FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Laima Uščinaitė
Vitamino C kokybinė ir kiekybinė analizė maisto
papilduose
Magistro darbas
Darbo vadovė: Dr. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Vitamino C kokybinė ir kiekybinė analizė maisto
papilduose
Magistro darbas
Recenzentas Darbo vadovas: doc. dr. Asta Kubilienė
Darbą atliko: Magistrantė Laima Uščinaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Vitamino C bendrosios fizikinės ir cheminės savybės ... 10
2.1. Vitamino C biologinis poveikis ... 11
2.1.1. Antioksidacinis vitamino C mechanizmas ... 12
2.2. Rekomenduojamos vitamino C paros normos ... 13
2.3. Vitamino C pagrindiniai šaltiniai ... 15
2.4. Vitamino C trūkumo sukelti padariniai ... 16
2.5. Vitamino C perteklius ... 17
2.6. Maisto papildų sudėties apibendrinimas ... 18
2.7. Vitamino C preparatų analizė ... 19
2.7.1. Askorbo rūgšties kiekybinio nustatymo spektrofotometriniu metodu, pavyzdžiai. ... 20
2.7.2. Askorbo rūgšties kiekybio nustatymo titrimetriniu metodu, pavyzdžiai ... 23
3. TYRIMO METODIKA ... 25
3.1. Tyrimo objektas... 25
3.2. Naudoti reagentai ... 26
3.3. Naudota aparatūra ir indai ... 27
3.4. Tyrimo metodai ... 27
3.4.2. Kiekybinis askorbo rūgšties, maisto papilduose, nustatymas spektrofotometriniu
metodu... ... 27
3.4.3. Kiekybinis askorbo rūgšties, maisto papilduose, nustatymas titrimetrijos metodu... ... 29
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
4.1. Analizuoti maisto papildai su vitaminu C ... 31
3.1. Kokybinis askorbo rūgšties nustatymas ... 31
3.2. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 32
3.2.1. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas maisto papilduose, spektrofotometriniu metodu... ... 33
3.2.2. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto spektrofotometriniu metodu ir nurodytu ant maisto papildo pakuotės, rezultatų palyginimas ... 34
3.3. Titrimetrinės analizės rezultatai ... 35
3.3.1. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas maisto papilduose, titrimetriniu metodu. . 36
3.3.2. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto titrimetriniu metodu ir nurodytu ant maisto papildo pakuotės, rezultatų palyginimas ... 37
3.4. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto spektrofotometriniu ir titrimetriniu metodu, rezultatų palyginimas. ... 38
4. IŠVADOS ... 41
SANTRAUKA
Laimos Uščinaitės magistro baigiamojo darbo mokslinė vadovė doc. Dr. Asta Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas.
Darbo pavadinimas: Vitamino C kokybinė ir kiekybinė analizė maisto papilduose Darbo tikslas: Atlikti vitamino C kokybinį ir kiekybinį ir nustatymą maisto papilduose,
pritaikant įvairius instrumentinės analizės metodus.
Darbo uždaviniai: Atlikti askorbo rūgšties maisto papilduose kokybinę analizę.
Nustatyti askorbo rūgšties kiekį įvairiuose maisto papilduose spektrofotometriniu metodu. Nustatyti askorbo rūgšties kiekį įvairiuose maisto papilduose titrimetriniu metodu. Palyginti rezultatus gautus spektrofotometriniu ir titrimetriniu analizių metodais su duomenimis pateiktais ant maisto papildo pakuotės.
Tyrimo objektai ir metodai: šeši maisto papildai su vitaminu C įsigyti Lietuvos
visuomenės vaistinėse. Tyrimui buvo pasirinkta vienkomponenčiai maisto papildai ir daugiakomponenčiai, kurių sudėtį papildo įvairus vitaminų kompleksas ir vaistinių augalų ekstraktai. Kokybiškai askorbo rūgštis buvo nustatoma pagal Europos farmakopėjos monografija (01/2011:0253). Kiekybiškai - spektrofotometriniu ir titrimetriniu metodais.
Išvados: Atlikus kokybinę analizę tirtuose maisto papilduose, kurių sudėtyje yra
SUMMARY
Title of work: Qualitative and quantitative analysis of vitamin C in food supplements. The aim of the work: To carry out quantitative and qualitative determination of vitamin
C in food supplements, applying various methods of instrumental analysis.
Tasks of the work: To perform qualitative analysis of ascorbic acid in food
supplements. Determine the amount of ascorbic acid in various food supplements by spectrophotometric method. Determine the amount of ascorbic acid in various food supplements by titrimetric method. Compare the results obtained with spectrophotometric and titrimetric analysis methods with data provided on the food supplement package.
Objects and methods of research: Six food supplements with vitamin C are available
in Lithuanian public pharmacies. One-component food supplements and multicomponents have been selected for the study, complemented by a diverse vitamin complex and herbal extracts. Qualitative ascorbic acid was determined by the European Pharmacopoeia monograph (01/2011: 0253). Quantitatively - spectrophotometric and titrimetric methods.
Conclusions: A qualitative analysis of the dietary supplements containing vitamin C
SANTRUMPOS
ROS (angl. reactive oxygen species) reaktyvioji deguonies rūšis
NADPH (angl. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas
SOD (angl. superoxide dismutase) superoksido dismutazė AFR (angl. sscorbate free radical) askorbo laisvasis radikalas
PMOR (angl. plasma membrane oxidoreductases) plazmos membranos oksidoreduktazė DHA (angl. dehydroascorbic acid) dehidroaskorbo rūgštis
GLUTs (angl. glucose transporters) gliukozės pernešėjas
TxnRd (angl. thioredoxin reductase) tioredoksino reduktazė Glrx (angl. glutaredoxin) glutaredoksinas
SVCTs (angl. sodium-dependent citamin-C transporters) natrio priklausomi vitamino C nešikliai
GMCSF (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) granulocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius
CSFRs (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptors) granulocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojančių faktorių receptorius
JAK2 (angl. Janus Kinase-2) Janus kinazė-2
IKK (angl. IκB kinase) IκB kinasė (fermentų kompleksas) RPN - rekomenduojama paros norma
ĮVADAS
Dėl didėjančio gyvenimo tempo, kasdien patiriamo streso, didelio aplinkos užterštumo ir nevisavertės mitybos silpnėja žmogaus imuninė sistema, todėl didėja biologiškai aktyvių medžiagų, ypač vitaminų ir mineralų, poreikis. 2014 m., lyginant su 2010 m., nustatyta, kad sergamumo rodiklis Lietuvoje padidėjo 15 proc., o ligotumas – 10 proc. (3), todėl labai svarbu imtis prevencinių priemonių, padedančių sumažinti šį rodiklį. Dažniausiai imuniteto stiprinimui skiriami vitamino C preparatai.
Vitaminas C nesintezuojamas ir nekaupiamas žmogaus organizme, todėl jis turi būti gaunamas iš maisto arba maisto papildais (4). Esant vitamino C trūkumui organizme gali atsirasti greitas nuovargis, sumažėjęs darbingumas ir atsparumas ligoms, dingęs apetitas ir kiti simptomai (5).
Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina askorbo rūgštis yra svarbi ir dažnai vartojama produktų grupė. Maisto papildas – maisto produktas, skirtas papildyti įprastą maisto racioną ir kuris vienas arba derinyje su kitomis medžiagomis yra koncentruotas maistinių ar kitų medžiagų, turinčių mitybini arba fiziologinį poveikį, šaltinis (1). Nors maisto papildams, kurie tiekiami į rinką ir pristatomi kaip maisto produktai, taikoma Lietuvos higienos norma, kuri yra privaloma visiems fiziniams, juridiniams asmenims, kitoms organizacijoms ar jų filialams, gaminantiems, fasuojantiems, gabenantiems, laikantiems, įvežantiems, importuojantiems, tiekiantiems į Lietuvos Respubliką maisto papildus (2) ir Lietuvos Respublikos rinkai tiekiami tik šios higienos normos reikalavimus atitinkantys maisto papildai, 2014 m. Lietuvos rinkoje nustatyta 20 nesaugių maisto papildų vartojimo atvejų.
Pagal Nacionalinės sveikatos tarybos metinį pranešimą kasmet Lietuvoje suvartojamų maisto papildų kiekis didėja, o vykdant tikslinius maisto papildų patikrinimus dėl veikliųjų medžiagų juose, nustatyta, kad veikliosios medžiagos kiekis yra daug mažesnis, nei yra nurodyta ant konkrečios pakuotės (3). Kadangi maisto papildai, kurių sudėtyje yra askorbo rūgštis, svarbi ir dažnai vartojama produktų grupė, svarbu tikrinti jų kokybę bei vitamino C kiekius, esančius maisto papildų sudėtyje.
Darbo tikslas: Atlikti vitamino C kokybinį ir kiekybinį nustatymą maisto papilduose,
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Atlikti vitamino C nustatymą įvairiuose maisto papilduose, pritaikant
kokybinius ir kiekybinius metodus.
Uždaviniai:
1. Atlikti askorbo rūgšties maisto papilduose kokybinę analizę.
2. Nustatyti askorbo rūgšties kiekį įvairiuose maisto papilduose spektrofotometriniu metodu.
3. Nustatyti askorbo rūgšties kiekį įvairiuose maisto papilduose titrimetriniu metodu. 4. Palyginti rezultatus gautus spektrofotometriniu ir titrimetriniu analizių metodais su
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vitamino C bendrosios fizikinės ir cheminės savybės
Vitaminas C, arba kitaip dar vadinamas askorbo rūgštis (C6H8O6), tai vandenyje tirpus vitaminas. Cheminis pavadinimas (5R)-[(1S)-1,2-dihidroksietil]-3,4-dihidroksifuran-2(5H)-onas (6). Askorbo rūgšties struktūra pateikta 1 paveiksle. (7)
Askorbo rūgštis Vitaminas C
(5R)-[(1S)-1,2-dihidroksietil]-3,4-dihidroksifuran-2(5H)-onas (7) 1. Pav. L-askorbo rūgšties struktūra (7)
2. pav. Askorbo rūgšties struktūros formos (8)
Askorbo rūgšties stereoizomerai yra L - askorbo rūgštis (1a), D - askorbo rūgštis (1b), L – izoaskorbo rūgštis (2a) ir D – izoaskorbo rūgštis (2b). Pav. 2 pavaizduotos entiomerų poros yra L - askorbo rūgštis (1a) ir D - askorbo rūgštis (1b), bei L - izoaskorbo rūgštis (2a) ir D - izoaskorbo rūgštis. L - askorbo rūgštis ir D - izoaskorbo rūgštis yra epimerai su skirtingai orientuotais vandenilio ir hidroksilo grupėmis prie 5 anglies atomo (9).
Stereoizomerai neturi jokio biologinio aktyvumo, išskyrus nedidelį kiekį iš isoaskorbo rūgšties (2,5 % – 5 % palygimus su L - askorbo rūgštis) (8,9).
Askorbo rūgštis yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai arba bespalviai kristalai, kurių spalva gali pakisti, tamsėti oro ir drėgmės sąlytyje. Sausoje būsenoje jis yra pakankamai stabilus, tačiau tirpale jis greitai oksiduojasi. Beveik bekvapis. Gerai tirpsta vandenyje, tirpsta etanolyje (96%) (7). Netirpsta eteryje, chloroforme, benzene, petroleteryje, aliejuose, riebaluose (6).
2.1. Vitamino C biologinis poveikis
Vitaminas C dalyvauja noradrenalino gamyboje (12), cholesterolio metabolizme (13), geležies absorbcijoje (14), kortikosteroidų sintezėje ir įvairių vaistų metabolizmo sistemose (15,16).
Taip pat askorbo rūgštis pageriną imuninę funkciją, palaikydamas tiek įgimtas, tiek įgytas imuninės sistemos įvairias ląstelines funkcijas, bei kaupiasi fagocitų ląstelėse (pvz., neutrofiluose) ir stiprinachemotaksiją, fagocitozę, reaktyviosios deguonies rūšies susidarymą ir galiausiai mikroorganizmų sunaikinimą (17).
Vartojant dideles vitamino C dozes pacientams sergantiems sepsiu arba po išemijos, galima apsaugoti nuo oksidacinio endotelio pakitimo, taip pagerinant audinių perfuziją, bei deguonies kiekį ir sušvelninti vėlesnę organų disfunkciją (18).
2.1.1. Antioksidacinis vitamino C mechanizmas
Oksidacinį stresą gali sukelti daug aplinkos veiksnių, pavyzdžiui, UV spinduliai, patogenai, deguonies trūkumas audiniuose ir kiti aspektai. Tokioms streso sąlygoms būdingas ROS (angl. reactive oxygen species (reaktyviosios deguonies rūšies)) generavimas. Iš ROS vandenilio peroksidas ir superoksidas dalyvauja daugelyje ląstelių reakcijų ir įvairių fermentų gamyboje, tokių kaip lipogenezė, peroksidazė, NADPH (nikotinamido adenino dinukleotido fosfato) oksidazė, ksantino oksidazė ir kt. Oksidacinio streso pasekmės priklauso nuo audinių, jo rūšių, membranos savybių, endogeninių antioksidantų kiekio ir sugebėjimo sukelti reakcijas antioksidantų sistemoje (19).
ROS susidarymą stabdo antioksidacinė sistema, kurią sudaro mažos molekulinės masės antioksidantai, tokie kaip askorbo rūgštis, glutationas, tokoferolis. Taip pat sudaro fermentai, reaguojantys į sumažintas antioksidantų formas ir ROS sąveikaujantys fermentai - SOD (superoksido dismutazė), peroksidazė ir katalazė (20,21).
Askorbo rūgštis stiprus antioksidantas galintis suskaidyti ROS ir reaktyvią azoto rūšį. Nors tai yra hidrofilinė molekulė, ji dalyvauja apsaugant hidrofobinius junginius, tokius kaip membranos lipidai, bendradarbiaujant su vitaminu E. Askorbo rūgštis veikia regeneruojančiai alfa-takoferolį iš alfa-takoferolio radikalo, taip pat gali padidinti vitamino E antioksidacinę galią (22).
Fiziologiniame pH lygyje, askorbo rūgštis susidaro monoaniono formoje ir pirmojo elektrono praradimas sąlygoja AFR (askorbo laisvojo radikalo) formavimąsi. AFR yra silpnas oksidatorius. PMOR (plazmos membranos oksidoreduktazė), daugelio fermentų kompleksas, atlieka svarbų vaidmenį konvertuojant AFR į oksiduotos formos DHA (dehidroaskorbo rūgštį).
Yra du žinomi mechanizmai vitamino C transportavimui į ląsteles. Universali sistema, esanti visose ląstelėse, perneša į ląsteles vitamino C kiekius kaip DHA per palengvinančias GLUTs (gliukozės pernešėjas).
Ląstelių viduje DHA greitai redukuojasi, tiesiogiai veikiant glutationui arba reakcijoms, kurias katalizuoja TxnRd (Tioredoksino reduktazė) arba Glrx (glutaredoksinas). NADH priklausomi mechanizmai taip pat gali prisidėti prie šio mechanizmo. TxnRd ir Glrx, taip pat patenka į ROS jautrių signalų keitiklių kategoriją.
Antroji transportavimo sistema funkcionuoja ląstelėse, kuriose vitaminas C tiesiogiai transportuojamas į ląsteles per natrio priklausomus askorbatų co-transporius arba SVCTs (natrio priklausomus vitamino C nešiklius) (23).
Žmogaus GMCSF (granulocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius) fosforilina CSFRs (granulocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojančių faktorių receptorius) ir palengvina aktyvinimą JAK2 (Janus kinazė-2), kad padidėtų DHA vartojimas per GLUTs. Dėl to padidėja ląstelėse vitamino C kiekis. Padidėjęs vitamino C ir DHA kiekis slopina ROS susidarymą ir aktyvina IKK (IκB kinasę – fermentų kompleksas), skatinanti antioksidantinę gynybą ir ją didina tarp skirtingų antioksidacinių sistemų (23, 25).
Tokie mechanizmai patvirtina ROS reikšmę citokinui ir augimo faktoriams. Jie duoda signalą ir nurodo vitamino C vaidmenį mažinant signalo atsakus, kad būtų išvengta streso sąlygų audiniuose. Šie veiksmai rodo, kad vitaminas C yra stiprus antioksidantas ir redukcinio signalo transdukcijos reguliatorius apsauginėse ląstelėse, bei gali kontroliuoti uždegiminius atsakus (25).
2.2.
Rekomenduojamos vitamino C paros normos
1 lentelė. Vitamino C rekomenduojamos paros normos (8). Amžius RPN (mg/d) Kūdikiai (mėnesiai) 0-6 40 7-12 50 Vaikai (metai) 1-3 15 4-8 25 9-13 45 Suaugusieji (metai) Vyrai 14-18 75 19- <70 90 Moterys 14-18 65 19 - <70 75 Nėščiosios 80-85 Žindymo metu 115 - 120 Rūkantys Papildomai 35
Vitaminas C turi būti reguliariai gaunamas su maistu. Nacionalinė mokslų akademija rekomenduoja 90 mg /d vitamino C suaugusiems vyrams ir 75 mg/d moterims (4).
Nėštumo metu yra padidėjęs vitamino C poreikis, ypač per paskutinį trimestrą. Todėl 80 -85 mg per parą visą nėštumą padeda patenkinti papildomus augančio vaisiaus poreikius (26).
Laktacijos metu 20 mg vitamino C per parą išsiskiria su pienu, nes absorbcijos efektyvumas yra 85%, todėl žindanti motina turi gauti 115-120 mg/d. Apskaičiuota, kad askorbo rūgšties koncentracija motinos piene yra 40 mg /l, tačiau vitamino C kiekis piene atspindi motinos mitybą, o ne kūdikio poreikius (27). Kad kūdikiams neatsirastų skorbuto požymių, jie turėtų gauti apie 40 mg/d vitamino C.
Rūkančių žmonių organizmas turi gauti papildomai 35 mg/d vitamino C dozės, lyginant su nerūkančiais 75 – 90 mg/d., nes padidėja askorbo rūgšties sunaudojimas dėl oksidacinio streso, kuris atsiranda iš cigarečių dūmų toksiškumo. Tai rodo, kad vitaminas C veikia kaip rūkančiųjų laisvųjų radikalų gaudyklė (29).
2.3. Vitamino C pagrindiniai šaltiniai
Žmonės ir kiti primatai, jūrų kiaulytės, Indijos vaisių šikšnosparniai, kai kurios žuvys ir paukščiai bei vabzdžiai nesugeba gaminti askorbo rūgšties endogeniškai (28). Jie negali sintetinti askorbo rūgšties endogeniškai, nes trūksta oksiduojančio fermento L-gulono-γ-laktonoksidazės. Šis fermentas yra būtinas paskutiniame L-gulono-γ-laktono konversijos žingsnyje į 2-okso-L-gulono-γ-laktoną, kuris yra L-askorbo rūgšties tautomeras ir savaime transformuojamas į vitaminą C (30). Todėl vitaminas C turi būti papildomas organizme kitais būdais. Vitamino C šaltiniai yra:
• Citrusiniai vaisiai (citrinos (48,7 mg/100 g), apelsinai (51,3 mg/100 g), greipfrutai (42 mg/100 g), kiviai (71 mg/100 g)), kurie yra turtingi vitaminu C. Taip pat nemaži vitamino kiekiai yra ir kituose vaisiuose (obuoliai (8 mg/ 100 g), kriaušės (4mg/100g), persikai (7 mg/100 g), melionai (30 mg/100 g), bananai (9 mg/ 100 g), mangai (20 mg/100 g), arbūzai (10 mg/100 g)), bei uogose (vynuogės (10 mg/100 g), vyšnios (60 mg/100 g) braškės (66 mg/100 g)).
• Daržovės (kopūstai (32,9 mg/100 g), brokoliai (83 mg/100 g), Briuselio kopūstai (79mg/100 g), žiediniai kopūstai (73 mg/100 g), svogūnai (37 mg/100 g), paprika (144 mg/100 g), agurkai (10 mg/100 g), pamidorai (22 mg/100 g), žirniai (40 mg/100 g), morkos (5 mg/100 g), bulvės (15 mg/100 g)), gali būti pastovesnis vitamino C šaltinis nei vaisiai, nes daržovių sezoniškumas dažniau tęsiasi ilgiau nei vaisių (31,32).
2.4. Vitamino C trūkumo sukelti padariniai
Vitamino C trūkumas, visuotinai žinomas kaip skorbutas, iš pradžių buvo jūreivių liga. Ji dažniausiai atsirasdavo tiems, kurių laivai ilgą laiką neturėdavo prieigos prie šviežių vaisių ar daržovių. 1747 m. Karališkojo laivyno daktaras Lindas nustatė, kad citrusiniais vaisiais gali būti gydomas skorbutas(26).
Olson (8) suskirstė skorbuto simptomus, pagal sutrikimus kaip sisteminę, hemoraginę, psichologinę, sekrecijos, neurologinę, hematologinę ir susijusių su jungiamuoju audiniu. Nedidelis trūkumas sukelia nuovargi ir dirglumą. Didesnis trūkumas sukelia dantenų pokyčius - kraujavimus dantenose, patinimus, dantų kritimus. Taip pat gali atsirasti galūnių skausmas ir hemoraginės apraiškos, sutrikdomas žaizdų gijimas, pažeidžiamas imunitetas (9). Askorbo rūgšties trūkumo simptomai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Askorbo rūgšties trūkumo simptomai (9)
Sutrikimai Simptomai
Sisteminiai Nuovargis
Mieguistumas
Hemoraginiai Perfolikulinis kraujavimas
Raudonos dėmelės ant odos Dantenų kraujavimas
Psichologiniai Depresija
Hipochondriazė Isterija
Sekreciniai Sausa oda
Kseroftalmija
Liežuvio, burnos išsausėjimas
Vasomotoriniai Pakinta neurotrofinis aminų metabolizmas
Hematologiniai Sunkėja geležies absorbcija
Sutrinka folikulų metabolizmas
Jungiamojo audinio Skorbinis artritas
Sutrikęs žaizdų gijimas
Gydant skorbutą rekomenduoja vartoti 1 - 2 g per dieną vitamino C pirmąsias dvi-tris dienas, po to 500 mg / d kitas 1-2 savaites. Vėliau vartoti askorbo rūgšties 100 mg / d nuo vieno iki trijų mėnesių (33).
Sisteminiai simptomai (nuovargis, skausmas, anoreksija, sumišimas) pagerėja per 24 valandas po gydymo. Kraujavimas ir sutrikimai, atsiradę dėl kolageno defekto (echimozė, petechijos, kraujavimas iš dantenų, hiperplazija, perifolikulinis kraujavimas) sumažėja po vienos - dviejų savaičių. Visiškai organizmas atsistato po 3 mėnesių tinkamo vitamino C papildymo (26).
Vitamino C kiekį organizme galima nustatyti iš plazmoje esančio askorbo rūgšties kiekio. Askorbo rūgšties koncentracija mažesnė nei 11 μmol / L rodo vitamino C trūkumą. Koncentracijos tarp 11 ir 23 μmol / L rodo žemą vitamino kiekį audiniuose, o >23 μmol / L -adekvatų (34).
Šiuolaikinėje visuomenėje vitamino C trūkumas yra retas atvejis, dažniausiai atsirandantis dėl sumažėjusio vitamino vartojimo arba padidėjusio organizmo poreikio. Jis pasitaiko žmonėms piktnaudžiaujantiems alkoholiu, benamiams, atskirtiems vyresnio amžiaus žmonėms ir asmenims, kurie savanoriškai riboja savo mitybą (34). Taip pat žmonėms, kurie mažai vartoja vaisių ir daržovių, pacientams, sergantiems cukriniu diabetu ar gingivitu, astma, glaukoma, kolageno sutrikimais, artritu, įvairiomis infekcinėmis (pneumonija, sinusitas, reumatas) ir lėtinėmis ligomis (16,32).
2.5. Vitamino C perteklius
Dažniausiai askorbo rūgštis yra netoksiška, tačiau didelės papildomo vitamino C dozės gali sukelti nepageidaujamus reiškinius, susijusius su žarnynu ar šlapimo sistemoje susidarančiais metabolitais.
Vartojimas 2-3 g / d. (ar leidžiant) vitamino C, gali sukelti viduriavimą (32) ir kitus virškinimo trakto sutrikimus, tokius kaip pykinimą, vėmimą, pilvo spazmus, rėmenį, nuovargį, odos paraudimą, galvos skausmus, nemigą arba mieguistumą (16). Žarnyno sutrikimai yra susiję su neabsorbuoto vitamino C osmosiniu poveikiu jame (35).
pat oksalato akmenų susidarymo rizika gali padidėti, kai vitamino C vartojama daugiau nei 1 g/d, asmenims, kuriems yra padidėjąs kalcio kiekis šlapime (32,36).
Vitamino C perteklius gali sukelti ir kitokių šalutinių poveikių, pavyzdžiui, dėl ilgalaikio ar per didelio kramtomųjų vitamino C preparatų naudojimo atsiranda danties emalio eroziją, bei sumažėją vitamino B12 ir vario kiekis organizme (6).
2.6. Maisto papildų sudėties apibendrinimas
Iš pasirinktų tiriamųjų maisto papildų, ant visų pakuočių pažymėta, kad jų sudėtyje yra l-askorbo rūgštis, kuri, yra biologiškai aktyvios formos. Ši medžiaga maisto papildų sudėtyje įvardinama panašiai – askorbo rūgštis, vitaminas C arba l-askorbo rūgštis.
Papilduose vartojami įvairūs askorbo rūgšties kiekiai. Vienkomponenčiuose papilduose, kuriuose yra vien tik askorbo rūgštis, jo dozės didelės - nuo 500 mg iki 1000 mg vienoje kapsulėje/ tabletėje. Šie preparatai skirti vartoti esant vitamino C avitaminozei, tad šios dozės yra racionalios. Analizuotose kompleksiniuose maisto papilduose dozės varijuoja nuo 150 mg iki 250 mg, bet gali būti ir mažesnės. Šiuose papilduose skiriasi vitamino C kiekis nuo vidutinės askorbo rūgšties paros dozės – 80 mg.
2.7. Vitamino C preparatų analizė
Askorbo rūgštis yra reduktorius. Dėl šios priežasties jis sąveikauja veikiant deguoniui, esant metalo jonams ar šviesai. Jis gali būti oksiduotas vienu elektronu radikaline būsena arba dvigubai oksiduotas iki stabilios formos, vadinamos dehidroaskorbo rūgštimi (3. Pav.). (37).
Pav. 3. Askorbo rūgšties (vitamino C) oksidavimas į dehidroaskorbo rūgštį
Klasikinis (tradicinis) metodas yra tūrio matavimo metodas - titravimo metodas, kuriame naudojamas oksidanto tirpalas, pvz. kalio jodatas arba bromatas (38). Tūrio matavimo metodai gali būti netikslūs dėl specifiškumo trūkumo.
Güçlü ir kt. (39) pasiūlė spektrofotometrinį vitamino C nustatymo metodą, pagrįstą askorbo rūgšties oksidacija į dehidroaskorbo rūgštį, naudojant Cu (II) -2,9-dimetil-1,10-fenantrolino (neokuproino (Nc)) regentą, amonio acetato terpėje. Absorbcija buvo matuojama sudariusio bis (Nc) -vario (I) chelato kiekio esant 450 nm bangos ilgiui. Kiti optiniai metodai, skirti vitamino C įvertinimui, apima spektrofotometrinį jodo, kurio reakcija su askorbo rūgštimi ir chemiliuminescencija (40), nustatymą.
Medžiagos cheminę analizę sudaro kelios stadijos: ėminio paėmimas, mėginio paruošimas analizei, analizės metodo parinkimas, cheminės reakcijos produkto kurio nors fizikinio dydžio matavimas, analizės duomenų gavimas ar apskaičiavimas, jų kokybės ir patikimumo įvertinimas (39).
2.7.1. Askorbo rūgšties kiekybinio nustatymo spektrofotometriniu
metodu, pavyzdžiai
Fadhel (37) pritaikė metodą, kuriuo galima nustatyti kiekybinę vitamino C sudėtį naudojant spektrofotometrinį metodą. Šis metodas naudojamas askorbo rūgšties nustatymui vandeniniuose tirpaluose, priklausomai nuo jo gebėjimo redukuoti permanganatą (530 nm) ir dichromatą (350 nm).
Standartinių tirpalų paruošimas: standartinis 100 ppm (0,1 mg/ml) askorbo rūgšties
tirpalas buvo paruoštas ištirpinus 0,01 g askorbo rūgšties ir praskiedus iki 100 ml distiliuotu vandeniu.
100 ml KMnO4 standartinis tirpalas (100 ppm (0,1 mg/ml)) buvo pagamintas, ištirpinant 0,01g KMnO4 į 5M H2SO4 ir praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki 100 ml.
500 ppm (0,5 mg/ml) K2Cr2O7 100 ml standartinis tirpalas buvo paruoštas ištirpinant 0,05 g K2Cr2O7 į 5M H2SO4 ir užpilant distiliuotu vandeniu iki 100 ml.
Tiriamojo pavyzdžio paruošimas: Į penkias (25 ml) tūrio matavimo kolbas buvo
įpilama po 40 ppm (0,04 mg/ml) KMnO4, po to atitinkamai pridedama 1, 4, 8, 12 ir 16 ppm (0,001 , 0,004, 0,008, 0,012 ir 0,016 mg/ml) askorbo rūgšties. Mišinio absorbcija matuojama spektrofotometru.
Į dešimt (25 ml) tūrio matavimo kolbas buvo įpilama po 100 ppm (0,1 mg/ml) K2Cr2O7, po to atitinkamai pridedama 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ppm (0,002, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 mg/ml) askorbo rūgšties. Mišinio absorbcija matuojama spektrofotometru.
Tyrimo metodika: paruošto tiriamojo tirpalo su permanganatu absorbcija buvo
4 pav. KMnO4 spektras, esant 1-16 ppm (0,001 – 0,016 mg/ml) askorbo rūgšties koncentracijų tirpalams (37)
5 pav. K2Cr2O7 spektras, esant 2 - 90 ppm (0,002 – 0,09 mg/ml) askorbo rūgšties koncentracijų tirpalams (37)
Ahmedo Z. Mohamedo Huseino (41) publikacijoje buvo įvertintas spektrofotometrinis metodas askorbo rūgšties nustatymui vandeniuose tirpaluose iš tablečių. Šis metodas buvo pagrįstas spalvoto azo dažiklio susidarymu diazotinant 2, 4-dichloraniliną, po kurio susidaro azo jungimo reakcija tarp gauto produkto ir askorbo rūgšties. Buvo nustatytos optimalios sąlygos, su kuriomis gauta maksimali absorbcija esant 535 nm bangos ilgiui.
Standartinių tirpalų paruošimas: 2 ml askorbo rūgšties etaloninio tirpalo 100 µg / ml
ir 0,75 ml 1M natrio hidroksido tirpalo buvo sumaišyta su 5 ml 2, 4 dichloranilino ir 0,5 ml 0,01 M natrio nitratu ir 0,5 ml 1M HCl. Mišinys sumaišytas ir užpildytas distiliuotu vandeniu iki žymės 10 ml matavimo kolboje.
Gautas mišinys 5 minutes purtomas, vėliau 5 minutes aušinamas šaltoje vandens vonelėje. Po 10 minučių geltona spalva visiškai išnyksta ir absorbcijos matavimas atliekamas prie 535 nm bangos ilgio. Pagaminamas palyginamasis tirpalas tuo pačiu metodu, tik be askorbo rūgšties.
Tiriamojo farmacinio preparato pavyzdžio paruošimas:
Tabletės. Susmulkinama dešimt tablečių į miltelius ir atsveriama 200 mg. Atsverti
milteliai ištirpinami 10 ml etanolio ir praskiedžiami 50 ml matavimo kolbose, kad gautųsi 200 μg / ml.
Geriamasis tirpalas: į kolbą iš tiriamojo tirpalo buteliuko atmatuota 4 ml tirpalo ir
ištirpinta 200 ml distiliuoto vandens.
Tyrimo metodika: Spalvotas produktas, po askorbo rūgšties sujungimo su
6 pav. (1) 2,4 dichloranilino absorbcijos spektras. (2) Askorbo rūgšties absorbcijos spektras. (3) Susidariusio azo dažo, askorbo rūgšties (40 µg / ml) ir 2,4-dichloranilino
absorbcijos spektras (41)
Askorbo rūgštis sudaro spalvotą produktą po to, kai ji prijungta prie elektrofilinio 2, 4-dichloranilino. Siekiant nustatyti palankiausias sąlygas (laiko ir papildymo poveikį, papildymo tvarką ir kt.), išbandyta įvairių reakcijos kintamųjų įtaka spalvų vystymuisi (41). Spalvos intensyvumas pasiekė maksimalų askorbo rūgšties azo dažų susidarymą. Gauta spalva buvo stabili mažiausiai 1 dieną ir šio laikotarpio pakako, kad būtų galima nuosekliai atlikti keletą matavimų (41) .
2.7.2. Askorbo rūgšties kiekybio nustatymo titrimetriniu metodu
pavyzdžiai
Mohammed sohel Chowdhury ir kt. (42) aprašytas metodas, kuriuo galima nustatyti kiekybinę askorbo rūgšties sudėtį, naudojant jodometrinį titravimo metodą, pagrįstą oksidacijos-redukcijos reakcija tarp vitamino C ir jodo.
Jodo tirpalo paruošimas: 0,1 M jodo tirpalo paruošimui buvo atsverta 10 g KI į 250 ml
matavimo kolbą ir įpiltas nedidelis kiekis distiliuoto vandens, po to tirpalas pašildytas. Mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir jame ištirpinama 3,15 g jodo miltelių, bei pripilama 250 ml distiliuoto vandens.
Krakmolo tirpalo paruošimas: ant 0,25 g atsvertų krakmolo miltelių pilama 50 ml šilto
Vitamino C standartinio tirpalo paruošimas: 25 mg askorbo rūgštis ištirpinta 100 ml
distiliuoto vandens.
Vitamino C mėginio tirpalo paruošimas: iš vitamino C blisterio atsitiktinai parinktos
dvi tabletės buvo pasvertos ir susmulkintos, kad susidarytų milteliai ir apskaičiuotas vidutinis jų dydis. Pavyzdžiui:
Dviejų tablečių svoris = 1,67 g (1670 mg) Vidutinis = 1,67 / 2 = 835 mg
250 mg askorbo rūgšties tabletės masė yra lygi 835 mg
100 mg askorbo rūgšties tabletė turi lygiavertį svorį = 167 * 2 mg = 334 mg
334 mg miltelių gautų iš tabletės buvo paimtos į 100 ml laboratorinę stiklinę ir ištirpintos 100 ml distiliuoto vandens.
Titravimas: Į 250 ml kūgine kolbą atmatuota 20 ml pagaminto standarto arba mėginių
tirpalų, bei praskiesta su 150 ml distiliuoto vandens. Į tirpalus įlašinama po 5-6 lašus pagaminto krakmolo tirpalo ir pradedamas titravimas iki mėlynos spalvos atsiradimo.
I3- oksiduoja vitaminą C į dehidroaskorbo rūgštį: C6H8O6 + I3 + H2O → C6H6O6 + 3I- + 2H + Vitaminas C dehidroaskorbo rūgštis
Galutinis taškas yra mėlynos spalvos susidarymas, atsirandantis dėl jodo reakcijos su krakmolo kleisteriu. Askorbo rūgščiai reaguojant su I2 susidaro jodidas, kuris, reaguodamas su krakmolo kleisteriu nesudaro spalvoto junginio. Tačiau sureagavus visai askorbo rūgščiai, atsiranda jodo perteklius, kuris su krakmolo kleisteriu sudaro mėlyną spalvą.
Šis titravimo metodas yra plačiai pripažintas ir tinkamas tirti vitamino C kiekį tabletėse arba skysčiuose (41).
Šiuose aprašytuose tyrimuose pateikti askorbo rūgšties nustatymo metodai, kurie yra paprasti, greiti, nebrangūs. Procedūros yra lengvai vykdomos ir nereikalauja daug mėginių (36, 40, 41).
3.
TYRIMO METODIKA
3.1. Tyrimo objektas
Šio darbo tyrimas atliktas pasirinkus maisto papildus, kurių sudėtyje arba viena iš sudedamųjų dalių yra askorbo rūgštis. Eksperimentiniam tyrimui buvo pasirinkti šeši skirtingi preparatai, kurių sudėtyje yra vitamino C, atitinkamai 600 mg, 500 mg, 150 mg ir 125 mg askorbo rūgšties vienoje tabletėje/kapsulėje, tyrimui naudoti preparatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Eksperimentiniam tyrimui pasirinkti preparatai.
Eil. nr. Preparato pavadinimas Veikliųjų medžiagų kiekis vienoje tab./kaps. Pagalbinės medžiagos 1. Vitaminas C, tabletės („Valentis“, Lietuva) L- askorbo rūgštis (Vitaminas C) (500 mg / tabletėje)
Lipnumą reguliuojančios medžiagos - mikrokristalinė celiuliozė, riebalų rūgščių natrio, kalio ir kalcio druskos ir silicio dioksidas, želatina. 2. Vitaminas C tabletės („Medicata Filia“, Lietuva) L- askorbo rūgštis (Vitaminas C) (500 mg / tabletėje)
Kukurūzų krakmolas, lipnumą reguliuojančioji medžiaga riebiųjų rūgščių magnio druska. 3. Prailginto veikimo vitaminas C mikrogranulių formos kapsulės („Farmax Baltic SIA“, Čekija) L- askorbo rūgštis (Vitaminas C) (500 mg / kapsulėje)
Želatina, erškėčių vaisių (Cynosbati
Pseudo-fructus EP) ekstraktas, tirštiklis
hidroksipropilmetilceliuliozė, tirštiklis etilceliuliozė, stabilizatorius polivinilpirolidonas K30. 4. Forday vitaminas C plus, tabletės („EVD Baltija“, ES) L-askorbo rūgštis (vitaminas C) (600 mg / tabletėje).
Emulsikliai mikrokristalinė celiuliozė ir skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, dygliuotojo šaltalankio (Hippophae
rhamnoides) vaisių sausasis ekstraktas,
lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių magnio druskos, silicio dioksidas, užpildas hidroksipropilmetilceliuliozė. 5. Visionace („Vitabiotics LTD“, Anlija) L-askorbo rūgštis (vitaminas C) (150 mg / tabletėje).
Magnio oksidas 60 mg, retinilo acetatas 300 µg, D-alfa-tokoferilo rūgšties sukcinatas 60 mg, vitaminas D – 2,5 µg, geležies 6 mg, vitaminas B1 – 12 mg, vitaminas B2 - 4,8 mg, vitaminas B3 - 18 mg, pantoteno rūgštis (vitaminas B5) 20 mg, piridoksino
rūgštis 400 µg, cianokobalaminas 9 µg, chromo (III) chloridas 50 µg, vario sulfatas 1000 µg, mangano sulfatas 4 mg, natrio selenatas 150 µg, kalio jodidas 100 µg, cinko sulfatas 15 mg, karotenoidų kompleksas (betakarotenas, gama-karotenas, citroksantinas, beta-zeakarotenas) 3 mg, citrusų bioflavonoidai 15 mg, mėlynių ekstraktas 60 mg, liuteino esteriai 4 mg,
lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė celiuliozė, silicio dioksidas, stearino rūgštis, stabilizatorius skersinio ryšio natrio
karboksimetilceliuliozė, emulsiklis
hidroksipropilceliuliozė, drėgmę išlaikanti medžiaga glicerolis, dažiklis titano oksidas, geležies oksidas, kaprilo/kaprino rūgščių trigliceridai. 6. Bio-VisionTM dengtos tabletės („Pharma Nord“, Danija) L-askorbo rūgštis (vitaminas C) (125 mg / tabletėje).
(dviejose tabletėse): vitamino E (DL-alfa-tokoferilio acetatas) 134mg, vitamino A 1250µg, cinko gliukonatas 20mg, vario gliukonatas 1mg, mėlynių ekstrakto 16mg, liuteino 4mg, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, lipnumą reguliuojanti medžiaga skersinio ryšio natrio karbosimetilceliuliozė, magnio stearatas, glazūros medžiaga
hidroksipropilmetilceliuliozė, talkas, dažiklis titano dioksidas, liuteinas, chlorofilas, kietiklis silicio dioksidas.
Maisto papildai atrinkti atsižvelgiant į sudėtyje esančias medžiagas ir jų kiekius. Tyrimui buvo pasirinkta vienkomponenčiai maisto papildai su vitaminu C ir daugiakomponenčiai, kurių sudėtį papildo įvairus vitaminų kompleksas ir vaistinių augalų ekstraktai.
3.2.
Naudoti reagentai
L-askorbo rūgšties standartas 99 proc. (Sigma-Aldrich, JAV); Distiliuotas vanduo (vandens distiliavimo sistema „Milipore“);
Koncentruota druskos rūgštis (konc. HCl) („Sigma-Aldrich”, Kanada); Kalio jodidas (KI) (Sigma-Aldrich, JAV);
Jodo milteliai; Krakmolo milteliai;
3.3. Naudota aparatūra ir indai
Tiriamųjų maisto papildų susmulkintų tablečių svėrimui buvo naudojamos elektroninės analitinės svarstyklės (Vokietija). Bendras l-askorbo rūgšties kiekis buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą („Spectronic Camspec M550“, Barley Hill Road Garforth Leeds, Anglija). Bandiniams tirti naudotos 1 cm skersmens kiuvetės. Taip pat buvo naudojama piesta ir grūstuvė, matavimo kolba 100 ml, biuretė 25 ml, matavimo stiklinė 50 ml, kūginė (Erlenmejerio) kolba 250 ml, šildytuvas, plastikinės pipetės, automatinė pipetė (JAV).
3.4. Tyrimo metodai
3.4.1. Kokybinis askorbo rūgšties maisto papilduose nustatymas
Askorbo rūgšties kokybinė analizė buvo atlikta remiantis Europos farmakopėjos (01/2011:0253) monografija.
Visų tiriamųjų maisto papildų tabletės buvo susmulkintos grūstuvėje ir atsverta po 0,01 g. Atsverti milteliai suberti į 100 ml matavimo kolbą ir ištirpinti distiliuotame vandenyje.
Mėginių atmatuota po 1 ml ir sumaišyta su 1 ml 5M HCl, bei ištirpinta distiliuotame vandenyje 10 ml kolboje. Atskirai atsverta 0,34 mg sidabro nitrato ir ištirpinta 20 ml distiliuoto vandens.
Į atskirus mėgintuvėlius su automatine pipete atmatuota po 0,2 ml sidabro nitrato ir 1 ml pagaminto tiriamojo tirpalo. Stebimas pilkų nuosėdų susidarymas.
3.4.2. Kiekybinis askorbo rūgšties, maisto papilduose, nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Tiriamo tirpalo ruošimas: visos tiriamosios maisto papildų tabletės buvo atskirai
susmulkintos grūstuvėje ir atsverta po 0,01 g. Atsverti milteliai buvo suberti į matavimo kolbą, bei ištirpinti 100 ml distiliuoto vandens. Į 10 ml kolbą, iš gautų pagamintų tirpalų paimta po 1 ml mėginio ir 1 ml 5M HCl, bei praskiesta distiliuotu vandeniu iki 10 ml žymos.
Etaloninio tirpalo paruošimas: etaloninių l-askorbo rūgšties miltelių atsverta 0,01 g ir
perkelta į matavimo kolbą, kurioje jie ištirpinti 100 ml distiliuoto vandens.
1 ml pagaminto tirpalo sumaišoma su 1 ml 5M HCl ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 10 ml žymos. Absorbcija matuojama spektrofotometru esant 243 nm bangos ilgiui. Askorbo rūgšties kiekis maisto papilduose apskaičiuojamas pagal formulę:
X =𝐶∗𝑉 𝑚
kur: C – askorbo rūgšties koncentracija; V – tirpalo tūris (ml);
m - tikslus atsvertas tabletės kiekis (g).
Askorbo rūgšties kalibracinei kreivei sudaryti buvo ruošiami 7 žinomų koncentracijų tirpalai (20 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; 1,25 µg/ml; 0,625 µg/ml; 0,3125 µg/ml).
Matavimai kartojami tris kartus. Išmatavus askorbo rūgšties žinomų koncentracijų tirpalų absorbcijas, sudaryta kalibracinė kreivė (7. pav.).
7. pav. Askorbo rūgšties kalibracinis grafikas
Duomenys įvertinami pagal askorbo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0.0545x - 0.0097
R² = 0.9992
y = absorbcijos dydis;
x = bendras l-askorbo rūgšties kiekis, µg/ml.
Kad galima būtų taikyti tiesinę kalibracijos lygtį, koreliacijos koeficientas turėtų būti R2 ≥0,99. Šiame tyrime askorbo rūgšties kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas yra R² = 0.9992, tai rodo, kad galima taikyti tiesinę kalibracijos lygtį.
3.4.3. Kiekybinis askorbo rūgšties, maisto papilduose, nustatymas
titrimetrijos metodu
Vitamino C kiekis nustatytas titruojant jodo tirpalu.
Jodo tirpalo paruošimas: 0,1 M jodo tirpalo paruošimui atsverta 10 g KI į 250ml
matavimo kolbą ir įpilta nedidelis kiekis distiliuoto vandens, po to tirpalas pašildytas. Mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir jame ištirpinama 3,15 g jodo miltelių, bei pripilama 250 ml distiliuoto vandens.
y = 0.0545x - 0.0097 R² = 0.9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 5 10 15 20 25 A b sor b ci ja (AB S) Koncentracija (µg/ml)
Šviežio krakmolo kleisterio (indikatorinis) (0,5%) tirpalo gamyba: pasveriama 0,25 g
krakmolo, tirpinama 50 ml beveik verdančiame vandenyje 100 ml kūginėje kolboje. Maišoma, kol ištirps.
Vitamino C tiriamųjų mėginių tirpalų gamyba: atsitiktinai, iš blisterio, parinktos
tabletės/kapsulės buvo atsvertos ir susmulkintos, iki miltelių susidarymo. Gautas miltelių kiekis ištirpintas distiliuotame vandenyje iki 100 ml žymos.
Etaloninio tirpalo gamyba: į matavimo kolbą atsverta 0,25 g standartiniu l-askorbo
rūgšties milteliu ir ištirpinta distiliuotame vandenyje iki 100 ml žymos.
Titravimas: Į 250 ml kūgine kolbą atmatuota 20 ml pagaminto standarto arba mėginių
tirpalų, bei praskiesta su 150 ml distiliuoto vandens. Į tirpalus įlašinama po 5-6 lašus pagaminto krakmolo tirpalo ir pradedamas titravimas iki mėlynos spalvos atsiradimo.
I3- oksiduoja vitaminą C į dehidroaskorbo rūgštį: C6H8O6 + I3 + H2O → C6H6O6 + 3I- + 2H + Vitaminas C dehidroaskorbo rūgštis
Galutinis taškas yra mėlynos spalvos susidarymas, atsirandantis dėl jodo reakcijos su krakmolo kleisteriu. Askorbo rūgščiai reaguojant su I2 susidaro jodidas, kuris, reaguodamas su krakmolo kleisteriu nesudaro spalvoto junginio. Tačiau sureagavus visai askorbo rūgščiai, atsiranda jodo perteklius, kuris su krakmolo kleisteriu sudaro mėlyną spalvą.
Askorbo rūgšties kiekis maisto papilduose miligramais 100 g produkto (mg%) skaičiavimo formulė:
X =100 ∗ 𝑇 ∗ 𝑉𝑟 𝑉𝑥 ∗ 𝑚
X – askorbo rūgšties kiekis (mg/100 g); V r – titruojant sunaudotas reagento tūris;
T – reagento titras (askorbo rūgšties mg kiekis, nutitruojamas 1 ml reagento); 100 – bendrasis tirpalo tūris (ml);
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Analizuoti maisto papildai su vitaminu C
Šiam tyrimui buvo naudojami maisto papildai, kurių sudėtyje yra vitaminas C, įsigyti Lietuvos visuomenės vaistinėse. Jie pateikti 5 lentelėje.
5. lentelė. Askorbo rūgšties kiekiai (mg) tirtuose maisto papilduose Maisto papildų sudėtis Tirti maisto papildai Sudėtis (mg)
Vienkomponenčiai A 500 B 500 Dvikomponenčiai C 500 D 600 Kompleksiniai E 150 F 125
Viso buvo ištirta 6 skirtingi maisto papildai. Du vienkomponenčiai (A ir B) į kurių sudėtį įėjo po 500 mg askorbo rūgšties. Du dvikomponenčiai (C ir D) ant C papildo pakuotės pažymėta 500 mg vitamino C, o ant D – 600 mg. Bei du kompleksiniai (E ir F) maisto papildai. Ant E pakuotės pažymėta, kad jo sudėtyje yra 150 mg askorbo rūgšties, o ant F – 125 mg.
Vienkomponenčiuose (A ir B) ir dvikomponenčiuose (C ir D) maisto papilduose dažniausiai įdėtos didesnės vitamino C dozės, skirtos tikslingai askorbo rūgšties avitaminozei gydyti. Kompleksiniuose (E ir F) papilduose nurodomos mažesnės vitamino C dozės, skirtos profilaktikai, bei derinamos su kitomis medžiagomis esančiomis maisto papildo sudėtyje.
3.1. Kokybinis askorbo rūgšties nustatymas
8 Pav. Kokybinis askorbo rūgšties, sureagavusių mėginių, tyrimų rezultatas. Nr.1 mėgintuvėlyje - etaloninis 99 proc. l-askorbo rūgšties tirpalas. Nr.2 vienkomponentis maisto papildas – A, Nr.3 – vienkomponentis maisto papildas - B, Nr. 4 – dvikomponentis
maisto papildas - C, Nr.5 – dvikomponentis maisto papildas - D, Nr.6 – kompleksinis maisto papildas - E, Nr.7 – kompleksinis maisto papildas - F.
Nr.1 mėgintuvėlyje buvo ištirpintas etaloninis 99 proc. l-askorbo rūgšties tirpalas. Pagal Nr.1 mėgintuvėlį buvo lyginami kiti tiriamieji maisto papildai.
Lyginamajame askorbo rūgšties tirpale, kaip ir tirtuose mėginiuose, iškrito pilkos spalvos nuosėdos ir tirpalas susidrumstė. Tai rodo, kad įvyko reakcija tarp askorbo rūgšties ir sidabro nitrato, kurios metu askorbo rūgštis dėl sidabro nitrato poveikio, redukavosi į dehidroaskorbo rūgštį ir iškrito pilkos spalvos nuosėdos.
3.2. Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Spektrofotometrija yra naudojama tiek kokybinėje, tiek kiekybinėje analizėje. Spektrofotometrijos principas - medžiagos absorbcijos (sugėrimo) intensyvumas prie tam tikro bangos ilgio yra tiesiogiai proporcingas tos medžiagos koncentracijai.
Šio tyrimo metu askorbo rūgšties kiekis buvo nustatinėjamas ir pagal 9.5 Europos farmakopėjos monografijoje (01/2011:0253) aprašytą spektrofotometrijos metodą. Tiriant maisto papildus buvo nustatytas askorbo rūgšties kiekio įvairavimas juose, kuris išreikštas mg/g. Mėginiai buvo atliekami tris kartus. Gauti rezultatai pateikti 3.2.1. ir 3.2.2. skyriuose.
3.2.1. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas maisto papilduose,
spektrofotometriniu metodu.
Pagal kalibracinę kreivę buvo suskaičiuotas askorbo rūgšties kiekis maisto papilde, gautas spektrofotometriniu metodu. Rezultatai pavaizduoti 9 paveikslėlyje.
9 pav. Spektrofotometriniu metodu nustatytas askorbo rūgšties kiekis (mg/g) maisto papilduose
3.2.2. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto spektrofotometriniu metodu
ir nurodytu ant maisto papildo pakuotės, rezultatų
palyginimas
Askorbo rūgšties kiekis nurodytas ant maisto papildo pakuotės buvo palygintas su rezultatais, gautais spektrofotometriniu metodu. Duomenys maisto papildo etiketėje buvo išreikšti skirtingais ekvivalentais, nei rezultatai, nustatyti spektrofotometriniu metodu, todėl siekiant juos palyginti buvo atliktas ant maisto papildų pakuočių pateiktų nurodytų kiekių perskaičiavimas iš miligramų į spektrofotometrinio metodo gautas išraiškas mg/g. Gauti rezultatai pateikti 10 paveikslėlyje.
10. pav. Askorbo rūgšties kiekio palyginimas, nustatyto spektrofotometriniu metodu ir nurodytu ant pakuotės.
Vienkomponenčiuose maisto papilduose nustatyti rezultatai rodo, kad ant pakuotės nurodomi didesni askorbo rūgšties kiekiai nei apskaičiuoti spektrofotometriniu metodu. Maisto papilde A spektrofotometriniu metodu - nustatyta, kad askorbo rūgšties kiekis yra
801.516 759.323 856.55 577.709 140.185 163.116 833.34 833.34 769.23 697.674 155.175 156.253 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 A sko rb o r ū gšti e s ki e ki s, m g/
g Spektrofotometrinis tyrimo
metodas
801,516 mg/g (96,2 proc.), o papilde B – 759,323 mg/g (91,1 proc.), kai ant abiejų maisto papildų pakuočių nurodyta po 833,34 mg/g vitamino C.
Dvikomponenčiuose maisto papilduose nustatytas skirtumas, tarp tai kas nurodyta ant pakuotės ir ką apskaičiuojama spektrofotometriniu metodu. Maisto papilde C spektrofotometriniu tyrimo metodu nustatyta – 856,55 mg/g (111,4 proc.) vitamino C, kai ant pakuotės nurodomas mažesnis jo kiekis – 769,23 mg/g. Taigi nustatytas didesnis rezultatas, nei nurodyta ant pakuotės. Dvikomponentyje maisto papilde D spektrofotometriniu metodu apskaičiuota – 577,709mg/g (82,8 proc.), kai ant pakuotės nurodomas didesnis vitamino C kiekis – 697,674 mg/g.
Kompleksiniuose maisto papilduose, kaip ir minėta, yra mažesnis vitamino C kiekis. Maisto papilde E spektrofotometriniu metodu nustatyta – 140,185 mg/g (90,3 proc.), o ant pakuotės, nurodytas didesnis askorbo rūgšties kiekis 155,175 mg/g. Kompleksiniame maisto papilde F tyrimo metodu nustatyta – 163,116 mg/g (104,4 proc.), kai ant pakuotės nurodyta – 156,253 mg/g.
Palyginus rezultatus, nustatytus spektrofotometriniu metodu su duomenimis, pateiktais ant maisto papildų pakuočių, kurie svyruoja nuo 17,2 proc. trūkumo iki 11,4 proc. askorbo rūgšties pertekliaus, galima teigti, kad nors ant pakuotės nurodomas nevisiškai tikslus vitamino C kiekis, tačiau atitinka normas, kuriuose gali būti kiekio svyravimas (nemažiau nei 20 proc. arba nedaugiau kaip 50 proc. medžiagos). Tirti maisto papildai spektrofotometriniu metodu ir jų nustatyti rezultatai atitinka normas ir maisto papildai yra kokybiški.
3.3. Titrimetrinės analizės rezultatai
Literatūros duomenimis askorbo rūgšties kiekio nustatymui gali būti taikomi įvairūs metodai: titrimetrija, fluorimetrija, chromatografija su spektrofotometriniu detektoriumi ir kiti. Antram askorbo rūgšties kiekybinės analizės metodui pasirinkta titrimetrija. Tiriant maisto papildus buvo nustatytas askorbo rūgšties kiekio juose, kuris išreikštas miligramais.
3.3.1.
Askorbo rūgšties kiekio nustatymas maisto papilduose
titrimetriniu metodu
Pagal askorbo rūgšties kiekio maisto papilduose miligramais 100 g produkto (mg%) skaičiavimo formulę buvo suskaičiuotas vitamino C kiekis gautas titrimetriniu metodu ir rezultatai pavaizduoti 11 paveikslėlyje.
11 pav. Titrimetriniu metodu nustatytas askorbo rūgšties kiekis (mg) maisto papilduose
3.3.2. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto titrimetriniu metodu ir
nurodytu ant maisto papildo pakuotės, rezultatų palyginimas
Askorbo rūgšties kiekis nurodytas ant pakuotės buvo palygintas su rezultatais, nustatytais titrimetriniu metodu. Apskaičiuoti rezultatai pateikti 12 paveikslėlyje.12 pav. Askorbo rūgšties kiekio palyginimas, nustatytas titrimetriniu metodu ir nurodytu ant maisto papildo pakuotės
Vienkomponenčiuose maisto papilduose A ir B, kaip minėta, titirimetriniu metodu nustatyti rezultatai buvo vienodi po 450 mg (90 proc.), taip pat ant maisto papildų pakuočių nurodyti vienodi vitamino C kiekiai po 500 mg. Skirtumas tarp kiekio nurodyto ant maisto papildo pakuotės ir rezultatų nustatytų titrimetriniu analizės metodu – 50 mg (10 proc.).
Dvikomponentyje C maisto papilde titrimetriniu metodu nustatyta, kad askorbo rūgšties yra 468,19 mg (94 proc.), kai ant maisto papildo pakuotės nurodytas didesnis vitamino C kiekis (500 mg). Dvikomponentyje maisto papilde D, titrimetriniu metodu apskaičiuota – 704,55 mg (117 proc.) askorbo rūgšties, o ant pakuotės nurodytas mažesnis jo kiekis – 600 mg (skirtumas 17 proc. didesnis).
Palyginus kompleksinio E maisto papildo rezultatus, apskaičiuotus titrimetriniu metodu ir tai kas pateikta ant pakuotės, buvo nustatyti vienodi vitamino C kiekiai, po 150 mg (100 proc.). Kompleksiniame F maisto papilde ant pakuotės pažymėta – 125 mg vienoje tabletėje, kai titrimetriniu metodu buvo nustatyta didesnis kiekis – 131,82 mg (105,5 proc.). Skirtumas tarp kiekio, nurodyto ant maisto papildo pakuotės ir rezultatų, nustatytų titrimetriniu analizės metodu, buvo 6,82 mg (5,5 proc.).
Palyginus rezultatus, nustatytus titrimetriniu metodu ir pateiktais ženklinimais ant maisto papildo pakuotės, galima teigti, kad daugumoje maisto papildų etikečių nurodomas tikslus vitamino C kiekis, kuris svyruoja nuo 10 proc. trūkumo iki 17 proc. askorbo rūgšties pertekliaus. Tačiau šie kiekio svyravimai atitinka leidžiamas normas maisto papildams (nemažiau nei 20 proc. ir nedaugiau kaip 50 proc. medžiagos). Tirti maisto papildai titrimetriniu metodu ir jų nustatyti rezultatai atitinka normas ir maisto papildai yra kokybiški.
3.4. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto spektrofotometriniu ir
titrimetriniu metodu, rezultatų palyginimas
Askorbo rūgšties kiekis nustatytas spektrofotometriniu ir titrimetriniu metodu. Šių analizių rezultatai buvo palyginti tarpusavyje.
13. pav. Askorbo rūgšties kiekio, nustatyto titrimetriniu ir spektrofotometriniu metodais, rezultatų palyginimas.
Spektrofotometriniu metodu atliktų tyrimų rezultatai skyrėsi nuo rezultatų, nustatytų taikant titrimetrinį analizės metodą.
Vienkomponenčiuose A ir B maisto papilduose titrimetriniu analizės metodu, nustatyta kad askorbo rūgšties kiekis yra po 450 mg (10 proc. vitamino C trūkumas). Spektrofotometriniu analizės metodu nustatyti didesni kiekiai, t.y. maisto papildas A - 480,91 mg (3,8 proc. trūkumas). Nustatytas 6,2 proc. skirtumas tarp nurodytų metodų. Maisto papilde B apskaičiuota – 455,59 mg (8,9 proc. askorbo rūgšties trūkumas). Nustatytas 1,1 proc. skirtumas tarp nurodytų metodų.
Dvikomponenčiuose maisto papilduose (palyginus dviem analizės metodais) skyrėsi askorbo rūgšties kiekis. Maisto papilde C titrimetriniu analizės metodu nustatyta – 468,19 mg (6 proc. trūkumas) vitamino C, kai spektrofotometriškai – 556,75 mg (11,4 proc. askorbo rūgšties perteklius). Nustatyta 17,4 proc. skirtumas tarp nurodytų metodų. Dvikomponenčiame maisto papilde D titrimetriniu analizės metodu nustatytas kiekis 704,55 mg (17 proc. perteklius), o mažesnis kiekis apskaičiuotas spektrofotometriniu analizės
metodu – 496,83 mg (17,2 proc. trūkumas). Palyginus dviem tirtais skirtingais analizės metodais, dvikomponenčiuose maisto papilduose matomas askorbo rūgšties 34,2 proc. skirtumas. Tam galėjo turėti įtakos esantys augaliniai (šaltalankių ir erškėčių) ekstraktai esantys maisto papilduose.
Kompleksiniuose maisto papilduose E titrimetriniu metodu nustatyta – 150 mg (100 proc.), o papilde F - 131,82 mg (5,5 proc. pertekliaus). Palyginus su rezultatais nustatytais spektrofotometriniu analizės metodu maisto papilde E apskaičiuota – 135,51 mg (9,7 proc. trūkumas). Nustatyta 9,7 proc. skirtumas tarp nurodytų metodų. Maisto papilde F – 130,49 mg (4,4 proc. pertekliaus) t.y. 1,1 proc. skirtumas tarp tirtų metodų.
4. IŠVADOS
1. Atlikus kokybinę analizę tirtuose maisto papilduose, kurių sudėtyje yra vitamino C, įvyko reakcija su sidabro nitratu ir susidarė pilkos spalvos nuosėdos, įrodančios šios medžiagos buvimą preparatų sudėtyje.
2. Spektrofotometriniu metodu nustatyti rezultatai: maisto papilduose vitamino C kiekis įvairavo nuo 17,2 proc. trūkumo iki 11,4 proc. pertekliaus. Šio kiekio svyravimas atitinka maisto papildų normos ribas (nemažiau nei 20 proc. ir nedaugiau kaip 50 proc. medžiagos), todėl tirti maisto papildai spektrofotometriniu metodu ir jų apskaičiuoti rezultatai atitinka nustatytas vitamino C kiekio ribas.
3. Titrimetriniu metodu nustatyti rezultatai: maisto papilduose askorbo rūgšties kiekis svyravo nuo 10 proc. trūkumo iki 17 proc. pertekliaus. Šio kiekio įvairavimai atitinka leidžiamas maisto papildų normos ribas (nemažiau nei 20 proc. ir nedaugiau kaip 50 proc. medžiagos), todėl tirti maisto papildai titrimetriniu metodu ir jų nustatyti rezultatai atitinka vitamino C normas.
5. NAUDOTA LITERATŪRA
1. Dėl Lietuvos higienos normos HN 17:2010 „Maisto papildai“ patvirtinimo. Lietuvos Respublikos Sveikatos Apsaugos Ministro įsakymas. 2010;(677).
2. Europos parlamento ir tarybos direktyva 2002/46/EB 2002 m. birželio 10 d. dėl valstybių narių įstatymų, susijusių su maisto papildais, suderinimo. Europos bendrijų oficialusis leidinys. 2002;490–7.
3. Baltušytė I., Bartkevičiūtė R., Barzda A., Dirmienė K., Drungilas V ir kt. Nacionalinės sveikatos tarybos metinis pranešimas 2015 mityba ir sveikata. 2015;
4. Vissers A. Increasing Vitamin C Content in Plant Foods to Improve Their Nutritional Value—Successes and Challenges. Vitamin C and human health. California; 2014. p. 203–25.
5. Fain O. [Vitamin C]. Review Prat [Internet]. 2013 Oct;63(8):1091–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24298827
6. Compound Summary for CID 54670067. Ascorbic acid [Internet]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ascorbic_acid#section=Top
7. Acidum ascorbicum. In: European Pharmacopoeia 70. 2011. p. 1418–20.
8. Eitenmiller RR, Landen WO, Jr, Ye L. Vitamin Analysis for the Health and Food
Sciences, Second Edition. 2007;664. Available from:
https://books.google.com/books?id=ynRFKhXRmvkC&pgis=1
9. Iqbal K, Khan A, Ali Khan Khattak M. Biological Significance of Ascorbic Acid (Vitamin C) in Human Health - A Review. Pakistan Journal of Nutrition [Internet]. 2004;3(1):5–13. Available from: http://www.scialert.net/abstract/?doi=pjn.2004.5.13 10. Hemilä H. Vitamin C and Infections. Department of Public Health, University of
Helsinki, Helsinki 2017;
11. Shibuya S, Ozawa Y, Toda T, Watanabe K, Tometsuka C, Ogura T, et al. Collagen peptide and vitamin C additively attenuate age-related skin atrophy in Sod1-deficient mice. Bioscience, biotechnology, and biochemistry [Internet]. 2014;78(7):1212–20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25229861
12. May JM, Qu Z, Meredith ME. NIH Public Access. 2013;(615):1–14.
of Health Sciences, 2008.
14. Sultana T, DeVita M V, Michelis MF. Oral vitamin C supplementation reduces erythropoietin requirement in hemodialysis patients with functional iron deficiency. International urology and nephrology [Internet]. 2016 Sep;48(9):1519–24. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27170339
15. Grosso G, Bei R, Mistretta A, Marventano S, Calabrese G, Masuelli L, et al. Effects of vitamin C on health: a review of evidence.Frontiers in bioscience (Landmark Edition)
[Internet]. 2013 Jun 1;18:1017–29. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23747864
16. Adullah M, Attia F. Vitamin, C (Ascorbic Acid) [Internet]. StatPearls. 2018. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29763052
17. Carr A, Maggini S. Vitamin C and Immune Function. Department of Pathology, University of Otago. 2017;1–25.
18. Oudemans-van Straaten HM, Spoelstra-de Man AM, de Waard MC. Vitamin C revisited. Critical care (London, England) [Internet]. 2014 Aug 6;18(4):460. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25185110
19. Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt K V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of botany [Internet]. 2003 Jan;91 Spec No:179–94. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12509339
20. Padayatty SJ, Katz A, Wang Y, Eck P, Kwon O, Lee J-H, et al. Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention. Journal of the American College of Nutrition [Internet]. 2003 Feb;22(1):18–35. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12569111
21. Varadharaj S, Steinhour E, Hunter MG, Watkins T, Baran CP, Magalang U, et al. Vitamin C-induced activation of phospholipase D in lung microvascular endothelial cells: regulation by MAP kinases.Cellular signalling [Internet]. 2006 Sep;18(9):1396– 407. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16376521
22. Martinez M del C, Afonso SG, Buzaleh AM, Batlle A. Protective action of antioxidants on hepatic damage induced by griseofulvin. Scientific world journal
[Internet]. 2014;2014:982358. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24523661
C is a kinase inhibitor: dehydroascorbic acid inhibits IkappaBalpha kinase beta. Molecular Cellular Biology [Internet]. 2004 Aug;24(15):6645–52. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15254232
25. Guaiquil VH, Golde DW, Beckles DL, Mascareno EJ, Siddiqui MAQ. Vitamin C inhibits hypoxia-induced damage and apoptotic signaling pathways in cardiomyocytes and ischemic hearts. Free Radical Biology and Medicine [Internet]. 2004 Nov 1;37(9):1419–29. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15454281 26. Perry ME, Page N, Manthey DE, Zavitz JM. Scurvy: Dietary Discretion in a
Developed Country. Clin Pract cases Emerg Med [Internet]. 2018 May;2(2):147–50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29849264
27. Zarban A, Toroghi MM, Asli M, Jafari M, Vejdan M, Sharifzadeh G. Effect of vitamin C and E supplementation on total antioxidant content of human breastmilk and infant urine. Breastfeeding medicine : the official journal of the Academy of Breastfeeding Medicine [Internet]. 2015 May;10(4):214–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25915716
28. Asđt A, Bđr B. an Overview of Ascorbic Acid Biochemistry.Gazi University, Faculty of Pharmacy, Department of Biochemistry, Turkey. 2009;38(3):233–55.
29. Lykkesfeldt J. Smoking depletes vitamin C: Should smokers be recommended to take supplements? Cigar Smoke Oxidative Stress. 2006;237–60.
30. Nishikimi M, Yagi K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. The American journal of clinical nutrition [Internet]. 1991;54(6 Suppl):1203S–1208S. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1962571
31. Jia X, Wang Z, Zhang B, Su C, Du W, Zhang J, et al. Food Sources and Potential Determinants of Dietary Vitamin C Intake in Chinese Adults: A Cross-Sectional Study. Nutrients [Internet]. 2018 Mar 7;10(3). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29518947
32. Tobergte DR, Curtis S. Vitamin and mineral requirements in human nutrition. Journal of Chemical Information and Modeling. 2013;53(9):1689–99.
33. Algahtani HA, Abdu AP, Khojah IM, Al-Khathaami AM. Inability to walk due to scurvy: A forgotten disease. Annals of Saudi medicine [Internet]. 30(4):325–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20622353
http://www.karger.com/?doi=10.1159/000434757
35. Graumlich JF, Ludden TM, Conry-Cantilena C, Cantilena LR, Wang Y, Levine M. Pharmacokinetic model of ascorbic acid in healthy male volunteers during depletion and repletion. Pharmceutical Research [Internet]. 1997 Sep;14(9):1133–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9327438
36. Yaich S, Chaabouni Y, Charfeddine K, Zaghdane S, Kharrat M, Kammoun K, et al. Secondary oxalosis due to excess vitamin C intake: a cause of graft loss in a renal transplant recipient. Saudi journal of kidney diseases and transplantation. [Internet].
2014 Jan;25(1):113–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24434393
37. Fadhel D. Spectrophotometric Determination of Ascorbic Acid in Aqueous Solutions. Journal of Al-Nahrain University. 2012;15(3):88–94.
38. College of Science Determination of Vitamin C Concentration by Titration. Collage of science. University of Canterbury.
39. Kubilay G, Esma T, Ozy M. Spectrophotometric determination of ascorbic acid using copper ( II )– neocuproine reagent in beverages and pharmaceuticals. Istanbul University, Faculty Chemistry Department. 2005;65:1226–32.
40. Da AF, Badea M, Aboul-enein HY. Flow injection system with chemiluminometric detection for enzymatic determination of ascorbic acid. University of Bucharest, Faculty of Chemistry 2000;305–9.
41. Hussein A.Z.M. Spectrophotometric Determination of Ascorbic acid in Aqueous Solutions and in Pharmaceuticals formulations. Journal of Al-Nahrain University [Internet]. 2013;16(3):65–71. Available from: http://jnus.org/pdf/1/2013/1/876.pdf 42. howdhury MS. Determination of amount of Vitamin C ( Ascorbic Acid ) from supplied
