FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
BIRUTĖ BUBULYTĖ
KUMARINO KIEKIO PALYGINIMAS
CINAMONO PRIESKONIUOSE IR MAISTO
PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Doc. Daiva Kazlauskienė
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
KUMARINO KIEKIO PALYGINIMAS
CINAMONO PRIESKONIUOSE IR MAISTO
PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas
Doc. Daiva Kazlauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Prof. Sonata Trumbeckaitė Magistrantė Birutė Bubulytė
Data Data
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Cinamonas ... 10
1.2. Cinamono cheminė sudėtis ... 10
1.3. Kiniškųjų ir Ceilono cinamonų morfologiniai požymiai ... 11
1.4. Vartojimo istorija ... 11
1.5. Cinamono panaudojimas ... 12
1.6. Rekomendacijos saugiam cinamono vartojimui ... 12
1.7. Kumarinas ... 13
1.8. Toksiškumo mechanizmas ... 14
1.9. Apsinuodijimo simptomai ... 15
1.10. Kumarino kokybinis ir kiekybinis nustatymas ... 16
2. TYRIMO METODIKA ... 18
2.1 Tyrimo objektas ... 18
2.1.1 Cinamono maisto papildų cheminė sudėtis ... 19
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 19
2.2.1. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 19
2.2.2. Etaloninio tirpalo paruošimas ... 20
2.2.3. Mėginių paruošimas analizei ... 20
2.2.4. Tyrimui naudota aparatūra ... 21
2.2.5. Tyrimo sąlygos ... 21
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ... 22
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 23
3.2.1. Metodikos specifiškumas ... 23
3.2.2. Tiesiškumas ... 26
3.2.3. Glaudumas (preciziškumas) ... 27
3.2.4. Kumarino aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ) ribos ... 29
3.3. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų pritaikymas ... 29
3.4. Cinamono prieskonių ir maisto papildų analizės rezultatai ... 31
3.4.1. Kumarino identifikavimas cinamono prieskoniuose ... 31
3.4.2. Kumarino kiekio įvertinimas cinamono prieskoniuose ... 36
3.4.3. Kumarino identifikavimas maisto papilduose ... 37
3.4.4. Kumarino kiekio įvertinimas maisto papilduose ... 39
4.IŠVADOS ... 40
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
B. Bubulytės magistro baigiamasis darbas „Kumarino kiekio palyginimas cinamono prieskoniuose ir maisto papilduose“. Mokslinis vadovas doc. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.
Darbo tikslas: nustatyti ir palyginti kumarino kiekį cinamono prieskoniuose bei maisto papilduose.
Uždaviniai: pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kumarino identifikavimui; pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kumarino kiekybiniam nustatymui; pritaikyti tinkamiausias kumarino ekstrakcijos sąlygas; įvertinti ir palyginti kumarino kiekį cinamono prieskoniuose bei maisto papilduose.
Tyrimo objektas ir metodai: tiriamieji objektai – cinamono prieskoniai ir maisto papildai, kurių sudėtyje yra cinamono miltelių. Kumarino kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Analizė atlikta naudojant chromatografą Waters e2695 su fotodiodų matricos detekcija. Tyrimo metu naudojami eliuentai – acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas. Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min. Kumarino aptikimui naudojamas 274,0 nm šviesos bangos ilgis.
Rezultatai ir išvados: pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kumarino identifikavimui (sulaikymo laikas ~13,350 min., detekcija prie 274,0 nm šviesos bangos ilgio), naudojant eliuentus acetonitrilą bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninį tirpalą. Pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kumarino kiekio nustatymui: kumarino kiekybinio nustatymo ribos nuo 0,008 iki 0,125 mg/ml; koreliacijos koeficientas >0,99. Pritaikytos tinkamiausios kumarino ekstrakcijos sąlygos, kai ekstrahentas buvo naudotas 80 % (V/V) metanolio– vandens mišinys. Nustatytas kumarino kiekis cinamono prieskoniuose, kuris įvairavo nuo 2,85 mg/kg iki 431,77 mg/kg. Nustatytas didžiausias kumarino kiekis maisto papilduose buvo 12,63 mg/kg, mažiausias kiekis 2,15 mg/kg.
B. Bubulytė master‘s thesis „Comparison of coumarin quantity in cinnamon powder and food supplements“. Scientific supervisor doc. D. Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2019.
Aim of the study: to determine and compare coumarin quantity content in cinnamon powder and food supplements.
Objectives of the study: to apply and validate the high performance liquid chromatography method of coumarin for identification; to apply and validate the high performance liquid chromatography method of coumarin for quantification; to apply the most appropriate method of coumarin extraction; evaluate and compare the amount of coumarin in cinnamon powder and food supplements.
Object and methods: objects – cinnamon powder and cinnamon food supplements. Qualitative and quantitative analysis of coumarin was performed by high performance liquid chromatography. Analysis was performed using a Waters e2695 with photodiode matrix detection. The eluents were used acetonitrile and water with 0,1 % trifluoroacetic acid. Eluent flow rate 1 ml/min. Detection was done at 274,0 nm.
Results: High performance liquid chromatography was applied and validated for coumarin identification (retention time ~ 13,350 min., detection at 274,0 nm). The eluents were used acetonitrile and water with 0.1 % trifluoroacetic acid. High performance liquid chromatography was applied and validated of coumarin for quantification: limit of quantification of coumarin from 0,008 to 0,125 mg/ml; correlation coefficient >0,99. Extraction was performed using a methanol-water (80:20, V/V) solution. The analysis showed that the largest amount was 431,77 mg/kg, smallest amount was 2,85 mg/kg. Coumarin levels were 2,15 mg/kg and 12,63 mg/kg in food supplements.
CP – cinamono prieskoniai
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
ICH – tarptautinė komisija, sprendžianti techninių reikalavimų dėl žmonėms skirtų farmacinių produktų suderinamumo klausimus (angl. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for
Pharmaceuticals for Human Use)
LoD – aptikimo riba (angl. limit of detection) LoQ – nustatymo riba (angl. limit of quantification) MP – maisto papildas
o-HPA – o-hidroksifenilacetaldehidas
SSN – santykinis standartinis nuokrypis UV – ultravioletinės šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Cinamonas – tai aromatingas prieskonis, gaunamas iš Cinnamomum spp. genties medžių vidinės žievės. Jis vartojamas įvairiems patiekalams, desertams, kepiniams. Tačiau ne visi žino apie cinamono naudingas ir žalingas savybes. Jo sudėtyje esantis organinis junginys – kumarinas gali pasižymėti hepatotoksiniu veikimu suaugusių ir vaikų kepenims. Susidaręs aktyvus metabolitas o-hidroksifenilacetaldehidas (o-HPA) veikia kepenų ląsteles, sukeldamas jų žūtį. [1] Neatsakingas ir per didelis cinamono vartojimas gali sukelti negrįžtamas pasekmes kepenų funkcijai. Įvertinus sudedamąsias cinamono dalis ir išanalizavus jų veikimą, galima skirti rekomenduojamas paros dozes, kurios nebus kenksmingos kepenų veiklai. Taip pat svarbu įsigyjant cinamono prieskonius atsižvelgti į cinamono rūšį ir kilmę, nes skirtingose cinamono rūšyse, pavyzdžiui, Cinnamomum cassia B., arba Cinnamomum
zeylanicum B., kumarino kiekis yra nevienodas. [2] Tačiau labai mažai gamintojų nurodo apie cinamono
kilmės šalį bei rūšį.
Kumarino nustatymui naudojami įvairūs analitiniai metodai. Efektyvioji skysčių chromatografija yra viena iš dažniausiai pasirenkamų analizės metodų kumarino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui.
Šio tiriamojo darbo objektas yra cinamono prieskoniai ir maisto papildai su cinamonu, kurie parduodami Lietuvos rinkoje.
Tiriamojo darbo tikslas – nustatyti ir palyginti kumarino kiekį cinamono prieskoniuose bei maisto papilduose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti ir palyginti kumarino kiekį cinamono prieskoniuose bei maisto papilduose.
Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kumarino identifikavimui. 2. Pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kumarino kiekybiniam
nustatymui.
3. Pritaikyti tinkamiausias kumarino ekstrakcijos sąlygas.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Cinamonas
Cinamonas yra prieskonis, gaunamas iš kelių cinamono genties medžių rūšių vidinės žievės dalies. Gentyje yra daugiau nei 300 rūšių, augančių atogrąžų ir subtropikų Šiaurės Amerikos, Centrinės Amerikos, Pietų Amerikos, Azijos, Australijos regionuose. Dažniausiai cinamonas išgaunamas iš šių augalų: Cinnamomum zeylanicum B., Cinnamonum aromaticum N., Cinnamonum loureirii N.,
Cinnamonum cassia B. Cinnamomum zeylanicum žinomas kaip „ceiloninis“ arba „tikrasis cinamonas“.
Cinamonas dažniausiai naudojamas kaip aromatingas prieskonis, kurio dėka galime suteikti tik jam būdingą aromatą įvairiuose maisto gaminiuose, įvairiose virtuvėse. Cinamono aromatas ir skonis yra gaunamas iš jo eterinio aliejaus ir pagrindinio ingrediento – cinamaldehido, taip pat daugelio kitų ingredientų, įskaitant eugenolį. [3]
Cinamono pavadinimas kilęs iš graikų kalbos – kinnamomon, tačiau Graikija šį žodį buvo pasiskolinusi iš lotynų, o lotynai – iš hebrajų. Tad tikrasis cinamono pavadinimas kilo iš hebrajų kalbos „saldus medus“.
Tikrasis cinamonas (Cinnamonum verum) paprastai vadinamas cinamonu arba Ceilono cinamonu, yra 10 – 15 metrų aukščio medis, kuris auga Šri Lankoje ir pietų Indijoje. Jo žievė plačiai naudojama kaip prieskonis. Į cinamono sudėtį įeina eterinis aliejus, kurio yra 1 – 2 % . Eterinis aliejus yra aukso spalvos, jam būdinga kartus skonis. Eterinio aliejaus sudėtis: etilo cinamatas, cinamaldehidas, beta-kariofilenas, linalolas ir metilchavikolis. Cinamonui specifinį skonį ir kvapą suteikia cinamono aldehidas arba cinamaldehidas, šis absorbavęs deguonį sudaro dervingus junginius. [4]
1.2. Cinamono cheminė sudėtis
Cinamono cheminę sudėtį sudaro: eterinis aliejus (1 – 2 %), eugenolis (iki 10 %), eugenolio acetatas, metileugenolis, seksviterpenoidai, cinamono rūgštis (5 – 10 %), fenoliniai junginiai (4 – 10 %), kondensuoti taninai, katechinai ir proantocianidinai, kalcio oksalatas, pėdsakai gleivių, dervų, krakmolo ir cukrų. Daugiausia cinamono prieskoniuose randama cinamono aldehido (60 - 80 %). [5] Taip pat, cinamone randama ir kumarino, kurio kiekis skirtingose cinamono rūšyse skiriasi. Kiniškuosiuose cinamonuose kumarino yra iki 1%, o Ceilono cinamonuose yra apie 0,004 %. [2]
1.3. Kiniškųjų ir Ceilono cinamonų morfologiniai požymiai
Kininis cinamonas nuolat žaliuojantis medis iki 15 m aukščio. Apatiniai lapai pražanginiai, viršutiniai priešiškai išsidėstę, turintys trumpus kotelius. Lapo lakštas plačiai ovalus ar lancetiškas. Lapai odiški, viršutinė lapo pusė žalia, blizganti su įdubusiomis pagrindinėmis gyslomis. Apatinė lapo pusė melsvai žalia, padengta minkštais plaukeliais. Žiedai smulkūs, sutelkti į šluotelės pavidalo žiedyną, kuris yra gelsvai baltos spalvos, turi iš 6 dalių susidedantį apyžiedį ir dvi eiles kuokelių. Vaisius – uoga. Augalas kultivuojamas Vietname, Kinijoje. [6]
Ceiloninis cinamonas nuolat žaliuojantis aukštas krūmas. Šakos cilindriškos, viršūnės tribriaunės, lapai išsidėstę priešiškai, turi trumpus kotelius. Lapai ovalios formos, odiški, su 3-7 pagrindinėmis gyslomis. Žiedai smulkūs, žalsvai geltonos spalvos, sutelkti kekės pavidalo žiedynuose. Auginamas Ceilone, auga Indijoje, pietų Kinijoje. Ceiloninio cinamono žievė vertinama labiau nei kiniškojo cinamono. Geriausia žaliava gaunama ruošiant ją nuo kultivuojamų augalų. [7]
Vaistinė augalinė žaliava – kultivuojamų tam tikrų rūšių cinamonų medžių ir krūmų šakų anksti pavasarį surinkta ir išdžiovinta žievė. Vamzdelių ar juostelių pavidalo, įvairaus ilgio, 0,2 – 0,5 mm storio, šviesiai rudos spalvos žievės gabaliukai. Lūžis lygus, kvapas aromatingas, malonus, skonis saldus, lengvai sutraukiantis. Paruošos vykdomos kultivuojamų augalų plantacijose. Žievė renkama nuo apipjaustytų krūmų stiebų, kai šoniniai ūgliai pasiekia 1–2 m ilgio ir 1,2–1,3 cm diametro. Žievė nuimama varinių peilių pagalba, nuvalomas viršutinis kamštinio audinio sluoksnis (periderma ir pirminė žievė). Po to žievė susukama į dvigubus ar trigubus ritinėlius ir džiovinama saulėje. Liekanos naudojamos eterinio aliejaus gamybai. [6]
1.4. Vartojimo istorija
Cinamonas laikomas vienas iš seniausių prieskonių pasaulyje. Pirmą kartą 2700 m. pr. Kr. Kinijos imperatorius Shen Nung aprašo gydymą cinamonu žolinių augalų žinyne. II tūkstyje pr. m. e. jis jau buvo plačiai naudojamas Senovės Egipte. Egiptiečiai cinamoną naudojo kaip prieskonį, gėrimų aromatizatorių, vaistą ir mumifikavimo ingredientą, mat jis turi konservuojančių savybių. Dėl daugybės vartojimo galimybių ir kone stebuklingų savybių, anuomet cinamonas buvo vertingesnis už auksą, senovės civilizacijos šį prieskonį aukodavo dievams. Senovės graikai ir romėnai naudojo cinamoną
laidotuvių laužams, degindavo kartu su mirusiais cinamoną, kad nesijaustų degančios mėsos kvapo, taip pat, naudojo cinamoną religinėms ceremonijoms kaip smilkalus. [8]
Ceilono cinamonus europiečiai atrado 1517 m., gerokai vėliau nei kasijos cinamonus. Portugalai tais metais atrado Šri Lankos salą (Ceiloną), kur augo Ceilono cinamonai. 1658 m. olandai užkariavo šią teritoriją ir ėmė importuoti cinamoną į Europą. Tačiau jau XVIII a. pabaigoje olandus iš salos išgujo anglai, kurie tvirtai perėme cinamono verslą. Atradę šį aromatingą prieskonį, europiečiai labai jį pamėgo, naudojo jį paskaninti tuo metu į Europą atvežtai arbatai, kavai, kakavai, šokoladui. [9] Senovės laikų gydytojai manė, kad cinamonu galima išgydyti gyvatės įkandimus, peršalimą, strazdanas ir inkstų sutrikimus. Buvo naudojamas diarėjos ir kitų virškinimo sistemos problemų gydymui. Eterinis cinamono aliejus pasižymi stipriomis antioksidacinėmis ir antimikrobinėmis savybėmis. [10] Cinamonas sumažina vidutinį gliukozės kiekį kraujyje nevalgius, tad gali būti veiksminga priemonė žmonėms, sergantiems II tipo cukriniu diabetu. [11] Taip pat reikšmingai mažina trigliceridų kiekį (23 – 30 %), mažo tankio lipoproteinus (7 – 27 %) ir bendrą cholesterolio kiekį (12 – 26 %). Cinamonas taip pat gali padėti mažinti kraujo spaudimą. [12]
1.5. Cinamono panaudojimas
Šiuo metu cinamonas plačiai naudojamas kaip prieskonis. Daugiausiai jo sunaudojama gaminat įvairių rūšių desertus, šokoladus, aštrius saldainius, taip pat arbatos, kakavos ir likerių gamybai. Artimuosiuose rytuose jis dažnai naudojamas pikantiškiems patiekalams. 2006 metais atliktas tyrimas parodė, kad šis produktas puikiai tinka naudoti kaip vabzdžių repelentą. [4]
1.6. Rekomendacijos saugiam cinamono vartojimui
Renkantis cinamoną, reikia atkreipti dėmesį į jo rūšį, nes skirtingose cinamonų rūšyse, pavyzdžiui, kiniškųjų cinamonų Cinnamomum cassia arba Ceilono cinamonų Cinnamomum zeylanicum, kumarino kiekis yra nevienodas. Rekomenduojama rinktis Ceilono cinamonus, nes juose yra mažiau kumarino nei kiniškuose cinamonuose. [13] Norėdami atskirti cinamono rūšį, reikia žiūrėti į cinamono lazdelės žievę. Tikrojo cinamono lazdelės bus šiek tiek plonesnės ir matysis keli žievelės sluoksniai, kasijos cinamono lazdelės žievė yra storesnė ir nesimato sluoksnių, ji būna kietesnė. [14] Sumaltą
cinamoną identifikuoti praktiškai neįmanoma, todėl reikėtų ieškoti informacijos ant pakuotės arba susisiekti su gamintoju. Kumarinas, esantis cinamono sudėtyje, gali sukelti hepatotoksinį poveikį, kai jis vartojamas dideliais kiekiais. Todėl žmonės, turintys kepenų veiklos sutrikimų arba vartojantys antibiotikus, vaistus nuo cukrinio diabeto, turėtų atsargiau vartoti cinamoną ir jo papildus. Taip pat vaikams, nėščioms moterimis arba krūtimi maitinančioms moterims rekomenduojama vartoti cinamoną mažesniais kiekiais.
Rekomenduojama suvartoti cinamono per parą nuo 1 iki 6 gramų. Nerekomenduojama vartoti žmonėms, kurie yra alergiški cinamonui ar augalams priklausantiems lauramedinių (lot. Lauraceae) šeimai. [15]
1.7. Kumarinas
Kumarinas yra aromatingas, organinis, cheminis junginys, priklausantis benzopirono cheminių medžiagų klasei, taip pat gali būti laikomas laktonų poklasiu. (1 pav.) Tai daugelio augalų natūrali, bespalvė, kristalinė medžiaga. [16] Pavadinimas kilęs iš prancūzų termino tonka pupelės coumarou. Tai yra vienas iš šaltinių, iš kurių buvo išgautas kumarinas kaip natūralus produktas 1820 m. Kumarinas turi saldų kvapą, kuris gerai atpažįstamas, apibūdinamas kaip „ką tik nupjautos žolės kvapas“. Ši medžiaga yra šiek tiek kartoko skonio, apetitą slopinanti priemonė. Augaluose kumarinas gaminamas kaip gynybinė medžiaga su kuria galima apsisaugoti nuo žolėdžių gyvūnų ar vabzdžių. Kumarinas naudojamas kvepaluose ir įeina į kondicionierių sudėtį. Taip pat buvo naudojamas kaip tabako ir tam tikrų alkoholinių gėrimų aromato stipriklis. Tačiau, šiuo metu jį yra draudžiama vartoti, kaip kvapiąją medžiagą maiste, nes pasižymi hepatotoksinėmis savybėmis žmogaus ir gyvūnų organizme. [17]
Kumarinas pirmą kartą buvo susintezuotas 1868 metais. Farmacijos pramonėje jis yra vartojamas, kaip pirminis reagentas gaminant daugybę sintetinių antikoaguliantų. Tai – preparatai, kurie mažina kraujo polinkį krešėti: dikumarolis, varfarinas ir rodenticidas. Farmacijos pramonėje iš saldžiųjų dobilų yra išgaunami kumarinai. Modifikuotas kumarinas, 4 – hidroksikumarinas, veikia kaip vitamino K antagonistas. Nemodifikuotas kumarinas, kuris yra natūraliai augaluose, neturi jokio poveikio kraujo krešėjimui. [1, 17]
Nuo 1970 m. kumarinas medicinoje buvo vartojamas gydyti edemas, kurias sukelia kraujo ir limfos apytakos sutrikimai, bei onkologinius susirgimus.Vėliau buvo užregistruoti atvejai, kuomet pacientai vartojo kumarino preparatus didelėms dozėmis ir jiems po kelių savaičių pasireiškė sunkus hepatotoksinis poveikis. Dėl to, šie preparatai buvo pašalinti iš kai kurių šalių (Australijos, Belgijos, Prancūzijos, Kanados) rinkų. [1]
1 pav. Cheminė kumarino struktūra
1.8. Toksiškumo mechanizmas
Pagrindinis kumarino metabolizmo būdas yra hidroksilinimas, kai prie kumarino yra prijungiama hidroksigrupė ir susidaro 7-hidroksikumarinas. (2 pav.) Šis metabolitas yra netoksiškas ir susidarantis daugiau nei 70 % žmonių organizmuose. Citochromas CYP450 2A6 (CYP2A6) yra vienintelis fermentas, kuris katalizuoja šią reakciją.
Kumarinas metabolizuojamas ir kitu būdu, kuomet susidaro tarpinis kumarino-3,4-epoksido junginys. Reakciją katalizuoja šie fermentai: citochromas CYP450 1A ir citochromas CYP450 2E. Kumarino-3,4-epoksidas gali konjuguotis su glutationu arba virsti o-hidroksifenilacetaldehidu (o-HPA).
o-HPA yra hepatotoksinis metabolitas, kuris vėliau oksiduojamas susidarant o-hidroksifenilacto rūgščiai
(HPAA) arba redukuojamas virstant hidroksifeniletanoliu (HPE). (2 pav.) Šių reakcijų metų o-HPA yra detoksikuojamas. [1]
Vienas iš galimų kumarino hepatotoksiškumo rizikos faktorių yra CYP2A6 geno polimorfizmas. Taip pat, hepatotoksiškumą gali lemti hepatitas, padidėjęs gamaglutamiltransferazės fermento kiekis. Be to, įvairiose rasėse skiriasi fermentų aktyvumas ir koncentracija. Pavyzdžiui, azijiečių fermento CYP2A6 aktyvumas yra silpnas, todėl toksinis kumarino poveikis bus didelis. Šiuo atveju mažiau susidarys 7–hidroksikumarino, o padaugės hepatotoksiško metabolito o-HPA susidarymas. Tačiau dar nėra galutinai išsiaiškintas kumarino hepatoksiškumo mechanizmas. [31]
2 pav. Kumarino toksiškimo mechanizmas
1.9. Apsinuodijimo simptomai
Apsinuodijimas kumarinu gali sukelti kraujavimą iš nosies, kraujavimą iš dantenų, šlapinimąsi su krauju, alveolinės kraujosrūvas, jei nėra traumų ar mėlynių, būdingas dusulys, skysčių kaupimasis plaučiuose. Kiti šalutiniai kumarino poveikiai yra alerginės odos reakcijos, paraudimas, skausmas. [18] Vartojant vaistus su kumarinu kaip šalutinis poveikis gali atsirasti: apetito praradimas, pykinimas, viduriavimas. Stipresnės šalutinės reakcijos, tokios kaip neįprastas kraujavimas, mėlynės, kraujas šlapime ar išmatose, stiprus galvos skausmas atsiranda jau po ilgesnio vaisto pavartojimo. Šlapimas gali tapti oranžinės spalvos, tai nėra žalinga ir išnyksta, kai vaistas būna nutraukiamas. Jei atsiranda alerginės reakcijos, odos bėrimai, raudonos dėmės, nedelsiant reikia kreiptis į gydytoją. Alerginės reakcijos simptomai: bėrimas, niežėjimas, patinimas, galvos svaigimas, kvėpavimo sutrikimai. [19]
Europos maisto saugos tarnyba (EFSA) nustatytė kumarino leistina paros norma (ang.
Tolerable Daily Intake – TDI) 0 – 0,1 mg/kg kūno svorio/per parą. Rekomenduojamas kumarino kiekis
1.10. Kumarino kokybinis ir kiekybinis nustatymas
Kumarino nustatymui naudojami įvairūs analitiniai metodai: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) [2, 20-23], dujų chromatografija [24-26] ir ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC) [13, 27].
ESC yra viena iš dažniausiai pasirenkamų analizės metodų kumarino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui, nes turi daug privalumų: pasižymi dideliu jautrumu, specifiškumu ir universalumu. [27]
2008 m. Italijoje kumarinas buvo nustatytas cinamono prieskoniuose, naudojant ESC metodą su DAD (fotodiodų matricos detektoriumi). Pav. 3 pavaizduota cinamono mėginio chromatograma. Kumarino aptikimui naudotas 275,0 nm šviesos bangos ilgis. Tyrimo metu naudojami eliuentai – fosfaro rūgštis, metanolis ir acetonitrilas. Buvo gauti rezultatai, kad apie 51 % cinamono mėginių buvo kasijos rūšies, 10 % buvo kasijos ir Ceilono cinamonų prieskonių mišinys, o tik 39 % buvo Ceilono rūšies cinamonas. Kumarino kiekis vyravo nuo 5 iki 3094 mg/kg. [21]
3 pav. Cinamono mėginio chromatograma, gauta ESC-DAD metodu. [21]
Kitas tyrimas atliktas 2017 m. naudojant atvirkštinių fazių ESC metodą su DAD. Tyrimo metu naudojami eliuentai: acetonitrilas, vanduo ir 0,5 % acto rūgštis. Kumarinas aptiktas ties 278,1 nm bangos ilgiu, sulaikymo laikas 10,4 min. (4 pav.) Nustatytas vidutinis kumarino kiekis cinamono žievėje 916,71 mg/kg. [22]
4 pav. Etaloninio kumarino tirpalo chromatograma. [22]
2012 m. Čekijoje buvo atliktas tyrimas, kurio tikslas buvo nustatyti kumarino kiekį skirtinguose cinamono prieskoniuose. Buvo analizuojama 60 cinamono prieskonių pavyzdžių iš 12 skirtingų firmų. Ant prieskonių pakuočių nebuvo nurodyta, kokios rūšies yra cinamonas, tačiau ant kai kurių pakuočių buvo nurodyta kilmės šalis. Taikytas ESC metodas su UV detektoriumi. Cinamono prieskoniai buvo lyginami su Ceiloninio cinamono pavyzdžiu iš Šri Lankos. Tyrimo metu buvo naudojami eliuentai – amonio acetatas, acetonitrilas ir metanolis. Atlikus tyrimą nustatyta, kad tirti prieskoniai yra gauti iš kasijos cinamono. Juose kumarino kiekis svyravo nuo 2650 iki 7017 mg/kg. [2]
2013 metais Jungtinių Amerikos Valstijų mokslininkai naudojant UESC metodą tyrė kumarino kiekį cinamono prieskoniuose ir maisto papilduose, kurių sudėtyje yra cinamono miltelių. Buvo gauti rezultatai, kad kumarino kiekis cinamono prieskoniuose buvo nuo 8,33 iki 52,22 mg/kg, o maisto papilduose kumarino kiekis buvo 2,45 – 3,61 mg/g. Pav. 5 pateikta tyrimo metu gautos chromatogramos. [13]
5 pav. Etaloninio kumarino tirpalo (A), cinamono prieskonių (B) ir maisto papildo (C) chromatogramos, 1 – kumarinas. [13]
2012 m. Norvegijoje buvo tiriama 14 maisto papildų su cinamonu. Mažiausias kumarino kiekis nustatytas < 1 mg/kg, o didžiausias kumarino kiekis 3250 mg/kg. [28]
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – cinamono prieskoniai ir maisto papildai, kurių sudėtyje yra cinamono miltelių. (1 lentelė)
1 lentelė. Tyrime naudoti cinamono prieskoniai ir maisto papildai su cinamonu
Tiriamasis
objektas Pavadinimas Firma
Cinamono kilmės šalys
Nurodyta cinamono
rūšys
CP-1 Maltas cinamonas Virtusso _____________ _________
CP-2 Cinamonas Alvo Vietnamas _________
CP-3 Cinamonas Saldva Vietnamas _________
CP-4 Maltas cinamonas, ekologiškas
Santa Marija Vietnamas _________
CP-5 Eco maltas Ceilono cinamonas
Cosmoveda _____________ Ceilono
CP-6 Cinamonas Kava plius
CP-7 Ceilono cinamonas maltas
Kava plius Šri Lanka Ceilono
CP-8 Cinamonas maltas sertifikuotas,ekologiškas
Sonnentor _____________ _________
CP-9 Cinamonas maltas Santa Maria CP-10 Ekologiškas maltas
cinamonas
Du medu Indonezija _________
CP-11 Ceilono maltas cinamonas, ekologiškas
Lebensbaum Šri Lanka/ Madaskaras
Ceilono
MP-1 Cinnamon Raab
Vitalfood
_____________ Ceilono
MP-2 Mantra Cinnamon Mantra
Pharma
Buvo tiriami šie cinamono maisto papildai: cinamono miltelių tabletės, Vokietija, (toliau - Maisto papildas–1), cinamono miltelių kapsulės, Vokietija (toliau – Maisto papildas–2).
2.1.1 Cinamono maisto papildų cheminė sudėtis
Maisto papildas–1 (MP–1). 1 tabletės sudėtis: Ceilono cinamonas (200,0 mg), maltodekstrinas, lipnumą reguliuojanti medžiaga: silicio dioksidas.
Maisto papildas–2 (MP–2). 1 kapsulės sudėtis: Ceilono cinamonas (333,3 mg), alfa-lipo rūgštis, piridoksino hidrochloridas, folio rūgštis, chromo pikolinatas, cholekalciferolis, cianokobalaminas, emulsiklis – riebalų rūgščių magnio druskos, silicio dioksidas.
2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
2.2.1. Tyrimo metu naudoti reagentai
Tyrime naudoti reagentai, standartai bei tirpikliai yra analitinio švarumo bei atitinka šioms medžiagoms keliamus kokybės reikalavimus.
Tyrimams buvo naudojami šie reagentai:
Kumarinas (grynumas ≥ 99,0 %,Sigma-Aldrich, Vokietija); Metanolis (grynumas ≥ 99,9 %, Sigma-Aldrich, Vokietija); Acetonitrilas (grynumas ≥ 99,8 %, Sigma-Aldrich, Vokietija); Chloroformas (grynumas ≥ 99,9 %,Sigma-Aldrich, Vokietija); Trifluoracto rūgštis (grynumas ≥ 99,0 %,Sigma-Aldrich, Vokietija); Etanolis 96 % (AB “Vilniaus degtinė”, Vilnius, Lietuva);
Išgrynintas vanduo, gautas naudojant vandens valymo sistemą „Millipore“ (Bedford, JAV).
2.2.2. Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloninis tirpalas buvo ruoštas iš standartizuoto kumarino (grynumas ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Vokietija), jį tirpinant etanolyje. 0,001 g kumarino užpilta etanoliu iki 10 ml kolbutės žymės. Užkimšta kolbutė maišoma ultragarso vonelėje. Pradinė tirpalo koncentracija buvo 100 µg/ml.
2.2.3. Mėginių paruošimas analizei
2.2.3.1. Cinamonų prieskonių mėginių paruošimas
Mėginiai ruošiami iš 0,5 g (0,001 g tikslumu) cinamono prieskonių, ekstrahuojant 25 ml metanolio – vandens (80:20, V/V) tirpalu. Ekstrakcija buvo vykdoma maišant ultragarso vonelėje 30 min. Gauti tirpalai filtruojami per membraninius 0.45 µm porų skersmens filtrus ir tiesiogiai analizuojami ESC metodu.
2.2.3.2. Maisto papildų mėginių paruošimas: tabletės
MP-1 darbinio tirpalo ruošimas: grūstuvėje buvo susmulkintos 3 tabletės (kiekvienoje yra po 200,0 mg cinamono miltelių). Bendra susmulkintų tablečių masė 750,0 mg. Pasverta 625,0 mg gautos masės (atitinka 500,0 mg cinamono miltelių), kuri perkelta į analitinę kolbutę ir įpilama 25 ml metanolio – vandens (80:20, V/V) tirpalo. Ekstrakcija buvo vykdoma maišant ultragarso vonelėje 30 min. Gautas tirpalas filtruojamas per membraninius 0,45 µm porų skersmens filtrus ir toliau naudojamas chromatografavimui.
2.2.3.3. Maisto papildų mėginių paruošimas: kapsulės
MP-2 darbinio tirpalo ruošimas: grūstuvėje buvo sumaišyta dviejų kapsulių turinys (kiekvienoje yra po 333,3 mg cinamono miltelių). Bendra kapsulių turinio masė 976,0 mg. Pasverta 732,0 mg gautos masės (atitinka 500,0 mg cinamono miltelių), kuri perkelta į analitinę kolbutę ir įpilama 25 ml metanolio - vandens (80:20, V/V) tirpalas. Ekstrakcija buvo vykdoma maišant ultragarso vonelėje 30 min. Gautas tirpalas filtruojamas per membraninius 0,45 µm porų skersmens filtrus ir toliau naudojamas chromatografavimui.
2.2.4. Tyrimui naudota aparatūra
Analizė atlikta naudojant Waters e2695 chromatografą (Waters Corporation, Milford, USA) bei fotodiodų matricos detektorių Waters 2998 (Waters Corporation, Milford, USA). Tyrimo metu buvo naudojama kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 1,7 µm. Duomenims apdoroti bei analizei atlikti naudota programinė įranga: Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV).
2.2.5. Tyrimo sąlygos
Tyrimo metu naudojami eliuentai – acetonitrilas bei 0,1 % trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas. Naudojamas gradientinis eliuavimas (2 lentelė).
2 lentelė. Eliuento sudėties kitimas laiko atžvilgiu
Tirpiklių sistemos sudėtis (%) Chromatografavimo laikas (min) 00:00 1:00 20:00 23:00 24:00
TFA 0,1 % (A) 98,0 98,0 2,0 2,0 98,0
Acetonitrilas (B) 2,0 2,0 98,0 98,0 2,0
Eliuento tekėjimo greitis: 1,0 ml/min. Analizėje naudotas injekcijos tūris – 10 µl tiriamojo tirpalo. Bendra chromatografavimo trukmė – 24 minutės. Detekcija: kumarino aptikimui naudojamas 274,0 nm šviesos bangos ilgis.
2.2.7. Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant MS Excel 2010 (Microsoft, JAV) programą. Visi bandymai buvo kartojami tris kartus, vėliau buvo apskaičiuojami tyrimų rezultatų matematiniai vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas
Kumarino nustatymui cinamono prieskoniuose ir maisto papilduose buvo pasirinktas ESC metodas. Jis pasirinktas dėl to, kad galima tiksliai ir kokybiškai nustatyti kumariną mėginiuose. Tyrimas atliktas naudojant Blahova et al (2012) moksliniame straipsnyje skelbtas metodikas, jas modifikuojant. Modifikuojant ESC metodiką, buvo keistos šios sąlygos: eliuentų sistemoje amonio acetatas ir metanolis pakeistas į 0,1 % trifluoracto rūgšties vandeninį tirpalą, pakeistas eliuento gradientinis kitimas ir analizės trukmė, UV detektorius pakeistas į DAD detektorių, eliuento tėkmės greitis padidintas iki 1,0 ml/min, kolonėlės temperatūra sumažinta iki 25°C. Analizė atlikta naudojant Waters e2695 chromatografą su fotodiodų matricos detekcija. Tyrimo metu buvo naudojama kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm), esant 274,0 nm šviesos bangos ilgiui. Modifikuoto metodo eliuentų sistema buvo sudaryta iš 0,1 % trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Eliuavimo būdas – gradientinis (3 lentelė). Nustatytas tėkmės greitis – 1,0 ml/min, injekcijos tūris – 10 μl.
3 lentelė. Eliuento sudėties kitimas laiko atžvilgiu
Atlikus chromatografinę analizę su etaloniniu kumarino tirpalu naudojant pasirinktą metodiką, gauti šie rezultatai: nustatytas etaloninio kumarino tirpalo vidutinis sulaikymo laikas (13,350 min.) ir UV absorbijos spektras (6 pav.).
Tirpiklių sistemos sudėtis (%) Chromatografavimo laikas (min)
00:00 1:00 20:00 23:00 24:00
TFA 0,1 % (A) 98,0 98,0 2,0 2,0 98,0
6 pav. Etaloninio kumarino tirpalo chromatograma su UV absorbcijos spektru (kumarinas nustatytas prie 274,0 nm šviesos bangos ilgio)
Modifikuotos metodikos tinkamumui, kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams atlikti, įrodyti būtina atlikti metodikos validaciją.
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Metodikos validacija patvirtina, kad metodas atitinka specifinius parametrus ir yra tinkamas taikyti praktikoje. Remiantis ICH (angl. The International Council for Harmonisation of Technical
Requirements for Pharmaceuticals for Human Use – tarptautinė komisija, sprendžianti techninių reikalavimų dėl žmonėms skirtų farmacinių produktų suderinamumo klausimus) gairėmis, buvo įvertintas metodo tinkamumas ir atitikimas šiems parametrams: specifiškumui (ang. Specificity), tiesiškumui (ang.
Linearity), preciziškumui (ang. Precision) arba glaudumui. Rezultatų glaudumą sudaro pakartojamumo
(ang. Repeatability) ir atkartojamumo (ang. Reproducibility) parametrai. Taip pat buvo nustatytos aptikimo (ang. LoD - Limit of detection) ir nustatymo (ang. LoQ - Limit of quantitation) ribos. [30]
3.2.1. Metodikos specifiškumas
Metodikos specifiškumas (angl. Specificity) parodo, kad tiriama analitė yra visapusiškai atskiriama nuo priemaišų ir kitų medžiagų. Analičių atskyrimui naudojamas ESC metodas, naudojant
fotodiodų matricos detektorių (DAD). Norint įrodyti specifiškumą, lyginamos tiriamųjų tirpalų ir etaloninio kumarino tirpalo chromatogramos, vertinami jų UV šviesos absorbcijos spektrai ir sulaikymo laikai.
Kumarinas identifikuotas lyginant etaloninio kumarino tirpalo ir tiriamojo mėginio (CP–9) chromatogramas (7 pav).
7 pav. chromatogramos: a) etaloninio kumarino (1) tirpalo vid. sulaikymo trukmė 13,350 min.; b) tiriamojo mėginio kumarino (1) vid. sulaikymo trukmė 13,357 min.
Etaloninio kumarino tirpalo (4 lentelė) ir cinamono mėginių sulaikymo laikai (5 lentelė) bei UV šviesos absorbcijos spektrai sutampa (8 pav.).
4 lentelė. Etaloninio kumarino tirpalo ir tiriamojo mėginio (CP-9) tirpalo vid. sulaikymo
laikas, smailės plotas, koncentracija
Smailė Vidutinis sulaikymo
laikas (min.)
Plotas Koncentracija (mg/ml)
Etaloninis kumarino tirpalas 13,350 2760627 0,006157
5 lentelė. Kumarino vidutinės sulaikymo trukmės skirtinguose cinamono prieskoniuose ir
maisto papilduose
8 pav. UV absorbcijos spektrai: a) tiriamojo mėginio (CP-9) b) etaloninio kumarino tirpalo.
Kadangi kumarinas buvo identifikuotas lyginant etaloninio kumarino tirpalo ir tiriamųjų cinamono mėginių chromatogramas, o etaloninio kumarino tirpalo ir cinamono mėginių sulaikymo trukmės, UV absorbcijos spektrai sutampa, galime teigti, kad specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.
Mėginio nr.: Vidutinė sulaikymo trukmė (min) CP-1 13,347 CP-2 13,406 CP-3 13,396 CP-4 13,385 CP-5 13,378 CP-6 13,368 CP-7 13,366 CP-8 13,367 CP-9 13,357 CP-10 13,361 CP-11 13,353 MP-1 13,361 MP-2 13,366 Vidurkis 13,372
3.2.2. Tiesiškumas
Tiesiškumas parodo smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės koncentracijos [30]. Šis parametras įvertintas kalibracinės kreivės metodu.
Kalibracinė kreivė sudaroma matuojant skirtingų koncentracijų etaloninius kumarino tirpalus (6 lentelė). Tirpalas E paruošiamas pasveriant 1,25 mg (tikslus svoris) kumarino miltelių ir ištirpinant 10 ml etanolio. Toliau atliekami etaloninio kumarino tirpalo E skiedimai. 1 ml tirpalo E skiedžiamas 1 ml etanoliu, gaunamas tirpalas D. Kiti tirpalai C, B ir A skiedžiami analogiškai.
Gauta kalibracinė kreivė įrodo, kad analizuotame koncentracijų intervale smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška (9 pav.). Kumarino koreliacijos koeficientas (R2) yra 0,999947 (7 lentelė).
6 lentelė. Etaloninių kumarino tirpalų ruošimas kalibracinės kreivės sudarymui
Koncentracija (mg/ml)
Tirpalas A Tirpalas B Tirpalas C Tirpalas D Tirpalas E
0,008 0,016 0,031 0,063 0,125
7 lentelė. Etaloninio kumarino tirpalo tiesiškumo parametrai
Tiesiškumo kriterijus atitinka reikalavimus, nes kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas > 0,99. [22]
3.2.3. Glaudumas (preciziškumas)
Norint įvertinti metodo glaudumą (preciziškumą), reikia apskaičiuoti pakartojamumą ir atkartojamumą.
Pakartojamumas (angl. Repeatability) parodo rezultatų tikslumą, kai analizė atliekama tą pačią dieną, nekeičiant tyrimo sąlygų. Šio rodiklio įvertinimui kumarino etaloninis tirpalas buvo injekuojamas 5 kartus tą pačią dieną ir tomis pačiomis sąlygomis (10 pav.).
10 pav. Pakartojamumo vertinimo metu gautos chromatogramos
Analitė Koreliacijos koeficientas
Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml)
Sulaikymo laiko vidurkis
Atkuriamumas (angl. Reproducibility) išreiškia rezultatų tikslumą esant toms pačioms analizės sąlygoms, bet skirtingomis dienomis. Šio parametro įvertinimui kumarino etaloninis tirpalas buvo injekuotas po 5 kartus dvi dienas iš eilės, esant tokioms pačioms eksperimentinėms sąlygoms (11 pav.).
11 pav. Atkuriamumo vertinimo metu gautos chromatogramos
Pakartojamumas ir atkuriamumas įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Santykinis standartinis nuokrypis, dar vadinamas variacijos koeficientu (angl. RSD) – tai standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykis, kuris yra išreikštas procentais. SSN vertė nėra tiksliai apibrėžta, tačiau kiekybinio tyrimo atveju turėtų būti ≤ 5 proc. [30]
Etaloninio kumarino tirpalo vidutinis sulaikymo laikas pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimuose kito nuo 13,350 min. iki 13,365 min. ir nuo 13,346 min. iki 13,370 min. (atitinkamai).
Analizuojamo etaloninio kumarino tirpalo pakartojamumo ir atkuriamumo SSN reikšmės sulaikymo laikui ir smailės plotui neviršija leistinos 5 % ribos (8 lentelė).
8 lentelė. Etaloninio kumarino tirpalo pakartojamumo ir atkuriamumo sulaikymo laiko ir smailės ploto santykiniai standartiniai nuokrypiai
Parametras Santykinis standartinis nuokrypis SSN (proc.)
Sulaikymo laiko Smailės ploto
Pakartojamumas 0,0 0,6
Atkuriamumas 0,1 0,9
Galima teigti, jog rezultatų pakartojamumas ir atkuriamumas atitinka nustatytus reikalavimus. Remiantis šiuo kriterijumi, metodas yra tinkamas kiekybiniam nustatymui.
3.2.4. Kumarino aptikimo (LoD) ir nustatymo (LoQ) ribos
Aptikimo riba (angl. LoD – limit of detection) – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas analizuojamame mėginyje, tačiau nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Remiantis ICH gairėmis, vertinant aptikimo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 3 arba 2:1.
Nustatymo riba (angl. LoQ – limit of quantification) – tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai įvertinamas analizuojamame mėginyje. Vertinant nustatymo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 10:1. [30] Kumarino aptikimo ir nustatymo ribos pateikiamos 9 lentelėje.
9 lentelė. Kumarino aptikimo ir nustatymo ribos
Kumarinas Aptikimo riba (LoD) (µg/ml) Nustatyto riba (LoQ) (µg/ml)
0,125 0,417
Įvertinus pasirinktus validacijos kriterijus ir remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad ESC metodika yra tinkama kumarino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui.
3.3. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų pritaikymas
Atliekant kumarino ekstrakciją iš cinamono prieskonių, svarbu parinkti tinkamą tirpiklį ir įvertinti jo poliškumą. Tirpiklis parenkamas atsižvelgiant į tiriamosios medžiagos tirpumą, panaudojimą publikuotuose kitų mokslininkų darbuose. Dažniausiai kumarino ekstrakcijai naudojami alkoholių ir vandens mišiniai, pavyzdžiui, metanolio arba etanolio ir vandens tirpalai [2, 20-22]. Išanalizavus kitų tyrėjų rezultatus, kaip ekstrahentai buvo pasirinkti: etanolis 80 %, metanolis 80 %, acetonitrilas ir chloroformas.
Tyrimas atliekamas pagal modifikuotą Blahova et al (2012) cinamono mėginių paruošimo metodiką. Šioje metodikoje pakeistas cinamono prieskonių svoris ir ekstrahento kiekis. Iš pradžių pasveriama 0,5 g (0,01 g tikslumu) cinamono prieskonių (CP–9), po to užpilama 25 ml atitinkamu ekstrahentu. Ekstrakcija buvo vykdoma maišant ultragarso vonelėje 30 min. Gauti tirpalai filtruojami per membraninius 0,45 µm porų skersmens filtrus ir toliau naudojami chromatografavimui. Kumarino išeiga nustyta ESC metodu.
Remiantis gautais rezultatais nustatyta, jog mažiausia kumarino išeiga gauta naudojant acetonitrilą. Didžiausia kumarino išeiga gauta bandymą atliekant su 80 % metanolio tirpalu. (12 pav.)
12 pav.: Kumarino išeiga ekstrahuojant skirtingais tirpikliais
Toliau buvo tiriama, kokios koncentracijos metanolis yra tinkamiausias kumarino ekstrakcijai iš cinamono prieskonių. Tam tikslui buvo pasirinkti įvairių koncentracijų (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ir 100 %) metanolio tirpalai (13 pav.). Ekstrakcija vykdyta pagal anksčiau aprašytą metodiką. Didžiausia kumarino išeiga gauta naudojant 80 % koncentracijos metanolio ir vandens mišinį (metanolis:vanduo 80:20). Mažiausia kumarino išeiga apskaičiuota, kai ekstrahentas buvo 50 % metanolio ir vandens tirpalas (50:50).
Apibendrinant atliktų eksperimentinių tyrimų rezultatus, galima teigti, jog didžiausia kumarino išeiga iš cinamono prieskonių yra pasiekiama, ekstrahuojant 80 % metanoliu. Dėl šios priežasties tolimesniems tyrimams ir buvo pasirinktas šis ekstrahentas.
3.4. Cinamono prieskonių ir maisto papildų analizės rezultatai
3.4.1. Kumarino identifikavimas cinamono prieskoniuose
Tyrimui pasirinkta 11 skirtingų cinamono prieskonių, kurie buvo įsigyti Lietuvos rinkoje. Eksperimentinių tyrimų metu, pagal sulaikymo laikus ir UV spektrų atitikimus identifikuotas junginys kumarinas. Etaloninio kumarino tirpalo vidutinis sulaikymo laikas 13,350 min. Kumarino vidutiniai sulaikymo laikai cinamono prieskoniuose varijavo nuo 13,347 iki 13,406 min (5 lentelė).
Cinamono prieskoniai: Maltas cinamonas, Virtusso (CP-1)
14 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Maltas cinamonas, Virtusso.
14 pav. Cinamono prieskonių: Maltas cinamonas, Virtusso chromatograma
Cinamono prieskoniai: Cinamonas, Alvo (CP-2)
15 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Cinamonas, Alvo.
15 pav. Cinamono prieskonių: Cinamonas, Alvo chromatograma
Cinamono prieskoniai: Cinamonas, Saldva (CP-3)
16 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Cinamonas, Saldva.
16 pav. Cinamono prieskonių: Cinamonas, Saldva chromatograma
Cinamono prieskoniai: Maltas cinamonas, ekologiškas, Santa Marija (CP-4)
17 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Maltas cinamonas, ekologiškas, Santa Marija.
17 pav. Cinamono prieskonių: Maltas cinamonas, ekologiškas, Santa Marija chromatograma
Cinamono prieskoniai: Eco maltas Ceilono cinamonas, Cosmoveda (CP-5)
18 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Eco maltas Ceilono cinamonas, Cosmoveda.
18 pav. Cinamono prieskonių: Eco maltas Ceilono cinamonas, Cosmoveda chromatograma
Cinamono prieskoniai: Cinamonas, Kava plius (CP-6)
19 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Cinamonas, Kava plius.
19 pav. Cinamono prieskonių: Cinamonas, Kava plius chromatograma
Cinamono prieskoniai: Ceilono cinamonas maltas, Kava plius (CP-7)
20 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Ceilono cinamonas maltas, Kava plius.
20 pav. Cinamono prieskonių: Ceilono cinamonas maltas, Kava plius chromatograma
Cinamono prieskoniai: Cinamonas maltas sertifikuotas, ekologiškas, Sonnentor (CP-8)
21 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Cinamonas maltas sertifikuotas, ekologiškas, Sonnentor.
21 pav. Cinamono prieskonių: Cinamonas maltas sertifikuotas, ekologiškas, Sonnentor chromatograma
Cinamono prieskoniai: Cinamonas maltas, Santa Maria (CP-9)
22 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Cinamonas maltas, Santa Maria.
22 pav. Cinamono prieskonių: Cinamonas maltas, Santa Maria chromatograma
Cinamono prieskoniai: Ekologiškas maltas cinamonas, Du medu (CP-10)
23 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Ekologiškas maltas cinamonas, Du medu.
23 pav. Cinamono prieskonių: Ekologiškas maltas cinamonas, Du medu chromatograma
Cinamono prieskoniai: Ceilono maltas cinamonas, ekologiškas, Lebensbaum (CP-11)
24 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono prieskoniuose: Ceilono maltas cinamonas, ekologiškas, Lebensbaum.
24 pav. Cinamono prieskonių: Ceilono maltas cinamonas, ekologiškas, Lebensbaum chromatograma.
3.4.2. Kumarino kiekio įvertinimas cinamono prieskoniuose
Didžiausia kumarino koncentracija buvo nustatyta 431,77 mg/kg cinamono prieskoniuose (CP– 9), o mažiausia kumarino koncentracija buvo 2,85 mg/kg cinamono prieskoniuose (CP–5).
Vidutinis kumarino kiekis buvo 188,58 mg/kg (25 pav.).
25 pav. Kumarino koncentracija (mg/kg) tirtuose cinamono prieskoniuose.
Cinamono prieskoniuose (CP–5, CP–7, CP–11) kumarino kiekis buvo labai mažas ir ant jų etikečių buvo nurodyta informacija, kad rūšis yra Ceilono cinamonų (Cinnamomum zeylanicum). (1 lentelė). Remiantis literatūra, galima daryti prielaidą, kad cinamonų rūšis yra Ceilono, nes kumarino kiekis < 100 mg/kg [27].
Pagal nustatytą kumarino kiekį, galima daryti prielaidą, jog 36 % tirtų prieskonių gali būti Ceilono cinamonų rūšies. Italijoje taip pat buvo gauti labai panašūs rezultatai, nustatyta, kad 39 % prieskonių yra Ceilono cinamonų rūšies [21].
Nustatyta kumarino koncentracija mažesnė nei kituose tyrimuose, pavyzdžiui, Italijoje atliktame tyrime kumarino koncentracija buvo nuo 6 iki 3094 mg/kg [21], o Čekijoje kumarino koncentracija svyravo nuo 2650 iki 7017 mg/kg [2].
3.4.3. Kumarino identifikavimas maisto papilduose
Tiriami 2 maisto papildai, kurių sudėtyje yra cinamono miltelių. Kumarinas buvo nustatytas cinamono maisto papilduose, atsižvelgiant į mėginio sulaikymo laiką bei UV spektrų atitikimą, lyginant
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 CP-1 CP-2 CP-3 CP-4 CP-5 CP-6 CP-7 CP-8 CP-9 CP-10 CP-11 Kum arino k oncentracija, m g /k g
su etalonių kumarino tirpalu. Etaloninio kumarino tirpalo vidutinis sulaikymo laikas 13,350 min. Kumarino vidutiniai sulaikymo laikai cinamono maisto papilduose varijavo nuo 13,361 iki 13,366 min (5 lentelė).
Maisto papildas: Cinnamon, Raab Vitalfood (MP-1)
26 pav. chromatogramoje pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono preparate: Cinnamon, Raab Vitalfood.
26 pav. Maisto papildo: Cinnamon, Raab Vitalfood chromatograma.
Maisto papildas: Mantra Cinnamon, Mantra Pharma (MP-2)
27 pav. chromatogramoje pateiktas pateikta kumarino smailė ir sulaikymo laikas cinamono preparate: Mantra Cinnamon, Mantra Pharma.
3.4.4. Kumarino kiekio įvertinimas maisto papilduose
Didžiausia kumarino koncentracija buvo 12,63 mg/kg maisto papilde (MP – 2), o mažiausia kumarino koncentracija buvo 2,15 mg/kg maisto papilde (MP – 1) (28 pav.).
28 pav. Kumarino koncentracija (mg/kg) cinamono maisto papilduose
Galima daryti prielaidą, kad tirtuose maisto papilduose buvo Ceilono cinamonų miltelių, nes kumarino kiekis mažesnis nei < 100 mg/kg [27]. Be to, ant abiejų maisto papildų etikečių buvo nurodyta, kad jų sudėtyje yra Ceilono cinamonų miltelių. Nustatytas kumarino kiekis maisto papilduose patvirtina šią informaciją.
Nustatytas kumarino kiekis cinamono maisto papilduose (10 lentelė) neviršijo Europos maisto saugos tarnybos (EFSA) leistinos kumarino paros normos (ang. Tolerable Daily Intake – TDI) ≤ 0,1 mg/kg kūno svorio per parą. [27] Kitose šalyse, pavyzdžiui, Norvegijoje leistina kumarino paros dozė buvo viršyta 2 iš 14 maisto papildų. [28]
Apibendrinant galima teigti, jog kumarino kiekis yra mažas ir neviršijo leistinos kumarino paros dozės ( ≤ 0,1 mg/kg ), todėl cinamono maisto papildus, esančius Lietuvos rinkoje, vartoti yra saugu.
10 lentelė. Kumarino kiekiai cinamono maisto papilduose.
* – Kumarino kiekis apskaičiuotas, kai suaugusio žmogaus svoris yra 60 kg
Maisto papildas Vidutinis svoris, (g) Rekomenduojama paros dozė (tabletėmis/kapsulėmis) Kumarino kiekis (mg/kg) Kumarino kiekis (mg per parą) *Kumarino kiekis (mg/kg kūno svorio per parą)
MP-1 0,488 3 2,15 0,0031 0,0001 MP-2 0,250 3 12,63 0,0095 0,0002 0 2 4 6 8 10 12 14 MP -1 MP-2 Kum arino k iek is, m g /k g
4. IŠVADOS
1. Pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kumarino identifikavimui (sulaikymo laikas ~13,350 min., detekcija prie 274 nm šviesos bangos ilgio), naudojant eliuentus acetonitrilą bei 0,1 % trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninį tirpalą.
2. Pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kumarino kiekio nustatymui: kumarino kiekybinio nustatymo ribos nuo 0,008 iki 0,125 mg/ml; koreliacijos koeficientas >0,99.
3. Pritaikytos tinkamiausios kumarino ekstrakcijos sąlygos, kai ekstrahentas buvo naudotas 80 % (V/V) metanolio – vandens mišinys.
4. Nustatytas kumarino kiekis cinamono prieskoniuose, kuris įvairavo nuo 2,85 mg/kg iki 431,77 mg/kg.
5. Nustatytas didžiausias kumarino kiekis maisto papilduose buvo 12,63 mg/kg, mažiausias kiekis 2,15 mg/kg. Kumarino kiekis neviršijo leistinos paros dozės, todėl cinamono maisto papildai yra saugūs vartoti.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktu tyrimu, buvo nustatyta, jog mažiausi kumarino kiekiai buvo Ceilono cinamono prieskoniuose, todėl rekomenduojama rinktis šios rūšies cinamono prieskonius.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Abraham K, Wohrlin F, Lindtner O, Heinemeyer G, Lampen A. Toxicology and risk assessment of coumarin: focus on human data. 2010;54(2):228-39.
2. Blahova J, Svobodova Z. Assessment of Coumarin Levels in Ground Cinnamon Available in the Czech Retail Market. 2012;1-4.
3. Bell, Maguelonne Toussaint-Samat ; translated by Anthea (2009). A history of food (New expanded ed.). Chichester, West Sussex: Wiley-Blackwell. ISBN 978-1405181198.
4. Felter H. Cinnamomum: Cinnamon. Henriettes Herbal. 2007
5. Faraga AM, Labibc RM, Noletod C, Porzeld A, Wessjohannd LA. NMR approach for the authentication of 10 cinnamon spice accessions analyzed via chemometric tools. 2018: 491- 498. 6. Chen PY, Yu JW, Lu FL, Lin MC, Cheng HF. Differentiating parts of Cinnamomum cassia using
LC-qTOF-MS in conjunction with principal component analysis. 2016;30(9):1449-57.
7. Husaina I, Rumana Ahmada R, Anu Chandra A, Razaa ST, Shuklab Y , Mahdia F. Phytochemical characterization and biological activity evaluation of ethanolic extract of Cinnamomum zeylanicum. 2018:110-116.
8. Palionienė S. Prieskoniai – ir maistas, ir vaistas. Ignalina:Aindra; 2012.
9. Obelevičius K, Petkevičiūtė S, Šeinauskaitė E. Prieskonių augalų ir jų vartojimo žinynas. Kaunas, 2011.
10. Nanasombat S, Wimuttigosol P. Antimicrobial and antioxidant activity of spice essential oils. 2011;20(1):45-53.
11. Bandara T, Uluwaduge I, Jansz ER. Bioactivity of cinnamon with special emphasis on diabetes mellitus: a review. 2012;63(3): 380-386.
12. Ranasinghe P, Pigera S, Premakumara S, Galappaththy P, Constantine GR, Katulanda P. Medicinal properties of ‘true’ cinnamon (Cinnamomum zeylanicum): a systematic review. 2013; 13:275. 13. Wang Y, Avula B, Dhammika Nanayakkara NP, Zhao J, Khan IA. Cassia Cinnamon as a Source of
Coumarin in Cinnamon-Flavored. Food and Food Supplements in the United States. 2013;61(18):4470-6.
14. Woehrlin F, Fry H, Abraham K, Preiss-Weigert A. Quantification of Flavoring Constituents in Cinnamon: High Variation of Coumarin in Cassia Bark from the German Retail Market and in Authentic Samples from Indonesia. 2010;58(19):10568-75.
15. Ulbricht C, Seamon E, Windsor RC. An Evidence-Based Systematic Review of Cinnamon (Cinnamomum spp.) by the Natural Standard Research Collaboration, 2011;8(4):378-454.
17. Jain PK, Joshi H. Coumarin: Chemical and Pharmacological Profile. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2012;236-240.
18. The National Institute for Occupational Safety and Health - NIOSH. 2017
19. Prieiga per internetą: https://www.medicinenet.com/coumarin-type_drugs-oral/article.htm
20. Sproll C, Ruge W, Andlauer Cl, Godelmann R, Lachenmeier DW. HPLC analysis and safety assessment of coumarin in foods. 2008;109(2):462-9.
21. Lungarini S, Aureli F, Coni E. Coumarin and cinnamaldehyde in cinnamon marketed in Italy: A natural chemical hazard? 2008;25(11):1297-305.
22. Solaiman R, Al-Zehouri J. Determination of coumarin in methanol extract of cinnamon
(Cinnamomum cassia Blume) using reversedphase high performance liquid chromatography. 2017;6(4):726-729.
23. Maggi F, Barboni L, Caprioli G, Papa F, Ricciutelli M, Sagratini G, Vittori S. HPLC quantification of coumarin in bastard balm (Melittis melissophyllum L., Lamiaceae). 2011;82(8):1215-21.
24. Ochiai N, Sasamoto K, Hoffman A, Okanoya K. Full evaporation dynamic headspace and gas chromatography-mass spectrometry for uniform enrichment of odor compounds in aqueous samples. 2012;1240:59-68.
25. Maggi F, Martonfi P, Conti F, Cristalli G, Papa F, Sagratini G, Vittori S. Volatile components of whole and different plant parts of bastard balm (Melittis melissophyllum L., Lamiaceae) collected in Central Italy and Slovakia. 2011;8(11):2057-79.
26. Vetter F, Muller C, Stockelhuber M, Bracher F. Determination of coumarin in seasonal bakery products using QuEChERS and GC-MS. 2017;72(6):313-316.
27. Ballin NZ, Sorensen AT. Coumarin content in cinnamon containing food products on the Danish market. 2014;198-203.
28. Fotland TO, Paulsen JE, Sanner T, Alexander J, Husoy T. Risk assessment of coumarin using the bench mark de (BMD) approach: Children in Norway which regularly eat oatmeal porridge with cinnamon may exceed the TDI for coumarin with several folds. 2012;50(3-4):903-12.
29. Scotter MJ, Roberts D, Rees GO. Development and single-laboratory validation of an HPLC method for the determination of coumarin in foodstuffs using internal standardization and solid-phase extraction cleanup. 2011;3(2), 414-419.
30. Note For Guidance on Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. ICH Topic Q2 (R1). European Medicines Agency. CPMP/ICH/381/95.
31. Iwata N, Kainuma M, Kobayashi D, Kubota T, Sugawara N, Uchida A, Shimazoe T. The Relation between Hepatotoxicity and the Total Coumarin Intake from Traditional Japanese Medicines Containing Cinnamon Bark. 2016;7:174.
