LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
AURELIJA NIKAITĖ
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA VIENAMEČIŲ PAPRIKŲ (CAPSICUM ANNUUM L.) VAISIŲ EKSTRAKTO, CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. dr. Augusta Ževžikovienė
KAUNAS, 2019
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA VIENAMEČIŲ PAPRIKŲ (CAPSICUM ANNUUM L.) VAISIŲ EKSTRAKTO, CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) METODĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Augusta Ževžikovienė Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Aurelija Nikaitė
Data Data
KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Cheminė vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių sudėtis ... 10
1.1.1. Cheminės sudėties skirtumai tarp C. annuum genotipų ... 10
1.2. Kapsaicinoidų sintezė ir fizikocheminės savybės ... 11
1.3.Biologiškai aktyvių junginių, esančių vienamečių paprikų vaisiuose, farmakologinės savybės ir terapinis pritaikymas ... 13
1.3.1. Kapsaicino poveikis gliukozės kiekiui kraujyje ... 14
1.3.2. Kapsaicino poveikis metabolizmui ... 15
1.3.3. Kitos biologiškai aktyvių paprikų vaisių junginių farmakologinės savybės ... 15
1.4. Veiksniai, ribojantys kapsaicinoidų pritaikymą medicinoje ... 16
1.5. Biologiškai aktyvių junginių, esančių paprikų vaisiuose, ekstrakcija ... 17
1.6. Biologiškai aktyvių junginių, esančių paprikų vaisiuose, analizės metodai... 18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.1.1. Maisto papildų, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų vaisių ekstrakto, sudėtis ... 20
2.2. Kapsaicinoidų nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 21
2.2.1. Naudota įranga ... 21
2.2.2. Medžiagos ir reagentai ... 22
2.2.3. Tyrimo sąlygos ... 22
2.2.4. Etaloninių tirpalų paruošimas ... 22
2.2.5. Tiriamųjų tirpalų paruošimas ... 23
2.3. Statistinė duomenų analizė ... 24
3. REZULTATAI IR APTARIMAS ... 25
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodikos validacija ... 25
3.1.1. Metodo specifiškumas ... 25
3.1.2. Metodo tiesiškumas ... 27
3.1.3. Metodo preciziškumas (glaudumas) ... 27
3.1.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 29
3.2. Kokybinis tiriamųjų sudėties įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 30
3.2.1. Kokybinis maisto papildų įvertinimas ... 30
3.2.2. Kokybinis paprikų miltelių įvertinimas ... 31
3.3. Kiekybinis tiriamųjų sudėties įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 32
3.3.1. Maisto papildų kapsaicinoidų sudėties kiekybinis įvertinimas ... 32
3.3.2. Paprikų miltelių kapsaicinoidų sudėties kiekybinis įvertinimas ... 33
4. IŠVADOS ... 37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
A. Nikaitės magistro baigiamasis darbas „Maisto papildų, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių ekstrakto, cheminės sudėties tyrimas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą“. Mokslinė vadovė doc. dr. A. Ževžikovienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2019.
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę ir kiekybinę analizę biologiškai aktyvių junginių, esančių maisto papilduose, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių ekstrakto, taikant efektyviąją skysčių chromatografiją.
Darbo uždaviniai: Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių biologiškai aktyvių junginių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui maisto papilduose; validuoti pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką; atlikti kiekybinę biologiškai aktyvių junginių analizę pasirinktuose maisto papilduose ir paprikų milteliuose; palyginti eksperimentiškai nustatytą ir deklaruotą ant pakuotės biologiškai aktyvių junginių kiekį maisto papilduose su paprikų prieskonių sudėtimi.
Tyrimo metodas: Pasirinktų maisto papildų ir prieskonių biologiškai aktyvūs junginiai buvo kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. Eliuentų sistema: A – trifluoracto rūgštis 0,1%, B – acetonitrilas. Kolonėlės temperatūra 25 °C, eliuento tėkmės greitis 1 ml/min, kapsaicinoidų detekcija vykdyta prie 280 nm UV šviesos bangos ilgio.
Rezultatai ir išvados: Tik viename iš pasirinktų maisto papildų identifikuotas kapsaicinas, tačiau nustatyta koncentracija neviršijo aptikimo ir nustatymo ribos, todėl nepavyko kapsaicino nustatyti kiekybiškai ir įvertinti pakuotės ženklinimo teisingumo, nes maisto papildo gamintojas nenurodo biologiškai aktyvių junginių kiekio. Kituose maisto papilduose kapsaicinoidai nenustatyti net kokybiškai.
Pasirinktuose prieskoniuose bendras kapsaicinoidų kiekis svyravo nuo 0,367 iki 4,275 mg/g, pastebėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp kapsaicino ir dihidrokapsaicino kiekio Kinijos ir Ispanijos kilmės prieskoniuose.
SUMMARY
The Master Thesis High Performance Liquid chromatography method for evaluating chemical composition of food supplements containing extract of Capsicum annuum L. fruits by Aurelija Nikaitė.
Scientific supervisor – Assoc. Prof. A. Ževžikovienė. Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2019.
Aim: To perform the qualitative and quantitative analysis of active compounds in food supplements, containing extract of Capsicum annuum L. fruits, using high performance liquid chromatography method.
Objectives: To optimize high performance liquid chromatography (HPLC) method for qualitative and quantitative analysis of active compounds in food supplements, containing extract of Capsicum annuum L. fruits; to perform validation of selected HPLC method; to perform quantitative analysis of active compounds in selected food supplements and paprika spices; to compare declared and actual composition of selected food supplements and paprika spices.
Method: Active compounds in selected food supplements and spices were evaluated qualitatively and quantitatively using high performance liquid chromatography. The system of two solvents was used:
A - trifluoroacetic acid 0,1 %, B – acetonitrile. The column was thermostated at 25 °C, injection volume was 10 μl, solvent flow rate 1 ml/min, detection of analytes was performed at 280 nm wavelength.
Results and discussion: Capsaicin was identified in only one of the selected food supplements.
The concentration of active compound was not labeled, so it was impossible evaluating whether the labeled information was correct. Capsaicinoids were absent in all of the rest food supplements. The selected spices showed a concentration of 0,367 – 4,275 μg/g of total capsaicinoids, while the differences between capsaicinoid content in spices from China and Spain were significant.
SANTRUMPOS
AMP – adenozinmonofosfatas C – kapsaicinas
DHC – dihidrokapsaicinas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija ETR – tioesterio reduktazė
h-C – homokapsaicinas
h-DHC – homodihidrokapsaicinas LoD – aptikimo riba
LoQ – nustatymo riba
n-DHC – nordihidrokapsaicinas PVDF – polivinilidenfluoridas
SSN – santykinis standartinis nuokrypis TRPV1 – 1 tipo vaniloidiniai receptoriai
ĮVADAS
Vienametė paprika (Capsicum annuum L.) – bulvinių (Solanaceae) šeimos vienametis augalas, plačiai vartojamas kaip prieskonis, šnekamojoje kalboje vadinamas čili pipirais. Pagal morfologinius požymius išskirti penki pagrindiniai C. annuum porūšiai, tačiau skirtingose šalyse kultivuojamos įvairios veislės, todėl tikslus rūšiai priklausančių veislių kiekis nežinomas [72]. C. annuum porūšiai skiriasi forma, dydžiu, spalva bei aitrumu [49]. Aitrumą paprikoms suteikia kapsaicinoidai – kurių didžiausią dalį sudaro kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas [2;17]. Vienamečių paprikų vaisiuose taip pat gausu mineralų ir vitaminų, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu [39].
Kapsaicinoidų savybė veikti skausmo receptorius ir sukelti laikiną jų nejautrą yra naudojama terapiniais tikslais – farmacijos rinkoje yra pusiau kietų preparatų, kurių sudėtyje yra standartizuoto C.
annuum ekstrakto arba sintetiniu būdu pagamintų kapsaicinoidų, šie preparatai naudojami neuralginiam skausmui malšinti [11]. Nepaisant patvirtinto farmakologinio poveikio, gausu tyrimų, analizuojančių kitas kapsaicino ir kitų paprikų vaisių komponentų pritaikymo klinikinėje praktikoje galimybes [15]. Nors vienkomponenčių peroralinių preparatų su vienamečių paprikų ekstraktu nėra, C. annuum ekstraktas aptinkamas maisto papildų, dažniausiai skirtų lieknėjimui, sudėtyje. Kapsaicino vaidmuo reguliuojant svorį yra tiriamas ir nors randama įrodymų, jog ši medžiaga gali turėti įtakos gliukozės ir riebalų metabolizmui, rezultatai nėra vienareikšmiai [7;17].
Darbo aktualumas. Pasaulio Sveikatos Organizacijos duomenimis, nutukimas nuo 1975 m.
beveik patrigubėjo, antsvoris tampa problema ir vaikų populiacijoje [74], todėl svarbu užtikrinti ne tik efektyvų problemos sprendimą, bet ir atrasti naudingus prevencijos būdus. Kokybiški maisto papildai, turintys pakankamą kiekį biologiškai aktyvių junginių ir subalansuotas maisto racionas galėtų prisidėti prie tarptautinės problemos mažinimo [74]. Kadangi vienamečių paprikų vaisių ekstraktas yra lieknėjantiems skirtų maisto papildų sudedamoji dalis, tikslinga nustatyti papilduose esančius biologiškai aktyvius junginius ir jų kiekį, tokio pobūdžio tyrimas Lietuvoje atliekamas pirmą kartą. Taip pat aktualu įvertinti, ar paprikų prieskonių, kurie gali būti įtraukiami į mitybos racioną, gamybos ir sandėliavimo metu nesuardomi biologiškai aktyvūs junginiai.
Šiuo darbu siekiama nustatyti cheminę sudėtį Lietuvoje notifikuotų lieknėjantiems skirtų maisto papildų, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų vaisių ekstrakto, bei įvertinti maisto papildų pakeičiamumo paprikų prieskoniais ypatybes.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę ir kiekybinę biologiškai aktyvių junginių, esančių maisto papilduose, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių ekstrakto, ir paprikų prieskonių analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių biologiškai aktyvių junginių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui maisto papilduose ir paprikų prieskoniuose.
2. Validuoti pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.
3. Atlikti kiekybinę biologiškai aktyvių junginių analizę pasirinktuose maisto papilduose ir skirtingų veislių paprikų prieskoniuose.
4. Palyginti eksperimentiškai nustatytą ir deklaruotą ant pakuotės biologiškai aktyvių junginių kiekį maisto papilduose su paprikų prieskonių sudėtimi.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Cheminė vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių sudėtis
Vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisiuose yra B grupės vitaminų, taip pat vitaminų C, E, A , mineralų, riebalų rūgščių, karotenoidų, polifenolinių junginių [41], flavonoidų. Pagrindiniai paprikų vaisiuose esantys karotenoidai yra β-karotenas, kapsantinas, violaksantinas, zeaksantinas [2]. Išanalizavus C. annuum ekstraktus, kurių gamybai naudotas heksanas ir acetonas, buvo aptikti 46 organiniai junginiai, iš kurių nustatyti 9 alkaloidai. Didžiausią dalį sudaro kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas – tai atitinka 60-70
% visų nustatytų alkaloidų [3]. Kitų autorių teigimu, kapsaicino ir dihidrokapsaicino kiekis gali sudaryti 80-90 % visų alkaloidų [2;67].
Gnayfeed et al (2001) nustatė, jog nuo brendimo fazės priklauso C. annuum vaisių cheminė sudėtis. Didžiausias β-karoteno kiekis yra prinokusiuose ir pernokusiuose vaisiuose, liuteino – mažiau prinokusiuose vaisiuose ir tarpinėse brendimo stadijose, vitamino C ir α-tokoferolio kiekiai didžiausi spalvos keitimo stadijoje, po to ženkliai sumažėja [18]. Kapsaicinoidų koncentracija įvairiose brendimo stadijose skiriasi tarp porūšių, tačiau visuose kapsaicino ir dihidrokapsaicino santykis išlieka didesnis nei vienas.
Conforti et el (2007) tyrimas patvirtina brendimo fazės įtaką antrinių metabolitų kiekiui – subrendusių paprikų vaisių ekstrakte aptinkamas didžiausias kiekis vitamino E, miristino rūgšties, palmitino rūgšties metilo esterio, linoleno rūgšties metilo esterio, tuo tarpu žaliose paprikose lyginant su kitomis brendimo stadijomis nustatyta daugiau fitolio [12]. Chloroforminiuose ekstraktuose didžiausas kapsaicino ir dihidrokapsaicino kiekis, atitinkamai 40,8 % ir 35,0 %, yra subrendusiose paprikose, mažai subrendusiose žaliose paprikose šių junginių aptinkami nedideli kiekiai, o nesubrendusiuose – neaptinkama [12].
1.1.1. Cheminės sudėties skirtumai tarp C. annuum genotipų
Taksonomiškai išskiriami penki C. annuum porūšiai, besiskiriantys morfologinėmis savybėmis [72]. Vienametė paprika plačiai kultivuojama pasaulio šalyse, šnekamojoje kalboje minimi įvairūs paprikų pavadinimai (Chalapos paprikos, Kajeno pipirai, aštrioji paprika), trūksta vientisos taksonominės klasifikacijos, susisteminančios C. annuum rūšį. Visgi, C. annuum porūšiai skiriasi ne tik morfologiškai, bet ir kapsaicinoidų koncentracija – skirtingų aitriųjų paprikų veislių bendras kapsaicinoidų kiekis
varijuoja nuo 2,3 iki 9,4 mg/g išdžiovintų paprikų vaisių [9]. Kapsaicino kiekiui paprikose apibūdinti naudojama Skovilio skalė – joje žemiausiai aptinkama saldžioji paprika, didesniu aitrumu pasižymi Chalapos paprikos, Kajeno pipirai, Serano pipirai.
Vienametės paprikos kapsaicinoidų turi mažiau nei Capsicum chinense L. ir Capsicum frutescens L. Skovilio skalėje C. annuum aitrumas varijuoja nuo 0 iki 300000 (1 pav.) ir laikomos mažai aitriomis [53]. Saldžiojoje paprikoje kapsaicinoidų nenustatoma [19].
1 pav. Skirtingų Capsicum genties rūšių aitrumas Skovilio skalės vienetais [53]
Sarpras et al
1.2. Kapsaicinoidų sintezė ir fizikocheminės savybės
Kapsaicinoidai – protoalkaloidai – yra antriniai metabolitai, natūraliai aptinkami įvairiose paprikų rūšyse ir lemiantys aštrias jų organoleptines savybes. Kapsaicinoidai susidaro vykstant vanililamino kondensacijai su įvairaus anglies atomų ilgio riebalų rūgštimis [15]. Šis procesas vyksta paprikų vaisių placentoje dalyvaujant fermentui kapsaicino sintetazei. Nedidelė koncentracija kapsaicinoidų nustatoma ir paprikų vaisių apyvaisyje bei sėklose [33]. Augalą kultivuojant sausros sąlygomis, kapsaicino sintetazės, ypač mažesnio aitrumo paprikose, aktyvumas didėja, todėl tokių paprikų vaisiuose sukaupiama daugiau kapsaicinoidų [15;46].
Pagrindiniai kapsaicinoidai, aptinkami paprikose, yra kapsaicinas (C) ir dihidrokapsaicinas (DHC), mažesniais kiekiais randama nordihidrokapsaicino (n-DHC), homodihidrokapsaicino (h-DHC),
homokapsaicino (h-C), iš viso žinoma daugiau nei 20 kapsaicinoidų analogų [14]. Struktūriškai kapsaicinoidai skiriasi šoninės grandinės anglies atomų ilgiu, kuris varijuoja nuo 9 iki 11 atomų, bei nesočiųjų ryšių skaičiumi ir padėtimi anglies atomų grandinėje. Nustatyta, kad didesniu biologiniu aktyvumu pasižymi junginiai, turintys 8 arba 9 anglies atomų ilgio grandinę [4].
Kapsaicinas (trans-8-metil-N-vanilil-6-nonenamidas, 2 pav.) praktiškai netirpus šaltame vandenyje, gerai tirpus organiniuose tirpikliuose – benzene, etanolyje, eteryje, riebaluose. Paprikų vaisiuose randama apie 0,1-1 % kapsaicino. Nors kapsaicinui būdinga izomerija, natūraliai dėl stabilesnės struktūros egzistuoja tik trans–kapsaicino izomeras [15].
2 pav. Kapsaicino cheminė struktūra
Dihidrokapsaicinas (8-metil-N-vanililnonanamidas, 3 pav.) – antrasis pagrindinis paprikų biologiškai aktyvus junginys, nuo kapsaicino besiskiriantis tik acilo grupės prisotinimu. Jis sintetinamas redukcijos būdu iš kapsaicino, dalyvaujant fermentui ETR (2-noltioesterio reduktazei) [20]. Šiam junginiui, kaip ir kapsaicinui būdingas aštrus skonis, menkas tirpumas vandenyje ir geras tirpumas etanolyje.
3 pav. Dihidrokapsaicino cheminė struktūra
Kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas gali būti išgryninti iš paprikų vaisių, tačiau dėl varijuojančio šių biologiškai aktyvių junginių kiekio skirtingose C. annuum porūšiuose, imta kurti in vitro kapsaicinoidų sintezės schemas. 2009 m. aprašyta kapsaicino analogų sintezė iš vanililamino ir acilchlorido [57].
Nonivamidas – pelargoninės rūgšties vanililamidas (4 pav.), pirmą kartą susintetintas 1919 m.
Nedidelis nonivamido kiekis aptinkamas ir C. annuum vaisiuose [13], tačiau šis junginys dažniausiai sintetinamas pramoniniu būdu. Dėl mažesnio nei kapsaicino ar dihidrokapsaicino aitrumo nonivamidas naudojamas farmaciniuose preparatuose [5].
4 pav. Nonivamido cheminė struktūra
Kapsinoidai – neaitrūs kapsaicinoidų analogai, natūraliai randami saldžiosiose paprikose.
Kapsiatas ir dihidrokapsiatas saldžiųjų paprikų vaisiuose pirmą kartą nustatyti 1998 m. [32]. Šių junginių ir kapsaicinoidų struktūrinis skirtumas – vietoje amidinės jungties kapsinoidai turi esterinę grupę.
Kapsiatas gali būti susintetinamas laboratorijos sąlygomis iš kapsaicino, katalizuojant fermentui lipazei (5 pav.) [27]. Kapsinoidų sintezės schemų kūrimas didina paprikų biologiškai aktyvių junginių pritaikomumo klinikinėje praktikoje galimybes, nes neaitrūs analogai turi priimtinesnes organoleptines savybes.
5 pav. Kapsiato sintezės schema [27]
Ishiharaet al
1.3. Biologiškai aktyvių junginių, esančių vienamečių paprikų vaisiuose, farmakologinės savybės ir terapinis pritaikymas
Kapsaicinas klinikinėje praktikoje yra naudojamas periferiniam neuralginiam skausmui malšinti ir yra sudedamoji dalis pusiau kietų preparatų, skirtų vartoti ant odos [17]. Kapsaicino analgetinis veikimas
siejamas su selektyviu agonistiniu poveikiu 1 tipo vaniloidiniams (TRPV1) receptoriams, kurie priklauso nociceptoriams. Kapsaicinui stimuliuojant TRPV1 receptorius, sukeliama jų desensitizacija, todėl receptoriai tampa nejautrūs įprastiems dirgikliams [11].
Lietuvos rinkoje yra du vaistiniai preparatai – tepalai, į kurių sudėtį įeina sintetinis kapsaicino analogas nonivamidas, taip pat pasižymintis agonistiniu poveikiu TRPV1 receptoriams [5]. Europos Sąjungos rinkoje yra tepalų ir transderminių pleistrų, kurių sudėtyje yra išgryninto ir standartizuoto paprikų vaisių ekstrakto. Paprikų vaisių ekstraktas, įeinantis į puskietes farmacines formas, turi 2,0 – 2,078 % kapsaicinoidų.
Nepaisant patvirtintų terapinių indikacijų, vienamečių paprikų vaisių ekstraktas taip pat įeina į įvairių maisto papildų, dažniausiai skirtų lieknėjimui, sudėtį. Tolesniame literatūros apžvalgos skirsnyje siekiama apžvelgti tyrimus, susijusius su kapsaicino ir kitų biologiškai aktyvių vienamečių paprikų vaisių junginių poveikiu organizmo sistemoms.
1.3.1. Kapsaicino poveikis gliukozės kiekiui kraujyje
Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta, kad kapsaicinui būdingas gliukozės kiekį kraujyje mažinantis poveikis [56;69]. Potencialus kapsaicino poveikio mechanizmas yra insulino sekrecijos didinimas [56], taip pat in vitro tyrimo metu nustatyta, kad kapsaicinas, aktyvindamas adenozinmonofosfato (AMP) – aktyvintą proteinkinazę, didina gliukozės pasisavinimą raumenų ląstelėse [30].
Nėščioms moterims, sergančioms gestaciniu diabetu, kapsaicino (5 mg/d) suvartojimas reikšmingai sumažino gliukozės koncentraciją kraujyje [65]. 2009 m. Tailande atlikto tyrimo metu siekta įvertinti gliukozės kiekio pokytį sveikų vyriškosios lyties savanorių kraujyje suvartojus 5 g šviežių paprikų, turinčių apie 26,6 mg kapsaicino. Gauti rezultatai rodo, kad gliukozės kiekis buvo reikšmingai mažesnis, o insulino kiekis reikšmingai didesnis paprikas vartojusių vyrų kraujyje lyginant su placebo grupe [7]. Kadangi tyrimo imtis yra nedidelė (12 dalyvių), šio tyrimo rezulatai mažai reprezentatyvūs, tačiau rodo kryptį tolesniems su kapsaicinoidais susijusiems tyrimams.
Kinijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad aitriąsias paprikas vartojusios populiacijos rezistentiškumas insulinui yra reikšmingai mažesnis, lyginant su tais, kurie paprikų į savo maisto racioną neįtraukia, tačiau šis poveikis labiau priklauso nuo suvartojamų paprikų rūšies nei kiekio [35]. Tai rodo, jog reguliariai vartojamos aitriosios paprikų rūšys gali padėti išvengti diabetinių būklių.
Farmakologines paprikų biologiškai aktyvių junginių savybes tiriantys mokslininkai renkasi įvairias metodikas, taip pat tyrėjai individualiai pasirenka kapsaicino dozę ar paprikų veislę. Su šviežių paprikų ar paprikų prieskonių įtraukimu į maisto racioną susiję tyrimai nerodo tikslios poveikio priklausomybės nuo kapsaicino kiekio, nes esant nevienodoms kultivavimo sąlygoms tokios pačios veislės paprikose gali būti sukaupiamas skirtingas biologiškai aktyvių junginių kiekis.
1.3.2. Kapsaicino poveikis metabolizmui
Siekiant įvertinti kapsaicinoidų terapinį pritaikymą kontroliuojant svorį, buvo atlikta klinikinių tyrimų analizė [59] – yra įrodymų, kad kapsaicinoidai didina energijos sunaudojimą, termogenezę, skatina lipidų oksidaciją ir mažina apetitą. Dar viena tyrimų su žmonėmis metanalizė taip pat rodo, kad kapsaicinas ir kapsiatai skatina energijos eikvojimą ir riebalų oksidaciją [73]. Tiriamiesiems, suvartojusiems po 1,03 g raudonųjų aitriųjų paprikų, turinčių 2,56 mg kapsaicino, reikšmingai padidėjo sotumo jausmas, lyginant su placebo grupe [28]. In vitro tyrimas patvirtina energijos metabolizmo paspartėjimą, paveikus žmogaus žarnyno epitelines ląsteles kapsaicinu [21].
Atliktas tyrimas su neaitriais kapsaicino analogais parodė, kad jie taip pat teigiamai veikia energijos suvartojimą, skatindami termogenezę [64]. Kitas tyrimas parodė, kad kapsinoidai didina riebalus metabolizuojančių fermentų kiekį kepenyse, todėl reikšmingai didina lipidų metabolizmą ir mažina riebalų susikaupimą adipocituose [24]. Metabolizmą skatinantis poveikis taip pat galimai susijęs su agonistiniu poveikiu TRPV1 receptoriams, nes jų aptinkama ir metaboliškai aktyviuose organuose [44], manoma, jog šis efektas gali būti susijęs ir su simpatinės nervų sistemos aktyvumo didinimu [15].
Nors trūksta klinikinių tyrimų su žmonėmis patvirtinti teigiamam kapsaicino poveikiui svorio kontrolei, esamų tyrimų duomenys galimai paskatino vienamečių paprikų ekstraktą naudoti maisto papilduose, skirtuose lieknėjimui.
1.3.3. Kitos biologiškai aktyvių paprikų vaisių junginių farmakologinės savybės
Paprikų ekstraktas ir kapsaicinas teigiamai veikia endotelio funkciją [10] ir mažina oksidacinę pažaidą [62]. Kapsaicinas taip pat skatina druskos pasišalinimą su šlapimu, todėl sumažėja sūraus maisto raciono sukeltos hipertenzijos rizika [22;36]. Šios savybės rodo galimą paprikų ekstrakto pritaikymą kardiovaskulinių ligų prevencijai. Kapsaicinas taip pat pasižymi gastroprotekciniu poveikiu – nustatyta,
kad kartu su indometacinu ar etanoliu vartojant nedideles dozes kapsaicino, sumažėja bazinė skrandžio rūgšties sekrecija ir mikrokraujavimų rizika [43].
Nors pagrindinis vienamečių paprikų biologiškai aktyvus junginys yra kapsaicinas, yra tyrimų, aprašančių ir dihidrokapsaicino poveikį. In vivo tyrimas su žiurkėmis rodo, kad dihidrokapsaicinas mažina uždegimą ir oksidacinę pažaidą smegenyse, taigi jam būdingas neuroprotekcinis poveikis [29].
Kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas skatina žmogaus gliomos ląstelių apoptozę [61]. Taip pat stebimas kapsaicino apoptozinis aktyvumas in vitro osteosarkomos [70], prostatos [48] ir kasos [47] vėžinėms ląstelėms. Vienamečių paprikų vaisių ekstraktui ir sintetiniams kapsaicinoidams būdingas in vitro antibakterinis aktyvumas prieš Streptococcus mutans [52], Helicobacter pylori [34;63].
Paprikų vaisiuose esantys karotenoidai taip pat gali lemti farmakologinį poveikį. Nustatyta, kad karotenodai, išskirti iš paprikų vaisių, mažina uždegimą adipocituose ir gali turėti įtakos insulino rezistentiškumo prevencijai [38]. Karotenoidams taip pat būdingas antioksidacinis, priešuždegiminis ir analgetinis poveikis [23]. Kadangi paprikų vaisių sudėtyje yra vitaminų ir mineralų, reguliarus suvartojimas galėtų būti vitaminų trūkumo prevencija [30].
Apžvelgti tyrimai rodo, jog vienamečių paprikų biologiškai aktyvūs junginiai galėtų būti pritaikomi ne tik neuropatiniam skausmui malšinti, bet ir širdies ir kraujagyslių ligų, virškinamojo trakto ligų, vėžinių ligų ir avitaminozių prevencijai.
1.4. Veiksniai, ribojantys kapsaicinoidų pritaikymą medicinoje
Kapsaicino ir kapsaicinoidų analogų pritaikymas sisteminiam vartojimui yra ribotas dėl nepakankamų klinikinių duomenų. Nors in vitro ir in vivo tyrimų su gyvūnais rezulatai rodo teigiamą kapsaicinoidų poveikį įvairioms organizmo sistemoms, apie tikslius farmakologinius veikimo mechanizmus duomenų trūksta [17;59].
Kapsaicinas, pavartotas peroraliai, yra greitai metabolizuojamas kepenyse ir kituose metabolizuojančiuose organuose, maksimali jo koncentracija pasiekiama po valandos [37]. Kapsaicinoidai metabolizuojami dalyvaujant CYP450 fermentų sistemai, pastebėtas kapsaicino inhibicinis poveikis CYP3A4 fermentui bei indukcinis poveikis CYP2E1 fermentui [68], tai galėtų lemti kliniškai reikšmingas vaistų sąveikas.
Toksiškumo tyrimai su šunimis parodė, jog kapsaicino poodinė injekcija sukelia tik nežymius organų toksiškumo simptomus – hipertenziją ir tachikardiją, tačiau yra greitai pašalinamas iš organizmo
[8]. Buvo atliktas nedidelės imties tyrimas su antsvorį turinčiomis moterimis – teigiama, jog 2 – 10 mg/d kapsaicino suvartojimas yra saugus, nes tiriamosioms nepasireiškė jokių sunkių nepageidaujamų reakcijų [16]. Visgi, galimam kapsaicino toksiškumui įvertinti reikėtų atlikti daugiau pakankamos imties klinikinių tyrimų.
Kapsaicinui būdingas didelis aitrumas, jis gali sukelti deginimo pojūtį kontakto su gleivinėmis metu, taip pat ir skrandžio dirglumą [55;71]. Šis veiksnys sprendžiamas kuriant kapsiatus, nepasižyminčius aitrumu. Dėl menko tirpumo vandenyje, kapsaicino biologinis prieinamumas yra prastas, todėl kapsaicino peroralinių farmacinių formų kūrimui reikalingi papildomi technologiniai procesai [71].
Išskirti farmakologiniai ir technologiniai veiksniai lemia tai, jog kapsaicinoidai pritaikomi tik naudoti ant odos skirtų farmacinių formų kūrimui. Siekiant C. annuum vaisių ekstraktą ar jo biologiškai aktyvius junginius pritikyti peroraliniam vartojimui, reikia įvertinti junginių dozės – atsako ryšį, preparatų gamybai taikyti pažangias molekulių pernašos sistemas ar kurti priimtinesnėmis technologinėmis savybėmis pasižyminčius kapsaicinoidų analogus.
1.5. Biologiškai aktyvių junginių, esančių paprikų vaisiuose, ekstrakcija
Vienamečių paprikų ekstrakto cheminė sudėtis priklauso nuo pasirinktos žaliavos kilmės, kultivavimo sąlygų bei ekstrakcijos metodo. Kaip minėta, paprikų veislės skiriasi chemine sudėtimi, todėl svarbu pasirinkti tikslinių komponentų daugiausiai turinčią žaliavą. Maisto pramonėje kaip dažikliai ar maisto priedai naudojami aliejiniai paprikų ekstraktai, sudaryti daugiausia iš karotenoidų, suteikiančių ekstraktams spalvą. Padažų gamybai naudojami ir aitriųjų komponentų turintys ekstraktai [2]. Farmacijos pramonėje naudojami ekstraktai gali būti bespalviai, nes jų pagrindiniai komponentai kapsaicinoidai – kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas – išgrynintame pavidale yra baltos spalvos.
Kapsaicinoidai išskiriami iš išdžiovintų subrendusių vienamečių paprikų vaisių, juos susmulkinus ir paveikus poliniais organiniais tirpikliais. Europos Farmakopėjos monografijoje Ph. Eur. 8.0, 2529 (01/2014), aprašančioje tirštą standartizuotą paprikų ekstraktą nurodoma, kad gamyba turi būti atliekama naudojant 80% (v/v) etanolį ir taikant tinkamą ekstrakcijos metodiką.
Kapsaicinoidų ekstrakcijai iš vienamečių paprikų vaisių gali būti taikomi įvairūs ekstrakcijos metodai, tokie kaip maceracija, Soksleto ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija, kietafazė ekstrakcija [3;45;58]. Siekiant sumažinti ekstrakcijos laiką, galima paveikti ekstrakcijos mišinį ultragarsu, mikrobangomis, fermentų kompleksu, suardančiu augalo sienelę [51]. Pagreitinta ekstrakcija tirpikliais,
taikant temperatūros ir slėgio didinimą ekstrakcijos proceso metu, pagerina ekstrakcijos efektyvumą ir sumažina tirpiklio išteklius [9]. Soksleto ekstrakcija yra nesudėtinga procedūra augalinių ekstraktų ruošimui, pasiekiama didelė kapsaicino išskyrimo išeiga, tačiau laiko ir tirpiklio sąnaudų prasme šis procesas nėra efektyvus – taikant ultragarsinę ekstrakcija 86 % sumažėja ekstrakcijos laikas lyginant su Soksleto ekstrakcija ir tokiu būdu nedaroma įtaka kapsaicino stabilumui [40].
Ekstrakcijos proceso efektyvumas priklauso nuo pasirinkto ekstrakcijos laiko ir temperatūros.
Taikant ultragarsinę ekstrakciją ir naudojant metanolį ar etanolį kaip tirpiklį, efektyvus ekstrakcijos laikas yra 20 min., temperatūros, jai kintant nuo 30 iki 60 °C, įtaka nėra statistiškai reikšminga, tačiau ženkliai mažesnė kapsaicinoidų išeiga gaunama palaikant mažesnę nei 30 °C temperatūrą (6 pav.) [3].
6 pav. Santykinis kapsaicinoidų atkuriamumas taikant skirtingą ekstrakcijos temperatūrą [3]
Barbero et al
1.6. Biologiškai aktyvių junginių, esančių paprikų vaisiuose, analizės metodai
Vienamečių paprikų vaisiuose esančių biologiškai aktyvių junginių analizė daugiausiai vykdoma chromatografiniais analizės metodais. Bendro kapsaicinoidų kiekio analizė laboratorijos sąlygomis galima taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą, tačiau pavienių komponentų atskyrimui šis metodas nėra pakankamai efektyvus, kadangi kapsaicinoidai struktūriškai yra labai panašūs [66]. Greitai analizei įmanoma pritaikyti ir kolorimetriją [50], bet šis metodas dėl menko tikslumo netinka daugiakomponenčiams mišiniams analizuoti.
Pagrindinis metodas, įvertinti atskirus kapsaicinoidus kokybiškai ir kiekybiškai yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Analičių detekcijai naudojami fotodiodų matricos [1], UV [6] bei masių spektrometrijos (MS) [33] detektoriai. Kokybiškai kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas analizuojamuose tirpaluose identifikuojami lyginant jų sulaikymo laikus ir UV šviesos spektrus su referentinių standartų duomenimis. Kiekybiniam nustatymui taikomas gradavimo grafiko metodas, vertinant analičių smailės plotą. ESC taikymo biologiškai aktyvių junginių nustatymui privalumas – nebūtina atlikti sudėtingų ekstraktų valymo procedūrų, efektyviai atskiriami struktūriškai panašūs junginiai.
Siekiant atlikti išsamesnę kapsaicinoidų profilio analizę, paprikų vaisių ekstraktams tirti taikomas dujų chromatografijos metodas. Analičių aptikimui naudojant masių spektrometrijos detektorių, galima atskirti ir identifikuoti ne tik kapsaiciną ir dihidrokapsaiciną, bet ir n-C, n-DHC, h-C, h-DHC [58]. Šis analizės būdas taikomas rečiau dėl sudėtingos ir brangios aparatūros.
Farmacinių preparatų, turinčių C. annuum ekstrakto, kiekybinę cheminės sudėties analizę rekomenduojama atlikti skysčių chromatografijos metodu. UV spektrofotometrija ir kolorimetrija minėtu atveju nėra tikslūs metodai, ypač tiriant daugiakomponenčius mišinius. Dujų chromatografija, nepaisant didelio informatyvumo, nėra būtina rutininei preparatų analizei, nes kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas, siejami su farmakologiniu poveikiu, sudaro didžiają dalį paprikose esančių alkaloidų, o kitų kapsaicinoidų kiekis yra nežymus.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką buvo siekta pritaikyti biologiškai aktyvių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui maisto papilduose, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų vaisių ekstrakto. Trys tiriamieji maisto papildai (farmacinė forma – tabletės) yra notifikuoti Lietuvoje ir buvo įsigyti Lietuvos vaistinėse (toliau MP_1, MP_2, MP_3), vienas maisto papildas (farmacinė forma – kapsulės) buvo įsigytas sveikatinimo prekių parduotuvėje Olandijoje (toliau MP_4).
Palyginimui buvo vykdomas aitriųjų paprikų miltelių (kilmės šalis Indija), įsigytų Lietuvos prekybos centre, tyrimas (toliau P_1).
Metodika buvo pritaikyta ir Lietuvos rinkoje parduodamų skirtingų veislių paprikų prieskoniuose esančių biologiškai aktyvių junginių įvertinimui. Buvo ištirti:
• Kajeno paprikų milteliai (kilmės šalis Kinija) – toliau PM_1;
• Kajeno paprikų milteliai (kilmės šalis Ispanija) – toliau PM_2;
• aitriųjų paprikų milteliai (kilmės šalis Kinija) – toliau PM_3;
• aitriųjų paprikų milteliai (kilmės šalis Ispanija) – toliau PM_4;
• saldžiųjų paprikų milteliai (kilmės šalis Kinija) – toliau PM_5;
• saldžiųjų paprikų milteliai (kilmės šalis Ispanija) – toliau PM_6.
2.1.1. Maisto papildų, kurių sudėtyje yra vienamečių paprikų vaisių ekstrakto, sudėtis
MP_1 vienos tabletės sudėtis: kalcio karbonatas, maltodekstrinas, užpildai (mikrokristalinė celiuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė), paprikų ekstraktas (49,5 mg), L-askorbo rūgštis (vit. C), rozmarinų lapų milteliai, dirvinių asiūklių milteliai, geležies fumaratas, glajinės medžiagos (riebalų rūgščių magnio druskos, hidroksipropilmetilceliuliozė, šelakas, polietilenglikolis, karnaubo vaškas), pipirmėtės lapų milteliai, kraujažolių žiedų milteliai, DL-α-tokoferilacetatas (vit. E), nikotinamidas, cinko oksidas, kalcio D-pantotenatas, gudobelių lapų ir žiedų ekstraktas, moliūgų sėklų milteliai, mangano sulfatas, vario sulfatas, piridoksino hidrochloridas (vit. B6), riboflavinas (vit. B2), tiamino mononitratas (vit. B1), retinilo acetatas (vit. A), pteroilmonoglutamo rūgštis (folio rūgštis),
chromo (III) chloridas, kalio jodidas, natrio molibdatas, natrio selenitas, D-biotinas, cholekalciferolis (vit.
D), cianokobalaminas (vit. B12).
MP_2 vienos tabletės sudėtis: gvaraninių paulinijų (Paullinia cupana) sėklų ekstraktas (Kofeinas 12%), lipnumą reguliuojančios medžiagos celiuliozė ir kalcio fosfatas, inulinas, kambodžinių garcinijų (Garcinia cambogia) vaisių ekstraktas, L-cholino bitartratas, tikrųjų imbierų (Zingiber officinale) šaknų ekstraktas, emulsiklis hidroksipropilmetilceliuliozė, vienamečių paprikų (Capsicum annuum) vaisių ekstraktas (25 mg), stabilizatorius skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos riebalų rūgštys, silicio dioksidas, magnio stearatas ir riebalų rūgščių magnio druskos, dažikliai titano dioksidas ir geležies oksidas, chromo pikolinatas.
MP-3 vienos tabletės sudėtis: kininių arbatmedžių (Camellia sinensis L.) lapų ekstr., dikalcio fosfatas (kietiklis), mikrokristalinė celiuliozė (lipnumą reguliuojanti medžiaga), trikalcio fosfatas (kietiklis), magnio oksidas, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė (stabilizatorius), vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių ekstraktas (12 mg), riebalų rūgščių magnio druskos (stabilizatorius), nikotinamidas, hidroksipropilmetilceliuliozė (tirštiklis), kalcio D-pantotenatas, cianokobalaminas, geležies oksidas (dažiklis), piridoksino hidrochloridas, titano dioksidas (dažiklis), riboflavinas, tiamino mononitratas, karnaubo vaškas (glajinė medžiaga), chromo pikolinatas.
MP_4 vienos kapsulės sudėtis: vienamečių paprikų (Capsicum annuum L.) vaisių milteliai (450 mg), maltodekstrinas, želatina.
2.2. Kapsaicinoidų nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
2.2.1. Naudota įranga
Kokybinei ir kiekybinei tiriamųjų objektų analizei naudotas skysčių chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino atskyrimui naudota ACE C18 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm), porų dydis 5 μm. Ultragarsinei mėginių ekstrakcijai naudota WiseClean (Witeg, Vokietija) vonelė, mėginių išgarinimui naudotas rotacinis garintuvas (Heidolph, Vokietija).
2.2.2. Medžiagos ir reagentai
Tyrimo metu etaloninių tirpalų paruošimui naudotas metanolis (99,9% Sigma-Aldrich, Vokietija), tiriamųjų tirpalų paruošimui naudotas etanolis (99,9% Sigma-Aldrich, Vokietija) bei acetonitrilas (99,8%
Sigma-Aldrich, Vokietija).
2.2.3. Tyrimo sąlygos
Taikytas gradientinis eliuavimas. Eliuentas A – trifluoracto rūgštis 0,1 %, eliuentas B – acetonitrilas, eliuentų sudėties kitimas nurodytas 1 lentelėje. Injekcijos tūris 10 μl, eliuentų tėkmės greitis 1 ml/min, palaikoma 25 °C kolonėlės temperatūra, analičių detekcija vykdyta prie 280 nm UV šviesos bangos ilgio.
1 lentelė. Gradientinės mobilios fazės sudėties kitimas
Laikas, min Eliuentas A (%, v/v) Eliuentas B (%, v/v)
0,01 45 55
12 45 55
13 5 95
15 5 95
16 45 55
2.2.4. Etaloninių tirpalų paruošimas
Etaloniniai tirpalai ruošiami naudojant analitinius kapsaicino (≥ 99,9% Sigma-Aldrich, Vokietija) ir dihidrokapsaicino (≥ 97,0% Sigma-Aldrich, Vokietija) standartus.
Etaloninis kapsaicino tirpalas ruošiamas tirpinant 1,275±0,037 mg kapsaicino standarto 5 ml etanolio. Gautas tirpalas filtruojamas per 0,45 μm porų skersmens polivinilidenfluorido (PVDF) filtrą, tirpalo koncentracija 0,255 mg/ml.
Etaloninis dihidrokapsaicino tirpalas ruošiamas tirpinant 1,210±0,052 mg dihidrokapsaicino standarto 5 ml etanolio. Gautas tirpalas filtruojamas per 0,45 μm porų skersmens PVDF filtrą, tirpalo koncentracija 0,242 mg/ml.
2.2.5. Tiriamųjų tirpalų paruošimas
2.2.5.1. Tiriamųjų tirpalų iš maisto papildų paruošimas
Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš pasirinktų maisto papildų ir paprikų miltelių buvo taikyta modifikuota literatūros šaltinyje aprašyta metodika [3]. Maisto papildų tablečių ir kapsulių kiekis ekstrakcijai pasirenkamas pagal ant pakuotės deklaruotą ekstrakto kiekį.
MP_1 tiriamojo tirpalo paruošimas: 6 tabletės susmulkinamos grūstuvėje, analitinėmis svarstyklėmis nustatoma jų masė. Susmulkinta tablečių masė perkeliama į analitinę kolbutę ir įpilama 15 ml acetonitrilo. Mišinys ekstrahuojamas ultragarso vonelėje 20 min. 50 °C temperatūroje. Ekstrakcijos mišinys atvėsinamas ir centrifuguojamas 5 minutes esant 500 aps./min greičiui. Centrifugatas išgarinamas iki sauso likučio naudojant rotacinį garintuvą. Sausas likutis ištirpinamas 2 ml acetonitrilo, gautas tirpalas filtruojamas per 0,45 μm porų skersmens PVDF filtrą ir naudojamas analizei.
MP_2 tiriamojo tirpalo paruošimas: 12 tablečių susmulkinama grūstuvėje, analitinėmis svarstyklėmis nustatoma jų masė. Susmulkinta tablečių masė perkeliama į analitinę kolbutę ir įpilama 30 ml acetonitrilo. Tolesnė eiga analogiška MP_1 ekstrakcijai.
MP_3 tiriamojo tirpalo paruošimas: 15 tablečių susmulkinama grūstuvėje, analitinėmis svarstyklėmis nustatoma jų masė. Susmulkinta tablečių masė perkeliama į analitinę kolbutę ir įpilama 30 ml acetonitrilo. Tolesnė eiga analogiška MP_1 ekstrakcijai.
MP_4 tiriamojo tirpalo paruošimas: 5 kapsulių turinys pasveriamas analitinėmis svarstyklėmis.
Gauta masė perkeliama į analitinę kolbutę, įpilama 15 ml acetonitrilo. Tolesnė eiga analogiška MP_1 ekstrakcijai.
2.2.5.2. Tiriamųjų tirpalų iš paprikų miltelių paruošimas
Ekstrakcijai paimama 3,062 ± 0,064 g kiekvienos rūšies paprikų miltelių (P_1, PM_1 – PM_6).
Pasverta miltelių masė perkeliama į analitinę kolbutę, įpilama 15 ml acetonitrilo. Mišinys ekstrahuojamas ultragarso vonelėje 20 min. 50 °C temperatūroje. Ekstrakcijos mišinys atvėsinamas ir centrifuguojamas 5 minutes esant 500 aps./min greičiui. Centrifugatas filtruojamas per 0,45 μm porų skersmens PVDF filtrą, gautas tirpalas naudojamas analizei.
P_1 milteliai pirminio tyrimo metu ekstrahuoti naudojant ir acetonitrilą, ir etanolį, siekiant pasirinkti efektyvesnį ekstrakcijos tirpiklį, tolesniam tyrimui dėl didesnės išeigos pasirinkta ekstrakcija acetonitrilu.
2.3. Statistinė duomenų analizė
Gauti rezultatai analizuoti naudojant MS Excel (Microsoft, JAV) programą su įdiegtu statistinės analizės paketu. Eksperimentiniai bandymai kartoti tris kartus, duomenų vertinimas atliktas apskaičiavus reikšmių aritmetinį vidurkį, standartinį nuokrypį ir santykinę paklaidą. Skirtumų tarp imčių statistiniam reikšmingumui įvertinti taikyta 0,05 kritinė reikšmė.
3. REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodikos validacija
Pasirinkta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodika validuota įvertinant šias charakteristikas:
• specifiškumą (angl. Specificity);
• tiesiškumą (angl. Linearity);
• preciziškumą (glaudumą) (angl. Precision), kurį sudaro pakartojamumas (angl. Repeatability) bei atkartojamumas (angl. Reproducibility);
• aptikimo ribą (angl. Limit of Detection, LoD);
• nustatymo ribą (angl. Limit of Quantification, LoQ).
3.1.1. Metodo specifiškumas
Metodo specifiškumas apibūdina metodo gebėjimą atskirti analitę mišinyje esant kitiems komponentams [25]. Tiriamajame mėginyje gali būti įvairių priemaišų, vaistiniai preparatai ir maisto papildai dažnai yra daugiakomponenčiai, į tabletės ar kapsulės sudėtį įeina pagalbinės medžiagos, kurios gali trukdyti analitės nustatymui, todėl metodas turi būti specifiškas ir atskirti net struktūriškai panašius junginius.
Pasirinkto metodo specifiškumas įvertintas lyginant kapsaicino ir dihidrokapsaicino etaloninių tirpalų ir tiriamųjų tirpalų chromatogramas ir vertinant šių analičių sulaikymo laikus, taip pat UV šviesos absorbcijos spektrus.
Vidutinis kapsaicino sulaikymo laikas etaloninių tirpalų chromatogramoje 8,314 ± 0,053 min, dihidrokapsaicino – 11,060 ± 0,081 min. Tiriamųjų tirpalų chromatogramose identifikuotų kapsaicino ir dihidrokapsaicino sulaikymo laikai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino tiriamuosiuose tirpaluose sulaikymo laikai Tiriamasis
mėginys
Kapsaicino sulaikymo laikas, min
Dihidrokapsaicino sulaikymo laikas, min
MP_4 8,318 Neaptikta
P_1 8,376 11,133
PM_1 8,266 10,950
PM_2 8,272 10,957
PM_3 8,291 10,993
PM_4 8,270 10,961
PM_5 8,278 Neaptikta
PM_6 8,296 Neaptikta
Vidurkis 8,296 ± 0,037 11,000 ± 0,077
Lyginant kapsaicino ir dihidrokapsaicino sulaikymo laikus etaloninių tirpalų chromatogramose su mėginių chromatogramose identifikuotais kapsaicino ir dihidrokapsaicino sulaikymo laikais, galima teigti, jog jie yra tapatūs.
Lyginant kapsaicinoidų UV šviesos absorbcijos spektrus analizuojamuose etaloniniuose tirpaluose (7 pav.) ir papildo MP_4 bei prieskonio P_1, kaip ekstrakcijos tirpiklį naudojant acetonitrilą, tirpaluose (8 pav.), matoma, jog spektrai sutampa abiems analitėms.
7 pav. Kapsaicino (A) ir dihidrokapsaicino (B) etaloninių tirpalų UV šviesos absorbcijos spektrai
8 pav. A – Kapsaicino UV šviesos absorbcijos spektras MP_4 tirpale. B – Dihidrokapsaicino UV šviesos absorbcijos spektras P_1 tirpale.
Kadangi kapsaicino ir dihidrokapsaicino sulaikymo laikai ir UV šviesos absorbcijos spektrai sutampa lyginant etaloninius tirpalus ir tiriamuosius tirpalus, galima teigti, jog specifiškumo kriterijus yra tenkinamas ir pasirinktas metodas yra tinkamas analičių atskyrimui mišinyje.
3.1.2. Metodo tiesiškumas
Tiesiškumui įvertinti buvo analizuoti skirtingų koncentracijų kapsaicino ir dihidrokapsaicino etaloniniai tirpalai ir sudarytos kalibracinės kreivės. Kai metodo tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas, kalibracinės kreivės lygtis leidžia įvertinti analitės koncentraciją tiriamajame mėginyje [60].
Kapsaicino kalibracinės kreivės sudarymui analizuoti 6 etaloninio tirpalo (0,255 mg/ml) skiedimai, dihidrokapsaicino – 5 etalonimio tirpalo (0,242 mg/ml) skiedimai. Gauta tiesiška analičių smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos. Tiesiškumo kriterijus yra tenkinamas, nes abiejų analičių kalibracinių kreivių koreliacijos koeficientai yra didesni nei 0,99 (3 lentelė).
3 lentelė. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino etaloninių tirpalų tiesiškumo rodikliai Analitės
pavadinimas
Koreliacijos
koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos, mg/ml
Sulaikymo laikas, min Kapsaicinas 0,9999730 y = 2,48*103 x - 2,95*103 0,004 – 0,255 8,309 Dihidrokapsaicinas 0,9999728 y = 2,66*103 x - 5,02*103 0,008 – 0,242 11,024
3.1.3. Metodo preciziškumas (glaudumas)
Metodo preciziškumas nustatytas atlikus pakartojamumo bei atkartojamumo tyrimus.
Pakartojamumas įvertintas tą pačią dieną po penkis kartus injekavus kapsaicino ir dihidrokapsaicino etaloninius tirpalus taikant tas pačias tyrimo sąlygas. Kapsaicino sulaikymo laikas pakartojamumo tyrime varijavo nuo 8,306 iki 8,321 min, dihidrokapsaicino – nuo 11,019 iki 11,041 min (9 pav.).
9 pav. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino pakartojamumas
Pasirinkto metodo pakartojamumas įvertintas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN) analičių sulaikymo laikui ir smailės plotui, gauti duomenys pateikti 4 lentelėje. Santykiniai standartiniai nuokrypiai nei vienu atveju neviršijo 5 procentų, kurie leistini kiekybinio tyrimo metu, todėl pakartojamumo kriterijus yra tenkinamas.
4 lentelė. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino pakartojamumo tyrimo rodikliai Analitė Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.
Sulaikymo laikui Smailės plotui
Kapsaicinas 0,1 0,6
Dihidrokapsaicinas 0,1 0,4
Siekiant įvertinti atkartojamumą, dvi dienas iš eilės tokiomis pačiomis sąlygomis po penkis kartus injekuoti kapsaicino ir dihidrokapsaicino etaloniniai tirpalai. Kapsaicino sulaikymo laikas atkartojamumo tyrimo metu varijavo nuo 8,295 iki 8,321 min, dihidrokapsaicino – nuo 10,999 iki 11,041 min (10 pav.).
10 pav. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino atkartojamumas
Atkartojamumo parametras įvertintas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN) analičių sulaikymo laikui ir smailės plotui. Abiem atvejais nustatyti SSN mažesni nei 5 procentai (5 lentelė), todėl atkartojamumo kriterijus yra tenkinamas. Kadangi pasirinktos metodikos pakartojamumo ir atkartojamumo parametrai atitinka kiekybiniam tyrimui taikomus reikalavimus, metodas yra preciziškas.
5 lentelė. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino atkartojamumo rodikliai Analitė Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.
Sulaikymo laikui Smailės plotui
Kapsaicinas 0,1 0,5
Dihidrokapsaicinas 0,1 0,3
3.1.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba (LoD) – mažiausia analitės koncentracija mėginyje, kuri gali būti identifikuota, bet nebūtinai nustatoma kiekybiškai [25]. Tai kokybinio sudėties tyrimo rodiklis, kai analitės koncentracija mėginyje yra mažesnė už aptikimo ribą, smailė chromatogramoje nebūtinai rodo analizuojamą medžiagą, nes gali būti laikoma triukšmu.
Nustatymo riba (LoQ) – mažiausia analitės koncentracija mėginyje, kuri gali būti pakankamai tiksliai įvertinta kiekybiškai [25]. Analitės koncentracijai neviršijant nustatymo ribos, koncentraciją mėginyje vertinti gali būti netikslinga.
Šie rodikliai apskaičiuoti pagal kapsaicino ir dihidrokapsaicino regresijos lygčių koeficientų standartinius nuokrypius [25;60]. Gauti rezultatai pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. Kapsaicino ir dihidrokapsaicino aptikimo ir nustatymo ribos
Analitė Aptikimo riba (LoD), μg/ml Nustatymo riba (LoQ), μg/ml
Kapsaicinas 2,28 6,90
Dihidrokapsaicinas 2,50 7,58
3.2. Kokybinis tiriamųjų sudėties įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
3.2.1. Kokybinis maisto papildų įvertinimas
Vykdant ekstrakcijos sąlygų parinkimą, pirminio tyrimo metu po ekstrakcijos acetonitrilu nebuvo atliekamas mėginių sukoncentravimas. Tiriant mėginius atlikus vien ultragarsinę jų ekstrakciją acetonitrilu nei vienoje iš gautų maisto papildų tirpalų chromatogramų nebuvo galima identifikuoti kapsaicino ir dihidrokapsaicino. Siekiant išsiaiškinti, ar pasirinkta ekstrakcijos metodika yra tinkama biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai, kartu su maisto papildais palyginimui buvo tirti ir aitriųjų paprikų milteliai (P_1). P_1 tirpalo chromatogramoje, remiantis etaloninių kapsaicino ir dihidrokapsaicino tirpalų chromatografiniais profiliais, galima identifikuoti šiuos junginius. Kapsaicino sulaikymo laikas 8,376 min, dihidrokapsaicino 11,133 min (11 pav.).Tai rodo, jog pasirinkta ekstrakcijos metodika yra tinkama, tačiau papilduose šių junginių yra pernelyg mažas kiekis, todėl reikalingas papildomas mėginio sukoncentravimas.
11 pav. P_1 tirpalo chromatograma, neatlikus mėginio sukoncentravimo
Pasirinktų papildų tirpalus rotaciniu garintuvu išgarinus iki sauso likučio ir juos resuspendavus nedideliame tirpiklio kiekyje, tik vieno iš keturių tirtų maisto papildų tirpalų chromatogramoje buvo galima identifikuoti kapsaicino smailę (12 pav.).
12 pav. M_4 tirpalo chromatograma, atlikus mėginio sukoncentravimą garinant
Galima daryti prielaidą, kad kapsaicino ir dihidrokapsaicino kiekis kitų tirtų maisto papildų tirpaluose neviršijo net aptikimo ribos. Svarbu pabrėžti tai, jog kapsaiciną pavyko identifikuoti tik maisto papildo, kurio sudėtyje yra vienamečių paprikų vaisių miltelių, o ne vaisių ekstrakto, tirpale (MP_4).
Tokie rezultatai gali indikuoti tai, kad pasirinktų maisto papildų gamybai naudotuose vienamečių paprikų vaisių ekstraktuose kapsaicinoidų nėra arba yra labai nedidelis šių biologiškai aktyvių junginių kiekis.
3.2.2. Kokybinis paprikų miltelių įvertinimas
Išanalizavus paprikų miltelių mėginius taikant pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, gautos chromatogramos, kuriose galima identifikuoti kapsaicino ir dihidrokapsaicino smailes.
Šių mėginių analizei nebuvo reikalingas papildomas mėginių sukoncentravimas. Kapsaicinas aptiktas visų tirtų C. annuum veislių milteliuose, dihidrokapsaicinas nenustatytas nei Kinijos, nei Ispanijos saldžiųjų paprikų milteliuose (13, 14 pav.).
13 pav. Saldžiųjų paprikų miltelių (kilmės šalis Kinija) tirpalo chromatograma
14 pav. Saldžiųjų paprikų miltelių (kilmės šalis Ispanija) tirpalo chromatograma
Gauti rezultatai neprieštarauja kitų mokslininkų atlikto tyrimų rezultatams [19], nes, kaip vėliau apskaičiuota, kapsaicino koncentracija tiriamuosiuose saldžiųjų miltelių mėginiuose neviršija aptikimo ribos, todėl negalima teigti kapsaicinoidų buvimo saldžiųjų paprikų milteliuose. Kapsaicinoidai šiuose prieskoniuose galėjo būti aptikti, jeigu prieskonių gamybai naudoti saldžiųjų paprikų vaisiai buvo auginami sausros sąlygomis, nes nustatyta, jog neaitrių veislių paprikose sukaupiamas kapsaicinoidų kiekis didėja, trūkstant drėgmės [46].
3.3. Kiekybinis tiriamųjų sudėties įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
3.3.1. Maisto papildų kapsaicinoidų sudėties kiekybinis įvertinimas
Tik ant vieno iš pasirinktų gamintojų maisto papildų pakuotės (MP_3) yra deklaruojamas kapsaicino kiekis – jis sudaro 0,5 % bendro ekstrakto kiekio (12 mg), tai yra 0,6 μg vienoje tabletėje. Kitų papildų (MP_1 ir MP_2) gamintojai ant pakuotės nurodo tik bendrą ekstrakto kiekį, MP_4 maisto papildo gamintojai pažymi, kad vienoje kapsulėje yra 450 mg Kajeno paprikos miltelių.
Nors MP_3 gamintojas nurodo kapsaicino kiekį, šiuose papilduose kapsaicino nepavyko nustatyti nei kokybiškai, nei kiekybiškai. Apskaičiuoti kapsaicino koncentraciją buvo galima tik MP_4 tirpale, gauta 1,503±0,02 μg/ml koncentracija, atitinkanti 0,25±0,03 μg kapsaicino vienoje kapsulėje. Apytikslė 0,5 μg/g kapsaicino koncentracija labiau būdinga saldžiųjų paprikų nei Kajeno paprikų vaisiams, kurie pasižymi aitrumu [19]. Visgi, analitės koncentracija tirpale neviršija nei aptikimo nei nustatymo ribos, todėl ją laikyti reprezentatyvia būtų netikslinga.
Remiantis kitų mokslininkų atliktais tyrimais, galima daryti prielaidą, kad maisto papildams skirto vienamečių paprikų vaisių ekstrakto gamybai buvo naudoti neaitraus genotipo (pavyzdžiui, saldžiųjų
paprikų), nepakankamai subrendę ar pernokę C. annuum vaisiai [12;18-19]. Gali būti, kad gamintojai nesiekė išekstrahuoti kapsaicinoidų, nes biologiniu aktyvumu pasižymi ir paprikų vaisiuose esantys karotenoidai, vitaminai bei kiti organiniai junginiai, o kapsaicinoidų kiekis vaisiuose yra nedidelis.
Maisto papildų gamintojai nenurodo papildomos informacijos apie ekstraktą, o ekstrakto sudėčiai įtakos turi ir ekstrakcijos metodas, tirpiklis bei temperatūra [3], dėl šių veiksnių kapsaicinoidų kiekis gali varijuoti. Pasirinktų maisto papildų kokybę sunku įvertinti dėl nepakankamai informatyvios pakuotės deklaracijos.
3.3.2. Paprikų miltelių kapsaicinoidų sudėties kiekybinis įvertinimas
Siekiant palyginti maisto papilduose ir paprikų prieskoniuose esančių kapsaicinoidų kiekį bei įvertinti, ar skiriasi Kinijos ir Ispanijos kilmės šalių paprikų miltelių sudėtis, kapsaicinas ir dihidrokapsaicinas šiuose mėginiuose įvertintas kiekybiškai. Analičių koncentracija (μg/ml) tirpale perskaičiuota į analičių koncentraciją (mg/g) paprikų milteliuose. Tyrimo rezultatai pateikti 15 ir 16 paveiksluose.
15 pav. Kapsaicino kiekis (mg/g) skirtingos kilmės paprikų milteliuose
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Kajeno paprikų milteliai
Aitriųjų paprikų milteliai
Saldžiųjų paprikų milteliai
Kilmės šalis Kinija Kilmės šalis Ispanija
