LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
AURITA BUTKEVIČIŪTĖ
NAMINIŲ OBELŲ (MALUS DOMESTICA BORKH.) VAISIŲ
TRITERPENINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Mindaugas Liaudanskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
NAMINIŲ OBELŲ (MALUS DOMESTICA BORKH.) VAISIŲ
TRITERPENINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Mindaugas Liaudanskas
Data
Recenzentas
Darbą atliko
Magistrantė
Aurita Butkevičiūtė
Data
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Obels (Malus Mill.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai požymiai ... 10
1.2. Obuolių fitocheminės sudėties tyrimai ... 11
1.3. Obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijos metodai ... 11
1.4. Triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės analizės metodai ... 16
1.5. Obuolių triterpeninių junginių biologinis poveikis ... 18
1.6. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai... 21
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 21
2.4. Tiriamųjų obuolių ėminių paruošimas ... 22
2.5. Tiriamųjų obuolių ėminių nuodžiūvio nustatymas ... 22
2.6. Tiriamųjų obuolių ištraukų paruošimas ... 23
2.7. Tyrimo metodai ... 23
2.8. Tyrimo duomenų analizė ... 23
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3.1. Obuolių ėminių triterpeninių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas ... 25
3.2. Obuolių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimai ... 27
3.3. Obuolių luobelių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimai ... 30
3.4. Obuolių minkštimų triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimai ... 33 3.5. Rezultatų apibendrinimas ... 35 4. IŠVADOS ... 35 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 39 7. PRIEDAI ... 46
SANTRAUKA
A. Butkevičiūtės magistro baigiamasis darbas / mokslinis vadovas dr. Mindaugas Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas – Naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių triterpeninių junginių sudėties
įvairavimo tyrimas.
Raktiniai žodžiai: Malus, obuoliai, triterpeniniai junginiai, ursolo rūgštis, efektyvioji skysčių
chromatografija, uždegimo slopinamasis poveikis.
Tyrimo objektas ir metodai: tirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių ('Aldas',
'Auksis', 'Connel Red', 'Ligol', 'Lodel', 'Rajka') obelų vaisių, jų luobelių ir minkštimų ėminiai. Kokybinė ir kiekinė triterpeninių junginių sudėties analizė atlikta taikant ESC metodą.
Darbo tikslas – nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų veislių naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti tinkamiausias obuolių ėminių triterpeninių junginių ekstrakcijos
sąlygas. 2. ESC metodu nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių ėminių triterpeninių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį. 3. Nustatyti triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimą Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių luobelių ėminiuose. 4. Nustatyti triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimą Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių minkštimų ėminiuose.
Tyrimo rezultatai ir išvados: atlikus eksperimentinius tyrimus sonifikacijos metodu, nustatytos
obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijos sąlygos. Didžiausias suminis identifikuotų triterpeninių junginių kiekis (2,38±0,01 mg/g, p < 0,05) nustatytas obuolių ėminius ekstrahavus 100 proc. (v/v) acetonu, ultragarso vonelėje 10 min. kambario temperatūroje. Šios ekstrakcijos sąlygos buvo pasirinktos tolesniems tyrimams vykdyti. ESC metodu obuolių ėminių ištraukose identifikuoti triterpeniniai junginiai: betulino rūgštis, korosolio rūgštis, oleanolo rūgštis ir ursolo rūgštis. ESC metodu didžiausias suminis triterpeninių junginių kiekis (8,327±0,391 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Lodel' veislės obuolių luobelių ėminiuose. Obuolių minkštimų ėminiuose identifikuotų ir kiekiškai įvertintų triterpeninių junginių variacijos koeficientai tarp skirtingų veislių buvo gerokai didesni nei obuolių ar obuolių luobelių ėminių. Labiausiai tarp tirtų veislių obuolių minkštimų ėminių varijavo korosolio rūgštis (CV=82 proc.).
SUMMARY
The title of the master thesis: Composition variability of triterpenic compounds in apple‘s trees
(Malus domestica Borkh.) fruits samples.
Key words: Malus, apples, triterpenic compounds, high performance liquid chromatography, anti–
inflammatory.
The object and methods of the research: the samples of whole apple, and apple‘s peel and flesh of
apple‘s cultivars 'Aldas', 'Auksis', 'Connel Red', 'Ligol', 'Lodel', and 'Rajka', which grow in Lithuanian climatic conditions. The qualitative and quantitative analysis of triterpenic compounds was performed by HPLC method.
The aim of the research: to determine qualitative and quantitative composition variability of
triterpenic compounds in apple‘s trees (Malus domestica Borkh.) fruits samples of cultivars grown in Lithuania.
The objectives of the research: 1. To select extraction conditions of triterpenic compounds from
apple fruit samples. 2. To determine of the quantitative and qualitative composition of triterpenic compounds in whole apple fruit samples of different cultivars grown under Lithuanian climate conditions. 3. To determine the quantitative and qualitative composition of triterpenic compounds in apple’s peel samples of different cultivars cultivated in Lithuanian climate conditions. 4. To determine the quantitative and qualitative composition of triterpenic compounds in apple’s flesh samples of different cultivars cultivated in Lithuanian climate conditions.
The results and conclusions of the research: in tested samples with sonification method was detected
extraction condition. The highest total amount of the identified triterpenic compounds (2,38±0,01 mg/g, p < 0,05) was detected when extracting apple fruit samples with 100% (v/v) acetone in an ultrasonic bath for 10 min. at room temperature. Based on the results, these conditions of extraction were selected for further analysis. In tested samples with HPLC method these triperpenic compounds were determined: betulinic, corrosolic, oleanolic and ursolic acids. In apple‘s peel samples the highest total amount of quantitated triterpenic compounds (8,327±0,391 mg/g, p < 0,05) was determined in samples of the 'Lodel' cultivar. To determine variation coefficient of qualitative and quantitative composition variability of triterpenic compounds in apple‘s flesh sample was highest than whole apple and apple‘s peel samples. In tested apple‘s flesh sample the most variability triterpenic compounds was corosolic acid (CV=82 ).
SANTRUMPOS
APD – aerozoliu pagrįstas detektorius;CV – variacijos koeficientas; COX–2 – ciklooksigenazė–2; DC – dujų chromatografija;
DNPC – didelio našumo priešsrovinė chromatografija; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FMD – fotodiodų matricos detektorius; GLUT–4 – gliukozės nešėjo sistema;
GM–KSF – granuliocitų makrofagų koloniją stimuliuojantis veiksnys; IL–1β – interleukinai–1;
IL–6 – interleukinai–6;
iNOS – azoto oksido sintetazė; LT – leukotrienai;
5–LPG – 5–lipooksigenazė;
NF–ĸB – branduolio transkripcijos veiksnys kapa B; PGE2 – prostaglandinai E2;
STAT3 – transkripcijos signalo perdavimo, aktyvinimo genas; TFA –12-O-tetradekanoilfarbol-13-acetatas;
TNF– – navikų nekrozės veiksnys alfa;
TXA2 – tromboksanas;
ĮVADAS
Propaguojamas sveikos gyvensenos būdas, siekis pagerinti sveikatos būklę ir apsisaugoti nuo lėtinių ligų, skatina žmones rinktis bei vartoti augalinės kilmės produktus, maisto papildus, augalinius vaistinius preparatus [19]. Vartoti augalinius preparatus rekomenduoja ir Pasaulio sveikatos organizacija, patvirtindama 2014–2023 m. tradicinės medicinos strategiją, kurios pagrindinis tikslas yra gerinti kokybiškų, saugių, veiksmingų augalinių produktų ir augalinių vaistinių preparatų prieinamumą gyventojams [86]. Kasmet didėjant natūralių augalinių produktų paklausai, svarbu vykdyti perspektyvių augalinių žaliavų paieškas, nustatyti jų cheminę sudėtį ir biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus, įvertinti praktinio panaudojimo galimybes [18].
Daugelis mokslininkų atkreipia dėmesį, kad įvairių susirgimų priežastis yra netinkama ar nepilnavertė mityba, todėl žmogaus maisto racione esančių vaisių ir daržovių cheminės sudėties tyrimams turi būti skiriamas itin didelis dėmesys siekiant užtikrinti jų saugumą ir kokybę. Vieni labiausiai vartojamų vaisių Lietuvoje ir pasaulyje yra obuoliai [38, 70]. 2016 m. duomenimis pasaulyje per metus užauginama net 89,33 mln. tonų obuolių, iš kurių 68,43 tūkst. tonų Lietuvoje [82]. Daugiausia obuolių apie 44,45 mln. tonų užauginama Kinijoje, 4,65 mln. tonų JAV ir 3,60 mln. tonų Lenkijoje [82].
Obuoliuose nustatomi įvairūs biologiškai aktyvūs junginiai: vitaminai, mikroelementai, makroelementai, organinės rūgštys, pektinai ir fenoliniai junginiai [12, 62]. Naujausi moksliniai tyrimai didelį dėmesį skiria obuolių pentacikliams triterpeniniams junginiams [6, 12]. Biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis atskirose obuolių dalyse yra skirtinga [62]. Tikslinga nustatyti identifikuotų triterpeninių junginių kiekio įvairavimą ne tik obuoliuose, bet ir atskirose jų dalyse: luobelėse, minkštimuose, nustatyti, kurioje obelų vaisių dalyje susikaupia didžiausias kiekis triterpeninių junginių. Daugelio mokslininkų rekomenduojama obuolius įtraukti į kasdieninę mitybą ir vartoti juos kaip funkcinį maistą, pritaikytą fiziologinėms organizmo funkcijoms gerinti [34, 78]. Triterpeniniai junginiai pasižymi plačiu biologinio poveikio spektru [29, 30, 58]. Aktualu šiuolaikiniais analizės metodais nustatyti obuolių triterpeninių junginių fitocheminės sudėties įvairavimą ir potencialų obuolių ištraukų panaudojimą sveikatinimo tikslams, įvairių ligų profilaktikai, funkcinio maisto gamybai.
Mokslinio darbo naujumas. Lietuvos klimato sąlygomis auginamų obuolių triterpeninių
junginių fitocheminės sudėties tyrimų nėra atlikta. Tikslinga ištirti Lietuvoje auginamų skirtingų veislių obelų vaisių, jų luobelių ir minkštimų triterpeninių junginių sudėties įvairavimą taikant šiuolaikinius analizės metodus. Atlikti tyrimai pateiks naujos informacijos apie Lietuvoje auginamų obuolių triterpeninių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, leis moksliniu požiūriu įvertinti galimybę panaudoti obuolius praktinės medicinos poreikiams, įvairių ligų prevencijai, individualių, specifiniu
biologiniu poveikiu pasižyminčių junginių išskyrimui, maisto papildų ir kitų produktų su obuolių ekstraktais, turtingais triterpeninių junginių, gamybai.
Darbo tikslas – nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų veislių naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų veislių naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamiausias obuolių ėminių triterpeninių junginių ekstrakcijos sąlygas.
2. ESC metodu nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių ėminių triterpeninių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį.
3. Nustatyti triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimą Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių luobelių ėminiuose.
4. Nustatyti triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimą Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių obuolių minkštimų ėminiuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Obels (Malus Mill.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai
požymiai
Obels (Malus Mill.) genties augalai plačiausiai paplitę Centrinėje Azijoje, Vidurio, Rytų ir Pietų Europoje bei Šiaurės Amerikoje [14, 76, 79]. Įvairių autorių duomenimis šią gentį sudaro nuo 35 iki 50 ar net 86 rūšių augalų [39, 78]. Naminės obels (Malus domestica Borkh.) kilmė tiksliai nėra žinoma, tačiau atlikti genomo tyrimai atskleidė, kad naminė obelis yra kilusi iš Centrinėje Azijoje augančios raudonosios obels (Malus sieversii Ledeb.) [14, 22, 79]. Lietuvoje natūraliai auga miškinė obelis (Malus sylvestris (L.) Mill.), o naminės obels (Malus domestica Borkh.) yra išvesta daug veislių [4, 6, 79].
1 pav. Naminės obels (Malus domestica Borkh.) vaismedis
Naminė obelis (Malus domestica Borkh.) priklauso erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimai ir yra daugiametis 4–15 metrų aukščio lapuotis medis [12, 18, 73]. Šakelės dažniausiai rusvai rudos spalvos. Šaknys pirmiausia auga į šonus, vėliau leidžiasi žemyn [3, 39]. Lapai žalios arba tamsiai žalios spalvos, simetriniai, ištisiniais kraštais, dantyti, lygiakraščiai arba smulkiai pjūkliški [39, 73]. Lapalakščio forma elipsiška, tinkliškas gyslotumas [39, 73]. Žiedai dvilyčiai, butonuose yra rausvi, o išsiskleidę balti ar baltai rausvi, susitelkę skėtiškose kekėse, taurėlapių ir vainiklapių po penkis [73]. Vaismedžiai žydi ir vaisius nokina priklausomai nuo obels rūšies ir veislės; yra išskiriamos anksti, vidutiniškai anksti ir vėlai žydinčios veislės [39]. Vaisiai yra įvairaus dydžio obuoliai – ovalios formos, kurių odelės spalva varijuoja nuo šviesiai gelsvos, geltonos, žalios, rausvos, raudonos ar mišrios spalvos [39]. Minkštimas sultingas, baltas, kreminis, gelsvas, žalsvas ar rausvas [73]. Naminių obelų vaisiai yra didesni, skersmuo gali siekti 7–8 cm, lyginant su miškinių obelų vaisiais, kurių skersmuo apie 6 cm. Kiekviename obuolyje yra 3–5 lizdai su 2–3 sėklomis lizde [73].
CH3
Mokslinėje literatūroje teigiama, kad yra išvesta apie 10000 skirtingų naminių obelų veislių, kurios tarpusavyje skiriasi derlingumu, atsparumu ligoms, šalnoms, vaisių dydžiu ir organoleptinėmis savybėmis [79].
1.2. Obuolių fitocheminės sudėties tyrimai
Obelų vaisių fitocheminė sudėtis priklauso nuo įvairių aplinkos veiksnių: obels veislės, klimato sąlygų, geografinės vietos, dirvos geocheminės sudėties, skynimo laiko ir laikymo sąlygų [38, 62, 75].
Malus genties augaluose aptinkami pentaciklę aglikonų struktūrą turintys triterpeniniai
junginiai, kuriems priskiriamos ursano, oleanano ir lupano klasės (2 pav.) [42, 52]. Obuolių ėminiuose identifikuoti ir ursano klasę sudaro: ursolo, 2-hidroksiursolo, korosolio, euskafo, pomolio, tormentino, anurkoino rūgštys, uvaolis ir -amirinas [40, 50, 75]. Oleanano klasei priklauso oleanolo, maslino, arjunino rūgštys, eritrodiolis ir β-amirinas [7, 50]. Lupano klasę sudaro betulino rūgštis, betulinolis ir lupeolis [30].
2 pav. Pagrindinių triterpeninių junginių klasių, nustatytų Malus genties augaluose, struktūrinės formulės [42, 50]
Pentacikliai triterpeniniai junginiai nustatyti aglikonų arba esterių formos obelų vaisiuose, jų minkštimuose, luobelėse, sėklose, lapų vaško sluoksnyje ir kamieno žievėje [26, 62, 75]. Triterpeninės rūgštys dažniausiai sudaro esterius su riebiosiomis: lauro, palmitino, stearino, oleino, linolo ir linoleno, rūgštimis [67]. Žmogaus organizme triterpeniniai junginiai geriausiai įsisisavinami aglikonų pavidalu,
a) Ursanas
R1= -CH3-amirinas
R1= -CH3OH uvaolis
R1= -COOH ursolo rūgštis
c) Oleananas
R1= -CH3 β-amirinas
R1= -CH3OH eritrodiolis
R1= -COOH, R3 = -H oleanolo rūgštis
R1= -COOH, R3= -OH maslino rūgštis
b) Lupanas
R1= -CH3 lupeolis
R1= -CH3OH betulinolis
R1= -COOH betulino rūgštis
R1 HO H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C CH3 R 1 HO H3C CH3 CH3 CH3 H2C R1 HO H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C
o esteriai praktiškai neįsisavinami [26]. Mokslininkai, siekdami padidinti triterpeninių junginių įsisavinimą organizme, formuoja miceles, liposomas, nanodaleles ir nanoemulsijas [26].
Didžiausias suminis triterpeninių junginių kiekis nustatytas obuolių luobelių vaško sluoksnyje ir gali sudaryti 50–90 proc. bendro biologiškai aktyvių junginių kiekio [42]. Ursolo rūgštis yra obuolių luobelėse vyraujantis pentaciklis triterpeninis junginys [42]. Jaunų obelų vaisiuose ursolo rūgštis sudaro 26–32 proc., o žydėjimo metu net iki 70 proc. bendro triterpeninių junginių kiekio [23, 32, 67]. Obuolių luobelių ėminiuose nemažas kiekis nustatomas ir oleanolo rūgšties, kurios kiekis gali sudaryti nuo 7 iki 15 proc. bendro triterpeninių junginių kiekio [23, 75]. Obuoliuose nustatytas nedidelis kiekis betulino rūgšties – nuo 1 mg/100 g iki 2,73 mg/100 g sausos žaliavos [12, 32]. Obuolių luobelių ėminiuose nustatyti ir kiti vandenyje mažai tirpūs biologiškai aktyvūs junginiai: alifatinės riebalų rūgštys (palmitino ir stearino rūgštys), -tokoferolis, β-sitosterolis, linolio, -linoleno, heksadekano ir oktadekano rūgštys [48, 75, 78]. Obuolių minkštimų ėminiuose nustatytas triterpeninių junginių kiekis yra gerokai mažesnis nei obuolių luobelių ėminiuose [12]. Obuolių minkštimų ėminiuose vyraujantys triterpeniniai junginiai yra ursolo rūgštis 1,43 g/100 g ir oleanolo rūgštis 0,28 g/100 g sausos žaliavos [42]. Obuolių išspaudose nustatyta: oleanolo rūgšties 0,16–1,0 g/100 g, ursolo rūgšties 0,80–4,80 g/100 g, korosolio rūgšties 0,51 g/100 g, maslino rūgšties 0,21 g/100 g sausos žaliavos ir nedidelis kiekis betulino rūgšties [40, 42].
Obuoliuose nustatyti flavonoidai sudaro didžiausią fenolinių junginių grupę [38]. Obuolių ėminiuose identifikuoti ir kiekiškai nustatyti flavan-3-oliai: (+)-katechinas 0,70–5,57 mg/100 g, (–)-epikatechinas 4,32–16,98 mg/100 g, procianidinas B1 11,48 mg/100 g [22, 46]. Nustatyti flavonoliai: kvercitrinas 6,29 mg/100 g, izoramnetino-3-O-gliukozidas 0,55 mg/100 g, izoramnetinas-3-O-rutinozidas 0,35 mg/100 g sausos žaliavos ir rutinas 1,09 mg/100 g sausos žaliavos [22, 46]. Obuolių ėminiuose identifikuotos fenolinės rūgštys: neochlorogeno, kriptochlorogeno, chlorogeno, kavos, galo, alyvų, trans-cinamono ir p-ferulo rūgštys [2, 22]. Chlorogeno rūgšties kiekis obuolių ėminiuose gali siekti net iki 16,67 mg/100 g sausos žaliavos [5, 46]. Dihidrochalkonų grupės junginiai: floretinas ir jo glikozidai floridzinas (floretin-2’-gliukozidas) ir floretin-2’-ksilogliukozidas dažniausiai nustatomi
Malus genties augaluose [15, 38]. Didžiausias kiekis nustatomas florizdino 5,28–9,13 mg/100 mg
sausos žaliavos [22, 46]. Obuoliuose (ypač luobelėse) nustatomi antocianinų grupės junginiai, dažniausiai cianidin-3-galaktozidas, rečiau cianidin-3-O-ksilozidas ir cianidin-3-arabinozidas [5, 15, 38].
Obuoliuose gausu vitaminų, mikroelementų ir makroelementų, kuriuos mažėjimo tvarka pagal kiekį galima išdėstyti šitaip: K>Mg>P >Ca> Na> Fe> Zn> Cu> Mn> Cr> Sr> Al [47, 62]. Obuoliuose nustatyti celiuliozės dariniai, pektinai, taninai, monosacharidai (gliukozė ir fruktozė) ir disacharidas sacharozė [12, 78]. Obuolių ėminiuose nustatomos įvairios organinės rūgštys: askorbo,
-ketoglutarato, citrinų, p-fumarato, obuolių, pieno, sukcinato ir vyno rūgštys [5]. Didžiausias kiekis obelų vaisių nustatytas obuolių rūgšties 919,06 mg/100 g, citrinų rūgšties 24,43 mg/100 g ir askorbo rūgšties 6,18 mg/100 g sausos žaliavos [62].
1.3. Obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijos metodai
Tinkamai parinkta ekstrakcijos metodika – itin svarbus žingsnis siekiant išskirti triterpeninius junginius iš augalinės žaliavos [13, 76]. Augalinėje žaliavoje yra skirtingo poliškumo junginiai, todėl tikslinga parinkti tinkamos koncentracijos, poliškumo ekstrahentą, ekstrakcijos temperatūrą ir trukmę [20, 64]. Remiantis mokslinių straipsnių duomenimis, pentaciklių triterpeninių junginių išskyrimui iš augalinės žaliavos dažniausiai naudojami nepoliniai tirpikliai: chlorinti angliavandeniliai (chloroformas, dichlormetanas), įvairių koncentracijų alkoholiai (metanolis, etanolis), dietileteris, n-heksanas ir acetonas [64, 72, 76].
Biologiškai aktyviems junginiams iš žaliavų išskirti, dažniausiai naudojami šie metodai: ekstrakcija organiniais tirpikliais (maceracija, perkoliacija), ekstrakcija Soksleto aparate, ultragarsu (sonifikacija), mikrobangomis, suslėgtais skysčiais, superkritiniais skysčiais, fermentine ekstrakcija ir kitais ekstrakcijos metodais [13, 31, 64]. Ilga ekstrakcijos trukmė, aukšta temperatūra gali suardyti triterpeninius junginius, todėl svarbu parinkti tinkamą ekstrakcijos metodiką, siekiant, kad šis procesas vyktų kuo trumpiau ir kuo žemesnėje temperatūroje [76].
Maceracija – paprastas, dažniausiai taikomas ekstrakcijos metodas [13]. Metodas pasižymi mažu efektyvumu, procesas trunka ilgai (trumpiausiai 72 val.), nėra ekonomiškas [13, 31].
Lesellier ir kt. nustatė, kad ekstrahuojant maceracijos metodu užšaldytus iki -80o C temperatūros obuolių išspaudų ėminius, ekstrakcijos efektyvumas padidėja, o trukmė sumažėja viena valanda [50]. Tostes ir kt. nustatė, kad ekstrahuojant obuolių luobelių ėminius maceracijos metodu, proceso efektyvumas padidėja iki 66 proc., naudojant nepolinius tirpiklius n–heksaną ir chloroformą [77]. Frighetto ir kt. siekė nustatyti geriausią ekstrahentą obuolių luobelių triterpeniniams junginiams išskirti. Mokslininkai pasirinko naudoti ekstrahentus: acetoną, etanolį, dichlormetanolį, dichloretanolį ir n-heksaną [23]. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad didžiausias triterpeninių junginių kiekis nustatytas ekstrahuojant acetonu ir etanoliu (96 proc., v/v), mažesnis kiekis dichlormetanoliu ir dichloretanoliu, mažiausias n–heksanu [23].
Šiuolaikiniuose moksliniuose tyrimuose tradicinis maceracijos metodas yra retai taikomas, dažniau naudojamos įvairios maceracijos modifikacijos ar kiti pažangesni ekstrakcijos metodai [13].
Ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija) – vienas efektyviausių ekstrakcijos metodų [13]. Sonifikacijos metodas, pagrįstas tuo, kad ekstahentu sklindančios ultragarso bangos sukelia kavitacijos
reiškinį – oro burbuliukų susiformavimą ir greitą jų sproginėjimą, kuris pažeidžia ląstelių sieneles, taip palengvėja ekstrahento patekimas į ląstelių vidų, todėl greitėja biologiškai aktyvių junginių tirpimas ekstrahente ir jų pasiskirstymas jame [49]. Vienas pagrindinių ekstrakcijos ultragarsu privalumų metodą galima taikyti aukštai temperatūrai neatspariems junginiams išskirti, ekstrakcijos trukmė pakankamai trumpa, siekia 10–120 minučių, todėl sumažėja tikimybė suirti augalinės žaliavos biologiškai aktyviems junginiams [43].
Fan ir kt., pritaikę sonifikacijos metodą, ekstrahavo obuolių išspaudas metanoliu [20]. Mokslininkai nurodo, kad didžiausias suminis triterpeninių junginių kiekis nustatytas esant ekstrakcijos parametrams: 40 kHz ultragarso dažnis, 300 W galia, 50oC temperatūra, tačiau esant šioms sąlygoms, ekstrakcija trunka gana ilgai – iki 90 minučių [20]. Tostes ir kt. atliko obuolių ėminių ekstrakciją ultragarso vonelėje kambario temperatūroje esant 25 kHz dažniui – naudoti ekstrahentai etanolis ir metanolis. Rezultatai atskleidė, kad esant šioms ekstrakcijos sąlygoms, nustatytas didžiausias suminis triterpeninių junginių kiekis, o triterpeniniai junginiai išekstrahuoti greičiau nei per 15 minučių [77].
Reikėtų pažymėti tai, kad ultragarso vonelei pasiekus 20 kHz dažnį yra tikimybė pradėti formuotis laisviesiems radikalams, todėl šį reiškinį galima laikyti vienu svarbesniu sonifikacijos metodo trūkumų [31, 76]. Susidarę laisvieji radikalai gali pažeisti biologines sistemas, taip skatindami įvairių lėtinių ligų bei uždegiminių procesų vystymąsi [69].
Atliekant ekstrakciją mikrobangomis, pagerėja triterpeninių junginių ekstrakcija iš augalinių žaliavų ir jų pasiskirstymas ekstrahente, nes nejonizuotos mikrobangos skatina molekulių judėjimą [13]. Mokslinėje literatūroje aprašyta, kad didžiausias biologiškai aktyvių junginių kiekis nustatomas, kai mikrobangų dažnis yra 0,915 arba 2,45 GHz [21, 49]. Pagrindinis ekstrakcijos mikrobangomis metodo privalumas biologiškai aktyvūs junginiai išekstrahuojami per 10–60 min. sunaudojant 20–50 ml ekstahento kiekį [13, 43, 49].
Grigorasa ir kt. atliko obuolių išspaudų ekstrakciją mikrobangomis [28]. Tyrimo metu naudotas ekstrahentas – etanolis [28]. Mokslininkai ekstrakciją mikrobangomis apibūdino kaip labai tinkamą metodą triterpeniniams junginiams išskirti dėl trumpos ekstrakcijos trukmės, kuri siekia mažiau nei 30 minučių [28].
Remiantis aptartais rezultatais, ekstrakcija mikrobangomis gali būti taikoma obuolių ėminių ekstrakcijai. Būtų tikslinga taikyti šį ektrakcijos metodą dėl našaus ir greito biologiškai aktyvių junginių išskyrimo, tačiau vienas didžiausių šio metodo trūkumų aukšta 80–150oC temperatūra, kuri gali suardyti biologiškai aktyvius junginius, įskaitant ir pentaciklius triterpeninius junginius [43].
Superkritinių skysčių ekstrakcija – vienas pažangiausių ekstrakcijos metodų, kuris paremtas biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija suskystintomis dujomis, pavyzdžiui, anglies dioksidu [31]. Naudojant anglies dioksidą, kaip superkritinį tirpiklį, galima išskirti aukštai temperatūrai jautrias
medžiagas [43]. Grynas anglies dioksidas efektyviai ekstrahuoja nepolinius ir mažai polinius junginius, tačiau yra blogas tirpiklis poliniams junginiams [31, 43]. Vienas iš metodo privalumų ekstrakcija gali būti atliekama žemoje 40oC temperatūroje, todėl išvengiama triterpeninių junginių suirimo [43]. Anglies dioksidą kaip ekstrahentą saugu naudoti, nes šios dujos nėra nuodingos, o ekstraktuose tirpiklio likučių nelieka, nes lakus ekstrahentas išgaruoja [31]. Kitas svarbus metodo privalumas keičiant slėgį ir temperatūrą, galima vykdyti atrankią ekstrakciją ir gauti išgrynintus ekstraktus [31, 43].
Lesellier ir kt. pentaciklius triterpeninius junginius išskyrė naudojant anglies dioksido ir metanolio mišinį (95:5, v/v) kaip ekstrahentą [50]. Tyrimams parinktos ir tarpusavyje lygintos šios ekstrakcijos sąlygos: 15, 20, 25oC temperatūra ir 12, 15, 18 mPa slėgis [50]. Taikant superkritinių skysčių ekstrakciją, didžiausias suminis pentaciklių triterpeninių junginių kiekis išekstrahuotas esant 20oC temperatūrai ir 12 mPa slėgiui [50].
Ekstrakcija superkritiniais skysčiais yra perspektyvus metodas, leidžiantis išvengti papildomų ekstraktų valymo etapų, o keičiant metodiką, galima išskirti norimas biologiškai aktyvių junginių grupes, tačiau vienas didžiausių metodo trūkumų – reikalinga brangi aparatūra, kuri sunkiai prieinama rutininėje analizėje ir metodas nėra tinkamas visiems biologiškai aktyviems junginiams išskirti [31, 43].
Ekstrakcija suslėgtais skysčiais – vienas naujesnių ekstrakcijos metodų [43]. Augalinė žaliava ekstrahuojama tirpikliais aukšto slėgio aplinkoje, tirpiklį išlaikant skystoje agregatinėje būsenoje. Pagrindinis parametras, kurį reikia parinkti, yra slėgis. Jis dažniausiai varijuoja 1–10 mPa intervale [43]. Tinkamo slėgio parinkimas svarbus palaikyti ekstrahentą skystoje agregatinėje būsenoje [43].
Jemmali ir kt. atliko liofilizuotų obuolių išspaudų ekstrakciją suslėgtais skysčiais. Tyrimo metu obuolių išspaudų ėminiai sumaišyti su nuosėdine uoliena diatomitu ir mišinys ekstrahuotas chloroformu. Ekstrakcijos metodo parametrai: 100 barų slėgis ir 40oC temperatūra [40]. Pentacikliai triterpeniniai junginiai išekstrahuoti per 5 minutes [40]. Gauti tyrimo rezultatai atskleidė, kad vykdant obuolių išspaudų ekstrakciją suslėgtais skysčiais, išskirti triterpeniniai junginiai maslino ir korosolio rūgštys, kurios maceracijos metodu retai ar visai neišekstrahuojamos [40].
Ekstrakcija suslėgtais skysčiais puikus metodas, kuris suteikia galimybę įvykdyti greitą ir efektyvią triterpeninių junginių ekstrakciją iš augalinės kilmės žaliavų, tačiau aparatūra brangi ir retai prieinama rutininėje analizėje [43].
Apibendrinant aptartus ekstrakcijos metodus, visi paminėti metodai gali būti potencialiai taikomi triterpeninių junginių ekstrakcijai, tačiau dažniausiai obuolių triterpeniniams junginiams išskirti yra naudojamas sonifikacijos metodas. Labai svarbu pasirinkti tinkamą ekstrakcijos metodą, ekstrahentą bei ekstrakcijos trukmę siekiant kuo efektyviau ir ekonomiškiau išekstrahuoti didžiausią kiekį triterpeninių junginių.
1.4. Triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės analizės metodai
Augalinė žaliava, vartojama medicinos praktikoje, turi atitikti jai keliamus reikalavimus, todėl yra atliekami fitocheminiai tyrimai, siekiant nustatyti žaliavų cheminę sudėtį ir jos įvairavimą skirtingose augalo dalyse [56].
Mokslinėje literatūroje aprašyta nemažai triterpeninių junginių analizės metodų, kuriuos galima sugrupuoti į du pagrindinius: chromatografinius ir elektrocheminius metodus [27, 50, 59]. Triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymui dažniausiai taikomi chromatografiniai metodai yra efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija ir plonasluoksnė chromatografija, susieta su tandemine masių spektrometrija [50, 59]. Rečiau taikomas elektrocheminis analizės metodas – kapiliarinė elektroforezė [27, 50, 51]. ESC metodo populiarumą lemia didelis efektyvumas, jautrumas, rezultatų atkuriamumas ir lengvas pritaikomumas įvairių biologiškai aktyvių junginių analizei [10, 54, 60].
Skirtingų mokslininkų pateiktas ESC metodikas (1 lentelė) sieja keli bendri panašumai: taikomas izokratinis eluavimas, visose aprašytose metodikose naudotos kolonėlės, kurių įkrovos dalelių dydis yra 5 µm. Mokslininkai triterpeninių junginių kokybinei ir kiekinei sudėčiai nustatyti pritaikė atvirkščių fazių ESC (1 lentelė). ESC metodo ypatumas – nejudančios fazės silikagelio silanolio grupės modikuotos (C8) oktano ir (C18) oktadekano grupėmis [51, 56]. Plante ir kt. bandė pagerinti analičių chromatografinių smailių atskyrimą naudojant triakontano (C30) grupes [66]. Apžvelgtose ESC metodikose dažniausiai naudojamos kolonėlės su C18 dalelių įkrova (1 lentelė).
Judrios fazės sudėtis ir naudojamas detektorius tai pagrindiniai triterpeninių junginių nustatymo ESC metodikų parametrai, kurie buvo keičiami mokslininkų (1 lentelė). Obuolių ėminių triterpeninių junginių analizėje dažniausiai naudojami šie eliuentai: acetonitrilas, metanolis ir vanduo, kurie gali būti parūgštinti acto, skruzdžių bei fosfato rūgštimis [33, 66, 77]. Dalyje literatūroje aprašytų ESC metodikų, triterpeninių junginių skirstymo trukmė yra santykinai ilga 25–30 min., tai gali padidinti analizės laiko sąnaudas ir kaštus [81].
Analičių detekcijai naudojami: ultravioletinės bei ultravioletinės ir regimosios šviesos, fotodiodų matricos, masių spektrometrinis detektoriai, kiek rečiau garinantysis šviesos išbarstymo, fluorescencinis ir aerozoliu pagrįstas detektoriai [51, 66]. Mokslinėje praktikoje taikomos įvairios masių spektrometrijos modifikacijos, pavyzdžiui, fotodiodų matricos detektorius, veikiantis kartu su masių spektrometru vienoje sistemoje [51, 56, 67]. Taikant šį detektorių derinį, triterpeniniai junginiai aptinkami, esant 210 nm bangos ilgiui, žymiai efektyviau, nei naudojant ultravioletinės ar ultravioletinės ir regimosios šviesos detektorių [56].
1 lentelė. Triterpeninių junginių fitocheminės sudėties nustatymo ESC metodikos
Chromatografinės
kolonėlės parametrai Judri fazė
Detek– torius Tėkmės greitis Šaltinis Phenomenex Luna C18, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm dalelių dydis A: metanolis
B: vanduo ir fosfato rūgštis FMD 1 ml/min [6, 8] Pursuit XRs C18,
150 mm x 4,6 mm, 5µm dalelių dydis
A: metanolis
B: vanduo ir skruzdžių rūgštis FMD 1 ml/min [28] XTera MS C18,
250 mm x 22 mm, 5µm dalelių dydis
A: metanolis
B: vanduo ir acto rūgštis UV/VIS 1 ml/min [33] Acclaim C30,
250 mm x 4,6 mm, 5µm dalelių dydis
A: vandeninis amonio acetatas
B: acetonitrilas ir metanolis APD 1 ml/min [66] Symmetry Shield RP18,
250 mm x 4,6 mm, 5µm dalelių dydis
A: acetonitrilas
B: vanduo ir fosfato rūgštis FMD 0,6 ml/min [77] Hypersil BDS C18,
200 mm x 4,6 mm, 5µm dalelių dydis
A: acetonitrilas
B: vanduo ir fosfato rūgštis FMD 1 ml/min [20]
Mokslinėje literatūroje plačiai aprašytas ir kitas triterpeninių junginių analizei taikomas chromatografijos metodas – dujų chromatografija. Šio metodo privalumai: analizė atliekama greitai, metodas efektyvus, pasižymi didele skiriamąja geba, jautrus, naudojamas gana mažas analizuojamųjų ėminių kiekis [55]. Pritaikius tinkamą detektorių, pavyzdžiui, masių spektrometrinį, analitės nustatomos labai tiksliai [55, 57].
Jemmali ir kt. obuolių išspaudų pentaciklių triterpeninių junginių nustatymui pritaikė DC, detekcijai naudoti: liepsnos jonizacinis ir masių spektrometrinis detektoriai. Prieš atliekant analizę, ėminiai derivatizuoti prijungiant atitinkamas grupes prie pentaciklių triterpeninių junginių hidroksilinių ir karboksilinių grupių [40]. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad triterpeniniai junginiai buvo efektyviai, selektyviai išskirstyti ir nustatyti [40]. Dujų chomatografijos metodas yra tinkamas obuolių triterpeniniams junginiams identifikuoti ir kiekiškai nustatyti [40].
Frighetto ir kt. pirmą kartą pritaikė didelio našumo priešsrovinę chromatografiją, ursolo rūgščiai išskirti iš obuolių luobelių ėminių. Pirmiausia nevalytas obuolių luobelių ekstraktas išgrynintas DNPC metodu, po to ursolo rūgšties tapatybė patvirtinta taikant plonasluoksnę chromatografiją su optiniu densitometru [23]. Išskirta ursolo rūgštis nustatyta DC metodu naudojant skirtingus detektorius: masių spektrometrinį, branduolių magnetinio rezonanso ir infraraudonųjų
spindulių [23]. DNPC metodas galėtų būti potencialus analizės metodas siekiant išskirti atskiriems obuolių triterpeniniams junginiams ir taip išvengti papildomų ekstraktų valymo etapų [23].
Galima teigti, kad kalbant apie instrumentinės analizės metodus, naudojamus triterpeninių junginių kokybinei ir kiekinei sudėčiai nustatyti, pirmo pasirinkimo metodu išlieka efektyvioji skysčių chromatografija. ESC metodas gali būti pritaikytas termiškai nestabilių ir nelakiųjų junginių tyrimui, skirtingai nei dujų chromatografija [28, 36]. Tai aktualu tiriant nelakiuosius junginius ir ypač atliekant naujų junginių paiešką.
1.5. Obuolių triterpeninių junginių biologinis poveikis
Malus genties augaluose nustatyti pentacikliai triterpeniniai junginiai pasižymi plataus
spektro biologiniu poveikiu [16]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad šį poveikį lemia heterocikliniame žiede esančios hidroksilo (C–3 padėtis) ir karboksilo (C–17 padėtis) grupės [72]. Pentacikliai triterpeniniai junginiai mažina mažo tankio lipoproteinų, cholesterolio, gliukozės koncentraciją kraujyje, aterosklerozinių plokštelių formavimąsi kraujagyslių vidiniame paviršiuje, slopina uždegimą, apsaugo hepatocitus ir gleivines, pasižymi priešvėžiniu, priešbakteriniu, priešvirusiniu, imunomoduliaciniu aktyvumu [9, 41, 44]. Oleanano klasės triterpeniniai junginiai selektyviau veikia širdies ir kraujagyslių sistemą, apsaugo kardiomiocitus nuo išemijos [5, 61]. Ursano klasės triterpeniniai junginiai pasižymi stipriu uždegimo slopinamuoju poveikiu, priešvėžiniu, skeleto raumenų atrofiją ir gliukozės koncentraciją kraujyje mažinančiu poveikiu [35, 63, 65]. Lupano klasės triterpeniniams junginiams būdingas tiek oleanano, tiek ursano klasių biologinis poveikis [30].
Kasmet didėjant augalinių žaliavų, turtingų biologiškai aktyvių junginių, poreikiui, svarbu in
vitro ir in vivo tyrimais nustatyti jų ekstraktų bei individualių junginių biologinį poveikį ir pritaikymo
klinikinėje praktikoje galimybes. Tokie eksperimentiniai tyrimai padėtų pagal PSO rekomendacijas formuoti moksliniais įrodymais pagrįstą tradicinės medicinos strategiją siekiant patiekti vartotojui saugius ir efektyvius produktus.
Uždegimo slopinamasis triterpeninių junginių poveikis. Mokslinėje literatūroje yra
aprašyta labai daug atliktų tyrimų siekiant įvertinti triterpeninių junginių uždegimo slopinamąjį poveikį [6]. Užsitęsęs uždegimas gali skatinti lėtinių susirgimų, tokių kaip vėžys, reumatoidinis artritas, Krono liga vystymąsi [23, 30, 58]. Atsižvelgiant į tai, labai svarbu kuo anksčiau imtis prevencinių priemonių ir sustabdyti uždegimo skatinamų ligų progresavimą.
Triterpeniniai junginiai uždegimą slopina įvairiais mechanizmais [6, 63, 65]. Uždegimo slopinamasis poveikis gali pasireikšti blokuojant prouždegiminių citokinų: IL–1β, IL–6, TNF– ir GM–KSF sintezę [12, 35]. Sulėtėjusi šių citokinų sintezė lemia uždegimo simptomų: paraudimo,
karščiavimo, skausmo ir pabrinkimo sumažėjimą [12]. Atliktas tyrimas in vivo su laboratorinėmis pelėmis, atskleidė, kad uždegimo slopinamasis poveikis pasireiškia po 6 val. vartojant 50 mg/kg ursolo rūgšties [63]. Pastebėta, kad sumažėja prouždegiminių fermentų TNF–, IL–1β koncentracija kraujyje atitinkamai 76 proc. ir 57 proc. [62]. Kitas uždegimo slopinanamojo poveikio mechanizmas pasireiškia tiesiogiai blokuojant uždegiminius fermentus: iNOS, 5–LPG bei COX–2 taip slopinant PGE2, TXA2 ir LT sintezę [17, 35].
Stipriausiai išreikštu uždegimo slopinamuoju poveikiu pasižymi ursolo ir oleanolo rūgštys [38, 68]. Atsižvelgiant į tai, tikslinga atlikti šių triterpeninių junginių išskyrimą ir įvertinti jų uždegimo slopinamąjį poveikį in vivo.
Triterpeniniai junginiai apsaugo širdies ir kraujagyslių sistemą. PSO 2017 m.
duomenimis pasaulyje kasmet nuo įvairių širdies ir kraujagyslių sistemos ligų miršta apie 17,7 mln. pasaulio žmonių, iš kurių 80 proc. miršta nuo miokardo infarkto [85]. Viršsvoris, padidėjęs kraujo spaudimas, gliukozės, cholesterolio ir mažo tankio lipoproteinų kiekis kraujyje yra rizikos veiksniai, skatinatys miokardo išemiją ir infarktą [85].
Tyrimai in vitro atskleidė, kad triterpeniniai junginiai veikia kardiomiocitus [30]. Ursolo rūgštis geba sumažinti šiluminio streso baltymų sukeltą neigiamą poveikį kardiomiocituose, reguliuojant proapoptozės mechanizmus [30]. Andre ir kt. įrodė, kad triterpeniniai junginiai mažina aterosklerozinių plokštelių formavimąsi blokuojant TNF– genų ekspresiją ir lipazės aktyvumą [6, 53]. Triterpeniniams junginiams būdingas cholesterolio, trigliceridų, mažo tankio lipoproteinų kiekį mažinantis ir didelio tankio lipoproteinų koncentraciją kraujyje didinantis poveikis [30].
Obuoliuose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai dėl savo teigiamo biologinio poveikio kardiomiocitams ir kraujagyslių sienelėms gali būti vartojami kaip potenciali prevencinė priemonė, siekiant išvengti miokardo išemijos ar infarkto. Tikslinga atlikti tolesnius tyrimus, vertinančius išgrynintų triterpeninių junginių biopasisavinimą ir gebėjimą pasiekti tikslinius receptorius sergant atitinkamomis širdies ir kraujagyslių ligomis.
Priešvėžinis triterpeninių junginių poveikis. PSO duomenimis, kiekvienais metais 3,7 mln.
žmonių diagnozuojamas vėžys, iš kurių 1,9 mln. miršta [84]. Aktualu vykdyti biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių išreikštu priešvėžiniu aktyvumu, sukeliančių mažai nepageidaujamų reakcijų, paiešką [12].
Mokslininkų pastebėta, kad triterpeniniai junginiai slopina navikinių ląstelių proliferaciją, lėtina metastazę, blokuoja NF–ĸB, todėl slopinama STAT3 baltymų aktyvinama kaskadinė grandinė ir blokuojama metaloproteazė–9 baltymas, skatinantis vėžinių ląstelių metastazę [24, 37, 75]. Ikeda ir kt. atliko tyrimą in vivo su laboratorinėmis pelėmis, sergančiomis odos vėžiu. Pastebėta, kad ursolo rūgštis blokuoja NF–ĸB pelių odos membranos lipopolisacharidų aktyvuotą prouždegiminį mediatorių RAW264 ir TFA taip slopinant odos vėžio vystymąsi [63]. Cargnin ir Gnoatto ištyrė, kad ursolo
rūgštis turi panašų poveikį krūtų vėžinėms ląstelėms kaip ir augalinės kilmės priešvėžinis vaistinis preparatas – tamoksifenas [12]. Ursolo rūgštis slopina vėžinių ląstelių p53 ir p21WAF1/Cip1 genų ekspresiją, tai ir krūtų vėžinių ląstelių proliferaciją [12].
Apibendrinant priešvėžinių tyrimų rezultatus, galima teigti, kad triterpeniniai junginiai, o ypač ursolo rūgštis, atlikus išsamius tyrimus su žmonėmis, galėtų būti naudojami klinikinėje praktikoje odos ir krūties vėžio profilaktikai ir papildomam gydymui [12, 25, 80].
Triterpeninių junginių gliukozės koncentraciją kraujyje mažinantis poveikis.
Šiuolaikiniame pasaulyje cukriniu diabetu serga apie 422 mln. suaugusių žmonių, iš kurių Lietuvoje 1 proc. miršta [83, 87]. Cukrinis diabetas yra viena sunkiausiai gydomų lėtinių ligų, kuri sukelia įvairias komplikacijas, ypač pabloginančias gyvenimo kokybę ir sutrumpinančias jo trukmę 8–10 m., todėl naujų augalinių žaliavų, pasižyminčių gliukozės koncentraciją kraujyje mažinančiu poveikiu, paieškos yra itin aktualios [45].
Tyrimuose in vitro ir in vivo pastebėta, kad korosolio, ursolo ir oleanolo rūgštys geba blokuoti fermentą tirozino fosfatazės 1B, todėl aktyvuojama gliukozės nešėjo–4 (GLUT–4) sistema [11, 74]. Fermento GLUT–4 aktyvinimas, skatina gliukozės įsisavinimą raumenyse ir gliukoneogenezę kepenyse [11, 74]. Šis veikimo mechanizmas nėra būdingas betulino rūgščiai [32]. Betulino rūgštis blokuoja žarnyno fermentą –gliukozidazę, kuri atsakinga už neabsorbuojamų oligosacharidų skaidymą į lengvai absorbuojamus monosacharidus (gliukozę ir fruktozę), todėl užblokavus šį fermentą sumažėja gliukozės koncentracija kraujyje [29, 32].
Obuoliuose nustatyti pentacikliai triterpeniniai junginiai pasižymi skirtingu gliukozės koncentraciją kraujyje mažinančiu poveikiu. Perspektyvu vartoti triterpeninius junginius antrojo tipo cukrinio diabeto prevencijai ir papildomai ligos kontrolei.
1.6. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Obuolių triterpeninių junginių sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų obelų vaisių, jų luobelių ir minkštimų triterpeninių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį. Prieš pradedant eksperimentinius tyrimus, išanalizuoti anksčiau paskelbti užsienio šalių mokslininkų straipsniai. Obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminiuose nustatyti triterpeniniai junginiai: ursolo rūgštis, oleanolo rūgštis, korosolio rūgštis, mažesnis kiekis betulino rūgšties. Triterpeniniai junginiai pasižymi įvairiapusiu biologiniu aktyvumu. Plačiausiai ištyrinėti šie poveikiai: priešvėžinis, priešbakterinis, gliukozės koncentraciją mažinantis, uždegimo slopinamasis bei širdies ir kraujagyslių sistemą apsaugantis poveikis.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimams naudoti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių: 'Aldas' (ankstyvi žieminiai, Lietuva), 'Auksis' (rudeniniai, Lietuva), 'Connel Red' (žieminiai, JAV), 'Ligol' (žieminiai, Lenkija), 'Lodel' (žieminiai, Lenkija) ir 'Rajka' (žieminiai, Čekijos Respublika), obuoliai. Obelų veislės 'Aldas' ir 'Auksis' yra įrašytos į Nacionalinį genetinių išteklių fondą [1]. Obelys auginamos Lietuvoje, Babtuose, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentiniame sode, vietos koordinatės (55∘60'N, 23∘48'E). Babtai yra 57 metrų aukštyje virš jūros lygio. Obuolių ėminiai surinkti 2016–2017 metais.
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai
Tyrimams naudoti analitinio švarumo ekstrahentai, ESC grynumo eliuentai ir etaloniniai junginiai: acetonitrilas, acetonas, metanolis, ursolo rūgštis, oleanolo rūgštis, betulino rūgštis, korosolio rūgštis („Sigma–Aldrich“ GmbH, Buchsas, Šveicarija) ir 96 proc. (v/v) etanolis (AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva). Tyrimų metu naudotas išgrynintas dejonizuotas vanduo ruoštas Milli–Q® („Millipore“, Bedfordas, JAV) vandens valymo sistema.
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra
Tyrimo metu obuolių luobelės nuo obuolių minkštimo atskirtos naudojant obuolių lupimo įrenginį „Kronen AS2“ („Kronen GmbH“, Kėlis, Vokietija). Susmulkinti obuoliai, jų luobelės ir minkštimai liofilizuoti ZIRBUS sublimacinėje džiovykloje 3×4×5/20 („ZIRBUS technology“, Bad Grundas, Vokietija). Liofilizuoti obuoliai, jų luobelės ir minkštimai susmulkinti į miltelius, naudojant elektrinį malūnėlį „Retsch GM 200 mill“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija).
Augalinėms žaliavoms, susmulkintiems liofilizuotiems milteliams ir reagentams sverti naudotos elektroninės analitinės svarstyklės „Sartorius CP64–0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminių triterpeninių junginių ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Bandelin Sanorex Digital 10P“ („Bandelin Electronic GmbH & Co. KG”, Berlynas, Vokietija). Obuolių, jų luobelių, minkštimų ėminių ištraukos filtruotos per stiklo filtrą naudojant vakuuminį siurblį „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor“ („Welch“, Skokie, JAV).
Ištraukų kokybinei ir kiekinei analizei atlikti naudotas chomatografas „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV).
2.4. Tiriamųjų obuolių ėminių paruošimas
Tyrimams paimta po 20 visiškai sunokusių kiekvienos veislės ('Aldas' 'Auksis' 'Connel Red' 'Ligol' 'Lodel' ir 'Rajka') obuolių. Obuoliai ir jų minkštimai susmulkinti atitinkamai į 1 cm storio skilteles, luobelės atskirtos nuo minkštimo ir supjaustytos į juosteles.
Visos supjaustytos obuolių dalys nedelsiant užšaldytos -35oC temperatūroje šaldytuve, kuriame įrengta oro cirkuliacija. Po 24 val. šaldymo jos perkeltos į sublimacinę džiovyklą, kurioje nustatytas 0,01 mbar slėgis ir -85o
C kondensatoriaus temperatūra. Obuolių, jų luobelių ir minkštimų liofilizuotos dalys susmulkintos elektriniu malūnėliu į miltelius, kurie iki analizės laikyti tamsiai, sandariai uždarytuose stikliniuose induose.
2.5. Tiriamųjų obuolių ėminių nuodžiūvio nustatymas
Tiriamųjų obuolių ėminių nuodžiūvis nustatytas Europos farmakopėjos Ph.Eur.01/2008: 20232 nurodytu metodu [2]. Vienas gramas obuolių, jų luobelių ar minkštimų miltelių džiovinta 105oC temperatūroje džiovinimo spintoje („Swiss quality“, Planegas, Vokietija), kad visiškai išgaruotų drėgmė ir lakieji junginiai. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai žaliavai. Masės skirtumas tarp svėrimų iki 0,01 g. Nuodžiūvis (proc.) skaičiuojamas naudojantis formule:
Čia:
m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g); m1 – žaliavos masė po džiovinimo (g).
2.6. Tiriamųjų obuolių ištraukų paruošimas
1 g liofilizuotų obuolių, jų luobelių ir minkštimų miltelių suberiami į tamsaus stiklo buteliukus, ir užpilami 100 proc. (v/v) acetonu. Buteliukai sandariai užsukami ir sudedami į ultragarso vonelę. Ekstrakcija vykdoma 10 min. kambario temperatūroje. Ultragarso bangų dažnis 80 kHz, galia – 1100 W. Ištraukos filtruojamos per stiklo filtrą naudojant vakuuminį siurblį. Po filtracijos stiklo filtras praplaunamas 100 proc. (v/v) acetonu. Filtratas perkeliamas į 10 ml matavimo kolbą ir skiedžiamas 100 proc. (v/v) acetonu iki brūkšnio. Prieš chromatografinę analizę ištraukos papildomai filtruojamos per 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus „Carl Roth GmbH“ („Carl Roth GmbH & Co. KG“, Karlsrūjė, Vokietija).
2.7. Tyrimo metodai
Obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminių triterpeninių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta naudojant chromatografą „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV), sujungtą su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV). Triterpeninių junginių skirstymui naudota „ACE C18“ ( „ACT“, Aberdynas, Jungtinė Karalystė) kolonėlė (250 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 5 μm). Kolonėlė laikyta 25oC temperatūroje termostate. Eluentas sudarytas iš 100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas A) ir vandens (eliuentas B). Izokratinis eliuavimas taikytas esant eliuentų santykiui 88 proc. (eliuentas A) ir 12 proc. (eliuentas B). Injekuotas ištraukos tūris – 10 μl, eliuento tėkmės greitis – 1 ml/min.
Tiriamųjų triterpeninių junginių chromatografinės smailės nustatytos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo trukmes ir ultravioletinių spindulių absorbcijos spektrines charakteristikas (λ=200400 nm). Identifikuotų triterpeninių junginių kiekinė sudėtis nustatyta atsižvelgiant į analitės chromatografinės smailės ploto priklausomybę nuo analitės koncentracijos tiriamosiose ištraukose, naudojantis penkių lygmenų kiekvienai analitei sudarytais etaloninių junginių kalibravimo grafikais. Remiantis kalibravimo grafiko duomenimis apskaičiuoti identifikuotų triterpeninių junginių kiekiai esant 205 nm šviesos bangos ilgiui.
2.8. Tyrimo duomenų analizė
Tyrimo duomenų statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2013” („Microsoft”, Redmondas, JAV) ir „SPSS 20.0“ („SPSS Inc.“, Čikaga, JAV) kompiuterines
programas. Visi ESC analizės metu gauti rezultatai pateikiami kaip trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis ± standartinis nuokrypis.
Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirtingų veislių obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminių nustatyti pritaikius vienfaktorinę dispersinę analizę – ANOVA ir daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Skirtumai laikomi reikšmingais esant p<0,05 reikšmei. Triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimui skirtingose veislėse nustatyti apskaičiuoti variacijos koeficientai.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Obuolių ėminių triterpeninių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas
Atlikus literatūros apžvalgą pastebėta, kad yra nemažai publikacijų apie obuolių fitocheminę sudėtį bei jos įvairavimą obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminiuose. Daugiausiai tiriami fenoliniai junginiai, o kitų grupių ne mažiau svarbūs biologiškai aktyvūs junginiai, tokie kaip pentacikliai triterpeniniai junginiai, tyrinėti daug mažiau. Dėl šių priežasčių yra itin aktualu šiuolaikiniais analizės metodais nustatyti obuolių triterpeninių junginių fitocheminės sudėties įvairavimą.
Mokslinės literatūros duomenimis, obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijai vienas labiausiai tinkamų ekstrakcijos metodų yra sonifikacija. Šis metodas itin tinkamas aukštai temperatūrai neatspariems junginiams ekstrahuoti (ekstrakcijos mikrobangomis metu naudojama aukšta temperatūra, galinti suardyti biologiškai aktyvius junginius), metodas lengvai pritaikomas rutininėje analizėje (ekstrakcijos superkritiniais skysčiais ar suslėgtais skysčiais metu reikalinga brangi įranga, kuri ne visuomet prieinama rutininėje analizėje), ekstrakcijos trukmė pakankamai trumpa (taikant maceraciją ir ekstrakciją Soksleto aparate, ekstrakcija trunka ilgai) [13, 31, 43]. Remiantis kitų mokslininkų anksčiau paskelbtais tyrimais, obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminių triterpeninių junginių ekstrakcijai pasirinktas sonifikacijos (ekstrakcijos ultragarso vonelėje) metodas.
Vystant augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių kokybinio ir kiekinio nustatymo metodiką, vienas reikšmingiausių analitinių žingsnių yra ekstrakcijos sąlygų parinkimas [71]. Svarbus veiksnys, lemiantis tiriamųjų junginių ekstrakcijos išeigą bei prognozuojant gautųjų augalinių ištraukų individualių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, yra ekstrahento parinkimas [64].
Triterpeninių junginių ekstrakcijai iš augalinės žaliavos dažniausiai naudojami nepoliniai ekstrahentai: acetonas, alkoholiai (etanolis ar metanolis, rečiau kiti žemesnieji alkoholiai), heksanas, etilacetatas, dietileteris, skysti chorinti angliavandeniliai (chloroformas, dichlormetanas) ir jų mišiniai [64, 72, 76].
Pirmajame ekstrakcijos sąlygų nustatymo tyrimų etape vertinta ekstrahento įtaka triterpeninių junginių ekstrakcijos išeigai. Atsižvelgiant į pasaulio mokslininkų skelbiamus tyrimų duomenis [20, 23], obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymo tyrimams pasirinkti šie ekstrahentai: metanolis 100 proc. (v/v), etanolis 96 proc. (v/v) ir acetonas 100 proc. (v/v). Didžiausias suminis identifikuotų triterpeninių junginių kiekis (2,29±0,06 mg/g, p < 0,05) nustatytas obuolių ėminius ekstrahavus 100 proc. (v/v) acetonu (3 pav.), todėl šis ekstrahentas pasirinktas tolesniems ekstrakcijos sąlygų nustatymo tyrimams.
3 pav. Obuolių ėminių ištraukų triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimas ekstrakcijai naudojant skirtingus ekstrahentus. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus
obuolių ėminių triterpeninių junginių kiekių skirtumus (p < 0,05)
Kitame ekstrakcijos sąlygų nustatymo tyrimų etape vertinta ekstrakcijos trukmės įtaka obuolių triterpeninių junginių ekstrakcijos išeigai. Statistiškai reikšmingai didžiausias suminis identifikuotų triterpeninių junginių kiekis (2,38±0,01 mg/g, p < 0,05) nustatytas ekstrahavus obuolių ėminius 10 min. kambario temperatūroje (4 pav.), todėl šis laikas pasirinktas skirtingų veislių obelų vaisių, jų luobelių ir minkštimų triterpeninių junginių palyginamiesiems tyrimams vykdyti.
4 pav. Triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimas ekstrahuojant obuolių ėminius skirtingais laiko intervalais. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus obuolių ėminių
triterpeninių junginių kiekių skirtumus (p < 0,05)
Apibendrinant triterpeninių junginių ekstrakcijos efektyvumo tyrimus, didžiausias suminis identifikuotų triterpeninių junginių kiekis nustatytas ekstrahavus obuolių ėminius 100 proc. (v/v)
b e f h m b e f j o a e g k n 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Korosolio rūgštis Betulino rūgštis Oleanolo rūgštis Ursolo rūgštis Suminis kiekis
T ri ter penini ų jun gi nių kie kis , m g/ g
Acetonas Etanolis Metanolis
j h hj hj j m m m m m fg f g g g de c d de e b a b b b 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5 10 15 20 30 T ri ter penini ų jun gi nių kie kis , m g/ g
Ekstrakcijos laikas, min.
Korosolio rūgštis Betulino rūgštis Oleanolo rūgštis Ursolo rūgštis Suminis kiekis
1
2
acetonu, 10 min. ultragarso vonelėje kambario temperatūroje. Dėl šios priežasties tolesniems tyrimams vykdyti pasirinktos aukščiau aprašytos ekstrakcijos sąlygos.
3.2. Obuolių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo
tyrimai
Atlikus ekstrakcijos sąlygų parinkimo tyrimus, kitas ne mažiau svarbus biologiškai aktyvių junginių analizės žingsnis yra tiriamųjų analičių chromatografinė analizė skirstymas, detekcija, identifikavimas ir kiekinis nustatymas. Remiantis literatūros duomenimis, tiriamųjų obuolių ėminių triterpeninių junginių kokybiniam ir kiekiniam nustatymui pasirinkta efektyvioji skysčių chromatografija detekcijai naudojant fotodiodų matricos detektorių.
Tirtų veislių obuolių ėminių ištraukose identifikuoti ir kiekiškai nustatyti šie triterpeniniai junginiai: betulino rūgštis, korosolio rūgštis, oleanolo rūgštis ir ursolo rūgštis. Obuolių ištraukų chromatograma pateikta 5 paveiksle.
5 pav. Obuolių ėminio ištraukos ESC chromatograma (veislė 'Lodel', λ=205 nm): 1–korosolio rūgštis, 2–betulino rūgštis, 3–oleanolo rūgštis, 4–ursolo rūgštis
Atlikus analizę ESC metodu, nustatyta, kad visų tirtų veislių obelų vaisių ėminių ištraukose vyraujantis triterpeninis junginys yra ursolo rūgštis. Prancūzų mokslininkų Grigorasa ir kt. skelbiami tyrimų duomenys patvirtina mūsų gautus rezultatus ursolo rūgštis vyrauja tarp obuolių ėminių ištraukose nustatytų triterpeninių junginių [28]. Statistiškai reikšmingai didžiausias ursolo rūgšties kiekis (2,577±0,142 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Lodel' veislės obuolių ėminiuose, mažiausias (1,179±0,060 mg/g, p < 0,05) – 'Aldas' veislės obuolių ėminiuose (2 lentelė). Ursolo rūgštis sudarė didžiąją dalį 72,1–81,2 proc. visų obuolių ėminių ištraukose nustatytų triterpeninių junginių kiekio (6
AU 0,00 0,06 0,12 0,18 0,24 Minutes 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 3 4 A bsorbci ja, A V
pav.). Gauti rezultatai patvirtina mokslinių tyrimų duomenis, kuriuose teigiama, kad ursolo rūgštis gali sudaryti 70 proc. ir daugiau visų obuolių ėminių ištraukose nustatytų triterpeninių junginių kiekio [67]. Kitų identifikuotų ir kiekiškai nustatytų triterpeninių junginių procentinė dalis žymiai mažesnė.
2 lentelė. Obuolių ėminių ištraukų triterpeninių junginių kiekinės sudėties įvairavimas. Tame pačiame stulpelyje esančios skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus tirtų veislių
obuolių ėminių kiekių skirtumus (p < 0,05)
Junginys, mg/g Veislė Betulino rūgštis Korosolio rūgštis Oleanolo rūgštis Ursolo rūgštis 'Aldas' 0,023±0,001c 0,059±0,014b 0,373±0,011de 1,179±0,060j 'Auksis' 0,022±0,005c 0,075±0,016b 0,325±0,019de 1,593±0,154h 'Connel Red' 0,022±0,007c 0,110±0,056b 0,323±0,058de 1,535±0,098h 'Ligol' 0,024±0,002c 0,274±0,076a 0,357±0,058de 1,870±0,094g 'Lodel' 0,032±0,005c 0,096±0,017b 0,468±0,112d 2,577±0,142f 'Rajka' 0,030±0,001c 0,232±0,001a 0,315±0,016e 1,624±0,085h CV, proc. 17,6 63,5 15,9 27,2
Oleanolo rūgšties kiekis tirtų veislių obuolių ėminiuose varijavo nuo 0,315±0,016 mg/g iki 0,468±0,112mg/g. Didžiausias oleanolo rūgšties kiekis (0,468±0,112mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Lodel' veislės obuolių ėminiuose, mažiausias (0,315±0,016 mg/g) – 'Rajka' veislės obuolių ėminiuose (2 lentelė). 'Rajka' veislės obuolių ėminiuose nustatytas oleanolo rūgšties kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kitose veislėse (išskyrus 'Lodel') nustatyto šios rūgšties kiekio. Gauti duomenys patvirtina kitų mokslininkų paskelbtų tyrimų rezultatus oleanolo rūgšties kiekis obuolių ėminiuose gali varijuoti nuo 0,16 g/100 g iki 1,0 g/100 g sausos žaliavos [40, 42]. Oleanolo rūgšties procentinė dalis obuolių ėminių ištraukose įvairuoja nuo 14,1 iki 22,8 proc. visų identifikuotų triterpeninių junginių kiekio ir yra 3,6–5,1 karto mažesnė už nustatytą ursolo rūgšties procentinę dalį (6 pav.).
Korosolio rūgšties kiekis tirtų obuolių ėminiuose mažesnis už nustatytą ursolo rūgšties ir oleanolo rūgšties kiekį. Didžiausias korosolio rūgšties kiekis (0,274±0,076 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Ligol' veislės obuolių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo šios rūgšties kiekio, nustatyto 'Rajka' veislės obelų vaisių ėminiuose (2 lentelė). Mažiausias korosolio rūgšties kiekis (0,059±0,014 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Aldas' veislės obuolių ėminiuose, rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo šios rūgšties kiekio, nustatyto 'Auksis', 'Connel Red' ir 'Lodel' veislių
obuolių ėminiuose. Gauti rezultatai patvirtina prancūzų mokslininkų Jemmali ir kt. skelbiamus tyrimų duomenis, kuriuose nurodoma, kad obuoliuose sukaupiama iki 0,51 g/100 g korosolio rūgšties [40]. Korosolio rūgšties procentinė dalis sudarė 3,0–10,9 proc. visų obuolių ėminiuose identifikuotų triterpeninių junginių kiekio, ji yra 2,1–4,7 karto mažesnė už oleanolo rūgšties ir 7,5–24,0 karto mažesnė už ursolo rūgšties procentinę dalį (6 pav.).
6 pav. Skirtingų veislių obelų vaisių ėminių triterpeninių junginių procentinės dalies įvairavimas
Obuolių ėminiuose nustatytas betulino rūgšties kiekis buvo mažiausias iš visų identifikuotų ir kiekiškai įvertintų triterpeninių junginių (2 lentelė). Šios rūgšties kiekis tirtų veislių obelų vaisių ėminiuose varijuoja nežymiai nuo 0,022±0,005 ir 0,022±0,007 mg/g iki 0,032±0,005 mg/g. Didžiausias betulino rūgšties kiekis (0,032±0,005 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Lodel' veislės obuolių ėminiuose, mažiausias (0,022±0,005 mg/g, p < 0,05) ir (0,022±0,007 mg/g, p < 0,05) atitinkamai 'Auksis' ir 'Connel Red' veislių obuolių ėminiuose, tačiau statistiškai reikšmingų betulino rūgšties kiekio skirtumų tarp tirtų veislių obelų vaisių ėminių nenustatyta (2 lentelė). Obuolių ėminių ištraukose betulino rūgšties procentinė dalis buvo mažiausia, ji sudarė tik 0,95–1,4 proc. visų identifikuotų triterpeninių junginių kiekio (6 pav.).
Triterpeninių junginių kiekinės sudėties varijavimo tarp skirtingų veislių obuolių ėminių nustatymui apskaičiuoti variacijos koeficientai, rodantys kiekvieno junginio variacijos amplitudę. Veislės veiksnys stipriausią įtaką turėjo korosolio rūgšties kiekinės sudėties varijavimui (CV=63,5 proc.). Kitų nustatytų triterpeninių junginių varijacijos koeficientai mažesni: ursolo rūgšties (CV27,2 proc.), betulino rūgšties (CV17,6 proc.), mažiausiai skirtingų veislių obuolių ėminiuose varijavo oleanolo rūgštis (CV15,9 proc.) (2 lentelė).
0 20 40 60 80 100
'Aldas' 'Auksis' 'Connel
Red'
'Ligol' 'Lodel' 'Rajka'
Veislė
Betulino rūgštis Korosolio rūgštis Oleanolo rūgštis Ursolo rūgštis
Procent inė dali s, proc .
Apibendrinant gautus rezultatus, tirtų veislių obelų vaisių ėminių ištraukose identifikuotus ir kiekiškai nustatytus triterpeninius junginius pagal mažėjimo tvarka galima išdėstyti tokia tvarka: ursolo rūgštis>oleanolo rūgštis>korosolio rūgštis>betulino rūgštis. Šie rezultatai patvirtina Jemmali ir kt. anksčiau pateiktų mokslinių publikacijų duomenis [40].
3.3. Obuolių luobelių triterpeninių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties
įvairavimo tyrimai
Nour ir kt. atlikto tyrimo metu nustatyta, kad biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis atskirose obuolių dalyse yra skirtinga [62]. Tikslinga įvertinti identifikuotų triterpeninių junginių kiekio įvairavimą ne tik obuoliuose, bet ir atskirose jų dalyse: luobelėse ir minkštimuose, nustatyti, kurioje obelų vaisių dalyje sukaupiamas didžiausias triterpeninių junginių kiekis.
Tarp visų obuolių luobelių ėminių ištraukose identifikuotų ir kiekiškai nustatytų triterpeninių junginių vyravo ursolo rūgštis. Obuolių luobelių ėminiuose nustatytas ursolo rūgšties kiekis 2,5–3,4 karto didesnis už obuolių ėminiuose nustatytą šios rūgšties kiekį. Didžiausias ursolo rūgšties kiekis (6,434±0,314 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Lodel' veislės obuolių luobelių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Auksis', 'Connel Red' ir 'Rajka' veislių obuolių luobelių ėminiuose nustatyto šios rūgšties kiekio (3 lentelė). 'Lodel' veislės obuolių luobelių ėminiuose, kaip ir obuolių ėminiuose, nustatytas didžiausias ursolo rūgšties kiekis. Mažiausias ursolo rūgšties kiekis (4,023±0,312 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Aldas' veislės obuolių luobelių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Ligol' veislės obuolių luobelių ėminiuose nustatyto šios rūgšties kiekio (3 lentelė). Ursolo rūgštis sudarė 72,5–79,6 proc. visų obuolių luobelių ėminių ištraukose nustatytų triterpeninių junginių kiekio (7 pav.). Ursolo rūgšties procentinė dalis obuolių luobelių ėminiuose labai artima obuolių ėminių ištraukose nustatytai. Gauti rezultatai patvirtina mokslininkų nustatytą ursolo rūgšties procentinės dalies įvairavimą. Šios rūgšties procentinė dalis gali sudaryti net iki 98 proc. visų obuolių luobelių ėminių ištraukose identifikuotų triterpeninių junginių kiekio [75].
Visų tirtų veislių obuolių luobelių ėminiuose nustatytas oleanolo rūgšties kiekis mažesnis už ursolo rūgšties kiekį. Šį dėsningumą patvirtina ir kitų mokslininkų anksčiau paskelbtų tyrimų duomenys [23, 98]. Didžiausias oleanolo rūgšties kiekis (1,240±0,109 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Connel Red' veislės obuolių luobelių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Auksis', 'Lodel' ir 'Rajka' veislių obuolių luobelių ėminiuose nustatyto šios rūgšties kiekio (3 lentelė). Mažiausias oleanolo rūgšties kiekis (0,945±0,062 mg/g, p < 0,05) nustatytas 'Ligol' veislės obuolių luobelių ėminiuose, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp oleanolo rūgšties kiekio 'Aldas', 'Auksis', 'Lodel' ir 'Rajka' veislių obuolių luobelių ėminiuose nenustatyta (3 lentelė). Oleanolo rūgšties
