MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JOVITA KULIKAUSKAITĖ
KININIO ARBATMEDŽIO (CAMELLIA SINENSIS L.)
POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Lekt. dr. Deividas Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
KININIO ARBATMEDŽIO (CAMELLIA SINENSIS L.) POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Deividas Burdulis Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Jovita Kulikauskaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) apibūdinimas ... 11
1.2 Kininių arbatmedžių paplitimas ir kultivavimas ... 11
1.3 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos arbatų rūšys ... 12
1.4 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos kokybė ... 13
1.5 Kininių arbatmedžių arbatų paruošimas ... 14
1.6 Kininių arbatmedžių arbatų vartojimas ... 15
1.7 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos cheminė sudėtis ... 16
1.8 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos panaudojimas medicinoje... 17
1.9 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos flavonoidų ir rauginių medžiagų apžvalga ... 21
1.9.1 Flavonoidai ... 21
1.9.2 Rauginės medžiagos ... 24
1.10 Laisvieji radikalai, antioksidantai, antiradikalinis aktyvumas ... 25
2 TYRIMŲ METODIKA ... 26
2.1 Tyrimo objektas ... 26
2.2 Naudoti reagentai ir medžiagos ... 26
2.3 Naudota aparatūra ir priemonės ... 27
2.4 Tyrimų metodai ... 27
2.4.1 Nuodžiūvio nustatymas arbatose ... 27
2.4.2 Ekstraktų ruošimo metodika ... 28
2.4.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 28
2.4.4 Raugų kiekio nustatymas ... 29
2.4.5 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 30
2.4.7 Statistiniai analizės metodai, naudoti duomenų apdorojimui ... 32
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
3.1 Arbatų nuodžiūvis ... 33
3.2 Ekstrakcijos metodo optimizavimas kininių arbatmedžių augalinei žaliavai .... 34
3.3 Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingų prekinių ženklų arbatose ... 38
3.4 Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų prekinių ženklų arbatose. ... 41
3.5 Raugų kiekio nustatymas... 43
3.6 Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ... 45
4 IŠVADOS ... 49
5 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51
SANTRAUKA
Jovitos Kulikauskaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Darbo pavadinimas: Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) polifenolinių junginių sudėties įvairavimo tyrimas.
Darbo tikslas - ištirti įvairiose arbatų rūšyse esančio kininio arbatmedžio vaistinės augalinės žaliavos cheminės sudėties kiekybinių rodiklių įvairavimą bei įvertinti antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamiausią flavonoidų ekstrakcijos metodą ir sąlygas kininių arbatmedžių žaliavos ekstrakcijai.
2. Nustatyti flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimą skirtingų prekinių ženklų arbatose.
3. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų prekinių ženklų žaliojoje ir juodojoje arbatose.
4. Ištirti raugų kiekybinės sudėties įvairavimą skirtingų prekinių ženklų žaliojoje ir juodojoje arbatose.
5. Įvertinti iš skirtingų arbatų rūšių gautų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Tyrimo metodai. Bendras flavonoidų kiekis kininio arbatmedžio etanoliniuose ekstraktuose nustatytas spektrofotometriniu metodu, rezultatai išreikšti procentais. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas arbatos ekstraktuose atliktas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Raugų kiekiui nustatyti taikytas titrimetrinis metodas. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, taikant DPPH radikalų surišimo metodą.
Tyrimo rezultatai ir išvados.
Nustatytas vidutinis bendras favonoidų kiekis juodosios arbatos mėginiuose yra 3,05 proc., o žaliosios arbatos – 2,22 proc. Daugiausia flavonoidų ištirta juodojoje birioje „Dilmah“ (3,62 proc.) ir žaliojoje „Lipton“ arbatoje (3,18 proc.). Vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis juodojoje arbatoje – 12,09 (± 3,4) mg GAE/g, žaliojoje – 16,25 (± 3,99) mg GAE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis ištirtas juodojoje „Greenfield“ pakeliais (16,3 (± 0,5) mg GAE/g) ir žaliojoje „Lipton“ (20,67 (± 0,17) mg GAE/g). Daugiausia raugų apskaičiuota žaliojoje „Dilmah“ arbatoje (30,61 ± 0,7 proc.) bei juodojoje „Dilmah“ arbatoje pakeliais (34,39 ± 0,7 proc.). Vidutinis raugų kiekis žaliosios arbatos mėginiuose 25,18 proc. (± 5,02), juodojoje arbatoje 20,56 proc. (± 9,54). Juodosios arbatos vidutinis antiradikalinis aktyvumas siekia 2,56 (± 0,06) mg TE/g. Tuo tarpu žaliosios arbatos ekstraktų vidutinis antiradikalinis aktyvumas yra 2,48 (± 0,07) mg TE/g. Antiradikalinio aktyvumo vidurkių skirtumai tarp juodosios ir žaliosios arbatos nėra statistiškai reikšmingi (p > 0,05).
SUMMARY
Master thesis of Jovita Kulikauskaitė/ supervisor Deividas Burdulis Dr.; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas
Title: composition diversity of polyphenolic compounds of Camellia sinensis L.
Aim of experiment: determine the qualitative and quantitative compositin and evaluate the antiradical capacity of Camellia sinensis L. in various tea samples.
Experiment tasks:
1. To determine the most suitable extraction method and conditions of Camellia sinensis L. samples.
2. To evaluate total flavonoid content quantitive variation of different producer of green and black tea.
3. To determine quantity of total phenolic compounds content of different tea samples. 4. To evaluate quantitative composition dynamics of tannins of different tea samples. 5. To evaluate antiradical activity of green and black tea samples.
Methods. Total amount of flavonoid content of Camellia sinensis L. ethanolic extracts was determined by spectrophotometric method and the results are expressed in percent. The total polyphenol content in green tea and black tea was determined by Folin-Ciocalteu method. For total tannin content the titration methods were applied. The antiradical activity was determined spectrophotometrically by DPPH radical scavenging method.
Results and conclusions.
The total flavonoid content average in black tea samples was 3,05 %, in green tea – 2,22 %. The highest flavonoid content was found in the black tea „Dilmah“ (3,62 %) and in green „Lipton“ tea (3,18 %). The total polyphenol concentration average in black tea was found 12,09 (± 3,4) mg GAE/g, whereas in green tea - 16,25 (± 3,99) mg GAE/g. The highest polyphenol content was found in the black „Greenfield“ (16,3 (± 0,5) mg GAE/g) and in green „Lipton“ (20,67 (± 0,167 mg GAE/g) tea. The highest tannin content found in green „Dilmah“ tea (30,61 ± 0,7 %) and in black „Dilmah“ tea samples (34,39 ± 0,7 %). Average of tannins in green tea samples was 25,18 % (± 5,02), in black tea 20,56 % (± 9,54). The antiradical activity average of black tea samples was 2,56 (± 0,06) mg TE/g, whereas in green tea antiradical activity average was 2,48 (± 0,07) mg TE/g. DPPH radical-scavenging activity averages differences in black and green tea samples was not statistically important (p > 0,05).
PADĖKA
Norėčiau padėkoti darbo vadovui lekt. dr. Deividui Burduliui už suteiktus patarimus ir pasiūlymus rengiant baigiamąjį darbą. Taip pat esu dėkinga Farmakognozijos katedros darbuotojams už pagalbą atliekant eksperimentinius tyrimus.
SANTRUMPOS
DNR – deoksiribonukleorūgštis DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas EC - epikatechinas ECG - epikatechino-3-galatas EGC – epigalokatechinas EGCG - epigalokatechino-3-galatas EP – Europos farmakopėjaFRAP – trivalentės geležies jonų redukcijos jėga GAE – galo rūgšties ekvivalentai
ROS – reaktyviosios deguonies formos SN - standartinis nuokrypis
TE – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia UV - ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Arbata, Camellia sinensis L., laikoma plačiausiai pasaulyje vartojamu gėrimu po vandens. Nors kininis arbatmedis auginamas visame pasaulyje, jis geriausiai auga atogrąžų ir subtropikų srityse, kuriose yra pakankamas kiekis kritulių, gera drenažo sistema, bei šiek tiek rūgštus dirvožemis. [1, 2, 3] Arbatos sudėtis kinta priklausomai nuo kininio arbatmedžio augimo sąlygų, arbatmedžio lapų amžiaus, metų laiko, klimato, sodininkystės ypatumų bei vėlesnio arbatos apdorojimo proceso. [4, 5]
Visos arbatos gaminamos iš tos pačios rūšies augalų, tik skiriasi jų veislės, auginimo sąlygos ir apdorojimas. [6] Gamybos metu žalioji ir juodoji arbata yra apdorojamos skirtingai. Norint pagaminti žaliąją arbatą, ką tik nuskintus lapelius reikia nedelsiant garinti arba kepinti karštose keptuvėse, kad būtų išvengiama fermentacijos proceso ir gaunamas išdžiovintas bei stabilus produktas. Juodoji arbata yra pilnai fermentuota. Fermentacijos proceso metu polifenoliniai junginiai, katechinai, dimerizuojasi suformuodami teaflavinus ir tearubiginus, todėl arbatos gali turėti skirtingą biologinį aktyvumą. [7]
Arbatoje yra beveik 4000 įvairių biologiškai aktyvių junginių, kurių net vieną trečdalį sudaro polifenoliai. Arbatos sukeliamą teigiamą poveikį žmogaus sveikatai, manoma, nulemia fenoliniai junginiai katechinai. Jiems būdingas didelis antioksidacinis aktyvumas, kuris saugo organizmą nuo laisvųjų radikalų sukeliamo oksidacinio streso padarytos žalos. [8] Žaliosios ir juodosios arbatos antioksidantai yra svarbūs ligų prevencijoje. Ištirta, kad jų vartojimas svarbus vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, neurodegeneracinių ligų ir senėjimo procesuose. Arbata tai natūralus ir saugus antioksidantas, kuris pasižymi sveikatą gerinančiomis savybėmis. [9, 10]
Camellia sinensis L. lapai yra naudojami kaip kraujavimą stabdanti priemonė, nes pasižymi
sutraukiančiu poveikiu. Arbata skatina apetitą, gerina virškinimą. Arbatmedžio augalinė žaliava naudojama psoriazės, bronchito, opų ir žaizdų gydymui, mažina karščiavimą, nuovargį, slopina deginimo pojūtį ir bendrą skausmą. [11] Kininio arbatmedžio žaliava plačiai naudojama tyrimuose ir populiari natūraliose tradicinėse medicinos sistemose. [12]
Šiuo metu rinkoje yra gausybė įvairių gamintojų ir rūšių arbatų, kurių savybės yra skirtingos. Tikslinga ištirti Lietuvos rinkoje esančias arbatas ir atrinkti perspektyviausias arbatų rūšis, pasižyminčias didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu ir turinčias optimaliausią cheminę sudėtį.
Darbo tikslas: ištirti įvairiose arbatų rūšyse esančio kininio arbatmedžio vaistinės augalinės žaliavos cheminės sudėties kiekybinių rodiklių įvairavimą bei įvertinti antiradikalinį aktyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - ištirti įvairiose arbatų rūšyse esančio kininio arbatmedžio vaistinės augalinės žaliavos cheminės sudėties kiekybinių rodiklių įvairavimą bei įvertinti antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamiausią flavonoidų ekstrakcijos metodą ir sąlygas kininių arbatmedžių žaliavos ekstrakcijai.
2. Nustatyti flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimą skirtingų prekinių ženklų arbatose.
3. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų prekinių ženklų žaliojoje ir juodojoje arbatose.
4. Ištirti raugų kiekybinės sudėties įvairavimą skirtingų prekinių ženklų žaliojoje ir juodojoje arbatose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) apibūdinimas
Botaninis aprašymas. Karalystė – augalų (Plantae), eilė – erikinių (Ericaceae), šeima – arbatmedinių (Theaceae), gentis – arbatmedinių (Camellia), rūšis – kininis arbatmedis (Camellia
sinensis L.). Kininis arbatmedis yra visžalis daugiametis medis arba krūmas, kuris natūraliai gamtoje
užauga iki 10 - 15 metrų aukščio, o arbatai kultivuojamų arbatmedžių aukštis sieka 0,6 – 1,5 metro. Žalioji ir juodoji arbata gaminama iš kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) lapų. Lapai šviesiai žali, trumpakočiai, kieti, priešiniai, elipsiški - apvalūs arba lancetiški, smulkūs, smailiaviršūniai, lapo kraštas pjūkliškas. Subrendusių lapų paviršius yra lygus, o jauni lapai gali būti su plaukeliais. Lapų ilgis įvairus, nuo 5 iki 30 cm, plotis apie 4 cm. Žiedai taisyklingi, 2,5 - 4 cm skersmens, išsidėsto lapų pažastyse, pavieniai arba susitelkę po 2-3, balti, rečiau rausvi, kvapnūs, taurėlapių ir žiedlapių 5 - 7, stiebeliai 5 - 15 mm ilgio, kuokelių daug. Vaisiai – briaunotos dėžutės su 1 - 5 sėklomis. [8, 13, 14, 15]
1.2 Kininių arbatmedžių paplitimas ir kultivavimas
Pirmieji įrašai apie arbatos auginimą ir naudojimą randami dar 2700 metais pr. Kr. Kinijos literatūroje, o Japonijoje - 1100 metais. Arabų dėka arbata Europą pasiekė 1550 metais. Kininis arbatmedis labai vertinamas Kinijoje, pietų Azijoje, sodinamas Indijoje, pietų Rusijoje, Rytų Afrikoje, Javoje, Ceilone, Sumatroje, Argentinoje ir Turkijoje. Kinija, Indija, Indonezija ir Japonija pagamina apie pusę visos pasaulinės arbatos produkcijos. [14] Skaičiuojama, kad kiekvienais metais pasaulyje pagaminama apie 2,5 milijonų tonų arbatos. Daugiausia arbatos sunaudojama Azijoje, kai kuriose Šiaurės Afrikos, Jungtinių Amerikos Valstijų ir Europos dalyse. [7] Kininis arbatmedis dažniausiai auginamas atogrąžų ir subtropikų klimato juostoje, vietovėse, kuriose ne mažiau kaip 127 cm kritulių kiekio per metus. [2] Augalui reikalingas šiltas ir drėgnas klimatas, derlinga ir drėgna dirva, saulėta augimo vieta. Kultivuojant kininius arbatmedžius, tinkamesnis yra rūgštus dirvožemis, tačiau augalas prisitaiko bei geba augti ir neutralioje dirvoje. [1, 3] Per didelis saulės kiekis gali nudeginti augalo lapus, todėl reikalingas popietinis pavėsis, taip pat augimvietė turėtų būti apsaugota nuo vėjo. Arbatai auginami arbatmedžiai yra genimi, siekiant supaprastinti lapų skynimą, augalas yra genimas taip, kad nebūtų didesnis nei juosmens aukščio. [3] Kininis arbatmedis dauginamas sėklomis ar vegetatyviniu būdu.[15]
1.3 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos arbatų rūšys
Daugelis arbatų rūšių (juodoji, žalioji ir kt.) yra gaunamos iš to paties augalo Camellia
sinensis L. lapų. Arbatos rūšį nulemia jos gamybos procesas. Arbatos gamybos etapai pateikti 1
paveiksle. Jei arbatos žaliava po rinkimo nėra greitai išdžiovinama, ji pradeda vysti ir oksiduotis – prasideda fermentacija. Oksidacija stabdoma naudojant garus arba sausai kepinant žaliavą karštose keptuvėse [6, 8]. Priklausomai nuo fermentacijos proceso, arbata yra skirstoma į tris pagrindines kategorijas:
1. Nefermentuota arbata; 2. Iš dalies fermentuota arbata;
3. Fermentuota arbata [1, 8, 16, 17, 18].
Arbatos žaliava gali būti apdorojama taikant kelių procesų derinius. Atsižvelgiant į taikytus gamybos metodus bei pagamintos arbatos charakteristikas, arbata skirstoma į šešis tipus: žalioji arbata, geltonoji arbata, tamsioji arbata, baltoji arbata, ulongo arbata, juodoji arbata.[16] Visos arbatos gaminamos iš tos pačios rūšies augalų, tik skiriasi jų veislės, auginimo sąlygos ir žaliavos apdorojimo būdas.[6]
1 pav. Skirtingų arbatų rūšių gamybos etapai [23]
Arbatos gamyba
Žali arbatos lapai
Vytinimas Džiovinimas Baltoji arbata Vytinimas Kepinimas aukštoje temperatūroje Lėtas džiovinimas Geltonoji arbata Apdorojimas garais Susukimas Džiovinimas Žalioji japoniška arbata Vytinimas Kepinimas keptuvėse Susukimas Džiovinimas Žalioji kiniška arbata Vytinimas Susukimas Dalinė fermentacija Džiovinimas Ulongo arbata Vytinimas Susukimas Fermentacija Džiovinimas Juodoji arbata
Arbatos fermentacija yra katechinų oksidacinė polimerizacija ir kondensacija, kuri yra katalizuojama endogeninių fermentų polifenolių oksidazės ir peroksidazės.[16] Fermentacijos proceso laikas lemia galutinio produkto kokybę. [19] Oksidacijos produktai, tokie kaip teaflavinai ir tearubiginai, lemia juodosios arbatos spalvą ir skonį. [16]
Žalioji arbata yra mažai fermentuota arba be jokios fermentacijos, juodoji arbata pilnai frementuota, o ulongo arbata yra dalinės fermentacijos produktas. [16, 17] Gamybos metu žalioji ir juodoji arbata yra apdorojamos skirtingai. [7]
Žalioji arbata yra nefermentuotos formos, ji sudaro apie 20 procentų visos arbatos produkcijos. [7, 8] Pagrindiniai žaliosios arbatos gamybos žingsniai apima žaliavos išsklaidymą, garinimą, valcavimą ir džiovinimą. Ruošiant žaliavą juodajai ar ulongo arbatai, vietoje garinimo yra įterpiamas vytinimas ir fermentacijos procesas. [17] Norint pagaminti žaliąją arbatą, ką tik nuskintus lapus reikia nedelsiant garinti, kad būtų išvengiama fermentacijos proceso ir gaunamas išdžiovintas bei stabilus produktas. Garinimo procesas sunaikina fermentus, skaidančius spalvų pigmentus, tai leidžia arbatai išlaikyti savo žalią spalvą, kuri išsaugoma per tolimesnius valcavimo ir džiovinimo etapus. [7] Šie procesai išsaugo natūralius polifenolius, pasižyminčius sveikatą gerinančiomis savybėmis. Kai žalioji arbata yra fermentuojama iki ulongo, vėliau iki juodosios arbatos, polifenoliniai junginiai (katechinai), esantys žaliojoje arbatoje, dimerizuojasi suformuodami teaflavinus, todėl arbatos gali turėti skirtingą biologinį aktyvumą. [7]
1.4 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos kokybė
Arbatos kokybę gali lemti augimo aplinka, augalo veislė, kultūrinė patirtis ir skirtingi žaliavos perdirbimo procesai. [17, 18] Dažnai arbatos kokybė yra svarbesnė nei gausus derlius. [17] Pagrindinės trys arbatų rūšys pasižymi skirtingomis kokybės charakteristikomis, įskaitant spalvą, aromatą, skonį ir išvaizdą. [16] Arbatos aromatai gali skirtis priklausomai nuo žaliavos kilmės šalies. Nedideli įvairių klimato veiksnių pokyčiai gali sukelti pastebimų pakitimų aromatinių medžiagų sudėtyje. Pastebėta, kad arbatos auginamos vietovėse, esančiose aukščiau jūros lygio, kur vyrauja žemesnė temperatūra, turi didesnę koncentraciją aromatinių junginių ir ryškesnį skonį. Arbatos, kurioms tenka daugiau pavėsio, gali pakeisti aromatą ir pagerinti skonį. Aromato pokyčius gali lemti metų laikas, daug reikšmės turi temperatūriniai svyravimai bei klimatas. [17]
Arbatmedžių lapai naudojami arbatos gamybai gali būti skinami rankomis arba mechaninėmis mašinomis. Lapų skynimas rankomis yra intensyvus darbas, reikalaujantis daugiau laiko ir mažiau produktyvus lyginant su mechaniniu skynimu, tačiau vertinamas kaip kokybiškesnis procesas. Patyręs darbuotojas per dieną gali priskinti apie 40 kg arbatmedžio lapų. [18] Kinijoje aukštos kokybės žalioji
arbata dažniausiai gaminama iš rankomis skintų šviežių arbatos lapų. Šviežios arbatos lapai gali būti nuimami skirtingu metų laiku, priklausomai nuo augimvietės klimato sąlygų. [16]
Kultūriniai aspektai, tokie kaip tręšimas, drėkinimas, piktžolių ir kenkėjų naikinimas, augalo ligos, turi didesnį poveikį derliui, o lapų amžius ir derliaus nuėmimo laikas yra svarbūs žaliavos kokybei. Arbatos perdirbimas apima daug sudėtingų procesų: vytinimas, vartymas, kaitinimas, valcavimas, džiovinimas, kiekvienas jų gali turėti įtakos galutinei arbatos kokybei. [17]
Arbatos sudėtis gali pakisti dėl degradacijos, oksidacijos, epimerizacijos ir polimerizacijos reakcijų laikymo metu, nes arbata sąveikauja su aplinkos deguonimi, drėgme, šviesa ir gali būti veikiama temperatūros svyravimų. [20] Atlikti tyrimai parodė, jog pastebėtas reikšmingas polifenolių katechinų kiekio sumažėjimas per šešis mėnesius nuo arbatos gamybos. Žaliojoje arbatoje randami dideli kiekiai epigalokatechino-3-galato (EGCG), per šešių mėnesių laikotarpį jo sumažėjo 28 proc., o epigalokatechino (EGC), antro labiausiai arbatoje paplitusio katechino, sumažėjo 51 proc. [21] Sandėliavimas hermetiškoje pakuotėje, vėsioje, tamsioje aplinkoje padeda prailginti arbatos galiojimo laiką ir išsaugoti vertingas sudėtines medžiagas.[22]
1.5 Kininių arbatmedžių arbatų paruošimas
Arbatžolių mišinius sudaro viena arba daugiau augalinių žaliavų, skirtų geriamiesiems vandeniniams preparatams ruošti. Gali būti gaminami nuovirai, infuzijos, naudojama maceravimo technologija. Arbatos gėrimas ruošiamas prieš pat vartojimą. Arbatos paprastai tiekiamos pakeliais arba birios. [24]
Arbatos paruošimo būdas yra svarbus siekiant išsaugoti naudingas arbatos savybes. Tokie veiksniai kaip vandens kokybė, temperatūra, pH vertė, maišymo intensyvumas, ekstrakcijos trukmė, vandens – arbatos kiekio santykis, arbatos dalelių dydis, arbatos forma – biri ar supakuota į pakelius, - lemia arbatos antioksidantų ekstrahavimo efektyvumą. [25]
Vandens kokybė turi įtakos ne tik arbatos skoniui, kvapui, bet ir antioksidaciniam aktyvumui. Atliktas tyrimas, kurio metu buvo lyginamas vandentiekio vandens, aktyvuota anglimi adsorbuoto vandens, dejonizuoto vandens, distiliuoto vandens, atvirkštinio osmoso vandens ir ultra - švaraus vandens poveikis žaliosios arbatos kokybei. Rezultatai parodė, kad arbatos infuzijos paruoštos naudojant vandentiekio vandenį, aktyvuota anglimi adsorbuotą vandenį bei dejonizuotą vandenį pasižymėjo panašiu antioksidaciniu aktyvumu. Nustatyta, kad geriausi rezultatai gauti distiliuoto vandens, atvirkštinio osmoso vandens, ir itin švaraus vandens atveju. [26] Tiriant vandens pH vertės reikšmę žaliosios arbatos aktyvių junginių ekstrakcijai, pastebėta, jog didesnis katechinų kiekis išsiskiria naudojant vandenį, kurio pH<6. Nustatyta, kad didesnis katechinų kiekis priklauso nuo jų stabilumo skirtingose pH vertėse, o ne nuo ekstrakcijos efektyvumo. [25]
Ekstrakcijos trukmė ir temperatūra svarbi ruošiant juodąją ir ulongo arbatą. Ilgesnis arbatos plikymo laikas ir aukštesnė temperatūra sąlygoja didesnį antioksidacinį aktyvumą, taip pat fenolinių junginių ir katechinų kiekį. [27] Didžiausias katechinų kiekis gaunamas iš žaliosios arbatos ekstrakciją vykdant 30 min. 80°C temperatūroje [25], o norint pasiekti didžiausią ekstraktų antioksidacinį aktyvumą užtenka arbatą plikyti 3-5 min. [28]
Arbatos forma naudojama ekstrakcijai gali lemti katechinų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą. Tirtos trijų formų žaliosios arbatos: miltelių pavidalo, supakuota į pakelius ir biri. Tyrimo rezultatai parodė, kad efektyviausia ekstrakcija vykdoma 80°C temperatūroje, o trukmė priklauso nuo arbatos formos: milteliai – 5 min., pakeliai – 15 min., biri arbata – 30 min. Geriausi rezultatai vertinant antioksidacinį aktyvumą ir bioaktyvių junginių kiekį gauti vykdant arbatos miltelių ekstrakciją. [29] Kitų tyrimų duomenimis, tiriant baltąją arbatą, katechinų ekstrakcijai reikšmingos įtakos arbatos forma neturėjo. [30]
Arbata gali būti ruošiama į ją pridedant skonį gerinančių priedų. Dažniausiai tai būna pienas, citrina, cukrus arba medus. Arbata su pienu vertinama ganėtinai prieštaringai. Mokslininkų nuomone, pienas sumažina arbatos antioksidacinį aktyvumą [31,32], tačiau kitų tyrimų rezultatai parodo, kad pienas arbatos atioksidacinam aktyvumui įtakos neturi. [27, 33, 34] Žalioji arbata, kurios ruošimo metu naudojamas galvijų, sojų ar ryžių pienas pasižymi didesniu katechinų epigalokatechino (EGC), epigalokatechino-3-galato (EGCG), epikatechino (EC) ir epikatechino-3-galato (ECG) kiekiu. Askorbo rūgštis ir citrusinių vaisių sultys (apelsinų, greipfrutų, citrinų ir žaliųjų citrinų) taip pat padidina katechinų kiekį arbatoje. [35] 2011 metais atlikto tyrimo duomenys įrodo, kad žalioji arbata su sacharoze ir askorbo rūgštimi gali pagerinti katechinų biologinį prieinamumą ir jų įsisavinimą iš žarnyno. [36]
1.6 Kininių arbatmedžių arbatų vartojimas
Klinikiniai tyrimai rodo, kad reguliarus ir ilgalaikis kasdienis arbatos vartojimas yra saugus ir yra reikšmingas kai kurių sunkių ligų prevencijai.
Žalioji arbata: 150-250 ml verdančio vandens užpilti 1,0-2,5 g susmulkintų džiovintų lapų. Palaukus 3-5 min., išsiskiria alkaloidai, arbata skiriama naudoti kaip stimuliatorius. Katechinų ekstrakcija trunka ilgiau, todėl jei norime vartoti diarėjos gydymui mirkome ne mažiau kaip 10 min. Gerti kelis kartus per dieną. Žaliava vandenyje turėtų būti laikoma 15-20 min. siekiant maksimaliai padidinti katechinų išsiskyrimą, tačiau jie arbatai suteikia kartų skonį. Bent 1 puodelis arbatos kasdien lemia antioksidacinį poveikį.
Juodoji arbata: 150-250 ml verdančio vandens užpilti 2,5 g susmulkintų džiovintų lapų. Po 2-5 min. skiriama naudoti kaip stimuliatorius. Mirkoma ne mažiau kaip 10 min. diarėjos gydymui, gerti 2-3 kartus per dieną. Geriant 3-4 kartus per parą apsaugo nuo aterosklerozės. Vartojant 1 arba daugiau kartų per dieną, sumažinama miokardo infarkto rizika.
Sausasis etanolinis žaliosios arbatos ekstraktas: dvi, 250 mg kapsulės 3 kartus per parą valgio metu skiriamos svoriui kontroliuoti.
Stimuliuojantis arbatos poveikis stipriausias yra po 2-5 min., nes kofeinas greitai ištirpsta karštame vandenyje. Ilgiau vykstant ekstrakcijai didėja katechinų kiekis arbatoje. Jie sumažina stimuliuojantį poveikį, nes polifenoliai suriša kofeiną. Juodosios ir žaliosios arbatos katechinai yra greitai absorbuojami ir pienas nemažina jų biologinio prieinamumo. [37]
1.7 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos cheminė sudėtis
Teigiama, kad arbatoje yra beveik 4000 įvairių bioaktyvių junginių, kurių net vieną trečdalį sudaro polifenoliai. [8] Polifenoliams priskiriami flavanoliai, flavandioliai, flavonoidai ir fenolinės rūgštys. [38] Polifenoliai, kurių randama daugiausia yra flavonoidai. [9] Kita didelė polifenolių grupė, randama arbatoje, - katechinai. Jie žaliojoje arbatoje sudaro apie 20–30 proc. [8] sauso svorio, o juodojoje tik 3-10 proc., nes gamybos metu flavanoliai yra oksiduojami ir polimerizuojasi į teaflavinus ir tearubiginus, kurie atitinkamai sudaro 2-6 proc. ir 20 proc. arbatos masės. [10, 39, 40] Manoma, jog katechinai labai svarbūs vertinant arbatos sukeliamą poveikį žmogaus sveikatai. [41] Pagrindiniai katechinų atstovai: epigalokatechino-3-galatas (EGCG), epigalokatechinas (EGC), epikatechino-3-galatas (ECG) ir epikatechinas (EC). Aktyviausias katechinas, kurio kiekis žaliojoje arbatoje didžiausias yra epigalokatechino-3-galatas (EGCG). [8] Jis sudaro net 50-80 proc. visų katechinų kiekio. [42] Ypač dideli EGCG kiekiai randami vyresnio amžiaus arbatmedžio lapuose. [43] Juodoji arbata pasižymi mažesnėmis šių katechinų koncentracijomis, nei žalioji arbata. [44] Visose arbatų rūšyse randama flavonolių glikozidų, pavyzdžiui kvercetino, rutino, bei fenolinių ir organinių rūgščių. [45] Rutinas ir kvercetinas sudaro 5 – 9 proc. visų polifenolių ir panašiais kiekiais randami įvairiose arbatų rūšyse. [46]
Kiti junginiai, randami arbatoje: alkaloidai (kofeinas, teofilinas ir teobrominas), amino rūgštys, angliavandeniai, baltymai, chlorofilas, lakieji organiniai junginiai, fluoras, aliuminis, mineralai ir mikroelementai. [41] Kofeino kiekis, randamas žaliojoje arbatoje svyruoja nuo 3 iki 6 proc., o juodojoje arbatoje sudaro 2-4 proc. sausos masės. [4, 47] Nėra reikšmingo skirtumo vertinant žaliosios ir juodosios arbatos mineralų kiekį. Galima išskirti tai, kad žalioji arbata pasižymi didesniu kiekiu mangano, o juodojoje arbatoje randami didesni kiekiai natrio ir vario. [48] Ulongo arbata yra paprastų polifenolių, pvz. katechinų, ir sudėtingų polifenolių mišinys. [49] Žalioji, ulongo ir juodoji
arbata yra vitamino C šaltinis. [12] Arbatos sudėtis kinta priklausomai nuo kininio arbatmedžio augimo sąlygų, arbatmedžio lapų amžiaus, metų laiko, klimato, sodininkystės ypatumų bei vėlesnio arbatos apdorojimo proceso. [4, 5]
1.8 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos panaudojimas medicinoje
Arbatos gėrimas yra ruošiamas iš džiovintų Camellia sinensis L. lapų. Kininio arbatmedžio žaliava plačiai naudojama tyrimuose ir populiari natūraliose tradicinėse medicinos sistemose, tokiose kaip Ajurveda, Unani ir homeopatija. [12]
Camellia sinensis L. lapai yra naudojami kaip kraujavimą stabdanti priemonė, nes pasižymi
sutraukiančiu poveikiu. Arbata skatina apetitą, gerina virškinimą. Arbatmedžio augalinė žaliava naudojama psoriazės, bronchito, opų ir žaizdų gydymui, mažina karščiavimą, nuovargį, slopina deginimo pojūtį ir bendrą skausmą. [11]
Naudojant skirtingus tyrimų su gyvūnais modelius, nustatyta, kad ekstraktas, geriamas arba tepamas ant odos, stabdo cheminių kancerogenų arba ultravioletinių spindulių sukeltų odos auglių susidarymą. Arbata stabdo senėjimo procesus, degeneracines nervų ligas, Alzheimerio ligos vystymąsi. Arbata veiksminga gydant širdies ir kraujagyslių ligas, kovojant su insultu, vėžiu, cukriniu diabetu. [9, 10, 11] Pasižymi būdingu priešuždegiminiu ir skausmą mažinančiu poveikiu.[50, 51]
Senėjimą lėtinantis poveikis. Teorija apie laisvųjų radikalų įtaką senėjimui teigia, kad padidėjęs laisvųjų radikalų susidarymas ir oksidacinis stresas yra atsakingi už fenotipo pokyčius, kurie lemia su amžiumi susijusius funkcinius sutrikimus ir neurodegeneraciją. Parkinsono, Alzheimerio liga, širdies ir kraujagyslių problemos ir diabetas yra nulemiami pakitusios oksidantas/antioksidantas pusiausvyros ir laisvųjų radikalų žalos. [8] Žalioji arbata apsaugo kraujo serumo lipidus ir baltymus nuo oksidacinio pažeidimo, kurį dar labiau sustiprina senėjimas. Žalioji arbata taip pat mažina DNR oksidacinio pažeidimo lygį nusakančio 8-okso-deoksiguanozino kiekį kepenyse, inkstuose ir smegenyse. [52] Taigi, žaliojoje arbatoje esantys polifenoliai yra naudingi prieš žalingą senėjimo procesą.
Priešvėžinis poveikis. Žaliosios arbatos katechinai įgijo didelę reikšmę kaip vėžio prevencinė priemonė. Viena iš svarbiausių katechinų savybių yra jų sąveika su įvairiomis tikslinėmis molekulėmis. [53]
Atliktas tyrimas, kurio metu vertintas žaliosios arbatos, kaip vėžio prevencinės priemonės, efektyvumas. Nustatyta, kad 10 žaliosios arbatos puodelių per dieną, papildytos žaliosios arbatos ekstraktu, reikšmingai (net 50 proc.) sumažina storosios žarnos adenomos pasikartojimą žmonėms, prieš vienerius metus turėjusiems polipektomiją. Svarbu ir tai, kad arbatos vartojimas sumažino adenomų dydį. [54] Šių tyrimų rezultatai paskatino domėtis žaliosios arbatos nauda gydant vėžį.
Atlikti tyrimai, siekiant įrodyti žaliosios arbatos katechinų veiksmingumą derinyje su priešvėžiniais vaistais. Vartojant EGCG ar žaliosios arbatos ekstraktą su tamoksifenu didėja prevencinis poveikis prieš krūties vėžio ląsteles. Šis derinys gali būti ideali priemonė krūties vėžio prevencijai. Tyrimo rezultatai aiškiai parodo veiksmingumą plaučių vėžio prevencijos, kuomet kartu vartojamas EGCG ir celekoksibas. [55] Sinergistinis priešvėžinių vaistų (COX-2 selektyviųjų inhibitorių) ir EGCG poveikis prieš žmogaus prostatos vėžines ląstles įrodyts in vitro ir in vivo. [56] Vėžiu sergantys pacientai, kurie geria žaliąją arbatą ir vartoja antinavikinius vaistus turi dvigubą vėžio prevenciją. [55]
Antioksidacinis poveikis. Arbata yra populiarus natūralus maistinis antioksidantas. Antioksidantai - junginiai, kurie apsaugo ląsteles nuo žalingo aktyvių deguonies formų, pavyzdžiui, superoksido (radikalas) O2-•, vandenilio peroksido H2O2 , hidroksilo radikalo OH• (jam gavus sukinio
smūgį jis tampa singletinės būsenos deguonimi O2), ir peroksinitrito, poveikio. [1] Laisvųjų radikalų
koncentracijos padidėjimas ląstelėje ir nesugebėjimas jų detoksikuoti, gali sukelti ląstelėje oksidacinį stresą. [57] Oksidacinis DNR pažeidimas skatina mutacijas ir taip pat didina vėžio vysymosi riziką. Be to, aterosklerozės, diabeto ir imunodeficito atsiradimas yra susijęs su lipidų ir baltymų oksidacija. [58]
Tyrimų in vivo metu, naudojant biologinius žymenis, buvo nustatyta, kad arbatos vartojimas sumažina DNR žalą tarp rūkančiųjų ir nerūkančiųjų. Sumažėjęs oksidacinio pažeidimo lygis koreliuoja su sumažėjusiu laisvųjų radikalų kiekiu, randamu šlapime. [59]
Atlikus tyrimus, kuriuose panaudotas lipoproteinų oksidacinis modelis, nustatyta, kad arbatoje esantiems flavonoidams būdingas 20 kartų galingesnis antioksidacinis aktyvumas nei vitaminui C. [60] Įrodyta, kad įvairūs arbatos priedai, pavyzdžiui, jazminų žiedlapiai ir citrinos žievelė, turi didelę įtaką antioksidaciniam žaliosios arbatos aktyvumui. Tyrimo metu nustatyta, kad gryna žalioji arbata pasižymi du ar net tris kartus didesniu antioksidaciniu aktyvumu, lyginant su arbata, kuri papildyta džiovintais vaisias ar svarainiais. [61]
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad didelis arbatos flavonoidų vartojimas gali sumažinti išeminės širdies ligos paplitimą, nes padidina vazodilataciją. [62] Tyrimo rezultatai įrodo, kad žaliosios arbatos vartojimas reikšmingai sumažina sistolinį kraujo spaudimą, bendrąjį cholesterolį ir MTL (mažo tankio lipoproteinų) cholesterolį. Didesnį poveikį lemia ilgesnis arbatos vartojimas. Rezultatai taip pat parodo, kad žalioji arbata neturi reikšmingos įtakos diastolinio kraujospūdžio, DTL (didelio tankio lipoproteinų) cholesterolio ir trigliceridų pokyčiams. [63]
Nustatyta, kad kasdienis žaliosios arbatos vartojimas po 5-6 puodelius, kuriuose yra 200 mg EGCG, leidžia pasiekti maksimalų gydomąjį efektą mažinant kraujospūdį bei koreguojant lipidų profilį. [64] Kito tyrimo metu įrodyta, kad tiek juodoji, tiek žalioji arbata dėl antioksidacinių savybių sumažina padidėjusį kraujospūdį. Polifenolių kiekis, naudotas šiame eksperimente, atitinka 1 litre
arbatos esančių polifenolių kiekį, todėl galime daryti išvadą, kad reguliarus arbatos vartojimas gali apsaugoti nuo hipertenzijos išsivystymo. [65]
Žaliosios arbatos poveikis kraujospūdžiui aiškinamas keliais skirtingais mechanizmais. Be to, kad mažėja AKF ir NADPH oksidazės, tyrimai su gyvūnais ir žmonėmis parodė, kad EGCG mažina kalikreino ir prostaglandinų E2 koncentraciją. Šie procesai lemia kraujospūdžio sumažėjimą. [66, 67] Žalioji arbata savo sudėtyje turi gama-amino sviesto rūgšties, kuri gali sumažinti kraujospūdį keisdama neurotransmiterių išsiskyrimą. [68] Tyrimai su gyvūnais parodė, kad flavan-3-oliai, kurių gausu žaliosiojoje arbatoje, moduliuoja endotelio funkciją, mažindami monocitų adheziją [69] 2012 metais atlikatas tyrimas, kurio tikslas ištirti flavan-3-olių poveikį metabolinio sindromo pasireiškimo rizikai. Daugiausia dėmesio skiriama arbatos katechinams ir atskiriems flavan-3-oliams, kurių gausu maiste. Rezultatai parodė, kad flavan-3-oliai sumažina hipertenzijos riziką, bei galimybę pasireikšti metabolinam sindromui. [70] Kito tyrimo metu buvo aiškinamasi ar žalioji arbata gali sumažinti hipertenziją ir atsparumą insulinui, mažinanat oksidacinį stresą bei gerinant endotelio disfunkciją. Tyrimai atlikti su metaboliniu sindromu sergančiomis žiurkėmis. Rezultatai patvirtino hipotezę, nes žalioji arbata žymiai sumažino reaktyvių deguonies formų susidarymą kraujagyslėse ir NADPH oksidazės aktyvumą, pagerino nuo endotelio priklausomą krūtinės aortos atspalaidavimą, bei sumažino kraujospūdį. [71]
Poveikis odai. Arbata nuo seno yra naudojama kaip naminė priemonė nudegimams, žaizdoms ir patinimams. Karštas žaliosios arbatos kompresas nuramina niežulį ir uždegimą po vabzdžių įkandimų. Arbatoje esantys taninai ir flavonoidai pasižymi antiseptinėmis savybėmis bei priešuždegiminiu poveikiu. Žalioji arbata taip pat turi keletą privalumų, jei naudojama išoriškai. Ji gali būti panaudojama norint sustabdyti arba sumažinti kraujavimą, slopinant niežulį ir bėrimą. [72]
Žaliosios arbatos sudedamosios dalys gali būti naudingos vartojant lokaliai ant odos. Jos skatina odos regeneraciją, žaizdų gijimą, tinkamos gydant odos ligas, pavyzdžiui, psoriazę, rožinę, aktininę keratozę, aftines opas. Tam tikromis koncentracijomis EGCG arba pagrindinių žaliosios arbatos polifenolių mišinys skatina pagyvenusius keratinocitus gaminti biologinę energiją ir sintetinti DNR ir taip atnaujinti ląstelių dalijimąsi.[73]
Antivirusinis poveikis. Ciesek ir kt. (2011) atlikę hepatito C viruso (HCV) tyrimus su EGCG, pastebėjo stiprų HCV infekcijos slopinimą. Žaliosios arbatos EGCG stipriai slopina HCV patekimą ir gali būti dalimi antivirusinės prevencijos, kuria siekiama išvengti HCV užsikrėtimo po kepenų transplantacijos. [74]
Arbatos katechinai parodė apsauginį poveikį prieš žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) infekciją. Tyrimai su ŽIV parodė, kad arbatoje randamas EGCG jungiasi prie CD4 T-ląstelių receptoriaus ir blokuoja jungimąsi su virusu. EGCG gebėjimas blokuoti virusinės ląstelės jungimąsi buvo pasiūlytas naudoti ŽIV infekcijos terapijoje [75]. Kawai ir kt. (2003) taip pat tyrė žaliosios
arbatos polifenolių poveikio prieš ŽIV mechanizmą. Atlikti tyrimai patvirtino, kad EGCG tiesiogiai jungiasi prie ląstelių paviršiaus CD4 molekulių. [76] Tačiau reikia daugiau in vivo tyrimų siekiant nustatyti ar EGCG gali būti naudojamas antiretrovirusiniame gydyme.
Gripo A ir B virusai yra pagrindinė kvėpavimo takų ligų priežastis. Antivirusinis EGCG aktyvumas prieš gripo virusą pirmą kartą paminėtas jau 1993 metais. [77] Atliktų tyrimų metu EGCG ir teaflavino digalatas slopino abu, gripo A ir B, virusus šunų inkstų ląstelėse in vitro. [78] Bandant išsiaiškinti ar arbatos katechininai gali padėti išvengti gripo infekcijos žmonėms atlikti klinikiniai tyrimai. Vertintas arbatos katechinų ekstraktų poveikis gripo infekcijos profilaktikai senyviems slaugos namų gyventojams. Gerklės skalavimui skirtas katechinų ekstrakto tirpalas (200 µg/ml, 60 proc. katechinų sudarė EGCG). Rezultatai parodė, kad gargaliavimas 3 kartus per dieną yra efektyvus gripo infekcijos prevencijai. [79] Kito tyrimo metu katechinų vartojimas, kuris truko 5 mėnesius, taip pat buvo reikšmingas ir turėjo prevencinį poveikį gripo infekcijai. [80]
Antimikrobinis poveikis. Arbatos antimikrobinį poveikį nulemia katechinai. Jie pažeidžia bakterijos ląstelės membraną, slopina riebalų rūgščių sintezę, fermentų aktyvumą. Tačiau jų sukeliamą antimikrobinį poveikį lemia ir keletas kitų katechinų savybių. Katechinai slopina uždegimą didindami azoto oksido sintezę [81], slopina angiotenzino II ir IL-6-sukeltą C-reaktyvaus baltymo ekspresiją [82], slopina IL-8 gamybą [83], slopindami IL-12 sumažina hialuronidazės aktyvumą. [84, 85]
Antimikrobiniai tyrimai, atlikti naudojant įvairius žaliosios arbatos ekstraktus parodė, kad žalioji arbata gali būti veiksminga prieš daugelį mikroorganizmų. Tyrimo metu stebėtas poveikis prieš gramteigiamus ir gramneigiamus organizmus, taip pat keletą virusų, grybelių ir parazitų. Pagrindinis gramteigiamas organizmas - Staphylococcus aureus. Dažniausiai tiriamas gramneigiamas organizmas -
Escherichia coli. Ištirta, kad žalioji arbata yra efektyvi antimikrobinė priemonė. [85]
Įvairių tyrimų metu nustatyta, kad žaliosios arbatos katechinai sinergistiškai veikia su tetraciklinu prieš S. aureus ir S. epidermidis [86]; penicilinu prieš S. epidermidis [87]; chloramfenikoliu, ciprofloksacinu ir cefotaksimu prieš izoliuotą E. coli [86, 88, 89].
Stebėtas arbatos poveikis prieš Helicobacter pylori. Žaliosios arbatos katechinai užblokuoja bakterijų gebėjimą aktyvinti taurinio ląstelių receptoriaus 4 (TLR-4), kuris sužadina uždegimo mediatorius, glikozilinimą. EGCG apsaugojo skrandžio gleivinės ląsteles nuo H. pylori sukeltos apoptozės ir DNR pažeidimų. Šis katechinas sustiprino skrandžio epitelio ląstelių proliferaciją. Įvertinus EGCG poveikį skrandžio epitelinių ląstelių gyvybingumui, nustatyta, kad nuolat vartojama žalioji arbata gali užkirsti kelią H. pylori infekcijai ir sumažinti gastrito atsiradimo tikimybę. [90]
1.9 Kininių arbatmedžių augalinės žaliavos flavonoidų ir rauginių medžiagų
apžvalga
1.9.1 Flavonoidai
Flavonoidai sudaro didžiausią augalinių polifenolinių junginių klasę. Nustatyta daugiau kaip 8000 įvairios struktūros favonoidų. Flavonoidai turi C6-C3-C6 bendrą struktūrinį pagrindą, kuriame du C6 vienetai yra benzolo žiedai A ir B. Jie sujungti C3 propaniniu fragmentu (2 paveikslas).
Flavonoidų struktūrą lemia glikozilinimo, hidroksilinimo ir kitos reakcijos, kurių metu vyksta pagrindinės molekulės pokyčiai. Flavonoidų struktūros pagrindas yra aglikonas, tačiau augaluose dažniausiai randami glikozidų formos. [91, 92, 93, 94]
Flavonoidų klasifikacija. Atsižvelgiant į C žiedo modifikacijas, flavonoidai skirstomi į šešis pagrindinius poklasius: flavonai, flavonoliai, flavanoliai, flavononai, antocianidinai ir izoflavonoidai. [92, 93, 94]
Flavanoliai. Flavanoliams (flavan-3-oliams) priklauso katechinai, kurie laikomi vienais
svarbiausių arbatos aktyviųjų junginių. Struktūra skiriasi nuo flavonoidų, nes nėra dvigubos jungties tarp C2 ir C3 atomų, bei neturi C4 karbonilo grupės C žiede. C3 padėtyje turi hidroksi grupę (3 paveikslas). Flavanoliai skiriasi nuo kitų flavonoidų, nes augaluose dažniausiai randami aglikonų pavidalu. [95, 96]
Pagrindiniai katechinų atstovai: epigalokatechino-3-galatas (EGCG), epigalokatechinas (EGC), epikatechino-3-galatas (ECG) ir epikatechinas (EC). [97] Šie katechinai yra bespalviai,
3 pav. Flavanolių pagrindinė struktūra [93] 2 pav. Flavonoidų struktūrinis pagrindas [93]
vandenyje tirpūs junginiai. Jie arbatai suteikia sutraukiantį, kartų skonį. Įvairūs katechinų pakitimai lemia ne tik arbatos skonį, bet taip pat spalvą ir aromatą. [97] Arbatos flavanoliai fermentacijos metu gali suformuoti dimerus, tokius kaip teaflavinas. [94]
Flavonai. Jie turi dvigubą jungtį tarp 2 ir 3 padėties ir ketono grupę C žiedo 4-oje padėtyje (4
paveikslas). Dauguma vaisių ir daržovių flavonų A žiedo 5-oje padėtyje dažniausiai turi hidroksi grupę. Glikozilinimo metu cukrai dažniausiai prisijungia 5 ir 7 pozicijose, o hidroksi grupių metilinimas ir acetilinimas dažniauiai vyksta B žiede. Flavonų atstovai: apigeninas, liuteolinas, viteksinas. [96, 98]
Flavonoliai. Struktūra panaši kaip flavonų, flavonoliai C3 padėtyje turi hidroksi grupę (5
paveikslas). Tai labiausiai paplitęs ir didžiausias flavonoidų pogrupis.
Pagrindiniai flavonolių atstovai, randami arbatoje, yra kvercetinas, mircetinas bei kemferolis, jie sudaro 2-3 proc. arbatos ekstrakto. Flavonoliai daugiausia yra glikozidų pavidalo, šios formos tirpios vandenyje. [96]
Flavononai. Taip pat vadinami dihidroflavononais. Neturi dvigubos jungties tarp C2 ir C3,
būdingas sotusis C žiedas, 4-oje padėtyje prisijungusi keto grupė (6 paveikslas). Atstovai: hesperidinas, likviritinas, likviritigeninas, eriodiktinas.
4 pav. Flavonų pagrindinė struktūra [93]
Izoflavonoidai. Aromatinis B žiedas jungiasi su C žiedu 3 padėtyje, 4 padėtyje turi keto grupę
ir dvigubą jungtį tarp C2 ir C3 (7 paveikslas). Atstovai: ononinas, genistinas.
Antocianidinai. Antocianidinų struktūra pateikta 8 paveiksle. Antocianidinai augaluose
daugiausia egzistuoja glikozidų formos, kuri yra sutartinai vadinama antocianinais. Tai augalų pigmenatai, nuo rožinės iki juodai - violetinės spalvos. Cianidinas, delfinidinas ir pelargonidinas yra dažniausiai randami antocianidinai. Ši junginių grupė gerai tirpi vandenyje. Didesnis prie aglikono prisijungusių cukraus molekulių skaičius lemia didesnį šių junginių poliškumą. Atstovai: antocinas, malvidinas. [91, 96, 98]
Flavonai, flavonoliai ir antocianinai augalams suteikia spalvas, kurios gali veikti kaip vizualins signalas ir privilioti vabzdžius, apdulkinančius augalus, bei sėklas platinančius gyvūnus. Atsižvelgiant į katechinams ir kitiems flavanoliams būdingą sutraukiantį poveikį, jie yra svarbūs ginantis nuo kenksmingų vabzdžių. Flavonoidai veikia kaip katalizatoriai fotosintezės šviesos fazėje ir kaip jonų kanalų reguliatoriai fosforilinimo reakcijose. Jie taip pat saugo augalų ląsteles nuo reaktyvių deguonies formų, pagamintų fotosintezės elektronų transporto sistemos, sukeliamo streso. Dėl
8 pav. Antocianidinų struktūrinė formulė [93] 7 pav. Izoflavonoidų struktūrinė formulė [93]
ultravioletinius spindulius (UV) sugeriančių savybių, flavonoidai apsaugo augalus nuo UV saulės spindulių ir nuo UV generuojamų reaktyvių deguonies formų. [93, 99, 100, 101]
1.9.2 Rauginės medžiagos
Raugai yra didelės molekulinės masės junginiai, vandenyje tirpių polifenolių grupė. Raugų pagrindą sudaro daugiaatomiai įvairios sudėties fenoliai, nuo paprasčiausių polifenolių iki sudėtingų daugiamolekulių darinių – flobafenų. Raugų molekulėse dažniausiai randamas pirokatecholis, pirogalolis, florogliucinolis bei galo rūgštis. Metilinimo ir karboksilinimo reakcijų metu susidaro galo rūgštis arba metilinti florogliucinolio dariniai – orsinas ir orselino rūgštis, kuri randama kerpėse esančių raugų sudėtyje. [91] Raugai geba sudaryti kompleksus su alkaloidais, polisacharidais ir proteinais. [102, 103] Raugai randami įvairiose augalų dalyse. Dažniausiai raugai kaupiasi medžių žievėje, šaknų bei šakniastiebių žievėje, žolinių augalų stiebuose ir lapuose, taip pat vaisių luobelėse. [91]
Raugai yra skirstomi atsižvelgiant į hidrolizės produktus. Skiriamos dvi didelės grupės:
Hidrolizuojami raugai – galotaninai (esterių tipo pirogalolio dariniai). Hidrolizuojamais raugais vadinamos medžiagos, kurios veikiant praskiestomis rūgštimis ar fermentais, suskyla į monosacharidą D-gliukozę bei aciklinius junginius – galo rūgštį arba elago rūgštį. Hidrolizuojami raugai skiriasi chemine struktūra, todėl jie skirstomi į tris grupes: depsidai, galotaninai, elagotaninai.
Kondensuoti raugai – pirokatecholio dariniai. Kondensuotus raugus veikiant fermentais ar praskiestomis rūgštimis, jie nehidrolizuoja, o kondensuojasi ir sudaro sudėtingesnius kondensacijos produktus. Ši grupė raugų neturi cukrų, o juos lydant kartu su šarmais gali būti suskaidomi į paprastesnius junginius. Atsižvelgiant į cheminę struktūrą, kondensuoti raugai skirstomi: leukoantocianidinų (flavan-3,4-diolių) dariniai, katecholių (flavan-3-olių) dariniai. [91]
Biologinis rauginių medžiagų poveikis nustatytas atliekant tyrimus in vitro ar panaudojant gyvūnų modelius, tačiau klinikiniai duomenys apie poveikį žmonėms yra riboti. Biologinis poveikis priklauso nuo raugų polimerizacijos laipsnio ir jų tirpumo. Labai polimerizuoti raugai pasižymi mažu biologiniu prieinamumu plonojoje žarnoje ir yra lėtai metabolizuojami žarnyno mikrofloros. [105] Yra nemažai epidemiologinių duomenų, kurie rodo, kad raugų vartojimas gali užkirsti kelią lėtinių ligų atsiradimui. Raugai turi poveikį žarnų bakterijoms ir žarnyno aplinkai, kuris gali būti susijęs su trumpos grandinės riebalų rūgščių sinteze ir apsauga nuo vėžio. [103] Antimikrobinis raugų poveikis labiausiai pastebimas naudojant elagotaninų ir antibiotikų derinius prieš antibiotikams atsparias bakterijas. [102] Raugams taip pat būdingas kardioprotekcinis, priešuždegiminis, priešvėžinis ir antimutageninis poveikis. Šie apsauginiai poveikiai yra susiję su jų gebėjimu slopinti laisvųjų radikalų žalingą poveikį bei aktyvinti antioksidacinius fermentus. [104, 105, 106]
1.10 Laisvieji radikalai, antioksidantai, antiradikalinis aktyvumas
Laisvieji radikalai – tai molekulės, jonai bei atomai, kurie išorinėje orbitoje turi nesuporuotą elektroną. Laisvieji radikalai reaguodami su kitomis medžiagomis skatina naujų radikalų susidarymą. [107] Reaktyvios deguonies formos (ROS) gaminamos gyvųjų organizmų, taip pat tai aplinkos veiksnių, tokių kaip oro teršalai ar cigarečių dūmai, rezultatas. ROS yra labai reaktyvios molekulės ir gali pakenkti ląstelių struktūroms, pavyzdžiui, angliavandeniams, nukleorūgštims, lipidams, baltymams, ir pakeisti jų funkcijas. Oksidantų ir antioksidantų balanso pokytis, kai padidėja ROS, yra vadinamas oksidaciniu stresu. Oksidacinis stresas prisideda prie daugelio patologinių būklių ir ligų. [108]
Jau 1987 metais mokslininkai nustatė, kad reaktyvios deguonies formos, kurios susiformuoja
in vivo normalaus aerobinio metabolizmo metu, nepaisant natūralių antioksidantų gynybos sistemos,
gali sukelti žalą DNR, baltymams ir lipidams. [109] ROS prisideda prie ląstelių senėjimo [110], mutagenezės [111], karcinogenezės [112] ir koronarinės širdies ligos vystymosi [113]. Manoma, kad tokius poveikius sukelia membranų destabilizavimas [111], DNR pažeidimai ir mažo tankio lipoproteinų (MTL) oksidacija.
Antioksidantai apibūdinami kaip medžiagos, kurios pasižymi gebėjimu saugoti nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio, sumažina arba net sustabdo laisvųjų radikalų susidarymą. [107]
Antioksidantinę ląstelės apsaugą sudaro fermentiniai antioksidantai, pereinamuosius metalų jonus surišantys baltymai ir mažos molekulinės masės antioksidantai. [114] Nustatyta, kad antioksidacinių medžiagų vartojimas su maistu gali sumažinti oksidacinį stresą ir apsaugoti nuo įvairių ligų progresavimo. [115]
Flavonoidai sudaro didelę antioksidantų grupę. Jų gausu vaisiuose, daržovėse, arbatžolėse bei vyne. [116] Galima išsikirti ir kitą fenolinių junginių grupę, kuri geba efektyviai slopinti reaktyvius deguonies junginius, tai antocianinai. [117] Antocianinai ir kiti flavonoidai yra laikomi svarbiais junginiais labiausiai dėl jų antioksidacinio poveikio, kuris suteikia jiems svarbų vaidmenį įvairių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, prevencijoje. Žalioji arbata dėl sudėtyje esančių polifenolinių junginių pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Arbatoje esantis EGCG saugo nuo žalingo ultravioletinių spindulių sukeliamo oksidacinio streso poveikio. Šis junginys slopina uždegiminių leukocitų infiltraciją odoje ir stabdo UV sukeltą epidermio lipidų peroksidaciją. [107] Arbatos polifenoliai turi stiprų antioksidacinį poveikį ir geba surišti superoksido, vandenilio peroksido, hidroksilo radikalus, azoto oksidą ir peroksinitritą, pagamintus įvairių cheminių medžiagų ir biologinių sistemų. [118]
2 TYRIMŲ METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – kininio arbatmedžio vaistinė augalinė žaliava. Tiriamos Lietuvos rinkoje esančios žaliosios ir juodosios skirtingų prekinių ženklų arbatų rūšys. Mėginiams naudojamos supakuotos pakeliais bei birios arbatos. Tyrime naudotos arbatų rūšys ir prekiniai ženklai pateikiami 1 lentelėje.
1 lentelė. Arbatų rūšys ir prekiniai ženklai
Eilės nr.
Arbatos rūšis Prekinis ženklas
1 Juodoji pakeliuose „Cento“
2 Juodoji pakeliuose „Favorit“
3 Juodoji pakeliuose „Greenfield“
4 Juodoji biri „Greenfield“
5 Juodoji pakeliuose „Loyd“
6 Juodoji pakeliuose „Lipton“
7 Juodoji biri „Dilmah“
8 Juodoji pakeliuose „Dilmah“
9 Juodoji biri „Batik“
10 Žalioji pakeliuose su citrina „Akbar“
11 Žalioji pakeliuose su citrina „Batik“
12 Žalioji pakeliuose „Iki“
13 Žalioji pakeliuose „Favorit“
14 Žalioji pakeliuose „Lipton“
15 Žalioji pakeliuose „Dilmah“
16 Žalioji biri „Presto“
2.2 Naudoti reagentai ir medžiagos
Rektifikuotas etilo alkoholis, 96,3 proc. V/V („Stumbras”, Lietuva), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim, Vokietija), 98 - 100 proc. V/V acto rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), heksametilentetraminas („Sigma-Aldrich”, Anglija), rutino
standartas („Carl Roth GmbH”, 76185, Vokietija), indigosulfonrūgšties tirpalas ( „Fluka“, Šveicarija), kalio permanganato 0,02 M tirpalas; („Fluka“, Šveicarija), Folin-Ciocalteu reagentas (,,SigmaAldrich“, St. Louis, JAV), natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma-Aldrich“, St. Louis, JAV), DPPH reagentas („Sigma-Aldrich”, Vokietija), troloksas (,,Sigma-Aldrich“ St. Louis, JAV).
2.3 Naudota aparatūra ir priemonės
Vakuuminė džiovinimo spinta „SPT-200. Vacuum Drier“ (Krakow, Lenkija), elektrinis malūnėlis (Coffee grinder, “First”, Austrija), analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija), mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija), ultragarsinė vonelė („Bandelin Sonorex Digital 10 P“, Vokietija), mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV), popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija), spektrofotometras („Beckman DU – 70”, 4273041, „Beckman Instruments”, JAV).
2.4 Tyrimų metodai
2.4.1 Nuodžiūvio nustatymas arbatose
Nuodžiūvis nustatytas Europos farmakopėjos reikalavimus atitinkančiu metodu. [119] Tiriamos žaliavos mėginys smulkinamas elektriniu malūnėliu iki 10 mm dydžio dalelių. Biuksai išdžiovinami iki pastovios masės džiovinimo spintoje. Pasvertuose biuksuose sveriami trys mėginiai po 2 g (±0,01 g tikslumu). Žaliava džiovinama 100-105 °C temperatūroje iki pastovios masės. Džiovinimo pradžią nusako laikas, kai džiovinimo spintoje temperatūra siekia 100-105 °C. Pirmą kartą mėginiai sveriami po 2 val., o pastovioji masė nustatoma jei du paskutinieji svėrimai, praėjus 30 min. po džiovinimo ir dar 30 min. po vėsinimo eksikatoriuje, skiriasi ne daugiau ± 0,001 g.
Nuodžiūvis skaičiuojamas, remiantis formule:
= ( − )× 100%
m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g);
Nuodžiūvis išreiškiamas procentais. Galutinis rezultatas – trijų svėrimų aritmetinis vidurkis, kuris skaičiuojamas dešimtųjų procento dalių tikslumu. Tarp vienu metu atliekamų nuodžiūvio nustatymo mėginių leidžiamieji nuokrypiai turi būti ne didesni kaip ± 0,5%. [91]
2.4.2 Ekstraktų ruošimo metodika
Gaminami skirtingų prekinių ženklų žaliosios ir juodosios arbatos etanoliniai ekstraktai. Žaliavos ir etanolio santykis 1:10. [120, 121] Atsveriama po 2 g (±0,01) kiekvienos žaliosios ir juodosios arbatos. Užpilama 20 ml (±0,01) 50 proc. V/V etanoliu. Pamaišoma, kad ekstrahentas sudrėkintų ir apsemtų naudojamą augalinę žaliavą. Ekstrahuojama mechaninėje purtyklėje 3 valandas, uždaruose rudo stiklo buteliukuose. Ekstrakcijos temperatūra – kambario, mechaninės purtyklės amplitudė – 250.
Pasibaigus purtymo laikui, vykdoma tolimesnė ekstraktų maceracija. Jie paliekami laboratorijoje 48 valandoms. Laikomi apsaugoti nuo šviesos, kambario temperatūroje, sandariai uždaryti. Po 48 val. gauti ekstraktai nufiltruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą filtrą. Išpilstomi į švarius tamsaus stiklo buteliukus, gerai uždaromi ir laikomi kambario temperatūroje, apsaugoti nuo šviesos.
Gaminama po tris kiekvienos arbatos mėginio etanolinius ekstraktus. Maceracija vykdoma tokiomis pačiomis sąlygomis.
2.4.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometriškai, atliekant reakciją su aliuminio (III) chlorido tirpalu rūgščioje aplinkoje. Ekstraktas parūgštinamas acto rūgšties tirpalu. Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas lyginant tiriamosios vaistinės augalinės žaliavos ekstraktų absorbcijos koeficientą su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos keoficientu.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml etanolinio tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. vandeninio acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. vandeninio aliuminio (III) chlorido tirpalo ir 0,4 ml 5 proc. vandeninio heksametilentetramino tirpalo. Mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės ir gerai sumaišomas. Po 30 min. spektrofotometru matuojamas paruošto tirpalo šviesos absorbcijos dydis esant 407 nm bangos ilgiui.
Palyginamojo tirpalo paruošimas. Į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 2 ml etanolinio tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. vandeninio acto rūgšties tirpalo. Skiedžiama distiliuotu vandeniu iki nurodytos žymės, sumaišoma.
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami etaloniniai rutino tiriamasis ir palyginamasis tirpalai. Tačiau skirtingai nuo tiriamojo tirpalo vietoj 0,2 ml paruoštos augalinės žaliavos ištraukos pilama 0,2 ml etaloninio rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas taip: 0,0125 g rutino (tikslus svėrinys) tirpinama 70 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos matavimo kolbutėje.
Vaistinėje augalinėje žaliavoje esantis bendras flavonoidų kiekis, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais (X), apskaičiuojamas pagal formulę:
= ( ) × ( ž) × ( ž) × 100 ( ž) × ( ) × 25
m(r) – rutino masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti; V(važ) – paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto tūris mililitrais;
A(važ) – paruoštas vaistinės augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m(važ) – vaistinės augalinės žaliavos masė gramais, sunaudota ištraukai ruoši; A(r) – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis. [60, 91, 120, 122]
2.4.4 Raugų kiekio nustatymas
Kininio arbatmedžio žaliavoje esantis raugų kiekis nustatomas titrimetriniu metodu. Titrimetriniai metodai paremti raugų oksidacijos – redukcijos reakcijomis. Raugai nustatomi oksidatoriais, pvz., kalio permanganatu. Taninai nustatomi oksidinant juos kalio permanganato tirpalu, dalyvaujant indigosulfonrūgščiai. [91]
Pasveriami 2 g susmulkintos augalinės žaliavos. 500 ml kolboje žaliava užpilama 250 ml verdančio vandens. Sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi ir dažnai pamaišant virinama vandens vonioje 30 min. Tuomet atvėsinama iki kambario temperatūros. Apie 100 ml gautos ištraukos atsargiai, kad nepatektų žaliavos dalelių, nukošiama per vatą į 200-250 ml kolbą. Į 750 ml kolbą įpilama 25 ml gautos ištraukos, 500 ml vandens ir 25 ml indigosulfonrūgšties tirpalo. Nuolatos maišant titruojama kalio permanganato 0,02 M tirpalu iki geltonos spalvos atsiradimo. Spalva lyginama su kartu atliekamo tuščiojo mėginio tirpalo spalva.
1 ml 0,02 M kalio permanganato tirpalo atitinka 0,004157 g raugų (perskaičiavus į taniną). Visiškai sausos žaliavos raugų kiekis procentais apskaičiuojamas pagal formulę:
=( − ) × 0,004157 × 250 × 100 × 100
× 25 × (100 − ) =
( − ) × 415,7 × (100 − )
V – tiriamos žaliavos ištraukai titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml;
V1 – tuščiajam mėginiui titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml;
m – žaliavos masė g; W – žaliavos drėgmė %.
Indigosulfonrūgšties tirpalas gaminamas 1,0 g indigokarmino ištirpinant 25 ml sulfato rūgšties, tuomet įpilama dar 25 ml sulfato rūgšties ir atsargiai praskiedžiama vandeniu iki 110 ml. [91]
2.4.5 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendro fenolinių junginių kiekis etanoliniuose kininio arbatmedžio žaliavos ekstraktuose nustatytas remiantis Folin – Ciocalteu kolorimetriniu metodu.
Folin - Ciocalteu reagentas 10 kartų praskiedžiamas distiliuotu vandeniu ir gaunamas darbinis reagentas. Paruošiamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas: 15 g natrio karbonato tirpinama 200 ml matavimo kolboje ir pripilama distiliuoto vandens iki žymės. Tiriamasis tirpalas paruošiamas 0,2 ml tiriamojo ekstrakto sumaišant su 5 ml darbinio Folin-Ciocalteu reagento ir 4 ml natrio karbonato tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui. Jei tiriamųjų mėginių absorbcija didesnė nei etaloninių galo rūgšties tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai yra skiedžiami. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:
= × ; /
C - galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V - ekstrakto tūris (ml);
m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g)
Paruošti standartiniai etanoliniai galo rūgšties tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale 0,03125 -0,5 mg/ml. Bendras fenolinių junginių kiekis vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono galo rūgšties kalibracinę kreivę. [5, 123, 124] Galo rūgšties kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pateikti 9 paveiksle.
2.4.6 Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas
Antiradikalinis aktyvumas įvertinamas ekstraktą veikiant 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH●) tirpalu. DPPH radikalų surišimo metodas yra techniškai paprastas ir greitas, atliekamas naudojant spektrofotometrą. Violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčių junginių į blankiai geltoną hidraziną. [125, 126]
Darbinio DPPH tirpalo paruošimas. 0,0017 g DPPH reagento (tikslus svėrinys) ištirpinama 96,3 proc. (V/V) etanolyje, 100 ml matavimo kolbutėje.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į mėgintuvėlį įpilama 20 μl tiriamojo vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto ir 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Gerai sumaišoma ir laikoma 30 min. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Po 30 min. matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos sumažėjimas esant 517 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – 96,3 proc. (V/V) etanolis.
Antiradikalinis aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:
= × ; /
C - trolokso koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V - ekstrakto tūris (ml);
m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g)
Trolokso kalibracinė kreivė gaunama tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje tiriamojo ekstrakto pilama 20 μl žinomos koncentracijos (1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml) trolokso tirpalo. Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 10 paveiksle.
2.4.7 Statistiniai analizės metodai, naudoti duomenų apdorojimui
Duomenų analizė atlikta programa „Microsoft Office Excel 2010“ (Microsoft, JAV). Kiekvieno tyrimo etapo matavimai kartojami tris kartus, rezultatai pateikiami kaip gautų duomenų aritmetinis vidurkis, nurodant standartinį nuokrypį (± SN). Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas taikant Pirsono koreliacijos koeficientą.
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Arbatų nuodžiūvis
Remiantis Europos farmakopėjos straipsniu (Ph. Eur. 2.2.32) nustatytas Camellia sinensis L. žaliavos nuodžiūvis. Arbatos rūšis, prekinis ženklas ir gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Kininio arbatmedžio žaliavos nuodžiūvio įvairavimas arbatos mėginiuose
Eilės nr. Arbatos rūšis Prekinis ženklas Nuodžiūvis, proc. (±SN)
1 Juodoji „Cento“ 7,12 ± 0,1
2 Juodoji „Favorit“ 7,38 ± 0,4
3 Juodoji „Greenfield“ 5,6 ± 0,1
4 Juodoji biri „Greenfield“ 7,5 ± 0,4
5 Juodoji „Loyd“ 7,17 ± 0,2
6 Juodoji „Lipton“ 7,32 ± 0,3
7 Juodoji biri „Dilmah“ 6,53 ± 0,2
8 Juodoji „Dilmah“ 6,57 ± 0,0
9 Juodoji biri „Batik“ 7,11 ± 0,1
10 Žalioji su citrina „Akbar“ 6,67 ± 0,2
11 Žalioji su citrina „Batik“ 6,91 ± 0,2
12 Žalioji „Iki“ 6,99 ± 0,3
13 Žalioji „Favorit“ 7,2 ± 0,0
14 Žalioji „Lipton“ 6,55 ± 0,1
15 Žalioji „Dilmah“ 7,05 ± 0,1
16 Žalioji biri „Presto“ 7,11 ± 0,4
Gauti rezultatai rodo, kad tirtuose arbatos mėginiuose nustatytas nuodžiūvis svyruoja tarp 5,6 - 7,5 proc. Atsižvelgiant į EP keliamus reikalavimus, vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis negali būti didesnis kaip 13 proc. Esant didesniam drėgmės kiekiui, suaktyvėję fermentai skaido glikozidus, augalinė žaliava pelija, netenka natūralios spalvos, kvapo ir skonio. [91] Arbatos mėginiai, naudojami tyrime, atitinka EP keliamus reikalavimus, nes neviršija leidžiamų nuodžiūvio ribų. Tolimesni tyrimų rezultatai pateikiami absoliučiai sausai žaliavai.
3.2 Ekstrakcijos metodo optimizavimas kininių arbatmedžių augalinei žaliavai
Siekiant išgauti kuo didesnį veikliųjų junginių kiekį, svarbu nustatyti efektyviausią ekstrakcijos metodą ir jo sąlygas. Parenkamas tinkamiausio poliškumo tirpiklis, įvertinamas metodo efektyvumas, atliekant ekstrakciją ultragarso vonelėje ir maceraciją purtyklėje, bei laiko įtaka ekstrakcijos efektyvumui. [127] Optimaliausias ekstrakcijos metodas buvo parinktas atsižvelgiant į didžiausią bendrą flavonoidų kiekį, kuris nustatomas spektrofotometriškai.
Tinkamiausio poliškumo tirpiklio ir jo koncentracijos parinkimas. Ekstrakcijai naudojamo tirpiklio poliškumas yra viena svarbiausių savybių lemiančių jo pasirinkimą. Mažiau poliški flavonoidai (pvz., izoflavonai, flavonoidai, flavonai ir flavonoliai) yra ekstrahuojami chloroformu, dichlormetanu, dietilo eteriu arba etilo acetatu. Flavonoidų glikozidai ir labiau poliški aglikonai ekstrahuojami alkoholiu arba alkoholio ir vandens mišiniu. Glikozidai padidina tirpumą vandenyje, todėl alkoholio ir vandens mišinys yra vienas geriausių pasirinkimų ekstrahuojant šiuos junginius. Flavonoidai iš augalinės žaliavos dažniausiai ekstrahuojami atliekant nesudėtingą tiesioginę ekstrakciją tirpikliu. [96]
Ekstrahuojant biologiškai aktyvius junginius iš kininio arbatmedžio augalinės žaliavos yra atliekama kietasis kūnas – skystis ekstrakcija. Dažniausiai naudojami tirpikliai yra etanolis, metanolis, etanolio ir vandens mišiniai. Ekstrakcijoje naudojamo tirpiklio poliškumui nustatyti naudojami šie tirpikliai: distiliuotas vanduo, 30 proc., 50 proc., 70 proc. ir 96 proc. V/V etanolio ir vandens mišiniai. Tiriamieji ekstraktai gaminami iš atsitiktinai parinktos arbatos augalinės žaliavos. Atsveriami 2 g (± 0,01) pasirinktos vaistinės augalinės žaliavos, suberiami į kūginę kolbutę, užpilama 20 ml vandens arba skirtingų koncentracijų etanolio ir vandens mišiniais V/V: 30 proc., 50 proc., 70 proc., 96 proc. Sandariai užkemšma. Vykdoma maceracija mechaninėje purtyklėje 1 val., kambario temperatūroje. Gauti ekstraktai nufiltruojami pro vandeniu sudrėkintą filtrą ir nustatomas bendras flavonoidų kiekis kiekviename mėginyje. Bandymas kartotas tris kartus, rezultatai pateikti 11 paveiksle.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Vanduo 30% 50% 70% 96% F lavonoid ų ki ekis, pr o c .
Etanolio konc. V/V, proc.
11 pav. Bendras flavonoidų kiekis naudojant vandenį ir skirtingos koncentracijos vandens – etanolio mišinius
