MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
RIMA URBŠTAITĖ
JAPONINIŲ SVARAINIŲ (CHAENOMELES JAPONICA (THUNB.) LINDL. EX SPACH) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Mindaugas Liaudanskas
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
JAPONINIŲ SVARAINIŲ (CHAENOMELES JAPONICA (THUNB.) LINDL. EX SPACH) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Data Darbo vadovas Dr. Mindaugas Liaudanskas Data Darbą atliko Magistrantė Rima Urbštaitė Data KAUNAS, 2018
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Svarainių (Chaenomeles Lindl.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas, morfologiniai požymiai ... 10
1.2. Japoninių svarainių vaisių, sėklų, lapų ir šaknų cheminės sudėties tyrimai ... 13
1.3. Fenolinių junginių ekstrakcijos iš svarainių vaisių metodai ... 15
1.4. Svarainiuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių poveikio tyrimai ... 17
1.5. Japoninių svarainių vaisių panaudojimas maisto pramonėje ... 19
1.6. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 20
2. METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Naudoti reagentai ... 22
2.3. Naudota aparatūra ... 22
2.4. Japoninių svarainių vaisių ėminių ištraukų paruošimas ... 23
2.5. Tyrimo metodai ... 23
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 23
2.5.2. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas ... 24
2.5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas ... 25
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 25
2.5.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 28
2.6. Tyrimo duomenų analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas ... 29
3.2. Lietuvoje auginamų japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 31
3.2.1. Fenolinių junginių kiekinės sudėties nustatymas svarainių vaisių ėminiuose ... 32
3.2.2. Japoninių svarainių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas . 34 3.2.3. Japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 36
3.3. Skirtingų veislių japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimas
... 37
3.3.1. Japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 38
3.3.2. Japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas ESC metodu ... 40
3.3.3. Japoninių svarainių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 43
3.3.4. Japoninių svarainių vaisių ėminių individualių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 45
3.4. Rezultatų apibendrinimas ... 46
4. IŠVADOS ... 48
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
6. LITERATŪRA ... 51
R. Urbštaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Mindaugas Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Japoninių svarainių (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. Ex Spach) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimas.
Tyrimo tikslas: ištirti Lietuvoje auginamų svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai: Atlikti Lietuvoje auginamų Chaenomeles japonica vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymą. Pritaikius spektrofotometrijos metodą, atlikti skirtingose Lietuvos vietovėse surinktų svarainių vaisių ir skirtingų veislių (ꞌAbavaꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌRasaꞌ, ꞌRondoꞌ) svarainių vaisių kiekinės sudėties ir antioksidacinio aktyvumo in vitro palyginamuosius tyrimus. ESC metodu nustatyti svarainių vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ꞌAbavaꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌRasaꞌ, ꞌRondoꞌ veislių svarainių ėminiuose. Įvertinti priklausomybę tarp svarainių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro ir svarainių vaisių ėminiuose nustatyto bendro fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių, proantocianidinų kiekio ir identifikuotų fenolinių junginių kiekio.
Tyrimo objektas ir metodai: Lietuvos klimato sąlygomis auginamų svarainių veislių ꞌAbavaꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌRasaꞌ, ꞌRondoꞌ ir neveislinių svarainių surinktų iš 20 skirtingų Lietuvos vietovių vaisių ėminiai. Bendras fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių, proantocianidinų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas in vitro vertintas UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Pritaikius ESC metodą, nustatyta kokybinė ir kiekinė fenolinių junginių sudėtis.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas (42,08±0,18 mg GRE/g (p<0,05)) Buivydiškių k. (Vilniaus raj.) auginamų svarainių vaisiuose. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, įvertinus DPPH, TFPH ir CUPRAC metodais, pasižymėjo svarainių ėminiai surinkti Buivydiškių k. (Vilniaus raj.). Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (30,75±0,06 mg GRE/g, p<0,05) nustatytas svarainių veislės 'Rasa' vaisių ėminiuose. Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių ir bendras proantocianidinų kiekis nustatytas 'Darius' veislės svarainių ėminiuose, atitinkamai 3,16±0,02 mg CRE/g (p<0,05) ir 4,37±0,06 mg EE/g (p<0,05). Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu, įvertinus ABTS, TFPH, DPPH, FRAP metodais, pasižymėjo 'Rasa' veislės svarainių vaisių ištraukos, vertinant ABTS, TFPH, CUPRAC metodais − 'Darius' veislės svarainių vaisių ištraukos. Atlikus svarainių veislių ėminių ESC kokybinę analizę identifikuoti 5 junginiai: (-)-epikatechinas, chlorogeno rūgštis, izokvercitrinas, rutinas ir (+)-katechinas. Nustatytas labai stiprus ryšys tarp chlorogeno rūgšties kiekio ir redukcinio aktyvumo, įvertinto CUPRAC metodu r=0,949 (p<0,05).
The title of the master thesis. Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in Japanese quince (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach) fruits.
The aim of the research. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of fruits of Japanese quince, which grow in Lithuanian climatic conditions and to evaluate the antioxidant activity in vitro of their extracts.
The objectives of the research. To select the extraction conditions of phenolic compounds from the samples of fruits of Japanese quince. To determine the quantitative composition of phenolic compounds and antioxidant activity in vitro variation in the samples of quince fruits, which have grown in different places in Lithuania, and quince fruits of cultivars ꞌRondoꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌAbavaꞌ, ꞌRasaꞌ. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of quince fruits cultivars ꞌRondoꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌAbavaꞌ, ꞌRasaꞌ by HPLC methodology. To evaluate correlation between quince fruit extract containing quantitative composition of total phenolic compounds, hydroxycinnamic acid derivatives, proantocianidins, identified phenolic compounds and the antioxidant activity in vitro. The object and methods of the research. The samples of fruits of Japanese quince fruits cultivars ꞌRondoꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌAbavaꞌ, ꞌRasaꞌ and Japanese fruits, which grown in 20 different places in Lithuania. Total phenolic compounds amount, total hidroxycinnamic acid derivatives amount, total proantocianidins amount and antioxidant activity of Japanese quince extract were determined by UV– VIS spectrophotometric analysis method. The qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was performed by HPLC method.
The results and conclusions of the research. The highest amount of total phenolic compounds (42.08±0,18 mg GRE/g (p<0.05)) were determinated in the sample of quince fruit from Buivydiskiai (Vilnius distr.). The strongest DPPH, TFPH, CUPRAC antioxidant activity was determinated in extract of the samples of quince fruit from Buivydiskiai (Vilnius distr.). The highest amount of total phenolic compounds (30.75±0.06 mg GRE/g (p<0.05)) were determinated in the sample of quince fruit of cultivar 'Rasa'. The highest total hidroxycinnamic acid derivatives amount 3.16±0.02 mg CRE/g (p<0.05) and total proantocianidins amount 4.37±0.06 mg EE/g (p<0.05) were determinanted in the sample of fruits of cultivar 'Darius'. The strongest ABTS, TFPH, DPPH, FRAP antioxidant activity was determinated in extract of cultivar 'Rasa' fruit. The strongest ABTS, TFPH, CUPRAC antioxidant activity was determinated in extract of cultivar 'Darius' fruit. The five phenolic compounds ((-)-epicatechin, chlorogenic acid, isoquercitin, rutin, (+)-catechin) were identified and quantified by HPLC method. Very strong correliation was determined between the chlorogenic acid and quince fruit extract reduction activity, which was measured by CUPRAC method (r=0.949, p<0.05).
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;COX-1 – ciklooksigenazė-1; COX-2 – ciklooksigenazė-2;
CV – variacijos koeficientas (anglų k. coefficient of variation)
CUPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Cupric ion reducing antioxidant
capacity);
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas; EE – (-)-epikatechino ekvivalentas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant
power);
GRE – galo rūgšties ekvivalentas;
LAMMC – Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centras NSM – neveislinių svarainių mišinys;
NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo; TE – trolokso ekvivalentas;
TFPH – trifluorperazino dihidrochloridas; TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas;
ĮVADAS
Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos 2010 m. pateiktais duomenimis nepakankamas vaisių ir daržovių vartojimas buvo susijęs su 6,7 milijonų žmonių mirčių [83]. Biologiškai aktyvūs junginiai, esantys vaisiuose ir daržovėse, gali padėti palaikyti tinkamą sveikatos būklę ir išvengti neinfekcinių ligų vystymosi [54, 83]. Dėl šios priežasties mokslininkai atlieka įvairius augalų tyrimus, siekdami išsiaiškinti, kokie junginiai pasižymi žmogaus organizmui naudingomis savybėmis. Viena plačiausiai tiriamų biologiškai aktyvių junginių grupių yra fenoliniai junginiai, pasižymintys antioksidaciniu, priešvirusiniu, priešmikrobiniu, antibakteriniu ir priešvėžiniu poveikiais [40]. Fenoliniai junginiai geba apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso, taip išsaugojant jų struktūrines ir fiziologines funkcijas [67, 69]. Dažnai augalinėje žaliavoje esantis fenolinių junginių kompleksas turi stipresnį biologinį poveikį nei atskiri kompleksą sudarantys junginiai, o norint pasiekti didesnį teigiamą poveikį sveikatai, augaliniai preparatai turi būti vartojami nuolat [40, 67]. Fenoliniai junginiai dėl jų biologinio aktyvumo gali būti potencialiai vertingi panaudojimui praktinėje medicinoje, farmacijoje, kosmetikoje, maisto papildų ir funkcinio maisto gamybai [12, 69].
Perspektyvus natūralių fenolinių junginių šaltinis yra japoninių svarainių vaisiai. Japoninis svarainis (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach) yra dekoratyvus augalas, kurio vaisių panaudojimas Rytų Azijos medicinoje buvo žinomas prieš 3000 metų [26]. Dauginimas sėklomis nulėmė japoninių svarainių morfologinių požymių ir biologiškai aktyvių komponentų kiekio įvairavimą [63]. Siekiant sumažinti šiuos įvairavimus, pagerinti vaisių estetinę išvaizdą, padidinti užauginamą derlių ir biologiškai aktyvių junginių kiekį, atliekama augalų selekcija ir išvedamos naujos japoninių svarainių veislės [6, 7].
Japoninių svarainių vaisių fenolinių junginių sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų svarainių kokybinę ir kiekinę sudėtį bei įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Gauti tyrimų rezultatai pateiks naujų žinių apie Lietuvos klimato sąlygomis auginamų japoninių svarainių vaisių sudėties įvairavimą, leis išsiaiškinti perspektyviausias svarainių veisles, kurių vaisiuose sukaupiami didžiausi fenolinių junginių − natūralių antioksidantų kiekiai. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, bus galima pateikti moksliškai pagrįstas išvadas apie tolesnių tyrimų būtinybę, siekiant įvertinti Chaenomeles japonica vaisių panaudojimo perspektyvas farmacijoje ir medicinoje.
Šio mokslinio darbo tikslas − ištirti Lietuvoje auginamų svarainių vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Lietuvoje auginamų Chaenomeles japonica vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas.
2. Ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse užaugintų svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį analizės metodą
3. Nustatyti skirtingose Lietuvoje vietovėse auginamų Chaenomeles japonica vaisių ėminių etanolinių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro, taikant spektrofotometrinį metodą.
4. Atlikti svarainių veislių ꞌAbavaꞌ, ꞌDariusꞌ, ꞌRasaꞌ ir ꞌRondoꞌ vaisių ėminių kiekinės sudėties bei antioksidacinio aktyvumo in vitro palyginamuosius tyrimus, taikant spektrofotometrinį analizės metodą.
5. ESC metodu nustatyti skirtingų svarainių veislių vaisių ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
6. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Svarainių (Chaenomeles Lindl.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas,
morfologiniai požymiai
Karalystė: Augalai – Plantae;
Skyrius: Magnolijūnai (Gaubtasėkliai) – Magnoliophyta (Angiospermae); Klasė: Magnolijainiai (Dviskilčiai) – Magnoliopsida (Dicotyledones); Poklasis: Erškėčiažiedžiai – Rosidae;
Eilė: Erškėtiečiai – Rosales;
Šeima: Erškėtiniai – Rosaceae Juss.;
Pošeimis: Obelinių – Maloideae C. Weber (Pomoideae Juss.); Gentis: Svarainiai – Chaenomeles Lindl. [13, 14, 81].
Svarainiai yra erškėtinių (Rosaceae) šeimos, obelinių (Maloideae) pošeimio augalai [13]. Filogenetiškai Chaenomeles gentis artima cidonijos (Cydonia Mill.), kriaušės (Pyrus L.) ir obels (Malus Mill.) gentims [13]. Chaenomeles genčiai priskiriamos keturios svarainių rūšys: C. japonica, C.
cathayensis, C. speciosa, C. thibetica, ir jos tarprūšiniai hibridai: Chaenomeles superba (puošnusis
svarainis, C. speciosa × C. japonica), Chaenomeles californica (C. cathayensis x C. japonica),
Chaenomeles clarkiana (C. cathayensis × C. japonica) ir Chaenomeles vilmoriniana (C. cathayensis × C. speciosa) [63, 77].
Chaenomeles genties augalai kilę iš Rytų Azijos – Kinijos ir Japonijos [77]. Japoninis svarainis
(Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach) yra vienas seniausių kultūrinių augalų, kuris kinų medicinoje buvo naudotas prieš 3000 metų [26]. Šio nykštukinio krūmo auginimas palaipsniui išplito po visą pasaulį [26]. Į Europą C. japonica atvežtas VI a. ir dabar daugiausiai auginamas šiaurės Europos šalyse: Suomijoje, Švedijoje, Estijoje, Latvijoje, Lietuvoje ir Lenkijoje [37, 77]. Kitos Chaenomeles genties rūšys C. speciosa (gražusis svarainis), C. thibetica, C. cathayensis yra mažiau prisitaikiusios augti šiaurės Europos klimato juostoje, todėl čia sutinkamos retai [43]. Prie Lietuvos gamtinių sąlygų labiausiai prisitaikiusi C. japonica ir jos tarprūšiniai hibridai su C. speciosa [13].
Baltijos regione japoninių svarainių (C. japonica) auginimo vystymas prasidėjo 1951 metais Latvijoje [63]. 1993 metais plantacijų plotas Latvijoje ir Lietuvoje siekė daugiau nei 400 ha, tačiau augalų dauginimas sėklomis lėmė vaisių charakteristikų įvairavimą [63]. Šis netolygumas sukėlė lauko valdymo problemų, produkcija tapo mažai pelninga [63]. Tuo pačiu metu, po nepriklausomybės atgavimo Baltijos šalyse, importuojami egzotiškų vaisių koncentratai sustiprino konkurenciją, o susidomėjimas japoninių svarainių auginimu dar labiau sumažėjo [63]. Šiuo metu susidomėjimas
Chaenomeles japonica vaisių auginimu Lietuvoje iš lėto didėja: 2015 metais deklaruotas svarainių
vaiskrūmių plotas sudarė 30 ha, 2016 metais 35,51 ha, o 2017 metais 38,43 ha [16, 17, 18].
Japoninis svarainis – Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach yra 50−100 cm krūmas [77]. Augalas atsparus žemoms temperatūroms ir gerai žiemoja, todėl tinkamas auginti soduose, parkuose, sodybose [14, 71]. Japoninių svarainių šakos gausiai dygliuotos 1−1,5 cm ilgio spygliais [63]. Jauni svarainių ūgliai plaukuoti, vėliau tampa pliki [77]. Lapai yra 3−5 cm ilgio, ovalūs ar atvirkščiai kiaušiniški su plačiai dantytais kraštais, pliki, su pamatu nusmailėjusiu į lapkotį [77]. Viršutinė lapo pusė tamsiai žalia, plika ir blizganti, o apatinė šviesesnės spalvos [77].
Krūmas žydi balandžio pabaigoje ir gegužės mėnesį [14, 77]. Žydėjimo periodas trunka apie 3−4 savaites, tai leidžia kai kuriems žiedams išvengti vėlyvų pavasario šalnų [48]. C. japonica turi nuo 1 iki 8 2−3 cm skersmens žiedų, susitelkusių trumpomis kekėmis ant dvimečių ar senesnių šakų (1 pav.) [4, 48, 63]. Žiedas turi 5 taurėlapius ir 5 vainiklapius [63]. Vainiklapių spalvos gali skirtis nuo baltos iki tamsiai raudonos, pereinant rožinę, oranžinę ir raudoną spalvas, dažnai būna dviejų spalvų žiedlapių [63]. Kuokelių daug – 40−60 [48, 63]. Jų ilgiai šiek tiek skiriasi, kuokeliai išsidėstę dviem ratais [63]. Piestelės turi 5 liemenėlius, trečdalis ar pusė jų ilgio suauga į vieną suformuodami vamzdelį, tai yra Chaenomeles genties augalams būdinga savybė [63]. Apdulkinimui svarbios yra bitės ir kamanės, kurias traukia didelis kiekis nektaro, tačiau žiedai nėra kvapūs [63]. Moteriškasis gametofitas vystosi apatinėje mezginėje [48]. Kiekviena sėklalizdė turi apie 20 dviem eilėmis išsidėsčiusių sėklapradžių [48]. Sėklalizdėje funkcionuojančių sėklapradžių, iš kurių po apvaisinimo gali išsivystyti sėklos, yra apie 6−10 [48].
Japoninių svarainių vaisiai – obuoliai, kurie yra mažiausi gentyje [63]. Svarainių skersmuo yra apie 4 cm, o svoris neviršija 50 g (2 pav.) [38, 71]. Vaisiai yra nuo žaliai geltonos iki tamsiai geltonos spalvos [71]. Sėklos sudaro 4−13 proc., minkštimas 36−50 proc., o sultys 41−52 proc. vaisiaus masės [43, 61]. Svarainiuose esantys eterinio aliejaus komponentai suteikia specifinį ir malonų aromatą [11]. Vaisiai nunoksta spalį [14]. Jie nėra jautrūs oksidaciniam rudavimo procesui, nes svarainių vaisių sultys turi didelį kiekį askorbo rūgšties ir fenolinių junginių, kurie veikia kaip
1 pav. Chaenomeles japonica žiedai
2 pav. Chaenomeles japonica vaisiai
natūralūs antioksidantai [63]. Vaisius laikant 1 oC temperatūroje, esant 85 proc. santykinei oro drėgmei,
maksimali svarainių laikymo trukmė gali būti 9 savaitės be reikšmingo vaisių kokybės sumažėjimo [74]. Laikant 5 oC temperatūroje, esant 80 proc. santykinei oro drėgmei, šis laikas sumažėja iki 4 savaičių [74].
Svarainių sėklų skaičius ir dydis priklauso nuo veislės ir sunokimo laipsnio [13]. Svarainių vaisių viduje būna nuo 16 iki 80 sėklų, o jų masė sudaro nuo 2,9 proc. iki 9,1 proc. vaisiaus masės [13]. Sėklos rudos, lygiu ir blizgiu paviršiumi, lašo formos [14]. Prinokimo ženklas yra lipnios luobelės ir rudos sėklos [63]. Visos Chaenomeles augalų rūšys gali būti lengvai dauginamos generatyviniu būdu [63]. Iš sėklų išauginti augalai pradeda derėti trečiaisiais – ketvirtaisiais metais [4]. Siekiant sumažinti vaisių charakteristikų įvairavimą, reikėtų propaguoti vegetatyvinį augalų dauginimą – atžalomis, atlankomis, auginiais [4, 63]. Auginiai virš 20 cm greičiau įsišaknija, užaugina daugiau šaknų ir geriau išgyvena žiemos laikotarpį [63].
Siekiant pagerinti japoninių svarainių genetines savybes, jų derlingumą ir vaisių kokybę, bendradarbiaujat Latvijos, Lietuvos, Švedijos ir Suomijos mokslininkams, pradėta svarainių veislių kūrimo programa [6]. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės institutas išvedė dvi kultūrines japoninių svarainių veisles 'Rondo' ir 'Darius', kurios išlaikė DUS (išskirtinumo, vienodumo ir stabilumo) testus ir buvo įregistruotos Europos Sąjungoje [47]. 2016 metais šios Lietuvoje išvestos svarainių veislės įtrauktos į Lietuvos augalų nacionaliniams genetiniams ištekliams priskirtų sodo ir daržo augalų sąrašą, o tai užtikrina šių veislių tausojimą ir išsaugojimą [1, 5]. Šiek tiek vėliau Latvijoje įregistruota japoninių svarainių veislė 'Rasa' [47]. 'Darius', 'Rondo' ir 'Rasa' veislės pagerino vaisių kokybę ir produktų charakteristikas [44].
Visos trys veislės 'Darius', 'Rondo' ir 'Rasa' pasižymi tuo, kad jų krūmai neturi spyglių, lapai atsparūs dėmėms, augalai gerai žiemoja, vaisiai subręsta anksti rudenį, rugsėjo pradžioje, ir yra atsparūs puvimui [7]. Šių veislių krūmai yra produktyvūs [7]. Bendras penkerių metų vaisių derlius nuo 'Darius' veislės vaiskrūmių yra 20,4 kg, 'Rasa' − 21,9 kg, 'Rondo '− 28 kg [7]. Maksimalus derlius nuo vieno 'Rondo' veislės svarainių krūmo per sezoną yra 10 kg, o 'Darius' veislės − 9 kg svarainių vaisių [7].
Kiekviena veislių ('Darius', 'Rasa', 'Rondo') turi savitųjų veislei būdingų bruožų [7, 59]. Lietuviška 'Rondo' veislė pasižymi gana dideliais krūmais, kurie žydi oranžinės spalvos žiedais ir nesutankėja [7]. Šios veislės vaisiai geltoni apie 40−50 g [7, 59]. 'Rondo' veislės svarainių vaisiuose vidutiniškai susikaupia 92,3 mg/100 g askorbo rūgšties [7]. Kitos lietuviškos svarainių veislės 'Darius' krūmas yra mažas su keliomis pagrindinėmis šakomis, ant kurių sukraunami oranžinės spalvos žiedynai [7]. Šios veislės vaisiai būna oranžinės spalvos ir apie 40 g svorio bei juose susikaupia vidutiniškai 68 mg/100 g askorbo rūgšties [7, 59]. Latvijoje išvestos veislės 'Rasa' krūmai yra vidutinio aukščio ir subrandina geltonos spalvos vaisius, kurių masė yra 35−40 g [7]. 'Rasa' veislės vaisiai turi apie 63 mg/100 g askorbo rūgšties [7].
Literatūroje yra duomenų apie Lenkijoje, Skernevicės sodininkystės institute, sukurtų veislių svarainių lapų kaupiamų biologiškai aktyvių junginių tyrimus [72]. Ištyrus šiame institute išvestų veislių 'Debosz', 'Witaminnyj' ir 'Zoltogaraczyj' lapų ėminius, nustatyta, kad didžiausias kiekis fenolinių junginių yra japoninių svarainių 'Witaminnyj' veislės lapuose [72].
1.2. Japoninių svarainių vaisių, sėklų, lapų ir šaknų cheminės sudėties tyrimai
Svarainiai naudojami maisto pramonėje kaip natūralus antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių junginių šaltinis [13]. Šių junginių yra ne tik vaisiuose, bet ir jų sėklose, lapuose bei kituose augalo organuose [13].
Japoninių svarainių vaisiuose nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 19,3 mg/100g iki 7643,37mg/100g, o vaisių sultyse nuo 210,0 mg/100 ml iki 592,0 mg/100 ml [41, 71, 72]. Literatūros duomenimis net daugiau kaip pusę (apie 57,8 proc.) visų svarainių vaisiuose identifikuotų fenolinių junginių sudaro procianidinai [68]. Vaisiuose jų gali būti iki 2,5 g/100 g [71]. Mokslinių tyrimų metu identifikuoti šie flavonoidai: (-)-epikatechinas (sudaro iki 33 proc. fenolinių junginių kiekio), (+)-katechinas ir kvercetinas [68, 72, 77]. Tarp fenolinių rūgščių vyrauja chlorogeno rūgštis, jos nustatyta 4,4 proc. [68, 77].
Japoninių svarainių vaisių sultys pasižymi rūgštiniu terpės pH (2,5−2,8), kurį nulemia organinės rūgštys [43]. Svarainių vaisių sultyse nustatytos šios organinės rūgštys: askorbo rūgštis (45,3– 78,5 mg/100ml), obuolių rūgštis (3,18–,22 mg/100ml), citrinų rūgštis (3,2–4,0 mg/100g) , chino rūgštis (0,93–1,25 mg/100 ml), gintaro rūgštis (8,20–21,43 mg/100 ml) [26, 43]. Svarainių vaisiuose identifikuota dešimt amino rūgščių: fosfoserinas, asparto rūgštis, treoninas, serinas, asparaginas, glutamo rūgštis, alaninas, fenilalaninas, γ-amino sviesto rūgštis ir lizinas [43].
Vienas svarbiausių svarainių vaisių komponentų, lemiančių stiprų jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, yra askorbo rūgštis [63]. Askorbo rūgšties kiekis svarainių vaisiuose įvairuoja nuo 18 iki 233 mg/100g, varijavimą lemia aplinkos veiksniai ir augalo genotipas [11, 25]. Bieniasz ir kt. nustatė, kad vaisių laikymas, esant 7 oC temperatūrai ir 70 proc. santykinei oro drėgmei, statistiškai reikšmingai
sumažina vaisiuose esančios askorbo rūgšties kiekį 20 proc. per 2 savaites [26]. Mechaninis vaisių apdorojimas ir cukraus sirupo paruošimas askorbo rūgšties kiekį sumažina dviem trečdaliais, o cukraus sirupo pasterizavimas ir laikymas prisideda prie tolesnio askorbo rūgšties mažėjimo iki labai mažo kiekio [26].
C. japonica vaisiuose gausu skaidulų, kurios sudaro apie 4,66 proc. vaisiaus masės [25, 41].
Pektinų kiekis sudaro 29−39 g/100g sausos žaliavos [33]. Didžioji dalis pektinus sudarančių monomerų yra galakturono ir urono rūgštys [64]. Vaisių sultyse identifikuoti su fenoliniais junginiais, daugiausiai
(+)-katechinu, (-)-epikatechinu ir procianidinais, susijungę monosacharidai [41]. Vaisių sultyse daugiausiai nustatyta fruktozės 817,2−1218,4 mg/100 ml, gliukozės 308,3−630,5 mg/100 ml, sorbitolio 121,1−389,3 mg/100 ml ir ksilozės 73,1−211,9 mg/100 ml [43]. Kitų angliavandenių – stachiozės, rafinozės, cukrozės ir ramnozės − nustatyti kiekiaimažesni [43].
Japoninių svarainių vaisiuose nustatyta įvairių makro- ir mikroelementų: kalio 249 mg/100 g, natrio 4 mg/100g, kalcio 22,6−22,9 mg/100 g, geležies 0,516−1,8 mg/100 g, cinko 0,38−0,546 mg/100 g, mangano 0,18 mg/100 g ir vario 0,15−0,3 mg/100 g [25, 77]. Mažesniais kiekiais aptinkama kobalto, aliuminio, boro ir nikelio [4]. Vaisių sultyse nustatyti šie anijonai – fluorido 42,95−101,87 mg/100 ml ir chlorido 3,45−6,80 mg/100 ml [43].
C. japonica vaisiai pasižymi maloniu aromatu, kurį suteikia eterinio aliejaus komponentai [33].
Identifikuoti 60 lakiųjų junginių 33 skirtinguose japoninio svarainio genotipuose: 13 terpeninių angliavandenilių, 14 alkoholių, 5 ketonai, 14 aldehidų ir 14 esterių [71]. Irano mokslininkai Hazef-Taghva ir kt., ištyrę iš japoninių svarainių vaisių išskirtą eterinį aliejų, identifikavo 35 lakiuosius junginius [39]. C. japonica eteriniame aliejuje nustatyta daugiausiai monoterpenų, kurie sudarė apie 88,3 proc. eterinio aliejaus [39]. Tarp monoterpenų grupės junginių daugiausiai nustatyta karvakrolio (62,6 proc.), kitų junginių yra mažiau: 8 proc. limoneno, 4,9 proc. p-cimeno ir 3,2 proc. γ-terpineno [39]. Eteriniame aliejuje identifikuoti seskviterpenai, kurie sudarė 3,9 proc., bei neterpenoidiniai junginiai: aldehidai 1,4 proc., rūgštys 0,8 proc. ir esteriai 0,2 proc. [39].
Svarainių vaisiuose nustatyti ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai – vitaminai: tiaminas, riboflavinas ir karotenoidai: β-karotenas (1,6−1,8 μg/g), likopenas (19,9−21,1 μg/g) ir liuteinas (34,5−44,9 μg/g) [4, 41].
Japoninių svarainių sėklose yra 6,1−20 proc. aliejaus [12, 37, 52]. Japoninių svarainių sėklų aliejų sudaro devynios riebalų rūgštys tarp kurių dominuoja nesočiosios riebalų rūgštys (89 proc.) [37]. Daugiausiai yra linolo (omega-6) (iki 53 proc.) ir oleino (omega-9) riebalų rūgščių (iki 44 proc.) [37, 38, 52]. Šaltai spaustame sėklų aliejuje bendras tokoferolių kiekis yra 68,5−72,6 mg/100g [12, 37]. Iš tokoferolių didžiausią kiekį sudaro -tokoferolis 69,61−85,96 mg/100, kitų tokoferolių nustatyta žymiai mažiau – β-tokoferolio 0,67-0,69 mg/100 g, γ-tokoferolio 2,16−2,22 mg/100 g [37, 38, 53]. Japoninių svarainių sėklų aliejuje nustatytas β-karotenas (97−107,7 mg/100 g), skvalenas (6 mg/100 g) ir mažas kiekis chlorofilo (1,2 mg/100 g) [12, 37].
Šalto spaudimo metu dalis fenolinių junginių, esančių sėklose, patenka į aliejų [38]. Jų buvimas teigiamai veikia aliejaus stabilumą, nes fenoliniai junginiai suriša laisvuosius radikalus, o tai stabdo riebalų rūgščių oksidacijos procesus [38]. Bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas UV–regimosios šviesos spektrofotmetriniu Folin-Denis metodu, svarainių aliejuje yra iki 352 mg/100 g [53]. ESC metodu identifikuoti šie fenoliniai junginiai: 4-hidrobenzoinė rūgštis, vanilino rūgštis, vanilinas,
p-kumarino rūgštis, ferulo rūgštis, trans-cinamono rūgštis, chlorogeno rūgštis, alyvų rūgštis, galo rūgštis ir protokatecho rūgštis [38, 53]. Vanilino, p-kumaro ir ferulo rūgštys sudaro apie 90 proc. svarainių sėklų aliejaus fenolinių junginių kiekio [38]. Perdirbimo procesas neigiamai veikia aliejaus antioksidacines savybes, todėl perdirbant aliejaus antioksidacinis aktyvumas gali sumažėti 80 proc. [37]. Antioksidacinio aktyvumo mažėjimas perdirbimo metu susijęs su karotenoidų koncentracijos sumažėjimu net 99 proc. ir fenolinių junginių kiekio sumažėjimu nuo 26 proc. iki 55 proc. [37].
Japoninių svarainių sėklose aptinkamas natūralus cianogeninis glikozidas amigdalinas, kuriam skylant susidaro toksiškas vandenilio cianidas [37]. Amigdalino paprastai nerandama šaltai spaustame japoninių svarainių sėklų aliejuje, nes jis netirpus riebaluose, tačiau, vykdant ekstrakciją metanoliu, amigdalinas gali ekstrahuotis [37]. Norint japoninių svarainių sėklas ar jų produktus vartoti maisto pramonėje ar kosmetikoje, turi būti užtikrinama, kad cianogeninių glikozidų produkte nebus, todėl augalinė žaliava turi būti detoksikuojama [53]. Detoksikacija gali būti atliekama sėklų miltus užpilant kambario temperatūros distiliuotu vandeniu 15 min. [53]. Procedūra turi būti kartojama tris kartus, kad pasišalintų visas amigdalinas [53].
Svarainių lapuose, lyginant su kitomis augalo dalimis, susikaupia didžiausias kiekis fenolinių junginių [13]. C. japonica lapų ėminiuose nustatyta 2255,77 mg/100g polimerinių proantocianidinų, 1777,90 mg/100g mono-, di- ir oligomerinių flavan-3-olių, 1548,88 mg/100g flavonolių ir 1342,05 mg/100g fenolinių rūgščių [72]. Iš svarainių lapų išskirta superoksido dismutazė, kuri laikoma stipriu antioksidantu ir yra tinkama odos apsaugos priemonėms gaminti [13].
Svarainių šaknyse identifikuoti šie junginiai: daukosterolis, trys terpenoidai (ursolo rūgštis, oleanolo rūgštis ir pomolinė rūgštis), glikozidas prunazinas ir (-)-epikatechinas [70, 77].
1.3. Fenolinių junginių ekstrakcijos iš svarainių vaisių metodai
Ekstrakcija – tai biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimas iš augalinės žaliavos [54]. Skirtingų fenolinių junginių poliškumas stipriai varijuoja, todėl sudėtinga išvystyti vieną optimalų ekstrakcijos metodą fenolinių junginių ekstrakcijai [32]. Ekstrakcijos procesui svarbu parinkti tinkamą ekstrahentą, jo poliškumas turi būti panašus į ekstrahuojamų medžiagų [70]. Literatūroje nurodoma, kad didžiausią fenolinių junginių ekstrakcijos išeigą galima pasiekti ekstrahuojant augalinę žaliavą įvairių koncentracijų vandens ir organinių tirpiklių − acetono, metanolio, etanolio − mišiniais [70]. Ekstrakcijos efektyvumas priklauso nuo žaliavos susmulkinimo laipsnio, ekstrahuojamų dalelių dydžio, tirpiklio savybių, tėkmės greičio, kontakto su žaliava laiko bei ekstrakcijos ciklų skaičiaus [70]. Visi faktoriai, turintys įtakos ekstrakcijos procesui (ekstrahentas, temperatūra, maišymo greitis, ekstrakcijos trukmė, slėgis, pH), yra svarbūs, nes netinkamos sąlygos gali sukelti junginių destrukciją [24, 32, 54].
Ekstrakcija gali būti atliekama įvairiais metodais. Maceracija ir ekstrakcija Soksleto aparate yra tradiciniai metodai, o mikrobangų ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija), suslėgtų ir superkritinių skysčių ekstrakcija yra šiuolaikiniai ekstrakcijos metodai [54]. Mokslinėje literatūroje yra duomenų apie Chaenomeles japonica vaisių ekstrakciją, atliekamą taikant maceracijos ir sonifikacijos metodus [29, 70, 73].
Maceracija. Maceracija paprasčiausias ekstrakcijos metodas, kuris remiasi konvekcijos principu [54]. Maceracija atliekama kambario temperatūroje, sumaišius žaliavą su ekstrahentu sandariame inde [54]. Paprastai procesas trunka keletą dienų, todėl metodas dažnai modifikuojamas [54, 70]. Maišymas gali padidinti maceracijos efektyvumą dėl dviejų priežasčių: 1) didėja difuzijos greitis; 2) pašalinamas koncentruotas tirpiklis nuo ekstrahuojamų dalelių paviršiaus, pakeičiant jį mažiau koncentruotu, todėl didėja ekstrakcijos išeiga [24].
2017 metais paskelbta mokslinė publikacija, kurioje aprašyta fenolinių junginių ekstrakcija iš
C. japonica vaisių ėminių, taikant maceracijos metodą [70]. Tyrimo metu susmulkinti šaldyti japoninių
svarainių vaisiai sumaišyti su ekstrahentu ir 6 val. ekstrahuoti kambario temperatūroje, maišant magnetine maišykle [70]. Ekstrakcija atlikta naudojant keturis skirtingus ekstrahentus: vandenį, metileno chloridą, 80 proc. metanolį ir 80 proc. etanolį [70]. Tyrimų metu nustatyta, kad vanduo ir metileno chloridas nėra tinkami svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijai [70]. Ekstrakcijai naudojant 80 proc. metanolį išekstrahuota 1,4 karto daugiau fenolinių junginių, lyginant su 80 proc. etanoliu, tačiau tolesniems tyrimams dėl saugumo vartotojams pasirinktas etanolis [70]. Siekiant išsiaiškinti, kokios koncentracijos etanolis geriausiai ekstrahuoja svarainių vaisių fenolinius junginius, ekstrakcijos procesas atliktas naudojant skirtingų koncentracijų (40 proc., 60 proc., 80 proc. ir 96 proc.) etanolį [70]. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas svarainių vaisių ėminius ekstrahavus 80 proc. etanoliu [70].
Ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija). Sonifikacija lengvai ir greitai atliekama laboratorijos sąlygomis [32]. Susmulkinta žaliava sumaišoma su tirpikliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje pasirinktą laiko tarpą [32]. Dėl ultragarso poveikio intensyvėja masių judėjimas bei tirpiklio patekimas į augalines ląsteles [24, 54]. Ekstrakcijos greitis ir efektyvumas didėja dėl: 1) kavitacijos; 2) pagreitėjusios difuzijos per ląstelės membraną; 3) ląstelės turinio išplovimo po sienelės suirimo [24, 76]. Svarbiausi veiksniai, turintys didžiausią įtaką ekstrakcijos ultragarsu efektyvumui, yra dalelių dydis, ekstrahento savybės, temperatūra, slėgis, ultragarso dažnis, galia bei ekstrakcijos trukmė [24]. Šio metodo privalumai – sumažėjusi ekstrakcijos trukmė ir sunaudojamo ekstrahento kiekis bei padidėjusi ekstrakcijos išeiga [45, 54].
Mokslinėje literatūroje aprašytos C. japonica vaisių ekstrakcijos ultragarsu metodikos skiriasi [29, 69, 72]. Lenkų mokslininkai svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijai naudojo 30 proc. metanolį, parūgštintą 1 proc. acto rūgštimi, kaip antioksidanto dar pridedant 2 proc. askorbo rūgšties
[72]. Ekstrakcija ultragarso vonelėje vykdyta 15 min, po to metanolinės ištraukos laikytos 4 oC
temperatūroje 24 val. tamsoje ir pakartotinai sonifikuotos 15 min. [72].
Strugała ir Gabrielska svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakciją atliko 70 proc. etanoliu [69]. Tyrimo metu mėginiai ultragarso vonelėje ekstrahuoti 15 min., ekstrakciją pakartojant dar du kartus [69]. Kinijos mokslininkai japoninių svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakciją atliko naudodami 80 proc. acetoną, 20 oC temperatūroje, ekstrahuojant ultragarso vonelėje 20 min. [29].
Pietų Korėjos mokslininkai išsamiai aprašo kito Chaenomeles genties augalo Chaenomeles
sinensis (Thouin) Koehne vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos ultragarsu optimizavimą [73].
Mokslininkai ekstrakcijos optimizavimo statistiniam modeliavimui pasirinko tris parametrus: ekstrahento (etanolio) koncentraciją (0−96 proc. (v/v)), temperatūrą (25−65 oC) ir ekstrakcijos trukmę
(10−50 min.) [73]. Šių parametrų įverčiams, kuriems esant pasiekiama didžiausia fenolinių junginių išeiga, nustatyti pritaikyta paviršiaus atsako metodika [73]. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstrahavus Chaenomeles sinensis vaisių ėminius 50 proc. (v/v) etanoliu, 14 min., esant 63,9
oC temperatūrai, kai fiksuoti ultragarso parametrai dažnis ir galia atitinkamai yra 40 kHz ir 250 W [73].
1.4. Svarainiuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių poveikio tyrimai
Chaenomeles genties augalų vaisiai Kinijoje žinomi kaip Mugua ir yra naudojami kinų
medicinoje [29]. Kinijos Liaudies Respublikos farmakopėjoje Mugua šaltiniu laikomas Chaenomeles
speciosa (Sweet) Nakai, o kitos Chaenomeles augalų rūšys vartojamos kaip pakaitalai [29]. Įvairių rūšių
svarainių vaisiai tūkstančius metų buvo vartojami gydant reumatoidinį artritą, hepatitą, astmą ir peršalimą [25].
Fenoliniai junginiai, tokie kaip fenolinės rūgštys ir flavonoidai (flavan-3-oliai (katechinai, proantocianidinai), flavonai, flavonoliai, antocianinai ir kt.) paskutiniais metais sulaukė daug mokslininkų dėmesio dėl jų įvairiapusio biologinio poveikio [13]. Žmogaus organizme biologiškai aktyvių junginių antioksidacinis poveikis gali pasireikšti keliais mechanizmais: 1) laisvųjų radikalų surišimu; 2) apsauga ir regeneracija kitų su maistu gaunamų antioksidantų (pvz. tokoferolio); 3) chelatų susidarymu, reaguojant su prooksidantiniais metalų jonais; 4) antioksidantinių fermentų gamybos stimuliacija [9, 32]. Fenolinių junginių molekulės struktūra yra pagrindinis veiksnys, lemiantis radikalų surišimą ir metalus chelatuojantį aktyvumą [32]. Pavyzdžiui, fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilinių grupių, kurios sąveikauja su funkcinėmis karboksilinėmis grupėmis, skaičiaus ir pozicijos [32]. Antioksidantinis fenolinių rūgščių aktyvumas stipriai padidėja, įvedus antrą hidroksilo grupę orto- ar para- padėtyje [58]. Tai įrodo, kad vaisiuose ir daržovėse kaupiamų fenolinių junginių analizė yra itin svarbi prieš atliekant jų biologinio poveikio tyrimus [32].
Fenoliniai junginiai veikdami kaip natūralūs antioksidantai suriša laisvuosius radikalus ir inhibuoja jų reakcijų produktus, geba stimuliuoti antioksidacinių fermentų sintezę, o tai apsaugo nuo oksidacinio streso sukeltos organizmo molekulinių struktūrų pažaidos [9, 69]. Fenoliniai junginiai lemia augalinių ištraukų antimikrobines ir antivirusines savybes, veikia antiadheziškai, apsaugo nuo širdies ir kraujagyslių ligų, turi priešvėžinį ir uždegimo slopinamąjį poveikius [29].
Svarainių vaisiai galėtų būti potencialiai vertingi panaudojimui praktinėje medicinoje ir farmacijoje, nes, kaip nurodo tyrimų duomenys, jų luobelių ir minkštimų ekstraktai gali apsaugoti žmogaus eritrocitus nuo hemolizės [13]. Etanolinis C. japonica vaisių ėminių ekstraktas turi poveikį liposomoms, sudarytoms iš fosfotidilcholino, kaip ir raudonųjų kraujo kūnelių membranos [77]. Ekstrakto komponentai gali būti įjungti į lipidinės membranos struktūrą ir taip jas stabilizuoti bei apsaugoti [69, 77]. Su šiuo poveikiu siejami fenoliniai junginiai, ypač chlorogeno rūgštis ir (-)-epikatechinas [77].
Strugała ir kt. nustatė, kad japoninių svarainių vaisių ėminių ekstraktas reikšmingai sumažino fermentų COX-1 ir COX-2 aktyvumą, taip slopindamas uždegiminį procesą. Ekstrakto biologiškai aktyvūs junginiai turėjo 2 kartus didesnį giminingumą fermentui COX-2 nei COX-1 (selektyvumo santykis 0,48) [68]. C. japonica vaisių ekstrakto uždegimo slopinamojo poveikio mechanizmas panašus į NVNU, tačiau šiam poveikiui pasiekti reikalingi žymiai didesni ekstrakto kiekiai, lyginant su indometacinu [68]. Svarainių luobelių ekstraktas slopina kai kurių mikroorganizmų dauginimąsi, o jo baktericidinis poveikis yra žymiai didesnis nei minkštimų ekstrakto [13]. Nuoviras iš svarainių sėklų, vaisių luobelių ir minkštimų ėminių pasižymi priešalerginiu poveikiu, esant I tipo alergijai [13].
Japoninių svarainių vaisiuose yra didelis kiekis taninų, kurie veikia sutraukiančiai, mažina plonojo žarnyno sudirginimą, todėl gali būti vartojami viduriavimui gydyti [23, 68, 71]. Tyrimų metu nustatyta, kad etanolinis C. japonica vaisių ėminių ekstraktas stimuliuoja gerųjų žarnyno bakterijų
Lactobacillus casei ir Lactobacillus plantarum augimą [68, 77]. Yra duomenų, kad japoninių svarainių
vaisių ėminių ekstraktas gali apsaugo nuo skrandžio opaligės [69].
Japoninių svarainių vaisių ėminių ekstraktas gali būti vartojamas, esant kepenų nepakankamumui [68]. Tiriant hepatocitų ląstelių kultūras su Chaenomeles japonica vandeniniu ekstraktu nustatyta, kad ekstraktas pasižymi antioksidaciniu ir antiapoptoziniu poveikiu hepatocitams, o tai lemia hepatoprotekcinį efektą kepenims [25]. Tyrimas su pelėmis parodė, kad C. japonica sultys, pavartotos prieš tai išgėrus alkoholio, padidina pelių kraujyje esančio etanolio koncentraciją, lyginant su kontroline grupe, gėrusia išgrynintą vandenį, taip padidindamos etanolio toksiškumą [77].
Naujausiuose moksliniuose tyrimuose teigiama, kad Chaenomeles japonica vaisių ekstraktas turi priešvėžinių savybių [34, 68, 77]. Tiriant žmogaus gaubtinės žarnos vėžinių ląstelių kolonijas (Caco-2), nustatyta, kad ekstraktas inhibuoja navikinių ląstelių augimą, skatina apoptozę ir šių ląstelių žūtį [77].
priešuždegiminį ir antimetastazinį aktyvumą storosios žarnos vėžinėms SW-480 ląstelėms [34, 55]. Šis poveikis sukeliamas slopinant prouždegiminį mediatorių ciklooksigenazę-2 (COX-2) ir branduolio faktorių kapa-B (NF-κB) [55]. Izoliuota procianidinų frakcija, išskirta iš C. japonica vaisių ėminių ekstrakto, stabdo krūties ir prostatos navikinių ląstelių proliferaciją [49, 68, 77].
Japoninių svarainių lapų ėminių ekstraktas slopina gaubtinės žarnos vėžinių ląstelių vystymąsi, jo vartojimas turėjo teigiamą poveikį afrikinio šamo kraujo tyrimo rodikliams ir imuninės sistemos būklei po ultravioletinės spinduliuotės sukelto hemotoksinio streso [13]. Svarainių lapų ėminių nuoviras sumažino padidėjusio cholesterolio žalingą poveikį triušių inkstams [13]. C. japonica lapų ėminių ekstraktas gali veiksmingai mažinti aterosklerozę ir atkurti kraujagyslių endotelio funkcijas [13].
Šalto spaudimo japoninių svarainių sėklų aliejus yra turtingas biologiškai aktyvių junginių − riebalų rūgščių, karotenoidų, skvaleno, fenoliniai junginių, fitosterolių, tokoferolių ir kt. [12]. Aliejuje esančios riebalų rūgštys omega-6 ir omega-9 yra svarbios smegenų membranų funkcijoms, smegenų aktyvumui ir organizmo atsparumui [13]. Šios riebalų rūgštys padeda išlaikyti tinkamą kraujo klampumą ir krešumą bei normalų kraujo spaudimą [13]. Svarainių sėklų gleivės efektyviai gydo toksinų pažeistą odą ir nudegimus [13]. Šaltai spaustas svarainių sėklų aliejus yra tinkama žaliava dermatologiniams gaminiams, nes natūraliai aliejuje esantys tokoferoliai apsaugo nesočiųjų riebalų rūgščių grandines nuo peroksidacijos procesų, stabilizuoja membranas ir atlieka svarbų vaidmenį, apsaugant odą nuo žalingų endogeninių ir egzogeninių veiksnių [13]. Lietuvoje panaudojus šaltai spaustą svarainių sėklų aliejų sukurti natūralūs kosmetiniai aliejai veidui ir odai, pasižymintys nuo oksidacinio streso odą apsaugančiu poveikiu [12].
1.5. Japoninių svarainių vaisių panaudojimas maisto pramonėje
Japoninių svarainių vaisiai dėl jų kietumo, aitraus ir sutraukiančio skonio nėra tinkami vartoti švieži, todėl turi būti perdirbami [26]. Jie gali būti naudojami ruošiant sultis, želę, saldainius, tyrę, džemą, marmaledą, karamelę, sirupą, gazuotus gėrimus, likerį, vyną, ledus [5, 11, 38]. Svarainių vaisiai tinkami konservavimui, arbatos ruošimui, pektinų ir aromatinių junginių išskyrimui [11, 41]. 2002 metais Latvijoje eksperimentinis vaisių ir uogų apdorojimo centras kartu su Latvijos žemės ūkio universitetu patentavo dviejų inovatyvių produktų, japoninių svarainių vaisių saldainių ir sirupo, technologijas [47, 54].
Švedijoje atliktas vartotojų pageidavimų tyrimas parodė, kad žmonės labai teigiamai žiūri į
Chaenomeles japonica vaisių skonį įvairiuose produktuose [62]. Tyrimo metu teirautasi gyventojų
nuomonės apie maisto produktus (ledus, limonadą, varškę, džemą ir jogurtą), kurių sudėtyje yra C.
žmonėms patiko svarainių limonadas ir varškė [62]. Mažiausiai teigiamų atsiliepimų sulaukta apie svarainių džemą ir jogurtą [62].
Malonus kvapas, didelis kiekis organinių rūgščių, fenolinių junginių, askorbo rūgšties ir skaidulinių medžiagų yra svarbiausios svarainių vaisių savybės, dėl kurių ši augalinė žaliava yra potencialiai vertinga kuriant ir vartotojams pateikiant sveikus maisto produktus [11]. Papildžius mitybą funkciniu maistu, kuriame gausu natūralių antioksidantų, galima užkirsti kelią lėtinių ligų atsiradimui ir vystymuisi, pagerinti protinę ir fizinę savijautą [51]. 2014 metais Lenkijos mokslininkai, atlikę C.
japonica vaisių ėminių etanolinio ekstrakto fenolinių junginių stabilumo ir biologinio poveikio in vitro
tyrimus, nustatė, kad etanolinis japoninių svarainių vaisių ėminių ekstraktas dėl savo stiprių antioksidacinių savybių galėtų būti potencialiai vertingas maisto papildų gamybai [69].
1.6. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Moksliniuose straipsniuose yra aprašyta Chaenomeles japonica augalų fitocheminės sudėties tyrimų. Literatūroje yra duomenų apie vaisių, sėklų, lapų ir šaknų biologiškai aktyvių junginių sudėtį. Pastaraisiais metais paskelbta publikacijų, kuriose aprašyta japoninių svarainių vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių sudėtis ir jų biologinis poveikis. Procianidinai, (-)-epikatechinas ir chlorogeno rūgštis sudaro didžiausią dalį svarainių vaisiuose nustatytų fenolinių junginių kiekio.
Svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijai mokslininkai dažniausiai taiko ekstrakcijos ultragarsu metodą, tačiau mokslinėje literatūroje skelbiamos metodikos aprašytos nepakankamai išsamiai, kad būtų galima jas atkartoti. Chaenomeles japonica vaisių fitocheminės sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų japoninių svarainių vaisių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį.
2. METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo metu tirti Chaenomeles japonica vaisių ėminiai. Nuo seno auginamų japoninių svarainių vaisiai surinkti iš dvidešimties sodybų, esančių skirtingose Lietuvos kaimo vietovėse: Keidų k. (Akmenės raj.), Nevarėnų k. (Telšių raj.), Vijolių k. (Šiaulių raj.), Kiškėnų k. (Klaipėdos raj.), Macikų k. (Šilutės raj.), Bajėnų k. (Pagėgių raj.), Ilguvos k. (Šakių raj.), Žvirgždaičių k. (Šakių raj.), Giedrių k. (Vilkaviškio raj.), Daukšių k. (Marijampolės raj.), Klausučių k. (Biržų raj.), Šepetos k. (Kupiškio raj.), Rečionių k. (Kaišiadorių raj.), Dubių k. (Jonavos raj.), Josvainių k. (Kėdainių raj.), Skubėtų k. (Šalčininkų raj.), Štadvilų k. (Zarasų raj.), Juodupės k. (Rokiškio raj.), Buivydiškių k. (Vilniaus raj.), Staniūnų k. (Panevėžio raj.) (3 pav.). Rinkimo laikas 2016 metų spalio 9−20 d. Japoninių svarainių veislių 'Abava', 'Darius', 'Rasa', 'Rondo' vaisiai ir neveisliniai svarainiai, iš kurių pagamintas neveislinių svarainių vaisių mišinys (NSM), rinkti LAMMC filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentiniame sode Babtuose (Kauno raj.). Rinkimo laikas – 2017 metų rugsėjo mėn.
Keidų k. Akmenės raj. Nevarėnų k. Telšių raj.
Vijolių k. Šiaulių raj.
Kiškėnų k. Klaipėdos raj.
Macikų k. Šilutės raj.
Bajėnų k. Pagėgių raj.
Ilguvos k. Šakių raj.
Žvirgždaičių k. Šakių raj. Giedrių k. Vlkaviškio raj.
Daukšių k. Marijampolės raj. Babtų k. Kauno raj.
Klausučių k. Biržų raj.
Šepetos k. Kupiškio raj.
Juodupės k. Rokiškio raj.
Dubių k. Jonavos raj.
Rečionių k. Kaišiadorių raj. Josvainių k. Kėdainių raj.
Skubėtų k. Šalčininkų raj. Buivydiškių k. Vilniaus raj. Staniūnų k. Panevėžio raj.
Štadvilų k. Zarasų raj.
2.2. Naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin–Ciocalteu reagentas, natrio karbonatas, galo rūgštis, natrio hidroksidas (gamintojas „Chempur“, Tarnovske Gurai, Lenkija), DMCA (p-dimetilaminocinamaldehidas), acto rūgštis, ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis), troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis), kalio persulfatas, vario (II) chlroridas, amonio acetatas, neokuproinas, DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas), natrio acetatas (gamintojas „Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), TPTZ (gamintojas „Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), geležies (III) chloridas heksahidratas (gamintojas „Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), TFPH (trifluorperazino dihidrochloridas), sieros rūgštis, acetonitrilas (gamintojas „Sigma-aldrich“, Steinheimas, Vokietija), acto rūgštis (gamintojas „Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); (+)-katechinas, (-)-epi(+)-katechinas, rutinas, izokvercitrinas, chlorogeno rūgštis, natrio molibdatas, natrio nitritas, vandenilio chlorido rūgštis (gamintojas „Sigma-Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra
Svarainių vaisių ėminių smulkinimas atliktas elektriniu malūnu „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Svėrimai atlikti elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64-0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Svarainių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ („Sigma-Aldrich“, Darmštatas, Vokietija). Mėginiai centrifuguoti naudojant centrifugą „Heraeus Biofuge Stratos“ („Heraeus Holding GmbH“, Hanas, Vokietija), nuodžiūvis tirtas naudojant drėgnomatį „Precisa 310 M“ („Precisa“, Dietikonas, Šveicarija). Spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV–regimosios šviesos spektrofotometrą „M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Japoninių svarainių vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties analizė atlikta naudojant skysčių chomatografą „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV).
2.4. Japoninių svarainių vaisių ėminių ištraukų paruošimas
Žaliavos paruošimas. Iš svarainių vaisių pašalintos sėklos, o likusi dalis su luobele supjaustyta
(iki 1 cm storio) ir užšaldyta -35°C temperatūroje šaldiklyje su oro cirkuliacija. Kitame etape atlikta vaisių liofilizacija 0,01 mbar slėgyje, esant -85°C kondesatoriaus temperatūrai liofilizatoriuje „Zirbus“ („Zirbus technology GmbH“, Bad Grundas, Vokietija). Liofilizuotos svarainių skiltelės sumaltos į miltelius, naudojant „Retsch GM 200“ elektrinį malūną („Retsh GmbH“, Hanas, Vokietija). Ėminiai laikyti sandariai uždarytuose induose, tamsioje, sausoje vietoje.
Nuodžiūvio nustatymas. Visų tiriamųjų mėginių nuodžiūvis nustatytas drėgnomačiu. Matuojant
nuodžiūvį ant prietaise įrengtų svarstyklių, tiksliai atsveriama 1 g žaliavos. Kiekvienam svarainių ėminiui procedūra kartota tris kartus ir išvesti nuodžiūvio įverčių vidurkiai. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai liofilizuotai žaliavai.
Etanolinių ištraukų paruošimas. Atsveriama 2,5 g (tikslus svėrinys) liofilizuotų svarainių vaisių
miltelių. Milteliai tamsaus stiklo buteliukuose užpilami 40 ml 50 proc. (v/v) etanoliu, sandariai uždaromi ir talpinami į ultragarso vonelę. Svarainių vaisių ėminiai ekstrahuojami ultragarso vonelėje 10 min., esant 80 kHz dažniui ir 1017 W galiai. Po ekstrakcijos etanolinės ištraukos centrifuguojamos 2 min. 8500 rpm, kambario temperatūroje. Supernatantas nupilamas nuo nuosėdų, filtruojamas per marlę ir supilamas į tamsaus stiklo plačiakaklius buteliukus, kurie iki analizės laikomi šaldytuve 4ºC temperatūroje. Prieš atliekant chromatografinę analizę etanolinės ištraukos papildomai filtruojamos per 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus.
2.5. Tyrimo metodai
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Tyrimo metu taikytas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas. Naudota Bobinaitės ir kt. straipsnyje aprašyta bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodika, nežymiai ją modifikavus [2].
Mėginio paruošimas. 4 ml etanolinės svarainių vaisių ištraukos praskiedžiama 4 ml 50 proc.
(v/v) etanoliu. 0,2 ml praskiestos svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin– Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [2].
Lyginamojo tirpalo paruošimas. 0,2 ml 50 proc. etanolio sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin–
Visi tiriamieji mėginiai 60 min. laikyti tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Po to spektrofotometru, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [2]. Kalibravimo grafikas (y = 0,2029x − 0,0052; R2=0,9802) sudarytas,
naudojant 0,25−4 mg/ml koncentracijos etaloninius galo rūgšties tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:
𝐶 =𝑥 × 𝑉 𝑚
C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g;
X – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.2. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas
Tyrimo metu taikyta Fraisse ir kt. straipsnyje paskelbta bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymo metodika su nežymiais pakeitimais [30]. Atliekant tyrimus, tiriamosios ištraukos praskiestos 10 kartų.
Mėginio paruošimas. Mėginys gaminamas 10 ml volumetrinėje kolbutėje. Kolbutėje 0,1 ml
etanolinės ištraukos skiedžiama 0,9 ml 50 proc. (v/v) etanoliu, pridedama 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml Arnow reagento (10 proc. natrio molibdato vandeninis tirpalas ir 10 proc. natrio nitrito vandenis tirpalas sumaišyti santykiu 1:1), 2 ml 8,5 proc. NaOH. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio [30].
Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 0,1 ml etanolinės ištraukos,
0,9 ml 50 proc. (v/v) etanolio, 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml NaOH ir praskiedžiama iki brūkšnio [30].
Spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [30]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 1,3584𝑥 − 0,0616; R2=0,9973)
sudarytas, naudojant 0,0625−1 mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:
𝐶 =𝑥 × 𝑉 𝑚
C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, mg CRE/g;
X – chlorogeno rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
2.5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas
Tyrimo metu naudota Heil ir kt. straipsnyje aprašyta bendro proantocianidinų kiekio nustatymo metodika [42]. Analizei paimta 5 µl japoninių svarainių vaisių ištraukos.
Mėginio paruošimas. 5 µl svarainių vaisių ištraukos sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA
reagento, ištirpinto parūgštintame etanolyje (9 dalys 96,3 proc. C2H5OH ir 1 dalis HCl konc.) [42]. Lyginamasis tirpalas. − parūgštintas etanolis [42].
Po mėginio paruošimo praėjus 5 min., esant 640 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [42]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,6352𝑥 + 0,0489; R2=0,9992) sudarytas, naudojant 0,125–1,3 mg/ml koncentracijos etaloninius
(-)-epikatechino tirpalus. Bendras proantocianidinų kiekis apskaičiuotas pagal formulę: 𝐶 =𝑥 × 𝑉
𝑚
C – bendras proantocianidinų kiekis, mg EE/g;
X – epikatechino koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas
ABTS, DPPH ir TFPH antiradikaliniai metodai parodo antioksidantų gebą surišti DPPH•,
ABTS•+ ar TFPH•+ laisvuosius radikalus [9, 22]. ABTS•+ laisvasis radikalas−katijonas tirpus vandeniniuose ir organiniuose tirpikliuose, o tai leidžia atlikti hidrofilinių ir lipofilinių junginių antiradikalinio aktyvumo nustatymą, esant silpnai šarminei reakcijos terpei (pH=7,4) [9, 69]. DPPH• radikalas tirpus tik organiniuose tirpikliuose, o tai apriboja hidrofilinių junginių antiradikalinio aktyvumo nustatymą [9]. TFPH metodo pagalba antiradikalinis aktyvumas gali būti nustatomas esant žemam pH [22]. Taikant CUPRAC metodą, redukcinis aktyvumas vertinamas pagal antioksidantų gebėjimą redukuoti Cu(II) į Cu(I), esant pH=7,0 [19]. FRAP metodo pagalba nustatomas antioksidantų redukcinis aktyvumas rūgštinėje terpėje (pH=3,6), redukuojant Fe(III) į Fe (II) [9].
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų−katijonų surišimo metodu. Naudota Yim ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodika [46], nežymiai ją modifikavus. Pirmiausia gaminamas 2 mmol/l ABTS•+ motininis tirpalas. 0,0548 g ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgšties) miltelių tamsaus stiklo buteliuke ištirpinami 50 ml išgrynintojo vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K2S2O8. Pagamintas motininis
susidaro ABTS•+ [46]. Susidaręs radikalas−katijonas išlieka stabilus 2 paras, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje [46]. Darbinis ABTS•+
tirpalas gaminamas motininį tirpalą skiedžiant išgrynintuoju vandeniu, kol, esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03 [46].
Mėginio paruošimas: 3 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio
ABTS•+ tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [46]. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,00003𝑥 − 0,00360; R2=0,9714) sudarytas, naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu. Naudota Yim ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo DPPH metodika [46], nežymiai ją modifikavus. Pirmiausia gaminamas motininis 60 μmol/l koncentracijos motininis DPPH tirpalas. 0,0012 g DPPH miltelių ištirpinama 50 ml 96,3 proc. (v/v) etanolyje. Darbinis tirpalas skiedžiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis, išmatuotas spektrofotometru, esant 517 nm bangos ilgiui, pasiekia 0,8±0,03 [46].
Mėginio paruošimas: 10 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio
DPPH tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 517 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [46]. Lyginamasis tirpalas – 96,3 proc. (v/v) etanolis [46]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,0000341𝑥 + 0,0166694; R2=0,9960) sudarytas, naudojant 400–20000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso
tirpalus.
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas TFPH radikalų-katijonų surišimo metodu. Pirmiausia pagaminamas motininis TFPH tirpalas, ištirpinant 0,480 g TFPH miltelių 10 ml išgrynintojo vandens [22]. Darbinis tirpalas gaminamas 100 ml kolboje: 0,5 ml motininio TFPH tirpalo sumaišoma su 0,1 ml K2S2O8 ir praskiedžiama iki 100 ml 4 mol/l H2SO4 tirpalu [22]. Tirpalas turi būti laikomas
tamsoje 15−20 min. 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis išmatuotas spektrofotometru, esant 502 nm bangos ilgiui turi būti 0,7±0,1. Gautas tirpalas išlieka stabilus 2 val., laikant kambario temperatūroje, tamsoje [22].
Mėginio paruošimas: 10 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio
TFPH tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 502 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – 4 mol/l H2SO4 tirpalas [22]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,0000371𝑥 + 0,1471727;
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu. Tyrimo metu naudota Raudonės ir kt. straipsnyje paskelbta redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [10]. Analizei paimta 5 µl japoninių svarainių vaisių ištraukos.
Darbinis FRAP tirpalas gaminamas sumaišius A, B ir C tirpalus santykiu 10:1:1:
• A tirpalas – 300 mmol/l buferinis CH3COONa tirpalas. Atsveriama 0,775 g CH3COONa, pridedama 4 ml ledinės acto rūgšties ir matavimo kolboje praskiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki 250 ml;
• B tirpalas – 10 mmol/l TPTZ tirpalas. Tirpalas gaunamas ištirpinant 0,0781 g TPTZ miltelių 40 mmol/l HCl parūgštintame išgrynintame vandenyje 25 ml matavimo kolbutėje;
• C tirpalas – 20 mmol/l FeCl36H2O vandeninis tirpalas. Atsveriama 0,1352 g FeCl36H2O ir
ištirpinama išgrynintajame vandenyje 25 ml kolbutėje [10].
Mėginio paruošimas: 10 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio
FRAP tirpalo. Mėginys laikomas tamsoje 30 min., po to, esant 593 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis [10]. Lyginamasis tirpalas – darbinis FRAP tirpalas, nepridėjus etanolinės ištraukos [10]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,0000166𝑥 + 0,000950; R2=0,9926) sudarytas, naudojant 400–24000 µmol/l koncentracijos
etaloninius trolokso tirpalus.
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu. Taikyta Apak ir kt. straipsnyje aprašyta redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [21], modifikavus paimamos ištraukos tūrį. Darbinis CUPRAC tirpalas gaunamas sumaišius A, B ir C tirpalus santykiu 1:1:1:
• A tirpalas – 10 mmol/l CuCl2 tirpalas. 0,085 g CuCl2 ištirpinama išgrynintame vandenyje 50 ml
kolbutėje;
• B tirpalas – 1 mmol/l CH3COONH4 buferinis tirpalas (pH=7). 0,0038 g CH3COONH4
ištirpinama išgrynintame vandenyje 50 ml kolbutėje;
• C tirpalas – 7,5 mmol/l neokuproino etanolinis tirpalas. 0,078 g neokuproino ištirpinama 96 proc. (v/v) etanoliu 50 ml kolbutėje [21].
Mėginio paruošimas: 5 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml šviežiai
paruošto darbinio CUPRAC tirpalo. Mėginys laikomas tamsoje 30 min., po to, esant 450 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [21]. Lyginamasis tirpalas – darbinis CUPRAC tirpalas, nepridėjus etanolinės ištraukos [21]. Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,0000222𝑥 − 0,0132677; R2=0,9995) sudarytas, naudojant 2000−48000
µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas. Svarainių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas apskaičiuotas pagal trolokso kalibravimo grafikus ir išreikštas trolokso ekvivalentu (µmol TE/g) absoliučiai sausai žaliavai. Trolokso ekvivalentas (TE) atitinka trolokso kiekį (µmol), kuris
tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turi lygiai tokį patį antioksidacinį aktyvumą, kaip 1 g augalinės žaliavos. Tiriamųjų ištraukų antioksidacinis aktyvumas in vitro, išreikštas TE ekvivalentu (µmol TE/g), apskaičiuojamas pagal formulę:
.(g) m (ml) V 1000 a b A band band. + = TE
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis;
a – nuolydis (angl. slope) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis (angl. intercept) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; Vband. – tiriamos augalinės žaliavos ištraukos bandinio tūris (ml);
mband. – tiriamos augalinės žaliavos atsvertas (tikslus) kiekis (g).
2.5.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta taikant mokslinėje literatūroje aprašytą validuotą efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, modifikavus judrios fazės tėkmės greitį, siekiant gauti kuo geresnį identifikuotų analičių atskyrimą [8]. Tyrimų metu taikytas tėkmės greitis − 0,8 ml/min.
2.6. Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2016“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 21“(„IBM“, JAV). Tyrimo metu apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Kiekinės sudėties įvairavimo įvertinimui apskaičiuotas variacijos koeficientas. Taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA įvertinta, ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi. Hipotezės apie dispersijų lygybę tikrinimui naudotas Livyno kriterijus. Nustačius, kad nepriklausomų kintamųjų dispersijos yra lygios, taikytas daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijus. Duomenų koreliacijai įvertinti nustatytas Pirsono koreliacijos koeficientas. Remiantis literatūra, koreliacijos koeficientų ryšiai vertinti pagal stiprumą: |r|<0,3 koreliacinis ryšys laikytas labai silpnu, kai 0,3<|r|<0,5 silpnu, kai 0,5<|r|<0,7 vidutinio stiprumo, kai 0,7<|r|<0,9 stipriu, o kai 0,9<|r|≤1 labai stipriu [3].
