FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
MONIKA PUCĖTAITĖ
VAISTINGŲJŲ SIRUPŲ SU PUŠŲ PUMPURŲ SKYSTAISIAIS EKSTRAKTAIS
TECHNOLOGIJA BEI VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Doc. dr. Saulė Velžienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
VAISTINGŲJŲ SIRUPŲ SU PUŠŲ PUMPURŲ SKYSTAISIAIS
EKSTRAKTAIS TECHNOLOGIJA BEI VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Saulė Velžienė _________ _______
(Parašas)
(Data)
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Monika Pucėtaitė Data
TURINYS
SANTRAUKA SUMMARY PADĖKA SANTRUPOS ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Paprastoji pušis (Pinus sylvetris L.) ... 12
1.1.1 Paprastosios pušies apibūdinimas ... 12
1.1.2 Botaninis apibūdinimas ... 13
1.1.3 Vaistinė žaliava ... 13
1.1.4 Cheminė sudėtis ... 14
1.1.5 Pušų pumpurų poveikis ir panaudojimas ... 14
1.2 Polifenolinių junginių samprata ... 15
1.3 Antioksidacinio aktyvumo samprata ... 16
1.4 Bendroji ekstraktų apžvalga ... 17
1.5 Bendroji sirupų apžvalga ... 18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
Darbo metu naudotos medžiagos ... 20
Darbo metu naudojami prietaisai ... 20
Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų gamyba reperkoliacijos būdu ... 21
2.3.1 Ekstraktų gamyba ... 21
2.3.2 Reperkoliacija ... 21
Sirupų gamyba ... 23
2.4.1 Cukraus sirupo gamyba ... 23
2.4.2 Sirupų su etanoliniais pušų pumpurų ekstraktais gamyba ... 23
Analizės metodai ... 24
2.5.1 Sauso likučio kiekio nustatymas ... 24
2.5.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 24
2.5.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvuoju radikalu ... 25
2.5.4 Klampos nustatymas sirupuose ... 26
2.5.5 Skystųjų ekstraktų ir sirupų stabilumo tyrimai ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
Pušų pumpurų ekstraktų tinkamumo vertinimas gaminant sirupus ... 27
Pušų pumpurų ekstrahento sugėrimo koeficiento ir optimalaus brinkinimo laiko nustatymas 28 Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas, bendras fenolinių junginių ir sauso likučio kiekis ... 29
Etanolinių ekstraktų įtakos sirupų kokybei tyrimas ... 31
Skystųjų pušų pumpurų ekstraktų įtakos sirupų klampai tyrimas ... 32
Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų tyrimai saugojimo metu ... 33
Pušų pumpurų sirupų tyrimai saugojimo metu ... 35
4. IŠVADOS ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
Monika Pucėtaitė. Magistro baigiamasis darbas ,,Vaistingųjų sirupų su pušų pumpurų skystaisiais ekstraktais technologija bei vertinimas“. Mokslinė vadovė doc. dr. Saulė Velžienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas - pagaminti skystuosius pušų pumpurų ekstraktus bei sirupus ir nustatyti kaip ekstrahento koncentracija įtakoja preparatų kokybę.
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis mokslo literatūroje sukauptais duomenimis ir esama praktinio naudojimo patirtimi parinkti optimalią ekstrahento koncentraciją bei sumodeliuoti vaistingųjų sirupų su pušų pumpurais sudėtį.
2. Parinkti optimalų ekstrahentą, ekstrakcijos sąlygas ir ekstrakcijos metodą ir įvertinti fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometrijos metodu.
3. Pagaminti vaistinguosius sirupus su pušų pumpurų skystaisiais ekstraktais. Įvertinti jų klampą ir nustatyti fenolinių junginių kiekį, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometrijos metodu.
4. Analizės metodų pagalba ištirti pagamintų preparatų kokybę, nustatyti saugojimo sąlygas ir terminus.
Tyrimo objektai: skystieji pušų pumpurų etanoliniai ekstraktai bei su jais pagaminti sirupai.
Metodika: Pušų pumpurų ekstraktų bendras fenolinis junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas nustatomas naudojant spektrofotometrijos metodą. Vaistingųjų sirupų bendras fenolinis junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas taip pat nustatomas naudojant spektrofotometrijos metodą. Atlikti stabilumo tyrimai bei sirupų klampos nustatymas. Rezultatai apdorojami naudojant Microsoft
Office Excel 2013 ir GraphPadPrism 8.1.0 programas.
SUMMARY
M.Pucėtaitė. The Master’s thesis of ,, Technology and evaluation of medicinal syrups with pine buds liquid extracts“. The supervisor is Assoc. Prof. Dr. Saulė Velžienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. – Kaunas.
The aim of the thesis – to produce liquid pine buds’ extracts and syrups and determine how extractor’s concentration influences the quality of both preparations.
Tasks of the research:
1. Based on the references from scientific literature and practical experience, find the right composition of medicinal syrups with pine buds’ liquid extracts.
2. To select a suitable extraction’s solvent, its conditions and a method as well as to estimate the amount of phenolic compounds and antioxidant activity using the spectrophotometry method. 3. To produce medicinal syrups with pine buds’ liquid extracts, evaluate dynamic viscosity and
estimate the amount of phenolic compounds and antioxidant activity using the spectrophotometry method.
4. To analyse the quality of madepreparations and determine its storage conditions and terms. Objects of the study: liquid ethanol extracts of pine buds and syrups produced with them. Methods: The total amount of phenolic compounds and antioxidant activity of pine buds’ extracts was measured using the spectrophotometric determination. The total amount of phenolic compounds and antioxidant activity of pine buds’ syrups were also determined spectrophotometrically. Dynamic viscosity and stability studies were conducted. The results were obtained using Microsoft Office Excel 2013 and GraphPadPrism 8.1.0 programs.
PADĖKA
SANTRUPOS
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas mPa·s – mini Paskalis per sekundę
Ph. Eur. – Europos farmakopėja
ROS – angl. ROS – reactive oxygen species UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Temos aktualumas. Manoma, kad viskas, kas vyksta gamtoje turi teigiamą poveikį, lyginant su antropogeninės kilmės produktais. Medicina yra tokia pat sena, kaip žmogaus ir viso pasaulio istorija. Šiais laikais, didėjant ligų intensyvumui, medicinos mokslas sparčiai auga ir plečiasi. Pradedami gaminti vaistai sudėtingoms ligoms gydyti, kurie susiję su įvairiais šalutiniais poveikiais. Vis dažniau žmonių vartoja sintetinius vaistus, kurie pasižymi sveikatai nenaudingu, neretai toksiniu, poveikiu. Toks paradoksalus kitimas, kai padėti turintys vaistai sukelia dar daugiau problemų, skatina žmoniją vėl atsisukti į gamtą, kur natūralius ir saugesnius junginius kaupiantys augalai gali padėti kovoti su įvairiais negalavimais.
Europoje vartojami vaistiniai augalai normaliam organizmo funkcijų palaikymui, taip pat kaip maisto papildai, medicinos paskirties priemonės, nereceptiniai vaistai, fitopreparatai ir homeopatiniai vaistai. Populiariausi augaliniai geriamieji vaistai Lietuvoje yra žolelių arbatos, nuovirai, sirupai arba etanolinės ištraukos. Žmonių vartojami preparatai stiprina imuninę sistemą, padeda palaikyti optimalią organizmo funkciją bei gydo atitinkamą, negalavimus sukėlusią, problemą. Augalinės kilmės produktai yra mėgstami, nes jie labiau priimtini vartoti profilaktiškai dėl savo lėtesnio ir silpnesnio veikimo bei mažesnio šalutinio poveikio [14]. Jie yra organinių medžiagų kompleksiniai mišiniai gauti iš augalo dalių, tokių kaip lapai, stiebai, žiedai, šaknys, pumpurai, sėklos [19]. Augalų kaupiami organiniai junginiai pasižymi įvairiu farmakologiniu aktyvumu – antimikrobiniu, antivirusiniu, antinavikiniu, antibakteriniu ir kt. Reikia ištirti kiek, šiais poveikiais pasižyminčių, biologiškai aktyvių junginių išlieka augaliniame vaistiniame preparate. Šių dienų pasaulyje yra labai svarbu žinoti jų veiksmingumą.
Teorinė ir praktinė reikšmė. Lietuvoje yra labai plačiai paplitusi paprastoji pušis (Pinus
sylvestris L.). Jos renkami pumpurai jau nuo senų laikų yra vartojami medicinos tikslais. Tradiciškai ši
Pušų pumpurai pasižymi karčiu skoniu, todėl pasirinkta gaminti sirupą, nes jis gali paslėpti nemalonų skonį. Taip pat sirupus lengviau praryti bei dozuoti, o skysta vaistinio preparato forma leidžia veikliosioms medžiagoms greičiau pasisavinti organizme.
Darbo ryšys su tyrimo metodika ir rezultatais. Veikiant vidiniams ir išoriniams veiksniams, žmogaus organizme susidaro laisvieji deguonies radikalai ( angl. ROS – reactive oxygen
species). Per didelis jų kiekis gali sukelti oksidacinį stresą, kuris yra žmogaus senėjimo ir įvairių ligų priežastis. Antioksidacinės medžiagos stabdo gyvybinių ląstelių pažeidimą, mažindamos ROS kiekį. Šių medžiagų organizmas pats negamina, todėl jos pagrinde yra gaunamos su maistu ar kitais augaliniais produktais. Antioksidantai yra naudojami aterosklerozės, artrito, astmos prevencijai. Moksliniais tyrimais yra įrodoma kokie medicininiai augalai ir jų produktai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu. Sintetiniai antioksidantai dažnai sukelia toksinius padarinius, todėl natūraliai kaupiamų antioksidantų paieška yra labai sustiprinta. Antioksidaciniu poveikiu labiausiai pasižymi flavonoidai, fenolinės rūgštys, vitaminai C, A, E bei kt.[17,24,41,42] Šiomis dienomis yra aktualu ieškoti naujų augalinių žaliavų su šiomis medžiagomis.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - pagaminti skystuosius pušų pumpurų ekstraktus bei sirupus ir nustatyti kaip ekstrahento koncentracija įtakoja preparatų kokybę.
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis mokslo literatūroje sukauptais duomenimis ir esama praktinio naudojimo patirtimi parinkti optimalią ekstrahento koncentraciją bei sumodeliuoti vaistingųjų sirupų su pušų pumpurais sudėtį.
2. Parinkti optimalų ekstrahentą, ekstrakcijos sąlygas ir ekstrakcijos metodą ir įvertinti fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometrijos metodu.
3. Pagaminti vaistinguosius sirupus su pušų pumpurų skystaisiais ekstraktais. Įvertinti jų klampą ir nustatyti fenolinių junginių kiekį, antioksidacinį aktyvumą spektrofotometrijos metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Paprastoji pušis (Pinus sylvetris L.)
1.1.1 Paprastosios pušies apibūdinimas
Paprastoji pušis (Pinus sylvestris L.) yra žinomas kaip ekonomiškai svarbus miško medis, plačiai paplitęs visoje Eurazijoje. Pasaulyje ji žinoma kaip Scots pine (Anglija), Хвоя звычайная (Baltarusija), Сосна обыкновенная (Rusija). Rūšies pavadinimas „sylvestris“ kilęs iš lotynų „miškų“, o genties „pinos” iš graikų „derva“. [20,29,45] 1-oje lentelėje pateikiama paprastosios pušies (Pinus
sylvestris L.) klasifikacija [45].
1 lentelė. Paprastosios pušies (Pinus sylvestris L.) mokslinė klasifikacija Karalystė Augalai (Plantae)
Pokaralystė Induočiai (Tracheophyta)
Skyrius Sėkliniai induočiai (Spermatophyta) Potipis Pušūnai (Pinophyta)
Klasė Pušainiai (Pinopsida) Šeima Pušiniai (Pinaceae) Gentis Pušis (Pinus)
Rūšis Paparastoji pušis (Pinus sylvestris)
Lietuvoje šis medis yra labai dažnai randamas. Jis mėgsta augti smėlinguose dirvožemiuose, miškuose ir aukštapelkėse. Didžiausi jų plotai yra rytų, pietryčių ir pietų Lietuvoje bei vakarų pajūrio zonoje. Visai neseniai ši rūšis buvo pripažinta nauju maisto ir biologiškai aktyvių junginių, turinčių gydomųjų savybių, šaltiniu. Didelis paplitimas reiškia, kad jis genetiškai labai varijuoja ir egzistuoja jo keletas pogrupių ir veislių. Tačiau dažnai šią rūšį galima lengvai atpažinti dėl savo ryškios apelsinų-raudonos spalvos žievės.
1.1.2 Botaninis apibūdinimas
Tai visžalis medis, mėgstantis drėgnus, gilius, purius smėlius. Užauga iki 20-40 metrų aukščio. Ūgliai, kol jauni, žalsvi, o vėliau ruduoja. Pumpurai pailgi, labiau ovalios formos, 6-12 mm ilgio, rausvai rudos spalvos, dažnai sakuoti. Pušų pumpurai pavaizduoti 1-ame paveiksle. Spygliai išsidėstę po du, melsvai žali, smailūs ir tiesūs, išsilaiko 2-3 metus. [8,23]
1 pav. Pušies pumpurai
Paprastoji pušis žydi gegužės – birželio mėnesiais. Kitų metų rugsėjo pabaigoje – spalio pradžioje, subręsta kankorėžiai, kurie trečių metų kovą – birželį prasiskleidžia, išberia sėklas ir nukrinta. Kankorėžiai pavieniai ar po 2-3 trumpais koteliais prisegti šakučių viršūnėse. Subrendę nusvirę, ovalūs, pailgai kiaušiniški, maždaug 20-70 mm ilgio, 15-35 mm storio, pilkai rudos spalvos. Dauginasi sėklomis. Atsparūs šalčiams ir sausrai. Gyvena apie 300-400 metų. [8]
1.1.3 Vaistinė žaliava
Džiovinti galima sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje. Taip pat ir saulėje. Nerekomenduojama džiovinti apšildomoje džiovyklėje, nes sakai gali susilydyti ir išgaruoti. Išdžiuvę pumpurai turi būti rudos, rudai žalios ar tamsiai rudos spalvos, dervų kvapo. Surinkti laikomi sandariai uždarytuose stikliuose induose. Vartojimo tinkamumas – 2 metai. [3,8,10]
1.1.4 Cheminė sudėtis
Pušų pumpuruose yra labai daug eterinių aliejų , iš kurių daugiausiai randami: α-pinenas (apie 30-40% ), limonenas (apie 25-40%), bornilacetatas (iki 11%), 3-karenas (nuo 7%), β-pinenas, α-terpineolis, terpinolenas, kariofilenas. Mažesni kiekiai randami 4-kareno, fencholio, borneolio, karvono. Taip pat pumpuruose galima rasti fenolinių junginių, pavyzdžiui : organinių rūgščių, tokių kaip benzoinė rūgštis, galo rūgštis, p-kumaro rūgštis, vanilino rūgštis. Be jų yra randamas benzaldehidas, acetofenonas, 3-metil-acetofenonas, toluenas, pinosilvinas, kvercetinas. Dar randama vitamino C, aldehidų (nonanalis, furfuralis, oktanalis), ketonų, alkoholių, aromatinių hidrokarbonatų, mineralinių druskų, flavonoidų, taninų, rauginių medžiagų, kartumynų (pinicikrinas), dervų ir sakų. [8,13,18,22,27,35,40,43]
1.1.5 Pušų pumpurų poveikis ir panaudojimas
Šios žaliavos preparatai gali būti vartojimai į vidų bei išoriškai. Pumpurai lengvina kosulį, dezinfekuoja bei valo kvėpavimo takus. Juos galima naudoti kaip arbatą, inhaliacijoms, o su jų pagamintais tepalais, krūtinės ląstai įtrinti. Galeniniai preparatai naudojami tulžiai ir šlapimui varyti. Taip pat pasižymi antiseptiniu, imuninę sistemą stiprinančiu ir uždegimą slopinančiu poveikiu. Esant plaučių ligoms veikia kaip gleivinės sekretą skystinanti medžiaga. [8,10,40]
1.2 Polifenolinių junginių samprata
Polifenoliai yra antriniai metabolitai, kurie atlieka daug svarbių vaidmenų augalų fiziologijoje bei turi žmogaus organizmo funkciją gerinančių savybių, nes veikia kaip antioksidacinį, antialerginį, priešuždegiminį, priešvėžinį, antihipertenzinį ir antimikrobinį poveikį turintys junginiai. Taip pat jie atlieka svarbų vaidmenį apsisaugant nuo augalų patogenų ir veikia kaip atsakas į įvairias abiotines streso sąlygas, pavyzdžiui, kritulius, UV spindulius. [22,38]
Polifenolinių junginių struktūra apima daugybę molekulių su polifenolio struktūra ir yra skirstoma į flavonoidus ir neflavonoidus. Pagrindinė neflavonoidų grupė yra fenolinės rūgštys. [22,38]
Semeniuc C. ir kt. 2015 metais atliktame tyrime nustatė, kad pušų pumpurų sirupe yra fenolinių rūgščių,
tokių kaip benzoinė rūgštis bei galo rūgštis, jų cheminės struktūros pavaizduotos 2-ame paveiksle [43].
3 pav. Pinosilvino cheminė struktūra [39]
Šis junginys yra randamas paprastojoje pušyje. Jis susidaro dėl išorinio streso įtakos, tokios kaip grybelinės infekcijos. Junginys pasižymi antimikrobiniu ir priešgrybeliniu poveikiu. [22,37,39]
Flavonoidai yra skirstomi į flavonolius, flavonus, flavononus, antocianidinus, flavonolius ir į izoflavonus [22]. Pušyse dažniausiai galima rasti flavonolį kvercetiną. Jo cheminė struktūra pavaizduota 4-ame paveiksle.
4 pav. Kvercetino cheminė struktūra ( čia R1 = OH, R2 = H) [33]
Šis flavonolis pasižymi antioksidaciniu poveikiu bei citotoksišku poveikiu vėžinėms ląstelėms [28,33].
1.3 Antioksidacinio aktyvumo samprata
oksidacijos ir antioksidacijos. Tam labai padeda mitybos derinimas su antioksidacinių junginių turinčiais produktais, kurie didina ląstelių apsaugą ir padeda išvengti oksidacinės žalos. [24,42]
Antioksidantas yra molekulė, kuri yra pakankamai stabili, kad gali perduoti elektroną laisvajam radikalui ir neutralizuoti jį, taip sumažinant žalos atsiradimo tikimybę. Šių molekulių sąveika su laisvaisiais radikalais gali saugiai nutraukti grandininę reakciją prieš gyvybinių molekulių pažeidimą. Yra žinomi du pagrindiniai antioksidantų veikimo mechanizmai. Pirmasis tai grandinės nutraukimo mechanizmas, kurio metu pirminis antioksidantas yra donoras ir atiduoda elektroną sistemose esančiam laisvajam radikalui. Antrasis mechanizmas apima ROS/antrinių antioksidantų pašalinimą, sustabdant grandinės iniciavimo katalizatorių. [15,29,36] Antioksidantai užkerta kelią aterosklerozės, reumatoidinio artrito, vėžio, astmos ir kitų įvairių ligų atsiradimui bei lėtina jų vystymasį. Nepaisant didelio aktyvumo, sintetiniai antioksidantai sukelia toksiškus šalutinius poveikius, todėl natūraliai atsirandančių antioksidantų paieška yra labiau sustiprinta. [17,31,34,41]
2015 metais Semeniuc C. ir kt. atliktuose, antioksidacinio aktyvumo, tyrimuose su pušų pumpurų sirupais buvo nustatyta, kad jie pažymi gana aukštu jo kiekiu (66,88 %) [43]. Pušų pumpuruose daugiausia randama fenolinių rūgščių ir flavonoidų, kurie pasižymi antioksidacinėmis savybėmis.
1.4 Bendroji ekstraktų apžvalga
Ekstraktai būna skystos, pusiau kietos (minkštieji ekstraktai) arba kietos (sausieji ekstraktai) konsistencijos preparatai, kuriuos galima gauti iš augalinių arba gyvulinių medžiagų, kurios paprastai yra sausos [Ph.Eur.04/2008:0765]. Skystieji ekstraktai yra koncentruotos ištraukos santykiu 1:1 ( iš 1 masės dalies augalinės žaliavos, gaunama 1 tūrio dalis skystojo ekstrakto) [1].
Skystieji ekstraktai gali būti gaminami keliais būdais: perkoliacija, reperkoliacija ir tirštų arba sausų ekstraktų tirpinimas tirpiklyje bei filtravimas. Vienas iš labiausiai naudojamų ekstrakcijos metodų yra reperkoliacija. Tai daugkartinės perkoliacijos metodas, kuris gali būti su nebaiktu ciklu arba baigtu ciklu.
Daugiausiai praktikoje sutinkama reperkoliacija su baigtu ciklu. Jos esmė yra žaliavos padalinimas į lygias dalis, kurių kiekviena ekstrahuojama ne grynu tirpikliu, o ištrauka, kuri yra gauta perkoliuojant ankstesnę žaliavos dalį. Taip ištrauka pereina per kelias žaliavos dalis ir tampa labai koncentruota. Šiuo metodu yra išvengiama ištraukos koncentravimo šildant, kai termolabilios medžiagos gali skilti. Pagamintus ekstraktus reikia keletą dienų laikyti ne didesnėje kaip 8°C temperatūroje ir po to filtruoti. [1,2,9]
1.5 Bendroji sirupų apžvalga
Sirupai yra geriamieji vandeniniai preparatai, kuriems yra būdingas saldus skonis ir klampi konsistencija [Ph. Eur 01/2008:0672]. Klasifikuojami jie į vaistinius ir skonį gerinančius (cukraus, vyšnių, apelsinų ir kt.) sirupus [16].
Medikamentinių sirupų gamybai dažniausiai yra naudojamas cukraus sirupas, kurio gamyba paprasta: cukrus ištirpinamas vandenyje, nuolat maišant ir virinamas keletą minučių. Tačiau ne tik cukraus sirupas gali būti naudojamas. Yra žinoma, kad gaminant sirupus reikia atsižvelgti ne tik į tai, ar vaistinės medžiagos tirpsta vandenyje, bet ir pasirūpinti, kad būtų užtikrintas vaisto ir kitų sirupo sudėtinių dalių suderinamumas. Pavyzdžiui, apelsinų sirupas yra labiau rūgštinės terpės, todėl tokią terpę mėgstančios vaistinės medžiagos joje ilgesnį laiką bus stabilios. [16,32]
Šios formos vaistinis preparatas turi nemažai pliusų. Jis gali paslėpti nemalonų vaistinių medžiagų skonį. Be to tai skystas preparatas, kuris yra lengviau nuryjamas bei lengviau dozuojamas. Taip pat dėl tokios formos, vaistų veikliosios medžiagos greičiau pasisavina organizme. Sirupus lengviau galima sugirdyti vaikams ar senyvo amžiaus žmonėms. Dar juos galima gaminti be etanolinio ekstrakto. Tai leidžia sirupą vartoti įvairaus amžiaus žmonėms, bei vartojantiems vaistus, kurie nedera su alkoholiu.
rūgimo, reikia į juos įdėti konservantų. Jie būna įvairūs, pavyzdžiui, kalio sorbatas, natrio karbonatas, glicerolis, etanolis. Dažniausiai yra naudojamas 90% koncentracijos etanolis.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
Darbo metu naudotos medžiagos
Tirpikliai:
1. Išgrynintas vanduo (Ph. Eur. 01/2011:0008).
2. Etanolis 96% V/V (AB „Vilniaus degtinė”, Lietuva). Reagentai:
1. 2N Folin – Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija). 2. Natrio karbonatas (Na2CO3) (Merck, Vokietija).
3. DPPH· - 2,2 – difenil - 1 – pikrilhidrazil hidratas (Sigma-Aldrich, JAV). Medžiagos gamybai:
1. Cukrus (AB „Nordic Sugar Kėdainiai”, Lietuva).
2. Pušų pumpurai (Dr. P. Karvelis „Pušų pumpurai”, Lietuva).
Darbo metu naudojami prietaisai
Vaistinės augalinės medžiagos apdorojimui naudojami prietaisai: 1. Laboratorinis malūnėlis D-47906 Clatronic (Kempen, Vokietija). Ekstraktų ir sirupų gamybai naudojami prietaisai:
1. Svarstyklės Kern EMB 200-3 (KERN&Sohn GmbH, Vokietija). 2. Kaitinimo plytelė 5006 CB EKP (Bomann, Vokietija).
3. Termometras CLIMACELL (BMT Medical Technology, Čekija). Tyrimų analizei naudojami prietaisai:
1. Džiovinimo spinta MEMMERT (Vokietija, 2012m.).
2. Spektrofotometras ( Shimadzu UV-1800 Spectrophotometer, JAV). 3. Viskozimetras ALPHA SERIES (FUNGILAB, S.A. Ispanija).
Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų gamyba reperkoliacijos būdu
2.3.1 Ekstraktų gamyba
Tyrimui atlikti naudojami 30%, 35%, 40%, 50% ir 60% etanoliniai tirpalai, kurių pagalba gaminami pušų pumpurų skystieji ekstraktai santykiu 1:1 (iš vienos dalies augalinės žaliavos gaunama 1 dalis ekstrakto). Naudojama vaistinė augalinė žaliava susmulkinama su malūnėliu. Ekstrakcijai naudojamas reperkoliacijos metodas be garinimo, su baigiamuoju ciklu. Ekstrahuojama 30g susmulkintų pušų pumpurų, iš kurių gaunama 30 ml koncentruoto ekstrakto.
2.3.2 Reperkoliacija
Reperkoliacijos metu medžiagos iš vaistinės augalinės žaliavos ekstrahuojamos per tris kartus. Norint pagaminti 30 ml pušų pumpurų ekstrakto reikia 30 g žaliavos. Analitinėmis svarstyklėmis atsveriami pušų pumpurai ir susmulkinami. Vieno ekstrakto ekstrakcijai naudojami 3 perkoliatoriai į kuriuos įkraunama po 10 g išbrinkintos žaliavos.
Brinkinimo metu žaliava užpilama reikiamu kiekiu ekstrahento. Kiekvieno ekstrakto gamybos metu pilamas atitinkamos koncentracijos etanolinis tirpalas (30%, 35%, 40%, 50% ir 60%). Kadangi pušų pumpurai buvo susmulkinti, tai jų paviršiaus plotas žymiai padidėjo, o tai reiškia, kad ekstrahento reikia pilti tikrai nemažai, todėl yra aktualu nustatyti augalinės žaliavos sugėrimo koeficientą, kuris padės nustatyti ekstrakcijai reikalingą ekstahento kiekį. Sužinojus koeficiento reikšmę, ekstrahento kiekį sužinome gautą koeficientą padauginus iš žaliavos kiekio prieš brinkinimą.
Ekstrahento kiekio nustatymo tyrimas atliekamas brinkinant 10g susmulkintų pušų pumpurų. Jie įdedami į porcelianinę lėkštelę ir užpilami 100ml etanolio tirpalu ir paliekami 2 valandas. Po to nuo augalinės žaliavos nupilamas ekstrahento perteklius, tada ji nuspaudžiama ir sveriama. Žaliavos sugeriamumo koeficientas skaičiuojamas pagal formulę [12]:
= ,
čia p2 - žaliavos masė po išbrinkinimo, g,
Yra svarbu nustatyti optimalią žaliavos brinkimo trukmę, todėl bandymo metu buvo pasirinkti laikai nuo 30 minučių iki 3 valandų, brinkinimo laiką didinant po 30 minučių. Kai žaliavos svoris nekinta, nustatomas laikas, kuris yra augalinės žaliavos brinkinimo laikas. Skystųjų ekstraktų gamybos schema pavaizduota 5-ame paveiksle.
5 pav. Pušų pumpurų ekstraktų gamybos schema
Išbrinkusios augalinės žaliavos yra pakraunamos į perkoliatorius ir užpilamos etanoliu. Norint, kad visos medžiagos liestųsi su ekstrahentu, reikia išstumti orą iš žaliavos. Atsukamas perkoliatoriaus čiaupas ir laukiama kol ektrahentas pradės bėgti lygia srove. Išbėgęs tirpalas supilamas atgal į perkoliatorių. Papildomai užpilama ehstrahento iki kol susidarys veidrodinis atspindys. Perkoliatorius sandariai uždaromas ir paliekamas stovėti apie 3 paras. Perkoliuojama 1/25 perkoliatoriaus tūrio per valandą greičiu. Iš pirmojo perkoliatoriaus surenkama pirmoji ištrauka, kuri yra naudojama antrajame perkoliatoriuje esančiai medžiagai brinkinti. Ji yra daugiau koncentruota, nei antra surinkta ištrauka, kuri naudojama žaliavai, atrajame perkoliatoriuje, ekstrahuoti. Trečiajame perkoliatoriuje esančiai medžiagai naudojamos iš antrojo perkoliatoriaus surinktos ištraukos. Galiausiai iš trečiojo perkoliatoriaus surenkamas galutinis, reikiamas ištraukos kiekis (t.y. 30ml). Kelias dienas pagaminti ekstraktai laikomi ne aukštesnėje nei 8C temperatūroje. Tada jie filtruojami pro 0,4 l filtrus.
Sirupų gamyba
2.4.1
Cukraus sirupo gamyba
Karštuoju metodu, masės būdu gaminamas paprastasis cukraus sirupas. 100g sirupo gamybai imama 64 g rafinuoto cukraus ir 36 ml išgrynintojo vandens. Cukrus yra ištirpinamas distiliuotame vandenyje ant kaitinimo plytelės, nuolat maišant. Virinama kuo trumpesnį laiką ( apie 1 minutę), 104 C temperatūroje. Dar karštą sirupą reikia perfiltruoti pro trigubą marlės sluoksnį. Jei gauto sirupo masė gaunasi mažesnė nei turi būti, reikia pripilti karšto vandens iki 100g. Pagamintas cukraus sirupas turi būti skaidrus, bekvapis, saldaus skonio, tirštas skystis.
2.4.2 Sirupų su etanoliniais pušų pumpurų ekstraktais gamyba
Gaminami penki sirupai, su skirtingomis pušų pumpurų ekstraktų koncentracijomis (30%, 35%, 40%, 50% ir 60%), masės būdu. Sirupų gamybos schema pavaizduota 6-ame paveiksle.
6 pav. Pušų pumpurų ekstrakto sirupo gamybos schema
100 g sirupui svarstyklėmis atsveriama 12g pušų pumpurų ekstrakto, 5g 90 etanolio tirpalo ir 83 g cukraus sirupo. Čia etanolis naudojamas kaip konservuojanti medžiaga. Tada į pagamintą cukraus sirupą įpilama ekstrakto ir etanolio mišinio, viskas maišoma 15-20 minučių ir paliekama nusistovėti parai laiko. Vėliau sirupas filtruojamas pro trigubą marlės sluoksnį, tada išpilstomas į tamsaus stiklo buteliukus ir laikomas šaldytuve +2-8 ± °C temperatūroje. Pušų pumpurų sirupas yra gelsvos spalvos, skaidrus, specifinio kvapo, tirštas skystis.
Analizės metodai
2.5.1 Sauso likučio kiekio nustatymas
Sauso likučio kiekis ekstrakte nustatytas gravimetrinės analizės metodu naudojant džiovinimo spintą MEMMERT (Vokietija) 2012m. Tyrimui paimta po 2g kiekvieno pušų pumpurų skystojo ekstrakto. Į pasvertą porcelianinę lėkštelę įpilamas ekstraktas. Lėkštelėje esantis turinys džiovinamas džiovinimo spintoje esant 105°C temperatūrai iki pastovaus svorio. Gauti rezultatai apskaičiuojami masės procentais.
2.5.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendram fenolinių junginių kiekiui skystuosiuose pušų pumpurų ekstraktuose ir sirupuose nustatyti naudotas spektrofotometrinis metodas. Tyrimo metu atliekama kolorimetrinė reakcija su Folin-Ciocalteu reagentu (Sigma, Šveicarija) naudojant UV-vis spektrofotometrą (Shimadzu UV-1800 Spectrophotometrer, JAV). Reagentų ruošimo schema pavaizduota 7-ame paveiksle.
7 pav. Reagentų paruošimo schema bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti
Tiriamiesiems ekstraktams paruošti imama po 0,5ml skystojo pušų pumpurų ekstrakto, kuris yra praskiedžiamas su 50ml atitinkamos koncentracijos etanoliu, santykiu 1:100.
Tiriamiesiems sirupams paruošti imama po 1ml sirupo ir praskiedžiama su atitinkamos koncentracijos etanoliu (1:10). Viskas gerai išmaišoma. Jei iškrenta nuosėdos, tiriamą sirupą reikia perfiltruoti per popieriaus filtrą.
Matavimu metu atliekama spalvinė reakcija: į 0,5ml tiriamojo ekstrakto ar sirupo įpilama 2,5ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagento ir 2ml 7,5% bevandenio Na2CO3 tirpalo. Šių mėginių pagaminama po tris (kiekvieno ekstrakto ir sirupo). Tirpalai paliekami nusistovėti 30 minučių, kol įvyksta reakcija. Įvykusi reakcija būna tada, kai tirpalai iš šviesiai mėlynos spalvos tampa tamsiai mėlyni.
Praėjus 30 minučių, spektrofotometru išmatuojami tirpalų optiniai tankiai esant 760 nm bangos ilgiui. Palyginamas tirpalas – vanduo. Kiekvienas bandinys matuotas 3 kartus, iš kurių išvedamas aritmetinis vidurkis su vidutine standartine paklaida.
2.5.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvuoju
radikalu
Sirupų ir ekstraktų veikliųjų medžiagų antioksidacinis aktyvumas įvertinamas taikant elektronų perdavimo reakcijomis pagrįsto laisvojo DPPH· (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) radikalo surišimo metodą. Metodo metu laisvasis DPPH radikalas, reaguodamas su antioksidantu , prisijungia protoną ir taip redukuojasi.[5,6,12]
Tyrimui atlikti naudojamas 6˟10-5 DPPH tirpalas. Jis ruošiamas tiksliai atsveriant 0,00118g chemiškai švaraus reagento ir jį ištirpinant 50ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas ruošiamas kiekvieną dieną - naujas. Jis laikomas tamsaus stiklo buteliuose.
Tiriamųjų ekstraktų ir sirupų paruošimas: paimama 0,1ml ekstrakto ar sirupo ir skiedžiama su 1,9ml 96% (V/V) etanoliu.
Paimama 0,1ml tiriamojo tirpalo ir įpilama į 1cm kiuvetę. Toliau į kiekvieną kiuvetę įpilame 2,9ml 6˟10-5 DPPH etanolinis tirpalas. Kiuvetėse sumaišomi tirpalai ir uždengti paliekami 30 minučių. Per tą laiką įvyksta reakcija, kurios metu pasikeičia DPPH tirpalo spalva. Ji iš violetinės pereina į geltoną. Mėginių absorbcijos dydžio mažėjimas išmatuojamas spektrofotometru, esant 515nm bangos ilgiui [4]. Lyginamasis tirpalas - 96% etanolis. Mėginiai matuoti po tris kartus. Iš jų išvestas aritmetinis vidurkis su vidutine standartine paklaida. Rezultatai skaičiuojami remiantis formule (1):
š = − × 100%
Ab – standartinio tirpalo absorbcija (DPPH tirpalo optinis tankis) (t= 0min.); Aa – tiriamojo tirpalo su standartiniu tirpalu absorbcija (po 30min.);
2.5.4 Klampos nustatymas sirupuose
Dinaminė sirupų klampa nustatoma viskozimetru ALPHA SERIES (FUNGILAB, S.A. Ispanija). Apie 50g tiriamojo sirupo supilama į matavimui skirtą specialų indą, kuris yra pastatomas ant prietaiso darbinio paviršiaus. Į jį panardinamos viskozimero šakutės, kad sukiklis būtų paniręs iki žymos. Matavimui naudojamas L2 velenas. Matavimo procesas trunka apie 1-2 minutes, 100 aps./min greičiu, kol veleno greitis nusistovi. Tyrimas atliktas kambario temperatūros (25±2°C) sąlygomis. Rezultatai skaičiuojami išvedus aritmetinį vidurkį su vidutine standartine paklaida, iš trijų gautų mėginių rodiklių.
2.5.5 Skystųjų ekstraktų ir sirupų stabilumo tyrimai
Stabilumo tyrimai, skystiesiems pušų pumpurų etanoliams ekstraktams, atlikti atsižvelgiant į antioksidacinio aktyvumo, fenolinių junginių ir sauso likučio kiekio kitimą visą tyrimo laiką. Sirupų stabilumas tirtas stebint antioksidacinio aktyvumo, fenolinio junginių kiekio ir klampos kitimą. Rezultatai buvo nustatomi kas 3 mėnesius, vienerius metus laiko. Tyrimo objektai visą laiką buvo laikomi šaldytuve +2-8 ± °C temperatūroje.
2.5.6 Duomenų analizės metodai
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Pušų pumpurų ekstraktų tinkamumo vertinimas gaminant sirupus
Eksperimento metu buvo pagaminti 5 skirtingos koncentracijos (30%, 35%, 40%, 50% ir 60%) etanoliniai ekstraktai. Prieš atliekant antioksidacinio aktyvumo, bendro fenolinių junginių ir sauso likučio kiekio analizės tyrimus, su jais buvo pagaminti sirupai.
Pagamintas sirupas privalo būti skaidrus, gelsvos spalvos ir specifinio kvapo, tačiau ne visi gauti sirupai atitiko šiuos kriterijus. Nesigavę sirupai pavaizduoti 8-ame paveiksle.
8 pav. Sirupai A (kairėje) ir B (dešinėje)
*A – sirupas su 50% pušų pumpurų etanoliniu ekstraktu, B- sirupas su 60% pušų pumpurų etanoliniu ekstraktu
Pagaminti 50% ir 60% sirupai gavosi neskaidrūs, susidrumstę ir maždaug po mėnesio laiko, juos laikant šaldytuve, + 2-8 ± °C temperatūroje, sugedo. Sirupai išsiskyrė neaiškios kilmės kvapu. 9-ame paveiksle pateikta nuotrauka parodo kaip turi atrodyti sirupai su pušų pumpurų etanoliniu ekstraktu.
9 pav. Sirupai C (kairėje), D (viduryje) ir E (dešinėje)
Apibendrinant galima teigti, kad 50% ir 60% etanoliniai ekstraktai nėra tinkami sirupų gamybai. Pagaminti sirupai neatitinka kokybės reikalavimų. Atsižvelgus į rezultatus, tolimesni tyrimai su šiais ekstraktais ir sirupais nebuvo atliekami.
Pušų pumpurų ekstrahento sugėrimo koeficiento ir optimalaus
brinkinimo laiko nustatymas
Brinkinimo laiko nustatymas yra svarbus norint sumažinti ekstraktų gamybos pasiruošimo trukmę ir greičiau pradėti žaliavos ekstrahavimą. Pats brinkimo procesas yra svarbus tuo, kad jo metu daugiau veikliųjų medžiagų išsiekstrahuoja. Ekstrahentas kapiliarais prasiskverbia į žaliavos gabalėlius ir tirpina jame esančias ekstrakcines medžiagas [12]. Tyrimo metu buvo nustatinėjamas optimalus susmulkintų pušų pumpurų brinkimo laikas. Gauti rezultatai pateikti 10-ame paveiksle.
10 pav. Pušų pumpurų brinkinimo trukmė
Eksperimento metu buvo nustatomas brinkstančios augalinės žaliavos svoris kas 30 minučių. Po 2 valandų svoris nusistovėjo ir nebedidėjo. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp rezultatų nebuvo (p>0,05). Per 1 valandą ir 30 minučių brinkimas vyksta greičiausiai, o po to sulėtėja. Nustatyta optimali brinkinimo trukmė yra 2 valandos, nes vėliau brinkinimo procesas nebevyksta.
Po brinkinimo proceso, pagal žaliavoje esantį ekstrahento kiekį, skaičiuojamas sugėrimo koeficientas. Tyrimui naudotas 30% etanolio tirpalas. Gauti rezultatai pateikti 2-oje lentelėje.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Iš b r in k u si o s ž al iav o s m as ę , g.
2 lentelė. Ekstrahento sugėrimo koeficiento nustatymas pušų pumpuruose po 2-jų valandų. Bandymo
Nr.
Žaliavos masė prieš brinkinimą, g
Žaliavos masė po
brinkinimo, g Sugėrimo koeficientas
1 10 40 4
2 10 39,5 3,95
3 10 40,5 4,05
*- Tyrimai kartoti 3 kartus (n=3)
Rezultatai rodo, kad vidutinis sugėrimo koeficientas yra K = 4. Skaičiuojant ekstrahento kiekį brinkinimui, buvo atsižvelgta į gautą koeficiento reikšmę.
Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas, bendras
fenolinių junginių ir sauso likučio kiekis
Eksperimento metu buvo siekiama nustatyti, kokios koncentracijos etanolinis tirpalas (30%, 35%, 40%) yra tinkamiausias gaminant pušų pumpurų skystuosius ekstraktus. Pagaminus etanolinius pušų pumpurų skystuosius ekstraktus yra svarbu nustatyti kaip etanolio koncentracija įtakoja išsiekstrahavusių veikliųjų medžiagų kiekį. Ištraukų kokybė vertinama pagal sausą likutį, kuris yra nustatomas gravimetriniu metodu ir pagal spektrofotometriniu metodu nustatytą bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.
11 pav. Etanolio koncentracijos įtakos nustatymas pušų pumpurų antioksidaciniam aktyvumui, bendram fenolinių junginių ir sauso likučio kiekiui tyrimas
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Bandymo metu, atliekant skystųjų ekstraktų tyrimus, kuriuose kaip ekstrahentas naudojamas etanolis, nustatyta, kad etanolio koncentracija turi įtakos antioksidaciniam aktyvumui, fenolinių junginių ir sausio likučio kiekiui (p<0,05). Po ekstrakcijos reperkoliacijos būdu, iš visų vaistinės augalinės žaliavos ekstraktų, didžiausiu nuodžiūviu pasižymėjo ekstraktas su 40% etanoliniu tirpalu - 4,32 ± 0,03%. Mažiausias sausų medžiagų kiekis buvo esant 30% ekstrahentui - 3,33 ± 0,02%. Pastebima priklausomybė nuo etanolinio tirpalo koncentracijos ir nuodžiūvio kiekio (p<0,05).
Atlikus antioksidacinio aktyvumo tyrimą nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp skirtingos koncentracijos etanolinių ekstraktų (p<0,05). Iš jų, didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu išsiskyrė pušų pumpurų ekstraktas su 40% ekstrahentu - 40,24 ± 0,01%, o mažiausiu - 30% koncentracijos ekstraktas - 35,6 ± 0,04%.
Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstrakte, pagamintame naudojant 40% etanolį (4,25 ± 0,4 g/ml ), o tuo tarpu mažiausias kiekis nustatytas su 30% koncentracijos ekstraktu (3,25 ± 0,02 mg/ml). Čia pastebimas skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
35,6 38,05 40,24 3,33 3,81 4,32 3,25 3,52 4,25 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 30 35 40 D P P H i n ak tyv av im o i r s au so l ik u č io k ie k is ( % ) B e n d r as is fe n o li n ių ju n gi n ių k ie k is (m g/ m l) Ekstraktų koncentracija (%)
Apžvelgus visus gautus trijų skirtingų ekstraktų rezultatus, aiškiai matoma, kad 40% koncentracijos pušų pumpurų ekstraktas pasižymi didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, bendru fenolinių junginių ir sauso likučio kiekiu. Galima teigti, kad etanolio koncentracija turi įtakos pagamintų pušų pumpurų skystųjų ekstraktų kokybei.
Etanolinių ekstraktų įtakos sirupų kokybei tyrimas
Gaminant vaistinguosius sirupus buvo naudoti 30%, 35% ir 40% pušų pumpurų etanolinai ekstraktai. Nors atliktų tyrimų metu geriausiomis savybėmis pasižymėjo ekstraktas su 40% ekstrahentu, buvo nuspręsta ištirti sirupus su visais trimis ekstraktais. Pagaminus sirupus yra svarbu nustatyti kiek išsiekstrahavusių fenolinių junginių išlieka juose priklausomai nuo ekstrakto koncentracijos.
Tyrimo rezultatai vertinant į sirupus įtrauktų 30%, 35% ir 40% ekstraktų įtaką antioksidaciniam aktyvumui ir bendram fenolinių junginių kiekiui sirupuose pateikti 12-ame paveiksle.
12 pav. Sirupuose esančio etanolinio pušų pumpurų ekstrakto įtakos nustatymas antioksidaciniam aktyvumui ir bendram fenolinių junginių kiekiui
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3) 15,81 16,67 17,74 0,39 0,41 0,55 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Pušų pumpurų etanolinių ekstraktų koncentracija sirupuose (%)
B e n d r as is fe n o li n ių ju n gi n ių k ie k is (m g/ m l) D P P H i n ak tyv av ias ( % )
Rezultatai, pateikti 12-ame paveiksle, rodo, kad sirupas su 30% koncentracijos etanoliniu ekstraktu pasižymi 15,81 ± 0,01 % antioksidaciniu aktyvumu. Tai mažiausias gautas rezultatas palyginus su kitais dviem sirupais. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas matomas sirupe su 40% etanoliniu ekstraktu - 17,74 ± 0,01 %. Skirtumas tarp rezultatų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Lyginant šiuos duomenis su rezultatais gautais tiriant ekstraktus, galima pastebėti tendenciją, kad gaminant sirupą su didesnės koncentracijos etanoliu, antioksidacinių medžiagų kiekis išlieka didesnis su tuo ekstraktu, kuriame buvo rastas didžiausias aktyvumas (šiuo atveju sirupe su 40% koncentracijos pušų pumpurų skystuoju ekstraktu).
Rezultatai tiriant fenolinių junginių kiekį rodo, kad jų kiekis ištirtuose ekstraktuose atitinkamai kinta ir sirupuose. Diagramoje (12 paveiklas) matome, kad fenolinių junginių kiekis sirupe su 30% etanoliu yra 0,39 ± 0,003 mg/ml, su 35% etanoliu - 0,41 ± 0,031 mg/ml, o su 40% - 0,55 ± 0,061 mg/ml. Skirtumas tarp kiekių yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Taigi bendras didžiausias fenolinių junginių kiekis yra sirupe su 40% etanoliniu ekstraktu, o mažiausias su 30%.
Apžvelgus bendrus rezultatus, geriausiomis savybėmis pasižymi sirupas su aukščiausios koncentracijos ekstraktu (40%). Jame buvo rastas statistiškai patikimas bei didžiausias antioksidacinis aktyvumas ir bendras fenolinių junginių kiekis. Galima teigti, kad atitinkamos koncentracijos etanoliniai ekstraktai turi įtakos tyrimų rezultatams. Didėjant etanolinio ekstrakto koncentracijai sirupe, didėja antioksidacinės savybės ir fenolinių junginių kiekis.
Skystųjų pušų pumpurų ekstraktų įtakos sirupų klampai tyrimas
13 pav. Sirupų klampos reikšmės
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Analizės metu, ištyrus sirupų klampą, mažiausią klampą (57,01 ± 0,03 mPa·s) turėjo sirupas su 30% etanoliniu ekstraktu. Didžiausią klampą (59,61 ± 0,06 mPa·s) turėjo sirupas su 40% skystuoju pušų pumpurų ekstraktu. Skirtumas tarp sirupų klampos rezultatų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Apibendrinant galima teigti, kad 30%, 35% ir 40% pušų pumpurų etanoliniai ekstraktai turi įtakos sirupų klampai.
Pušų pumpurų skystųjų ekstraktų tyrimai saugojimo metu
Eksperimento metu papildomai buvo tikrinamas skystųjų etolinių ekstraktų (30%, 35% ir 40%) stabilumas atsižvelgiant į antioksidacinio aktyvumo, bendro fenolinio junginių ir sauso likučio kiekio kitimą per laiką. Tyrimas buvo atliekamas kas 3 mėnesius 1 metus laiko. Etanoliniai pušų pumpurų ekstraktai buvo laikyti šaldytuve, 30 ml tamsaus stiklo buteliukuose, esant + 2-8 ± °C temperatūrai. Ekstraktuose nustatyto antioksidacino aktyvumo rezultatai, per 12 mėnesių, pateikti 3-ioje lentelėje. 57,01 58,48 59,61 55 56 57 58 59 60 30 35 40 K lam p a (m P a·s )
3 lentelė. Antioksidacinio aktyvumo kiekio kitimas skystuosiuose ekstraktuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai) Saugojimo laikas (mėn.) Antioksidacinis aktyvumas (%)
30 proc. 35 proc. 40 proc.
Pušų pumpurų skystasis etanolinis ekstraktas - 35,60 ± 0,04 38,05 ± 0,01 40,24 ± 0,01 3 35,41 ± 0,04 37,98 ± 0,07 40,19 ± 0,02 6 35,26 ± 0,07 37,91 ± 0,08 40,17 ± 0,02 9 35,17 ± 0,04 37,86 ± 0,08 40,13 ± 0,60 12 35,11 ± 0,30 37,82 ± 0,07 40,08 ± 0,05
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Įvertinus ir palyginus duomenis matoma, kad antioksidacinio aktyvumo kitimas per vienerius metus 30% etanoliniame pušų pumpurų ekstrakte yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). 35% ir 40% koncentracijos ekstraktuose statistiškai reikšmingo antioksidacinio aktyvumo kiekio kitimo nebuvo (p>0,05). Fenolinių junginių kiekio kitimas ekstraktuose, per 12 mėnsesių, pateiktas 4-oje lentelėje.
4 lentelė. Bendro fenolinių junginių kiekio kitimas skystuosiuose ekstraktuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai)
Saugojimo laikas (mėn.)
Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml)
30 proc. 35 proc. 40 proc.
Pušų pumpurų skystasis etanolinis ekstraktas - 3,25 ± 0,02 3,52 ± 0,02 4,25 ± 0,40 3 3,09 ± 0,02 3,48 ± 0,05 4,24 ± 0,08 6 3,01 ± 0,01 3,41 ± 0,04 4,21 ± 0,04 9 2,91 ± 0,01 3,39 ± 0,02 4,16 ± 0,06 12 2,82 ± 0,06 3,35 ± 0,02 4,11 ± 0,03
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
5 lentelė. Sauso likučio kiekio kitimas skystuosiuose ekstraktuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai) Saugojimo
laikas (mėn.)
Sausas likutis (%)
30 proc. 35 proc. 40 proc.
Pušų pumpurų skystasis etanolinis ekstraktas - 3,33 ± 0,02 3,81 ± 0,02 4,32 ± 0,03 3 3,30 ± 0,02 3,75 ± 0,02 4,30 ± 0,03 6 3,21 ± 0,03 3,69 ± 0,02 4,28 ± 0,02 9 3,15 ± 0,01 3,54 ± 0,03 4,24 ± 0,01 12 3,10 ± 0,01 3,46 ± 0,01 4,20 ± 0,01
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Peržiūrėjus gautus duomenis nustatyta, kad sausio likučio kitimai per 12 mėnesių visuose ekstraktuose buvo statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
Apibendrinant galima teigti, kad 30% skystasis etanolinis ekstraktas, antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio kitimo atžvilgiu, išliko nestabilus per 12 mėnesių, o 35% ir 40% etanoliniai pušų pumpurų ekstraktai išliko stabilūs visa tyrimo laiką.
Pušų pumpurų sirupų tyrimai saugojimo metu
6 lentelė. Antioksidacinio aktyvumo kiekio kitimas vaistinguosiuose sirupuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai) Saugojimo laikas (mėn.) Antioksidacinis aktyvumas (%)
Su 30 % ekstraktu Su 35 % ekstraktu Su 40 % ekstraktu
Pušų pumpurų vaistingasis sirupas - 15,81 ± 0,01 16,67 ± 0,03 17,74 ± 0,01 3 15,49 ± 0,03 16,49 ± 003 17,70 ± 0,01 6 15,39 ± 0,05 16,27 ± 0,07 17,68 ± 0,02 9 15,28 ± 0,05 16,08 ± 0,09 17,62 ± 0,03 12 15,25 ± 0,02 15,99 ± 0,03 17,58 ± 0,01
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Atlikus duomenų analizę nustatyta, kad sirupuose su 30% ir 35% etanolinais pušų pumpurų ekstraktais, antioksidacinio aktyvumo kitimas per 12 mėnesių yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Sirupas su 40% koncentracijos ekstraktu, antioksidacinio aktyvumo atžvilgiu, išliko stabilus visą tyrimo laiką. Fenolinių junginių kiekio kitimo rezultatai per 12 mėnesių pateikti 7-oje lentelėje.
7 lentelė. Bendro fenolinių junginių kiekio kitimas sirupuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai) Saugojimo
laikas (mėn.)
Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml)
Su 30 % ekstraktu Su 35 % ekstraktu Su 40 % ekstraktu
Pušų pumpurų vaistingasis sirupas - 0,39 ± 0,003 0,41 ± 0,031 0,55 ± 0,061 3 0,37 ± 0,003 0,39 ± 0,03 0,51 ± 0,05 6 0,34 ± 0,002 0,37 ± 0,03 0,48 ± 0,05 9 0,25 ± 0,002 0,28 ± 0,04 0,41 ± 0,04 12 0,21 ± 0,002 0,20 ± 0,04 0,38 ± 0,04
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Įvertinus duomenis statistiškai reikšmingų fenolinių junginių kiekio kitimo pokyčių nebuvo rasta sirupuose su 35% ir 40% VAŽ ištraukomis (p>0,05), tačiau per laiką, sirupe su 30% skystuoju pušų pumpurų ekstraktu, fenolinių junginių kiekiai statistiškai reikšmingai pakito (p<0,05).
8 lentelė. Klampos kitimas sirupuose ( esant + 2-8 ± °C temperatūrai) Saugojimo
laikas (mėn.)
Klampa (mPa·s)
Su 30 % ekstraktu Su 35 % ekstraktu Su 40 % ekstraktu
Pušų pumpurų vaistingasis sirupas - 57,01 ± 0,03 58,48 ± 0,03 59,61 ± 0,06 3 57,09 ± 0,05 58,54 ± 0,03 59,69 ± 0,03 6 57,15 ± 0,06 58,61 ± 0,04 59,79 ± 0,05 9 59,09 ± 0,05 59,41 ± 0,02 60,97 ± 0,14 12 59,14 ± 0,05 59,49 ± 0,12 61,08 ± 0,03
*-Rezultatai gauti tiriant 3 mėginius (n=3)
Iš prieš tai įvertintų klampos rezultatų žinome, kad sirupas su 30% skystuoju pušų pumpurų ekstraktu pasižymi mažiausia klampa. Dabartinio tyrimo analizė rodo, kad mažiausia šio sirupo klampa išsilaiko iki 6 mėnesių, nes klampos kitimas nėra statistiškai reikšmingas tuo laikotarpiu (p>0,05). Tuo tarpu nuo 6 tyrimo mėnesio iki 9, klampa statistiškai reikšmingai padidėja (p<0,05) ir iki 12 mėnesio tyrimų išlieka mažai pakitusi (p>0,05). Tokia pati tendencija pastebima ir kituose sirupuose.
4. IŠVADOS
1. Remiantis mokslo literatūros duomenimis, skystųjų pušų pumpurų ekstraktų gamybai parinktas reperkoliacijos metodas su baigiamuoju ciklu, be garinimo. Ekstrahentais naudojami 30%, 35% ir 40% koncentracijos etanoliniai tirpalai.
2. Pagaminti sirupai su 50% ir 60% skystaisiais pušų pumpurų ekstraktais, dėl savo išvaizdos ir nestabilumo nėra tinkami vartojimui.
3. Atlikus pušų pumpurų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo, bendro fenolinio junginių ir sauso likučio kiekio tyrimus nustatyta, kad 40% etanolinis ekstraktas pasižymi aukščiausiais rezultatais. Jo antioksidacinis aktyvumas - 40,24 ± 0,01%, bendras fenolinių junginių kiekis - 4,25 ± 0,4 g/ml ir nuodžiūvis - 4,32 ± 0,03%. Mažiausi rezultatai gauti 30% koncentracijos pušų pumpurų ekstrakte.
4. Analizės metodais didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas nustatytas sirupe su 40% skystuoju pušų pumpurų ekstraktu.
5. Analizės metodais didžiausia klampa (57,01 ± 0,03 mPa·s) nustatyta sirupe su 40% etanoliniu pušų pumpurų ekstraktu.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Aleknavičienė B, Bernatonis D, Briedis V, Drakšienė G, Savickas A, Velžienė S. Pramoninės vaistų technologijos laboratoriniai darbai. Kauno medicinos universitetas; 2002. p. 64-76.
2. Briedis V, Grinevičius J, Savickas A, Švambaris L. K. Vaistų technologija (ketvirtas tomas); 2002.
3. Budnikas V, Obelevičius K. Vaistažolės. Tradicinis vartojimas. Arbatų ir kitokių ištraukų gaminimas namuose. Kaunas; 2015.
4. Dicevičius K. Vaistinių ramunių žiedų, karčiųjų kiečių žolės ir anyžinių ožiažolių vaisių geriamųjų lašų kokybės rodiklių analizė. [Magistro baigiamasis darbas]. Kaunas: LSMU; 2016.
5. Dilbaitė-Lekstutienė D. Sirupo su pankolių vaisių, beržų lapų ir našlaičių žolės skystaisiais ekstaktais technologija. Kaunas: LSMU; 2015.
6. Kasparavičienė G, Briedis V. Juodųjų serbentų ir juodavaisių aronijų uogų sulčių stabilumas ir antioksidacinis aktyvumas. Medicina; 2003.p.65–69.
7. Pudžiuvelytė L. Šeivamedžių žiedų ir uogų skystųjų ekstraktų ir sirupų technologijos ir kokybės vertinimas. [Magistro darbas]: LSMU; 2014. p. 29-32.
8. Ragažinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas; 2005. p. 261-263.
9. Valodkaitė. O. Kvapiojo rozmarino etanolinių ištraukų technologijos ir kokybės vertinimas. [Magistro darbas]: LSMU; 2011.p. 31-33.
10. Vasiliauskas J. Žolininkas pataria. Vilnius, 2015.p.107-109
11. Vaistai iš gamtos. Žinynas apie augalinius vaistus, jų vartojimą ir poveikį organizmui. Vilnius:Alma littera; 2011.p.154.
12. Velžienė S. Tinktūros Neuroventralis L, skystojo ekstrakto Ventralis ir tablečių Ventralis technologijos ir jų vertinimas. [Daktaro disertacija]: Kauno medicinos universitetas, 2005.p. 41-50.
13. Zykevičiūtė J. “Vaistinių arbatų sudėties ir antioksidacinių savybių įvertinimas”; [Magistro darbas]: VDU GMF; 2009.p.9-13.
15. Alam MN, Bristi NJ, Rafiquzzaman M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharm J SPJ Off Publ. Saudi Pharm Soc. 2013;21(2):143–52.
16. Allen V. L, Popovich G. N, Ansel H. C. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,9th edition. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins; 2009.
17. Apetrei L. C, Tuchilus C, Aprotosoaie C. A, Oprea A, Malterud E. K, Miron A. Chemical, Antioxidant and Antimicrobial Investigations of Pinus cembra L. Bark and Needles. Molecules; 2011. p. 7773-7788.
18. Baczek K, Kosakowska O, Przybyl L. J, Piorojabrucka E, Kuzma P, Obiedzinski M, et al. Intraspecific Variability of Self-sown Scots Pine (Pinus sylvestris L.) Occurring in Eastern Poland in Respect of Essential Oil Content and Composition. Baltic Forestry. 2017;23(3):576-583.
19. Bent S. Herbal medicine in the United States: review of efficacy, safety and regulation. Journal of general internal medicine. 2008;23(6):854-859.
20. Choubey Sh, Varughese R. L, Kumar V, Beniwal V. Medicinal importance of gallic acid and its ester derivatives: a patent review. Pharm. Pat. Anal.; 2015; 4(4): 305–315.
21. Cregg M. B, Zhang W. J. Physiology and morphology of Pinus sylvestris seedlings from diverse sources under cyclic drought stress. Forest Ecology and Manegement; 2001. p. 131-139.
22. Daglia M. Polyphenols as antimicrobial agents. Biotechnology; 2012;23: 174–181. 23. Diego N, Montalbán I. A, Moncaleán P. In vitro regeneration of adult Pinus sylvestris L. Trees. South African Journal of Botany; 2010;76: 158–162.
24. Dudonne S, Vitrac X, Coutiere P, Woillez M, Merillon M.J. Comparative Study of Antioxidant Properties and Total Phenolic Content of 30 Plant Extracts of Industrial Interest Using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC Assays. J. Agric. Food Chem.; 2009;57: 1768–1774.
25. EMEA. Benzyl alcohol and benzoic acid group used as excipients. Prieiga per internetą:
https://www.ema.europa.eu
26. EMEA. Questions and answers on benzoic acid and benzoates used as excipients in medicinal products for human use. Prieiga per internetą: https://www.ema.europa.eu
27. Encyclopedia of herbs. Pine buds – herbs for constipation and cold. [Internet]. Herbal leaf; 2014 [cited 2019 03 05]. Available from: http://herballeaf.eu/encyclopedia-of-herbs/pine-buds/
29. Hamid A. A, Aiyelaagbe O. O, Usman A. L, Ameen M. O, Lawal A. Antioxidants: Its medicinal and pharmacological applications. African Journal of Pure and Applied Chemistry. Vol. 4(8); 2010: 142-151.
30. Houston Durrant T, de Rigo D, Caudullo G. Pinus sylvestris in Europe: distribution, habitat, usage and threats Luxembourg: Publication Office of the European Union. 2016: 132-133.
31. Hudson B. J. F. Food antioxidants. [Internet]. Elsevier applied science, London and New
York; 1990 [žiūrėta 2019-02-15]. Prieiga per internetą:
https://books.google.lt/books?hl=en&lr=&id=Z8q5BgAAQBAJ&oi=fnd&pg=PR9&dq=antioxidants& ots=1GVfODnC2W&sig=YNM4G_6E46kwOFG26iv7ZHkUUxI&redir_esc=y#v=onepage&q=antiox idants&f=false
32. Hull P. Glucose Syrups: Technology and applications. Blackwell publishing; 2010. 33. Jaakola L, Hohtola A. Effect of latitude on flavonoid biosynthesis in plants. Plant, Cell and Environment; 2010. p. 1239–1247.
34. Judžentienė A, Kupčinskienė E. Chemical composition of Essential oils from Needles of
Pinus sylvestris L. Grown in Northern Lithuania. J. Essent. Oil Res.; 2008. p. 26–29.
35. Kizilarsan C, Sevg E. Ethnobotanical uses of genus Pinus L. (Pinaceae) in Turkey. Indian Journal of Traditional Knowledge, vol 12; 2013. p. 209-220.
36. Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health. Pharmacognosy Reviews: July-December Vol 4; 2010. p.118-126.
37. López-Nicolás M. J, Rodríguez-Bonilla P, García-Carmona F. Complexation of Pinosylvin, an Analogue of Resveratrol with High Antifungal and Antimicrobial Activity, by Different Types of Cyclodextrins. Journal of Agricultural and Food Chemistry; 2009. p. 10175-10180.
38. Maimoona1 A, Naeem I, Saddiqe1 Z, Ali N, Ahmed G, Shah I. Analysis of total flavonoids and phenolics in different fractions of bark and needle extracts of Pinus roxburghii and Pinus wallichiana. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5; 2011. p. 2724-2728.
39. Nascimento M. S., Santana A. L. B. D.,. Maranhão C. A, Oliveira L. S., Bieber L. Phenolic Extractives and Natural Resistance of Wood. InTechOpen; 2013. p. 349-370.
40. Oancea I. A, Oancea E, Ungureanu E. M, Stancius G, Chirilac E. Analytical characterisation of some buds of etheric oils used in cosmetics. Revue Roumaine de Chimie; 2017. p. 511-516.
42. Park S. Y, Jeonl H. M, Hwang J. H, Park R. M, Lee H. S, Sung Gu Kim G. S. Et al. Antioxidant activity and analysis of proanthocyanidins from pine (Pinus densiflora) needles. Nutrition Research and Practice (Nutr Res Pract). 2011;5(4): 281-287.
43. Semeniuc C, Rotar A, Stan L, Rodica Pop C, Socaci S, Mireşan V. Characterization of pine bud syrup and its effect on physicochemical and sensory properties of kefir. [Internet]. 2015.
[žiūrėta 2019-02-03]. Prieiga per internetą:
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19476337.2015.1085905
44. Sukri N. A. B. Effect of different types of solvent on extraction of phenolic compounds from Cosmos caudatus. [Masters thesis]; 2012. p.1-6.
45. USDA Natural Resources Conservation Service. Scots pine (Pinus sylvestris L.) classification. Prieiga per internetą: https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PISY.
