
Etaloniniai tirpalai
Etaloniniai tiriamųjų medžiagų tirpalai ruošti jų standartus – alprazolamą (Sigma-Aldrich, JAV), diazepamą (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV) ir dikalio klorazepatą (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV) – tirpinant metanolyje. Gauti standartiniai alprazolamo (AE), diazepamo (DE) ir dikalio klorazepato (KE) 0,2 mg/ml koncentracijos tirpalai. Tiriamųjų medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišant po 1 ml etaloninių tirpalų, gautas etaloninis medžiagų mišinio tirpalas – ADKE.
Analizė
Buvo išbandytos kelios gradientinio eliuavimo sistemos: 1. 7,5 pH trietilamino ir metanolio mišinio (pH 7,5);
2. H2SO4 ir ACN;
3. Fosfatinis buferis ir metanolis; 4. TFA ir metanolis.
Tiriamojo tirpalo injekcijos tūris 1 μl. Eliuavimas – gradientinis, gradiento tėkmės greitis 0,3 ml per minutę. Chromatografavimui naudoti AE, DE, KE etaloniniai tirpalai, kurių koncentracijos 0,2mg/ml.
3.2 Rezultatai ir jų aptarimas
3.2.1. Mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato, kokybinis tyrimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu.
Masių spektrometrijos detektorius kokybiniam medžiagų vertinimui yra parankus dėl galimybės nustatyti tiriamųjų medžiagų masių spektrus, pagal kuriuos sužinome molekulinę junginio masę. Tai leidžia analizuojamą mišinį kokybiškai įvertinti lyginant tiriamųjų medžiagų sualikymo laiką su etaloninių medžiagų sulaikymo laiku bei lyginant tiriamųjų medžiagų masių spektrus su literatūroje pateikiamais nustatytais medžiagų masių spektrais. Taikant šiuos du vertinimo kriterijus, pasiekiamas aukštas kokybinio vertinimo tikslumas. Optimizuojant DC-MS metodiką, kuria būtų galima identifikuoti alprazolamą, diazepamą ir dikalio klorazepatą, jiems esant mišinyje, pirmiausiai įvertinti etaloninių tirpalų masių spektrai. Gauti spektrai palyginti su literatūros šaltiniuose pateikiamais tiriamųjų medžiagų masių spektrais.
4 pav. Alprazolamo masių spektras. a) Gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi; b) Pateiktas „Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“[25].
A
Palyginus literatūroje pateiktus [25] ir masių spektrometro detektoriumi gautus alprazolamo masių spektrus (4 pav.) nustatyta, kad abiejose spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 308, 279, 204, 273, 77, 307, 310, 309 m/z.
Palyginus literatūroje pateiktus [25] ir masių spektrometro detektoriumi gautus alprazolamo masių spektrus (5 pav.) nustatyta, kad abiejose spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 256, 283, 284, 285, 257, 255, 258, 286 m/z.
5 pav. Diazepamo masių spektras. a) Gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi; b) Pateiktas „Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“[25].
Atlikus dikalio klorazepato masių spektro užrašymą, pastebėta, kad užrašomas jo skilimo produkto – nordazepamo spektras. To priežastis – dikalio klorazepato terminis skilimas proceso metu [24,25]. Palyginus literatūroje pateiktus [25] ir masių spektrometro detekoriumi gautus nordazepamo masių spektrus (6 pav.) nustatyta, kad abiejouose spektruose principinių jonų reikšmės yra ties 242, 270, 269, 241, 103, 76, 77, 271 m/z.
B
A
6 pav. Dikalio klorazepato (nordazepamo) masių spektras, gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi.
Kolonėlės parinkimas
Norint parinkti tinkamiausią chromatografinę kolonėlę, tinkamą tiriamųjų medžiagų mišinių išskirstymui, atlikti bandymai su keliomis skirtingomis kolonėlėmis: RTX – 5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), HP-5MS (30m x 0,25mm x 0,25 μm) ir Rxi-5 MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm). Geriausias benzodiazepinų mišinio atskyrimas pasiektas su kolonėle Rxi-5 MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm).
Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato etaloninių medžiagų mišinys nurodytomis sąlygomis chromatografuotas 10 kartų. Gauti duomenys (6 lentelė) įvertinti statistiškai apskaičiuojant aritmetinį gautų sulaikymo laiko reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį, santykinę paklaidą esant 0,95 pasikliautinajam lygmeniui, pasikliautinąjį intervalą, kai klaidos tikimybė p = 0,05.
6 lentelė. Statistinis tiriamųjų vaistinių medžiagų sulaikymo laikų vertinimas.
Kartotiniai rezultatai neviršija leistinos p < 0,05 paklaidos ribos, todėl metodika yra tinkama atlikti mišinio analizę iš vaistinių preparatų.
3.2.2. Dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikos validacija
Norint įrodyti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikos tinkamumą tiriamųjų vaistų mišinio (alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato) nustatymui, reikia atlikti metodikos validaciją. Validacija atlikta įvertinus šiuos parametrus: specifiškumas, rezultatų glaudumas (rezultatų atsikartojamumas ir tarpinis preciziškumas), tiesiškumas, aptikimo ir nustatymo riba.
Tiriamoji medžiaga Vidutinis sulaikymo laikas Rt (min) Santykinė paklaida Rt SN (Standartinis nuokrypis) Rt SSN (Santykinis standartinis nuokrypis, %) Pasikliautinasis intervalas Alprazolamas 13,476 0,05 0,0016 0,02 13,478-13,482 Diazepamas 10,050 0,05 0,0015 0,02 10,049-10,052 Dikalio klorazepatas (Nordazepamas) 10,395 0,04 0,002 0,02 10,395-10,400
Specifiškumas
Metodo specifiškumas – tai yra gebėjimas atskirti tiriamąją medžiagą nuo priemaišų ir kitų medžiagų. Analizuojamos medžiagos specifiškumas įrodomas lyginant analitės ir standarto sulaikymo laikus bei spektrinius sutapimus.
Atlikus tiriamųjų medžiagų, išsskirtų iš vaistinių preparatų analizę, gauti rezultatai palyginti su etaloninių tirpalų analizės rezultatais. Sulaikymo laikai (7 pav.) ir masių spektrai (8 pav.) atitiko tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikus, gautus analizuojant etaloninius tirpalus.
8 Pav. Alprazolamo masių spektras. a) Gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi; b) Pateiktas „Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“[25].
9 Pav. Diazepamo masių spektras. a) Gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi; b) Pateiktas „Clarke`s Analysis of Drug and Poisons“[25].
10 Pav. Nordazepamo masių spektras. a) Gautas išmatavus masių spektrometro detektoriumi; b) Pateiktas „NIST Mass Spectrometry Data Center Collection“[37].
Glaudumas
Siekiant įvertinti glaudumą (preciziškumą) buvo įvertinti analizės metu gautų rezultatų atsikartojamumas ir preciziškumas. Atsikartojamumas nusako rezultatų tikslumą, atliekant juos tą pačią dieną, vienodomis sąlygomis. Šiam tyrimui atlikti, etaloninių tirpalų mišinio analizė kartota keturis kartus. Preciziškumas – apibūdina rezultatų tikslumą, atliekant bandymą tomis pačiomis sąlygomis, tačiau kitomis dienomis. Įvertinti DC-MS metodo atkuriamumą, buvo atliekami 8 bandymai dviem skirtingomis dienomis.
Gauti atsikartojamumo ir preciziškumo rezultatai (7 lentelė) įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN), kuris kiekybinio tyrimo metodui turėtų būti mažesnis nei 5 proc. vienai dienai ir mažesnis nei 10 proc. tarp kelių dienų.
7 lentelė. Metodikos glaudumo įvertinimas.
Tiriamos medžiagos Santykinio standartino nuokrypio rezultatai
Pirmos dienos Antros dienos
Smailės plotui Sulaikymo laikui Smailės plotui Sulaikymo laikui Alprazolamas 0,03 % 0,04 % 0,04 % 0,04 % Diazepamas 0,02 % 0,04 % 0,03 % 0,04 % Dikalio klorazepatas (nordazepamas) 0,02 % 0,05 % 0,02 % 0,05 %
Remiantis gautais duomenimis, matyti, kad tiriamųjų medžiagų SSN sulaikymo laikui ir smailės plotui neviršijo 5 proc. tą pačią dieną ir neviršijo 10 proc. bandymuose tarp kelių dienų. Todėl metodika tinkama alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui.
Tiesiškumas
Tiesiškumas – rezultatų priklausomybė nuo tiriamojo tirpalo koncentracijos. Norint jį įvertinti sudaromas gradavimo grafikas ne mažiau kaip iš penkių taškų ir gaunama kalibracinė kreivė. Kalibracinė kreivė alprazolamui (11 pav.) sudaryta iš 5 taškų, diazepamui (12 pav.) ir dikalio klorazepatui (nordazepamui) (13 pav.) iš 6 taškų. Gautos kalibracinių kreivių charakteristikos pateiktos 8 lentelėje. Gautuose rezultatuose matyti tiesinė priklausomybė, tinkanti kiekybiniam nustatymui. Visų analizuotų tiriamųjų medžiagų koreliacijos koeficientai didesni nei 0,99.
Tiriamoji medžiaga Koreliacijos koeficientas
Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos
Alprazolamas 0,999491 Y=892.868925*x-8944.541667 12,500-200,000 μg/ml Diazepamas 0,998285 Y=8005.883383*x+132529.348259 31,250-1000,000 μg/ml Dikalio klorazepatas (nordazepamas) 0,999022 Y=917561.657143*x-311588.4666 1,000-6,000 μg/ml
8 lentelė. Kalibracinių kreivių charakteristikos.
12. Pav. Diazepamo kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y=8005.883383*x+132529.348259.
13. Pav. Dikalio klorazepato (nordazepamo) kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y=917561.657143*x-311588.4666.
Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba – tai mažiausias tiriamosios medžiagos kiekis, kurį galima aptikti taikant pasirinktą metodiką, bet nebūtinai nustatyti kiekybiškai. Nustatymo riba – mažiausias tiriamosios
medžiagos kiekis, kurį galima nustatyti kiekybiškai. Gautos aptikimo ir nustatymo ribų reikšmės alprazolamui, diazepamui ir dikalio klorazepatui pateiktos 9 lentelėje.
Tiriamoji medžiaga Aptikimo riba (μg/ml) Nustatymo riba (μg/ml)
Alprazolamas 0,005 0,040
Diazepamas 0,004 0,013
Dikalio klorazepatas (Nordazepamas) 0,006 0,020
9 lentelė. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato aptikimo ir nustatymo ribos. Įvertinus gautų rezultatu atitikią validacijos parametrams nustayta, kad DC-MS metodika yra tinkama alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybinei ir kiekybinei analizei.
3.2.3. Vaistinių preparatų analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu
Nustačius optimalias sąlygas, kuriomis galima identifikuoti alprazolamą, diazepamą ir dikalio klorazepatą metodika pritaikyta analizuojant darbinius tirpalus A, D ir K, pagamintus iš vaistinių preparatų ir jų mišinį.
Ištyrus vaistinio preparato “Xanax” tiriamąjį tirpalą, alprazolamas (14 pav.) identifikuotas pagal sulaikymo laiką – 13,503 min. ir masių spektrą (15 pav.)
14 Pav. Tiriamojo alprazolamo tirpalo A chromatograma.
15Pav. Tiriamojo alprazolamo tirpalo masių spektras.
Ištyrus vaistinio preparato “Diazepeks” darbinį tirpalą, diazepamas (16 pav.) identifikuotas pagal sulaikymo laiką – 10,05 min. ir masių spektrą (17 pav.).
16 Pav. Tiriamojo diazepamo D tirpalo chromatograma.
17 Pav. Tiriamojo darbinio diazepamo D tirpalo masių spektras.
Ištyrus vaistinio preparato „Tranxene“ tiriamąjį tirpalą identifikuotas nordazepamas kaip ir tiriant etaloninį tirpalą. Nordazepamas identifikuotas pagal sulaikymo laiką (10,40 min.) ir masių spektrą.
18 pav. Tiriamojo dikalio klorazepato K tirpalo chromatograma.
Tiriant tiriamuosius tirpalus A,D ir K, išskirtus iš vaistinių preparatų, gauti alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo laikai atitiko pasikliautinojo intervalo reikšmes. (10 lentelė)
10 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų sulaikymo laikai.
Mėginys Sulaikymo laikas (min.) Pasikliautinasis intervalas
Alprazolamas (A) 13,503 13,478-13,482
Diazepamas (D) 10,05 10,049-10,052
Dikalio klorazepatas (Nordazepamas) (K) 10,40 10,395-10,400
Nustačius, kad metodika tinkama atskirų mišinio komponentų identifikavimui, atlikta mišiio analizė (20 pav.)
20 pav. Mišinio, sudaryto iš alprazolamo (3), diazepamo (1) ir dikalio klorazepato (2) chromatograma.
Mišinyje alprazolamas, diazepamas ir dikalio klorazepatas buvo identifikuoti pagal sulaikymo laikus ir masių spektrus.
Tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai atitiko pasikliautinojo intervalo reikšmes, gautas tiriant etaloninius tirpalus. Gauti alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo laikai pateikti 11 lentelėje.
Diazepamas
11 lentelė. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato sulaikymo laikų vertinimas tiriamajame mišinyje)
Parinkta dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodika yra tinkama alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinio komponentų išskirstymui ir kokybiniam įvertinimui.
3.2.4. Kiekybinė vaistų mišinio analizė
Siekiant įvertinti pasirinktos DC-MS metodikos tinkamumą kiekybiniam tiriamųjų medžiagų nustatymui, buvo sudaryti kalibraciniai grafikai smailės aukščio priklausomybei nuo medžiagos koncentracijos (11-13 pav.).
3.2.5. Ultraefektyvioji skysčių chromatografijos metodikos parinkimas
Analizė atlikta naudojant chromatografinę kolonėlę ACQUITY UPLC BEH C18 2,1x50mm (Waters)“, sorbento dalelių dydis 1,7 µm.
Eliuento parinkimas
Atskiriant ir identifikuojant vaistinių medžiagų mišinio komponentus, etaloniai tirpalai AE, DE ir KE buvo chromatografuoti naudojant skirtingos sudėties eliuentus. Atlikus eksperimentus simetriškos chromatograminės smailės gautos su H2SO4 ir ACN (ES1), ir trietilamino ir metanolio
(ES2) eliuentų sistemomis.
Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato etaloniniai tirpalai nurodytomis sąlygomis chromatografuoti 5 kartus. Gauti duomenys įvertinti apskaičiuojant aritmetinį sulaikymo laikų vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį, santykinė paklaidą esant 0,95 pasikliautinajam lygmeniui ir pasikliautinąjį intervalą, kai klaidos tikimybė p=0,05. (8 lentelė)
Tiriamoji medžiaga Sulaikymo laikas (min) Pasikliautinasis intervalas
Alprazolamas 13,48 13,478-13,482
Diazepamas 10,049 10,049-10,052
13 lentelė. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikų statistiniai rodikliai.
Tiriamoji medžiaga Vidutinis sulaikymo laikas, min Standartinis nuokrypis Santykinis standartinis nuokrypis, % Paklaida Pasikliautinasis intervalas Alprazolamas 4,126 0,023 0,56 0,03 4,10-4,14 Diazepamas 4,166 0,021 0,50 0,04 4,15-4,19 Dikalio klorazepatas 3,768 0,022 0,58 0,04 3,75-3,78
3.2.6. Vaistinių preparatų tyrimas ultraefektyviąja skysčių chromatografija
Atliekant chromatografavimą su tiriamaisiais tirpalais gauti tokie medžiagų sulaikymo laikai - dikalio klorazepatas (Rt – 3,75 min), diazepamas (4,15 min), alprazolamas (4,12 min) (14 paveikslas). Šie rezultatai neviršija leistinos p < 0,05 ribos ir atitinka pasikliautinojo intervalo reikšmes. (14 lentelė)
21 pav. a) Alprazolamo(1), dikalio klorazepato(2) ir diazepamo(3) tiriamųjų tirpalų chromatograma eliuentų sistemoje ES1; b) eliuentų sistemoje ES2.
A
14 lentelė. Alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikai.
Tiriamoji medžiaga Sulaikymo laikas, min Pasikliautinasis intervalas
Alprazolamas 4,12 4,10-4,14
Diazepamas 4,15 4,15-4,19
Dikalio klorazepatas 3,75 3,75-3,78
Įvertinus gautus rezultatus, nustatyta, kad metodika yra tinkama tiriamųjų medžiagų kokybinei analizei. Alprazolamo ir diazepamo sulaikymo laikai labai panašūs, todėl metodika nėra tinkama tiriamųjų medžiagų mišinio analizei. Tačiau metodika gali būti pritaikoma alprazolamo ir dikalio klorazepato arba diazepamo ir dikalio klorazepato mišinių kokybiniam tyrimui.
5. IŠVADOS
1. Parinkta ir validuota dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodika, tinkama mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato mišinio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui.
2. Parinkta ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika, tinkama mišinio, sudaryto iš alprazolamo arba diazepamo ir dikalio klorazepato, kokybiniam įvertinimui.
3. Mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybiniam įvertinimui parinktos GC-MS ir UESC metodikos, kiekybinei analizei – GC-MS metodika.
6.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Validuota GC-MS metodika yra tinkama mišinio, sudaryto iš alprazolamo, diazepamo ir dikalio klorazepato kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui vaistiniuose preparatuose. Rekomenduojama atlikti tolimesnius tyrimus, pritaikant ją šio mišinio, išskirto iš biologinių objektų, tyrimams.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bertram G. Katzung, Susan B. Master, Anthony J. Trevor Basic and Clinical Pharmacology 12th Edition. 373-387.
2. Lietuvos sveikatos statistika 2012 m. Prieiga per internetą http://sic.hi.lt/html/lss.htm 3. Lietuvos sveikatos statistika 2015 m. Prieiga per internetą http://sic.hi.lt/html/lss.htm 4. Baltic Statistics on Medicines 2013-2015 m.
5. Lietuvos sveikatos statistika 2014 m. Prieiga per internetą http://sic.hi.lt/html/lss.htm 6. Umbrasienė N. Žmonių apsinuodijimų, išanalizuotų 2007 – 2011 metais, lyginamoji
analizė. VVSPT., Vilnius; 2012 m.
7. Žmonių apsinuodijimų, ištirtų 2010 metais, analizė. Prieiga per internetą
http://vsc.sam.lt/pub/imagelib/file/apzvalga_koreguota.pdf
8. Marinella Mandelli, Gianni Tognoni and Silvio Garattini. Clinical Pharmacokinetics of Diazepam. 1978 m. Prieiga per internetą
https://link.springer.com/article/10.2165/00003088-197803010-00005
9. W.D. HOOPER, I.A. WAIT, G.E. McKINNON and P.E.B. REILLY Departments of Medicine and Biochemistry, The University of Queensland, Brisbane, Queensland, Australia. Metabolism of diazepam and related benzodiazepines by human liver microsomes. EUROPEAN JOURNAL OF DRUG METABOLISM AND PHARMACOKINETICS, 1992, Vol. 17, No.1, pp. 51-59.
10. Serum Diazepam Concentrations in Overdose. Their Significance. Peter Jatlow, M.D., Kenneth Dobuler, M.D., and David Bailey, M.D. Prieiga per internetą
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/40432
11. S. N. MACLEOD. M.D.. Ph.D., H. G. GILES. Ph.D.. I. RENGERT. Isa. F. F. LIU. and E. M. SELLERS. M.D., Ph.D. Age and Gender Related Differences in Diazepam
Pharmacokinetics 1979 m. Prieiga per internetą
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.1552-4604.1979.tb01612.x/full
12. Audrius Sveikata, Gintautas Gumbrevičius, Arvydas Milašius, Renata Sveikatienė,
Virginija Adomaitienė. Anksiolitikų ir hipnotikų farmakologinių savybių apžvalga 2009 m. 13. Geoffrey K. Isbister, Luke O’Regan, David Sibbritt, Ian M. Whyte. Alprazolam is
relatively more toxic than other benzodiazepines in overdose. Prieiga per internetą
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2125.2004.02089.x/full
14. HV Pai, SC Upadhya, SJ Chinta, SN Hegde, V Ravindranath. Differential metabolism of alprazolam by liver and brain cytochrome (P4503A) to pharmacologically active
15. Jan A. Fawcett, M.D., and Howard M. Kravitz, D.O. Alprazolam: Pharmacokinetics, Clinical Efficacy, and Mechanism of Action 1982 m. Prieiga per internetą
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.1875-9114.1982.tb03191.x/full
16. Joris C. Verster and Edmund R. Volkerts Clinical Pharmacology, Clinical Efficacy, and Behavioral Toxicity of Alprazolam: A Review of the Literature. 2004 m. Prieiga per internetą http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1527-3458.2004.tb00003.x/full
17. Fatal overdose of tramadol and alprazolam K. Michaud*, M. Augsburger, N. Romain, C. Giroud, P. Fatal overdose of tramadol and alprazolam. Prieiga per internetą
http://www.fsijournal.org/article/S0379-0738(99)00118-8/fulltext
18. Michael R. Liebowitz, Abby J. Fyer, Hack M. Gorman, Raphael Campeas, Andrew Levin, Sharon R. Davies, Deborah Goetz and Donald F. Klein Alprazolam in the Treatment of Panic Disorders. 1986 m.
19. L. M. Oswald and J. D. Roache H. M. Rhoades. Predictors of Individual Differences in Alprazolam Self-Medication. Experimental and Clinical Psychopharmacology, Vol 7(4), Nov 1999, 379-390.
20. Tzu-Ting Chen, Chih-Hung Ko, Shao-Tsu Chen, Chia-Nan Yen , Po-Wen Su , Tzung-Jeng Hwang Jin-Jia Lin k,l,m, Cheng-Fang Yen. Severity of alprazolam dependence and
associated features among long-term alprazolam users from psychiatric outpatient clinics in Taiwan. Journal of the Formosan Medical Association Volume 114, Issue 11, Pages 1097– 1104.
21. Recommended methods for the Identification and Analysis of Barbiturates and Benzodiazepines Under International Control.
22. Leo H. Sternbach. 1,4-Benzodiazepines. Chemistry and Some Aspects of the Structure-Activity Relationship 1971 m. Prieiga per internetą
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.197100341/full
23. Nicholas B. Tiscione, Xiaowin Shan, Ilene Alford and Dustin Tate Yeatman. Quantitation of Benzodiazepines in Whole Blood by Electron Impact-Gas Chromatography–Mass Spectrometry Reproduction (photocopying) of editorial content of this journal is prohibited without publisher’s permission. Journal of Analytical Toxicology, Vol. 32, October 2008. 24. Dariusz B£ACHUT, Marta BYKAS-STRÊKOWSKA, Ewa TARACHA, Bogdan
SZUKALSK. APPLICATION OF GAS CHROMATOGRAPHY/MASS
SPECTROMETRY (GC/MS) TO THE ANALYSIS OF BENZODIAZEPINES. 2004 m. 25. Moffat A. C., Osselton M.D., Widdop B. Clarke`s Analysis of Drugs and Poisons, 4th
26. Chromatografijos metodai ir jų taikymas. Sofija Sasnauskienė, Regina Firantienė, Valerija Jablonskienė. Chromatografijos metodai ir jų taikymas
27. Benzodiazepine toxicity Chip Gresham http://emedicine.medscape.com/article/813255-overview
28. Diazepam https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/diazepam#section=Top
29. Cooper, Alan J.; Magnus, Ralph V.; Rose, Michael; Phanjoo, André; Lancaster, Neville P.; Pollard, Patricia; Knowlson, Patrick. Controlled trial of dipotassium clorazepate
("Tranxene") in anxiety The British Journal of Psychiatry, Vol 123(575), Oct 1973, 475-476.
30. TD Wallis, JC Valle-Jones, JR Craven, GW Hanks, PD Stonier. Single daily dose treatment of anxiety with clobazam or dipotassium clorazepate. 1979 m.
31. http://extranet.vvkt.lt/paieska/ Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registras 32. D.D. BREIMER. PHARMACOKINETICS AND METABOLISM OF VARIOUS
BENZODIAZEPINES USED AS HYPNOTICS. 1979 m. Prieiga per internetą
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2125.1979.tb00449.x/abstract
33. Ronald A. Hites. Gas Chromatography Mass Spectrometry. http://helsenet.info/pdf/mass/4.pdf
34. J. Throck Watson Professor and David Sparkman Adjunct Professor. Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications and Strategies for Data Interpretation, Fourth Edition. Chapter 10. Gas Chromatography/Mass Spectrometry. 2007 m.
35. Vaistų suvartojimo statistika 2016 m. VVKT ataskaita.
36. Hans Brandenberger,Robert A. A. Maes. Analytical Toxicology for Clinical, Forensic and Pharmaceutical Chemists
37. NIST Mass Spectrometry Data Center Collection. Prieiga per internetą
