LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VAIVA NOVOGRECKAITĖ

LIETUVOS KLIMATO SĄLYGOMIS AUGINAMŲ SENOVINIŲ VEISLIŲ OBUOLIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Mindaugas Liaudanskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

LIETUVOS KLIMATO SĄLYGOMIS AUGINAMŲ SENOVINIŲ VEISLIŲ OBUOLIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Mindaugas Liaudanskas Data

Recenzentas Darbą atliko Lekt. Živilė Pranskūnienė Magistrantė

Vaiva Novogreckaitė Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1 Obels (Malus Mill.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas bei morfologiniai požymiai ... 10

1.2 Obuolių fitocheminės sudėties tyrimai ... 11

1.3 Obuolių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai... 12

1.4 Obuolių fenolinių junginių biologinis poveikis ... 14

1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 16

2. TYRIMO METODIKA ... 17

2.1 Tyrimo objektas ... 17

2.2 Tyrimo metu naudoti reagentai ... 17

2.3 Tyrimo metu naudota aparatūra ... 18

2.4 Tiriamųjų obuolių ėminių paruošimas ... 18

2.5 Tiriamųjų obuolių ėminių nuodžiūvio nustatymas ... 18

2.6 Tiriamųjų obuolių ištraukų paruošimas ... 19

2.7 Tyrimo metodai ... 19

2.8 Tyrimo duomenų analizė ... 23

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24

3.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas senųjų veislių obuolių ėminiuose ... 24

3.2 Senųjų obuolių veislių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 26

3.3 Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas obuolių vaisiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. ... 29 3.4 Rezultatų apibendrinimas ... 33 IŠVADOS ... 34 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 35 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 36 4. PRIEDAI ... 41

SANTRAUKA

V. Novogreckaitės magistro baigiamasis darbas / mokslinis vadovas dr. Mindaugas Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas.

Pavadinimas – Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senovinių veislių obuolių fenolinių junginių sudėties įvairavimo tyrimas

Raktiniai žodžiai: Malus, obuoliai, fenoliniai junginiai, chlorogeno rūgštis, ESC.

Tyrimo objektas ir metodai: tirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senovinių ('Antaninis', 'Jono pepinas', 'Lietuvos pepinas', 'Biržuvėnų žieminis', 'Koštelė', 'Sierinka', 'Golden Russet') obelų vaisių ėminiai. Kokybinė ir kiekinė fenolinių junginių sudėties analizė atlikta taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos bei ESC metodus.

Darbo tikslas – Ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senovinių veislių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti senųjų veislių obuolių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą UV– regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu.

2. ESC metodu nustatyti senųjų veislių obuolių ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.

3. Nustatyti senųjų veislių obuolių ėminių etanolinių ištraukų antiradikalinį aktyvumą in vitro. 4. Nustatyti senųjų veislių obuolių vaisių ėminių etanolinių ištraukų redukcinį aktyvumą in vitro. Tyrimo rezultatai ir išvados:

Didžiausias bendras fenolinių junginių (7,97±0,17 mg GRE g) bei hidroksicinamono rūgšties darinių (12,12±1,68 mg/g). kiekiai nustatyti 'Koštelė' (7,97±0,17 mg CRE/g) veislės obuoliuose. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis – 'Lietuvos pepinas' (2,35±0,10 mg/g) veislės obuoliuose.

ABTS (605,41±12,00 µmol/g), FRAP (147,89±0,97 µmol TE/g) bei TFPH (342,76±11,32 µmol TE/g) metodais didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo 'Sierinka' veislės obuolių ekstraktas, o DPPH – 'Koštelė' (580,69±12,58 µmol TE/g). Didžiausias redukcinis aktyvumas pastebėti 'Sierinkos' (147,89±0,97 TE/g) bei 'Paprastojo antaninio' (147,64±0,93 µmol TE/g) veislės obuolių ėminiuose.

SUMMARY

V. Novogreckaitė final master’s thesis/ research supervisor. dr. Mindaugas Liaudanskas; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis.–Kaunas.

Title: Composition research of phenolic compounds in old apple cultivars of Lithuania

The aim of the research – to investigate quality and quantity of phenolic compounds in old apple cultivars of Lithuania. 'Antaninis', 'Jono pepinas', 'Lietuvos pepinas', 'Biržuvėnų žieminis', 'Koštelė', 'Sierinka', 'Golden Russet')

The objectives of the research:

1. To determinate the variation of the quantitative composition of phenolic compounds of the old apple cultivars by UV–VIS spectrophotometry.

2. To determinate the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of apple fruits by HPLC methodology.

3. To determinate the antiradical activity of ethanol extracts of old varieties of apples in vitro. 4. To determinate the reduction activity of ethanol extracts of old varieties of apples in vitro. Object and methods: Apple fruits samples of cultivars were collected in 2017 grown in Lithuania. The total content of phenolic compounds in apples samples was performed using UV–VIS spectrophotometric method. Antioxidant activity was assessed by DPPH, ABTS, FRAP and TFPH spectrophotometric methods.

Results: The biggest amounth of total content of phenolic compounds in apples samples ethanolic extracts was determined in 'Koštelė' (7,97±0,17 mg GRE/g) Most hydroxycinnamic acids derivates was in 'Koštelė' samples (12,12 ±1,68 mg CRE/g). And the most of chlorogenic acid was in 'Lietuvos pepinas' (2,35±0,10 mg/g).

The biggest antioxidant activity by ABTS (605,41±12,00 µmol TE/g), FRAP (147,89±0,97 µmol TE/g) and TFPH (342,76± 11,32 µmol TE/g) was determined in 'Sierinka', but in DPPH – 'Koštelė' (580,69±12,58 µmol TE/g).

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2’–azino–bis–(3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgštis); CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;

COX–1 – ciklooksigenazė–1; COX–2 – ciklooksigenazė–2;

CV – variacijos koeficientas (anglų k. coefficient of variation) DPPH – 2,2–difenil–1–pikrilhidrazilo radikalas;

EE – (–)–epikatechino ekvivalentas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant power); GRE – galo rūgšties ekvivalentas;

LAMMC – Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centras; NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo;

TE – trolokso ekvivalentas;

TFPH – trifluorperazino dihidrochloridas; TPTZ – 2,4,6–tri–(2–piridil)–1,3,5–triazinas;

ĮVADAS

Pasaulinė sveikatos organizacijos patvirtinta 2014 – 2023 m. tradicinės medicinos strategija remia valstybes, kurios skatina tradicinės medicinos vaidmenį. Pagrindinis strategijos tikslas – augalinių vaistinių preparatų populiarinimas bei prieinamumas gyventojams. Net 6,7 milijonų žmonių mirčių pagal PSO 2010 m. pateiktus duomenis buvo dėl nepakankamo vaisių ir daržovių vartojimo [1]. Kasmet didėjant natūralių augalinių produktų paklausai, svarbu vykdyti perspektyvių augalinių žaliavų paieškas, nustatyti jų cheminę sudėtį ir biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus, įvertinti praktinio panaudojimo galimybes. Vaisiuose bei daržovėse gausu biologiškai aktyvių junginių, kurie gali padėti palaikyti sveikatos būklę bei išvengti neinfekcinių ligų vystymosi [2]. Viena plačiausiai tiriamų biologiškiai aktyvių junginių grupė – fenoliniai junginiai, pasižymintys priešvėžiniu, antioksidaciniu bei priešvirusiniu poveikiais [3]. Fenoliniai junginiai gali būti potencialiai vertingi medicinoje, farmacijoje, kosmetikoje, maisto papildų ir maisto produktų gamyboje.

Daugelis mokslininkų atkreipia dėmesį, kad įvairių susirgimų priežastis yra netinkama ar nepilnavertė mityba, todėl žmogaus maisto racione esančių vaisių ir daržovių cheminės sudėties tyrimams turi būti skiriamas itin didelis dėmesys siekiant užtikrinti jų saugumą ir kokybę. Obuoliai yra vieni iš labiausiai auginamų ir plačiausiai vartojamų vaisių visame pasaulyje, kurie užima svarbią vietą žmogaus mitybos racione. Obuoliuose nustatomi įvairūs biologiškai aktyvūs junginiai: vitaminai, mikroelementai, makroelementai, organinės rūgštys, pektinai ir fenoliniai junginiai [4].

Mokslinio darbo naujumas. Nors pardavime yra tik kelių ar keliolikos komercinių veislių obuoliai, tačiau yra šimtai vietinių veislių, kurios auginamos skirtinguose įvairių šalių regionuose. Nuo seno auginamų vietinių, paprastai į prekybos tinklus nepatenkančių, veislių obuolių cheminė sudėtis yra daug mažiau tyrinėta. Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senųjų lietuviškų veislių obuolių fenolinių junginių sudėtis nėra tyrinėta. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis obuoliuose kinta priklausomai nuo auginimo technologijos, klimatinių sąlygų ypatumų, laikymo sąlygų ir obelų veislės. Tyrimų metu tikslinga ištirti senųjų lietuviškų veislių obuolių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, nustatyti obelų veisles, kurių vaisiuose kaupiami didžiausi šių junginių kiekiai. Gauti rezultatai pateiks naujos informacijos apie senųjų lietuviškų veislių obuolių fenolinių junginių sudėtį, leis nustatyti obelų veisles, potencialiai vertingiausias auginimui Lietuvos pramoniniuose ir mėgėjiškuose soduose. Gauti tyrimų duomenys sudarytų galimybę ateityje panaudoti senųjų lietuviškų veislių obuolius individualių fenolinių junginių išskyrimui, jų ekstraktais praturtintų maisto papildų kūrimui ir gamybai.

Darbo tikslas – Ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senovinių veislių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą in vitro.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – Ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senovinių veislių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti senųjų veislių obuolių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą UV– regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu.

2. ESC metodu nustatyti senųjų veislių obuolių ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.

3. Nustatyti senųjų veislių obuolių ėminių etanolinių ištraukų antiradikalinį aktyvumą in vitro. 4. Nustatyti senųjų veislių obuolių vaisių ėminių etanolinių ištraukų redukcinį aktyvumą in vitro.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Obels (Malus Mill.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas bei

morfologiniai požymiai

Obels (Malus Mill.) genties augalai priskiriami obelinių (Maloideae) pošeimiui, ir priklauso erškėtinių šeimai. Genčiai priskiriamos 35 – 50 ar net 86 rūšys [5–8], kurios atstovai plačiausiai paplitę vidutinio klimato zonose Manoma, kad augalai yra kilę iš Centrinės Azijos, Kazachijos kalnų regionų, o iš ten plito po kitus kraštus [9]. Lietuvos Respublikos teritorijoje natūraliai auga miškinė obelis (Malus sylvestris (L.) Mill.), o naminės obels (Malus domestica Borkh.) yra išvesta daug veislių. Miškinė obelis auga pavieniui lapuočių bei mišriuose miškuose, pamiškėse, laukuose [10]. Naminė obelis geba prisitaikyti prie įvairių klimato sąlygų, tačiau geriausiai auga vėsesnio klimato juostoje (35–50° šiaurės platumos), vandeniui pralaidžioje dirvoje, kurios pH 6–7 [8].

Naminė obelis  daugiametis vasarą žaliuojantis lapuotis medis su rusvos spalvos šakelėmis. Augalų aukštis 4 – 10 (15) metrų [8,11,12]. Lapai pražanginiai, kotuoti, žali arba tamsiai žali, dažniausiai su smailėjančia viršūne, 5 – 10 cm ilgio ir 2 – 5 cm pločio. Lapų kraštai simetriniai su ištisiniais kraštais, dantyti, lygiakraščiai arba smulkiai pjūkliški. Prielapiai nukrintantys [11,13]. Žiedai dvilyčiai, kvapnūs, butonai rausvi, o išsiskleidę vainiklapiai balti ar rožiniai. Žiedai telkiasi į skėtiškus žiedynus. Taurėlapių ir vainiklapių yra po penkis [11]. 20 kuokelių su geltonomis dulkinėmis išsidėstę trimis ratais (10+5+5). Mezginė apatinė su 3 – 5 lizdais. Liemenėliai 5, tarpusavyje suaugę [5]. Augalai žydi balandžio – gegužės mėnesiais. Žydėjimo laikas itin priklauso nuo obels rūšies ir veislės [5,13]. Vaisiai – obuoliai, kurie sunoksta (70) 120 – 150 (180) dienų nuo žydėjimo pabaigos. Skirtingų obelų veislių obuoliai prinoksta skirtingu laiku ir pagal prinokimo laiką skirstomos į vasarines, rudenines ir žiemines. Kiekvienoje iš šių grupių išskiriami pogrupiai: ankstyva vasarinė, vasarinė, vėlyva vasarinė, rudeninė ir t.t..

Obuoliai, priklausomai nuo veislės, būna įvairaus dydžio, spalvos ir skonio. Obelų vaisiai skirstomi į 7 dydžio grupes: labai smulkūs (iki 26 g), smulkūs (26 – 50 g), smulkesni už vidutinius (51 – 75 g), vidutiniai (76 – 100 g), stambesni už vidutinius (101 – 125 g), stambūs (126 – 175 g), labai stambūs (daugiau kaip 175 g). Daugumos veislių obuolių odelė būna skirtingos spalvos: viena spalva, paprastai šviesesnė (žalia, žalsvai gelsva, gelsva, šviesiai geltona, auksinė), vadinama pagrindine, o kita, paprastai ryškesnė (rausva, raudona, oranžinė, purpurinė), vadinama papildomąja. Sėklų skaičius priklausomai nuo rūšies gali kisti nuo 5 – 15 (30). Sėklos pailgai kiaušiniškos, iš šonų suplotos, dažniausiai vienu lygiu ar įgaubtu šonu, kitu – išgaubtu, pilkai rudos spalvos, matiniu, truputi blizgančiu

paviršiumi, 6 – 7 mm ilgio, 3,5 – 4,5 mm pločio, 1,8 – 2,1 mm storio Vaisiaus minkštimas gali būti baltas, kreminis, gelsvas, žalsvas, rausvas ar raudonas. Obuolys traškus arba minkštas, sausas, vidutinio sultingumo arba labai sultingas, švelnus, tirpstantis burnoje, smulkiai arba stambiai grūdėtas. Obuolių skonį apsprendžia jų sudėtyje esančios organinės rūgštys ir angliavandeniai. Jie būna saldūs, rūgštūs, saldžiai rūgštūs, rūgščiai saldūs ir kt. [5, 8].

Pasaulyje žinoma virš 7500 obelų veislių, kurios tarpusavyje skiriasi derlingumu, atsparumu šalnoms ir ligoms, derėjimo laiku, vaisių forma, dydžiu, skoniu ir spalva [2].

1.2 Obuolių fitocheminės sudėties tyrimai

Obuoliai – populiarūs visame pasaulyje ir itin plačiai kultivuojami vaisiai. Obuoliuose esantys biologiškai aktyvūs junginiai nulemia augalinės žaliavos poveikį bei kokybę [2]. Obuolių cheminė sudėtis kinta jų vystymosi ir nokimo metu. Neprinokusiuose obuoliuose yra daugiau krakmolo, obuolių rūgšties, ląstelienos, pektinų, raugų, o fenolinių junginių, proantocianidinų ir flavonoidų yra 10 kartų daugiau negu sunokusiuose obuoliuose Cheminės sudėties įvairavimą lemia šie veiksniai: obuolių veislė, augimo regionas, medžių amžius bei jų fiziologinė būklė, klimatinės sąlygos (drėgmė, šviesa), dirvožemis, sunokimo laipsnis, derliaus nuėmimo laikas, laikymo sąlygos bei laikymo trukmė [14]. Obuoliuose nustatyti fenoliniai junginiai skirstomi į du pagrindinius pogrupius: flavonoidus ir fenolines rūgštis. Svarbiausi obuoliuose nustatyti flavonoidai yra kvercetino glikozidai (avikuliarinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, rutinas, kvercetino–3–O–ksilozidas, kvercetino–3–O–arabinozidas), flavan–3–oliai – (+)–katechinas ir (−)–epikatechinas bei jų oligomerai – procianidinai B1, B2 ir C1, polimeriniai procianidinai, dihidrochalkonai – floridzinas ir floretinas. Obuoliuose nustatyta chlorogeno rūgštis [2,4,15].

Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 662 µg/g iki 4291 µg/g Kvercetino glikozidų įvairuoja nuo 41,0 µg/g – 87,0 µg/g [54], (+)–katechino – 50,1 µg/g – 148,2 µg/g, (−)–epikatechino – 236,5 µg/g – 684,0 µg/g, procianidino B1 – 39,6 µg/g – 108,1 µg/g, procianidino B2 – 320,9 µg/g – 931,2 µg/g, floridzino – 63,8 µg/g – 142,4 µg/g, chlorogeno rūgšties – 341,3 µg/g – 2228,4 µg/g [2,4,16]. Obuolai naudojami pektinui gauti, kuris dėl gelifikuojančių savybių naudojamas maisto, kosmetikos bei farmacijos pramonėje. Pektinų kiekiai obuoliuose, priklausomai nuo veislės bei ekstrakcijos sąlygų, įvairuoja nuo 3.4 proc. iki 15 proc. absoliučiai sausos žaliavos masės [17].

Obuoliuose nustatyti vitaminai, mikroelementai ir makroelementai, kuriuos mažėjimo tvarka pagal kiekį galima išdėstyti šitaip: K>Mg>P >Ca> Na> Fe> Zn> Cu> Mn> Cr> Sr> Al. Obuoliuose nustatyti pektinai, taninai, monosacharidai (gliukozė ir fruktozė) ir disacharidas – sacharozė. Obuolių ėminiuose nustatytos įvairios organinės rūgštys: askorbo, citrinų, p–fumarato, obuolių, pieno, sukcinato ir vyno rūgštys. Didžiausias kiekis obelų vaisiuose nustatytas obuolių rūgšties 919,06 mg/100 g, citrinų rūgšties 24,43 mg/100 g ir askorbo rūgšties 6,18 mg/100 g sausos žaliavos [13].

1.3 Obuolių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai

Mėginio ekstrakcijos metodas priklauso nuo tiriamo objekto. Tinkamai parinkta ekstrakcija – optimizuoja fenolinių junginių išgavimą iš žaliavos. Biologiškai aktyviems junginiams iš žaliavų išskirti, dažniausiai naudojami šie metodai: ekstrakcija organiniais tirpikliais (maceracija, perkoliacija), ekstrakcija Soksleto aparatu, ultragarsu (sonifikacija), mikrobangomis, suslėgtais skysčiais, superkritiniais skysčiais, fermentine ekstrakcija ir kitais ekstrakcijos metodais [20, 21].

Fenolinių junginių ekstrakcija maceracijos metodu. Fenolinių junginių ekstrakcijai maceracijos būdu naudojami metanolis, etanolis, propanolis, acetonas, etilacetatas, jų tarpusavio mišiniai ir mišiniai su vandeniu. Metodas pasižymi mažu efektyvumu, procesas trunka ilgai (trumpiausiai 72 val.), yra neekonomiškas [19, 20]. Dėl ilgos ekstrakcijos trukmės yra tikėtinas biologiškai aktyvių junginių suirimas ir mažesnė fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga. Junginių suirimui įtakos turi šviesa ir aplinkos temperatūra. Fenolinių junginių ekstrakcijos trukmė priklauso nuo ekstrahuojamų junginių tirpumo, jų koncentracijos ekstrahuojamame objekte, pasirinkto organinio tirpiklio ir tirpiklio tūrio santykio su mėginio mase [20].

Fenolinių junginių ekstrakcija ultragarso pagalba. Ultragarso savybė padidinti organinių junginių ekstrakcijos iš kietų objektų efektyvumą siejama su kavitacijos fenomenu, kuris inicijuojamas ultragarso bangai sklindant tirpikliu. Kavitacijos metu tirpiklyje esantys dujų burbulai sprogsta dėl jų viduje staiga padidėjusio slėgio ir temperatūros. Dujų burbulo sprogimas šalia kieto paviršiaus (pvz. ląstelės sienelės) sukelia staigų tirpiklio judėjimą link ląstelės sienelių, taip didėjant tirpiklio skvarbai į ląstelę bei kontaktinio paviršiaus tarp kietos ir skystos fazės plotui. Kuriant ekstrakcijos ultragarso pagalba metodikas, optimizuojamas ekstrahento poliškumas ir jo kiekis, mėginio masė, ekstrakcijos temperatūra ir laikas bei ultragarso šaltinio parametrai (dažnis ir intensyvumas). Svarbiausi iš šių parametrų yra ekstrakcijos tirpiklis bei jo santykis su vandeniu, ekstrakcijos temperatūra ir laikas [21].

Obuolių mėginių ekstrakcijai naudojant ultragarsą naudojami skirtingi tirpikliai: etanolio ir vandens (70:30 v/v) mišinys, metanolio–vandens–acto rūgšties (30:69:1, v/v/v) mišinys [4]. Vienas pagrindinių ekstrakcijos ultragarsu privalumų – metodą galima taikyti aukštai temperatūrai neatspariems junginiams išskirti, ekstrakcijos trukmė pakankamai trumpa (siekia 10–120 minučių), todėl sumažėja tikimybė suirti augalinės žaliavos biologiškai aktyviems junginiams [21]. Dėl gero atkartojamumo, mažo sunaudojamo tirpiklių kiekio ir žemos ekstrakcijos temperatūros ekstrakcija ultragarso pagalba pritaikoma daugybės skirtingų biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų [24, 25].

Alonso – Salces ir kt. atlikto tyrimo metu fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų vykdoma dviem etapais. Pirmojo etapo metu vykdoma ekstrakcija ultragarso vonelėje naudojant etilacetatą. Nufiltravus netirpų likutį ir iš filtrato išgarinus etilacetatą, tirpus etilacetate sausas likutis ultragarso vonelėje ekstrahuotas dichlormetanu. [24].

Fenolinių junginių ekstrakcija mikrobangų pagalba. Naudojant fenolinių junginių ekstrakciją iš obuolių ėminių mikrobangomis reikšmingai sutrumpinamas ekstrakcijos laikas, sumažinamas sunaudojamų tirpiklių kiekis bei didėja fenolinių junginių išeiga [25]. Pagrindinis ekstrakcijos mikrobangomis metodo privalumas – biologiškai aktyvūs junginiai išekstrahuojami per 10–60 min. sunaudojant 20–50 ml ekstahento kiekį [21, 23].

Fenolinių junginių ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Ekstrakcijos metu naudojami įprasti organiniai tirpikliai, aukštas slėgis ir (arba) aukšta temperatūra. Tai vienas iš modernių kietų mėginių ekstrakcijos metodų. Įprastai, naudojant ekstrakciją suslėgtais skysčiais, kietas mėginys talpinamas į nerūdijančio plieno ekstrakcijos kamerą ir ekstrahuojamas tinkamu tirpikliu, esant aukštai temperatūrai (40 – 200 ºC) ir slėgiui (500 – 3000 psi). Ekstrakcija vykdoma trumpai (5 – 15 min). Ekstrahavimo pabaigoje mėginio ekstraktas suslėgtų dujų pagalba išstumiamas į surinkimo indą [20]. Ekstrakcija superkritiniais skysčiais yra itin perspektyvus metodas, leidžiantis išvengti papildomų ekstraktų valymo etapų, o keičiant metodiką, galima išskirti norimas biologiškai aktyvių junginių grupes [21]. Alonso– Salces ir kt. atliko fenolinių junginių kiekinės ir kokybinės sudėties įvertinimą obuolių minkštimuose ir žievelėse. Fenolinių junginių ekstrakcijai pasirinkta ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Ekstrakcijos tirpiklis – metanolis. Parinkta 40 ºC ekstrakcijos temperatūra, statinės ekstrakcijos trukmė – 5 min., slėgis 1000 psi [15].

Apibendrinant aptartus ekstrakcijos metodus, visi paminėti metodai gali būti potencialiai taikomi fenolinių junginių ekstrakcijai, tačiau dažniausiai obuolių fenoliniams junginiams išskirti yra naudojamas sonifikacijos metodas. Labai svarbu pasirinkti tinkamą ekstrakcijos metodą, ekstrahentą bei ekstrakcijos trukmę siekiant kuo efektyviau ir ekonomiškiau išekstrahuoti didžiausią kiekį fenolinių junginių.

1.4 Obuolių fenolinių junginių biologinis poveikis

Fenolinių junginių svarba žmogaus mitybai ir ligų profilaktikai patvirtinta moksliniais tyrimais. Nustatyta, kad kasdien vartojant didelį kiekį vaisių, daržovių ir neskaldytų grūdų, kuriuose gausu fenolinių junginių, sumažėja daugeliu lėtinių ligų: vėžio, širdies ir kraujagyslių, nutukimo, cukrinio diabeto bei degeneracinių ligų išsivystymo rizika [26]. Fenoliniai junginiai pasižymi plačiu farmakologinio poveikio spektru – antioksidantiniu, uždegimą slopinančiu, antialerginiu, priešvėžiniu, antimikrobiniu (antibakteriniu, priešgrybeliniu, antivirusiniu), vazodilataciniu, antisklerotiniu, antitrombiniu, diuretiniu, spazmolitiniu, antiopiniu, estrogeniniu, neuroprotektiniu, hepatoprotektiniu poveikiais [27].

Antioksidantinis poveikis. Antioksidantai – junginiai, kurie slopina ar sustabdo oksidacijos procesus, neutralizuoja laisvuosius radikalus ir tokiu būdu padeda apsaugoti organizmo ląsteles nuo žalingo oksidacinio streso poveikio. Oksidacinis stresas sukelia fermentų, baltymų, DNR ir lipidų oksidacinius pažeidimus bei skatina lėtinių ligų atsiradimą ir vystymąsi [29, 30].

Fenolinių junginių antioksidantines savybes paaiškinamos šiais mechanizmais:

1) Fenoliniai junginiai turi mažą oksidacijos – redukcijos potencialą. To pasekoje efektyviai surišami hidroksilo, vandenilio peroksido, superoksido, alkoksilo, peroksilo, azoto oksido ir peroksinitrilo radikalai [29].

2) Fenoliniai junginiai gali aktyvuoti II fazės detoksifikuojančių NAD(P)H–kvinono oksidoreduktazės, glutationo Stransferazės ir UDP–gliukuronoziltransferazės. Taip organizmas apsaugomas nuo elektrofilinių toksinų ir oksidacinio streso sukeltų pažeidimų ir genų, koduojančių antioksidantinių glutationo peroksidazės, katalazės ir superoksido dismutazės fermentų ekspresijos [27].

3) Fenoliniai junginiai slopina fermentus, inicijuojančius uždegimus. Flavonoidai taip pat gali slopinti ciklooksigenazes, lipoksigenazes, mikrosominę monooksigenazę mitochondrijų sukcinoksidazę, NADH oksidazę, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų susidaryme [29, 30].

4) Fenoliniai junginiai pasižymi gebėjimu surišti metalų jonus (ypač Fe2+ _{ir Cu}+_{), dėl to}

nutraukiamos Fentono ir Haberio – Veiso reakcijos. Ląsteles apsaugomos nuo reaktyvių laisvųjų radikalų sukeltos oksidacijos. Įrodyta, kad kvercetinas sudaro kompleksinius junginius su dvivalenčiu kadmiu ir pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu in vitro tyrimuose, todėl gali būti potencialus priešnuodis apsinuodijus kadmiu [29].

5) Fenoliniai junginiai pasižymi gebėjimu regeneruoti α–tokoferolį iš α–tokoferolio radikalo. Pavyzdžiui, kvercetinas gali apsaugoti vitaminą E, esantį mažo tankio lipoproteinuose, surišdamas laisvuosius radikalus [29].

Obuoliuose nustatyto procianidino B2 antioksidacinis poveikis yra stipriausias. Silpnesniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi hiperozidas ir chlorogeno rūgštis, silpniausiu – floridzinas [2].

Turkijoje vykusiame tyrime senjorai suvalgydavo 2g/kg per parą šviežių obuolių. Tyrime lygintas eritrocitų ir plazmos antioksidantinis aktyvumas prieš ir po tyrimo. Nustatyta, kad obuolių vartojimas padidina antioksidantinių fermentų, įskaitant superoksido dismutazes ir glutationo peroksidazes, aktyvumą eritrocituose ir bendrą antioksidantinį potencialą plazmoje. Fermentų padidėjimas rodo, kad kasdieninis obuolių vartojimas mažina oksidacijos procesus organizme [31].

Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Flavonoidai apsaugo kraujagyslių endotelio ląsteles, didina azoto oksido išsiskyrimą, atpalaiduoja kraujagysles, mažina kraujospūdį bei pagerina arterijų standumą [32]. Teigiamas flavonoidų poveikis endotelio funkcijai paaiškinamas dviem mechanizmais:

1. Flavonoidai patekę į organizmą yra metabolizuojami į fenolines rūgštis, kurios pasižymi radikalus neutralizuojančiu poveikiu.

2. Flavonoidai yra oksidazių inhibitoriai, kurie sukelia superoksido anijono radikalų susidarymą. Flavonoidai ir jų metabolitai turi uždegimą slopinantį poveikį bei antioksidantinį aktyvumą, sumažina reaktyvių deguonies/azoto formų gamybą ir tokiu būdu sustiprina endotelio funkciją [33].

Atlikti tyrimai su gyvūnais ir žmonėmis parodė, kad kasdieninis obuolių vartojimas mažina bendro cholesterolio, mažo tankio lipoproteinų ir didina didelio tankio lipoproteinų koncentraciją kraujo plazmoje. Suomių mokslininkai, analizuodami mitybos įpročius išsiaiškino, kad tie, kurie valgė (> 47 g/d) obuolius rečiau patyrė miokardą infarktą. Šias obuolių savybes apsprendžia flavonoidai ir pektinai, kurie kartu ar atskirai veikia lipidų metabolizmą taip sumažina padidėjusio cholesterolio kiekį kraujyje. Mokslininkai nustatė, kad per dieną reikia suvalgyti maždaug tris obuolius [34].

Priešvėžinis poveikis. Fenolinių junginių antioksidantinės savybės siejamos su priešvėžiniu poveikiu. Fenoliniai junginiai slopina vėžinių ląstelių augimą, matrikso metaloproteinazių (MMP) sekreciją, navikinių ląstelių proliferaciją, inhibuoja baltymų kinazės aktyvumą, pasižymi antiangiogeninėmis savybėmis bei skatina vėžinių ląstelių apoptozę. Chlorogeno rūgštis in vitro slopina mutageniniu ir kancerogeniniu poveikiu pasižyminčių junginių susidarymą [35].

Atlikti tyrimai su gyvūnais įrodo, kad obuoliai gali apsaugoti nuo odos, krūties ir storosios žarnos vėžio, o epidemiologiniai tyrimai parodė, kad kasdien valgant bent vieną obuolį sumažėja rizika susirgti

plaučių ir storosios žarnos vėžiu [3]. Lenkijoje atliktas tyrimas su žmonėmis (592 onkologiniai ligoniai ir 765 sveiki ligoniai) parodė, kad obuolius valgę tyrimo dalyviai sumažino riziką susirgti žarnyno vėžiu daugiau nei 50 proc [36].

Uždegimą slopinantis poveikis. Flavonoidai moduliuoja arachidono rūgštį metabolizuojančių fermentų ciklooksiginazės (COX), 5–lipooksigenazės (LOX) ir fosfolipazės A2, veikimą, azoto oksidą (NO) gaminančio fermento veiklą ir azoto oksido sintezę [37]. In vitro tyrimai parodė, kad obuolių sulčių ekstraktas žymiai slopina NF–kB reguliuojamų prouždegimo genų (TNF–α, IL–1β, CXCL 9, CXCL 10) ekspresiją, uždegimo atitinkamų fermentų (COX–2, CYP3A4) ir transkripcijos faktorių ekspresiją (STAT1, IRF1) [13].

Antidiabetinis poveikis. Kvercetinas yra fermento aldozės reduktazės inhibitorius, kuris konvertuoja gliukozę į sorbitolį žmogaus organizme [38]. Atliktas tyrimas, kurio metu tiriamieji valgydavo iki 6 obuolių per savaitę. Palyginus gautu duomenis pastebėta, kad rizika susirgti 2 tipo cukriniu diabetu sumažėjo 27 proc. [31].

1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Lietuvos klimato sąlygomis auginamų obuolių fenolinių junginių fitocheminės sudėties tyrimų nėra atlikta. Tikslinga ištirti Lietuvoje auginamų skirtingų veislių obelų vaisių sudėties įvairavimą taikant šiuolaikinius analizės metodus. Atlikti tyrimai pateiks naujos informacijos apie Lietuvoje auginamų obuolių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, leis moksliniu požiūriu įvertinti galimybę panaudoti obuolius praktinės medicinos poreikiams, įvairių ligų prevencijai, individualių, specifiniu biologiniu poveikiu pasižyminčių, junginių išskyrimui, maisto papildų ir kitų produktų su obuolių ekstraktais, turtingais fenolinių junginių, gamybai.

Obuoliai šiuo metu tyrinėjami dėl savo plataus biologinio poveikio žmogaus sveikatai. Obuoliai yra nebrangūs, prieinami kiekvienam, puikus natūralių antioksidantų šaltinis bei perspektyvi augalinė žaliava maisto papildų gamybai. Papildžius mitybą funkciniu maistu, kuriame gausu natūralių antioksidantų, galima užkirsti kelią lėtinių ligų atsiradimui ir vystymuisi, pagerinti protinę ir fizinę savijautą. Fenoliniai junginiai pasižymi įvairiapusiu biologiniu aktyvumu. Plačiausiai ištyrinėti šie poveikiai: priešvėžinis, priešbakterinis, uždegimo slopinamasis bei širdies ir kraujagyslių sistemą apsaugantis poveikis.

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrimas buvo atliktas su šiais Lietuvoje nuo seno auginamų veislių obuolių ėminiais: 'Koštelė', 'Sierinka', 'Paprastasis Antaninis', 'Biržuvėnų žieminis', 'Golden Russet', 'Jono pepinas', 'Lietuvos pepinas'. Mėginiai paruošti Lietuvoje, Babtuose, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centro (LAMMC) filiale, Sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentiniame sode.

Obuolių fenolinių junginių kokybės ir kiekinės sudėties tyrimams obuolių ėminiai rinkti 2017 m. Bandymai atliekami 2017 – 2019 metais.

2.2 Tyrimo metu naudoti reagentai

Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai, tirpikliai bei standartai: etanolis (96,3 proc. V/V) (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin–Ciocalteu fenolio reagentas („Sigma–Aldrich Chemie GmbH“, Buchsas, Šveicarija), natrio karbonatas („Carl Roth“, Karlsruhas, Vokietija), acto rūgštis („SigmaAldrich Chemie GmbH“, Buchsas, Šveicarija), aliuminio (III) chlorido heksahidratas („Sigma– Aldrich Chemie“, Steinheimas, Vokietija), heksametilentetraminas („Lachema“, Čekija), natrio acetato trihidratas („Scharlau“, Ispanija), TPTZ (2,4,6–tripiridil–s–triazinas) (Carl Roth, Karlsruhas, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Vaseline–Fabrik Rhenania“, Bonnas, Vokietija), DPPH (2,2– difenil–1pikrilhidrazilas) („Carl Roth“, Karlsruhas, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis iš „Sigma– Aldrich Chemie GmbH“ (Buchsas, Šveicarija), TFPH (trifluorperazino dihidrochloridas) („Sigma– Aldrich Chemie“, Steinheimas, Vokietija), Trolox® (troloksas) 6–hidroksi–2,5,7,8–tetrametilchroman– 2–karboksilinė rūgštis („Fluka“, Seelzas, Vokietija), sieros rūgštis (95 proc. V/V) („Chempur“, Lenkija), natrio 2,6–dichlorfenolindofenoliatas („Sigma–Aldrich Chemie“, Buchsas, Šveicarija), natrio hidroksidas gautas („Chempur“, Lenkija); indikatorius fenolftaleinas („Sigma–Aldrich Chemie“, Buchsas, Šveicarija). Tyrimų metu naudotas išgrynintas dejonizuotas vanduo ruoštas Milli–Q® („Millipore“, Bedfordas, JAV) vandens valymo sistema.

2.3 Tyrimo metu naudota aparatūra

Susmulkinti obuoliai liofilizuoti ZIRBUS sublimacinėje džiovykloje 3×4×5/20 („ZIRBUS technology“, Bad Grundas, Vokietija). Liofilizuoti obuoliai susmulkinti į miltelius, naudojant elektrinį malūnėlį „Retsch GM 200 mill“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija).

Augalinėms žaliavoms, susmulkintiems liofilizuotiems milteliams ir reagentams sverti naudotos elektroninės analitinės svarstyklės „Sartorius CP64–0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Obuolių ėminių fenolinių junginių ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Bandelin Sanorex Digital 10P“ („Bandelin Electronic GmbH & Co. KG”, Berlynas, Vokietija). Filtracija atlikta vakuuminiu siurbliu „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor WELCH“ (Skokie, JAV), naudoti filtro popierėliai „Filtrak GmbH“ (Niederschlag, Vokietija), mikropipetės „Eppendorf Research“ (JAV). Ištraukų kokybinei ir kiekinei analizei atlikti naudotas chomatografas „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV).

2.4 Tiriamųjų obuolių ėminių paruošimas

Tyrimams paimta po 20 visiškai sunokusių kiekvienos veislės ('Koštelė', 'Sierinka', 'Paprastasis Antaninis', 'Biržuvėnų žieminis', 'Golden Russet', 'Jonopepinas', 'Lietuvos pepinas') obuolių. Obuoliai supjaustyti į vienodo dydžio griežinėlius (iki 1 cm storio), pašalinami koteliai bei sėklos.Griežinėliai užšaldyti -35°C temperatūroje šaldiklyje su oro cirkuliacija ir džiovinti liofilizatoriuje „Zirbus“ (Vokietija). Liofilizacija vykdyta 0,01 mbar slėgyje, kondensoriaus temperatūra -85°C. Liofilizuoti obuolių griežinėliai sumalti į miltelius, naudojant elektrinį malūną „Retsch“ 200 (Vokietija). Ėminiai laikyti sandariai uždarytuose stikliniuose induose, tamsoje.

2.5 Tiriamųjų obuolių ėminių nuodžiūvio nustatymas

Nuodžiūvis nustatytas Europos farmakopėjos Ph.Eur.01/2008: 20232 reikalavimus atitinkančiu metodu [39]. Vienas gramas mėginio džiovinta 105℃ temperatūroje džiovinimo spintoje („Swiss quality“, Planegas, Vokietija), kad visiškai išgaruotų drėgmė ir lakieji junginiai. Masės skirtumas tarp

svėrimų iki 0,01 g. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai liofilizuotai žaliavai. Nuodžiūvis (proc.) skaičiuojamas naudojantis formule:

𝑋 =(𝑚 − 𝑚1)

𝑚 × 100, proc. Čia:

m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g) m1 – žaliavos masė po džiovinimo (g)

2.6 Tiriamųjų obuolių ištraukų paruošimas

Atsveriama 2,5 g (tikslus svėrinys) liofilizuotų obuolių miltelių, užpilama 30 ml 70 proc. (v/v) etanoliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje „Sonorex Digital 10 P“ („Bandelin electronic GmbH“, Vokietija) 20 min. 40°C temperatūroje sandariai uždarytuose stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 480 W, dažnis – 35000 Hz. Gautas ekstraktas filtruojamas per popierinį filtrą, obuolių liofilizatas esantis ant filtro du kartus praplaunamas po 10 ml 70 proc. (v/v) etanolio į 50 ml matavimo kolbutę ir paskiedžiama 70 proc. (v/v) etanoliu iki žymės. Prieš ESC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus („Carl Roth GmbH“, Vokietija).

2.7 Tyrimo metodai

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriškai, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Imama 0,2 ml tiriamojo ekstrakto ir praskiedžiama 4 ml 96 proc. (V/V) etanoliu, sumaišoma. Į praskiestą ekstraktą įpilama 5 ml Folin – Ciocalteau reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas tokiu pat būdu, tik vietoj 0,2 ml ekstrakto įpilama distiliuoto vandens.

Pagaminti tirpalai gerai sumaišomi ir paliekami tamsioje vietoje. Po 60 min. spektrofotometru matuojamas tirpalų šviesos absorbcijos dydis esant 765 nm bangos ilgiui. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas pagal galo rūgšties kalibracijos lygtį (R2_=0,9868)

𝑦 = 2,2209𝑥 + 0,036

Galo rūgšties koncentracijos ribos 0 – 5 mg/ml. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg GRE/g), perskaičiuotas galo rūgšties ekvivalentu, apskaičiuojamas pagal formulę:

𝐶 =𝑐 × 𝑉

𝑚 , mg GRE/g Čia:

C – bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais, mg GRE/g; c – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml;

V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;

m – ekstrakcijai atsvertas tikslus augalinės žaliavos kiekis, g.

Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustomas spektrofotometrijos būdu.

Mėginio paruošimas. Mėginys gaminamas 10 ml volumetrinėje kolbutėje. Kolbutėje 0,1 ml etanolinės ištraukos skiedžiama 0,9 ml 50 proc. (v/v) etanoliu, pridedama 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml Arnow reagento (10 proc. natrio molibdato vandeninis tirpalas ir 10 proc. natrio nitrito vandenis tirpalas sumaišyti santykiu 1:1), 2 ml 8,5 proc. NaOH. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio.

Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 0,1 ml etanolinės ištraukos, 0,9 ml 50 proc. (v/v) etanolio, 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml NaOH ir praskiedžiama iki brūkšnio. Spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis.

Kalibravimo grafikas (R² = 0,9947, 𝑦 = 0,5349𝑥 + 0,0767) sudarytas, naudojant 0,0625 – 1 mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:

𝐶 =𝑐 × 𝑉

Čia:

C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, mg CRE/g;

c – chlorogeno rūgšties koncentracija koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;

m – ekstrakcijai atsvertas tikslus augalinės žaliavos kiekis, g.

Antioksidantinio aktyvumo nustatymas. Obuolių etanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu (TE). TE atitinka trolokso koncentraciją (μM), turinčią tokį patį antioksidantinį aktyvumą, kaip vienas gramas augalinės žaliavos. TE reikšmė (μmol/g) apskaičiuojama pagal formulę:

𝑇𝐸 = 𝐴 + 𝑏 𝑎 × 1000×

𝑉

𝑚, µmol TE/g Čia:

A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis;

a – nuokrypis iš trolokso kalibracinės kreivės lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinės kreivės lygties; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;

m – ekstrakcijai atsvertas tikslus augalinės žaliavos kiekis, g.

Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas DPPH• (2,2–difenil–1–pikrilhidrazilo) laisvųjų radikalų surišimo metodu. DPPH metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas redukuoti violetinės spalvos DPPH radikalus į blankiai geltonos spalvos hidraziną.

Darbinio DPPH tirpalo paruošimas. 0,0017 g DPPH reagento (tikslus svėrinys) ištirpinama 96,3 proc. (V/V) etanolyje, 100 ml matavimo kolbutėje.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į mėgintuvėlį įpilama10 μl tiriamojo ekstrakto ir 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Gerai sumaišoma ir laikoma tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min. Po 30 min. laikymo tamsoje, spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos sumažėjimas esant 517 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – 96,3 proc. (V/V) etanolis. Antiradikalinis obuolių ekstraktų aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas (μmol/g) (R² = 0,99232):

𝑦 = 0,00002𝑥 + 0,05255 Trolokso koncentracijos ribos 0 – 2700 μM.

Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų – katijonų surišimo metodu. Gaminamas 2 mmol/l ABTS•+ motininis tirpalas. 0,0548 g ABTS (2,2’–azino–bis–(3– etilbenzotiazolin–6–sulfoninė rūgšties) miltelių tamsaus stiklo buteliuke ištirpinami 50 ml išgrynintojo vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K2S2O8. Pagamintas motininis ABTS tirpalas laikomas

tamsoje 16 val., kol vyksta oksidacijos – redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+ . Susidaręs radikalas – katijonas išlieka stabilus 2 paras, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje.

Darbinis ABTS•+ tirpalas gaminamas motininį tirpalą skiedžiant išgrynintuoju vandeniu, kol, esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03.

Mėginio paruošimas: 3 µl obuolių vaisių etanolinės ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio ABTS•+

tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min, po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo. Antiradikalinis obuolių ekstraktų aktyvumas nustatomas pagal trolokso (naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus) kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas TE, μmol/g (R2_=0,9640):

𝑦 = 0,00005x −0,00609

Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas TFPH•+ (trifluorperazino dihidrochlorido) radikalų – katijonų surišimo metodu. TFPH metodu įvertinamas antioksidantų, esančių tiriamajame ekstrakte, gebėjimas redukuoti oranžiniai raudonos spalvos TFPH radikalus–katijonus į bespalvį TFPH sulfoksidą.

Pradinio tirpalo paruošimas. 0,480 g (tikslus svėrinys) TFPH reagento ištirpinama išgrynintame vandenyje 10 ml matavimo kolbutėje. Kolbutės turinys gerai išmaišomas ir laikomas 20 min. tamsoje. Darbinio TFPH tirpalo paruošimas. Į 100 ml matavimo kolbutę įpilama 0,5 ml pradinio TFPH tirpalo, 0,1 ml 100 mM K2S2O8 tirpalo ir 70 ml 4 M sulfato rūgšties, gerai sumaišoma ir iki 100 ml žymės pripilama 4 M sulfato rūgšties. Gautas tirpalas laikomas tamsoje, maždaug 15–20min.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į mėgintuvėlį įpilama 10 μl tiriamojo ekstrakto ir 3 ml darbinio TFPH tirpalu. Gerai sumaišoma ir laikoma tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30min. Po 30 min. laikymo tamsoje, spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos sumažėjimas esant 502 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – 4M sieros rūgštis. Antiradikalinis obuolių ekstraktų aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas TE, μmol/g (R² = 0,992264)

𝑦 = 0,000034x + 0,134898 Trolokso koncentracijos ribos 0 – 2000 μM.

Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo metodu. FRAP metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas redukuoti Fe (III) į Fe (II).

FRAP reagento sudėtis: A. 300 mM natrio acetato buferinis tirpalas (pH = 3,6) B. 10 mM TPTZ (2,4,6–tripiridil–s–triazino) tirpalas 40 mM vandenilio chlorido rūgštyje C. 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.

Darbinio FRAP tirpalo paruošimas. Darbinis FRAP reagento tirpalas ruošiamas prieš pat tyrimą, sumaišant A, B ir C reagentus, santykiu 10:1:1.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į mėgintuvėlį įpilama 10 μl tiriamojo ekstrakto ir 3 ml darbinio FRAP reagento tirpalo. Gerai sumaišoma ir laikoma tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 90 min. Po 90 min. spektofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos sumažėjimas esant 593 nm bangos ilgiui.

Lyginamasis tirpalas – FRAP reagentas. Redukcinis obelų vaisių ekstraktų aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas TE, (μmol/g) (R² = 0,999653).

𝑦 = 0,000033𝑥 + 0,033382 Trolokso koncentracijos ribos 0 – 8000 μM.

Obuolių ėminių fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė. Analizė atlikta naudojant chromatografą „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV), sujungtą su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV). Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta taikant mokslinėje literatūroje aprašytą validuotą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką [18].

2.8 Tyrimo duomenų analizė

Tyrimo duomenų statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2013” („Microsoft”, Redmondas, JAV) ir „SPSS 20.0“ („SPSS Inc.“, Čikaga, JAV) kompiuterines programas. Visi ESC analizės metu gauti rezultatai pateikiami kaip trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis ± standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirtingų veislių obuolių, jų luobelių ir minkštimų ėminių nustatyti pritaikius vienfaktorinę dispersinę analizę – ANOVA ir daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Skirtumai laikomi reikšmingais esant p<0,05 reikšmei. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimui skirtingose veislėse nustatyti apskaičiuoti variacijos koeficientai.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas senųjų veislių obuolių

ėminiuose

Vertinant obuolių kokybę svarbu nustatyti fenolinių junginių kiekinę sudėties įvairavimą. Fenoliniai junginiai yra viena svarbiausių augalinių biologiškai aktyvių junginių grupių, turinti didelį teigiamą poveikį žmogaus organizmui. Fenolinių junginių kiekinės sudėties analizė svarbi obuolius vartojant ne tik mitybai, bet ir gaminant obuolių produktus bei maisto papildus [2].

Atlikti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų senųjų obelų veislių 'Antaninis', 'Jono pepinas', 'Lietuvos pepinas', 'Biržuvėnų žieminis', 'Koštelė', 'Sierinka', 'Golden Russet' obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimai. Obuolių vaisių fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimui pasirinktas spektrofotometrinis metodas naudojant Folin–Ciocalteu reagentą. Metodas grindžiamas fenolinių junginių reakcija su fosfomolibdato ir fosfovolframo rūgščių kompleksu šarminiame tirpale [2].

1 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas obuolių ėminiuose. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p <0,05)

Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas pateiktas 1 pav. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (7,97±0,17 mg GRE/g,) nustatytas 'Koštelės' veislės obuolių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo bendro fenolinių junginių kiekio (7,91±0,21 mg GRE/g) nustatyto 'Sierinkos' veislės obuolių ėminiuose. Mažesni fenolinių junginių kiekiai nustatyti – 'Paprastojo antaninio' (6,88±0,19 mg GRE/g), 'Lietuvos pepino' (6,60±0,01 mg GRE/g), 'Biržuvėnų žieminio' (6,33±0,11 mg

B C D A D B,C A 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' B en d ras fenolini ų junginių kiekis , mg GRE /g Veislė

GRE/g) veislių obuolių ėminiuose. Mažiausas bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas 'Jono pepinas' ir 'Golden Russet' veislių obuolių ėminiuose (atitinakamai 4,49±0,11 mg GRE/g ir 4,38±0,24 mg GRE/g). JAV mokslininkai, ištyrę šioje šalyje populiarių veislių ('Idared', 'Rome Beauty', 'Cortland' ir 'Golden Delicious') obuolių ėminius, nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 3,06±0,67 mg GRE/g iki 5,88±0,83 mg GRE/g [42].

Apibendrinant tyrimo rezultatus, galima daryti preliminarią išvadą, kad 'Koštelė' ir 'Sierinka' veislių obuoliuose sukaupiami didesni fenolinių junginių nei kitų veislių obelų vaisiuose. Norint išsiaiškinti tirtų veislių obuolių ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą, būtina taikyti skirstymo metodus.

2 pav. Senųjų veislių obuolių ėminių bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių

ėminių (n=3, p<0,05)

Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis (12,12±1,68 mg CRE/g, p<0,05) nustatytas 'Koštelės' veislės obuolių ėminiuose. Mažesni kiekiai nustatyti 'Sierinka' (7,82±0,09 mg CRE/g), 'Jono pepinas' (6,73±1,02 mg CRE/g), 'Golden Russet' (6,67±1,39 mg CRE/g). 'Biržuvėnų žieminis' (6,58±0,3 mg CRE/g) veislių obuolių ėminiuose. Mažiausias hidroksicinamono darinių kiekis (5,76±0,37 mg CRE/g) nustatytas 'Lietuvos pepino' veislės obuolių ėminiuose (2 pav.).

C, D _D C A B, C E B 0 2 4 6 8 10 12 14 16 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' Hi d rok sicin am on o rū gštie s d ar in ių k ieki s, m g CR E /g Veislė

3.2 Senųjų obuolių veislių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in

vitro nustatymas

Norint tinkamai įvertinti tiriamojo mėginio antioksidacinį aktyvumą in vitro paprastai taikoma keletas skirtingų metodų. Augaliniai ekstraktai yra daugiakomponentės matricos, turinčios skirtingos struktūros biologiškai aktyvių junginių. Jų antioksidacinis aktyvumas pasireiškia skirtingais reakcijų mechanizmais, todėl negali būti pilnai įvertinamas vienu metodu [40].

Lietuvos senųjų veislių obuolių vaisių etanolinių ištraukų antiradikalinio aktyvumas įvertintas DPPH, ABTS ir TFPH metodais. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimui pasirinktas spektrofotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas, kuris yra techniškai paprastas, greitas ir pakankamai tikslus. Metodas remiasi antioksidantų gebėjimu redukuoti violetinės spalvos DPPH radikalus į blankiai geltonos spalvos hidraziną [23]. Lyginant su kitais antiradikalinio aktyvumo metodais (pavyzdžiui, ABTS), DPPH radikalas yra stabilus, gyvuoja ilgą laiko tarpą bei prieš naudojimą jo nereikia aktyvinti, pakanka ištirpinti reikiamą jo kiekį. Antioksidantinio aktyvumo tyrimo rezultatai, nustatyti DPPH metodu, pateikti 3 paveiksle.

3 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas, nustatytas spektrofotometriniu DPPH metodu. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių

ėminių (n=3, p<0,05) D C B A E C B 0 100 200 300 400 500 600 700 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' Antir ad ik ali n is ak tyvum as , µ m ol TE /g Veislės

Stipriausias antiradikalinis aktyvumas (580,69±12,58 µmol TE/g, p<0,05), surišant DPPH• radikalus, nustatytas ištyrus 'Koštelės' veislės obuolių ėminių ištraukas. Silpniausias antiradikalinis aktyvumas (384,31±18,09 µmol TE /g, p<0,05) šiuo metodu nustatytas ištyrus veislės 'Jono pepino' obuolių ėminių ištraukas.

Stipriausias ABTS metodu įvertintas antiradikalinis aktyvumas (605,41±12,00 µmol TE/g, p0,05) nustatytas ištyrus 'Sierinka' veislės obuolių ėminių ištraukas, o silpniausias – ištyrus 'Jono pepino' ir Lietuvos pepino veislių obuolių ištraukas (atitinkamai 221,16±6,67 µmol TE/g ir 248,45±6,32 µmol TE/g). Statistiškai patikimo skirtumo tarp 'Jono pepino' ir 'Lietuvos pepino' veislių obuolių ėminių ištraukų nenustatyta (4 pav.).

4 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas obuolių ėminiuose, nustatytas spektrofotometriniu ABTS metodu. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus

tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p<0,05)

Stipriausias TFPH metodu įvertintas antiradikalinis aktyvumas nustatytas 'Sierinkos' (342,76±11,32 µmol TE/g), 'Koštelės' (336,28±13,49 µmol TE/g) ir 'Jono pepino' (328,95±2,24 µmol TE/g) veislių obuolių ėminiuose, statistiškai patikimo skirtumo tarp šių veislių obuolių ėminių ištraukų nenustatyta. Silpniausias antiradikalinis aktyvumas (206,73±2,57 µmol TE/g, p<0,05) nustatytas ištyrus 'Biržuvėnų žieminio' veislės obuolių ėminių ištraukas (5 pav.).

B, C _C C B D D A 0 100 200 300 400 500 600 700 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' Antir ad ik ali n is ak tyvum as, µ m ol TE /g Veislė

5 pav Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas obuolių ėminiuose, nustatytas

spektrofotometriniu TFPH metodu. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p<0,05)

Apibendrinant galima teigti, kad stipriausiu antiradikaliniu aktyvumu, naudojant ABTS bei TFPH metodus, pasižymėjo 'Sierinka' veislės obuolių ėminių ištraukos, tačiau DPPH metodu – 'Koštelė'. 'Jono pepinas' pasižymėjo silpniausiu antiradikaliniu aktyvumu atliekant DPPH bei ABTS metodus, o TFPH metodu silpniausias antiradikalinis aktyvumas pastebėtas 'Biržuvėnų žieminis' veislės ėminiuose.

Redukcinio aktyvumo įvertinimui pasirinktas spektrofotometrinis FRAP metodas, kuris remiasi antioksidantų gebėjimu rūgštinėje terpėje redukuoti geltonos spalvos geležies 2,4,6–tripiridil–s–triazino [Fe(III)(TPTZ)2]3+ kompleksą į intensyviai mėlynos spalvos [Fe(II)–(TPTZ)2]2+ kompleksą. FRAP

metodui būtina sudaryti rūgštines sąlygas (pH 3,6), kad nesusidarytų [Fe(III)–(TPTZ)2]3+ komplekso

nuosėdos. Redukcinio aktyvumo tyrimo rezultatai, nustatyti FRAP metodu, pateikti 6 paveiksle.

B D C A _A C A 0 50 100 150 200 250 300 350 400 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' Antir ad ik ali n is ak tyvu m as , µ m ol T E /g Veislė

6 pav. Redukcinio aktyvumo įvairavimas obuolių ėminiuose, nustatytas

spektrofotometriniu FRAP metodu. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p<0,05)

Stipriausias redukcinis aktyvumas nustatytas ištyrus 'Sierinkos' ir 'Paprastojo antaninio' veislės obuolių ėminių ištraukas (atitinkamai 147,89±0,97 µmol TE/g ir 147,64±0,93 µmol TE/g), statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių veislių obuolių ėminių ištraukų nenustatyta. Silpniausias redukcinis aktyvumas (83,81±2,21 µmol TE/g) nustatytas ištyrus 'Biržuvėnų žieminio' veislės obuolių ėminių ištraukas. Statistiškai patikimo skirtumo nenustatyta tarp 'Biržuvėnų žieminio', 'Jono pepino' (86,48±0,44 µmol TE/g) bei 'Lietuvos pepino' (87,43±0,65 µmol TE/g) veislės obuolių ėminių ištraukų redukcinio aktyvumo (6 pav.).

3.3 Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas obuolių

vaisiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Analičių chromatografinė analizė (skirstymas, detekcija, identifikavimas ir kiekinis nustatymas) yra svarbus biologiškai aktyvių junginių analizės žingsnis. Remiantis literatūros duomenimis, tiriamųjų obuolių ėminių fenolinių junginių kokybiniam ir kiekiniam nustatymui pasirinkta efektyvioji skysčių

A D C B C, D C, D A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 'Paprastasis antaninis' 'Biržuvėnų

žieminis' 'GoldenRusset'

'Koštelė' 'Jono pepinas' 'Lietuvos pepinas' 'Sierinka' R edu kcini s aktyv um as, µ m ol T E /g Veislė

chromatografija detekcijai naudojant fotodiodų matricos detektorių. ESC metodas pasižymi labai geru atkartojamumu, aukštą skiriamąja geba. Chromatografinė augalų ekstraktų analizė suteikia galimybę nustatyti chemotaksonominius analitinius žymenis, kurie svarbūs naujų kultūrinių veislių apibūdinimui ir įteisinimui, augalinių produktų kokybės užtikrinimui ir falsifikavimo kontrolei [41].

Tirtų veislių obuolių ėminių ištraukose intenfikuoti ir kiekiškai nustatyti šie junginiai: procianidinas B1, (+)-katechinas, chlorogeno rūgštis, procianidinas B2, (-)-epikatechinas, procianidinas C1, rutinas, hiperozidas, izokvercetrinas, reinotrinas, avikuliarinas, kvercitrinas, floridzinas. Obuolių ėminio ištraukos chromatograma pateikta 7 pav.

7 pav. Obuolių ėminio ištraukos ESC chromatograma (veislė 'Koštelė', λ=280 nm): 1 – procianidinas B1, 2 – (+)–katechinas, 3 – chlorogeno rūgštis, 4 – procianidinas B2, 5 – (-)–

epikatechinas, 6 – procianidinas C1, 7 – rutinas, 8 – hiperozidas, 9 – izokvercitrinas, 10 – reinotrinas, 11 – avikuliarinas, 12 – kvercitrinas, 13 – floridzinas

Kitų mokslininkų atliktos ultra  efektyviosios skysčių chromatografijos su tandemine masių spektrometrija analizės metu obuolių ėminiuose identifikuoti šie fenoliniai junginiai: apigeninas, liuteolinas, izoramnetinas ir jo glikozidai, kemferolio glikozidai, miricetinas, epigalokatechinas, floretinas.

Obuolių ėminių ištraukose tarp visų kiekiškai įvertintų junginių, didžiausias kiekis nustatytas chlorogeno rūgšties (8 pav.), kurios kiekis svyravo nuo 1,20±0,05 mg/g ('Jono pepinas') iki 2,35±0,10 mg/g ('Lietuvos pepinas').

8 pav. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas obuolių ėminiuose. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p<0,05)

Identifikuoti 6 kvercetino glikozidų grupės junginiai – hiperozidas, rutinas, izokvercetinas, reinotrinas, avikuliarinas, kvercetrinas (9 pav). Tarp jų vyravo hiperozidas, jo kiekis svyravo nuo 0,016±0,001 mg/g ('Golden Russet') iki 0,19±0,008 mg/g ('Koštelė'). Jis sudarė 18,80 – 43,15 proc. visų identifikuotų ir kiekiškai įvertintų kvercetino glikozidų grupės junginių kiekio. Tai patvirtina kitų mokslininkų nurodytos panašios hiperozido kiekinės sudėties varijavimo tendencijos. Šių autorių tirtų veislių ėminiuose hiperozidas sudarė 23 – 33 proc. visų nustatytų kvercetino glikozidų kiekio [42].

9 pav. Kvercetino glikozidų kiekio įvairavimas obuolių ėminiuose (n=3).

C D E B A C A 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Jono pepinas' 'Koštelė' 'Lietuvos pepinas' 'Paprastasis antaninis' 'Sierinka'

C

hl

or

og

eno

rūg

šti

es

k

iek

is

, m

g/

g

Veislė

žieminis' 'GoldenRusset'

'Jono pepinas' 'Koštelė' 'Lietuvos pepinas' 'Paprastasis antaninis' 'Sierinka' K ve rc etr in o gli k oz id ų k ieki s, m g/g Veislė

Obuolių ėminiuose nustatyta katechinų grupės junginių – (+)–katechino ir (-)–epikatechino. Junginių suminis kiekis varijavo nuo 0,10±0,006 mg/g (veislė 'Lietuvos pepinas') iki 0,36±0,009 mg/g (veislė 'Biržuvėnų žieminis'). Užsienio autorių publikacijose nustatyti katechinų grupės junginių kiekiai įvairuoja nuo 0,35 mg/g iki 0,81 mg/g absoliučiai sausos žaliavos [43].

10 pav. Flavan-3-olių grupės junginių įvairavimas obuolių ėminiuose

Obuolių ėminiuose nustatytas floridzino kiekis įvairavo nuo 0,011±0,005 mg/g (veislė 'Biržuvėnų žieminis' ir 'Sierinka') iki 0,30±0,01 mg/g (veislė 'Golden Russet') (12pav.). Tai sudarė 2,96 – 15,44 proc. visų kiekiškai įvertintų fenolinių junginių kiekio.

11 pav. Floridzino kiekio įvairavimas obuolių ėminiuose. Skirtingos raidės žymi statistiškai

reikšmingus skirtumus tarp tirtų obuolių vaisių ėminių (n=3, p<0,05) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Jono pepinas' 'Koštelė' 'Lietuvos pepinas' 'Paprastasis antaninis' 'Sierinka' F lavan -3 -oli ų jun gin ių k ieki s, m g/g Veislė

(+)-Katechinas (-)-Epikatechinas Procianidinas B1 Procianidinas B2 Procianidinas C1

D A B C B C, D 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 'Biržuvėnų žieminis' 'Golden Russet' 'Jono pepinas' 'Koštelė' 'Lietuvos pepinas' 'Paprastasis antaninis' 'Sierinka'

F

lo

ri

dzi

no

,

m

g

/g

Veislė

Kitų mokslininkų tyrimų duomenimis didesni floridzino kiekiai įprastai nustatomi obuolio luobelių ėminiuose ir sudaro 4,5 proc. visų nustatytų fenolinių junginių kiekio [2].

3.4 Rezultatų apibendrinimas

Atlikus Lietuvos klimato sąlygomis auginamų obuolių etanolinių ištraukų sudėties ir antioksidacinio aktyvumo in vitro tyrimus, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą, galima teigti, kad obuolių vaisių fenolinių junginių kiekinė sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas įvairuoja plačiose ribose. Šį įvairavimą galėjo nulemti skirtingas augalų genotipas.

Įvertinus bendrą fenolinių junginių kiekį UV–regimosios šviesos spektrofotmetrijos metodu galima daryti preliminarią išvadą, kad 'Koštelės' ir 'Sierinkos' veislių obuolių ėminiuose nustatyti didesni kiekiai fenolinių junginių nei kitų veislių obuolių ėminiuose. Hidroksicinamono rūgšties dariniai daugiausiai vyrauja 'Koštelė' veislių obuolių ėminiuose.

Atlikus fenolinių junginių analizę ESC metodu, nustatyta, kad chlorogeno rūgštis – vyraujantis junginys visuose obuolių vaisių ėminiuose. Gauti rezultatai patvirtina literatūros duomenis, kad obuolių etanolinėse ištraukose vyrauja chlorogeno rūgštis [2]. Vyraujantis kvercetino glikozidų grupės darinys – hiperozidas (18,80 – 43,15 proc. visų identifikuotų ir kiekiškai įvertintų kvercetino glikozidų junginių kiekio).

Stipriausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas ištyrus 'Sierinkos' bei 'Koštelės' veislės obuolių ėminių ištraukas, o stipriausias redukcinis aktyvumas – ištyrus 'Sierinkos' bei 'Paprastojo antaninio' veislės obuolių ėminių ištraukas.

IŠVADOS

1. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu nustatytas 'Koštelės' (7,97±0,17 mg GRE/g) bei 'Sierinkos' (7,91±0,21 mg GRE/g) veislės obuoliuose. Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas 'Koštelės' vaisių ėminiuose (12,12±1,68 mg CRE/g).

2. Tirtų veislių obuolių ėminiuose vyravo chlorogeno rūgštis. Didžiausias kiekis (2,35±0,10 mg/g) nustatytas ‘Lietuvos pepino' (2,31±0,06 mg/g) 'Sierinka' veislės obuolių ėminiuose. Identifikuoti 6 kvercetino glikozidų grupės junginiai, tarp kurių vyravo hiperozidas. Jis sudarė 18,80 – 43,15 proc. visų identifikuotų ir kiekiškai įvertintų kvercetino glikozidų grupės junginių kiekio. Hiperozido kiekis įvairavo nuo 0,016±0,001 mg/g ('Golden Russet') iki 0,19±0,008 mg/g ('Koštelė').

Identifikuotų flavan–3–olių grupės junginių suminis kiekis varijavo nuo 0,10 mg/g (veislė 'Lietuvos pepinas') iki 0,36 mg/g (veislė 'Biržuvėnų žieminis').

Floridzino kiekis įvairavo nuo 0,011±0,005 mg/g veislėse 'Biržuvėnų žieminis' bei 'Sierinkos' iki 0,30±0,01 mg/g 'Golden Russet' veislės obuolių ėminuose.

3. Stipriausias antiradikalinis aktyvumas in vitro ABTS ir TFPH metodais nustatytas ištyrus 'Sierinka' veislės obuolių ėminių ištraukas (atitinkamai 605,41±12,00 µmol TE/g ir 342,76±11,32 µmol TE/g), DPPH metodu – ištyrus 'Koštelė' (580,69±12,58 µmol TE/g) veislės obuolių ėminių ištraukas.

4. Stipriausias redukcinis aktyvumas in vitro FRAP metodu nustatytas ištyrus 'Sierinkos' ir 'Paprastojo antaninio' veislių obuolių ėminių ištraukas (atitinkamai 147,89±0,97 µmol TE/g ir 147,64±0,93 µmol TE/g).

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

ESC metodu ištyrus Lietuvos klimato sąlygomis auginamų senųjų veislių obelų vaisių ištraukų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, rekomenduojama maistui, maisto papildų, funkcinio maisto ir įvairių kitų produktų gamybai naudoti 'Sierinkos' veislės obuolius. Šios veislės obuolių ėminiuose nustatytas didžiausias suminis identifikuotų fenolinių junginių kiekis. Perspektyvu 'Sierinkos' veislės obelis auginti Lietuvos individualiuose ir pramoniniuose soduose.

Visų tirtų veislių obelų vaisių ėminių ištraukose vyraujantis fenolinis junginys yra chlorogeno rūgštis. Rekomenduojama iš obuolių išskirti chlorogeno rūgštį, kuri galėtų būti vertingas, specifiniu poveikiu pasižymintis biologiškai aktyvus junginys, pritaikomas sveikatinimo tikslais.