Skystųjų preparatų iš Juglans nigra L. lapų gamyba, biologiškai aktyvių junginių kiekio įvertinimas ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

VYTAUTĖ KETURAKYTĖ

Skystųjų preparatų iš Juglans nigra L. lapų gamyba, biologiškai

aktyvių junginių kiekio įvertinimas ir antioksidacinio aktyvumo

tyrimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: prof. dr. Daiva Majienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, Data

SKYSTŲJŲ PREPARATŲ IŠ JUGLANS NIGRA L. LAPŲ GAMYBA,

BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ KIEKIO ĮVERTINIMAS IR

ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Darbo vadovas Darbą atliko Prof. dr. Daiva Majienė Magistrantė

Data Vytautė Keturakytė Data

Recenzentas Dr. A. Kubilienė Data

PADĖKA

Uţ materialinę bazę, reikalingus laboratorinius prietaisus atliekant magistrinį baigiamąjį darbą dėkoju Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros kolektyvui. Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir pagalbą dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui. Uţ pagalbą dirbant spekektrofotometru ir įgyvendinant tyrimų metodikas dėkoju vyresn. laborantui – doktorantui Mindaugui Marksai.

TURINYS

SANTRAUKA ... 6

SUMARRY ... 8

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 13

1.1 Juodasis riešutmedis (Juglans nigra L.) ... 13

1.2 Pagrindinių J. nigra veikliųjų medţiagų charakteristika ... 15

1.2.1 Fenoliniai junginiai augalinėje ţaliavoje ... 15

1.2.2 Naftochinonai ... 16

1.2.2.1 Plumbaginas ... 18

1.2.2.2 Juglonas ... 19

1.2.3. Flavonoidai ... 20

1.2.3.1 Flavonoidų fiziko – cheminės savybės ... 23

1.2.3.2 Flavonoidų reikšmė augalams ... 23

1.2.3.3 Flavonoidų panaudojimo medicinoje galimybės ... 23

1.3 Antioksidacinis aktyvumas ... 24

1.3.1. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas augalinėje ţaliavoje ... 26

1.3.2. Prooksidacinis aktyvumas ... 26

1.4. Skystųjų preparatų gamybos metodai ... 27

1.4.1 Tinktūrų gamyba ... 27

1.4.2 Vandeninės ištraukos ... 28

2. METODIKA ... 29

2.1. Naudoti reagentai ir aparatūra ... 29

2.2. Tyrimo objektai ... 30

2.3 Ţaliava ... 30

2.4 Skystųjų preparatų iš J. nigra gamyba ... 30

2.4.1 Etanolinės tinktūros ruošimas ... 30

2.5 Biologiškai aktyvių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ... 31

2.5.1 Flavonoidų kokybinis nustatymas ... 31

2.5.2 Fenolinių junginių kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu būdu ... 32

2.5.3 Flavonoidų kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu būdu ... 33

2.5.4 Juglono nustatymas ... 33

2.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 33

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35

3.1 Tiriamų parametrų apskaičiavimas ir statistinių duomenų apdorojimas ... 35

3.2 Kokybinis flavonoidų nustatymas tiriamuosiuose objektuose ... 35

3.2 Spektrofotometrinė analizė ... 36

3.3.1 Bendro fenolinių junginių ir bendro flavonoidų kiekio rezultatų įvertinimas ... 36

3.3.2 Juglono kiekio nustatymas tiriamuosiuose objektuose ... 39

3.4 Fluorimetrinė analizė ... 40

3.4.1 Antioksidacinis aktyvumas ... 40

IŠVADOS ... 44

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45

SANTRAUKA

Skystųjų preparatų iš Juglans nigra L. lapų gamyba, biologiškai aktyvių junginių

kiekio įvertinimas ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas

V. Keturakytės magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas prof. dr. D. Majienė;

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakultetas, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai ţodţiai: juodasis riešutmedis, etanolinė tinktūra, vandeninė ištrauka, antioksidantinis

aktyvumas, fenoliniai junginiai, flavonoidai, naftochinonai, juglonas.

Tyrimo tikslas - pagaminti vandenines ir etanolines ištraukas iš Junglans nigra L. lapų ir įvertinti

bendrą fenolinių junginių, bendrą flavonoidų, juglono kiekį bei nustatyti antioksidacinį aktyvumą.

Metodika:

1. Tyrimo objektai: 70% etanolinė juodojo riešutmedţio tinktūra, vandeninė juodojo riešutmedţio lapų ištrauka bei gamyklinis “Black Walnut” 1:1 ekstraktas (gamintojas „Nature's Answer”, JAV).

2. Ištraukų iš J. nigra lapų gamyba.

1) Etanolinės tinktūros gamyba. Pritaikius perkoliacijos metodą iš juodojo riešutmedţio lapų ţaliavos, naudojant 70% etanolį, buvo pagaminta tinktūra (santykis 1:10).

2) Vandeninė ištrauka. 10 g smulkintos lapų ţaliavos buvo uţpilta 120 ml verdančio vandens ir kaitinta 1 val. Ištrauka nufiltruota pro 4 nr. Vatmano filtrą.

3. Kokybinės flavonoidų įvertinimo reakcijos.

4. Bendras fenolinių junginių nustatymas naudojant Folin – Ciocalteu metodą (standartas – galo r.)

5. Bendras flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu, naudojant AlCl3 tirpalą

(standartas - rutinas).

6. Juglono kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu.

7. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fluorimetriniu būdu, naudojant 10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas (AMR) ir krienų peroksidazę (HPR).

Rezultatai. Bendram fenolinių junginių, bendram flavonoidų bei juglono išekstrahuoto kiekio

palyginimui buvo pagamintos J. nigra lapų etanolinė ir vandeninė ištraukos. Tiriamų objektų biologiškai aktyvių komponentų kiekiai buvo palyginti su gamykliniu „Black Walnut“ ekstraktu. Didţiausias bendras

fenolinių junginių, bendras flavonoidų kiekis nustatytas „Black Walnut“ ekstrakte, kiekiai atitinkamai maţėja etanolinėje ir vandeninėje ištraukose. Didţiausias juglono kiekis nustatytas ekstrakte, maţesnis – tinktūroje. Vandeninėje ištraukoje juglono neaptikta. Antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo etanolinė tinktūra ir vandeninė ištrauka. Lyginant etanolinę tinktūrą su vandenine ištrauka pastebėta, kad neutralizavimo geba tiesiogiai priklauso nuo bendro fenolinių junginių kiekio. „Black Walnut“ ekstraktas pasiţymėjo prooksidaciniu aktyvumu.

Išvados:

1. Nustatyta, kad fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis priklauso nuo ekstrahento parinkimo ir gamybos metodo.

2. Tyrimų rezultatai parodė, kad juglonas gerai tirpsta etanolyje, vandeninėje ištraukoje juglono nerasta.

3. Tyrimai parodė, kad etanolinė ir vandeninė ištraukos pasiţymi antioksidaciniu poveikiu, „Black Walnut“ ekstraktas – prooksidaciniu.

SUMARRY

Biologically active compounds and antioxidant activity evaluation of liquid Black

walnut (Juglans nigra L.) leaf preparations

V. Keturakytė master thesis/ Term paper advisor prof. dr. D. Majienė;

Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy.

Keywords: black walnut, ethanolic tincture, aqueous extract, antioxidant activity, phenolic

compounds, flavonoids, naphthoquinones, juglone.

Aim of the work - produce aqueous and ethanolic extracts of Junglans nigra leaves, evaluate the

total phenolic and total flavonoids content, juglone concentration and identify antioxidant activity.

Methods:

1. Objects of study: ethanolic tincture and aqueous extract of black walnut leaves, “Black Walnut” extract, 1:1 („Nature's Answer”, USA).

2. Liquid preparations of J. nigra leaves production:

1) Ethanolic tincture production. Tincture was produced of black walnut leaves applying the method of percolation. The 70% ethanol was used. Tincture ratio is 1:10.

2) Aqueous exract production. 10 g shredded leaves of black walnut were extracted with 120 ml of boiling wather for 1 hours. After boiling extract was filtered throught the Whatman paper no. 4.

3. Qualitative evaluation of flavonoids.

4. Total phenolic content was determined by spectrophotometric (Folin - Ciocalteau) method. 5. Total flavonoids content was measured with an aluminum chloride colorimetric assay using

spectrophotometer.

6. Juglone determination by spectrophotometric method.

7. Fluorimetric antioxidant activity assay by using N-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) and horseradish peroxidase (HPR).

Results. Ethanolic and aqueous extracts of J. nigra leaves were made to compare total phenolic,

total flavonoids content, juglone concentration. Biologically active components study results of ethanolic and aqueous extracts were compared with “Black Walnut” extract. The highest total phenolic and total flavonoids content determinated in “Black Walnut” extract, amounts respectivelly decreasing in ethanolic

and aqueous extracts. The highest juglone concentration was established in “Black Walnut”, lower concentration – in ethanolic tincture. Juglone was not found in aqueous extract. Both, ethanolic and aqueous, extracts have showed antioxidant activity, but in ethanolic tincture it is higher. “Black Walnut” extract have been noticed to have prooxidant activity.

Conclusions:

1. The results showed, that phenolic and flavonoids content depends of extraction solvent and method of production.

2. The results showed, that juglone is freely soluble in ethanol. Juglone was not detected in aqueous extract.

3. Ethanolic and aqueous, extracts have showed antioxidant activity. Prooxidant activity was noticed in “Black Walnut” extract.

SANTRUMPOS

DMSO – dimetilsulfoksidas;

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; GRE – galo rūgšties ekvivalentai;

HPR - krienų peroksidazė;

PBS (ang. phosfate buffer saline) – fosfatinis buferis;

ROS (angl. reactive oxygen species) - reaktyvios deguonies formos; RE – rutino ekvivalentai;

r. – rūgštis.

ĮVADAS

Juodasis riešutmedis (Juglans nigra L.) – riešutmedinių šeimos medţių rūšis. Pirmieji šio augalo teikiamą naudą pastebėjo amerikiečiai. Senovės medicinoje iš riešutmedţio augalinės ţaliavos (lapų, riešutų, ţievės) pagamintos arbatos, etanoliniai ekstraktai, nuovirai, uţpilai buvo vartojami kaip vidurius laisvinanti, tonizuojanti, antiparazitinė priemonė, kompresais buvo gydomos ţaizdos, artritas, įvairios odos ligos. Senovės amerikiečių tautos kramtydavo riešutmedţio ţievę norėdamos numalšinti dantų, galvos skausmą. Šiuo metu plačiai tiriamas juodojo riešutmedţio priešvėţinis, antimikrobinis, antioksidacinis poveikiai.[24,49,51]

Platų farmakologinį poveikį įtakoja aktyvūs komponentai aptinkami J. nigra augalinėje ţaliavoje. Atliktų tyrimų duomenimis šis augalas kaupia fenolinius junginius, flavonoidus, fitosterolius, naftochinonus, taninus, maţesniais kiekiais aptinkami mikro ir makroelementai (As, Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Zn), vitaminai (C, A, B1, B2, B3). [18,24,25,38,42,43]

Fenoliniai junginiai įtakoja J. nigra antioksidacinį aktyvumą, todėl yra svarbu parinkti tinkamą gamybos metodą ir ekstrahentą, kad ekstrakcijos metu būtų išekstrahuota kuo daugiau fenolinių junginių.

Darbe spektrofotometriniais metodais buvo įvertinti fendras fenolinių junginių, bendras flavonoidų kiekis, juglono koncentracija. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti buvo pasirinktas fluorimetrinis metodas.

Temos aktualumas, naujumas, ištirtumas

Juodojo riešutmedţio preparatai pasiţymi plačiu farmakologiniu poveikiu, todėl norint saugiai ir tinkamai juos naudoti ligų, negalavimų gydymui ir prevencijai reikia ištirti augalo sudėtį.

Nors J. nigra ţaliava buvo naudojama nuo senų laikų įvairiems negalavimas šalinti, tačiau šio riešutmedţio preparatų pasiūla yra maţa, Lietuvoje jų galima įsigyti maisto papildų (tinktūrų, ekstraktų, kapsulių) pavidalu. Siauras pritaikymas medicinoje gali būti siejamas su naftochinonų, o ypatingai – juglono, tyrimų trūkumu ir maţu augalo ištirtumu.

Skirtinguose regionuose augančio J. nigra sudėtis gal varijuoti, todėl aktualu suţinoti, kokius kiekius aktyviųjų junginių kaupia Lietuvoje augantis juodasis riešutmedis.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tyrimo problema – skirtingai paruoštuose skystuosiuose J. nigra lapų preparatuose

išsiekstrahuoja skirtingos biologiškai aktyvios medţiagos ir jų kiekiai.

Tyrimo objektai:

1. Etanolinė tinktūra, pagaminta iš J. nigra lapų; 2. Vandeninė J. nigra lapų ištrauka;

3. Pramoniniu būdu pagamintas “Black Walnut” ekstraktas, 1:1 (maisto papildas, gamintojas “Nature’s Answer”, JAV )

Tyrimo tikslas - pagaminti vandenines ir etanolines ištraukas iš Junglans nigra L. lapų ir įvertinti

bendrą fenolinių junginių, bendrą flavonoidų kiekį, juglono koncentraciją bei antioksidacinį aktyvumą.

Tyrimo uţdaviniai:

1. Pagaminti etanolines ir vandenines ištraukas iš Juglans nigra lapų.

2. Spektrofotometriniu būdu nustatyti ištraukose esančių fenolinių junginių koncentracijas. 3. Spektrofotometriniu būdu nustatyti ištraukose esančių flavonoidų koncentracijas. 4. Spektrofotometriniu būdu nustatyti juglono kiekį.

5. Fluorimetriniu metodu ištirti preparatų antioksidacinį aktyvumą.

Tyrimo metodai:

1. Literatūros apţvalga; 2. Laboratoriniai tyrimai.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1 Juodasis riešutmedis (Juglans nigra L.)

1 pav. Juodasis riešutmedis (Juglans nigra L.) 2 pav. J. nigra vaisiai

Morfologinis aprašymas. Juodasis riešutmedis (lot. Juglans nigra, angl. Black Walnut) - tai riešutmedinių (Juglandaceae) šeimos, riešutmedţių (Juglans) genties medţių rūšis (1 pav.). Medţio aukštis siekia 30 – 40 metrų. Ţievė pilka – juoda, giliai išvagota. Juodojo riešutmedţio balana yra beveik balta, medţio šerdis – šviesiai rudos – rudos spalvos. Vainikas tankus ir išsikerojęs. Šakelių šerdyse yra oro tarpų. Lapai 20-60 cm ilgio, sudėtiniai, standūs, neporiškai plunksniški, sudaryti iš 15-23 lapelių, iš kurių didţiausi yra išsidėstę centre. Lapelių ilgis 7-10 cm, plotis – 2-3 cm. Lapeliai beveik lygiakraščiai, tamsiai ţali, blizgantys, atvirkščiai kiaušiniški arba elipsiški, smailiu galu. Tarpugyslės padengtos plaukeliais. Juodasis riešutas yra vienanamis augalas, kurio vyriški ir moteriški ţiedai subręsta skirtingu metu. Kuokeliniai ţiedai – 8-10 cm ilgio geltonai – ţali ţirginiai. Piesteliniai ţiedai susitelkę po 2-8 į ţiedynus, praţysta šiųmečių ūglių viršūnėse. Jie atsiranda pirmieji ir pradeda ţydėti prieš arba iš karto po lapų atsiradimo. Ţydi vėlai geguţę arba ankstyvą birţelį. Vaisius uţmezga po 4-6 augalo gyvavimo metų. Vaisius – ovalios arba rutuliškos, retai – elipsės formos, rudos spalvos, raukšlėtas, kietas, 3,5 – 8 cm skersmens kaulavaisis (2 pav.). Kaulavaisį gaubia geltonos – ţalios spalvos apyvaisis, kuris išsivysto iš ţiedyno skraistės. Vaisiui sunokus apyvaisis nukrenta. Vaisiai ant medţio būna pavieniai arba susitelkę į grupes po du, arba tris. Sėkla – 3-4 cm skersmens, ovalios formos, giliai, išilgai vagota. Medis gyvena 100 - 130 metų. [24,49,50,51]

Savaime auga Šiaurės Amerikos centrinėje dalyje, Kanadoje, vakarų Azijoje, Kinijoje, Indijoje. Į Europą juodasis riešutmedis buvo atveţtas 1629 metais. Jis pamaţu prisitaikė augti daugelyje šalių: Didţiojoje Britanijoje, Prancūzijoje, Belgijoje, Vokietijoje, Šveicarijoje, Lenkijoje, Rusijoje ir kt. Primiausiai buvo auginamas botanikos soduose ir parkuose, o tik IXX a. buvo pradėtas auginti miškuose (Vokietijoje). [24,32,35]

Savaime Lietuvoje neauga, auginamas pavienių sodininkų, taip pat botanikos soduose: VDU botanikos sode, Skinderiškio dendrologiniame parke.

Kaip ţaliava medicinoje naudojami riešutmedţio lapai (Juglandis folium), vaisiaus ţievė, medţio ţievė. Tačiau ţievė medicininiams tikslams turi būti naudojama ypač atsargiai, nes yra nuodinga. [24,52]

Pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai aptinkami juodajame riešutmedyje: flavonoidai (kvercetinas, sakuranetinas, galaktozidas, pentozido derivatas, kvercetin-3-arabinozidas, kvercetin-3-ksilozidas, kvercetin-3-ramnozidas, miricetinas, taksifolinas, kemferolis, hyperinas), kiti fenoliniai junginiai (3-kafeilchininė rūgštis, 5-kafeilchininė rūgštis, 3-p-kumarilchininė rūgštis, 4-p-kumarilchininė rūgštis, p-kumaro rūgštis), naftochinonai (juglonas, hidrojuglonas, plumbaginas), fitosterolai (stigmasterolis, β-sitosterolis), elagitaninai (korilaginas ir jo izomeras juglaninas), taninai, regiolonas. Riešuto sėklose yra aliejaus, polinesočiųjų ir mononesočiųjų riebalų rūgščių, gleivių, albuminų, mineralinių medţiagų (As, Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Zn), celiuliozės. [18,24,25,38,43]

Biologiškai aktyvūs komponentai, tokie kaip juglonas, taninai, flavanoidai, riebalinis aliejus įtakoja farmakologinį poveikį. Medicinoje naudojami juodojo riešutmedţio etanoliniai ekstraktai, nuovirai, uţpilai, kompresai, arbatos. Riešutmedţio ţievė buvo naudojama Amerikoje jau nuo senų laikų. Cherokee, Delaware, Meskwaki ir kt. tautos ţievės arbatą naudodavo kaip vidurius laisvinančią, vėmimimą skatinančią priemonę, taip pat kramtydavo ţievę norėdami numalšinti dantų, galvos skausmą. Garsus XVII a. anglų ţolininkas Nicholas Culpepper sumaišydavo riešutmedţio lapus su medumi, svogūnu ir druska, ir naudodavo šią masę gyvatės arba vorų nuodų ištraukimui po įkandimo. Lapai ir ţievė turi sutraukiantį, dezinfekuojantį poveikį ir yra naudojami odos ligoms gydyti. Jie veiksmingai gydo skrofuliozę, dedervinę, egzemą, aknę. Įrodyta, kad etanolinis lapų ekstraktas veiksmingai gydo ţaizdas: ţaizdos greičiau sugįja, sumaţėja epitelizacijos laikotarpis. Sėklos, kai jose vegetacijos laikotarpiu susikaupia daug riebalinio aliejaus, yra naudingos gydant gangrenas, piktvotes, odos sausgyslių paţeidimus. Juodasis riešutmedis naudojamas gydant grybelinius pėdų susirgimus („atleto pėda“), ţarnyno parazitines infekcijas, tokias kaip ţiedinės kirmėlės. Tyrimai parodė, kad aliejus, išskirtas iš Juglans nigra, turi stiprų antimikrobinį aktyvumą prieš daugelį mielių ir mikroskopinių grybų, įskaitant Candida

albicans, Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus

ir kt. Juodojo riešutmedţio lapų preparatai jau nuo seno naudojami ir tradicinėje kinų medicinoje, kaip priemonė nuo įvairiausių ligų, tame tarpe ir vėţio. Keletas atliktų in vivo tyrimų parodė, kad pagrindinis aktyvus junginys juglonas slopina auglių augimą (Okada et al., 1967; Bhargava and Westfall, 1968; Sugie

et al., 1998; Ji et al., 2009). Taip pat neseniai atlikti tyrimai parodė, kad juglonas turi stiprų citotoksinį

poveikį veikiantį prieš įvairias vėţines ląsteles in vitro (Segura-Aguilar et al., 1992; Cenas et al., 2006; Chen et al., 2009; Ji et al., 2011). [18,23,24,32,34]

Šalia teigiamo farmakologinio poveikio juglonas sukelia eilę nepageidaujamų reiškinių. Apie toksišką poveikį kitiems augalams pradėta kalbėti 1881 m. Šalia juodojo riešutmedţio negali augti obelys kriaušės, juodalksniai, liepos, berţai ir kt. medţiai, vaisiai bei darţovės. [26,29]

1.2 Pagrindinių J. nigra veikliųjų medţiagų charakteristika

1.2.1 Fenoliniai junginiai augalinėje ţaliavoje

Fenoliniai junginiai – tai bene didţiausia antrinių metabolitų grupė, kurią sintetina ir kaupia augalai. Fenolinių junginių pagrindą sudaro fenolis - C6H5OH. Šiuo metu ţinoma daugiau nei 8000

fenolinės struktūros junginių. Augaluose esantys fenoliniai junginiai skirstomi i paprastuosius fenolius, fenolines rūgštis, flavonoidus, taninus, ligninus, kumarinus ir stilbenus. Fenoliniai junginiai – fenoliai, flavonoidai, taninai – yra natūralūs antioksidantai ir yra naudingi ne tik patiems augalams, bet ir ţmonių sveikatai. Jie uţkerta kelią degeneracinių ligų plitimui, nes sumaţina laisvųjų radikalų ir reaktyvaus deguonies poveikį oksidacinio streso metu. Oksidacins stresas gali sukelti DNR ir baltymų paţeidimą, lipidų peroksidaciją, pagreitinti organizmo senėjimo, uţdegiminius procesus, skatinti vėţio išsivystymą. [28,43,46]

Augaluose polifenoliai daţniausiai sutinkami konjuguoti su įvairiais mono ar polisacharidais, prisijungę vieną ar kelias fenolines grupes, arba kaip funkciniai esterių ir metilesterių dariniai. Augalams fenoliniai junginiai reikalingi kaip pigmentai, taip pat augimui ir dauginimuisi, apsaugo nuo ţalingo aplinkos ir kitų patogenų poveikio. [13,36]

Fenoliniai dariniai gali būti ekstrahuojami iš švieţiai nuskintos, šaldytos ar dţiovintos augalinės ţaliavos. Prieš ekstrakciją ţaliava smulkinama, homogenizuojama, dţiovinama ore ar liofilizuojama. Liofilizuojant augalinę ţaliavą joje išlieka didenis kiekis fenolinių junginių, nei dţiovinant ore. Daţniausiai dėl paprastumo, veiksmingumo ir plataus taikymo ekstrahavimui naudojama ekstrakcija tirpikliais. Nuo seno ţinoma, kad ekstrahuotų junginių kiekis priklauso nuo tinkamo solvento parinkimo, ekstrakcijos laiko, temperatūros, taip pat cheminės sudėties ir mėginio fizikinių savybių. Ekstrakcijai daţniausiai naudojami tirpikliai yra metanolis, acetonas, etanolis, etilacetatas bei jų deriniai, maišomi

skirtingomis proporcijomis su vandeniu.[28,46] 1 schema. Fenolinių junginių analizės etapai ir metodai

Po ekstrakcijos tirpale be fenolinių junginių yra daug angliavandenių ir/arba lipidinės kilmės medţiagų. Todėl polifenolių frakciją reikia sukoncentruoti. Tai galima padaryti kietafazės ekstrakcijos, kolonėlinės chromatografijos ar kt. metodais. Natūralūs fenoliai domina mokslininkus daugeliu poţiūrių (antioksidantinis, sutraukiantis poveikis, savo spalva ir kt.). Todėl tinkamos tyrimo strategijos parinkimas priklauso nuo to, kokie yra tyrimo tikslai. Daţniausios yra dvi fenolių analizės kryptys: tiriamas bendrasis fenolių kiekis mėginyje arba vertinami konkrečios grupės ar klasės fenoliai. Tyrimo metodai: spektrofotometrija, dujų/skysčių chromatografija, branduolių magnetinis rezonansas ir kt. Polifenolinių junginių analizės etapai pavaizduoti 1 schemoje. [28,46]

1.2.2 Naftochinonai

Naftochinonai priklauso fenolinių junginių poklasiui. Jie yra viena iš antrinių metabolitų grupių plačiai paplitusi gamtoje. Didţiausią naftochinonų kiekį turinčios augalų šeimos yra: Bignoniaceae,

aktinomicetų (Streptomyces), grybų (Fusarium, Marasmius, Verticillium), kerpių bei dumblių antriniai medţiagų apykaitos produktai. [21]

Naftochinonų struktūros pagrindą sudaro biciklinė sistema – naftalenas, kuriame pakaitai gali būti išsidėstę pozicijose C1 ir C4 (1,4 - naftochinonai) arba C1 ir C2 (1,2 - naftochinonai). Taip pat ţinomi dimeriniai ir trimeriniai naftochinonai. Daugelis iš jų yra spalvoti junginiai. Spalvos daţniausiai svyruoja nuo geltonos, oranţinės iki rudos. [21]

Beveik visi naftochinonai tirpsta alkoholyje, acetone, chloroforme, benzene ir acto rūgštyje, plumbaginas ir juglonas šiek tiek tirpsta karštame vandenyje. Paprasčiausi savo struktūra ir labiausiai gamtoje paplitę naftochinonai yra juglonas, plumbaginas, lavsonas ir lapacholis (1 lentelė). [21]

1 lentelė. Pagrindinių naftochinonų struktūra, pavadinimai, charakteristikos Pakaitai Sistematinis (Trivialus pavadinmas) Molekulinė masė Lydymosi temperatūra [°C] _ 1,4-naftochinonas 158.15 119 – 122 R3 = -OH 5-hidroksi-1,4- naftochinonas (juglonas) 174.14 155 R1 = -OH 2-hidroksi-1,4- naftochinonas (lavsonas) 174.15 192 – 195 R1 = -CH3, R3 = -OH 5-hidroksi-2-metil-1,4- naftochinonas (plumbaginas) 188.18 78 – 79 R1 = -CH3 2-metil-1,4- naftochinonas (menadionas) 172.18 105 – 107 R3, R6 = -OH 5,8-dihidroksi-1,4- naftochinonas (naftazalinas) 190.16 237 R1, R3, R5 = -OH 2,5,7-trihidroksi-1,4- naftochinonas (flaviolinas) 206.17 164 – 168.5 R1 = - CHOHCH2CH=C(CH3)2 5,8-dihidroksi-2- (1-hidroksi-4-288.30 Neţinoma

R3, R6 – OH metilpent- 3-enil)-1,4- naftochinonas (šikoninas) R1 = -OH R2 = -CH2CH=C(CH3)2 2-hidroksi-3-(3- metil-butil-2-enil)-1,4- naftochinonas (lapacholis) 242.27 141 – 143

Naftochinonai kaupiasi augalų šaknyse, lapuose, ţievėje, vaisiuose, medienoje, ţieduose. [21] Naftochinonai turi didelę fiziologinę svarbą. Jų molekulinės struktūros turi redukcinių savybių, todėl dalyvauja daugelyje biologinių oksidacinių procesų. Ubichinonas, plastichinonas ir vitaminas K - funkcinės sudedamosios biocheminių sistemų dalys. Liaudies medicinoje, ypač tarp Indijos gyventojų, augalai, turintys naftochinonų buvo naudojami įvairių ligų gydymui. Naftochinonams priskiriamas antibakterinis, fungicidinis, antiparazitinis, insekticidinis, priešuţdegiminis, antipiretinis, proliferaciją slopinantis, citotoksinis poveikis. Jie taip pat turi poveikį širdies ir kraujagyslių bei reprodukcinei sistemoms. Naftochinonų veikimo mechanizmas gana platus ir sudėtingas – jie jungiasi prie DNR ir slopina replikacijos procesus, sąveikauja su daugeliu baltymų (fermentų), sutrikdo ląstelių ir mitochondrijų membranų veiklą, kvėpavimo grandinės procesus, vykstančius ant mitochondrijų membranų. [21,22,41]

1.2.2.1 Plumbaginas

Plumbaginas (5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas) cheminiu atţvilgiu yra hidroksinaftochinonas. Šis junginys pirmą kartą izoliuotas iš Plumbago genties augalų. Taip pat aptinkamas ir juodajame riešutmedyje, tačiau jo kiekis maţesnis uţ pagrindinį komponentą jugloną. [21,40]

Plumbaginas pasiţymi neuroprotekciniu, priešuţdegiminiu, priešvirusiniu, antimaliariniu, kardiotoniniu, imunosupresiniu poveikiais. Skirtingai nei juglonas plumbaginas turi antioksidacinį veikimą. [21]

1.2.2.2 Juglonas

Juglonas (5-hidroksi-1,4-naftochinonas) priklauso naftochinonų grupei. Tai pagrindinis biologiškai aktyvus J. nigra komponentas. Jis taip pat nusatomas ir J. regia rūšies medţiuose.[16]

Juglonas sunkiai tirpsta karštame vandenyje, tirpus etanolyje, acetone, chloroforme, benzene, acto r. [53]

Juglono prekursoriai didelėmis koncentracijomis kaupiasi pumpuruose, ţieduose, vaisiuose ir karnienoje. Jie koncetruojasi greitai besidauginančiose augalo ląstelėse. Esant oksidacinėms sąlygoms, pavyzdţiui, kai audinys yra paţeidţiamas, formuojasi juglonas. Juglono sintezės etapai pavaizduoti 2 schemoje. [29]

Juglonas riešutmedyje egzistuoja netoksinėje – hidrojuglono - formoje. Juglono buvimas redukuotoje formoje priklauso nuo gliukozės koncentracijos medţio ląstelėse. Hidrojuglonas yra bespalvis, juglonas – tamsiai rudos spalvos. Didţiausia juglono ir hidrojuglono koncetracija yra riešutmedţio butonuose, riešuto kevale ir šaknyse. Stiebe ir lapuose ši koncentracija maţesnė.[14]

Juglonas pasiţymi antimikrobiniu, priešvėţiniu, vidurius laisvinančiu, odos ligas gydančiu poveikiu. Nepaisant plataus farmakologinio poveikio nėra ištirti aiškūs juglono poveikio mechanizmai [17]

2 schema. Metabolinis juglono sintezės kelias Juglans rūšies augaluose. Reakcija X – grįţtamoji (Coder, 1982)

1.2.3. Flavonoidai

Flavonoidai – tai grupė polifenolinių junginių. Jų priskaičiuojama iki 6,5 tūkstančio, kurių cheminė sandara yra nustatyta. Flavonoidai plačiai paplitę augalų karalystėje ir gali būti randami beveik visų rūšių augaluose, taip pat kai kuriuose dumbliuose, samanose, kerpsamanėse. [5,7,19]

Pirmieji flavonoidų tyrimai buvo pradėti 1936 m., kai vengrų mokslininkas Albert Szent-Gyorgi atrado sinergistinį vitamino C ir dar neţinomo kofaktoriaus iš citrinos ţievelės ryšį. Pirmiausiai neţinomą medţiagą jis pavadino “citrin”, o tik vėliau ji gavo kitą pavadinimą – “vitaminas P”. [44]

Flavonoidai egzistuoja kaip aglikonai, glikozidai ir metilinti dariniai. Augaluose flavonoidų aglikonai egzistuoja daugelyje struktūrinių formų. Flavonoidai turi C6 – C3 – C6 molekulinę grupę. Jų struktūros pagrindą sudaro flavanas (2-fenil-benzo-γ-pirono ţiedas), sudarytas iš dviejų benzeno ţiedų (A ir B), kuriuos jungia heterociklinis pirano ţiedas (C) (3 pav.). [5,44]

3 pav. Flavonoidų struktūra

Falvanoidai klasifikuojami pagal propaninio fragmento oksidacijos laipsnį, šoninio fenilo radikalo padėtį, heterociklo dydį, prisijungusių cukrų molekulių kiekį, cukrų prisijungimo prie aglikono pobūdį. Pagrindinės flavanoidų grupės: [5,39]

1. Flavonai. Tai benzo-γ-pirono dariniai (4 pav.). C2-C3 turi dvigubą jungtį. Ţinoma apie 500 atstovų,

pagrindiniai iš jų: luteolinas, apigeninas, viteksinas, chrizinas, diosmetinas, diosminas.

2. Flavonoliai. Geltonos spalvos medţiagos. 3 pozicijoje turi hidroksilo grupę, C2-C3 – dviguba jungtis (5

pav). Nustatyta apie 200 atstovų. Pagrindiniai atstovai: kvercetinas, kemferolis, rutinas, miricetinas, morinas, fizetinas, galanginas, ramnetinas.

5 pav. Flavonolio ir flavonolio darinių struktūrinės formulės

3. Flavononai (dihidroflavononai). Lyginant su flavonais ir flavonoliais nebelieka dvigubos C2-C3 jungties

(6 pav.). Pasiţymi vitamininiu – P aktyvumu. Turi apie 30 atstovų. Pagrindiniai atstovai: eriodiktinas, likviritinas, likviritigeninas.

4. Flavanonoliai (dihidroflavonoliai) (6 pav.). Nėra dvigubos jungties tarp C2-C3, 3 padėtyje yra hidroksilo

grupė. Pagrindiniai atstovai: pinobaksinas, taksifolinas, silibininas, silimarinas.

6 pav. Flovonono ir flavanonolio struktūra

5. Flavan-3-oliai (katechino tipas) (7 pav.). Pagrindiniai atstovai: ketechinas, epikatechinas.

6. Leukoantocianidinai (flavan-3,4-dioliai) (8 pav.). Pagrindiniai atstovai: leukoantocianidinas, leukopianidinas.

7. Antocianidinai. Augalų pigmentai (nuo roţinės iki juodai-violetinės spalvos) (9 pav.). Pagrindiniai atstovai: antocianas, malvidinas, cianidinas.

8. Chalkonai (10 pav.). Pagrindiniai atstovai: chalkonas, izolikviritinas, 3,4-dihidroksichalkonas.

9 pav. Antocianidino struktūra. 10 pav. Chalkono struktūrinė formulė.

9. Auronai. Struktūroje turi benzopirano ţiedą (11 pav.). Pagrindiniai atstovai: auronas, 3,4 – dihidroksiauronas.

10. Izoflavonoidai (11 pav.). Pagrindiniai atstovai: ononinas, genistinas.

11 pav. Aurono ir izoflavono struktūra

11. Neoflavonoidai (12 pav.). Egzistuoja nedidelis kiekis junginių. Atstovai: dalberginas, nivetinas.

12. Biflavonoidai. Formulės schema - (C6-C3-C6)2 (12 pav.). Pagrindiniai atstovai: ginkgetinas,

bilobetinas, amentoflavonas.

1.2.3.1 Flavonoidų fiziko – cheminės savybės

Flavonoidai yra kristalinės medţiagos, jiems būdinga pastovi lydymosi temperatūra. Dauguma junginių yra spalvotos medţiagos, kurių spalva – šviesiai geltona, tamsiai geltona ar gelsvai oranţinė (flavonai, flavonoliai, chelkonai, auronai). Katechinai, flavanonai, izoflavonai, leukocianidinai – bespalvės medţiagos. Tirpumas priklauso nuo glikozidinimo laipsnio. Glikozidai gerai tripsta vandenyje, spirito ir vandens mišinyje. Aglikonai visada gerai tirpsta nepoliniuose organiniuose tirpikliuose – eteryje, etilacetate, spirite. Daugumai flavanoidų, išskyrus aglikonus, būdingas optinis aktyvmas. Dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose. [5]

1.2.3.2 Flavonoidų reikšmė augalams

Flavonoidai randami darţovėse, vaisiuose, riešutuose, sėklose, stiebuose, arbatoje, vyne. Flavonoidai yra natūralūs augalų pigmentai. Pigmentas antocianinas suteikia spalvą ţiedams ir prisideda prie augalų lytinio daugunimosi funkcijos. Taip pat jis absorbuoja ţalios spalvos bangas, taip apsaugodamas chloroplastus nuo ţalingo stiprios apšvitos poveikio. Flavanoidai, esantys augalo lapuose, apsaugo jį nuo grybelių, infekcijų, UV spinduliuotės, maţina aplinkos stresinių veiksnių poveikį ir gerina augalo prisitaikymą gamtoje. Taip pat manoma, kad jie didina augalo prisitaikymą prie temperatūrinio streso. Flavanoidai, kartu su kitais fenoliniais junginiais, apsaugo augalą nuo ţolėdţių – vabzdţių ir ţinduolių. Taip pat nustatyta, kad flavanoidai dalyvauja fotosensibilizacijos, energijos perdavimo, kvėpavimo, fotosintezės kontrolės reakcijose. [16,44]

1.2.3.3 Flavonoidų panaudojimo medicinoje galimybės

Ţmogus flavonoidus pasisavina su maistu, taip pat vynu, arbata. Daugelis flavanoidų yra beveik netoksiški, todėl labai plačiai naudojami medicinoje. Flavanoidai veikia širdies sistemą, pasiţymi cholesterolį, osteoporozę maţinančiu poveikiu. Atlikta daug tyrimų ir patvirtinta, kad flavanoidai turi priešgrybelinį, antibakterinį poveikį, todėl jau nuo senų laikų buvo naudojami kaip natūralūs antibiotikai. Vis dėl to plačiausiai ţinoma apie antioksidantinį flavonoidų veikimą. [19,39]

Dėl savo antioksidantinių savybių flavonoidai turi didelę įtaką širdies – kraujagyslių sistemai. Jie apsaugo kraujagyslių endotelį nuo laisvųjų radikalų poveikio, maţina aterosklerozinius pakitimus, maţina riziką susirgti koronarine širdies liga. Flavonoidų vartojimas taip pat maţina demencijos riziką. Atlikti

tyrimai parodė, kad 3 – metilkvercetinas turi teigiamą chronotropinį poveikį širdţiai ir pasiţymi kairiojo prieširdţio aritmogeniniu veikimu. Buvo tirtas ir liuteolino, apigenino ir genisteino glikozidų antihipertenzinis poveikis, kuris buvo didesnis nei vaisto papaverino. Kvercetinas, miricetinas ir kemferolis ir kiti flavonoidai inhibuoja trombocitų agregacija, todėl pasiţymi antitromboziniu efektu. Flavonolių antitrombozinis poveikis pasireiškia dėl to, kad jie suriša laisvuosius radikalus, tuo pačiu metu išlaikydami tinkamą azoto ir prostaciklino koncentraciją endotelyje. [19,39]

Kvercetinas pasiţymi priešuţdegiminėmis savybėmis. Jis uţdegiminio proceso metu inhibuoja ciklooksigenazę ir lipooksigenazę, ir neleidţia formuotis tolesniems uţdegimo mediatoriams. Kita priešuţdegiminė flavanoidų savybė yra gebėjimas slopinti neutrofilų degranuliaciją. Tai tiesioginis būdas sumaţinti arachidono rūgšries išskyrimą iš neutrofilų ir kitų imuninių ląstelių.[19]

Silimarinas labiausiai iš visų flavanoidų pasiţymi hepatoprotekciniu poveikiu. Jis normalizuoja kepenų ląstelių fosfolipidų sintezę, maţindamas kepenų suriebėjimą. Kepenis saugantį ir regeneruojantį poveikį taip pat turi rutinas ir venorutinas. Flavonoidai gali būti saugiai ir veiksmingai naudojami gydant kepenų disfunkciją, virškinamojo trakto sutrikimus (pykinimą, pilvo skausmą, apetito netekimą). [39]

Kvercetinas ir rutinas naudojamas gydant kapiliarų trapumą ir flebosklerozę.[39]

Flavonoidai pasiţymi antimikrobiniu (antivirusiniu, antibakteriniu ir priešgrybeliniu) veikimu. Prieš flavonoidus jautrūs Herpes simplex, ŢIV, respiracinis sincicinis, poliovirusas, adenovirusas. Flavonoidai esantys glikozidinėje formoje yra labiau veiksmingesni prieš roto virusą, nei tie, kurie yra aglikono formoje. Daugelis flavanoidų veikia Streptococcus padermes, Staphylococcus albus, Escherichia

coli, Clostridium perfingens, rutinui, naringinui, baikalinui ir hidroksietilrutozinui yra jautri Pseudomonas aeruginosa. Chlorflavoninas buvo pirmasis chloro turinti flavonoidas, priešgrybelinis antibiotikas,

išgaunamas iš Aspergillus candidus štamų. [19,39]

Flavonoidų priešvėţinis veikimas taip pat siejamas su antioksidantinėmis savybėmis. Kai kurie flavonoidai (fisetinas, liuteolinas) slopina ląstelių proliferaciją. Tačiau priešvėţinis flavonoidų veikimas iki galo gerai neištirtas. [19]

1.3 Antioksidacinis aktyvumas

Laisvieji radikalai – tai molekulės, atomai ar jonai, turintys neporinį elektroną savo orbitoje. Molekulė yra stabili tik tuomet, kai turi porinį elektronų skaičių. Taigi laisvieji radikalai – tai nestabilios molekulės, atakuojančios kitas molekules ir prisijungiančios elektroną. Laisvųjų radikalų reakcijos

prasideda dėl įvairių reaktyvių deguonies junginių: superoksido radikalo (O2•-), hidroksilo radikalo (•OH), azoto monoksido (NO•), peroksilo radikalo (ROO•), vandenilio peroksido (H2O2), hipochlorinės

rūgšties (HOCl), singuletinio deguonies (1

O2) ir kitų. Jie reguodami su kitomis medţiagomis (ne

radikalais), skatina naujų radikalų susidarymą, vyksta grandininės reakcijos. Radikalai formuojasi keliais mechanizmais veikiant vidiniams ir išoriniams faktoriams. Vidiniai veiksniai skatinantys laisvųjų radikalų susidarymą yra audinių kvėpavimas, fermentinės, autooksidacijos ir fagocitozės reakcijos. Cigarečių dūmai (rūkant aktyviai ar pasyviai) taip pat turi laisvųjų radikalų. Įkvėpus jų, audiniuose sutrinka kraujotakos reguliavimo mechanizmai – nuo endotelio priklausoma vazorelaksacija, trombocitų agregacija, išsivysto endotelio ląstelių disfunkcija. Laisvųjų radikalų susidarymui turi įtakos net ir kai kurie ksenobiotikai (paracetamolis, bleomicinas, antracikliniai antibiotikai). Paprastai natūrali organizmo gynybinė sistema šiuos laisvuosius radikalus neutralizuoja, paversdama juos neţalingais. Neigiamas išorinės aplinkos poveikis: UV spinduliavimas, aplinkos teršalai, rūkymas ir alkoholis. [1,8,10]

Ryškiausias laisvųjų radikalų poveikio pavyzdys yra uţdegiminės, lėtinės ligos: aterosklerozė, kancerogenezė, cukrinio diabeto komplikacijos, katarakta, reumatoidinis artritas ir kt. Oksidacinis stresas yra viena iš organizmo senėjimo prieţasčių. [11]

Antioksidantai yra svarbūs mitybos komponentai, kurie neleidţia susidaryti laisviesiems radikalams, juos slopina arba dalyvauja jų suardymo procese, taip padeda išvengti oksidacinio streso ir lėtina bendruosius senėjimo procesus bei saugo nuo lėtinių ligų. [11]

Antioksidantais daţniausiai vadinamos medţiagos, kurių maţi kiekiai yra pakankamai efektyvūs slopinant ar visiškai sustabdant oksidacijos procesus. Jie slopina laisvųjų radikalų susidarymą, pašalina juos arba skatina jų suirimą ir taip saugo organizmą nuo galimo ţalingo poveikio audiniams. Organizme vienodai svarbios ir endogeninės, ir egzogeninės apsauginės antioksidacinės sistemos, saugančios ląstelių komponentus nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio. Pagal veikimo mechanizmą antioksidantus galima skirstyti į tris pagrindines grupes: fermentus antioksidantus, grandininę reakciją nutraukiančius antioksidantus bei kintamo valentingumo metalus surišančius baltymus. [2]

Didelis antioksidacinis aktyvumas būdingas polifenoliniams junginiams, o ypač flavonoidams. Flavonoidai gali slopinti laisvųjų radikalų susidarymą, vykstantį keliais skirtingais mechanizmais, taip pat jie gali sustiprinti endogeninių antioksidantų veikimą. [11]

Flavonoidai priskiriami prie riebaluose tirpių, egzogeninių antioksidantų. Yra nustatyta, kad šių medţiagų antioksidacinis veikimas gali pasireikšti keliais mechanizmais: 1) tiesiogiai prijungiant laisvuosius radikalus; 2) surišant pereinamųjų metalų jonus; 3) sąveikaujant su lipidų bisluoksniu biomembranose; 4) veikiant antioksidacinę ląstelės sistemą. [1]

1.3.1. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas augalinėje ţaliavoje

Antioksidacinis aktyvumas augalinėje ţaliavoje gali būti nustatomas šiais metodais: fotometriniu DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo), 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS•+) radikalų sujungimo, fluorimetriniais metodais (AMR, skopoletino), β-karoteno blukimo testu, metil linoleato peroksidacija, luminolio (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) cheminės liuminescencijos inhibavimo, geleţies tiocianato susidarymo slopinimo, kapiliarinės elektroforezės, geleţies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymo, ESC ir kt. metodais. Sudėtiniuose mišiniuose, tokiuose kaip augalinės ţaliavos ekstraktai ir maisto bandiniai, spektrofotometriniu metodu nustatomas tik visų bandinyje esančių junginių suminis antioksidacinis aktyvumas ir negalima nustatyti atskirų komponentų bendroje antioksidantų sudėtyje. Atskrų junginių antioksidacinį veikimą galima nustatyti ESC (efektyviosios skysčių chromatografijos) pokolonėliniais metodais. [4,9,11,31]

Daţnai naudojamas, palyginus pigus, greitas ir tikslus yra DPPH radikalų sujungimo metodas. DPPH yra stabilus, ilgai gyvuojantis organinis azoto radikalas. Tai tamsiai violetinės spalvos kristalai, tirpstantys organiniuose tirpikliuose. DPPH radikalų prieš naudojimą nereikia aktyvinti, pakanka ištirpinti reikiamą jų kiekį. Violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasiţyminčių junginių į blankiai geltoną hidraziną. [4,14]

Vandenilio peroksido kiekį galima nustatyti fluorimetriniu metodu naudojant specifinius šiam tyrimui Amplex red (AMR) ir krienų peroksidazės (HPR) reagentus. Tai jautrus, vieno ţingsnio metodas. Kai terpėje yra HPR, Amplex red reaguoja su H2O2 santykiu 1:1. Šios reakcijos metu išsiskiria raudonai

fluorescuojantis oksidacijos produktas – resurfinas. AMR sunaudoja stoichiometrinį H2O2 kiekį.

Papildomai naudojant superoksido dismutazę (SOD) šiuo metodu galima nustatyti ir superoksido radikalą (O2•-). SOD paverčia superoksido radikalą į H2O2, toliau vyksta oksidacijos reakcija susidarant

fluorescuojančiam produktui. Šiuo metodu nustatomas bandinyje esančių junginių suminis antioksidacinis aktyvumas. [31,38]

1.3.2. Prooksidacinis aktyvumas

Nors daţnai pabrėţiamas fenolinių junginių antioksidacinis veikimas, esant tam tikroms sąlygoms jie gali elgtis kaip prooksidantai, t.y. virsti cheminėmis medţiagomis, sukeliančiomis oksidacinį stresą. [33]

Tačiau prooksidacinis poveikis gali būti ne tik ţalingas, bet ir naudingas. Jis sukelia lengvo laipsnio oksidacinį stresą, suaktyvina ląstelių antioksidacinę apsaugą ir netgi gali padidinti ksenobiotikus metabolizuojančių fermentų kiekį, o šių veiksnių pasekoje ląstelė apsaugoma nuo ţalingo aplinkos poveikio.[33]

1.4. Skystųjų preparatų gamybos metodai

1.4.1 Tinktūrų gamyba

Tinktūros – tai skystieji ruošiniai (skystosios ištraukos), daţniausiai gaminamos iš sausos augalinės ar gyvūninės kilmės. Tinktūrų gamybos būdai yra šie:

1) Maceracija; 2) Perkoliacija; 3) Turboekstrakcija; 4) Gamyba iš ekstraktų.

Gaminant tiktūras iš ţaliavos, kuri turi stipriai veikiančių medţiagų, iš 1 ţaliavos masės dalies gaunama 10 tūrio dalių tinktūros (santykis 1:10). Jei augalinėje ţaliavoje nėra stipriai veikiančių medţiagų gamybos santykis yra 1:5. [3]

Pagrindinės tinktūrų gamybos stadijos yra ekstrakcija, išvalymas ir standartizavimas.

Maceracijos metodas yra pats seniausias ir paprasčiausias. Sausa ţaliava susmulkinama, dedama į sandarų indą ir uţpilama apskaičiuotu kiekiu ekstrahento. Taip ekstrahuojama 5-7 paras. Maceracijos metodo trūkumai:

 Ilgai tęsiasi, nes lėtai vyksta difuzija;  Ekstrahentui išgaravus susidaro nuostolių;  Išbrinkusią ţaliavą sunku mašyti;

 Dideli difuzijos proceso nuostoliai.

Pranašesnis uţ maceraciją yra perkoliacijos metodas. Naudojant šį metodą pro ektrahuojamos medţiagos sluoksnį tam tikru greičiu košiamas ektrahentas. Ekstrahentui judant iš ţaliavos į tirpiklį difunduoja ekstrakcinės medţiagos. Pagrindinis perkoliacijos pranašumas – ţaliava plaunama vis naujomis tirpilio porcijomis, palaikomas didelis koncentracijos skirtumas. [3]

1.4.2 Vandeninės ištraukos

Uţpilai ir nuovirai – vaistaţolių ištraukų vandeniniai tirpalai. Gaminant uţpilus ir nuovirus, augalinė ţaliava turi būti tam tikro smulkumo, nes nuo to priklauso biologiškai aktyvių junginių išsiekstrahavimas.[3]

Uţpilas (lot. infusum) ruošiamas iš tų vaistinių augalų dalių, kurios palyginti lengvai atiduoda savo veikliąsias medţiagas – tai ţolė, lapai, ţiedai, švieţi vaisiai. Uţpilą galima gaminti tiek šaltu, tiek karštu būdu. Karštuoju būdu kaitinama 15 min., aušinama 45 min.

Nuoviras (lot. decoctum) ruošiamas iš tų vaistinių augalų dalių, kurios palyginti sunkiai atiduoda savo veikliąsias medţiagas – tai ţievė, šaknys, šakniastiebiai, mediena, stambūs lapai, išdţiovinti vaisiai. Augalinė ţaliava kaitinama 30 min., aušinama 10 min.[3]

Vandeninių ištraukų gamybos stadijos: ţaliavos smulkinimas, sijojimas, kaitinimas, tūrio korekcija.

Vandens kiekis apskaičiuojamas naudojant vandens sugerties koeficientą. Jeigu nenustatyta kitaip šaknims šis koeficientas lygus 1,5 karto daugiau uţ ţaliavos masę, o lapams, ţolei ir ţievei – 2 kartus daugiau.[3]

2. METODIKA

2.1. Naudoti reagentai ir aparatūra

2.1.1 Naudoti reagentai

1) C2H5OH - etanolis 96% (UAB „Stumbras“ Lietuva);

2) HCl - vandenilio chloridas (Sigma, Vokietija); 3) Zn - cinkas (Merck, Vokietija)

4) H3BO3 - boro rūgštis (Sigma, Vokietija);

5) C6H8O7 - citrinų rūgštis (Merck, Vokietija);

6) Pb(CH3COO)2 - švino acetatas (Sigma, Vokietija);

7) NH4OH - amonio hidroksidas (Reachim, Rusja);

8) Folin- Ciocalteu reagentas (Sigma, Šveicarija); 9) Na2CO3 - Natrio karbonatas (Merck, Vokietija);

10) (CH3)2CO – acetonas (Lachema, Čekija);

11) H2O2 - Vandenilio peroksidas 3% (Sigma – Aldrich, Nr. 216763);

12) Fosfatinis buferis (PBS);

13) C14H11NO4 - Amplex red (AMR) (Sigma, Vokietija);

14) Krienų peroksidazė (HPR) (Sigma, Vokietija);

15) AlCl3 – aliuminio trichloridas (Sigma – Aldrich, JAV);

16) NaNO2 – nitrito r. (Merc, Vokietija);

17) NaOH – natrio hidroksidas (Sigma, Vokeitija).

Medţiagos standartams:

1) Galo rūgštis (Sigma, Vokietija); 2) Rutinas (Sigma, Vokietija);

3) Juglonas (Sigma – Aldrich, JAV. Nr. H47003).

2.1.2 Naudota aparatūra

1) Sietų rinkinys kvadratinėmis angelėmis (Nr. 20);

3) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company, Limited 1998 Japonija;

4) Spektrofotometras “UNICOM UV/VIS“;

5) Fluorimetras “Fluorascan Ascent Themo Scientific”.

2.2. Tyrimo objektai

Baigiamojo darbo tyrimo objektai: 1) Etanolinė J. nigra tinktūra; 2) Vandeninė J. nigra lapų ištrauka;

3) Gamyklinis “Black Walnut” nealkoholinis ekstraktas, santykis 1:1 (gamintojas „Nature's Answer”, JAV), 30ml. Gamintojas nurodo, kad ekstraktui gaminti buvo naudojamas etanolis, tačiau tolesnėse gamybos stadijose jis pašalintas.

2.3 Ţaliava

Juodojo riešutmedţio ţaliava rinkta Vytauto Didţiojo botanikos sode 2012 metų geguţės mėnesį. Lapai skinami išsivystę. Lapai dţiovinami ant švaraus popieriaus, pavėsyje. Paruošta ţaliava pakuojama į popierinius maišus, laikoma gerai vėdinamoje, vėsioje, tamsioje patalpoje.

2.4 Skystųjų preparatų iš J. nigra gamyba

2.4.1 Etanolinės tinktūros ruošimas

Etanolinė J. nigra tiktūra buvo gaminama perkoliacijos metodu. Tai pagrindinis tinktūrų gamybos metodas. Jo esmė – pro ekstrahuojamos medţiagos sluoksnį tam tikru greičiu košiamas ekstrahentas. Tuo metu ekstrakcinės medţiagos ištirpsta ir difunduoja iš ţaliavos į tirpiklį. [3]

Etanolinės tiktūros gamyba buvo atliekama tokiu būdu. 10 g susmulkintos lapų ţaliavos persijojama per 5 mm sietą ir Petri lėkštelėje suvilgoma 70% (V/V) etanolio. Laikoma 4-6 val. Vyksta brinkimo stadija. Paskui ţaliava perkeliama į perkoliatorių, stengiantis, kad ţaliavos masėje nesusidarytų oro tarpai. Perkoliatoriuje esanti ţaliava uţpilama ekstrahentu taip, kad susidarytų 30-40 mm ekstrahento sluoksnis virš ţaliavos paviršiaus. Ekstrahentas pilamas, esant atidarytam apatiniam perkoliatoriaus

čiaupui. Išbėgęs pro perkoliatoriaus čiaupą skystis supilamas atgal į perkoliatorių ir ţaliava paliekama maceruotis 48 val.[3]

Perkoliavimo stadijos metu atsukamas perkoliatoriaus čiaupas ir sutvarkoma taip, kad per valandą ištekėtų 1/24 perkoliatoriaus tūrio. Perkoliacija tęsiama, kol gaunama 100 ml tinktūros (santykis 1:10).

Ką tik pagaminta tinktūra yra tamsiai ţalios spalvos, drumsta, todėl paliekama nusistovėti 3 paras. Vėliau ji dekantuojama ir filtruojama pro dvigubą marlės sluoksnį.[3]

70% (V/V) etanolio gamyba. Naudotas 96% (V/V) etanolis. Norint apskaičiuoti vandens kiekį, reikalingą 70% etanoliui gauti, naudojama formulė:

X=V×b/a

X – didesnės koncentracijos alkoholio tūris(ml, l); V – norimo skiedimo alkoholio tūris (ml,l); b – norimo skiedimo alkoholio konc., % tūrio; a – stipraus alkoholio konc. %

2.4.2 Vandeninės ištraukos ruošimas

Ištrauka gaminama nuovirų gamybos būdu, santykiu 1:10. 10 g lapų ţaliavos susmulkinama ir persijojama per 20 numerio sietą. Susmulkinti lapai sudedami į kaitinimo kolbą ir uţpilami 120 ml šalto vandens. Vandens kiekis apskaičiuojamas naudojant vandens sugerties koefcientą, kuris šiuo atveju lygus dviem. Kolba kaitinama vandens vonelėje apie 1 val. Ištrauka atvėsinama ir paliekama nusistovėti kelias valandas, o paskui filtruojama pro Vatmano popierių nr. 4. [15,43]

2.5 Biologiškai aktyvių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas

2.5.1 Flavonoidų kokybinis nustatymas

Cianidinė reakcija. Į 2 ml ištraukos įlašinama 5 – 7 lašai koncentruotos HCl ir pridedama 10 – 15 mg metalinio magnio arba cinko. Po 3 – 5 min. atsiranda raudona, oranţinė ar roţinė spalva. Reakcijai pagreitinti rekomenduojama mišinį pakaitinti (2 – 3 min.) verdančioje vandens vonelėje. Flavonolius, flavononus ir flavonus metalinis magnis, esant vandenilio chlorido rūgščiai, redukuoja iki antocianų, kurie

suteikia jiems oranţinę ar raudoną spalvą. Chalkonai ir auronai, pridėjus koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties (be magnio), nusidaţo raudonai, nes susidaro oksonio druskos.[6]

Reakcija su borato ir citrinos rūgštimis. Į 1 – 2 ml tiriamosios ištraukos įpilama toks pat tūris 1% borato ir 1% citrinos rūgščių tirpalo 96% etilo alkoholio mišinio (1:1). Susidaro ryškiai geltona spalva su gelsvai ţalia fluorescencija. 5-oksiflavonai ir 5-oksiflavonoliai reaguoja su borato rūgštimi, esant citrinos rūgščiai. Sudaro ryškiai geltonos ar gelsvai ţalsvos spalvos fluorescuojančius junginius.[6]

Reakcija su amoniako tirpalu. Į 1 ml tiriamosios ištraukos įpilama keletas lašų amoniako tirpalo ir šildoma. Atsiradusi geltona spalva šildant pereina į oranţinę ar raudoną. Flavonai, flavononai, flavonoliai ir flavononoliai su amoniako tirpalu nusidaţo geltona spalva, kuri pereina į oranţinę arba raudoną.[6]

Reakcija su baziniu švino acetatu. Į 1 ml tiriamosios ištraukos įlašinama 3 – 5 lašai 2% švino acetato tirpalo. Gelsvai oranţinė spalva rodo, jog ištraukoje yra flavonoidų.[6]

2.5.2 Fenolinių junginių kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu būdu

Fenoliniai junginiai pasiţymi antimikrobiniu, antioksidaciniu, priešuţdegiminiu, priešvėţiniu ir kitais svarbiais poveikiais, todėl yra svarbu ţinoti, kiek fenolinių junginių kaupia tiriamosios J. nigra tinktūros.[30]

Šiam tyrimui buvo pasirinktas spektrofotometrinis metodas. Tai optinis analizės metodas pagrįstas šviesos absorbcijos matavimu. Spektrofotometrinė analizė yra gana greita ir jai būdingas didelis atrankumas. Metodo privalumai: santykinai nebrangi ir pasiekiama aparatūra, tiriamoji medţiaga tyrimo metu nesuardoma, pasiţymi didele metodikų gausa, kurias galima nesunkiai modifikuoti. Metodo trūkumai: gauti duomenys ne visada atitinka duomenis, nustatytus plačiai paplitusiais ir veiksmingais metodais (efektviąja skysčių ar dujų chromatografija, kapiliarine elektroforeze). Kiekybinio tyrimo, taikant spektrofotometrinį metodą, pagrindas – Bugero, Lamberto, Bero dėsnis. Juo nustatoma optinio tankio tiesioginė priklausomybė nuo šviesą sugeriančios medţiagos koncentracijos tirpale. [6,12]

Bendras fenolinių junginių kiekis juodojo riešutmedţio ekstraktuose nustatytas UV-VIS spektrometru „Unicam Helios“, naudojant Folin- Ciocalteu reagent (Atanassova M., 2011). Tyrimui buvo paruošti standartiniai galo rūgšties 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 mg/ml koncentracijos etaloniniai tirpalai. 1ml kiekvienos koncentracijos galo rūgšties tirpalo sumaišytas su 5 ml paruošto Folin - Ciocalteu reagento (reagentas paruoštas skiedţiant jį su distiliuotu vandeniu 1:10) ir įdedant 4 ml Na

tirpalo. Visų mėginių absorbcija matuota spektrofotometru esant bangos ilgiui 750 nm po 90 min kambario temperatūroje. Fenolinių junginių kiekiui nustatyti paimtas 1 ml tiriamojo tirpalo, sumaišytas su 5ml 1:10 Folin – Ciocalteu reagentu ir 4 ml Na

2CO3 7,5 % vandeninio tirpalo. [20]

2.5.3 Flavonoidų kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu būdu

Flavonoidų kiekiui taip pat buvo naudojamas spektrofotometrinis analizės metodas. Jis pagrįstas flavonoidų savybe sugerti šviesą UV – spektro dalyje. Tyrimui buvo paruošti standartiniai rutino 0,02, 0,04, 0,06, 0,1 mg/ml koncentracijos etaloniniai tirpalai. 1 ml tiriamojo tirpalo buvo sumaišoma su 4 ml distliuoto vandens, 0,3 ml 5% NaNO2. Po 5 min. į kolbutę dedama 0,3 ml 10% AlCl3 tirpalo, 2 ml 1M

NaOH. Turinys skiedţiamas vandeniu iki 10 ml. absorbcijos maksimumas matuojamas ties 510 nm banga.[20]

AlCl3 tirpalo ruošimas. 10 g aliuminio chlorido suberiama į 100 ml kolbą, pripilama distiliuoto

vandens iki 100 ml ţymos.[5]

Rutino etaloninio tirpalo ruošimas. 1 mg rutino ištripinama 1 ml 96% (V/V) etanolio. Iš pagrindinio rutino tirpalo gradavimo grafikui pagaminami 0,02, 0,04, 0,06, 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalai.

2.5.4 Juglono nustatymas

Juglono koncentracija etanolinėje tinktūroje buvo nustatinėjama spektrofotometriniu būdu (Schmid S.K., 1987). Eksperimento metu buvo nustatytos gradavimo grafiko vertės. Juglono standartas (0.002 g) ištirpintas 100 ml 70% (V/V) etanolio, buvo gautos 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml koncentracijos. Gauti tirpalai buvo parūgštinti sieros rūgštimi iki ph 0,8. Absobcija matuojama prie 420 nm bangos. [45]

Kiekvieno tiriamojo paimama po 1 ml ir matavimo kolboje skiedţiama 70% (V/V) etanolio iki 50 ml ţymos. Absorbcija matuojama prie 420 nm bangos.

2.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas

Polifenoliniams junginiams būdingas antioksidacinis aktyvumas dėl jų gebėjimo sujungti laisvuosius radikalus, neutralizuoti reaktyvias deguonies (ROS) formas. Preliminarūs augalinių ţaliavų antioksidacinio aktyvumo tyrimai atliekami in vitro analitiniais metodais.[13]

Antioksidacinis tiriamųjų mėginių aktyvumas buvo tiriamas fluorimetriniu metodu. Tai optinis analizės metodas, kai medţiagos kiekis nustatomas, remiantis fluorescencijos intensyvumu, apšvietus analizuojamą medţiagą UV spinduliais. Fluorescencijos intensyvumas tiesiogiai proporcingas medţiagos koncentracijai. Šiame tyrime vandenilio peroksido (H2O2) aktyvumui nustatyti naudojamas Amplex Red

(10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas) reagentas. Amplex Red reagentas, esant krienų peroksidazei, reaguoja su H2O2 santykiu 1:1. Šios reakcijos metu susidaro raudonai fluorescuojantis resurfinas (14 pav).

Resurfino suţadinimo ir emisijos maksimumas stebimas ties 563 – 587 nm ilgio banga. [12,31,48]

Vandenilio peroksido tirpalo gamyba. Kontrolinis H2O2 tirpalas fluorimetriniam tyrimui buvo

gaminamas iš 3% H2O2 tirpalo. Tirpalo skiedimas buvo pasirinktas eksperimentiškai: 10 µl H2O2 + 990

µl distiliuoto vandens. Paruoštas darbinis tirpalas yra nestabilus, todėl jį reikia gaminti prieš kiekvieną eksperimentą.

1 mM AMR tirpalo gamyba. 10 mM AMR tirpalas prieš eksperimentą skiedţiamas su DMSO: 90 µl DMSO sumaišomas su 10 µl AMR. Tirpalas laikomas šaldiklyje, apsaugotas nuo šviesos. Prieš pat eksperimentą tirpalas atšildoma.

HPR tirpalo paruošimas. 1 mg HPR miltelių ištirpinama 1 ml fosfatinio buferio (PBS) .

PBS tirpalo paruošimas. 800 ml distiliuoto vandens ištirpiname 8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4, 0,24g KH2PO4. Įpilam HCl r. tirpalo iki pH 7,4. Galiausiai pripilame distiliuoto vandens iki 1

litro tūrio ţymos.

Fluorimetrinės lėkštelės šulinėlių tūris yra 200 µl. Tikslūs reagentų tūriai parenkami eksperimentiškai. Į šulinėlį dedamas pasirinktas kiekis tiriamosios medţiagos tirpalo, 10 µl H2O2 tirpalo, 1

µl AMR tirpalo, 2 µl HPR tirpalo ir apskaičiuotas kiekis terpės – fosfatinio buferio. H2O2 tirpalo kiekis

buvo parinktas atsiţvelgiant į H2O2 kalibracinę kreivę.

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Tiriamų parametrų apskaičiavimas ir statistinių duomenų apdorojimas

Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuosiuose mėginiuose buvo apskaičiuotas pagal galo rūgšties gradavimo grafiko tiesės lygtį:

y = 5,45x – 0,027

Bendras flavonoidų kieki tiriamuosiuose junginiuose buvo apskaičiuotas pagal rutino gradavimo grafiko tiesės lygtį:

y = -84,9x + 1,699

Juglono kiekis tiriamuosiuose objektuose buvo apskaičiuotas pagal juglono standarto gradavimo grafiko tiesės lygtį:

y = 2,87x +0,027

Antioksidacinio aktyvumo apskaičiavimas. Antioksidacinis aktyvumas apskaičiuojamas lyginant tiriamųjų mėginių duomenis su kontroliniu mėginiu ir išreiškiamas.

Visi tyrimai su pasirinktais mėginiais buvo atlikti po 3 kartus (n=3). Duomenys statistiškai apdoroti su „Sigmaplot“ programos 12.5 versija.

3.2 Kokybinis flavonoidų nustatymas tiriamuosiuose objektuose

Etanolinei tinktūrai, vandeninei ištraukai ir „Black Walnut“ ekstraktui buvo atliekami flavonoidų kokybės testai. Reakcijos aprašytos metodikoje „2.5.1 Flavonoidų kokybinis nustatymas“.

Tamsi tinktūtų spalva trukdė matyti spalvas, todėl visos tinktūros buvo skiedţiamos kelis kartus. 1) Cianidinė reakcija. Visais atvejais buvo tamsiai raudona spalva. Spalva buvo intensyviausia

“Black Walnut” tinktūros mėginyje.

2) Reakcija su borato ir citrinos rūgštimis. Geltonas reakcijos produktas susidarė visuose mėginiuose. 3) Reakcija su amoniako tirpalu. Reakcija teigiama, visuose mėginiuose. Juos šildant atsiranda gelsva

4) Reakcija su baziniu švino acetate. Tiriamieji tirpalai įgavo gelsvą spalvą, kuri po kurio laiko virsta oranţine.

Teigiamos reakcijos rodo, kad visuose tirtuose mėginiuose yra flavonoidų, todėl yra tikslinga ištirti tiriamųjų skystų J. nigra preparatų bendrą flavonoidų kiekį.

3.2 Spektrofotometrinė analizė

3.3.1 Bendro fenolinių junginių ir bendro flavonoidų kiekio rezultatų įvertinimas

Galo rūgšties ir rutino standartai tyrimams buvo pasirinkti neatsitiktinai. Literatūroje randama daug bendro fenolinių junginių bei bendro flavonoidų kiekio nustatymo tyrimų, kuriuose naudojami būtent šie standartai. [25,40]

Galo r. koncentracija mg/ml 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 A b s o rb c ija , n m 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

K o n c e n tr a c ija , m g /m l G R E 0 10 20 30 40 50 60 70 Etanolinė tinktūra Vandeninė ištrauka "Black Walnut"

16 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis tiriamuosiuose junginiuose. 1 – etanolinė tinktūra, 2 – vandeninė ištrauka, 3 – „Black Walnut“. p<0,05 palyginus duomenis su ekstraktu

Gauti rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais (p<0,05). Didţiausias kiekis fenolinių junginių buvo nustatytas „Black Walnut“ ekstrakte (57,01 mg/ml), kiek maţesnis kiekis – etanolinėje (29,25 mg/ml). Eksperimentas parodė, kad ekstrahentui esant vandeniui išsiehstrahavo maţiausiai fenolinių junginių – 12,84 mg/ml. Kaip matyti iš 16 pav. gamybos metodas ir ekstrahentas turi didelę įtaką fenolinių junginių išekstahavimui iš J. nigra ţaliavos. Ekstrahentui esant etanoliui išsiekstrahuoja daug didesnis kiekis fenolinių junginių nei naudojant vandenį. Nors galutiniame „Black Walnut“ produkte nėra etanolio, jis buvo naudojamas pirmosiomis ekstrakto gamybos stadijose, o tik paskui pašalintas. Tai paaiškina, kodėl šiame ekstrakte aptiktas didţiausias kiekis fenolinių junginių.

Iš literatūroje aptinkamų J. nigra ţaliavos tyrimų didţiausią kiekį polifenolinių junginių sudaro 3-kafeilchininė rūgštis, 5-kafeilchininė rūgštis, 3-kumarilchininė rūgštis, 4-kumarilchininė rūgštis, p-kumaro rūgštis. [25,41] * * 29,25 12,84 57,01 *

Rutino gradavimo grafikas Rutino koncentracija, mg/ml 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 A b s o rb c ija , n m 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

17 pav. Rutino gradavimo grafikas

K o n c e n tr a c ija , m g /m l R E 0 10 20 30 40 50 60 Etanolinė tinktūra Vandeninė ištrauka "Black Walnut"

18 pav. Bendras flavonoidų kiekis tiriamuosiuose mėginiuose. 1 – etanolinė tinktūra, 2 – vandeninė ištrauka, 3 – „Black Walnut“. p<0,05 lyginant su ekstraktu

Panašiu dėsningumu, lyginant su fenoliniais junginiais, pasiskirstė ir flavonoidų kiekiai. Lyginant su rutino ekvivalentais didţiausia koncentracija flavonoidų nustatyta „Black Walnut“ ekstrakte (46,16 mg/ml), etanolinėje tinktūroje ji siekia 17,14 mg/ml. Kaip ir fenolinių junginių, taip ir flavonoidų maţiausias kiekis aptinkamas vandeninėje ištraukoje – 7,56 mg/ml.

* * * 46,16 7,56 17,14

3.3.2 Juglono kiekio nustatymas tiriamuosiuose objektuose

Juglonas yra svarbiausias aktyvus komponentas juodojo riešutmedţio ţaliavoje, todėl yra aktualu ţinoti, koks kiekis juglono gali būti aptinkamas Lietuvoje augančio J. nigra medţių lapuose bei palyginti juglono kiekį su rinkoje esančia gamykline tinktūra.

Literatūros duomenimis visi Juglandaceae šeimos augalai kaupia jugloną, tačiau būtent juodajame riešumedyje jo kiekis yra didţiausias. [27]

Juglono koc. mg/ml 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 A b s o rb c ija 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

19 pav. Juglono gradavimo gafikas

2 lentelė. Juglono kiekis tiriamuosiuose mėginiuose (vidurkis±standartinis nuokrypis, mg/1 ml) Tiriamieji mėginiai Juglono kiekis (mg juglono/1ml tinktūros)

Etanolinė 2,79±0,02

Vandeninė Neaptikta

„Black Walnut“ 15,1±0,04

Juglono kiekis tiriamuosiuose mėginiuose buvo apskaičiuojamas pagal juglono gradavimo grafiką (19 pav.). Didţiausias kiekis juglono buvo aptiktas gamykliniame „Black Walnut“ ekstrakte (15,1 mg/ml). Kiek maţesnis kiekis – etanolinėje tinktūroje (2,79 mg/ml). Juglono visiškai neaptikta vandeninėje ištraukoje. Tačiau tai nestebina, nes juglonas netirpsta šaltame vandenyje, nebent nedidelis jo

kiekis gali ištirpti karštame vandenyje. Šį rezultatą patvirtina ir J.A. Pereira ir kt. (2007 m.) atliktas tyrimas. Vandeninė J. nigra lapų ištrauka buvo tirta HPLC - DAD metodu, juglono šiame mėginyje nebuvo rasta. [43]

Neseniai Paudel P. ir kt. (2013) atliktame tyrime buvo analizuojama J. nigra eterinio aliejaus sudėtis. Ţaliava buvo surinkta Alabamoje (JAV), išskirtas eterinis aliejus analizuotas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos būdu. Nustatyta, kad 31,5 mg eterinio aliejaus, gauto iš 374,3 g lapų masės, yra 2,77 mg (8,8%) juglono. [37]

Willis R. J. (2000 m.) nustatė, kad juglono kiekis riešutmedţio lapuose, riešutuose, šaknyse svyruoja 0,1 – 5 proc. intervalo ribose (skaičiuojant nuo sausos medţiagos masės), ir yra priklausomas nuo augimo sezono bei naudojamo ekstrakcijos metodo. Vegetacijos sezono pabaigoje daţniausiai aptinkami maţi juglono kiekiai. [27]

3.4 Fluorimetrinė analizė

3.4.1 Antioksidacinis aktyvumas

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas tiriamuosiuose objektuose yra reikšmingas, nes parodo jų gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus.

Kad geriau įvertinti antioksidacinį aktyvumą ir stebėti fenolinių junginių įtaką H2O2 radikalo

neutralizavimui buvo dedami skirtingi tūriai tiriamųjų medţiagų. Tiriant skystuosius vandeninius ir etanolinius J. nigra preparatus pastebėta antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo bendro fenolinių junginių kiekio – didėjant fenolinių junginių kiekiui didėja H2O2 radikalo neutralizavimo geba.

Pro ce n ta i, % 0 20 40 60 80 100 120 Kontrolinis

0,15 mg/ml GRE fenolinių jung. 0,3 mg/ml GREfenolinių jung. 0,59 mg/ml GRE fenolinių jung. 0,05 mg /ml GRE fenolinių jung.

21 pav. H2O2 kitimas veikiant jį skirtingais etanolinės tinktūros kiekiais, turinčiais skirtingą kiekį

fenolinių junginių. p < 0,05 lyginant su kontrole

Antioksidacinis aktyvumas apskaičiuojamas iš fluorimetru gautų duomenų, prieš tai įvertinus mėginių praskiedimą. Didţiausio praskiedimo mėginys, turintis 0,05 mg/ml fenolinių junginių neutralizavo 34,3 proc. H2O2. Tiriamieji mėginiai, kuriuose yra 0,15 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,59 mg/ml

fenolinių junginių pagal GRE atitinkamai neutralizavo 56,5 proc., 78,5 proc. ir 94,4 proc. H2O2.

Rezultatai rodo, kad lapų etanoliniiai ekstraktai gali būti naudojami kaip lengvai prieinamas natūralių antioksidantų šaltinis.

100% 44.5% 21.5% 5.6% 65,7% * * * * *

Pro ce n ta i, % 0 20 40 60 80 100 120 Kontrolinis mėginys

0,06 mg/ml GRE fenolinių jung. 0,14 mg/ml GRE fenolinių jung. 0,43 mg/ml fenolinių jung. 0,76 mg/ml fenolinių jung.

22. pav. H2O2 kitimas veikiant jį skirtingais vandeninės ištraukos kiekiais. p<0,05 lyginant su kontrole

Panašus dėsningumas matomas ir vandeninėje ištraukoje, tačiau dėl maţesnio bendro fenolinių junginių kiekio, lyginant su etanoline tinktūra, gebėjimas neutralizuoti H2O2 proporcingai maţėja.

Ištrauka, turinti 0,06 mg/ml fenolinių junginių sumaţino H2O2 kiekį 25 proc. Mėginiai turintys 0,14

mg/ml, 0,43mg/ml ir 0,76 mg/ml fenolinių junginių terpėje atitinkamai sugebėjo neutralizuoti 49 proc., 69,5 proc. ir 89,7 proc. H2O2. Pro ce n ta i, % 0 50 100 150 200 250 300 Kontrolinis

5,9 mg/ml GRE fenolinių jung. 7,3 mg/ml GRE fenolinių jung.

23 pav. H2O2 kieko kitimas veikiant jį “Black Walnut” tinktūra. p<0,05 lygiant su kontrole 100% 163% 182% 100% 75% 30.5% 10.3% 51% * * * * * * * *

Kiek kitoks poveikis pastebėtas tiriant gamyklinį ekstraktą. Net ir maţi ekstrakto kiekiai padidino terpėje esančio H2O2 kiekį. 5,9 mg/ml fenolinių junginių padidino H2O2 kiekį 63 proc., o 7,3 mg/ml – 82

proc. Galima daryti išvadą, kad tai - prooksidacinis veikimas. Kaip jau minėta, ţaliavos antioksidacinį poveikį daugiausiai lemia fenoliniai junginiai. Tačiau esant tam tikroms sąlygoms, arba esant labai didelei polifenolinių junginių koncentracijai gali pasireikšti priešingas antioksidaciniui – prooksidacinis veikimas.

Nors “Black Walnut” ekstrakte nustatytas didelis juglono kiekis, tačiau jis antioksidaciniui poveikiui įtakos neturi. Tyrimais nustatyta, kad juglonas nepasiţymi antioksidaciniu poveikiu. Kiti naftochinonai – plumbaginas ir lavosonas – tokį poveikį turi.[37,41]