„Alternatyvių šaltinių panaudojimas bioetanolio gamybai ir natūralių priemonių taikymas gautų žlaugtų gedimo prevencijai“

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

Aistė Senkuvienė

„Alternatyvių šaltinių panaudojimas bioetanolio gamybai ir natūralių priemonių taikymas gautų žlaugtų gedimo prevencijai“

„The use of alternative sources for the production of bioethanol and the application of natural preservation for the prevention of spoiling

distillers grains“

Bioverslo vadybos ištęstinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas:

Prof. dr. Paulius Matusevičius

Konsultantas:

Prof. dr. Elena Bartkienė

Kaunas, 2015

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Alternatyvių šaltinių panaudojimas bioetanolio gamybai ir natūralių priemonių taikymas gautų žlaugtų gedimo prevencijai“

1. Yra atliktas mano pačios:

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2015 01 13 Aistė Senkuvienė

(data) (autoriuas vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ

LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Aistė Senkuvienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

...

...

...

Prof. dr. P. Matusevičius

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

APROBUOTAS GYVULININKYSTĖS KATEDROJE

(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretorės parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

TURINYS

SUMMARY 4

SANTRAUKA 5

SANTRUMPOS 6

ĮVADAS 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA 10

1.1. Bulvių veislės ir jų savybės 10

1.2. Bulvių cheminė sudėtis 11

1.3. Bulvių panaudojimas maisto pramonėje, šalutiniai gamybos produktai 12

1.4. Etanolis, jo savybės ir pagrindiniai gavimo būdai 13

1.5. Tradicinės ir netradicinės žaliavos naudojamos etanolio gamybai 14

1.6. Aukštesnieji alkoholiai ir kiti fuzelio junginiai 16

1.7. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių įtaka sveikatai 18

1.8. Bioetanolis ir jo gamybos būdai 19

1.9. Žlaugtų panaudojimas 21

1.10. Žlaugtų maistinė vertė ir panaudojimas pašarų sektoriuje 21

2. DARBO METODIKA 24

2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas 24

2.2. Tyrimų objektai ir metodai 25

2.2.1. Eksperimentui naudotos žaliavos 25

2.2.2. Bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų paruošimas etilo alkoholio gamybai 26

2.2.3. Etilo alkoholio gamyba laboratoriniu būdu 27

2.2.3.1. Raugalo pH, sausųjų medžiagų kiekio ir bendro titruojamojo rūgštingumo nustatymas

27 2.2.4. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių nustatymas dujų

chromotografijos metodu

27 2.2.5. Etilo alkoholio koncentracijos (tūrio %) nustatymas mėginiuose 28 2.2.6. Žlaugtų fermentacija bakteriocinus produkuojančiomis pieno rūgšties

bakterijomis

29

2.3. Biogeninių aminų tyrimo metodika 29

2.4. Žlaugtų mikrobiologiniai rodiklių tyrimas 30

2.5. Matematinė statistinė duomenų analizė 30

3. REZULTATAI 31

3.1. Raugalo pH, sauųjų medžiagų kiekis ir bendras titruojamasis rūgštingumas 31

3.2. Biokatalizatorių įtaka etanolio išeigai 33

3.3. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekis etanolyje, pagamintame iš bulvių ir jų šalutinių gamybos produktų

34

3.3.1. Acetaldehido kiekio palyginamasis įvertinimas 34

3.3.2. Metanolio kiekio palyginamasis įvertinimas 35

3.3.3. Propanolio kiekio palyginamasis įvertinimas 36

3.3.4. Suminio aukštesniųjų alkoholio ir kitų fuzelio junginių palyginamasis įvertinimas

37

3.4. Biogeninių aminų kiekis žlaugtuose 38

3.5. Mikrobiologiniai žlaugtų rodikliai 42

4. REZULTATŲ APTARIMAS 44

IŠVADOS 47

LITERATŪROS SĄRAŠAS 48

PRIEDAI 53

SUMMARY

Author: Aiste Senkuviene

Subject: „The use of alternative sources for the production of bio-ethanol and the application of natural preservation for the prevention of spoiling distillers grains“

Thesis supervisor: Prof. dr. Paulius Matusevicius Consultant: Prof. dr. Elena Bartkienė

Place of accomplishment: A thesis completed in the Department of animal nutrition, Department of food safety and quality Veterinary academy of Lithuanian University of Health Sciences.

Scope of the thesis: 59 pages, 7 tables, 15 pictures.

The goal of the thesis was: To evaluate safety parmeters of ethanol, produced from potatoes and their by-products, and to bacteriocins producing lactic acid bacteria for distillers grains natural preservation.

Ethanol was made from potatoe and their by-products by using different enzymes for mass saccharification process. Safety of produced ethanol was evaluated by examination of higher alcohols and other fusel compounds. Lactic acid bacteria were used for distillers grains (DGGS) conservation. Biogenic amines and microbiological parameters of (DGGS) were evaluated.

According to our results, different enzymes have different influence on technological and ethanol parameters and yield. The highest yield of ethanol was obtained from samples prepared with Stargen, Depol 692 ir Ecopulp Tx 200 - A, as well as in control samples, without enzymes. The highest concentration of fusel compounds was found in a samples L

(81920.7 mg/l), which were produced by using Stargen. The lowest concentration of fusel compounds was found in samples B

(4835.2 mg/l), which were produced by using Ecopulp Tx-200 A.

Biogenic amines formation in DGGS were affected by enzymes used for saccharification of the raw material. The highest total biogenic amines content was found in control samples B

(105.5 mg/kg). The lowest biogenic amines content was found in samples B

(7.8 mg/kg), which were produced by using Depol 680 P.

DGGS fermentation with selected lactic acid bacteria could be alternative for preservations, to increase DGGS nutritional value and their positive impact on the health of animals, because it would contain the recommended quantity of lactic acid bacteria (more than 10

).

Keywords: potatoes, ethanol, by-products, DGGS, lactic acid bacteria, fermentation, safety,

quality.

SANTRAUKA

Tema: Alternatyvių šaltinių panaudojimas bioetanolio gamybai ir natūralių priemonių taikymas gautų žlaugtų gedimo prevencijai.

Darbo vadovė: Prof. dr. Paulius Matusevičius.

Atlikimo vieta: Darbas atliktas 2012-2015 metais Lietuvos Sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijoje, Gyvūnų mitybos katedroje, Maisto saugos ir kokybės katedroje.

Darbo dydis: 59 puslapiai, 7 lentelės, 15 paveikslų.

Darbo tikslas - įvertinti etanolio, pagaminto iš bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų, saugą aukštesniųjų alkoholių aspektu bei pritaikyti gautiems žlaugtams natūralius konservavimo būdus bakteriocinus produkuojančiomis pieno rūgšties bakterijomis.

Atliekant šį darbą buvo atlikta etilo alkoholio gamyba iš bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų, naudojant įvairius biokatalizatorius ir nustatyta jo sauga aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių aspektu. Bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų fermentacija buvo vykdyta Saccharomyces cerevisiae mielėmis, naudojant įvairius biokatalizatorius bei be jų.

Pagal gautus rezultatus, fermentai, turėjo skirtingą įtaką technologiniams proceso parametrams ir etanolio išeigai: raugalo pH kito nuo 5,44 iki 5,88, atitinkamai, mėginių B

ir B

; Raugalo bendras titruojamasis rūgštingumas (BTR) kito nuo 1,4 iki 9,5 ºN, atitinkamai, mėginių B

ir L

; raugale sausųjų medžiagų kiekis kito nuo 1,3 iki 2,5%, atitinkamai, mėginių L

ir L

; Didžiausia etanolio išeiga gauta sucukrinimui naudojant Stargen, Depol 692, Ecopulp Tx 200 - A fermentus, taip pat kontroliniuose mėginiuose. Žaliavos sucukrinimui naudoti fermentiniai preparatai, turėjo skirtingą įtaką aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių formavimuisi etanolyje. Didžiausias suminis fuzelio junginių kiekis nustatytas mėginyje L

(81920,7 mg/l), naudojant fermentinį preparatą Stargen. Mažiausias suminis fuzelio junginių kiekis nustatytas mėginyje B

(4835,2 mg/l), naudojant fermentinį preparatą Ecopulp Tx 200 - A.

Biogeninių aminų (BA) formavimuisi žlaugtuose įtakos turėjo etanolio gamybos metu žaliavos sucukrinimui naudoti fermentai. Didžiausias suminis BA kiekis nustatytas kontroliniuose mėginiuose B

(105,5 mg/kg). Mažiausias BA kiekis nustatytas mėginiuose B

(7,8 mg/kg), naudojant fermentinį preparatą Depol 680 P.

Žlaugtų fermentacija parinktomis pieno rūgšties bakterijomis galėtų būti alterntyvi priemonė

cheminiams konservantams, o gaunama pašarų žaliava, be maistinės vertės galėtų turėti ir teigiamą

įtaką gyvūnų sveikatingumui, nes joje būtų rekomenduojamas probiotiniams priedams pieno

rūgšties bakterijų kiekis (daugiau nei 10

).

Raktažodžiai: bulvės, etanolis, šalutiniai perdirbimo produktai, žlaugtai, pieno rūgšties bakterijos, fermentacija, sauga, kokybė.

SANTRUMPOS

BA – biogeniniai aminai.

SM – sausosios medžiagos.

PSO – Pasaulinė Sveikatos Organizacija.

MŽŪO – Maisto ir Žemės Ūkio organizacija.

BTR – bendras titruojamasis rūgštingumas.

PRB - pieno rūgšties bakterijos.

ESSC – efektyvaus slėgio skysčių chromotografija.

Ls– Lactobacillus sakei.

Pp – Pediococcus pentosaceus.

Pa – Pediococcus acidilactici.

ĮVADAS

Augalininkystės produkcijos nuostoliai priklauso nuo įvairių sąlygų: laikymo sąlygų, auginimo ir nuėmimo laiko. Taip pat, labai svarbi šiame sektoriuje dirbančių kvalifikacija, kuri įgalina gerai išmanyti laikomos ir auginamos produkcijos savybes, cheminę sudėtį, įvairių aplinkos veiksnių poveikį ir tarpusavo ryšį auginamai produkcijai (Follis ir kt., 2010).

Etanolis yra chemiškai aktyvi medžiaga, kitaip vadinamas etilo alkoholiu arba tiesiog alkoholiu. Etanolis yra bespalvis degus skystis, turintis būdingą alkoholio kvapą bei deginantį skonį.

Nuo senovės pagrindinė etilo alkoholio panaudojimo sritis buvo alkoholinių gėrimų gamyba, tačiau, didėjant degalų paklausai bei susirūpinimu gamtos tarša, vis dažniau etanolis naudojamas bio- kuro gamyboje. Pasaulyje kiekvienais metais pagaminama apie 350 mln. m³ bio- etanolio. Labiausiai paplitęs bio- etanolio gamybos būdas yra iš didelį cukraus ir krakmolo kiekį turinčių žaliavų. Šiuo metu populiariausios žaliavos bio- etanolio gamyboje yra grūdinės kultūros, cukriniai runkeliai, bulvės.

Nors šiandien etanolio gamyboje vis dar populiariausia žaliava yra grūdinės kultūros, tačiau vis daugiau dėmesio skiriama šakniavaisiams, kaupiantiems krakmolą (bulvėms), arba inuliną (topinambams).

Siekiant gauti kuo didesnes bio- etanolio išeigas ir kuo efektyviau panaudoti vietinę augalinę žaliavą, jos apdorojimui gali būti naudojami įvairūs alternatyvūs šaltiniai.

Etanolio gamybos metu susidaro nemažai nepageidaujamų junginių – esterių, aldehidų, aukštesniųjų alkoholių ir kt., kurie yra toksiški. Tai yra priežastis, dėl kurios gaminant etanolį alkoholinių gėrimų gamybai arba maisto produktų konservavimui būtina užtikrinti jo saugą šių junginių aspektu.

Siekiant gamybos efektyvumo, kuriamos naujos etanolio gamybos technologijos, kurių pagrindas yra biotechnologiniais sprendimais paremtas gamybos efektyvumo didinimas. Taikant naujas technologijas, ar tobulinant jau esamas, labai svarbu, kad galutinis produktas būtų saugus ir nepakenktų vartotojams.

Gaminant etanolį iš bulvių ir bulvių gamybos šalutinių produktų po fermentacijos ir

distiliacijos lieka apie 1/3 buvusių bulvėse sausųjų medžiagų. Bulvių žlaugtuose beveik nebelieka

pagrindinės jų sudedamosios dalies krakmolo, tačiau lieka baltymų, riebalų, ląstelienos ir

mineralinių medžiagų. Tai geras energijos ir mineralinių medžiagų šaltinis gyvuliams. Bulvių

žlaugtuose yra didelis kiekis energijos. Bulvių žlaugtai yra baltymingas ir daug energijos turintis

pašaras ir pagal baltymų visavertiškumą (aminorūgščių sudėtį ir kiekį) prilygsta kitiems

baltymingiems pašarams. Be to, bulvių žlaugtai yra bene pigiausias energijos ir baltymų šaltinis gyvuliams.

Gamtoje yra daug natūralių mikroorganizamų, turinčių teigiamą poveikį žmonių, gyvulių, paukščių ir kitų gyvų organizmų sveikatai, gerinančių virškinamojo trakto mikrobinę sudėtį. Todėl sukurta visa eilė mikrobiologinių preparatų, skirtų naudoti žmogaus ir gyvūnų sveikatinimui, produktų saugos užtikrinimui ir kt.. Dažniausiai šiuo tikslu naudojamos pieno rūgšties bakterijos pvz. Lactobacillus acidophillus L. bulgaricus, L. casie, L. fermentum, L. Plantarum Streptococcus thermophilus.

Pieno rūgšties bakterijos yra ekologiški mikroorganizmai, sintetinantys labai svarbias, biologiškai aktyvias medžiagas – vitaminus, fermentus, antibiotikus, aminorūgštis. Jie reguliuoja virškinamojo trakto biologinius procesus, saugo gyvulių jauniklius nuo žarnyno ligų, taip pat skatina augimą. Jos turi trejopą poveikį: naikina patogeninius organizmus, stimuliuoja imunitetą ir biocheminius procesus, neutralizuoja ir kompensuoja sutrikusią organų veiklą.

Probiotikai, palyginti su kitais cheminiais preparatais, turi daug pranašumų: jie traktuojami kaip saugūs, nesukelia šalutinių reakcijų, alergijos, gyvūnai juos ypač gerai toleruoja (Teruo Higa, 2006).

Pieno rūgšties bakterijos pašarų fermentacijai naudojamos dėl keleto priežasčių: norint sumažinti pašarų užterštumą mikrooganizmais (Beal ir kt., 2002; Beal ir kt., 2005) ir pagerinti pašaruose esančių medžiagų bio- prieinamumą įvairioms gyvūnų rūšims (Heres ir kt., 2003; Skrede ir kt., 2003).

Fermentacija yra sudėtingas procesas, kurio metu susidaro įvairūs junginiai, kurie, deja, ne visuomet yra pageidautini galutiniame produkte. Vieni tokių yra biogeniniai aminai (BA), kurių per didelis kiekis gali daryti neigiamą įtaką gyvūnų sveikatai. BA randami daugelyje produktų, o kai kuriuose produktuose ir gana didelėmis koncentracijomis (Wolken ir kt., 2006). Paprastai per didelis BA kiekis siejamas su nepageidaujama mikroorganizmų veikla – prasidėjusius mikrobiologiniu gedimu (Zaman ir kt., 2010). Didžiausią neigiamą įtaką daro histaminas, putrescinas, kadaverinas, tiraminas, triptaminas, kurie kaupiasi vykstant mikrobiologinei aminorūgščių fermentacijai arba mikrobiologinio gedimo procesų metu (De las Rivas ir kt., 2008).

Mūsų darbo tikslas buvo - įvertinti etanolio, pagaminto iš bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų, saugą aukštesniųjų alkoholių aspektu bei pritaikyti gautiems žlaugtams natūralius konservavimo būdus bakteriocinus produkuojančiomis pieno rūgšties bakterijomis.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti etanolio gamybą iš bulvių ir jų perdirbimo metu gaunamų šalutinių produktų šaltuoju

gamybos būdu, naudojant žaliavos sucukrinimui biokatalizatorius ir įvertinti skirtingų

gamybos technologijų ir naudotų žaliavų įtaką aukštesniųjų alkoholių ir fuzelių junginių formavimuisi etanolyje;

2. Atlikti žlaugtų konservavimą pieno rūgšties bakterijomis ir įvertinti gautų žlaugtų mikrobiologinius rodiklius;

3. Įvertinti biogeninių aminų formavimosi tendencijas žlaugtuose, gautuose gaminant etanolį

šaltuoju gamybos būdu ir žaliavos sucukrinimui naudojant skirtingus biokatalizatorius.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Bulvių veislės ir jų savybės

Bulvės yra skirstomos pagal vegetacinį laikotarpį į:

 labai ankstyvas;

 ankstyvas;

 vidutinio ankstyvumo;

 vėlyvas.

Renkantis veislę, ypač didesniems ūkiams, reikėtų pasirinkti ligoms atsparias, derlingas veisles.

Lietuvoje dažniausiai auginamos šios bulvių veislės:



,,Presto“ - labai ankstyva,aukštos kokybės maistinė bulvių veislė. Šviežiam vartojimui,

pirminiam fasavimui, skutimui. Gumbų forma ovali. Minkštimo spalva gelsva. Greitai bręsta.

Sausųjų medžiagų kiekis 18 %. Išvirus nesukrenta ir nejuoduoja. Žiemą vidutinis ramybės periodas.

Atspari nematodams Ro1-Ro4, juodajai kojelei, rizoktonijai ir puviniams, jautresnė rauplėms, marui, sudaužymams. Norint išauginti kuo ankstyvesnį subrandintą derlių, rekomenduojama padaiginti, tinkamos auginti ekologiniuose ūkiuose.



„Borwina“ - maistinės paskirties labai ankstyva bulvių veislė sukurta Vokietijoje. ,,Borwina“

veislės bulvės ovalios, lygia geltona luobele, sekliomis akutėmis. Vidutinis prekinio gumbo svoris- 101 g. išvirtos nesubyra, tačiau pakankamai miltingos. Bulvių minkštimas- geltonas. ,,Borwina“

veislės bulvės žydi negausiai, raudonai violetiniais žiedais.

 „Vineta“ - ankstyva, maistinės paskirties bulvių veislė. Gumbai apvaliai ovalūs, stambūs, šiurkštesne odele, vidutinio gilumo akutėmis. Vidutinis krakmolo kiekis apie 16 %. Vidutinis sausų medžiagų kiekis 22 - 24 %. Geros prekinės išvaizdos, atsparūs mechaniniams pažeidimams.

Luobelė ir minkštimas gelsvi. Išvirus nežymiai subyra. Gerai laikosi žiemą. Augalai atsparūs vėžiui, bulviniams nematodams Ro1, virusams A ir Y ir lapų susisukimo virusui, juodajai kojelei.

Fitoftorozei - vidutinio atsparumo. Šios veislės bulvės mažiau reiklios dirvai ir drėgmei, ypač atsparios sausrai, neimlios ligoms ir kenkėjams. Nepakenčia azoto pertekliaus, dėl kurio pristabdomas gumbų brendimas ir susilpninamos sandėliavimo savybės. Tinkamos daiginti. Puikaus skonio. Geros sandėliavimo savybės, ilgas ramybės periodas. Tinkamos auginti ekologiniuose ūkiuose. Šios veislės bulvės įvairiomis kintamomis auginimo sąlygomis duoda pastovų vidutinį derlių.

 ,,Osprey“ - maistinės paskirties ankstyvųjų bulvių veislė sukurta Jungtinėje Karalystėje.

Bulvėstambios, ovalios, gelsva su rausvomis dėmėmis luobelė, sėkliomis raudonomis akutėmis.

Suvirimas- universalus, išvirtos nesubyra, bet ir nėra kietos. Minkštimas - kreminis. ,,Osprey”

veislės bulvės žydi gausiai, šviesiais rausvais violetiniais žiedais. Selekcininko duomenimis, atsparios Y virusui- dryžligės sukėlėjui, paprastųjų rauplių bei juodosios kojelės sukėlėjams.

 ,,Melody“ - vidutinio ankstyvumo, maistinės paskirties bulvių veislė, naudojama šviežiam vartojimui, pakavimui, plovimui. Pasižymi puikiomis skonio savybėmis visą žiemojimo laiką:

nejuoduoja išvirus, vidutiniškai miltingos. Ilgas ramybės periodas (7-8 mėnesiai). Gumbai ovalūs, gelsva tinkline luobele, sekliomis akutėmis, kere formuojami vienodo dydžio. Minkštimas švelniai geltonas. Vidutinis krakmolo kiekis apie 17 %. Sausų medžiagų kiekis apie 20,5 %. Melody išsiskiria pakankamai dideliu atsparumu mechaniniams sužeidimams ir sudaužymams. Didelis atsparumas nematodams - Ro1 - Ro4, rauplėms, juodajai kojelei, rizoktonijai. Vidutiniškai atspari Y virusui, marui. Kilmės šalis – Olandija.

 ,,Laura“ - vidutinio ankstyvumo, maistinės paskirties bulvių veislė. Gumbai pailgai ovalūs, raudoni, labai puikios prekinės išvaizdos. Minkštimas ryškiai geltonas. Vidutinis krakmolo kiekis apie 13 %. Sausų medžiagų kiekis apie 20 %. Augalai neimlūs nematodams Ro1 - Ro5, virusams (garbanei, dryžligei, lapų susisukimo virusui), tačiau jautrios marui. Šios veislės bulvės ypač atsparios sausrai. Gero skonio, verdant nesukrenta, išvirus nepakeičia spalvos. Ilgas ramybės periodas. Nebijo vandens pertekliaus. Kilmės šalis – Vokietija.

1.2. Bulvių cheminė sudėtis

Sausųjų medžiagų bulvės sukaupia 20-30%. Pagrindinis angliavandenis bulvėse yra krakmolas. Valgomojoje bulvėje jo būna 16-20%. Vėlesnės brandos bulvės krakmolo sukaupia daugiau negu ankstyvosios. Bulvių maistinė vertė pateikta 1.1. lentelėje (A Kita, 2002).

1.1. lentelė. Vidutinė bulvių maistinė vertė

Sudedamosios dalys Kiekis

Vanduo 78,8 g

Sausųjų medžiagų 21,2 g

Baltymų

 Gyvūninių baltymų

 Augalinių baltymų

2,0 g 0,0 g 2,0 g Riebalų

 Sočiųjų riebalų rūgščių

 Mononesočiųjų riebalų r.

 Polinesočiųjų riebalų r.

0,1 g 0,01 g 0,00 g 0.06 g

Cholesterolio 0 mg

1.1. lentelės tęsinys. Vidutinė bulvių maistinė vertė

Sudedamosios dalys Kiekis

Angliavandenių

 Krakmolo

 Cukrų (mono- ir disacharidų)

 Skaidulinių medžiagų

18,3 g 16,6 g 0,3 g 1,6 g Mineralinių medžiagų

 Natrio

 Magnio

 Fosforo

 Kalio

 Kalcio

 Geležies

 Cinko

 Seleno



1,0 g 16 mg 25 mg 52 mg 452 mg

11 mg 0,6 mg 0,36mg 0 µg 3,0µg

Vitaminai A, D, E, B, B, B, B, C 3,43 mg

1.3. Bulvių panaudojimas maisto pramonėje, šalutiniai gamybos produktai

Žmonės maistui sunaudoja tik nedidelę dalį išauginto derliaus. Pašariniams augalams auginti užimami dideli žemės plotai, sunaudojama daug energijos ir kitų išteklių: trąšų, pesticidų ir kt.. Šios medžiagos labai teršia dirvožemį, vandenį ir labai kenkia žmogaus sveikatai. Gaminant produktus žmonių mitybai, susikaupia daug šalutinių gamybos produktų, kuriuos perdirbus į pašarus galima gauti žymią ekonominę naudą: daugiau produkcijos, nereikia skirti lėšų atliekoms naikinti, gerėja gamtosauga ir t.t..

Sausi pašarai turi didelę pašarinę vertę, tačiau jų džiovinimas labai padidina jų kainą. Drėgni pašarai yra pigesni ir jais šeriant gyvulius pagaminama pigesnė produkcija, tačiau jie mažiau parankūs naudoti, nes greitai genda. Daugelyje šalių drėgni pašarai sudaro reikšmingą pašarų dalį.

Kiaulėms daugiausia šeriamos kviečių krakmolo gavybos, bulvių perdirbimo atliekos, išrūgos, mielės, o galvijams – salyklojai, cukrinių runkelių griežiniai, bulvių tarkiniai, žlaugtai. Šalutiniai maisto produktų gamybos produktai yra sušeriami kaip atskira raciono pašaro dalis arba sunaudojami gaminant kombinuotuosius pašarus.

Daugiausia drėgnų šalutinių produktų (apie 68 proc.) gaunama perdirbant bulves. Jų pašarinė vertė priklauso nuo perdirbimo pobūdžio. Ruošiant maisto produktus iš bulvių, apie 35-46 proc.

perdirbamos masės tampa atliekomis (M.S.Swaminathan, K.V.Peter, 2008).

Išgaunant iš bulvių krakmolą, lieka bulvių sultys ir bulvių ląsteliena (brazdai). Sultyse yra

gerai įsisavinamų baltymų, todėl šis pašaras yra labai tinkamas gyvulių prieaugliui didinti. Žlaugtus

sudaro bulvių ląstelių sienelės, krakmolo ir sulčių likučiai. Jais, taip pat bulvių lupenomis,

dažniausiai šeriami vyresnio amžiaus galvijai. Bulvių lupenos jiems yra puikus energijos šaltinis. Jų sausojoje medžiagoje yra maždaug tiek pat energijos kaip miežių ar avižų grūduose, o baltymingumas apie 100 g/kg SM. Bulvių šalutiniai gamybos produktai yra labai gerai virškinami, gyvuliai noriai juos ėda.

Drėgnas bulvių liekanas galima silosuoti sumaišius su šienu, šiaudais. Imama 1 dalis smulkinto sausojo pašaro ir 2-3 dalys bulvių šalutinių produktų. Silosą galima laikyti pakankamai ilgai, t.y., apie 6 mėnesius.

Labiausiai vertinami sausi bulvių produktai, nes juose energija koncentruota. Ypač didelis energijos kiekis energijos tuose bulvių produktų šalutiniuose produktuose (pvz. bulvių traškučių nuolaužose), kuriuos gaminant naudojamas aliejus. Riebalai (sausosiomis medžiagomis) sudaro 25- 30 proc. Daug riebaus pašaro gyvuliams duoti negalima, todėl riebalų kiekį būtina nustatyti prieš šeriant gyvulius. Termiškai apdorotas bulvių krakmolas lengvai virškinamas, todėl ypač rekomenduojamas kiaulėms. Sausų bulvių likučių yra įmaišoma į kombinuotuosius pašarus (Harold C. Long, 2010).

Bulvių šalutiniai produktai paklausūs tik tuomet, kai šeriant gaunamas toks pat produktyvumas, kaip ir naudojant įprastinius pašarus.

Drėgnais bulvių šalutiniais produktais galima pakeisti javų grūdus galvijų mityboje.

Paskaičiuota, kad 4,5-5,0 kg bulvių šalutinių produktų prilygsta 1 kg grūdų. Jais šeriant gaunami geri priauglio rezultatai.

Naudojant gyvuliams įvairius bulvių šalutinius gamybos produktus būtina įvertinti, kad šiuose pašaruose yra nepakankamas baltymų, ląstelienos, mineralinių elementų, vitaminų, ypač riebaluose tirpių, kiekis, todėl šių medžiagų, iki reikiamos normos, būtina pridėti papildomai.

1.4. Etanolis jo savybės ir pagrindiniai gavimo būdai

Etanolis yra priskiriamas prie atsinaujinančių energijos šaltinių, kuris gali būti gaminamas iš atsinaujinančių žemės ūkio žaliavų. Jis gali būti vadinamas etanoliu, etilo alkoholiu arba tiesiog alkoholiu. Tai yra bespalvis degus skystis, turintis alkoholio kvapą ir aštrų skonį. Jis gali būti gaminamas iš tokių populiarių augalų kaip cukranendrės, runkeliai ar bulvės.

Etanolio virimo temperatūra 78,4 ºC, lydymosi temperatūra -114,3 ºC, pH 7,0, molekulinė masė 49,069. Etanolis fizikinėmis savybėmis yra labai panašus į vandenį, todėl jį išgryninti yra labai sunku (Hamelinck C.N. ir kt., 2005).

Etanolis yra chemiškai aktyvi medžiaga, cheminės etanolio savybės priklauso nuo alkoholių

funkcinės grupės – hidroksilo. Pagal chemines savybes etanolis yra neutrali medžiaga, tačiau

etanolis gali reaguoti kaip silpna bazė ir rūgštis. Jo rūgštinės savybės yra silpnesnės negu vandens.

Etanolis taip pat gali reaguoti su organinėmis rūgštimis ir taip sudaryti esterius. Tam tikromis sąlygomis etanolis gali dehidratuotis bei reaguoti su aktyviais metalais. Etanolis pakankamai lengvai oksiduojasi ir susidaro aldehidas.

Pramonėje etanolis gali būti susintetinamas arba gaunamas iš tam tikrų gamtinių angliavandenių, tokių kaip krakmolas bei celiuliozė (Kadar Z. ir kt., 2007).

Seniausias etilo alkoholio gamybos būdas - cukrinių medžiagų alkoholinis rūgimas - angliavandenius veikiant mielėmis, jie ima skaidytis, t.y., pradeda rūgti. Pramonėje etanolis gali būti gaminamas iš polisacharido - celiuliozės. Pramonėje medienos atliekos hidrolizuojamos 5-6 % sieros rūgštimi, taikant tam tikrą slėgį. Hidrolizės produktas neutralizuojamas, filtruojamas ir fermentuojamas. Gaunamas hidrolizinis alkoholis (Sun Y., Cheng J., 2002).

Grynas alkoholis maišosi su vandeniu ir benzinu įvairiais santykiais, todėl jis gali būti naudojamas kaip kuras vidaus degimo varikliuose. Etanolis labai gerai tirpina daugumą organinių medžiagų, taip pat pasižymi antiseptinėmis savybėmis (Ezeji TC. ir kt., 2004).

1.5. Tradicinės ir netradicinės žaliavos naudojamos etanolio gamybai

Techninis etilo alkoholis yra sintetinio kaučiuko, plastmasių, fotoreikmenų, dirbtinio šilko, lakų dažų ir organinio stiklo žaliava. Techninis etilo alkoholis gaminamas iš medienos, sulfitinis etilo alkoholis – iš celiuliozės pramonės atliekų, sintetinis etilo alkoholis – iš etileno turinčių dujų.

Etilo alkoholis gaminamas anaerobinio rūgimo metu. Rauginimui naudojamos greitai besidauginančios, didelėms cukraus ir alkoholio koncentracijoms atsparios mielės.

Geriausiai etilo alkoholio gamybai tinka didelį krakmolo ir cukraus kiekį turinčios žaliavos.

Gaminant etanolį iš bulvių, bulvės pirmiausia šutinamos 130-140 ºC temperatūroje, kad krakmolas hidrolizuotųsi. Krakmolo sucukrinimui salyklas, kurio gamybai būdavo naudojamas salyklas, kurio gamybai naudojami sveiki ir daigūs rugiai arba miežiai. Šutinta masė sumaišoma su salyklu ir 55-57 ºC temperatūroje krakmolas virsta fermentuojamais sacharidais. Tuomet masė ataušinama iki rauginimui tinkamos temperatūros (apie 30 ºC) ir į ją pridedama mielių.

Mielės aktyviausiai veikia terpėje, kurioje yra 10 – 18 % sacharidų.

Sucukrinta masė rauginama specialiose plieninėse rauginimo statinėse. Kai baigiasi rūgimo procesas gautasis raugalas yra distiliuojamas. Jau subrendusiame raugale, be etilo alkoholio, taip yra labai bjauraus kvapo ir nuodingo izobutilo-, izoamilo- ir metilo- alkoholio, baltymų, mineralinių medžiagų, mielių.

Iš bulvių gaminamas aukščiausio valymo ir I rūšies etanolis.

Distiliavimo procese iš raugalo išsiskiria žaliasis etilo alkoholis, kuris yra bespalvis. Jis gali būti naudojamas tik technikos tikslams, nes jame gausu priemaišų – net apie 50 įvairių cheminių junginių: esterių, aldehidų, furfurolo, terpenų ir kt..

Iš etanolio gaminama daugybė alkoholinių gėrimų rūšių: likeris, trauktinės, degtinė ir kt.

Bioetanolio gamyboje gali būti naudojamos šios žaliavos:

 cukraus turinčios žaliavos: cukranendrės, cukriniai runkeliai;

 krakmolo turinčios žaliavos: bulvės, grūdai;

 lignoceliuliozė, mediena, šiaudai.

Gaminant etanolį, augaluose esantys angliavandeniai per daugelį tarpinių produktų metabolizuojami į alkoholį. Paprasčiausia alkoholį gauti iš cukrinių runkelių ar cukranendrių, nes cukrus juo paverčiamas be tarpinių produktų. Iš krakmolo (pavyzdžiui, grūdų) iš pradžių reikia gauti cukrų, iš kurio vėliau rauginant gaunamas etanolis. Iš daug ląstelienos turinčių augalų bio- etanolį gaminti sudėtingiau, nes, norint, kad celiuliozė virstų cukrumi, reikia naudoti rūgštis arba fermentus. Todėl šis būdas kol kas praktiškai nenaudojamas, nes reikalauja daug išlaidų ir yra neekonomiškas. Visame pasaulyje dedama daug pastangų tobulinant šį bio- etanolio gamybos būdą, kadangi žaliavų – šiuo atveju bet kokios biomasės ištekliai yra milžiniški. Kitame bio- etanolio gamybos cikle surūgusią augalų masę (misą) reikia distiliuoti, kad išsiskirtų alkoholis. Likę žlaugtai gali būti sušeriami gyvuliams, panaudoti bio- dujoms gaminti arba dirvoms tręšti. Gautame alkoholyje dar yra apie 4 proc. vandens, todėl jį reikia išgryninti (koncentruoti) iki 99,6-99,8 proc.

koncentracijos (Craig Rubens, 2008).

Šiuo metu Lietuvoje gaminami tik pirmos kartos bio- degalai. Pirmos kartos biodegalai yra degalai, kuriems kaip žaliava naudojami maistiniai augalai (kukurūzai, soja, palmės, cukranendrės, saulėgrąžos, rapsai, grūdinės kultūros, kt.), kurie turi lengvai išgaunamų cukrų, krakmolo ir aliejaus.

Gamybos metu cukrai sufermentuojami į bio- etanolį, o iš riebalinių rūgščių transesterifikacijos būdu pagaminamas biodyzelinas.

Pirmosios kartos bio- degalai susiduria su daugeliu problemų, apie kurias gerai žinoma iš žiniasklaidos. Pirmos kartos bio- degalų gamybos apimtys yra ribotos, kadangi besaikis jų didinimas kelia grėsmę maisto produktų gamybai ir bio- įvairovei. Jų gamyba brangesnė, lyginant su degalų gamyba iš iškastinio kuro – naftos. Kai kada bio- degalų gamybos metu šiltnamio efektą skatinančių dujų išsiskyrimas yra didesnis nei tradicinių degalų, jei vertinamas visas gyvavimo ciklas, įskaitant trąšų gamybą, transportavimą ir kt. (Jessica Prystenski, 2008).

Antros kartos bio- degalai yra degalai, kuriems kaip žaliava naudojama lignoceliuliozės

turinti biomasė. Tai mediena ir jos atliekos, žemės ūkio atliekos (šiaudai, kukurūzų kotai ir pan.) bei

energetiniai augalai. Šių žaliavų kiekiai yra milžiniški ir nesudaro konkurencijos maisto produktų

gamybai. Antros kartos bio- degalų gamybai suvartojama visa žaliava, o ne tik atskiri jos komponentai.

Antros kartos bio- degalai gali būti gaminami, naudojant du pagrindinius technologinius procesus. Pirmasis – tai biocheminis procesas, kurio metu fermentai ir kiti mikroorganizmai skaido celiuliozės ir hemiceliuliozių komponentus į cukrus, kurie vėliau fermentuojami į etanolį. Antrasis – tai termocheminis procesas, kurio metu, pasitelkiant pirolizės ar gazifikacijos technologijas, iš bio- masės gaminamos sintezės dujos – anglies monoksido ir vandenilio dujų mišinys. Iš sintezės dujų, taikant įvairius tolesnio apdirbimo metodus, galima gaminti bio- dimetileterį, bio- metanolį, bio- vandenilį (toliau jį naudojant kuro elementuose) ar polimerizuoti sintezės dujas į angliavandenilius- biodyzeliną pagal Fišerio-Tropšo metodą. Sintetiniai degalai ir bio- etanolis iš celiuliozės turi puikų anglies balansą ir juos vartojant galima sumažinti CO

emisiją iki 90 %, lyginant su degalais, pagamintais iš naftos (Biofuels Annual Report; 2009).

Paminėti du antros kartos bio- degalų gamybos būdai nėra vieninteliai, tačiau jie yra arčiausiai komercinio lygmens. Lyginant tarpusavyje biocheminį ir termocheminį bio- degalų gamybos procesus, reikia pažymėti, kad biocheminio proceso metu ligninas nėra skaidomas ir lieka kaip gamybos proceso atlieka, kurią galima panaudoti kurui, tuo padidinant viso gamybos proceso energetinį efektyvumą. Termocheminio proceso metu ir ligninas yra suskaidomas į sintezės dujas.

Tobulinant biocheminį bio- degalų gamybos būdą, reikia gerinti pirminį bio- masės žaliavos apdorojimą, didinti fermentų veikimo efektyvumą ir mažinti jų kainą bei mažinti gaminamų bio- degalų savikainą. Termocheminio degalų gamybos proceso technologijos yra labiau ištobulintos, tačiau pagrindinė problema yra siekis sumažinti galutinio produkto savikainą.

Lyginant tarpusavyje pirmos ir antros kartos bio- degalus, pastarųjų galima pagaminti ženkliai daugiau iš biomasės, užauginamos tame pačiame žemės plote. Be to, antros kartos bio- degalų gamybai naudojama biomasė gali būti auginama mažiau derlingose žemėse (Washington Post, 2008).

1.6. Aukštesnieji alkoholiai ir kiti fuzelio junginiai

Fuzeliu vadinami junginiai, turintys didesnę molekulinę masę ir virimo temperatūrą nei etanolis. Fuzeliai susidaro daugelio alkoholinių gėrimų gamyboje. Nedidelė fuzelio junginių bei esterių koncentracija formuoja alkoholinių gėrimų juslines savybes. Jei fuzelių koncentracija per didelė, ji suteikia gėrimams nepageidaujamą skonį (Lilly ir kt., 2006; Hazelwood ir kt., 2008; Anli, Bayram, 2010).

Aukštesnieji alkoholiai susidaro vykstant mielių metabolizmui iš aminorūgščių ir todėl yra

visų alkoholinių gėrimų natūrali sudedamoji dalis.

Pagrindiniai aukštesnieji alkoholiai alkoholiniuose gėrimuose yra 1-butanolis, 1-propanolis, 2-butanolis, izobutanolis bei izoamilo alkoholis.

Pasaulinė sveikatos organizacija (PSO), bei Maisto ir žemės ūkio organizacijos (MŽŪO) komitetas aukštesniuosius alkoholius yra įtraukęs į funkcinę klasę „skonį pagerinantys priedai“. Iš aukštesniųjų alkoholių yra įtraukti: 1-propanolis, 1-butanolis, izobutanolis. Aukštesnieji alkoholiai yra svarbūs, juslines savybes suteikiantys junginiai alkoholinių gėrimų gamyboje (Lang ir kt., 2006;

McKee ir kt., 2005).

1.2 lentelė. Pagrindiniai alkoholinių gėrimų fermentacijos šalutiniai produktai (Anli, Bayram, 2010)

Šalutiniai fermentacijos

produktai

Cheminė formulė Molinė masė (g/mol) Būdingas aromatas

Metanolis CH

OH 32,04 -

Fuzeliai

Izobutanolis C

H

OH 74,12 Aštrus ir aitrus

n - propanolis C

H

OH 60,1 Vaisinis

Amilo alkoholis C

H

OH 88,15 Sausas ir aitrus

n - butanolis C

H

OH 74,12 Etanolio

Izoamilo alkoholis C

H

OH 88,15 Aštrus deginantis

2 - butanolis C

H

OH 74,12 Vaisinio alkoholio

Esteriai

Etilacetatas C

H

O

88,11 Vaisinis (anansų)

Metilacetatas C

H

O

74,08 Vaisinis

Aldehidai

Acetaldehidas C

H

O 44,05 Vaisinis

Metanolis – žinomas kaip medžio alkoholis arba medžio spiritas. Tai vienas paprastesnių alkoholių (Halderman ir kt., 2009). Metanolis yra lengvas, bespalvis ir degus, jo kvapas yra saldesnis nei etanolio. Esant kambario temperatūrai metanolis naudojamas kaip tirpiklis, nes yra polinis skystis. Metanolis yra naudojamas bio- dyzelino gamyboje. Dėl savo toksiškų savybių metanolis yra dažnai naudojamas kaip denatūruoto priedo etanolis. Jis dažnai vadinamas medienos alkoholiu, nes jis gaunamas kaip medienos sausosios distiliacijos šalutinis produktas. Metanolis dar žinomas kaip denatūruotas spiritas (Engl ir kt., 2009).

Izobutanolis – bespalvis, degus skystis, turintis specifinį kvapą (Hahn ir kt., 2005). Jis

dažniausiai naudojamas kaip tirpiklis. Izobutanolis gali susiformuoti natūraliai fermentuojant

angliavandenius, bei susidaryti kaip organinių medžiagų skilimo šalutinis produktas. Jis gali būti

naudojamas daugybėje techninių ir pramoninių krypčių: lako gamyboje; kaip kvapnioji medžiaga

maisto pramonėje; įvairių gumų ir plastikų gamyboje; kaip dažų tirpiklis; nagų lako valiklių

ingredientas; kaip dažų priedas, norint sumažinti jų klampumą (Wald, 2011). Natūraliai izobutanolis

susidaro fermentuojant angliavandenius. Jis randamas fermentuotuose gėrimuose: brendyje, džine,

kavoje ir kt. Jis yra kai kurių uogų ir vaisių natūralus cheminės sudėties komponentas: vyšnių, aviečių, vynuogių, obuolių ir kt.

Izoamilo alkoholis – tai vienas iš aštuonių amilo alkoholio izomerų (Smith ir kt., 2010).

Izoamilo alkoholis yra pirminis alkoholis. Tai yra skaidrus ir vidutinio tvarumo skystis. Jis laikomas narkotiku ir yra apie keturis kartus toksiškesnis už etilo alkoholį. Pirmą kartą jis buvo išskirtas iš fuzelio, etilo alkoholio gamybos metu, kaip pašalinis melasos fermentacijos produktas. Izoamilo alkoholis yra geras tirpiklis ir skiediklis, jis naudojamas hidraulinių skysčių gamyboje.

Propanolis – pirmos klasės alkoholis. Jis yra bespalvis skystis. Propanolis dar žinomas kaip propan-1-olis, propilo alkoholis, n–propilo alkoholis, n–propanolio ar tiesiog propanolio alkoholis.

Jis dažniausiai naudojamas farmacijos pramonėje kaip tirpiklis. Propanolis natūraliai susiformuoja mažais kiekiais daugelio fermentacijos procesų metu.

Etilacetatas – tai etilo alkoholio skilimo produktas (O‘neil, 2006). Jis naudojamas kaip skiediklis ir tirpiklis. Etilacetatas plačiai naudojamas dėl savo mažos kainos, mažo toksiškumo ir malonaus kvapo. Jis taip pat naudojamas kavos pupelių ir arbatos be kofeino gamyboje. Etilacetatas naudojamas kaip kietiklis ir aktyvatorius dažų gamyboje. Jo yra vaisiuose, konditerijos ir parfumerijos gaminiuose. Etilacetatas yra nestabilus ir turi žemą virimo temperatūrą – 77 ºC. Jis yra labiausiai paplitęs vyno esteris. Jei vyne etilacetato kiekis per didelis, jis yra brokuojamas. Esant etilacetato sąlyčiui su deguonimi gali pablogėti vyno kokybė, nes etanolis oksiduojasi į acetaldehidą, o tai pasireiškia stipriu acto skoniu.

Metilacetatas – degus skystis, turintis gana malonų kvapą (Lide, 2006). Jis yra naudojamas kaip tirpiklis, todėl, kad yra mažiau toksiškas ir mažiau tirpus vandenyje. Esant kambario temperatūrai metilacetato tirpumas vandenyje 25 %, tačiau esant aukštesnei temperatūrai jo tirpumas yra žymiai didesnis. Metilacetatas nėra atsparus bazėms ir rūgštims. Jis yra gaunamas pramoniniu būdu, kaip acto rūgšties gamybos šalutinis produktas.

Acetaldehidas – vienas iš svarbiausių aldehidų, plačiai naudojamų pramonėje (Lechenmeier, 2010; Iacopino, 2009). Tai skaidrus skystis, lengvai degantis, turintis labai stiprų vaisinį kvapą. Jis yra natūraliai randamas gamtoje. Jo būna kavoje, duonoje, vaisiuose, sūryje. Jis kaupiasi augaluose kaip jų normalios medžiagų apykaitos produktas.

1.7. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių įtaka sveikatai

Kai kuriems alkoholiniams gėrimams aukštesnieji alkoholiai yra svarbūs skonio junginių

susidarymui. Apie aukštesniųjų alkoholių toksiškumą ir leistiną vartoti koncentraciją duomenų

literatūroje pakankamai nėra, taip pat nėra atlikta pakankamai toksikologinių tyrimų, kad būtų

galima įvardinti leistinas suvartoti aukštesniųjų alkoholių koncentracijas (Lechenmeier ir kt., 2008).

Nedidelis šių junginių kiekis nėra nepageidaujamas, tačiau jei produkte jų koncentracija yra didelė, tai gali sukelti didelių sveikatos problemų. Viena iš pagrindinių sukeltų problemų yra „pagirių“

sindromas, kurį sukelia didelis acetaldehido kiekis (Batista, Meirelles, 2011). Acetaldehidas yra labai toksiškas komponentas, susidarantis etanolio gamybos metu. Jis gali susidaryti fermentacijos procesą veikiant įvairiems veiksniams: toksiškiems metalams, kurie gali papulti iš vandens, naudojamo gamyboje arba netinkamai sureguliuotos distiliacijos įrangos; taip pat jis gali susidaryti dėl žaliavų cheminės sudėties ar prasidėjusio jų mikrobiologinio gedimo ar biologiškai aktyvių komponentų, esančių žaliavų sudėtyje (Leichenmeier, 2010; Iacoptino, 2009). Acetaldehidas turi neigiamą įtaką žmogaus sveikatai. Jis gali sukelti taškines mutacijas. Šie mutageniniai ir kancerogeniniai pokyčiai atsiranda nuo per didelės acetaldehido koncentracijos. Koncentracija, sukelianti organizme pokyčius, yra nuo 40 iki 200 μmol/l (Lachenmeier, Sohnius, 2008).

Metilacetatas gali turėti įtakos sveikatai patekęs per kvėpavimo takus ir per odą. Šiuo chemikalu galimas ir ūmus apsinuodijimas, jis gali stipriai dirginti odą ir sukelti niežulį.

Etilacetatas yra kvėpavimo takus dirginanti medžiaga, o esant didelėms koncentracijoms, jis sukelia narkozę ir depresiją.

Metanolis yra ypač atidžiai kontroliuojamas alkoholis, kadangi didelis šio junginio kiekis gali sukelti sunkų apsinuodijimą (Batista, Meirelles, 2011). Daugelyje alkoholinių gėrimų yra metanolio, tačiau jo kiekiai juose yra labai maži ir jie nekelia pavojaus sveikatai. Europos Sąjunga yra apribojusi metanolio kiekį alkoholiniuose gėrimuose, kuriuose yra nuo 1000 g/hl gryno etanolio ir sudaro apie 0,4 % tūrio metanolio. Metanolis yra labai toksiškas, todėl didelis jo kiekis gali sukelti mirtį. Jis yra nuodingas, labai stipriai veikia nervų sistemą. Mirtina metanolio dozė yra 30 ml. Apsinuodijimo metanoliu požymiai – skauda galvą, pykina, raižo ar skauda pilvą, netenkama regėjimo, apima bendras silpnumas (Lin, Shaw, 2009).

Propanolio poveikis žmogaus organizmui yra labai panašus į etanolio poveikį, tačiau iki 4 kartų stipresnis. Propanolis metabolizuojasi į propiono rūgštį. Propanolis yra labai toksiškas ir priskiriamas rizikos grupei priklausantiems chemikalams (Lide ir kt., 2006).

Izobutanolis gali sukelti ūmų apsinuodijimą, tačiau liekamųjų sveikatos sutrikdymų nėra nustatyta.

Izoamilo toksiškumas gali pasireikšti pastarajam patekus į organizmą per kvėpavimo takus ir odą.

1.8. Bioetanolis ir jo gamybos būdai

Neišvengiamai didėjantis naftos poreikis ir naftos išteklių mažėjimas visame pasaulyje skatina

susidomėjimą atsinaujinančiais angliavandenių ištekliais, iš kurių gaminamas etanolis, kaip

alternatyva kurui. Bio- kuras – tai degūs dujiniai, skystieji bei kietieji produktai, gaminami iš bio- masės ir naudojami energijai išgauti (John, Michael, 1999; Robert W. ir kt., 1999). Skystojo bio- kuro produktai yra vadinami tiesiog bio- degalais. Bio- degalai - tai kuras, naudojamas vidaus degimo varikliuose (Dien, B.S. ir kt., 2000). Bio- degalais gali būti vadinami: bio- dimetileteris, bio- dyzelinas, bio- etanolis, bio- dujos, bio- metanolis, bio- metiltretbutileteris, bio- vandenilis, grynas augalinės kilmės aliejus, sintetiniai bio- degalai (Michael E. ir kt., 2007; Mustafa Balat, 2011; De-gang L., 2005). Bio- etanoliui išgauti naudojamos žaliavos, kurių sudėtyje yra cukraus, krakmolo ar lignoceliuliozės (M. Forde, 2010). Dažniausiai bio- etanolio gamybai naudojama žaliava: javai, kukurūzų grūdai, cukriniai runkeliai, cukranendrės, bulvės. Svarbiausias bio- etanolio gamybai yra cukraus ir krakmolo kiekis biomasėje, tačiau, vis daugiau dėmesio skiriama bioetanolio gamybai iš augalinės žaliavos, kuri susideda iš celiuliozės (Charis, Alessandra, 2011;

Bonciu C. ir kt., 2010; Rojan P. ir kt., 2011).

Bioetanolio gamybą sudaro kelios pakopos:

 Žaliavos paruošimas ir apdorojimas;

 Fermentacija;

 Valymas ir koncentravimas;

 Koncentravimas.

Iš kiekvienos žaliavos etanolio gamybos technologija skiriasi ir ji priklauso tiek nuo bio- masės rūšies, tiek nuo savybių. Pradžioje žaliava turi būti valoma ir smulkinama. Vėliau, bio- masė hidrolizuojama bei fermentuojama. Proceso metu iš žaliavų, turinčių didelį kiekį cukrų, išskiriamas cukrus, o iš krakmolo arba celiuliozės gaunami monosacharidai, bakterijos ar fermentai iš jų metabolizuoja etanolį. Etanolį atskiriant distiliavimo būdu susidaro šalutinis produktas – žlaugtai.

Žlaugtai naudojami bio- dujų arba pašarų gamybai (Gustavo, 2009; Saddler, Mabee, 2010; Mariam, 2008).

Po distiliacijos gaunamas apie 96 % koncentracijos etanolis, tačiau, dėl didelės vandens

koncentracijos jis negali būti naudojamas degalams. Reikalinga dehidratacija (nuvandeninimas),

kurios dėka vandens koncentracija sumažinama iki 0,2 %. Nuvandeninimui naudojamos dvi

technologijos, tai membraninis arba azeotropinis atskyrimas. Dažniau naudojamos membraninės

atkyrimo technologijos, nes azeotropiniam etanolio atskyrimui sunaudojamas didelis energijos

kiekis (Mariam B., 2008; Gregg D., Saddler J. N., 1996).

1.9. Žlaugtų panaudojimas

Didžioji bio- etanolio gamybos dalis priklauso Brazilijai ir JAV. Brazilijoje bio- etanolis dažniausiai gaminamas iš cukranendrių, o JAV – iš kukurūzų grūdų. ES šalyse bio- etanoliui gaminti naudojamos grūdinės kultūros, cukranendrės, bulvės, kukurūzai. Grūdų fermentacijos į alkoholį metu vienas trečdalis juose esančių sausųjų medžiagų yra regeneruojamos į šalutinius produktus. Fermentacijos pabaigoje lieka du pagrindiniai produktai (distiliatai): nesusifermentavusi frakcija (stambesnės grūdų dalys) ir smulki skystoji frakcija, susidedanti iš labai smulkių grūdų dalelių, mielių ir tirpių mitybinių medžiagų. Dažniausiai nesusifermentavusi frakcija gamybos proceso pabaigoje sumaišoma su smulkia skystąja frakcija, ir šis produktas yra vadinamas žlaugtais su tirpiaisiais likučiais (Ming W. ir kt., 2007).

Žlaugtų sausosiose medžiagose lieka iki 10 proc. krakmolo (priklausomai nuo žaliavos rūšies, sausosiose medžiagose būna nuo 45-64 proc. krakmolo). Dėl to kitų mitybinių medžiagų kiekis žlaugtuose padidėja 2-3 kartus, palyginti su neapdorotais grūdais. Pavyzdžiui, jei kviečių grūdų 1 kg sausųjų medžiagų buvo 10 g žalių riebalų, tai kviečių grūdų žlaugtų 1 kg sausųjų medžiagų bus 30 g žalių riebalų. Žalių baltymų grūdų žlaugtuose būna 2-2,5 karto daugiau negu grūduose, iš kurių pagamintas alkoholis.

Etanoliui gaminti yra sunaudojamas tik bulvėse esantis krakmolas, o žlaugtuose lieka visi iki perdirbimo bulvėse buvę baltymai, riebalai, ląsteliena, mineralinės medžiagos, vitaminai ir kt. Šios medžiagos, kartu su nesusifermentavusiu krakmolu, sudaro vieną trečdalį sausųjų medžiagų, buvusių bulvėse. Nustatyta, kad 1 litrui (0,83 kg) bio- etanolio pagaminti reikia vidutiniškai 2,8 kg bulvių, arba iš 1 kg bulvių gaunama 0,33-0,37 litro alkoholio ir 0,25-0,28 kg angliarūgštės (CO

).

Pavyzdžiui, iš vienos tonos bulvių galima gauti iki 370 litrų etanolio ir 460 kg (70 proc. SM) žlaugtų arba 290 kg džiovintų žlaugtų (Tijmensena ir kt., 2002).

1.10. Žlaugtų maistinė vertė ir panaudojimas pašarų sektoriuje

Gaminant bio- etanolį iš bulvių, po jų fermentacijos ir distiliacijos proceso lieka maždaug 1/3 buvusių bulvėse sausųjų medžiagų. Iš vienos tonos perdirbtų bulvių lieka apie 300 kg žlaugtų, perskaičiavus į sausąsias medžiagas. Didžiausia problema yra ta, kad po distiliacijos proceso žlaugtuose yra tik apie 8-10 proc. sausųjų medžiagų. Todėl perdirbus į bio- etanolį 1 t bulvių gamykloje lieka apie 3-3,8 t šviežių drėgnų žlaugtų, turinčių 8-10 proc. sausųjų medžiagų.

Lietuvoje drėgni žlaugtai nusausinami iki 70-75 proc. drėgmės (25-30 proc. sausųjų medžiagų).

Užsienio šalyse žlaugtai dehidratuojami iki 40-50 proc. sausųjų medžiagų ir apie pusę jų -

išdžiovinami bei naudojami kombinuotiesiems pašarams gaminti, kaip baltyminis priedas (Joanne L. ir kt., 2001).

Apie 55-60 proc. žlaugtuose esančių baltymų yra neskaidomi galvijų didžiajame prieskrandyje (sojų rupinių baltymų – apie 35 proc.), t. y., įsisavinami plonosiose žarnose. Dėl to žlaugtų baltymai kur kas efektyviau panaudojami pieno ar mėsos produkcijai gauti negu grūdų ar kitų pašarų baltymai. Pagal jų kiekį bulvių žlaugtai beveik prilygsta rapsų rupiniams ir tik šiek tiek daugiau negu trečdaliu atsilieka nuo sojų rupinių, o pagal apykaitos energijos kiekį yra artimi visoms baltyminėms žaliavoms.

Pašarų baltymų vertę apibūdina juose esančių aminorūgščių sudėtis ir kiekis. Pagal aminorūgščių sudėtį grūdų žlaugtai nenusileidžia sojų, saulėgrąžų ar rapsų baltymams. Kviečių grūdų žlaugtuose, palyginti su kviečių grūdais, daugiau gyvulio organizmui būtinų aminorūgščių.

Bulvių žlaugtuose yra didelis energijos kiekis. Bulvių žlaugtai yra baltymingas ir daug energijos turintis pašaras ir pagal baltymų visavertiškumą (aminorūgščių sudėtį ir kiekį) prilygsta kitiems baltymingiems pašarams. Be to, bulvių žlaugtai yra bene pigiausias energijos ir baltymų šaltinis gyvuliams. Tačiau žlaugtų cheminė sudėtis ir kokybė labai priklauso nuo alkoholio gamybai naudojamų bulvių rūšies, jų cheminės sudėties, kokybės bei užterštumo nepageidaujamais mikroorganizmais, mikotoksinais ir kitomis nepageidaujamomis medžiagomis. Be to, jų vertę lemia etanolio gamybos technologija (Joanne Slavin, 2003).

Šeriant gyvulius bulvių žlaugtais, pagrindinę energijos dalį jie gauna su žlaugtuose esančiais baltymais, o didžiausia bulvių energijos dalis sukaupta krakmole. Baltymai, kaip energijos šaltinis, 65 proc. mažiau efektyvūs negu krakmolas. Gyvulių augintojai, įsigydami bulvių žlaugtus, turi įvertinti, kad juose yra daug baltymų. Jų perteklius racionuose didina pašarų energijos sąnaudas ir taip mažina pašarų panaudojimo produkcijai gauti efektyvumą.

Didžiausia bulvių žlaugtų panaudojimo gyvūnų mitybai problema yra ta, kad juos džiovinti gana brangu, o drėgni žlaugtai labai greitai genda. Esant šaltesniam orui, jie turi būti sušeriami per 7-9 dienas, o jei šilta – per 3-4 dienas. Laikant ilgesnį laiką, bulvių žlaugtuose pradeda augti pelėsiniai grybai ir kaupiasi mikotoksinai. Drėgni bulvių žlaugtai ilgesnį laiką gali būti saugomi anaerobinėmis sąlygomis, t. y., juos hermetizavus (T.J. DeVries ir kt., 2003).

Nedidelei ar vidutinio dydžio galvijų fermai praktiškai neįmanoma per 4-5 dienas sušerti

didesnį drėgnų bulvių žlaugtų kiekį. Vežti kas kelias dienas po nedidelį šviežių bulvių žlaugtų kiekį

ekonomiškai neapsimoka. Dėl to bulvių žlaugtus būtina konservuoti: silosuoti vienus arba

sumaišytus su kitais pašarais. Silosuojant bulvių žlaugtus, būtina laikytis tų pačių technologinių

reikalavimų kaip ir silosuojant žoles ar kitus žalius augalus. Svarbiausias reikalavimas – sudaryti

anaerobines sąlygas. Kuo greičiau švieži bulvių žlaugtai hermetizuojami ir užkonservuojami, tuo

geresnė jų kokybė. Kadangi šviežiuose bulvių žlaugtuose praktiškai nėra cukraus, tai rūgimo

procesas beveik nevyksta, tačiau anaerobinėmis sąlygomis jie gali būti saugomi ilgesnį laiką, nes šviežių bulvių žlaugtų pH yra apie 3,5–4. Ši bulvių žlaugtų savybė naudinga, pridedant jų į gaminamą žolių ar kukurūzų silosą, nes greičiau parūgštinama silosuojamos masės terpė ir pagerinama fermentacija.

Bulvių žlaugtus labiausiai tinka įmaišyti į kukurūzų silosą, nes jų žalioji masė yra cukringa ir

krakmolinga, o žlaugtai – baltymingi. Užsienyje bulvių žlaugtai konservuojami su cukrinių runkelių

griežiniais santykiu 50:50. Konservuojant bulvių žlaugtus, tinkamiausi priedai yra slopinančios arba

stabdančios mikroorganizmų veiklą medžiagos. Tai propiono, benzoinė, sorbinė rūgštys ir jų

druskos. Geriausia konservavimo priedus įterpti bio- etanolio gamybos įmonėje, o konservanto

pridėti, priklausomai nuo numatomo bulvių žlaugtų saugojimo laiko (D.H. Kleinschmit ir kt.,

2006).

2. DARBO METODIKA

2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas

Pirmame eksperimento etape buvo atlikta etilo alkoholio gamyba iš bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų, naudojant įvairius biokatalizatorius ir nustatyta jo sauga aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių aspektu (2.1 pav.).

Bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų fermentacija buvo vykdyta Saccharomyces cerevisiae mielėmis, naudojant įvairius biokatalizatorius bei be jų. Vykdant eksperimentą nustatytas gauto raugalo pH, sausųjų medžiagų kiekis, bendras titruojamasis rūgštingumas (BTR), etanolio išeiga tūrio procentais ir susidaręs aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekis.

Pagrindiniai tyrimų etapai pateikti 2.1 paveiksle.

Etilo alkoholio gamyba iš bulvių perdirbimo šalutinių produktų

naudojant biokatalizatorius ir Saccharomyces cerevisiae mieles

Etilo alkoholio gamyba iš bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų nenaudojant biokatalizatorių

Raugalo pH įvertinimas

Sausųjų medžiagų kiekis (SM)

Bendras titruojamasis rūgštingumas (BTR)

Mėginių paruošimas chromatografinei analizei

Etilo alkoholio koncentracijos mėginiuose nustatymas (tūrio proc.)

Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekio įvertinimas dujų

chromatografijos metodu

Skirtingas gamybos schemas taikant paruoštų etilo alkoholio mėginių aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio

junginių palyginamasis įvertinimas

2.1 pav. I eksperimento dalies schema

Antrame eksperimento etape buvo analizuojama bio- konservavimo pieno rūgšties bakterijomis įtaka žlaugtų saugos rodikliams (mikrobiologiniams rodikliams ir biogeninių aminų kiekiui). Taip pat nustatytas pieno rūgšties bakterijų kolonijas sudarančių vienetų skaičius grame produkto (PRB KSV/g) (2.2 pav.).

Žlaugtai

Fermentacija PRB (P.pentosaceus, P.acidilactici, L.sakei)

Analizė

Biogeninių aminų kiekis,

mg/kg

Mielių, grybų, enterobakterijų

KSV/g

PRB KSV/g

2.2 pav. II eksperimento dalies schema

2.2. Tyrimų objektai ir metodai

2.2.1. Eksperimentui naudotos žaliavos

Etilo alkoholio gamybai iš augalinės žaliavos naudotų mielių ir fermentų aprašymai pateikti 2.1 lentelėje.

2.1 lentelė. Eksperimente naudotos mielės ir biokatalizatoriai bei jų aprašymas

Pavadinimas Aprašymas

Mielės Saccharomyces

cerevisiae

Mielės įsigytos iš vietinio prekybos centro Biokatalizatoriai

Optimalus veikimo

pH

Rekomenduojama norma 100 g

žaliavos

Aktyvumo vienetai (AV)

Depol

680P 4,5-5,5 0,4-0,5 g/100 g Ksilanolitinis 750; α- amilazinis 115;

amilogliukozidazinis 225 AV/ml ar g

Depol

692 4-6 0,5 ml/100 g Celiulazinis 800; pektinazinis 535 V/ml ar g

Stargen 5-6 0,25 ml/100 g Amilazinis 225

Ecopulp ® TX-200-A 4,5-8,5 0,4-0,1mg Ksilanolitinis 10700 Av/ml ar

g

Atlikus etilo alkoholio gamybą iš augalinės žaliavos naudojant mieles ir fermentus atitinkamai buvo gauti mėginiai B

, B

, B

, B

, B

(iš bulvių) ir L

, L

, L

, L

, L

(iš bulvių perdirbimo šalutinių produktų). B

ir L

mėginiai, kurių fermentacijai naudotos tik mielės, be fermentų, kontroliniai.

Etilo alkoholio gamybai laboratoriniu būdu naudoti fermentų kiekiai 100 g žaliavos sucukrinti pateikti 2.2 lentelėje.

2.2 lentelė. Eksperimente naudoti mielių ir biokatalizatorių kiekiai

Pavadinimas Aprašymas

Mielių kiekis / 100 g žaliavos fermentacijai

Kluyveromyces marxianus 5 ml

Biokatalizatorių kiekis / 100 g žaliavos fermentacijai

Depol

680P 0,45 mg

Depol

692L 0,5 ml

Stargen 0,25 ml

Ecopulp Tx 200 - A 0,2 mg

2.2.2. Bulvių ir jų perdirbimo šalutinių produktų paruošimas etilo alkoholio gamybai

Bulvės ir jų perdirbimo šalutiniai produktai buvo susmulkinti naudojant buitinę trintuvę.

Smulkinimui naudoti augaliniai produktai buvo nuplauti ir naudoti smulkinimui su žievele.

Gamybos šalutiniai produktai (žievelės) taip pat buvo susmulkintos iki tyrės konsistencijos masės ir panaudotos etanolio gamybai.

2.2.3. Etilo alkoholio gamyba laboratoriniu būdu

Bulvių ir bulvių žievelių masės pH nustatytas 6,35, todėl papildomo apdorojimo prieš vykdant sucukrinimą biokatalizatoriais nereikėjo (rūgštinimo arba šarminimo), nes pH atitiko fermentų veikimo optimalų pH.

Fermentavimui paimta 100 g smulkintos žaliavos, įpilta 200 ml distiliuoto vandens, įdėta atitinkamų fermentų ir laikyta 60 minučių 60 °C temperatūroje termostate, kad masė susicukrintų.

Po to, ataušinta iki 30°C temperatūros ir įdėta mielių bei palikta fermentuoti 48 val. 30 °C temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis.

Po 48 valandų fermentacijos masė buvo nukošta pro marlės filtrą, gautas filtratas

distiliuojamas. Distiliatui gauti buvo paimta 100 ml raugalo ir distiliuota iki 50 ml distiliato.

Gautas distiliatas buvo praskiestas iki 100 ml distiliuotu vandeniu ir panaudotas tolimesniems tyrimams. Gauti žlaugtai buvo apdoroti pieno rūgšties bakterijomis (aprašyta sekančiuose skyreliuose).

2.2.3.1. Raugalo pH, sausųjų medžiagų kiekio ir bendro titruojamojo rūgštingumo nustatymas

Raugalo pH buvo išmatuotas pH – metru „Sartorius Professional Meter PP – 15“. pH – metro elektrodo darbiniai parametrai nurodyti gamintojo: pH nuo 0 iki 14; galima tiriamųjų mėginių temperatūra nuo -5 °C iki 100 °C; elektrodas laikomas 3 mol/l KCl tirpale.

Tirpių sausųjų medžiagų kiekis raugale nustatytas standartiniu tarptautinėje praktikoje taikomu refraktometriniu metodu (AACC-68-62, 1999). Gautas tirpių sausųjų medžiagų kiekis išreikštas % tiriamojo raugalo.

Bendras titruojamasis rūgštingumas (BTR) nustatytas titruojant natrio šarmo tirpalu, naudojant indikatorių fenoftaleiną, neutralizuojant laisvąsias rūgštis, rūgščiąsias druskas, riebalų laisvąsias rūgštis, baltymų laisvąsias grupes bei ištirpusį anglies dioksidą (CO

). BTR išreikštas 1 moldm

koncentracijos natrio šarmo tirpalo kiekiu, sunaudotu 100 g mėginio esančiai rūgščiai neutralizuoti, tūris cm

. Rūgštingumo laipsnis, tai 1 dm

koncentracijos natrio šarmo tirpalo, sunaudoto mėginyje esančiai rūgščiai neutralizuoti kiekis, išreiškiamas Neimano laipsniais (°N).

2.2.4. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių nustatymas dujų chromatografijos metodu

Kiekybinė ir kokybinė aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių analizė tirtuose mėginiuose buvo atlikta dujų chromatografijos metodu. Naudota kolonėlė Zebron ZB – WAX; 30m x 0,25 x 0,25 µm; 100 % polietilenglikolio; Phenomenex. Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių koncentracijos (mg/ml) mėginiuose buvo apskaičiuotos pagal gautų pikų plotus, lyginant juos su standartiniu, žinomos koncentracijos aukštesniųjų alkoholių tirpalu (3.3 lentelė).

Taikyta programa, pagal kurią nuo 60 °C kolonėlės temperatūra iki 120 °C pakelta per 10 minučių, keliant po 4 °C per minutę. Standartinio tirpalo chromatograma pateikta 2.3 paveiksle.

2.3 lentelė. Aukštesniųjų alkoholių koncentracijos standartiniame tirpale Stan-

dartas, mg/l

Acetal- dehidas

Metil- acetatas

Etil- ace- tatas

Meta- nolis

Propa- nolis

Izobuta- nolis

Izoamilo- alkoholis

62,8 18,64 180,4 79,1 32,16 161,6 330

2.3 pav. Standartinio tirpalo chromatograma

2.2.5. Etilo alkoholio koncentracijos (tūrio %) nustatymas mėginiuose

Etilo alkoholio koncentracija (tūrio %) mėginiuose buvo nustatyta naudojant areometrų rinkinį, kai mėginio temperatūra 20 °C. Etilo alkoholio koncentracija (tūrio %) mėginiuose įvertinta pagal žinynuose pateiktas lenteles.

2.2.6. Žlaugtų fermentacija bakteriocinus produkuojančiomis pieno rūgšties bakterijomis

Pieno rūgšties bakterijos (PRB), kurios gamina bakteriocinus, buvo gautos iš Kauno technologijos universiteto, Maisto mokslo ir technologijos katedros. Iki eksperimento PRB buvo laikytos -80°C temperatūroje (PRO-LAB Diagnostics, Jungtinė Karalystė). Atšildytos PRB pagausintos MRS sultinyje (CM 0359, Oxoid Ltd, Hampshire, Jungtinė Karalystė) 30 +/- 3°C temperatūroje 48 valandas išlaikant termostate. Prieš naudojimą į terpę buvo pridėta 40 mM fruktozės ir 20 mM maltozės. Pagausintos MRS sultinyje PRB prieš eksperimentą buvo praskiestos fiziologiniu tirpalu iki 10

KSV/ml koncentracijos ir panaudotos žlaugtų fermentacijai.

Fermentacija atlikta naudojant grynas PRB kultūras (2 proc. nuo žlaugtų tūrio; v/v) 30 +/- 3°C

temperatūroje 24 val. termostate (Binder, Vokietija).