MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
IEVA GARBUZAITĖ
Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio
aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu
(H. pruinatum ir H. aviculariifolium) jonažolių žolėje
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. L. Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas:
Prof. dr., Ramunė Morkūnienė
Data
Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo
nustatymas spektrofotometriniu metodu
(H. pruinatum ir H. aviculariifolium) jonažolių žolėje
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. L. Ivanauskas
Data:
Recenzentas:
Parašas
Data
Darbą atliko:
Magistrantė
Ieva Garbuzaitė
Data
KAUNAS
,2018
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 8
SANTRUMPOS ... 10
1. ĮVADAS ... 11
Tyrimo objektai, tikslas ir uždaviniai. ... 12
Tyrimo objektai: ... 12
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
Jonažolės žolės charakteristika ir morfologija ... 13
Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson cheminė sudėtis... 15
Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson farmakologinės savybės ... 16
Jonažolės žolėje randamų fenolinių junginių bendra charakteristika ir struktūra ... 17
Jonažolės žolėje randamų flavonoidų bendra charakteristika ir struktūra ... 18
Antioksidacinio aktyvumo mechanizmas, antioksidantai ... 20
Fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai jonažolės žaliavoje ... 22
Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 25
3. TYRIMO METODIKA ... 27
Tyrimo objektas ... 27
Reagentai ... 27
Jonažolių žolės tiriamojo pavyzdžio paruošimas ... 28 Jonažolių žolės analizei taikomi spekrofotometriniai metodai ... 28 3.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas FolinCiocalteu metodu. ... 28 3.5.2 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto rutino ekvivalentu nustatymas, spektrofotometriniu metodu 29
3.5.3 Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu ... 30 Statistinė duomenų analizė ... 31 4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32 Atliktos spektrofotometrinės (FolinCiocalteu metodo , reakcijos su Aliuminio (III) chloridu ir CUPRAC) analizės rezultatai ... 32 4.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H.
aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu ... 33 4.1.2 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu ... 33 4.1.3 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu ... 34 4.1.4 Bendras flavonoidų nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu ... 35 4.1.5 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu ... 36 4.1.6 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu ... 37 4.1.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H.
aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu ... 38 4.1.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu ... 39 4.1.9 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu ... 40
Rezultatų apibendrinimas ... 41
5. IŠVADOS ... 43
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
SANTRAUKA
I. Garbuzaitės magistro darbas „Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu (H. pruinatum ir H. aviculariifolium) jonažolių žolėje“,
mokslinis vadovas Prof. L. Ivanauskas, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2018.
Raktiniai žodžiai: jonažolė, spekrofotomerija, fenoliniai junginiai, flavonoidai, antioksidacinis aktyvumas.
Tikslas: Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą naudojant spektrofotometrijos metodą (H. pruinatum ir H. aviculariifolium) jonažolių žolėje.
Uždaviniai: 1. Parinkti tinkamas ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių išgavimui iš jonažolių (H.
pruinatum ir H. aviculariifolium) žolės augalinės žaliavos. 2. Nustatyti H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų fenolinių junginių įvairavimą ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu. 3. Įvertinti H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų fenolinių junginių įvairavimą ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu. 4. Įvertinti azoto trąšų poveikį fenolinių junginių kaupimo kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumui H. pruinatum Boiss and Bal. žolėje.
Tyrimo metodika: H. pruinatum Boiss and Bal. H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų, žolės, žiedų ir stiebų ekstraktai ruošiami
susmulkintą žaliavą užpilant 99,9 proc. V/V metanolio ir ekstrahuojami ultragarso vonelėje 30 minučių kambario temperatūroje. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus apskaičiuojant remiantis galo rūgšties kalibraciniu grafiku mg/g. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas aliuminio (III) chloridu reakcija spektrofotometriniu metodu, rezultatai apskaičiuoti ir išreikšti rutino ekvivalentu mg/g. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu vario redukcijos antioksidantinės galios (CUPRAC) metodu, rezultatus apskaičiuojant remiantis trolokso kalibraciniu grafiku mg/g.
Rezultatai ir išvados: H. pruinatum stiebų, žiedų, lapų augalinėje žaliavoje daugiausiai fenolinių junginių nustatyta žieduose (80 GRE mg/g), o mažiausiai fenolinių junginių nustatyta lapuose (60 GRE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,000108). Lyginant H. pruinatum ir H. aviculariifolium lapų augalinę žaliavą daugiau fenolinių junginių nustatyta H. aviculariifolium lapuose (81,1 GRE mg/g). Taip pat nustatyta, kad H. pruinatum žolės trąša azotu, neturėjo įtakos fenolinių junginių kiekio įvairavime, nes jų koncentracija kito nepriklausomai nuo sunaudoto trąšų kiekio (158,4 GRE mg/g, 0 N kg/ha iki 134 GRE mg/g, 3 N kg/ha), tai didėjo (137,5 GRE mg/g, 6 N kg/ha iki 153,1 GRE mg/g, 9 N kg/ha).
kaupia lapai (449,9 RE mg/g), mažiausiai flavonoidų nustatyta stiebuose (212,6 RE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,000108). Lyginant H. pruinatum ir H. aviculariifolium lapų augalinę žaliavą daugiau flavonoidų nustatyta H. pruinatum lapuose (449,9 RE mg/g). Taip pat nustatyta, kad H.
pruinatum žolės trąša azotu neturi įtakos flavonoidų kiekio įvairavime, nes jų koncentracija tai mažėjo
(375,1 RE mg/g, (0 N kg/ha) iki 301,5 RE mg/g, (3 N kg/ha)), tai didėjo (321 RE mg/g, (6 N kg/ha) iki 339,9 RE mg/g, (9 N kg/ha)).
H. pruinatum didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo lapų augalinė žaliava (283,4
TE mg/g), o mažiausiu stiebai (106,8 TE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,000108). Taip pat lyginant H. pruinatum ir H. aviculariifolium lapų augalinę žaliavą, didesniu antioksidaciniu aktyvumu H. aviculariifolium (462,5 TE mg/g). Galiausiai įrodyta, kad H. pruinatum žolės trąša azotu neturi įtakos antioksidaciniam aktyvumui, nes jų koncentracija neproporcingai kito (31,7 TE mg/g, (0 N kg/ha) iki 25,15 TE mg/g, (3 N kg/ha)), ar (25 TE mg/g, (6 N kg/ha) iki 23,64 TE mg/g, (9 N kg/ha)).
SUMMARY
I. Garbuzaites master‘s thesis „Determination of phenolic compounds and antioxidant activity of H. pruinatum and H. aviculariifolium plants using spectrophotometric method“, scient manager Prof. L. Ivanauskas; Lithuanian University of Health Science, Medical Academy, Faculty of Farmacy, Department of Analytical and Toxicology Chemistry – Kaunas, 2018.
Keywords: Hypericum, spectrophotometry, phenolic compounds, flavonoids, antioxidant activity.
The object of the research: extracts of H. pruinatum Boiss and Bal. leaves, flowers, stems and
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) leaves. Spectrophotometric method was used for the quantitive determination of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity in the research.
The aim: Determine quantitative composition of phenolic comounds and antioxidant activity in H. pruinatum and H. aviculariifolium plats using spectrophotometry method.
The tasks: 1. Chosing appropriate conditions for the extraction of phenolic compounds and antioxidant activity from the raw materials. 2. Identify phenolics variation and antioxidant activity of
H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and
Bornm.) Robson leaves by spectrophotometric method. 3. Determine total phenolics variation and
antioxidant activity of H. pruinatum Boiss and Bal. stems, leaves and flowers by spectrophotometric method. 4. Analize effect of nitrogen fertilizer on the accumulation of phenolic compounds and antioxidant activity of H. pruinatum Boiss and Bal. plant.
Methodology: H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson plants were used for extract preparation. Plant
material was added to 99,9 % v/v methanol and extracted in ultrasonic bath for 30 minutes at room
temperature. Total amount of phenolic compounds were quantified by spectrophotometry using Folin – Ciocalteu reagent. Calculations of results are based on gallic acid calibration curve which is expressed in mg/g. Moreover, spectrophotometry was performed and total amount of flavonoids were quantified, results calculated and expressed in equivalent of rutin mg/g. Antioxidant activity was quantified by spectrophotometry using cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), calculation of results based on trolox calibration curve mg/g.
Results of the study: The highest content of phenolic compounds in H. pruinatum was found in flowers (80 GRE mg/g), while leaves had lowest phenolic content (60 GRE mg/g). This difference is statistically significant (p=0.000108). Compering H. pruinatum and H. aviculariifolium leaves, more
phenolic compounds were found in H. aviculariifolium (81,1 GRE mg/g) than H. pruinatum (48,8 GRE
mg/g . In addition, fertilizer had no effect on H. pruinatum content of phenolic compounds.
Constituents’ content was not directly related to the amount of consumed fertilizer (158,4 GRE mg/g (0 N kg/ha) – 134 GRE mg/g (3 N kg/ha)) and 137,5 GRE mg/g (6 N kg/ha) – 153,1 GRE mg/g (N 9 kg/ha)).
Considering flavonoids, H. pruinatum leaves had highest amount of flavonoids (449,9 RE mg/g) while stems had lowest quantity (212,6 RE mg/g). This difference is statistically significant (p=0.000108). Compering H. pruinatum and H. aviculariifolium leaves more flavonoids were found in H. pruinatum (449,9 RE mg/g) than H. aviculariifolium (276 RE mg/g). Also it was determined that fertilizer had no effect on H. pruinatum content of flavonoids and their quantity fluctuation (375,1 RE mg/g (0 N kg/ha) – 301,5 RE mg/g (3 N kg/ha)) and (321 RE mg/g (6 N kg/ha) – 339,9 RE mg/g (N 9 kg/ha)).
In aspect of H. pruinatum antioxidant activity highest activity had leaves (283,4 TE mg/g) while stems had lowest quantity (106,8 TE mg/g). This difference is statistically significant (p=0.000108). Compering H. pruinatum and H. aviculariifolium leaves, higher activity had H. aviculariifolium (462,5
TE mg/g) than H. pruinatum (283,4 TE mg/g). Finally, fertilizer did not enhanced nor inhibited
antioxidant activity of H. pruinatum plant (31,7 TE mg/g (0 N kg/ha) – 25,15 TE mg/g (3 N kg/ha)) and (25 TE mg/g (6 N kg/ha) – 23,64 TE mg/g (N 9 kg/ha)).
SANTRUMPOS
CUPRAC - (angl. cupric reducing antioxidant capacity) vario redukcijos antioksidantinė galia DC - dujų chromatografija
DNPH - 2,4 – dinitrofenilhidrazinas
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas ESC - efektyvioji skysčių chromatografija
FC - Folin-Ciocalteu reagentas GRE - galo rūgšties ekvivalentas
HAT, angl. hydrogen atom transfer – vandenilio atomo perdavimas Pvz - pavyzdžiui
RE - rutino ekvivalentas RNS – reaktyvi azoto forma
ROS - reaktyvaus deguonies formos RE - rutino ekvivalentas
SET, angl. single electron transfer – elektronų perdavimas TE – trolokso ekvivalentas
1. ĮVADAS
Jau kurį laiką visame pasaulyje vis didėja susidomėjimas vaistiniais augalais ir jų farmakologinėmis savybėmis. Vis plačiau yra tyrinėjamos vaistiniuose augaluose kaupiamos biologinės medžiagos, jų nustatymas, išgavimas ir pritaikymas preparatų gamyboje.
Fenoliniai junginiai – viena iš labiausiai tyrinėjamų ir nagrinėjamų junginių grupė, kuri pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Šiuolaikinės reaktyvaus deguonies formų (ROS) teorijos parodė, kad ROS atlieka dvigubą vaidmenį organizmuose. ROS yra ne tik stipriai susijusi su lipidų peroksidacija, bet taip pat yra susijusi su įvairių ligų, įskaitant senėjimą, mutagenezę, kancerogeniškumą, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto ir neurodogeneracijos vystymąsi.[1] Įrodyta, kad fenoliniai junginiai, tokie kaip: fenolinės rūgštys, flavonoidai, proantocianidinai ir antocianinai, atlieka svarbų vaidmenį, apsaugant žmogaus organizmą nuo laisvųjų radikalų poveikio.[2] Dėl šių priežasčių mokslininkai vis dažniau tiria augalines žaliavas, kurios pasižymi fenolinių junginių gausa. Jų kokybei ir kiekybei ištirti naudojami įvairūs analizės metodai – efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, plonasluoksnė chromatografija ir spektrofotometrija.
Šio darbo tyrimo objektas – dviejų jonažolės rūšių (Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ) ir (H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson) augalinė
žaliava. Abi rūšys priklauso jonažolinių (Hypericaceae) šeimai, augalai kaupia, flavanoidus, ksantonus, bioflavonoidus, antrachinono darinius (naftodiantronus), fenolines rūgštis, preniliuotus floroglicinolius, flavonoidus, eterinius aliejus ir kt.[3]. Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup.
and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson) auga natūraliose Turkijos augavietėse.
Jos yra fenolinių junginių šaltinis ir pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu [1]. Taip pat šios šeimos atstovai pasižymi antidepresiniu, antivirusiniu, priešvėžiniu, antibakteriniu poveikiu. Gali būti vartojami esant skrandžio ligoms – gastritui, skrandžio opai, Helicobacter pylori infekcijai gydyti, gali būti vartojama kaip prevencija Alzhaimerio ligai [4], [5], [6], [7]. Šios savybės yra svarbios kuriant preparatus iš vaistinės augalinės medžiagos. Iš Hypericum rūšies augalų gaminami homeopatiniai preparatai bei maisto papildai. Preparatų formos įvairios – kapsulės, arbatos.
Darbo naujumas ir aktualumas – Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H.
aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson augalinė žaliava Lietuvoje nebuvo analizuota, nes ši rūšis Lietuvoje neauga. Su šiomis rūšimis yra atlikta mažai tyrimų, nes Turkija pasižymi gausiu Jonažolių asortimentu 96 rūšys iš kurių 47 endeminės, ir tiesiog tiriant jas joms skirta mažai dėmesio. Todėl yra aktualu atlikti daugiau išsamesnių tyrimų su šiomis rūšimis, nustatyti kaupiamų aktyvių junginių kiekį ir palyginti su kitomis Hypericum. rūšimis. Gauta informacija gali būti panaudota kuriant ir gaminant vaistinius augalinius preparatus iš augalinės žaliavos. Yra svarbu tirti kuo daugiau naujų rūšių, stebėti augalų savybes, cheminę sudėtį ir pokyčius.
Tyrimo objektai, tikslas ir uždaviniai.
Tyrimo objektai:- Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir Hypericum aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson žolės augalinė žaliava
Tyrimo tikslas:
Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu (H.
pruinatum ir H. aviculariifolium) jonažolių žolėje. Tyrimo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamas ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių išgavimui iš jonažolių (H. pruinatum ir
H. aviculariifolium) žolės augalinės žaliavos.
2. Nustatyti H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų fenolinių junginių įvairavimą ir
antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu.
3. Įvertinti H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų fenolinių junginių įvairavimą ir antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu.
4. Įvertinti azoto trąšų poveikį fenolinių junginių kaupimo kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumui
2. LITERATŪROS APŽVALGA
Jonažolės žolės charakteristika ir morfologija
1 pav. Jonažolė (Hypericum)
Jonažolė (Hypericum) – yra geltonai žydintis, daugiametis žolinis augalais, kuris paplitęs Europoje, Vakarų Azijoje ir Šiaurės Afrikoje (1 pav). Pavadinimas Hypericum, manoma, kad yra kilęs iš graikų žodžio „hiper“ (virš) ir „eikon“ (vaizdas). Lietuviškas pavadinimas atsirado nuo žydėjimo laiko, nes šis vaistinis augalas pražysta Joninių metu, birželio 24 d. Hypericum gentis priklauso kliuzijinių (Clusiaceae) šeimai ir yra maždaug 370 rūšių.[8] Pasižymi antidepresiniu, antiuždegiminiu, antimikrobiniu, sutraukiančiu poveikiu, todėl buvo vartojamas viduriavimui stabdyti. Šis augalas plačiai naudojamas homeopatinių preparatų gamyboje [3] .
H. pruinatum Boiss and Bal. natūraliai augantis augalas plačiai paplitęs šiaurės rytinėje
Turkijoje, pietvakarinėje Gruzijoje. Stiebas 15-35 cm. aukščio, tiesus, į viršūnė gausiai šakotas. Lapai priešiniai, elipsės formos arba linijiški, bekočiai, lygiakraščiai, 1–3 cm ilgio, 0,5–1 cm pločio. Žiedynas piramidinis, cilindriškas. Žiedai geltonai auksiniai. Kapsulė 7-10 mm, kiaušialąstė (2 pav.) [9].
2 pav. Hypericum pruinatum [10]
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson yra dar vienas Turkijos floros Hypericum genties narys, kuris auga natūraliose, kai kuriose sausose akmeningose arba akmeningose ir kalkingose Turkijos zonose [11]. Steibas 15 – 32 cm aukščio, tiesus, šakotas nuo šaknų. Lapai tiesūs linijiški, suapvalinti, kiaušinio firmos 1–3 cm ilgio, 0,5–1 cm pločio. Žiedai 15 - 20 mm pločio, maži, kiaušinio formos, siaurai pailgi. Žiedlapiai auksiniai geltonos, kartais raudonos spalvos, 8 – 10 x 3 – 4 mm dydžio (3 pav.).
Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson cheminė sudėtis
Tyrimai parodė, kad šios jonažolės kaupia flavonolius (katechinus), naftodiantronus (hiperciną, pseudohipericiną), ksantonus, glikozidus, antrachinonus, floroglucinolius ir acilfloroglucinolius (hiperforiną, adhiperforiną), flavonoidus (rutiną, hiperozidą, kercitriną), flavonolio glikozidus, laktonus, fenolines rūgštis, lipidus, triterpenus, fenilpropanus, taninus ir eterinius aliejus [13].
Tyrimais įrodyta, jog Hypericum pruinatum Boiss and Bal. augalinėje žaliavoje daugiausiai kaupiamų junginių yra naftodiantronai (ypač hipercinas 0,36 mg/g ir pseudohipericinas 1,18 mg/g), floroglucinoliai ir acilfloroglucinoliai (ypač hiperforinas 0,05 mg/g), flavonoidai (ypač epikatechinas 1,32 mg/g , izokvercitrinas 3,74 mg/g, kvercetinas 6,75 mg/g, (+) - katechinas 1,06 mg/g, hiperozidas 6,07 mg/g, avikuliarinas 1,49 mg/g, kvercitrinas 3,42 mg/g, rutinas 0,89 – 0,92 mg/g ) biflavonai ( amentoflavonai 1,83 mg/g) fenolinės rūgštys (chlorogeno 0,67 – 20,21 mg/g).[13], [10], [14], [15], [16] (1 lentelė).
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson
augalinėje žaliavoje daugiausiai kaupiamų juninių yra naftodiantronai (ypač hipercinas 0,66 mg/g ir pseudohipericinas 0,58 mg/g), floroglucinoliai ir acilfloroglucinoliai (ypač hiperforinas 0,02 mg/g),fenolinės rūgštys (chlorogeno 1,45 – 4,19 mg/g, nechlorogeno 0,11 – 0,18 mg/g, kofeino 0,01 – 0,04 mg/g, 2,4 dihidroksibenzoinė rūgštis 0,01 – 0,05 mg/g), flavonoidai (ypač epikatechinas 0,16 – 0,79 mg/g , izokvercitrinas 0,12 – 0,47 mg/g, kvercetinas 0,02 – 0,09 mg/g, (+) - katechinas 0,11 mg/g, hiperozidas 0,29 – 0,57 mg/g, avikuliarinas 0,04 mg/g, kvercitrinas 2,03 – 7,63 mg/g) [1], [16], [17] (1 lentelė).
1 lentelė. Jonažolės žaliavoje vyraujantys junginiai
Junginio pavadinimas Struktūra
Pseuodohipericinas
Hiperforinas
Kvercetinas
Hiperozidas
Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson farmakologinės savybės
Po ilgų mokslinių tyrimų ir praktinių bandymų medikai įrodė, kad jonažolės ekstraktas yra efektyvus ir nekenksmingas vaistas blogai nuotaikai gydyti. Jonažolė pagerina nuotaiką, padidiną atidumą ir sutelktumą, sugrąžina darbingumą, išnyksta silpnumas, drovumas, galvos skausmai ir nemiga. Taip pat ji pasižymi daugybe kitų poveikių:
1) Antimikrobinis poveikis. Tyrimai parodė, kad jonažolės petroleterio ekstraktas pasižymi geriausiais rezultatais, rodančiais didelį antibakterinio aktyvumo spektrą gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų atžvilgiu. Priešingai, metanolinis ir chloroforminis ektraktai buvo mažiau veiksmingi, o vandens ekstraktas buvo visiškai neefektyvus. Metanoliniai ir petroleterio ekstraktai pasižymi didesniu antibakteriniu poveikiu prieš gram – teigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis) negu prieš gram – neigiamas (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebisiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) [18,19]. 2) Priešgrybelinis poveikis. Mikrobiologiniais tyrimais įrodytas jonažolės metanolinio ir heksano
ekstraktų slopinamasis poveikis prieš Candida albicans ir Penicillinum chrysogenum grybelį. Vandeniniame augalo ekstrakte esantys saponinai slopina mielių siūlinių gijų bei bioplėvelės formavimąsį [19], [20], [21].
3) Antidepresinis poveikis. Aiškus mechanizmas dar nėra žinomas, bet tyrimuose buvo bandyta ištirti galimus poveikius, lyginant su kitais antidepresantais, pvz: tricikliais. Hiperforinas, kuris randamas jonažolės alkoholiniuose ar anglies dvideginio ekstraktuose, manoma yra vienas pagrindinių komponentų, nulemiančių antidepresinį aktyvumą [22], [23], [24].
4) Antioksidancinis aktyvumas. Tyrimai rodo, kad stipriausiu aktyvumu pasižymi metanoliniai ar metanoliniai/acetoniniai ektraktai. Taip pat antioksidacinį aktyvumą lemia flavonoidai, kurie randami augalinėje žaliavoje [25], [26], [27].
5) Antinavikinis poveikis. Pastaraisiais metais yra padidėjęs susidomėjimas hypericinu kaip potencialiu klinikiniu priešvėžiniu agentu, nes keliuose tyrimuose buvo nustatyta galinga in vivo ir in vitro antineoplastinis veiksmingumas, po apšvitinimo. Jonažolių ekstraktai pasižymi citotoksiniu poveikiu prieš įvairias navikines ląsteles: stemplės vėžio, ankstyvo plaučių vėžio, šlapimo pūslės, smegenų, galvos ir kaklo, akių, kiaušidžių ir plaučių vėžio, o taip pat odos vėžio (bazinės ir plokščiosios karcinomos, Kapoši odos sarkomos ir odos T ląstelių limfomos). Aktyvus komponentas – hipericinas [28].
Jonažolės žolėje randamų fenolinių junginių bendra charakteristika ir
struktūra
Fenoliniai junginiai yra antriniai metabolitai, susidarantys iš pentozės fosfato, šikimato ir fenilpropanoidinių darinių. Šie junginiai yra viena iš labiausiai paplitusių fitocheminių grupių, turinčių didelę fiziologinę ir morfologinę reikšmę augaluose. Šie junginiai atlieka svarbų vaidmenį augalų augime ir reprodukcijoje, užtikrina apsaugą nuo patogenų, plėšrūnų, ligų sukelėjų, be to, prisideda prie
vaisių ir daržovių spalvos ir jutiminių savybių [29]. Naujausi tyrimai parodė, kad daugelis fenolinių junginių, gautų iš augalų, yra veiksmingesni antioksidantai in vitro nei vitaminai E arba C gauti iš vaisių, todėl manoma, kad gali reikšmingai prisidėti prie apsauginio poveikio ir in vivo [30]. Fenoliniai junginiai atlieka svarbų vaidmenį žalingų procesų neutralizavime žmogaus organizme. Jie tiesiogiai suriša žalingus O2 •-, HO• ,ROO• ir NO• radikalus, kurie yra aptinkami biologinėse sistemose [31]. Fenolinių junginių grupę sudaro: fenolinės rūgštys, flavonoidai, kumarinai, taninai, stilbenai [32].
Fenolinių junginių struktūra.
Fenoliniai junginiai, tai junginiai turintys vieną ar daugiau aromatinių žiedų su viena ar daugiau hidroksilo grupių. Juos kaupia augalai ir yra labiausiai paplitusių antrinių augalų metabolitų. Šiuo metu žinoma daugiau kaip 8000 fenolinių struktūrų, pradedant nuo paprastų molekulių, tokių kaip fenolinės rūgštys, iki labai polimerizuotų medžiagų, tokių kaip taninai [31]. Lentelėje nurodytos fenolinių junginių klasės (2 lentelė) [29].
2 lentelė. Fenolinių junginių klasės ir jų struktūra [29]
Paprastieji fenoliai, benzokvinonai C6
Hidroksibenzoinės rūgštys C6 – C1
Acetofenonai, fenilacetinės rūgštys C6 – C2 Hidroksicinamoninės rūgštys, fenilpropanoidai
(kumarinai, izokumarinai, chromonai, chromenai) C6 – C3 Naftochinonai C6 – C4 Ksantonai C6 – C1 – C6 Stilbenai, antrachinonai C6 – C2 – C6 Flavonoidai, izoflavonoidai C6 – C3 – C6 Lignanai, neolignanai (C6 – C3)₂ Biflavonoidai (C6 – C3 – C6)₂ Ligninai (C6 – C3)ₙ Kondensuoti taninai (C6 – C3 – C6)ₙ
Jonažolės žolėje randamų flavonoidų bendra charakteristika ir struktūra
Flavonoidai yra fenoliniai junginiai. Jie randami visose augalo dalyse kaip sudėtiniai įvairių komponentų mišiniai. Tai mažos molekulinės masės dariniai, susidedantys iš penkiolikos anglies atomų. Jų struktūra, susideda iš dviejų aromatinių žiedų A ir B, sujungtų trijų anglies atomų (C6-C3-C6konfigūracija), kurie dažniausiai yra susijungę į heterociklinį žiedą C, dėl šios savybės jie gali sugerti šviesą UV spektro dalyje, tai padeda juos identifikuoti [33]. Flavonoidus galima suskirstyti į skirtingus pogrupius, priklausomai nuo C žiedo variacijos, prie kurio yra prijungtas B žiedas, ir C žiedo neprisotinamumo ir oksidacijos laipsnio (4 pav.). Flavonoidai, kuriuose B žiedas yra susijungęs C žiedo 3 padėtyje, vadinami izoflavonais. Tie, kuriose B žiedas yra susijungęs 4 pozicijoje, vadinamos neoflavonoidais, o tie, kurių B žiedas yra susijungęs 2 padėtyje, gali būti dar labiau suskirstyti į kelis pogrupius, atsižvelgiant į C žiedo struktūrines ypatybes. Šie pogrupiai yra: flavonai, flavonoliai, flavanonai, flavanononai, flavanonoliai, flavanoliai arba katechinai, antocianai ir chalkonai [34,35].
Flavonoliai (kvercetinas, morinas, rutinas, kempferolis, miricetinas, izoramnetinas, kvercetrinas, miricitrinas, spirenosidas, galanginas, robininas, kemferidas, fisetinas, ramnetinas ir kt.). Flavanoliai (katechinas, epikatechinas, galokatechinas ir kt.).
Flavonai (flavonas, luteolinas, apigeninas, viteksinas, orientinas, izoviteksinas, izoorientinas, rpoifolinas, tangeretinas, baikaleinas, diosmetinas, diosminas. ir kt.).
Flavanonai (flavanonas, likviritigeninas, likviritinas, eriodiktinas, hesperidinas, naringinas, naringeninas, hesperidinas ir kt.)
Antocianidinai (pelargonidinas, cianidinas, delfinidinas, peoninas ir kt.). Izoflavonoidai (genisteinas, formononetinas, biochaninas ir kt.) [36].
3 lentelė. Flavonoidų junginių klasės ir jų struktūros [34]
Flavonoliai
Izoflavonai
Auronai
Antocianidai
4 pav. Flavonoidų struktūrinė formulė [35]
Antioksidacinio aktyvumo mechanizmas, antioksidantai
Antioksidantai – tai medžiagos, kurių maža koncentracija sulėtina baltymų, angliavandenių, lipidų ir DNR oksidaciją. Jie gali būti suskirstyti į tris pagrindines kategorijas (5 pav.) [37]:
1) Pirmosios eilės antioksidantai, kurių sudėtyje yra superoksido dismutazės (SOD), katalazės (CAT), glutationo reduktazės (GR) ir mineralų, tokių kaip Se, Cu, Zn ir kiti;
2) Antrosios linijos gynybos antioksidantai, kurie apima glutationą (GSH), vitaminą C, albuminą, vitaminą E, karotinoidus, flavonoidus ir kt.
3) Trečiosios eilės gynybai skirti antioksidantai, kurie apima kompleksinę fermentų grupę, skirtą pažeistos DNR, pažeistų baltymų, oksidintų lipidų ir peroksidų taisymui. Pavyzdžiai: lipazė, proteazė, DNR fermentai, transferazės, metionino sulfoksido reduktazė ir t.t.
Oksidacinis stresas yra disbalanso tarp reaktyvių deguonies rūšių (ROS) (4 lentelė) ir antioksidantų rezultatas. Šis procesas slopina arba išvis sustabdo daugybę ląstelių funkcijų ir sukelia įvairias patologines ligas, tokias kaip AIDS, senėjimas, artritas, astma, autoimuninės ligos, kancerogenizmas, širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimai, katarakta, diabetas, neurodegeneracinės ligos, Alzhaimerio liga, Parkinsono demencija ir kt. [38].
4 lentelė. Reaktyvios deguonies (ROS) formos[37]
Reaktyvios deguonies rūšys (ROS)
Radikailai
Superoksido radikalas O₂•
Hidroksilo radikalas OH•
Peroksilo radikalas ROO•
Neradikalai
Vandenilioperoksidas H₂O₂
Ozonas O₃
5 pav. Antioksidantų klasifikacija [37]
Veikimo mechanizmas paremtas vandenilio atomo perdavimo reakcijomis. Antioksidantai įvairiais veikimo mechanizmais neutralizuoja žalingas reaktyvias deguonies (ROS) ir reaktyvias azoto (RNS) formas. Antioksidantai žmogaus organizme sudaro sudėtingą daugiakomponentę gynybinę sistemą, kuri garantuoja ROS/RNS radikalų ir neradikalų sujungimą, modifikaciją, slopinimą arba ardymą. Antioksidantai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniais mechanizmais: vandenilio atomo perdavimo (HAT, angl. hydrogen atom transfer) ir elektronų perdavimo (SET, angl. single electron transfer) reakcijomis [36].
Fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai
jonažolės žaliavoje
Pirmiausia prieš norint nustatyti kokybinį ar kokybinį fenolinių junginių įvairavimą, reikia paruošti tinkamus augalinės žaliavos ekstraktus. Augalinė žaliava gali būti ekstrahuojama šviežia, šaldyta ar džiovinta. Ji yra susmulkinama arba sumalama malūnėliu, kad būtų padidintas paviršiaus plotas, taip ektrahentui/tirpikliui yra lengviau prasiskverbti ir taip greičiau vyksta ekstrakcija [39]. Kaip
išskirti fenolinius junginius yra daugybė metodikų, bet dažniausiai yra naudojamos reakcijos su organiniais arba neorganiniais tirpikliais. Ekstrakcijos greitis priklauso nuo laiko, temperatūros, tirpiklio parinkimo, medžiagos fizikocheminių savybių, pakartojimų skaičiaus ir kitų sąlygų. Vienas pirmiausių žingsnių yra tirpiklio/ekstrahento parinkimas [40]. Vieni dažniausiai naudojamų ir efektyviausių yra acetonas, alkoholiai ( metanolis, etanolis, propanolis), chloroformas, heksanas, vanduo [41,42].
Tradiciniai ekstrahavimo būdai yra gerai žinomi ir naudojami, tokie kaip Soksleto metodas, maceracija, perkoliacija, nuovirai, šaltas spaudimas ir kiti. Šių metodų privalumai: mažas ekstrahento kiekis, trumpas ekstrakcijos laikas. Laikui bėgant buvo atrasti ir ištobulinti nauji metodai, tokie kaip superkritinių skysčių ekstrakcija (SFE – supercritical fluid extraction), kietos fazės mikroekstrakcija (SPME – solid phase microextraction), mikrobangos (MAE – microwave-assisted extraction), ultragarsas (UAE - ultrasound-assisted extraction), superktitinio vandens ekstrakcija (SCWE – subcritical water extraction) ir aukšto hidrostatinio slėgio skysčių ekstrakcija (HHPP – high hydrostatic pressure processing). Šie nauji metodai dar labiau sutrumpina ekstrakcijos laiką, sumažina kenksmingų medžiagų išskyrimą ir yra paprastesni atlikti [43].
Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybiniam nustatymui yra naudojama daug įvairiausių metodų. Dažniausiai naudojami yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), aukšto slėgio plonasluoksnė chromatografija (HPTLC - high performance thin layer chromatography), dujų chromatografija (DC) ir žinoma įvairios kombinacijos su masių spektrometrija, spektrofotometriniai metodai ir kiti [43], [44].
Vieni dažniausiai naudojamų, paprasčiausių ir lengviausiai atliekamų metodų fenolinių junginių kiekiui nustatyti, tai kolorimetriniai. Viskas atliekama naudojant spektrofotometrą regimojoje šviesoje tik yra keičiami reagentai.
Reakcija su Folin- Ciocalteu regentu. Folin- Ciocalteu reagentą sudaro natrio molibdato, natrio volframato ir kitų reagentų mišinys. Reaguodamas su fenoliais, keičia savo spalvą nuo geltonos iki mėlynos, o absorbcija matuojama spektrofotometru, po 30 – 60 min. 750 nm šviesos bangos ilgyje. Ši reakcija paremta chemine redukcija ir vyksta šarminėje terpėje. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentą [45].
Berlyno mėlio susidarymo reakcija. Ši reakcija skirta greitai identifikuoti bendrą fenolinių junginių kiekį. Ši reakcija paremta polifenolinių junginių reakcija, kuri vyksta rūgštinėje terpėje su kalioheksocianoferoatu ir geležies (III) chloridu. Augalinėje žaliavoje esantys polifenoliai reaguoja su geležies cianido jonu ir oksiduojasi. Tuo tarpu geležies cianido jonas (𝐹𝑒(𝐶𝑁)63−) yra redukuojamas iki geležies cianido jonų (𝐹𝑒(𝐶𝑁)64−). Tada 𝐹𝑒(𝐶𝑁)64− reaguojant su trivalentės geležies jonu susidaro Berlyno mėlynojo kompleksas (𝐹𝑒4−[𝐹𝑒(𝐶𝑁)6]3). Absorbcija
matuojama prie 700nm bangos ilgio spektrofotometru. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal tanino rūgšties standartą [46].
Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti augalinėje žaliavoje yra taikoma reakcija su aliuminio (III) chloridu ir su 2,4 – dinitrofenilhidrazinu.
Reakcija su aliuminio (III) chloridu. Aliuminio (III) chlorido reakcija pagrįsta flavonoido ir aliuminio komplekso susidarymu esant rūgštinei terpei. 𝐴𝑙𝐶𝑙3 sudaro stabilius ryšius su C-4 keto grupe ir C-3 bei C-5 hidroksilo grupėmis, kurios randamos flavonoiduose. Absorbcija matuojama pasirinktame šviesos bangų ilgio intervale (404–510) nm, priklausomai kokia metodika yra taikoma. Flavonoidų koncentracija gali būti išreiškiama rutino, kvercetino , galo rūgšties ar kitos medžiagos ekvivalentu [47], [48].
Reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH). 2,4 – dinitrofenilhidrazinas yra naudojamas kokybiškai nustatyti ketonines arba aldehidines grupes. Reakcijos metu susidaro 2,4 – dinitrofenilhidrazonas. Teigiamą reakciją parodo susidariusios geltonos, oranžinės arba raudonos spalvos nuosėdos. Reakcija vyksta rūgštinėje terpėje, tirpalą kaitinant 50℃ temperatūroje 50 min. Po to tirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros ir jo matuojama absorbcija 495 nm šviesos bangos ilgyje. Flavonoidų kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas sudarant standartinę kreivę [49].
Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti augalinėje žaliavoje dažniausiai yra taikomas CUPRAC ar spektrofotometrinis DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) tyrimo metodas.
Spektrofotometrinis CUPRAC tyrimo metodas. Šio metodo esmė, tai dvivalenčio vario (Cu (II)) redukcija į vienvalentį (Cu (I)), kurią vykdo žaliavoje esantys reduktoriai (antioksidantai). CUPRAC tyrime naudojamas panašus junginys neokuproinas (2,9-dimetil-1,10-fenantrolinas). Reakcijai nereikia labai rūgštinės pH. Spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Šiuo metodu galima tirti didesnį kiekį antioksidantų, kurie yra polifenoliai, nes varis esantis laisvas ar komplekso sudėtyje turi žymiai mažesnį redokso potencialą nei geležis [50], [51].
Spektrofotometrinis DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) tyrimo metodas. DPPH radikalai yra vieni iš nedaugelio stabilių organinio azoto radikalų, kurie yra violetinės spalvos. Šie radikalai yra chromogeniniai. DPPH radikalų surišimo galia vertinama, kai absorbcija tampa stabili, matuojant absorbcijos sumažėjimą, esant (515 – 528) nm fiksuotam bangos ilgiui. Šis metodas yra paprastas, greitas, reikalingas tik spekrofotometras. Šį metodą suku pritaikyti nustatant karotinoidus, nes jie turi panašius spektrus su DPPH esant 515 nm bangos ilgiui [50].
Taip pat gali būti naudojama dujų chromatografija ar efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).
Dujų chromatografija naudojama tiek kiekybiniam, tiek kokybiniam fenolinių junginių idetinfikavimui. Tyrimai parodė, kad metodas efektyvesnis, kai atliekamas kartu su masių spektrometrija. Analizuojant dujų fazę, be bandinio izoliavimo, valymo ir paruošimo reikalingas cheminės modifikacijos žingsnis, dažnai vadinamas derivatizacija, kai hidroksilo grupės yra paverčiamos eteriais arba esteriais. [52].
Yra įvairių reagentų, naudojamų modifikuoti ir generuoti lakiuosius darinius. Diazometanas dažnai naudojamas metilesterių gamybai. Etilo ir metilo chloroformatas naudojamas etilo ir metilo esterių susidarymui. Dimetilo sulfoksidas su metil jodidu šarminėje terpėje yra dar viena metilo esterių susidarymo procedūra. Tačiau metilesteriai gali sukelti tam tikrą painiavą, nes jie natūraliai pasitaiko kai kuriose augalinėse medžiagose. Labiausiai paplitusi reagentų grupė – trialkilsililas. Jie generuojasi kovalentiškai sujungiant alkilinto pakaitinio silicio atomą su hidroksilo grupių deguonimi. Nors egzistuoja daugybė rinkoje parduodamų sililinimo reagentų, dažniausiai aptariami literatūroje, tiriant fenolines rūgštis, buvo N, O-bis- (trimetilsilil) acetamidas (BSA), N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoracetamidas (MSTFA ) ir N, O-bis- (trimetilsilil) -trifluoracematinas (BSTFA) [53].
Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojami lydytos silicio kapiliarų kolonėlės, kurių ilgis 25-30 m., skersmuo vyruoja nuo 0,25 iki 0,5 mm, o stacionarios fazės dalelių dydis yra apie 0,25 μm [53].
Efektyvioji skysčių cromatografija (ESC). Šis metodas taip pat naudojamas tiek kiekybiniam, tiek kokybiniam fenolinių junginių identifikavimui. Per pastaruosius dvidešimt metų fenolinių junginių išskyrimui ir apibūdinimui naudojamas populiarus analitinis metodas yra ESC su atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C18 analitinę kolonėlė (RP-C18) su prieškolone, 25℃ temperatūroje, o eliuentų sistema būna sudaryta iš polinių rūgščių organinių tirpiklių. [54]. Flavonidus galima atskirti, kiekybiškai įvertinti ir identifikuoti vienu metu, taikant ESC su ultravioleto (UV) šviesoje, masės ar branduolio magnetinio rezonanso (NMR) detektoriais. Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas ir kapiliarinei elektroforezei (CE). Viena ypatybė, kuri yra labai naudinga flavonoidų analizei, yra fenilo žiedo buvimas. Šis puikus chromoforius yra aktyvus UV šviesoje ir suteikia galimybę lengvai aptikti flavonoidus. Jų UV spinduliai yra itin informatyvūs, suteikiantys reikšmingą informaciją apie jų struktūrą [55], [56].
Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Apibendrinant Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson priklauso jonažolinių (Hypericaceae) šeimai. Kaupia daug įvairių, aktyvių junginių, bet pagrinde fenolinius junginius. Šie junginiai ir apsprendžia
jonažolės poveikį. Tai yra antimikrobinį, priešgrybelinį, antidepresinį, antioksidancinį, antinavikinį poveikį. Paprasčiausi būdai ir dažniausiai naudojami, nustatyti fenolinius junginius ir antioksidacinį aktyvumą yra FolinCiocalteu metodas – fenoliniams junginiams, reakcija su Aliuminio (III) chloridu – flavonoidams ir CUPRAC – antioksidaciniam aktyvumui.
3. TYRIMO METODIKA
Tyrimo objektas
H. pruinatum Boiss and Bal. žaliava, kuri buvo tręšta azotu, buvo gauta iš gamtos tyrimų centro
lauko bandymų stoties, vaistinių ir aromatinių augalų kolekcijos, Vilniuje.
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson ir H.
pruinatum Boiss and Bal. žaliava, kuri buvo auginta in vitro gauta iš labaratorijos, kuri įsikūrusi
Ondokuz Mayis universitete, Samsunas, Turkijoje.
Surinkta augalinė žaliava (žiedai, stiebai, lapai, žolė) buvo laikoma kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant žaliavą nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinta jonažolės žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25℃ temperatūroje, sausoje vietoje.
Reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”); Metanolis 99,9% (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Rutino reagentas (97,11%, “HWI ANALYTIK GMBH”); Etanolis 96% (Vilniaus degtinė);
Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV); Vario (II) chlorido dihidratas („Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija); Neokuproinas („Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija));
Amonio acetatas („Sigma-Aldrich“ (Belgija));
Naudota aparatūra
Ultragarso vonelė (WiseClean);
Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA);
Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija); Analitines svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
Jonažolių žolės tiriamojo pavyzdžio paruošimas
Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,05 g susmulkintų jonažolės žiedų, stiebų, žolės ir lapų. Ekstrakcija vykdoma 30 min. su 10 ml, 99,9% (v/v) metanoliu vibracinėje vonioje. Gautas ekstraktas filtruojamas per 25 mm skersmens, 0,22 mikrometrų porų dydžio švirkštų filtrus (Frisenette). Ekstraktai laikomi stikliniuose buteliukuose tolimesniems tyrimams. Kiekvieno mėginio buvo daromi 3 pavyzdžiai.
Jonažolių žolės analizei taikomi spekrofotometriniai metodai
3.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas FolinCiocalteu metodu.
Pirmiausia yra paruošiamas darbinis reagentas, 7% natrio karbonato tirpalas. Jis ruošiamas: 17,5 g medžiagos tirpinama 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris yra sumaišomas su 1 ml Folin – Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens. Po 5 minučių įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 minučių kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Praėjus duotam laikui spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Atliekami trys matavimų pakartojimai.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tik vietoje jonažolės augalinės žaliavos ekstrakto pilamas 1 ml metanolio.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami lygiai taip pat kaip tiriamieji, tik vietoje 1 ml ekstrakto pilami 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant 70% metanolinį tirpalą, buvo paruošti penkių skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 mg/ml (6 pav.).
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį.
y = 0,9068x + 0,0617; 𝑅2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
6 pav. Galo rūgšties kalibracinis grafikas bendrai fenolinių junginių koncentracijai nustatyti
3.5.2 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto rutino ekvivalentu nustatymas, spektrofotometriniu metodu
Pirmiausia yra paruošiamas darbinis reagentas, 4 ml, 96% etanolio, 0,2 ml, 33% ledinės acto rūgšties, 0,8 ml, 5% heksametilentetramino, 0,6 ml, 10% aliuminio chlorido, distiliuoto vandens ir 0,2 ml vaistinės augalinės žaliavo ekstrakto.. Heksametilentetraminas paruošiamas 5g medžiagos tirpinant 100 ml distiliuoto vandens, o 10% aliuminio chloridas ruošiamas 10 g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 100 ml distiliuoto vandens. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Praėjus duotam laikui spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 407 nm šviesos bangos ilgyje. Atliekami trys matavimų pakartojimai.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 99,9% (v/v) metanolis.
Etaloniniai rutino rūgšties tirpalai ruošiami lygiai taip pat kaip tiriamieji, tik vietoje 1 ml ekstrakto pilami 1 ml žinomų koncentracijų rutino rūgšties tirpalai. Taip paruošiami penkių skirtingų koncentracijų rutino rūgšties tirpalai: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml (7 pav.)
Gauti duomenys vertinami pagal rutino rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį. y = 0,9465x – 0,0950;
𝑅2 = 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
7pav. Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų koncentracijai nustatyti.
3.5.3 Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu
Tiriamųjų mėginių redukcinis aktyvumas tirtas spektrofotometriniu CUPRAC metodu. CUPRAC reagentas gaunamas iš vario druskos (CuCl2x2H2O), neokuproino ((CH3)2 C12 H6N2)) ir acetaninio buferio, kurio pH=7, juos sumaišant santykiu 1:1:1. Gerai sumaišytas ir paruoštas tirpalas buvo laikomas 1 valandą tamsoje, esant kambario temperatūrai. CuCl2 tirpalas buvo ruošiamas iš 0,17 g CuCl2x2H2O druskos, kuri buvo tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedžiama matavimo kolboje iki 100 ml. Neokuproino tirpalas buvo ruošiamas iš 0,1566 g neokuproino ištirpinant jį 70 proc. metanolyje ir skiedžiant matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml. Acetatinis buferis buvo ruošiamas iš 0,077 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinant jį vandenyje ir praskiedžiant vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml. Imama 3 ml reagento ir sumaišoma su 10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio.
Pasibaigus inkubaciniam laikotarpiui spektrofotometru matuojamas tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Atliekami trys matavimų pakartojimai.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 99,9% (v/v) metanolis.
Etaloniniai tralokso tirpalai ruošiami lygiai taip pat kaip tiriamieji, tik vietoje 1 ml ekstrakto pilami 1 ml žinomų koncentracijų tralokso tirpalai.
Gauti duomenys vertinami pagal tralokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį (8 pav.). y=0.3899x + 0.0908;
R2=0.99;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras antioksidacinis aktyvumas, išreikštas TE (tralokso ekvivalentu) mg/ml.
8 pav. Trolokso kalibracinė kreivė antioksidaciniam aktyvumui nustatyti
Statistinė duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojantis „Microsof Office Excel 2015” (Microsoft, JAV), „SPSS 20“ (IBM, JAV) programinėmis įrangomis. Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazę, statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0,05.
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tyrimams buvo naudojami H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson žydėjimo metu surinkti lapai, žiedai, stiebai ir žolė.
H. pruinatum Boiss and Bal. žaliava, kuri buvo tręšta azotu, buvo gauta iš gamtos tyrimo centro
lauko bandymų stoties, vaistinių ir aromatinių augalų kolekcijos, Vilniuje. H. aviculariifolium Jaup. and
Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson ir H. pruinatum Boiss and Bal. žaliavos,
kurios buvo augintos in vitro, surinktos laboratorijoje, kuri įsikūrusi Ondokuz Mayis universitetas,
Samsunas, Turkija.
Atliktos spektrofotometrinės (FolinCiocalteu metodo , reakcijos su Aliuminio
(III) chloridu ir CUPRAC) analizės rezultatai
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant metanolinius (99,9%) (v/v) H.
pruinatum ir H. aviculariifolium lapų, žolės, žiedų ir stiebų ekstraktus. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų įvairavimas augalinėje žaliavoje, taip pat antioksidacinis aktyvumas. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/g, bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu RE mg/g, o bendras antioksidacinis aktyvumas išreikšta tralokso ekvivalentu TE mg/g.
Tyrime analizuota in vitro kultūros auginimo laboratorijoje: Ondokuz Mayis universiteto,
Samsunas, Turkija surinkta Hypericum pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson augalinė žaliava ir H. pruinatum Boiss and Bal. žaliava, kuri buvo tręšta azotu, kuri gauta iš gamtos tyrimų centro lauko bandymų stoties, vaistinių ir
aromatinių augalų kolekcijos, Vilniuje. Buvo rinktos po tris kiekvienos žaliavos serijos, bandymai
pakartoti tris kartus (n=3). Gautų rezultatų tarpusavio reikšmingumas buvo statistiškai įvertintas. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo laikomas, kai p<0,05. Gauti rezultatai pateikiami 9 - 20 paveiksluose.
4.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H.
aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu
Pagal galo rūgšties ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis. Rezultatai vaizduojami 9 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didesnį fenolinių junginių kiekį kaupia
H. aviculariifolium (81,1 GRE mg/g). Mažiau fenolinių junginių nustatyta H. pruinatum (48,8 GRE
mg/g). Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.
9 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g) dviejų Hypericum rūšių lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
4.1.2 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu
Pagal galo rūgšties ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis. Rezultatai vaizduojami 10 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didžiausią fenolinių junginių kiekį kaupia H. pruinatum žiedai (80,0 GRE mg/g). Mažiausiai fenolinių junginių nustatyta stiebų augalinėje žaliavoje (23,2 GRE mg/g). Iš gautų duomenų nustatytas didelis skirtumas tarp tiriamų augalų dalių kaupiamų fenolinių junginių kiekio. Nustatyti skirtumai įvertinti, kaip statistiškai reikšmingais (p<0,05).
81,1
48,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Fen
ol
in
ių
ju
ng
in
ių
G
RE
m
g/
g
Fenolinių junginių C mg/g lapuose
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson H. pruinatum Boiss and Bal.
Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, kad žiedai kaip fenolinių junginių šaltinis yra naudingesnė augalinė žaliava negu stiebai ar lapai.
10 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g) H. pruinatum stiebuose, lapuose ir žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3; *p<0,05 statistiškai reikšmingas skirtumas
4.1.3 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su skirtingu azoto kiekiu (0, 3, 6, 9, 12 N kg/ha) tręštais H. pruinatum žolės ekstraktais gauti panašūs fenolinių junginių kiekiai. (11 pav.) Didelis skirtumas fenolinių junginių įvairavime, tarp azotu tręštos ir azotu netręštos žolės, neužfiksuotas. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) fenolinių junginių aptikta (158,4 GRE mg/g), o tręštoje didžiausiu kiekiu azotu (12 N kg/ha) žolėje fenolinių junginių aptikta (137,3 GRE mg/g) Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad trąša azotu neturi didelės reikšmės fenolinių junginių įvairavime H. pruinatum žolėje. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų p>0,05.
23,2
80
60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Stiebai
žiedai
lapai
Fen
ol
in
ių
ju
ng
in
ių
G
RE
m
g
/g
11 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g), H. pruinatum žolės ekstraktuose po trąšos azotu, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
4.1.4 Bendras flavonoidų nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu
Pagal rutino ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras flavonoidų kiekis. Rezultatai vaizduojami 12 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didesnį flavonoidų kiekį kaupia H. pruinatum (449,9 RE mg/g). Mažiau fenolinių junginių nustatyta H. aviculariifolium (276 RE mg/g). Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų p>0,05.
158,4
134
137,5
153,1
137,3
120 125 130 135 140 145 150 155 160 1650 N kg/ha 3 N kg/ha 6 N kg/ha 9 N kg/ha 12 N kg/ha
Fen
ol
in
ių
ju
ng
in
ių
G
RE
m
g/
g
Azoto trąšų koncentracija kg/ha
H. pruinatum Boiss and Bal. žolės fenolinių junginių C mg/g,
patręšus azoto trąšomis
12 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) dviejų Hypericum rūšių lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
4.1.5 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu
Pagal rutino ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras flavonoidų kiekis. Rezultatai vaizduojami 13 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didžiausią flavonoidų kiekį kaupia H. pruinatum lapai (449,9 RE mg/g). Mažiausiai flavonoidų nustatyta stiebų augalinėje žaliavoje (212,6 RE mg/g). Iš gautų duomenų nustatyta, kad žiedai ir stiebai kaupia panašų kiekį flavonoidų (žiedai 245,5 RE mg/g, o stiebai 212,6 RE mg/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi p<0,05. Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, kad lapai kaip flavonoidų šaltinis yra naudingesnė augalinė žaliava negu stiebai.
276
449,9
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Fl
av
on
oi
dų
RE
m
g/
g
Flavonoidų C mg/g lapuose
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson H. pruinatum Boiss and Bal.
13 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) H. pruinatum stiebuose, lapuose ir žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3; * p<0,05 statistiškai reikšmingas skirtumas
4.1.6 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su skirtingu azoto kiekiu (0, 3, 6, 9, 12 N kg/ha) tręštais H. pruinatum žolės ekstraktais gauti panašūs flavonoidų kiekiai. (14 pav.) Didelis skirtumas flavonoidų įvairavime, tarp azotu tręštos ir azotu netręštos žolės, neužfiksuotas. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) flavonoidų aptikta (375,1 RE mg/g), o tręštoje didžiausiu kiekiu azotu (12 N kg/ha) žolėje fenolinių junginių aptikta (270,1 RE mg/g) Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad trąša azotu neturi didelės reikšmės flavonoidų įvairavime H. pruinatum žolėje. Statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas p>0,05.
212,6
245,5
449,9
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Stiebai
žiedai
lapai
Fl
av
on
oi
dų
RE
m
g/
g
14 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas (mg/g), H. pruinatum žolės ekstraktuose po trąšos azotu, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
4.1.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. ir H.
aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu
Pagal tralokso ekvivalentą buvo apskaičiuotas antioksidacinis aktyvumas. Rezultatai vaizduojami 15 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi H. aviculariifolium (432,5 TE mg/g). Mažesnis aktyvumas nustatytas H. pruinatum (283,4 TE mg/g). Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų p>0,05.
375,1
301,5
321
339,9
270,1
0 50 100 150 200 250 300 350 4000 N kg/ha 3 N kg/ha 6 N kg/ha 9 N kg/ha 12 N kg/ha
Fl
av
on
oi
dų
RE
m
g/
g
Azoto trąšų koncentracijaH. pruinatum Boiss and Bal. žolės flavonoidų C mg/g, patręšus
azoto trąšomis
15 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas (mg/g) dviejų Hypericum rūšių lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
4.1.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. stiebų, lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu
Pagal tralokso ekvivalentą buvo nustatytas antioksidacinis aktyvumas. Rezultatai vaizduojami 16 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi H.
pruinatum lapai (283,4 TE mg/g). Silpniausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi stiebų augalinė
žaliava (106,8 TE mg/g). Iš gautų duomenų nustatyta, kad žiedai ir stiebai pasižymi beveik vienodu antioksidaciniu aktyvumu (žiedai 109,6 TE mg/g, o stiebai 106,8 TE mg/g). Nustatyti skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05). Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, kad lapai pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu ir yra naudingesnė žaliava negu stiebai ar žiedai.
462,5
283,4
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500A
n
ti
o
k
si
d
aci
n
io
ak
ty
v
u
m
o
T
E
m
g
/g
Lapų antioksidacinis aktyvumas C mg/g
H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson H. pruinatum Boiss and Bal.
16 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas (mg/g) H. pruinatum stiebuose, lapuose ir žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3;*p<0,05 statistiškai reikšmingas skirtumas
4.1.9 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas H. pruinatum Boiss and Bal. žolės ekstraktuose po trąšos azotu, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su skirtingu azoto kiekiu (0, 3, 6, 9, 12) kg/ha tręštais H. pruinatum žolės ekstraktais gauti panašūs antioksidacinio aktyvumo duomenys. (17 pav.) Didelis skirtumas antioksidacinio aktyvumo įvairavime, tarp azotu tręštos ir azotu netręštos žolės, neužfiksuotas. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) nustatytas antioksidacinis aktyvumas (31,7 TE mg/g), o tręštoje didžiausiu kiekiu azotu (12 N kg/ha) žolėje nustatytas (21 TE mg/g) pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad trąša azotu neturi didelės reikšmės antioksidacinio aktyvumo įvairavime H. pruinatum žolėje. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų p>0,05.
106,8
109,6
283,4
0 50 100 150 200 250 300Stiebai
žiedai
lapai
A
n
ti
o
k
si
d
aci
n
io
ak
ty
v
u
m
o
T
E
m
g
/g
17 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas (mg/g), H. pruinatum žolės ekstraktuose po trąšos azotu, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3
Rezultatų apibendrinimas
Atlikus spektrofotometrinius tyrimus ir gavus rezultatus nustatyta, kad H. aviculariifolium Jaup. and Spach subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų augalinė žaliava yra vertingensė fenoliniais junginias ir pasižymi stipresniu antioksidaciniu aktyvumu. Taip pat H. pruinatum Boiss and Bal. lapų augalinė žaliava pasižymi didesniu flavonoidų kiekiu. Atlikus visus tyrimus nustatyta, kad trąša azotu neturi jokios įtakos H. pruinatum Boiss and Bal. žaliavos sudėties įvairavimui. Taip pat nustatyta, kad fenolinius junginius stipriau kaupia žiedai, o flavonoidus ir stipresniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi H. pruinatum lapai.
Įvertinus H. pruinatum Boiss and Bal. ir H. aviculariifolium Jaup. and Spach
subsp. aviculariifolium (Freyn and Bornm.) Robson lapų augalinėje žaliavoje kaupiamą fenolinių
junginių kiekį nustatyta, kad daugiau fenolinių junginių kaupia H. aviculariifolium augalinė žaliava – 81,1 GRE mg/g, negu H. pruinatum – 48,8 GREmg/g, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp rūšių nėra, p>0,05. Palyginus H. pruinatum stiebų, lapų ir žiedų augalinėje žaliavoje kaupiamų fenolinių junginių kiekį, nustatyta, kad daugiausiai fenolinių junginių yra žieduose – 80 GRE mg/g, mažiausiai stiebuose – 23,2 GRE mg/g. Gauti rezultatai parodė statistiškai reikšmingus skirtumus p=0,000108. Įvertinus trąšos azotu poveikį fenolinių junginių įvairavimui H. pruinatum žolės ekstraktuose nebuvo nustatytas joks reikšmingas sudėties pokytis. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) fenolinių junginių aptikta (158,4 GRE mg/g), o tręštoje didžiausiu kiekiu azotu (12 N kg/ha) žolėje fenolinių junginių aptikta (137,3 GRE mg/g), statistiškai reikšmingų skirtumų nėra, p>0,05.
31,7
25,15
25
23,64
21
0
5
10
15
20
25
30
35
0 N kg/ha 3 N kg/ha 6 N kg/ha 9 N kg/ha 12 N kg/ha
A
n
ti
o
k
si
d
aci
n
is
akty
v
u
m
as
T
E
m
g
/g
Azoto trąšų koncentracijaH. pruinatum Boiss and Bal. žolės antioksidacinis aktyvumas C
mg/g, patręšus azoto trąšomis
Įvertinus H. pruinatum ir H. aviculariifolium lapuose kaupiamus flavonoidus nustatyta, kad daugiau flavonoidų kaupia H. pruinatum (449,9 RE mg/g), nei H. aviculariifolium – 276 RE mg/g tačiau
statistiškai reikšmingų skirtumų tarp rūšių nėra, p>0,05. Palyginus H. pruinatum stiebų, lapų ir žiedų augalinėje žaliavoje esančių flavonoidų kiekį, nustatyta, kad daugiausiai jų yra lapuose – 449,9 RE mg/g, mažiausiai stiebuose – 212,6 RE mg/g. Buvo nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai, p>0,05. Trąša azotu taip pat neparodė reikšmingų flavonoidų koncentracijos pokyčių H. pruinatum Boiss and Bal. žolėje. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) flavonoidų aptikta (375,1 RE mg/g), o tręštoje didžiausiu azotu kiekiu (12 N kg/ha) aptikta (270,1 RE mg/g), statistiškai reikšmingų skirtumų nėra, p>0,05.
Įvertinus H. pruinatum ir H. aviculariifolium lapų antioksidacinį nustatyta, kad didesniu aktyvumu pasižymi H. aviculariifolium (462,5 TE mg/g), nei H. pruinatum (283,4 TE mg/g) tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp rūšių nėra, p>0,05. Palyginus H. pruinatum stiebų, lapų ir žiedų ekstraktus nustatyta, kad antioksidaciniu aktyvumu daugiausiai pasižymi lapai– 283,4 TE mg/g, mažiausiai stiebuose – 106,8 TE mg/g. Nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai, p>0,05. Trąša azotu taip pat neparodė reikšmingų pokyčių antioksidaciniam H. pruinatum žolės aktyvumui. Azotu netręštoje žolėje (0 N kg/ha) aktyvumas buvo (31,7 TE mg/g), o tręštoje didžiausiu azotu kiekiu (12 N kg/ha) aptikta (21 TE mg/g), statistiškai reikšmingų skirtumų nėra, p>0,05.
Šiame darbe gautų ir pateiktų rezultatų negalime lyginti su kitų autorių atliktais moksliniais darbais, kadangi nebuvo rasta tyrimų atliktų tokiomis pačiomis sąlygomis, metodais bei šiomis jonažolių rūšimis.
