5 priedas DARBAS ATLIKTAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas “
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Toma Mikitiejeva
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Toma Mikitiejeva
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-21 prof. Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data ) (katedros vedėjos parašas)
vardas, pavardė) Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TOMA MIKITIEJEVA
RAUKŠLĖTALAPIŲ ERŠKĖČIŲ (ROSA RUGOSA THUNB.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Mindaugas Liaudanskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr Ramunė Morkūnienė Data
RAUKŠLĖTALAPIŲ ERŠKĖČIŲ (ROSA RUGOSA THUNB.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Mindaugas Liaudanskas
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Data Toma Mikitiejeva
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1 Rosa L. genties augalų taksonominė įvairovė, paplitimas, morfologiniai požymiai ... 13
1.2 Raukšlėtalapių erškėčių organų cheminė sudėtis ... 14
1.3 Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai iš augalinių žaliavų ... 16
1.4 Kokybiniai ir kiekybiniai fenolinių junginių nustatymo metodai ... 17
1.5 Raukšlėtalapių erškėčių lapų preparatų biologinio poveikio tyrimai ... 19
1.6 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 21
2. METODIKA ... 22
2.1 Tyrimo objektas... 22
2.2 Naudoti reagentai ... 23
2.3 Naudota aparatūra ... 23
2.4 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ištraukų paruošimas ... 24
2.5 Tyrimo metodai ... 25
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 25
2.5.2 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant FRAP metodiką ... 25
2.5.3 Laisvųjų radikalų surišimo in vitro įvertinimas, taikant ABTS metodiką ... 26
2.5.4 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 27
2.6 Tyrimo duomenų analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.2 Skirtingose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių sudėties ir
jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro įvairavimas ... 31
3.2.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose ... 32
3.2.2 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 33
3.2.4 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių, rinktų skirtingose vietovėse, individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas ... 36
3.3 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių sudėties įvairavimas vegetacijos metu ... 42
3.3.1 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas vegetacijos metu ... 42
3.3.2 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ištraukų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro įvairavimas vegetacijos metu ... 43
3.3.4 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių, rinktų vegetacijos metu, individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas ... 46
3.4 Rezulatų apibendrinimas ... 51
4. IŠVADOS ... 53
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 55
SANTRAUKA
T. Mikitiejevos magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. M. Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas.
Tyrimo tikslas: Ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos laikotarpiu surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą ir įvertinti ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai: Atlikti Lietuvoje augančių Rosa rugosa Thunb. lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymą. Taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrinį analizės metodą, ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos periodo metu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį ir jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Įvertinti priklausomybę tarp R. rugosa lapų ėminių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro. ESC metodu nustatyti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos periodo metu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą.
Tyrimo objektas ir metodai: Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiai, surinkti 2018 metais birželio – rugpjūčio mėnesiais, keturiolikoje skirtingų Lietuvos vietovių ir lapų ėminiai rinkti skirtingais fenologiniais tarpsniais, 2019 metų birželio – lapkričio mėnesiais. Bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas in vitro nustatytas UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių sudėtis vertinta pritaikius ESC metodą.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (452,28±5,60 mg GRE/g) nustatytas raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminius ekstrahuojant 40 proc. (v/v) etanoliu, 70 min., esant 678 W ultragarso vonelės galiai. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Stanaičių kaime (Kauno raj.) (343,56±4,58 mg GRE/g) rinktų lapų ėminiuose. Stipriausias redukcinis aktyvumas (2,60±0,21 mmol TE/g) nustatytas ištyrus raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių, rinktų Kašėtų kaime (Varėnos raj.) ištraukas, o stipriausias antiradikalinis aktyvumas (3,50±0,34 mmol TE/g) – ištyrus Stanaičių kaime (Kauno raj.) surinktų lapų ėminių ištraukas. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (443,02±0,61 mg GRE/g) nustatytas lapkričio 1 dieną surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu in vitro pasižymėjo lapų ėminių, rinktų spalio 22 dieną ir lapkričio 1 dieną, ištraukos. Nustatyta stipri koreliacija tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (r=0,769). Atlikus raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių, rinktų skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos periodo metu, ESC kokybinę ir kiekybinę analizę, identifikuoti 9 junginiai: procianidinas B1, chlorogeno rūgštis, procianidinas
B2, procianidinas C1, p-kumaro rūgštis, izokvercitrinas, reinotrinas, avikuliarinas, kvercitrinas. Skirtingose vietovėse ir vegetacijos periodo metu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose dominavo procianidinas B2 – flavan-3-olių grupės junginys.
SUMMARY
T. Mikitiejeva master‘s thesis. Research supervisor Dr. M. Liaudanskas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas.
The title of the master thesis. Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in wrinkled rose (Rosa rugosa Thunb.) leaves.
The aim of the research. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds and to evaluate the antioxidant activity in vitro of wrinkled rose leaves, collected in different parts of Lithuania and during vegetation period.
The objectives of the research. To select the extraction conditions of phenolic compounds in the samples of wrinkled roses‘ leaves. To determine the quantitative composition of phenolic compounds and antioxidant activity in vitro variation in the samples of wrinkled roses‘ leaves, which have grown in different places in Lithuania and during vegetation period. To evaluate the correlation between quantities of total phenolic compounds and the antioxidant activity in vitro. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of wrinkled roses‘ leaves, collected in different parts of Lithuania and during vegetation period by HPLC methodology.
The object and methods of the research. The object is Rosa rugosa Thunb. leaves, collected in 14 different places in Lithuania between June and August 2018 and at different phenology phases between June and November 2019. Total phenolic compounds amount and antioxidant activity of Rosa rugosa Thunb. extracts were determined by UV– VIS spectrophotometric analysis method. The qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was performed by HPLC method.
The results and conclusions of the research. The highest amount of total phenolic compounds was obtained by using 40 % (w/w) ethanol, 678 W ultrasound power for 70 minutes. The highest amount of total phenolic compounds were determinated in the sample of Rosa rugosa Thunb. leaves, collected in Stanaiciai village (Kaunas distr.) (343,56±4,58 mg GRE/g). The strongest reducing power, which was measured by FRAP method, was determinated in extract of the sample of wrinkled rose leaves from Kasetos village (Varena distr.) (2,60±0,21 TE mmol/g), the strongest antiradical activity (3,50±0,34 TE mmol/g), measured by ABTS method, was found in Rosa rugosa Thunb. leaves sample, collected in Stanaiciai village (Kaunas distr.). The highest amount of total phenolic compounds (443,02±0,61 mg GRE/g) were determined in Rosa rugosa Thunb. leaves, collected in the end of vegetation (November 1). The strongest FRAP and ABTS antioxidant activity were determinated in extracts of wrinkled roses‘ leaves, collected in the end of vegetation (October 22 and November 1). The strongest correlation was estimated between the amount of total phenolic compounds content and antiradical activity (r=0,769). The nine phenolic
compounds procyanidin B1, chlorogenic acid, procyanidin B2, procyanidin C1, p-coumaric acid, isoquercitrin, reynoutrin, avicularin, quercitrin were identified and quantified by HPLC method.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis);ANOVA – kriterijus rezultatų statistiniam patikimumui įvertinti (angl. analysis of variance); CV – variacijos koeficientas (angl. coefficient of variation);
DC – dujų chromatografija (angl. gas chromatography); ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FC – Folin–Ciocalteu reagentas;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power); GRE – galo rūgšties ekvivalentas;
KE – kapiliarinė elektroforezė; MS – masių spektrofotometrija; TE – trolokso ekvivalentas;
TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas;
ĮVADAS
Įvairių augalinių vaistinių preparatų, maisto papildų ir kitų produktų, pagamintų iš natūralių žaliavų, vartojimas pastaraisiais dešimtmečiais nuolat didėja [1]. Pasaulio sveikatos organizacijos parengtoje tradicinės medicinos strategijoje ypač akcentuojama šios medicinos svarba ligų prevencijai ir papildomam gydymui [2]. Vis didesnis medicinos, farmacijos ir gretutinių sričių mokslininkų dėmesys skiriamas augalų ir jų teikiamų žaliavų fitocheminės įvairovės tyrimams. Šių tyrimų rezultatai yra itin svarbūs kuriant augalinius vaistinius preparatus ir maisto papildus, atliekant naujų, potencialiai perspektyvių augalinių žaliavų paieškas.
Augalų teikiamose žaliavose nustatyta biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių įvairiapusiu biologiniu poveikiu. Viena iš perspektyviausių ir plačiausiai tyrinėtų šių junginių grupių yra fenoliniai junginiai. Fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai, mažina hipertenzijos, aterosklerozės, vėžio ligų riziką, pasižymi antibakteriniu ir priešmikrobiniu poveikiu [3]. Jų antioksidacinis poveikis susijęs su laisvųjų radikalų surišimu ir gebėjimu apsaugoti ląsteles nuo žalingo oksidacinio streso, sukeliančio ląstelių struktūrinių komponentų pažaidas [4]. Svarbu tirti potencialiai vertingas augalines žaliavas, siekiant nustatyti augalų teikiamų žaliavų fitocheminę sudėtį ir išsiaiškinti jų preparatų biologinį poveikį [1].
Raukšlėtalapių erškėčių lapai yra fenolinių junginių šaltinis. Raukšlėtalapių erškėčių lapuose kaupiami fenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys), vitaminai (askorbo rūgštis, tiaminas, karotenoidai), eteriniai aliejai [5, 6]. Priklausomai nuo augalo vegetacijos tarpsnio, augavietės, išorinių aplinkos veiksnių, augalinių žaliavų kaupiamų biologiškai aktyvių junginių sudėtis, lemianti iš jų pagamintų preparatų poveikį, gali įvairuoti. Raukšlėtalapių erškėčių lapai naudojami arbatų ir maisto papildų gamyboje. Moksliniais tyrimais įrodytas raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ištraukų antioksidacinis, priešvėžinis, antidiabetinis, uždegimą slopinantis, antimikrobinis poveikis [7].
Raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių sudėties tyrimų stoka tiek Lietuvos, tiek užsienio mokslinėje literatūroje, paskatino ištirti šios augalinės žaliavos kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti iš jos pagamintų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Tyrimų rezultatai pateiks naujų žinių, kurio fenologinio tarpsnio metu raukšlėtalapių erškėčių lapuose sukaupiamas didžiasias fenolinių junginių – natūralių antioksidantų kiekis. Gauti duomenys suteiks naujos informacijos apie Lietuvos klimato sąlygomis skirtingose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą. Gauti duomenys galėtų būti panaudoti maisto papildų, arbatų bei funkcinio maisto kūrimui ir gamybai, individualių, specifiniu poveikiu pasižyminčių junginių išskyrimui.
Šio mokslinio darbo tikslas – ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos laikotarpiu surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos laikotarpiu surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas.
2. Ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos periodo metu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą.
3. Nustatyti skirtingose Lietuvos vietovėse ir skirtingais fenologiniais tarpsniais rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
4. ESC metodu nustatyti skirtingose Lietuvos vietovėse ir vegetacijos periodo metu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą.
5. Įvertinti koreliaciją tarp R. rugosa lapų ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Rosa L. genties augalų taksonominė įvairovė, paplitimas, morfologiniai požymiai
Karalystė: Augalai – Plantae;
Skyrius: Magnolijūnai (Gaubtasėkliai) – Magnoliophyta (Angiospermae); Klasė: Magnolijainiai (Dviskilčiai) – Magnoliopsida (Dicotyledones); Poklasis: Erškėčiažiedžiai – Rosidae;
Eilė: Erškėtiečiai – Rosales;
Šeima: Erškėtiniai – Rosaceae Juss.;
Pošeimis: Erškėtrožiniai – Rosoideae Juss. ex Arn.; Gentis: Erškėtis – Rosa L. [8, 9].
Erškėtiniai (Rosaceae Juss.) yra gaubtasėklių augalų šeima, kuriai priskiriama daugiau nei 100 genčių ir apie 3100 rūšių daugiamečių, rečiau vienmečių žolinių augalų, sumedėjusių medžių ir krūmų [10, 11]. Apie 50 genčių paplitę Šiaurės Amerikoje. Šios šeimos taksonomija yra ginčytina, tačiau dažniausiai išskiriami keturi pošeimiai: migdolinių (Amygdaloideae T. & G..), obelinių (Maloideae C. Weber) (Pomoideae Juss.), erškėtrožinių (Rosoideae Juss ex Arn.) ir lanksvinių (Spiraeoideae Endl.) [11].
Raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) priklauso erškėtinių šeimai. Tai dekoratyvinis, maistinis ir vaistinis augalas, dažniausiai auginamas dėl vaisių ir grožio. Dažnai sodinamas eroduojamuose šlaituose [12] Lietuvoje natūraliai auga 10 erškėčių rūšių, dar 18 auginama, iš jų kelios yra sulaukėjusios [13]. Plačiausiai paplitęs paprastasis erškėtis (Rosa canina L.) – dažnesnis pietinėje Lietuvos dalyje. Kitos dažniausiai Lietuvoje augančių erškėčių rūšys: miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm.), grūdėtasis erškėtis (Rosa rubiginosa L.), tankiadygis erškėtis (Rosa spinosissima L.), švelnialapis erškėtis (Rosa mollis Sm.), raudonlapis erškėtis (Rosa glauca Pourr.) bei geltonlapis erškėtis (Rosa foetida Herrm.). Lietuvoje medicinos tikslams vartojami 3 rūšių erškėčių (paprastųjų, miškinių ir raukšlėtalapių) vaisiai [14].
Raukšlėtalapis erškėtis pirmą kartą aprašytas 1784 m. C. P. Thunberg knygoje „Flora Japonica“ ir tais pačiais metais įtrauktas į Karlo Linėjaus veikalą „Gamtos sistemą“ (Linnaeus' Systema Vegetabilium) [5]. Lietuvoje erškėčių genties rūšys yra gana plačiai paplitusios visoje šalyje, išskyrus šiaurinę Lietuvos dalį. Raukšlėtalapiai erškėčiai, dažniausiai augantys palaukėse ir pakelėse, yra kilę iš Kinijos ir Korėjos. Jie ypač paplitę Tolimuosiuose Rytuose, Kamčiatkoje, Sachaline, Japonijoje, Europoje ir Šiaurės Amerikoje [15, 16]. Pirmieji įrašai apie šį augalą Europoje yra nuo 1796 m., bet žmonių susidomėjimas šia rūšimi
padidėjo tik nuo 1845 m. [8]. Mūsų šalyje raukšlėtalapiai erškėčiai pradėti auginti XX a. pirmojoje pusėje, o pirmieji įrašai apie juos užfiksuoti 1937 m. [12]
Lietuvoje augalas yra įtrauktas į invazinių rūšių sąrašą. Vienas vertingiausių erškėčių požymių, nulemiančių jų plitimą želdynuose, atsparumas žiemos šalčiams. Spartų plitimą lemia ir augalo gebėjimas daugintis sėklomis bei vegetatyviškai – šakniastiebiais. Šiaurės Vakarų Europoje invazinis augalas kelia didelę grėsmę kopų kraštovaizdžiui, natūralios augalijos vertės išsaugojimui. Atliktų tyrimų metu nustatytas neigiamas raukšlėtalapių erškėčių poveikis ir pakrančių augalų įvairovei [17].
Morfologiniai požymiai. Raukšlėtalapis erškėtis yra daugiametis krūmas, augantis iki 2 metrų aukščio. Žydi birželio – rugsėjo mėnesiais. Stiebai statūs, stori, šakos gausiai padengtos 3 – 10 mm ilgio dygliais. Lapai – sudėtiniai, elipsiniai 5–15 cmilgio, sudaryti iš 5–9 lapelių. Jų viršutinė pusė plika, tamsiai žalia, blizganti ir raukšlėta, apatinė – pilkai žalsva bei plaukuota [15]. Prielapiai platūs, smailiomis viršūnėmis, suaugę su lapkočiu. Žiedai taisyklingi, 6–11 cm skersmens, pavieniai arba kekėse po 2–6 [5]. Vainiklapiai 5, gali būti baltos, šviesiai rožinės ar tamsiai rožinės spalvos, kvapūs. Kuokelių 5 arba 5n, mezginių nuo daug iki dviejų suaugusių [5]. Vaislapynas dažniausiai apokarpinis, rečiau cenokarpinis. Augalas subrandina didelius, rutuliškus 3–4 cm skersmens vaisius, kurie yra šiek tiek suploti ir subręsta vasaros pabaigoje [5, 12]. Vaisiaus minkštimas oranžinis, miltingas, saldžiarūgštis. Raukšlėtalapis erškėtis dažniausiai auga smėlėtose ar žvyrėtose pakelėse, kopų ir pievų bendrijose, žemės ūkio ar miestų vietovėse [9]. Savaime gali augti ir šalia greitkelių, nes šiam augalui dirvožemio druskingumas didelio poveikio neturi. Jis labai atsparus ligoms ir įvairiems kenkėjams [8].
1.2 Raukšlėtalapių erškėčių organų cheminė sudėtis
Kaip vaistinė augalinė žaliava dažniausiai naudojami erškėčių vaisiai, rečiau – lapai, žiedai, šaknys. Mokslinės literatūros duomenimis, visuose raukšlėtalapių erškėčių organuose yra biologiškai aktyvių junginių [18]. Raukšlėtalapių erškėčių šaknyse kaupiami flavan-3-oliai ir triterpeniniai junginiai, lapuose – hidrolizuojami taninai, flavonoidai, monoterpenai, seskviterpenai ir triterpenai, žieduose nustatyta įvairių eterinio aliejaus komponentų, fenolinių rūgščių (galo rūgštis), antocianinų (cianidinas, peonidinas), vaisių ėminiuose – karotenoidų ir fenolinių rūgščių (galo rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo rūgštis) [15, 19].
Fenoliniai junginiai. Raukšlėtalapių erškėčių lapai kaupia fenolinius junginius, daugiausia identifikuota flavonoidų ir fenolinių rūgščių. Fenolinių junginių nustatyta raukšlėtalapių erškėčių lapuose,
žieduose ir šaknyse, žiedlapiuose – dideli kiekiai hidrolizuojamų taninų, o šaknyse randama kondensuotų taninų ir flavan-3-olių grupės junginių [7]. Žiedų ėminiuose identifikuotos fenolinės rūgštys: ferulo rūgštis, kafeino rūgštis, p-kumaro ir chlorogeno rūgštys. Nesubrendusiuose erškėčių vaisiuose nustatyti flavan-3-olių ir flavonflavan-3-olių grupių junginiai [7]. Dideli kiekiai fenolinių junginių, tokių kaip pirogalolis ir pirokatecholis, yra išskiriami pažeidus lapus. Šie junginiai yra reikšmingi antimikrobiniam aktyvumui prieš fitopatogeninius grybus ir bakterijas [5]. Naujausi tyrimai parodė, kad tinktūros irištraukos, pagamintos iš raukšlėtalapių erškėčiųžiedų ir lapų, pasižymi dideliu flavonoidų kiekiu. Jose nustatytas bendras flavonoidų kiekis įvairuoja nuo 1,37 iki 7,21 mg RE/g [7]. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose vyrauja apigeninas, tilirosidas, apigenin-7-O-gliukozidas ir kemferolis [7]. Žiedų ėminiuose nustatyti rutinas, izokvercitrinas, avikuliarinas, nesubrendusių vaisių – kvercetinas, izokvercetinas; šaknų ėminiuose identifikuotas rutinas [7, 20].
2011 metais atlikto tyrimo „Arbatų ir tinktūrų, pagamintų iš Rosa rugosa Thunb. biologinis aktyvumas ir sudėtis“ metu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, naudojant spektrofotometrinę Folin–Ciocalteu metodiką. Bendras fenolinių junginių kiekis tirtuose ėminiuose įvairavo nuo 0,14 iki 13,9 mg GRE/ml, priklausomai nuo augalo organo. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (nuo 12,75 iki 13,9 mg GRE/ml) nustatytas raukšlėtalapių erškėčių žiedų, lapų ir šaknų etanolininėse ištraukose, mažiausias (11,88 mg GRE/ml) – erškėčių vaisių tinktūroje. Erškėčių lapų, vaisių ir žiedų, kaupiančių fenolinius junginius preparatai, pasižymi antioksidaciniu, priešvėžiniu, antimikrobiniu poveikiu [15, 18].
Eterinis aliejus. Erškėčių žieduose kaupiamaseterinis aliejus, kuriame yra apie 30 komponentų, iš jų pagrindiniai: β-citronelolis, geraniolis, geraniolio acetatas, citronelato acetatas, metileugenolis ir linalolis [12]. Eterinio aliejaus kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose – 0,03–0,04 proc. [21]. Žiedų ėminiuose nustatyti lakieji terpenoidai, hemiterpenai bei monoterpenai. Raukšlėtalapių erškėčių lapai kaupia seskviterpenus ir ant apatinių lapų gyslų paviršiaus turi grybų formos liaukų trichomas. Iš lapų liaukinių trichomų, kuriose kaupiami seskviterpenai, jauni lapai išskiria didelį kiekį sirupo lašelių pavidalu (10–20 mg/g) [22]. Jaunuose lapuose yra nedideli, bet reikšmingi kiekiai kvapiųjų monoterpenų ir aromatinių aliejų [23].
Vitaminai. Erškėčių vaisiai yra polivitamininė žaliava. Europos farmakopėjoje nurodoma, kad kokybiškai išdžiovintuose erškėčių vaisiuose turi būti ne mažiau kaip 0,3 proc. askorbo rūgšties. Erškėčių vaisiuose yra didelis askorbo rūgšties kiekis, kuris gali varijuoti nuo 300–4000 mg/100g [24]. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose nustatyta askorbo rūgštis (1,0–1,5 proc.), tiaminas, riboflavinas, tokoferolis, naftochinonai, provitaminas β-karotenas, žiedų ištraukose yra β-karoteno bei likopeno [5, 15].
Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose nustatyti pektinai, cukrai, citrinų rūgštis ir rauginės medžiagos [5, 18]. Žiedų ėminiuose yra pigmentų. Tai įvairūs antocianinų dariniai, kurie lemia žiedų spalvą, nustatytos aminorūgštys ir nesočiosios riebalų rūgštys [23].
1.3 Fenolinių junginių ekstrakcijos metodai iš augalinių žaliavų
Ekstrakcija – tai biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimas iš augalo dalių, naudojant selektyvius tirpiklius. Ekstrakcijos tikslas yra išekstrahuoti tirpius augalo metabolitus [25]. Fenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežių, šaldytų ar džiovintų vaistinių augalinių žaliavų. Prieš ekstrahavimą augalų mėginiai yra paruošiami – žaliavos sumalamos arba sutrinamos, prieš tai jas išdžiovinus oru arba šalčiu [26]. Augalų mėginiai džiovinti šalčiu (liofilizuoti) pasižymi didesniu fenolinių junginių kiekiu [26]. Vykdant ekstrakciją, svarbu pasirinkti tinkamą tirpiklį. Dažniausiai naudojami tirpikliai yra tie, kurie turi žemą virimo temperatūrą. Tirpikliai turi būti netoksiški, nedegūs, chemiškai neutralūs ir jie neturėtų daryti neigiamos įtakos analizuojamų medžiagų stabilumui [27]. Dažniausiai naudojami ekstrahentai – alkoholiai (metanolis, etanolis), acetonas, etilo acetatas ar jų mišiniai su vandeniu [27, 28]. Nėra nustatytos vienos universalios ektrahavimo sistemos, tinkančios visų augalų fenoliniams junginiams ekstrahuoti [26]. Etanolis yra geras tirpiklis fenolinių junginių ekstrakcijai, nes pasižymi didele ekstrahavimo galia ir yra saugus vartotojui. Etanolinės ištraukos gali būti be apribojimų ar papildomų tyrimų naudojamos farmacijos ir maisto pramonėje, o metanolis yra veiksmingesnis ekstrahuojant mažesnės molekulinės masės fenolinius junginius [26].
Ekstrakcijai atlikti gali būti naudojami įvairūs metodai. Maceracija ir ekstrakcija Soksleto aparatu yra įprasti ir tradiciniai ekstrahavimo metodai [26]. Atlikus ekstrakcijos efektyvumo tyrimus šiais metodais, nustatytas mažas efektyvumas ir galimas aplinkos užterštumas dėl naudojamų didelių organinių tipiklių kiekių ir ilgos ekstrakcijos trukmės [27]. Pastaraisiais metais sukurti šiuolaikiniai efektyvesni ekstrakcijos metodai: mikrobangų ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija), ekstrakcija orbitalinėje purtyklėje, suslėgtų ir superkritinių skysčių ekstrakcija. Juos atliekant, sunaudojama mažiau energijos ir tirpiklių, užima mažiau laiko [29]. Mokslinėje literatūroje yra duomenų ir apie raukšlėtalapių erškėčių vaisių ekstrakciją, atliekamą taikant sonifikaciją [30].
Ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija). Ekstrakcija ultagarsu yra efektyvi, saugi, nereikalaujanti sudėtingų instrumentų ir palyginus nebrangi [26]. Tai laikoma vienu iš paprasčiausių ekstrahavimo būdų, nes lengva atlikti naudojant įprastą laboratorinę įrangą [31]. Susmulkinta žaliava sumaišoma su pasirinktu
tirpikliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje nustatytą laiko tarpą reikiamoje temperatūroje [31]. Akustinių bangų sklidimas ultragarsinėje vonelėje sukelia kavitacijos procesą [25]. Ultragarso banga sklinda tirpikliu ir sukelia tirpiklyje esančių kavitacinių burbulų sprogimą, sustiprindama tirpiklio skverbimąsi į ląsteles ir padidindama paviršiaus plotą tarp kietos ir skystos fazės [31]. Ekstrakcijos ultragarsu trūkumai – nevienodas ultragarsinės energijos pasiskirstymas analitėje ir dideli energijos nuostoliai ultragarso vonelėje [26].
Pietų Korėjos mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu įvertinto raukšlėtalapių erškėčių vaisių ėminių bendrą fenolinių junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekį, ekstrahuojant ėminius ultragarso vonelėje. Statistiniam modeliavimui pasirinkta temperatūra įvairavo nuo 30 iki 50 °C, ekstrakcijos trukmė – 30–50 min, ultragarso galia – 200 W, dažnis – 40 kHz. Raukšlėtalapių erškėčių vaisių ėminiai ekstrahuoti 50, 75 ir 95 proc. (v/v) etanoliu. Mėginio ir tirpiklio santykis 1:20 [30]. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstrahavus raukšlėtalapių erškėčių vaisių ėminius 50 proc. (v/v) etanoliu, 30 min., esant 50 °C temperatūrai. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas atlikus ekstrakciją 50 proc. (v/v) etanoliu, 40 min., 50 °C temperatūroje. Didžiausias askorbo rūgšties kiekis nustatytas naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, 30 min. ir esant 30 °C temperatūrai [30].
1.4 Kokybiniai ir kiekybiniai fenolinių junginių nustatymo metodai
Fenolinai junginiai yra gausi biologiškai aktyvių junginių grupė. Tai antriniai augalų metabolitai. Jie klasifikuojami į penkias klases: fenolines rūgštis, flavonoidus, stilbenus, taninus ir lignanus [32]. Fenolinių junginių ekstrakcija iš augalinės žaliavos itin svarbus analitinis žingsnis, vykdant šių biologiškai aktyvių junginių nustatymą. Siekiant gauti didžiausią fenolinių junginių išeigą, būtina pasirinkti tinkamą ekstrahentą, ekstrakcijos trukmę ir temperatūrą. Ekstrakcijos tirpiklio pasirinkimas gali turėti reikšmingos įtakos išekstrahuotų fenolinių junginių kiekiui [33]. Pavyzdžiui, tiriant skirtingų tirpiklių poveikį fenolinių junginių išskyrimui iš raudonžiedžių sidabražolių (Potentilla atrosanguinea Lodd.) lapų ir žiedų, paaiškėjo, kad 50 procentų etanolis yra efektyvesnis nei grynas etanolis, 50 procentų metanolis ar 50 procentų acetonas [34].
Augalinių žaliavų ekstraktų, ištraukų ar kitų preparatų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatoma taikant įvairius instrumentinės analizės metodus. Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojami šie metodai: UV–regimosios šviesos spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), kapiliarinė elektroforezė (KE) [33].
Reakcija su Folin–Ciocalteu arba Folin–Denis reagentu. Spektrofotometrija yra vienas iš paprasčiausių bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodų. Folin–Denis ir Folin–Ciocalteu metodikos daugelį metų plačiai naudojami įvertinant bendrą fenolinių junginių kiekį augalinėse žaliavose [33]. Abi metodikos taiko fenolinių junginių reakciją su fosfomolibdato ir fosfovolframo rūgščių kompleksu šarminiame tirpale. Redukcijos produktai, turintys fenolinių junginių, nusidažo mėlyna spalva, o absorbcijos spektras yra apie 760 nm [35]. Folin–Denis ir Folin–Ciocalteu reagentai nėra specifiniai ir nepasižymi selektyvumu tik fenoliniams junginiams, nes su šiais reagentais reaguoja ir medžiagos, kurios turi oksidacinių – redukcinių savybių (askorbo rūgštis, aromatiniai aminai, cukrūs) [35]. Tai vienas didžiausių šių metodikų trūkumų, tačiau dėl savo paprastumo jos vis dar naudojamos mokslinių tyrimų praktikoje [26].
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Tai vienas iš tiksliausių ir dažniausiai naudojamų metodų kokybinim ir kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui [33]. Šiuo metu tai populiariausias ir patikimiausias metodas, naudojamas fenolinių junginių analizei [26]. Augalinių ekstraktų fenolinių junginių skirstymui ir kiekybiniam nustatymui ESC metodu dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių efektyvioji skysčių chormatografija, skirstymui naudojant C18, rečiau C8 ar C4 silikagelio kolonėles, kaip eliuentais
dažniausiai naudojami acetonitrilas, metanolis ar jų vandeniniai tirpalai [33]. Įvairių mokslinės literatūros šaltinių duomenimis, fenolinių junginių detekcija atliekama naudojant UV–regimosios šviesos, masių spektrometrinius, diodų matricos detektorius, rečiau naudojami ir kiti detektoriai: fluorimetriniai, kolorimetriniai ir fluorescenciniai [33]. Derinant ESC kartu su masių spektrometrija (MS), pasiekiamas didelis jautrumas ir aukštas specifiškumas [33]. Yra daug privalumų, kurie lemia platų ESC naudojimą analizuojant fenolinius junginius augalinėse ir biologinėse matricose: platus komercinių kolonėlių asortimentas, įskaitant tas, kuriose naudojami naujos kartos sorbentai su tinkamomis tikslinėmis savybėms ir galimybe sujungti dvi ar daugiau kolonėlių, metodo jautrumas, tinkamumas nelakiems ir termolabiliems dariniams atskirti, galimybė tiksliai nustatyti dominančių analičių kiekybinę sudėtį [35, 36]. ESC metodo trūkumai – įranga yra brangi ir su ja gali dirbti tik kvalifikuoti asmenys [36].
Kapiliarinė elektroforezė (KE). Pastaruoju metu kapiliarinės elektroforezės reikšmingumas nustatant fenolinius junginius didėja. Tam, kad šiuo metodu būtų pasiekiama tinkama skiriamoji geba, būtina pasirinkti tinkamą buferį, jo pH ir koncentraciją, kapiliaro tipą ir tūrį, optimizuoti elektroforezės temperatūrą, įtampą ir mėginio įpurškimo būdą. Dažniausiai naudojami fosfatinis arba boratinis buferiai, 5–100 µm diametro kapiliarai, 10–30 kV įtampa, injekcijos tūris – 10–50 ml [27]. Detekcijai galima naudoti fotodiodų matricos ar UV–regimosios šviesos detektorių. Analizuojant flavonoidus dažniausiai taikoma kapiliarinė zonos elektroforezė arba micelių elektrokinetinė chromatografija [27]. Išskiriami KE analizės
privalumai: mažesni pavyzdžio kiekiai lyginant su ESC, mažesnis tirpiklių suvartojimas, trumpa analizės trukmė, gera skiriamoji geba, tačiau šis metodas pasižymi mažesniu jautrumu nei efektyvioji skysčių chormatografija [37].
Kiti taikomi fenolinių junginių atskyrimo ir kiekybinio nustatymo būdai: popieriaus chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, superkritinių skysčių chromatografija [33, 37]. Popieriaus chromatografija ir plonasluoksnė chromatografija naudojamos siekiant atskirti fenolinius junginius maisto produktuose. Popieriaus chromatografijos metodas yra paprastas, tačiau naudojamas rečiau, šiam metodui trūksta tikslumo, palyginus su kitais fenolinių junginių nustatymo metodais. Popieriaus chromatografija naudota norint identifikuoti fenolinius junginius iš arbatos lapų su butanoliu, acto rūgštimi bei vandeniu, naudojant juos kaip judančiąją fazę [33]. Plonasluoksnė chromatografija yra efektyvesnis būdas norint analizuoti fenolinius junginius neapdorotuose augalų ekstraktuose. Plonasluoksnės chromatografijos technika yra greita ir nebrangi. Plonasluoksnę chromatografiją galima derinti kartu su masių spektrometrija (MS) – vienu efektyviausių analizės būdų, skirtingų struktūrų išsiaiškinimui [38]. Superkrinių skysčių chromatografija yra universalus metodas fenoliniams junginiams analizuoti ir identifikuoti. Palyginus su kitais metodais, superkritinių skysčių chromatografija pasižymi dideliu atskyrimo efektyvumu, itin gera skiriamąja geba, trumpa analizės trukme, yra ekologiška ir suderinama su įvairių tipų detektoriais [33].
1.5 Raukšlėtalapių erškėčių lapų preparatų biologinio poveikio tyrimai
Raukšlėtalapių erškėčių lapai kaupia daug biologiškai aktyvių junginių. Jų lapuose esantys fenoliniai junginiai veikia kaip natūralūs antioksidantai. Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas lemia augalinių ištraukų uždegimą slopinančias, priešvėžines, antivirusines, antimikrobines, antihipertenzines savybes [21, 39]. Atliktų mokslinių tyrimu metu įrodyta, kad raukšlėtalapių erškėčių lapų ir vaisių ištraukos lemia antidiabetinį, antimikrobinį poveikį, mažina hepatotoksiškumą [7].
Antioksidacinis aktyvumas. Širdies ir kraujagyslių ligų, vėžio, diabeto, žmogaus imunodeficito viruso slopinimui ir prevencijai gali būti vartojami augalinėse žaliavose esantys antioksidantai [28]. Mokslinių tyrimų metu buvo tiriamos arbatos ir tinktūros iš skirtingų raukšlėtalapių erškėčių organų, siekiant nustatyti jų antioksidacines savybes [7]. Nustatytas stiprus antiradikalinis aktyvumas (0,26–4,25 mmol TE/g) ir redukcinis aktyvumas (1092,04–9258,70 mmol Fe2+/g). Užsienio šalių mokslininkai atliko tyrimą su pelėmis ir įvertino raukšlėtalapių erškėčių skirtingų organų ištraukų poveikį. Paveikus peles
glutationo peroksidaze ir katalaze, fermentų aktyvumas tiriamųjų pelių kraujyje padidėjo. Tuo pačiu metu kepenyse padidėjo glutationo peroksidazės ir katalazės genų ekspresijos lygis, o malondialdehido kiekis smegenyse ir kepenyse sumažėjo. Tyrimų rezultatai parodė, kad pelių gyvenimo trukmė pailgėjo, palyginus su kontrolinėmis pelėmis, paveikus jas raukšlėtalapių erškėčių ištraukomis, pagamintomis iš skirtingų augalo organų dalių [7].
Priešvėžinis poveikis. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad raukšlėtalapių erškėčių lapų ir žiedų tinktūros bei nuovirai pasižymi priešvėžiniu poveikiu [18]. Atlikto mokslinio tyrimo metu buvo vertintos plaučių vėžio (A549), kiaušidžių (TOV–112D), gimdos kaklelio (HeLa), krūties vėžio (T47D) ląstelių linijos. Tinktūros ir nuovirai, paruošti iš raukšlėtalapių erškėčių lapų ir žiedų, pasižymėjo stipriu priešnavikiniu poveikiu plaučių (A549) ir kiaušidžių (TOV–112D) (85–95 proc. negyvų ląstelių) lastelių linijoms, tačiau pastebėtas toksiškas poveikis ir normalioms fibroblastinių ląstelių linijoms (80–90 proc. negyvų ląstelių) [18]. Iš raukšlėtalapių erškėčių lapų ir vaisių pagamintos arbatos neparodė reikšmingo priešvėžinio poveikio [18].
Antimikrobinis poveikis. Atlikto mokslinio tyrimo metu vertintos skirtingų raukšlėtalapių erškėčių organų ištraukų ir tinktūrų antimikrobinės savybės prieš gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų padermes. Tyrimų rezultatai parodė, kad tinktūros ir arbatos, pagamintos iš raukšlėtalapių erškėčių lapų, pasižymėjo stipriausiomis antibakterinėmis savybėmis, o sėklų ir vaisių ėminių ištraukų ir tinktūrų antimikrobinės savybės silpnesnės. Tinktūros, pagamintos iš raukšlėtalapių erškėčių lapų, pasižymi stipresnėmis antibakterinėmis savybėmis nei ištraukos [18]. Nustatyta, kad raukšlėtalapių erškėčių lapuose yra biologiškai aktyvių fitoncidų, kurie bakteriocidiškai veikia patogeninius mikroorganizmus [40].
Antidiabetinis poveikis. Cukrinis diabetas yra plačiai paplitusi lėtinė liga. Raukšlėtalapių erškėčių organų ištraukos naudojamos kaip gydomoji priemonė diabeto profilaktikai. Mokslinių tyrimų metu patvirtinta, kad raukšlėtalapių erškėčių šaknų antidiabetinis poveikis yra susijęs su jų kaupiamais fenoliniais junginiais, surišančiais laisvuosius radikalus ir apsaugančiais ląsteles nuo oksidacinio streso [7]. Tyrimai atlikti su žiurkėmis, sergančiomis cukriniu diabetu, parodė, kad raukšlėtalapių erškėčių šaknų ištraukos padeda sumažinti gliukozės kiekį kraujyje, padidinant jautrumą insulinui. Šis poveikis susijęs su oksidacinio streso ir α-gliukozidazės slopinimu ląstelėse [7].
Uždegimą slopinantis poveikis. Azijos liaudies medicinoje raukšlėtalapių erškėčių šaknų preparatai naudoti gydyti cukriniam diabetui, lėtinėms uždegiminėms ligoms ar skausmui malšinti [18]. Erškėčių vaisių papildai dėl sukeliamo poveikio gali būti vartojami osteoartrito ar reumatoidinio artrito profilaktikai [41]. Raukšlėtalapių erškėčių šaknų preparatų uždegimą slopinantįpoveikį lemia triterpeniniai
junginiai – euskafo ir tormento rūgštys [7]. Atliktų mokslinių tyrimų rezultatai įrodė, kad skirtingų erškėčių rūšių preparatai pasižymi skausmą malšinančiu ir uždegimą slopinančiu poveikiu [41].
Erškėčių preparatai iš vaisių, lapų ir žiedų buvo plačiai vartojami jau Viduramžiais. Erškėtį Avicena minėjo savo raštuose kaip vaistinį augalą gydant įvairias ligas [42]. Raukšlėtalapių erškėčių vaisiai vartojami avitaminozės profilaktikai ir gydymui. Didelis askorbo rūgšties kiekis (300–4000 mg/100 g) užtikrina normalią endokrininių liaukų, smegenų, širdies ir kepenų veiklą. Lapų antpilai ir nuovirai populiarūs liaudies medicinoje ir naudoti diarėjos, vidurių dieglių, maliarijos, reumato ir radikulito gydymui. Raukšlėtalapių erškėčių žiedai, lapai ir vaisiai naudojami kulinarijoje, vyno ir likerio gamyboje. Kosmetikoje erškėčių žiedų ištraukos naudojamos kvepalų ir kūno priežiūros produktų gamybai. Iš raukšlėtalapių erškėčių žiedų gali būti gaminamas rožių žiedų medus, zefyrai ir midus [6]. Dėl karotinoidų, pektinų ir mineralinių medžiagų pieno pramonė jogurto gamybai naudoja erškėčių vaisių miltelius, skirtus maisto produktų kokybei ir skoniui gerinti [39]. Norvegijoje erškėčių lapus deda ant egzemų. Augalo lapų arbatos ir antpilai pasižymi teigiamu poveikiu organizmui – didina jo atsparumą infekcinėms ligoms, apsinuodijimams, gydomas burnos ertmės uždegimas ar išopėjimas [40]. Atliktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų, lapų, vaisių ir šaknų ištraukų tyrimų metu nebuvo užfiksuota jokio neigiamo poveikio žmonių sveikatai, tačiau gali pasireikšti alergija žiedadulkėms ar rožių kvapui dėl padidėjusio jautrumo reakcijos [7]. Erškėčių preparatai neturi šalutinio poveikio, jų užpilus ir nuovirus galima gerti be apribojimų [8].
1.6 Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Raukšlėtalapių erškėčių lapuose kaupiami fenoliniai junginiai. Pastaraisiais metais paskelbta publikacijų, kuriose aprašyta raukšlėtalapių erškėčių lapuose nustatytų fenolinių junginių sudėtis ir biologinis poveikis. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijai dažniausiai taikoma ekstrakcija Soksleto aparatu bei maceracija, tačiau gana plačiai aprašyta ekstrakcija ultragarsu ir mikrobangomis. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių nustatymui dažniausiai naudojami UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos ir ESC metodai. Raukšlėtalapių erškėčių lapų fitocheminės sudėties ir jų ištraukų biologinio aktyvumo tyrimų stoka paskatino ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse augančių ir vegetacijos laikotarpiu rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.
2. METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo metu tirti raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiai, surinkti 2018 ir 2019 metais. 2018 metais augalo lapai rinkti iš keturiolikos skirtingų Lietuvos augaviečių (1 lentelė). 2019 metais žaliava rinkta vegetacijos laikotarpiu, kas dešimt dienų, nuo Salantų mieste atokiai pievoje augančio raukšlėtalapio erškėčio krūmo. Rinkimo laikas – nuo birželio 14 d. iki lapkričio 1 d (2 lentelė). Surinkta augalinė žaliava džiovinta gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinti raukšlėtalapių erškėčių lapai supakuoti į popierinius maišelius ir laikyti tamsioje, sausoje vietoje.
1 lentelė. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių rinkimo datos ir vietos
2 lentelė. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių rinkimo datos ir fenologiniai tarpsniai [43]
Rinkimo data Metų diena Fenologinis tarpsnis
2019-06-14 165
Pirmieji lapai pilnai išsiskleidę. Auga ir skleidžiasi nauji lapai
2019-06-24 175 2019-07-04 185 2019-07-14 195 2019-07-24 205 2019-08-03 215 2019-08-13 225 2019-08-23 235
Rinkimo data Žaliavos rinkimo vieta
2018-06-29 Platelių miestelis, Plungės raj. (miškas) 2018-07-11 Juodupėnų kaimas, Kretingos raj. (pamiškė)
2018-07-17 Telšiai (pamiškė)
2018-07-22 Nida (kopos)
2018-07-22 Juodkrantė (kopos)
2018-07-30 Vydmantų kaimas, Kretingos raj. (pieva) 2018-07-31 Kašėtų kaimas, Varėnos raj. (pieva)
2018-08-01 Šventoji (kopos)
2018-08-02 Stanaičių kaimas, Kauno raj. (smėlėta pieva) 2018-08-04 Mazūriškių kaimas, Klaipėdos raj. (žvyruotas karjeras) 2018-08-08 Derceklių kaimas, Klaipėdos raj. (žvyruota pieva) 2018-08-11 Salantai, Kretingos raj. (pamiškė)
2018-08-13 Girionys, Kauno raj. (miškas)
2019-09-02 245
Branda – pilnai subrendę, produktyvūs lapai, intensyviai
vykdantys fotosintezę 2019-09-12 255 2019-09-22 265 2019-10-02 275 2019-10-12 285 2019-10-22 295 Lapų senėjimas 2019-11-01 305
2.2 Naudoti reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai, tirpikliai ir standartai: išgrynintas dejonizuotas vanduo, kuris paruoštas naudojant Milli – Q („Millipore“, Bedforfas, JAV) vandens gryninimo sistemą, 96 proc. (v/v) etanolis iš AB „Vilniaus degtinė“ (Vilnius, Lietuva), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (,,Sigma Aldrich“, St. Louis, JAV), natrio karbonatas („Carl Roth GmbH & Co“, Karlsrūjė, Vokietija), galo rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV). Natrio acetato trihidratas („Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), ledinė acto rūgštis („Fluka“, Seelze, Vokietija), koncentruota druskos rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) ir geležies (III) chlorido heksahidratas (FeCl3×6 H2O) įsigyti iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija), naudotas ABTS reagentas – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonrūgštis), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsrūjė, Vokietija) ir troloksas ((±)–6–hidroksi–2,5,7,8–tetrametilchromano–2–karboksilinė rūgštis) (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), acetonitrilas („Sigma Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija), acto rūgštis („Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); procianidinas B1, chlorogeno rūgštis, procianidinas B2, procianidinas C1, p-kumaro rūgštis, izokvercitrinas, reinotrinas, avikuliarinas, kvercitrinas („Sigma-Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija).
2.3 Naudota aparatūra
Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių smulkinimas atlikas elektriniu malūnu („Retsch GM 200“, Hanas, Vokietija). Ėminių svėrimui naudotos analitinės svarstyklės („Sartorius CP64 – OCE“, Getingenas, Vokietija). Fenolinių junginių ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje („Bandelin Sonorex Digital 10 P“, Darmštatas, Vokietija). Mėginiai filtruoti naudojant vakuuminį siurblį „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor“ („Welch“, Skokie, JAV), nuodžiūviui nustatyti naudota džiovinimo spinta („Swiss
quality“, Planegas, Vokietija).Bendrofenolinių junginių kiekio, antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in
vitro nustatymui naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometras „M550“ („Spectronic Camspec“
Garfortas, Jungtinė Karalystė). Raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta naudojant skysčių chomatografą „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV) su diodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV).
2.4 Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ištraukų paruošimas
Žaliavos paruošimas. Raukšlėtalapių erškėčių lapai sumalami į miltelius, naudojant elektrinį
malūną. Ėminiai laikyti popieriniuose maišeliuose, tamsioje, sausoje vietoje.
Nuodžiūvio nustatymas. Tiriamųjų raukšėtalapių erškėčių lapų ėminių nuodžiūvis nustatytas
Europos farmakopėjos Ph.Eur.01/2008:20232 nurodytu metodu [44]. Atsveriama 1,0 g (tikslus svėrinys) raukšlėtalapių erškėčių lapų miltelių. Džiovinama 105°C temperatūroje džiovinimo spintoje, kad visiškai išgaruotų drėgmė ir lakieji junginiai. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausos žaliavos masei. Masės skirtumas tarp svėrimų iki 0,01 g. Nuodžiūvis (proc.) skaičiuojamas naudojantis formule:
X =
(𝑚 −𝑚1)𝑚
× 100
m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g); m1 – žaliavos masė po džiovinimo (g).
Etanolinių ištraukų paruošimas. Ištraukos paruoštos atsveriant po 0,25 g (tikslus svėrinys)
susmulkintos augalinės žaliavos. Atsverta žaliava suberiama į tamsaus stiklo buteliukus ir užpilama 10 ml 40 proc. (v/v) koncentracijos etanoliu. Mėginiai sandariai uždaromi, suplakami ir dedami į ultragarso vonelę. Ekstrahuojama kambario temperatūroje, 70 min., esant 678 W galiai. Po ekstrakcijos etanolinės ištraukos vakuuminiu siurbliu filtruojamos per vatą į 10 ml matavimo kolbutę ir įpilama 40 proc. etanolio iki žymos. Ištraukos supilstomos į tamsaus stiklo buteliukus, kurie laikomi šaldytuve 4ºC temperatūroje. Prieš atliekant chromatografinę analizę etanolinės ištraukos filtruojamos per 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus.
2.5 Tyrimo metodai
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometru, naudojant Folin–Ciocalteu reagentą. Pradinis Folin–Ciocalteu reagentas 10 kartų praskiedžiamas išgrynintu vandeniu ir gaunamas darbinis FC reagentas. Pasiruošiamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas: atsveriama 75 g natrio karbonato, tirpinama distiliuotame vandenyje 1000 ml matavimo kolboje ir pripilama distiliuoto vandens iki žymos [45].
Tiriamasis tirpalas: 1 ml praskiestos ištraukos sumaišoma su 5 ml darbinio FC reagento, sumaišoma
su 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu.
Palyginamasis tirpalas: 1 ml tirpiklio (40 proc. etanolis) sumaišoma su 5 ml darbinio FC reagento
ir su 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu.
Tiriamieji mėginiai ir kalibravimo tirpalas laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Vėliau, spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui. Naudojant 0,015625–0,25 mg/ml koncentracijos etaloninius tirpalus, sudarytas kalibravimo grafikas (y=2,6116x-0,0045; R² = 0,9999). Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu mg/g absoliučiai sausos žaliavos ir apskaičiuotas pagal formulę:
𝐶 =
𝑋 × 𝑉𝑚
C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g; X – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml; m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.2 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant FRAP metodiką
Raukšlėtalapių erškėčių lapų ištraukų redukcinis aktyvumas nustatytas naudojant Benzie ir Strain metodiką [46]. Pirmiausia paruošiami šie reagentai:
a) 300 mM acetatinis buferis: 3,1 g natrio acetato trihidrato tirpinama vandenyje, 1000 ml matavimo kolboje ir užpilama 16 ml ledinės acto rūgšties.
b) Į 50 ml išgryninto vandens įpilama 0,17 ml koncentruotos druskos rūgšties. Gaunamas 40 mM druskos rūgšties tirpalas. Gautame tirpale, ištirpinus 0,1562 TPTZ miltelių, gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas.
c) Norint gauti 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą, 0,2703 g šios medžiagos ištirpinama 50 ml išgryninto vandens.
Sumaišius a, b, c reagentus santykiu 10:1:1, pagaminamas darbinis FRAP tirpalas.
Tiriamasis tirpalas: 3 ml darbinio FRAP tirpalo sumaišoma su 20 µl praskiestos raukšlėtalapių
erškėčių lapų etanolinės ištraukos.
Palyginamasis tirpalas: ruošiamas taip pat, tik vietoj ištraukos dedama 20 µl 40 proc. etanolio.
Tiriamieji mėginiai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Vėliau, spektrofotometru išmatuojama absorbcija esant 593 nm bangos ilgiui.
Naudojant 1000–8000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (y=0,0001x-0,079; R2=0,9979).
Redukcinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) 1 g absoliučiai sausos žaliavos, apskaičiuojama pagal formulę:
TE =
A+ba × 1000
×
Vband.(ml)
mband.(g)
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis; a – nuolydis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; Vband. – tiriamosios augalinės žaliavos ištraukos bandinio
tūris, ml; mband. – tiriamosios augalinės žaliavos atsvertas kiekis, g.
2.5.3 Laisvųjų radikalų surišimo in vitro įvertinimas, taikant ABTS metodiką
Naudota Yim ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodiką, kuri buvo nežymiai modifikuota [47].
Pasiruošiamas 2 mM koncentracijos motininis ABTS tirpalas. 0,0548 g atsvertų ABTS miltelių ištirpinama 50 ml išgryninto vandens, tamsaus stiklo buteliuke. Į gautą tirpalą dedama 0,0095 g kalio persulfato, mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje 16 val.
Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas motininį tirpalą skiedžiant prie 734 nm bangos tol, kol gaunama absorbcija lygi 0,800.
Tiriamasis tipalas: 20 µl praskiesto tiriamo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS tirpalo.
Mėginiai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Po to išmatuojamas absorbcijos pokytis esant 734 nm bangos ilgiui.
Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo.
Naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (y=0,00003x-0,00360; R2=0,9714).
Tiriamųjų ištraukų antiradikalinis aktyvumas in vitro, išreikštas TE ekvivalentu (µmol TE/g), apskaičiuojamas pagal formulę:
TE =
A+ba × 1000
×
Vband.(ml)
mband.(g)
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis; a – nuolydis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; Vband. – tiriamosios augalinės žaliavos ištraukos bandinio
tūris, ml; mband. – tiriamosios augalinės žaliavos atsvertas kiekis, g.
2.5.4 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta atvirkščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu „Waters 2695 Alliance“ chromatografine sistema, taikant mokslinėje literatūroje aprašytą validuotą metodiką [48]. Analičių detekcijai naudotas diodų matricos detektorius „Waters 2998“. Fenolinių junginių skirstymas atliktas naudojant kolonėlę „YMC-Pack ODS-A“ (250×4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su prieškolone „YMC-Triart“ (10×3,0, C18, dalelių dydis 5 µm). Eliuentų
sistema sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo vandenyje (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas B). Tyrimų metu taikytas judrios fazes tėkmės greitis – 1 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl. Kolonėlė laikyta termostate, esant 25°C temperatūrai. Chromatografinės smailės identifikuotos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo trukmes bei UV absorbcijos spektrines charakteristikas. Flavan-3-olių grupės junginių kiekiai raukšlėtalapių erškėčių ėminių ištraukose apskaičiuoti bangos ilgiui esant 280 nm, fenolinių rūgščių – 320 nm, flavonolių – 360 nm [48].
2.6 Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2013“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 22“ („IBM“, JAV). Tyrimai kartoti po 3 kartus. Rezultatai pateikti kaip trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis ± standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirtingose augavietėse ir kas 10 dienų rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų nustatyti atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA), taikant daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Duomenų koreliacijai įvertinti nustatytas Pirsono koreliacijos koeficientas. Koreliacijos koeficientų ryšiai įvertinti pagal stiprumą: kai r reikšmė 0,2–0,5, koreliacijos ryšys laikytas silpnu, kai 0,5–0,7 vidutiniu, 0,7–0,9 stipriu, o kai 0,9–1 labai stipriu [60]. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05 todėl, kai p<0,05, reikšmės laikomos statistiškai reikšmingomis.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų
nustatymas
Ekstrakcija yra svarbus bandinio paruošimo etapas. Ekstrakcijos procesui įtakos gali turėti ekstrahuojama žaliava, dalelių dydis, tirpiklis bei ekstrahavimo metodas [33]. Fenoliniams junginiams iš augalinių žaliavų ekstrahuoti naudojami poliniai tirpikliai (vanduo, metanolis, etanolis, acetonas) [25]. Didžiausią fenolinių junginių ekstrakcijos išeigą galima pasiekti ekstrahuojant augalinę žaliavą įvairių koncentracijų vandens ir organinių tirpiklių − acetono, metanolio, etanolio – mišiniais. Ekstrakciją rekomenduojama atlikti su alkoholio–vandens arba acetono–vandens mišiniais, nes gaunama didesnė išeiga ir dalis fenolinių junginių ne visada gali būti išekstrahuojami naudojant grynus organinius tirpiklius [35]. Daugelis mokslininkų fenolinių junginių ekstrakcijai dažniausiai renkasi mažiausiai toksišką organinį tirpiklį – etanolį, ypač jeigu ekstraktus norima panaudoti sveikatinimo tikslams ar maisto pramonėje [31]. Dėl šių priežasčių etanolis pasirinktas raukšlėtalapių erškėčių lapų ekstrakcijai. Atsižvelgiant į mokslinės literatūros šaltiniuose aprašytus skirtingų ekstrakcijos metodų privalumus ir trūkumus, raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių išgavai pasirinkta ekstrakcija ultragarso vonelėje (sonifikacija). Šis procesas atliekamas greitai ir lengvai, jo metu vyksta greita difuzija, gaunama gana didelė veikliųjų medžiagų išeiga [49]. Ekstrakcijos sąlygos nustatytos atsižvelgiant į: tirpiklio koncentraciją, ekstrakcijos trukmę ir ultragarso vonelės galią.
Pirmajame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape įvertinta tinkamiausia etanolio koncentracija. Sąlygų parinkimui naudotas sumaltas raukšlėtalapių erškėčių lapų mišinys iš keturiolikos skirtingų augaviečių. Ėminiai ekstrahuoti skirtingų koncentracijų (30, 40, 50, 60, 70, 80, 96 proc.) etanoliu. Ekstrakcijos laiko trukmė – 20 min., ultragarso vonelės galia – 1130 W. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (357,06±0,25 mg GRE/g, p<0,05) nustatytas ekstrakcijai naudojant 40 proc. (v/v) etanolį, nors jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kiekio, kai ėminiai ekstrahuojami 50 ir 60 proc. (v/v) etanoliu.
Dėl ekonomiškumo ir ekologiškumo tolesniems tyrimams vykdyti pasirinktas 40 proc. (v/v) etanolis (1 pav.).
1 pav. Etanolio koncentracijos įtaka raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Žvaigždutės rodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) bendro fenolinių junginių kiekio skirtumus, ekstrahuojant erškėčių lapų ėminius skirtingos koncentracijos
etanoliu
Kitame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape parinkta ekstrakcijos trukmė tiriant bendrą fenolinių junginių kiekį. Tyrimo metu taikyta įvairi ekstrakcijos trukmė (5–90 min.) ultragarso vonelėje, norint sužinoti kada išekstrahuojamas didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis. Ekstrakcijai naudotas 40 proc. (v/v) etanolis, ultragarso vonelės galia – 1130 W. Tarp 60 min. ir 70 min. gautų rezultatų statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05). Skaitine verte didesnis bendras fenolinių junginių kiekis (452,28±5,60 mg GRE/g) nustatytas ekstrahuojant raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminius 70 min., todėl šis ekstrakcijos laikas pasirinktas tolesniems tyrimams (2 pav.).
2 pav. Ekstrakcijos trukmės įtaka raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus (p<0,05) bendro fenolinių junginių
kiekio skirtumus, ekstrahuojant erškėčių lapų ėminius skirtingais laiko intervalais
** **** **** **** *** *** * 0 50 100 150 200 250 300 350 400 30 40 50 60 70 80 96 B end ras feno li ni ų jun gini ų kie kis , m g G R E /g
Etanolio koncentracija, proc. (v/v)
C, D B, C A B C, D, E C, D D, E F F, G G E B 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 80 90 B endras fenol ini ų jun gi nių ki eki s, m g G R E /g
Paskutiniame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape įvertinta tinkamiausia ultragarso vonelės galia. Ėminių ekstrakcija atlikta esant skirtingai ultragarso vonelės galiai (452–1130 W). Tyrimo metu naudota etanolio koncentracija – 40 proc. (v/v), ekstrakcijos trukmė – 70 min. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (414,57±0,55 mg GRE/g, p<0,05) nustatytas paveikus raukšlėtalapių erškėčių mėginus 678 W galios ultragarsu (3 pav.).
3 pav. Ekstrakcijos galios įtaka raukšlėtalapių erškėčių lapų fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus (p<0,05) bendro fenolinių junginių
kiekio skirtumus, ekstrahuojant erškėčių lapų ėminius skirtingos galios ultragarsu
Atlikus raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių ekstrakcijos sąlygų parinkimo tyrimus, nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis gautas ekstrahavus raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminius 40 proc. (v/v) etanoliu 70 min. ultragarso vonelėje, esant 678 W ultragarso vonelės galiai. Šios ekstrakcijos sąlygos pasirinktos tolesniems raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių sudėties tyrimams.
3.2 Skirtingose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių
junginių sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro įvairavimas
Fenoliniai junginiai yra vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių, lemiančių augalinių žaliavų ištraukų ar kitų preparatų antioksidacinį poveikį, todėl svarbu išsiaiškinti jų kiekio įvairavimą tarp skirtingose vietovėse rinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių. Antioksidantai – tai junginiai, kurie neutralizuoja laisvuosius radikalus sudarydami mažai toksiškus junginius ir sumažindami organizme jų sukeliamą žalą [4]. Organizmo apsaugai nuo laisvųjų žalingų radikalų, rekomenduojama vartoti maisto produktus, turinčius natūralių antioksidantų [50]. Norint nustatyti antioksidacinį aktyvumą,
B, C D B, C A B C 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 452 678 791 904 1017 1130 B endr as f eno li ni ų jung ini ų kie kis , m g G R E /g
rekomenduojama taikyti keletą skirtingų metodikų, nes augalinės ištraukos yra daugiakomponentės matricos, turinčios skirtingos struktūros ir poliškumo biologiškai aktyvių junginių. Jų antioksidacinį aktyvumą lemia skirtingi reakcijų mechanizmai [51]. Atsižvelgiant į tai, kad Lietuvoje nėra atliktų tyrimų apie raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro įvairavimą, o mokslinėje literatūroje dažniau tiriami paprastųjų ar kitų rūšių erškėčių žiedai arba vaisiai, atlikti raukšlėtalapių erškėčių lapų, rinktų skirtingose Lietuvos augavietėse, ištraukų tyrimai. Šie tyrimai pateiks naujos, aktualios informacijos apie raukšlėtalapių erškėčių ėminių ištraukų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties bei redukcinio ir antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimą.
3.2.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas raukšlėtalapių erškėčių lapų
ėminiuose
Spektrofotometrinės analizės metodikos yra paprastos, nereikalaujančios daug išlaidų ir suteikiančios naudingos informacijos apie fenolinių junginių kiekybinę sudėtį. Vertinant augalinės žaliavos kokybę, fenolinių junginių kiekybinė sudėtis yra svarbus rodiklis [52].
Skirtingose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas. Bendras fenolinių junginių kiekis raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminiuose varijuoja nuo 135,01±2,52 mg GRE/g (p<0,05) Vydmantų kaime (Kretingos raj.) iki 343,56±4,58 mg GRE/g (p<0,05) Stanaičių kaime (Kauno raj.). Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ištyrus Stanaičių kaime (Kauno raj.), Derceklių kaime (Klaipėdos raj.), Juodkrantėje (Neringos sav.) ir Kašėtų kaime (Varėnos raj.) rinktas žaliavas (4 pav.). Šiose vietovėse rinktų R. rugosa lapų ėminių rezultatai tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Analizuojant tyrimų duomenis, apskaičiuotas variacijos koeficientas, parodantis fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą tarp skirtingose vietovėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių lapų ėminių. Variacijos koeficientas – 7,56 proc., o tai rodo, kad gautų rezultatų sklaida yra nedidelė.
