FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS DIPLOIDINIŲ RAUDONŲJŲ DOBILŲ (Trifolium pratense L.) VEISLIŲ AUGALINĖSE ŽALIAVOSE

DOVILĖ STANYTĖ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO

TYRIMAS DIPLOIDINIŲ RAUDONŲJŲ DOBILŲ

(Trifolium pratense L.) VEISLIŲ AUGALINĖSE ŽALIAVOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc.dr. Raimondas Benetis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS DIPLOIDINIŲ RAUDONŲJŲ DOBILŲ (Trifolium pratense L.) VEISLIŲ AUGALINĖSE ŽALIAVOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko doc. dr. Raimondas Benetis Magistrantė Dovilė Stanytė

Recenzentas

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

2. ĮVADAS ... 8

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

4.1. Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ... 11

4.2. Antioksidantai ... 13

4.3. Fenoliniai junginiai ir jų antioksidacinės savybės ... 14

4.4. Fenolinių junginių ekstrakcija ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai ... 17

5. RAUDONOJO DOBILO (Trifolium pratense L.) BENDROJI CHARAKTERISTIKA ... 20

6. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24

6.1. Tyrimų objektas ... 24

6.2. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 25

6.3. Naudota aparatūra ... 25

6.4. Tyrimų metodai ... 25

6.4.1. Diploidinių T. pratense veislių žaliavų ekstraktų paruošimas ... 25

6.4.2. Reagentų paruošimas ... 26

6.5. Diploidinių T. pratense veislių žaliavų ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 27

6.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27

6.5.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu ... 28

6.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 28

6.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ _{jonų surišimo metodu ... 29}

6.5.5. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS•+ metodu ... 30

6.6. Duomenų analizė ... 31

7. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32

7.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 32

7.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas ... 32

7.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas ... 33

7.1.3. Ekstakcijos ultagarsu temperatūros parinkimas ... 34

7.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas diploidinių T. pratense veislių žaliavose ... 35

7.4. Diploidinių T. pratense veislių žaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 40

7.4.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu T. pratense žaliavose ... 41

7.4.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu T. pratense žaliavose ... 44

7.4.3. Chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo metodu T. pratense veislių žaliavose ... 46

7.5. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo diploidinių raudonųjų dobilų veislių žaliavose ... 48

8. IŠVADOS ... 49

9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51

SANTRAUKA

Dovilės Stanytės magistro baigiamasis darbas/mokslinis, vadovas doc.dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.

Fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas diploidinių raudonųjų dobilų (Trifolium pratense L.) veislių augalinėse žaliavose.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje kultūroje auginamų, diploidinių raudonųjų dobilų (Trifolium prantense L.) veislių augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei nustatyti antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai: 1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių ekstrahavimui iš diploidinių T. pratense žaliavų mėginių; 2. Spektrofotometriniu metodu įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę analizę ir jos įvairavimą skirtingų T. pratense veislių žaliavų mėginiuose; 3. Nustatyti T. pratense žaliavų ekstraktuose esančių biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus DPPH, ABTS ir FIC metodais. 4. Įvertinti diploidinių T. pratense veislių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti buvo naudojamos Lietuvoje kultivuojamų diploidinių T. pratense veislių (Vyčiai, Radviliai, Arimaičiai ir Kamaniai) augalinės žaliavos. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu su 70 % (V/V) etanoliu, ekstrakcijos laikas – 15 min, temperatūra – 50 °C. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu (mg/g). Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu (mg/g). Antioksidacinis ekstraktų aktyvumas įvertintas – 3 modelinėse sistemose (DPPH, ABTS ir FIC). Rezultatai gauti DPPH ir FIC metodais pateikti procentais, o ABTS metodu gauti duomenys išreikšti trolokso ekvivalentais (TE, μmol/g).

Rezultatai ir išvados: Tyrimo metu nustatyta, kad diploidinių T. pratense veislių žaliavose sukaupiami reikšmingi suminiai fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai, o jų įvairavimas tiesiogiai priklauso nuo fenologinio tarpsnio ir morfologinių augalo dalių. Didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas tirtų T. pratense veislių žiedų žaliavose (atitinkamai, vidutiniškai: 32,085 mg/g; 23,900 mg/g), o mažiausias stiebuose. Nustatyta, jog diploidinių T. pratense veislių ekstraktai pasižymi stipriu antiradikaliniu aktyvumu abiejose tirtose modelinėse sistemose (DPPH ir ABTS). Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas T. pratense veislių žiedų ekstraktuose, taikant tiek DPPH (vidutiniškai – 81,343 %), tiek ABTS (TE, vidutiniškai – 41,277 µmol/g) metodus. Stipresniu chelatiniu aktyvumu pasižymi diploidinių T. pratense veislių žiedų (Arimaičių, Kamanių) ir lapų (Vyčių, Radvilių) ekstraktai. T. pratense augalinėse žaliavose nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatyto DPPH (0,926), ABTS (0,842) ir FIC (0,779) metodais.

SUMMARY

The supervisor of the final master‘s thesis/research prepared by Dovilė Stanytė is assoc. Prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas.

The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity in the raw materials of diploid cultivars of red clover (Trifolium pratense L.).

Research aim: To analyse the quantitative composition of phenolic compounds and flavonoids in the raw materials of diploid cultivars of red clover (Trifolium prantense L.) grown in Lithuania, and to determine their antioxidant activity.

Objectives: 1. To select optimal extraction conditions for the extraction of phenolic compounds from diploid T. pratense raw materials; 2. Using the spectrophotometry method, to evaluate the quantitative composition of phenolic compounds and flavonoids, as well as its variability in the raw material samples of different cultivars of T. pratense; 3. To determine the antioxidant activity of biologically active compounds accumulated in the extracts of the raw materials of T. pratense, as well as its variation patterns using the DPPH, ABTS and FIC methods. 4. To assess the correlation between quantitative composition of total phenolic compounds and flavonoids in diploid T. pratense and antioxidant activity of their extracts.

Research methodology: Raw plant materials of cultivated diploid red clover species (Vyčiai, Radviliai, Arimaičiai and Kamaniai) were used for the research. Extraction method – ultrasound extraction, extractant – 70 % (V/V) ethanol, extraction duration – 15 min, temperature – 50 °C. Folin-Ciocalteu method was used to determine the total phenolic compound amount, results were expressed as gallic acid equivalent (mg/g). Reaction with AlCl3 was applied to determine the total flavonoid amount, results were expressed as rutin equivalent (mg/g). Antioxidant activity of the extracts was assessed - 3 model systems (DPPH, ABTS and FIC) methods presented as a percentage, ABTS data is presented as trolox equivalent (TE, μmol/g).

Results and conclusions: It was found that high levels of phenolic compounds and flavonoids are accumulated in the raw materials of diploid T. pratense cultivars and it varies significantly depending on the phenological stage and the morphological plant part. The largest total amount of phenolic compounds and flavonoids was found in the flower materials of T. pratense (respectively, an average of: 32,085 mg/g; 23,900 mg/g). The high antiradical activity was determined in extracts of diploid T. pratense using both model systems (DPPH and ABTS). The highest antioxidant activity was found in the flower extracts of T. pratense cultivars, by applying both DPPH (average – 81,343 %) and ABTS (TE, average – 41,277 µmol/g) methods. T. pratense flower (Arimaičių, Kamanių) and leaf (Vyčių, Radvilių) extracts possesed stronger chelating activity. Strong correlation between the total phenolic compound and antioxidant activity, was determined using the DPPH (0,926), ABTS (0,842) and FIC (0,779) methods.

1. SANTRUMPOS

ABTS 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. FIC geležies (II) jonų surišimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) GAE galo rūgšties ekvivalentas

TE trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalent) V/V tūrio procentai (išreikšta etanolio koncentracija)

ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species) RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species) Ph. Eur. Europos farmakopėja (lot. Pharmacopoeia Europaea) USP Jungtinių Amerikos Valstijų Farmakopėja

DNR deoksiribonukleorūgštis (angl. DNA – Deoxyribonucleic acid) UV ultravioletinė spinduliuotė

PPO polifenolių oksidazės (angl. PPO – polyphenol oxidases) BAM biologiškai aktyvios medžiagos

2. ĮVADAS

Laisvieji radikalai laikomi viena pagrindinių šių dienų ligų priežastimi. Daugėjant organizme laisvųjų radikalų, viršijamas apsauginis antioksidantų poveikis, ko pasekoje sukeliama žala, kuri susijusi su vėžiu, senėjimo procesais, atsirandančiomis lėtinėmis ligomis, širdies ir kraujagyslių ligomis, neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio liga, Parkinsono liga ir kitos [1,2]. Jau 1950 metais Denham Harman pasiūlė ‘laisvųjų radikalų teoriją senėjimui‘, kuri įgijo visuotinį pripažinimą ir patvirtina tai, kad laisvųjų radikalų žala didėja su amžiumi. ROS kaupiasi ląstelėse ir lemia jų pakitimus, dėl ko pasekoje susilpnėja audinių ir organų funkcijos [3].

Antioksidantai – tai medžiagos, kurios gali stabilizuoti ir inaktyvuoti laisvuosius radikalus, kurie atakuoja įvairias lastelių struktūras. Organizme yra fermentinės antioksidantinės sistemos, kurios neutralizuoja susidariusius laisvuosius radikalus ir apsaugo audinius bei ląsteles nuo pažeidimų. Natūralūs antioksidantai, tokie kaip fenoliniai junginiai yra antriniai augalų metabolitai, kurie yra sintetinami augaluose [3,4].

Raudonasis dobilas (Trifolium pratense L.) – tai daugiametis žolinis augalas, priklausantis pupinių (Fabaceae L.) šeimai [5]. Per pastarąjį dešimtmetį šios genties augalu buvo susidomėta kaip fenolinių junginių ir flavonoidų šaltiniu. Raudonojo dobilo žiedai kai kuriose šalyse yra kaip vaistinė žaliava (pvz. JAV), kuri plačiai vartojama kaip alternatyva pakaitinei hormonų terapijai. Raudonasis dobilas jau senovės laikais naudojamas kaip skausmą malšinantis, priešpodagrinis, reumatinis, kosulį slopinantis bei atsikosėjimą gerinantis vaistas [6,7]. T pratense lapuose ir žieduose gausu fenolinių junginių, kurie siejami su antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antimikrobiniu, priešvėžiniu ir širdies ir kraujagyslių ligas apsaugančiu, fitopreparatų antioksidaciniu poveikiu [8,9,10]. Šiuo metu daugelyje šalių svarbiausias T. pratense panaudojimas menopauzės simptomams mažinti ir kaip alternatyva pakaitinei hormonų terapijai [10]. Augalinės žaliavos pasižymi lipidus apsaugančiu poveikiu [11,12], mažinančiu riziką neurodegeneratyvinių ligų atsiradimui ir senėjimo procesų lėtinimu [5,13]. Visas šias savybes lemia T. pratense žaliavose kaupiami reikšmingi fenolinių junginių kiekiai, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Fenoliniai junginiai, tokie kaip flavonodai ir fenolinės rūgštys pasižymi daugiaveiksmiu antioksidaciniu potencialu [6,8,11]. Šios bioaktyvios medžiagos labai svarbios naujų vaistų kūrimui ir gali būti puiki alternatyva seniesiems vaistams, bei kaip garnyras ir ingredientas gaminant maistą, dėl savo maistinės vertės [12,14].

Kurį laiką buvo susiformavusi nuomonė, jog tetraploidiniai dobilai yra patvaresni ir atsparesni ligoms, tačiau naujausi tyrimai atskleidžia, kad diploidinės veislės nesiskiria nuo

tetraploidinių veislių savo jautrumu ligoms ir tam tikrais atvejais, kai kurios veislės turi didesnę išlikimo tikimybę lyginant su tetraploidinėmis. Diploidinių veislių dobilai lenkia tetraploidinius savo didesniu prikultų sėklų skaičiumi, bei lengvesniu bičių apdulkinimu [15,16,17,18]. Diploidinė (2n=14) raudonųjų dobilų rūšis yra aukštos kokybės pašarinis ankštinių šeimos augalas [19,20]. Todėl tikslinga įvertinti diplodinių raudonųjų dobilų veislių fitocheminius rodiklius ir antioksidacinį aktyvumą.

Darbo naujumas. Pirmą kartą Lietuvoje tirtos kelerių auginimo metų skirtingų diploidinių raudonojų dobilų (Trifolium pratense L.) veislių žaliavos: Vyčiai, Radviliai, Arimaičiai, Kamaniai. Šių tyrimų metu buvo tirtos kultivuojamų diploidinių raudonųjų dobilų dviejų auginimo metų, dviejų fenologinio vystymosi tarpsnių ir skirtingų morfologinių augalo dalių žaliavos. Atliktas ekstrakcijos sąlygų optimizavimas, įvertinti ekstraktų bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai ir antioksidantinis aktyvumas, vertinant antiradikalines ir chelatines ekstraktų savybes, spektrofotometriniais metodais.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje kultūroje auginamų, diploidinių raudonųjų dobilų (Trifolium prantense L.) veislių augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei nustatyti antioksidacinį aktyvumą.

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje kultūroje auginamų, diploidinių raudonųjų dobilų (Trifolium prantense L.) veislių augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei nustatyti antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių ekstrahavimui iš diploidinių T. pratense žaliavų mėginių;

2. Spektrofotometriniu metodu įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą skirtingų T. pratense veislių žaliavų mėginiuose;

3. Nustatyti T. pratense žaliavų ekstraktuose esančių biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus DPPH, ABTS ir FIC metodais.

4. Įvertinti diploidinių T. pratense veislių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1. Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas

Laisvieji radikalai laikomi viena pagrindinių šių dienų ligų priežastimi. Daugėjant organizme laisvųjų radikalų, viršijamas apsauginis antioksidantų poveikis, ko pasekoje sukeliama žala, kuri susijusi su vėžiu, senėjimo procesais, atsirandančiomis lėtinėmis ligomis, dermatologinėmis, širdies ir kraujagyslių ligomis, neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio liga, Parkinsono liga ir kitos [1,2,3,21,22].

Laisvieji radikalai – tai dažniausiai nestabilios ir reaktyvios deguonies turinčios molekulės, kurios turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų [2]. Pagrindinės laisvųjų radikalų formos pripažintos sukeliant žalingą poveikį – reaktyvios deguonies (ROS) ir reaktyvios azoto (RNS) formos. ROS ir RNS sutrikdo griežtai reguliuojamus svarbius organizmo fermentus. Poveikio rezultatas, kurį sukelia prooksidantai - oksidacinis stresas, kurio metu ląstelių struktūros yra pažeidžiamos, įskaitant lipidus, baltymus, membranas ir DNR [3,23,24,25,26].

Laisvieji radikalai dažniausiai sukeliantys oksidacinį stresą yra reaktyvios deguonies rūšys, skirstomos į radikalinius bei neradikalinius junginius (1 lentelė) [1,2,21,24,25,27]:

1 lentelė. Reaktyvios deguonies (ROS) formos [21,24].

Reaktyvios deguonies rūšys (ROS)

R

adikal

a

i

Superoksido radikalas

O

Hidroksilo radikalas

OH

Peroksilo radikalas

ROO

N er adika la i

_{Vandenilio peroksidas}

_H

_O

Ozonas

O

Molekulinis deguonis

O

Oksidacinis stresas – žala, kuri atsiranda dėl redokso disbalanso, tai yra destruktyvių laisvųjų radikalų padidėjimas ir antioksidacinės apsaugos sumažėjimas, reguliuojamuose antioksidantų gynybos keliuose [2,26].

Dėl oksidacinio streso, kuris pažeidžia įvairias žmogaus ląsteles (monocitus, neutrofilus, eozinofilus ir makrofagus) organizme kyla uždegiminis atsakas [3,28]. Uždegiminiuose procesuose

dalyvauja deguonis, O2 elektrono praradimas padidina superoksido anijono radikalo (O2•) formavimąsi, kuris greitai konvertuojamas į vandenilio peroksidą (H2O2). Vandenilio peroksidas toliau gali būti verčiamas į hidroksilo radikalą (OH•), vieną iš stipriausių radikalų biologinėje sistemoje, kuris greitai reaguodamas su polinesočiūjų riebalų rūgštimis suformuoja peroksilo radikalus (ROO•) [22,28]. Vandenilio peroksidas taip pat gali oksiduoti ir chlorido jonus į hipochlorito rūgštį (HOCl), kuri yra stiprus oksidantas reaguojantis su aminais ir verčiantis juos chloraminais, kai kurie iš jų yra labai toksiški [28].

Iš aktyvių azoto junginių plačiausiai minimos dvi rūšys – azoto oksidas ir peroksinitrito anijonas [22,28]. Azoto oksidas yra sintezuojamas dideliais kiekiais, šią reakciją katalizuoja fermentas azoto oksido sintazė (NOS) [28]. Azoto oksido radikalas (NO•) yra labai reaktyvus [29]. NO blokuoja elektronų srautą mitochondrijose ir inhibuoja antioksidacinių fermentų superoksido dismutazę (SOD), išsekina glutationo peroksidazės ir katalazės atsargas bei pažeidžia DNR molekules. Peroksinitrito anijonas (ONOO•) yra stiprus prooksidantas, sukeliantis oksidacinį stresą, kurio metu padidėja oksiduojančių junginių (hidroksilo, nitrilo ir chloro radikalų) arba nitrozilinimo stresą, kuomet padidėja nitroazaminų ir S-nitrozotiolų kiekis. [22,29].

Oksidaciniai procesai biologinėse sistemose yra neišvengiami. Organizmai yra prisitaikę susidoroti su laisvųjų radikalų poveikiu, tačiau esant tam tikroms sąlygoms organizme susidaro laisvųjų radikalų perteklius, kuris sukelia nekontroliuojamus cheminius procesus. Dėl šių cheminių reakcijų išsivysto patologinės būsenos ir kiti susirgimai – nervų, imuninės sistemos, odos ligos, širdies ir kraujagyslių ligos, vėžys, bei pastaruoju metu labai aktyviai nagrinėjamos – Alzheimerio ir Parkinsono ligos, kurių priežastimi yra laisvieji radikalai. Halliwell B. teigia jog smegenys ir nervų sistema yra jautrios oksidaciniam stresui, ir yra nepakankamai aprūpintos antioksidacinėmis gynybos sistemomis, jog būtų galima išvengti žalos [1,22,26,30]. Taip pat laisvieji radikalai silpnina imunitetą, spartina senėjimo procesus bei sukelia mutacijas [1,25,30,31]. Jau 1950 metais Denham Harman pasiūlė ‘laisvųjų radikalų teorija senėjimui‘, kurioje paaiškinima, kodėl prasideda senėjimas (Harman, 1956) [32]. Schrader M. ir Fahimi D.H apžvalgoje minima, jog oksidacinis stresas bus susijęs su senėjimo procesais [26]. Šiuolaikiniuose moksliniuose straipsniuose patvirtinama, jog laisvieji radikalai greitina senėjimo procesus, bei ankstina ligas, kurios paprastai siejamos tik su daug vyresniu amžiumi [1,2,3]. Todėl, norint apsaugoti organizmo ląsteles nuo laisvųjų radikalų pažeidimų, svarbų vaidmenį vaidina antioksidantai [3].

4.2. Antioksidantai

Antioksidantai – tai medžiagos, kurios gali stabilizuoti ir inaktyvuoti laisvuosius radikalus, kurie atakuoja įvairias ląstelių struktūras. Organizme yra fermentinės antioksidantinės sistemos, kurios neutralizuoja susidariusius laisvuosius radikalus ir apsaugo audinius bei ląsteles nuo pažeidimų [3]. Antioksidantai vaidina pagrindinį vaidmenį apsaugodami ląsteles nuo laisvųjų radikalų pažeidimų - lipidų peroksidacijos, baltymų pažaidos ir DNR struktūros pokyčių [1]. Antioksidantai gali būti skirstomi į fermentinius ir nefermentinius bei vidinius ir išorinius.

- Pagal prigimtį – fermentiniai ir nefermentiniai antioksidantai:

 Fermentiniai antioksidantai – tai superoksido dismutazė (SOD), glutationio peroksidazė ir katalazė.

 Nefermentiniai antioksidantai – tai fenoliniai junginiai, vitaminai (A, C, E), taninai, antocianai ir kt.

- Pagal šaltinius – išoriniai ir vidiniai antioksidantai:

 Vidiniai antioksidantai – tai organizmo ląstelių (pagrinde mitochondrijų) gaminami ir produkuojami junginiai, kurie laisvuosius radikalus verčia į mažiau toksiškus junginius.

 Išoriniai antioksidantai – tai su maistu gaunamos medžiagos, kurios veikia tokiu pat principu kaip ir vidinės sistemos komponentai inaktyvuodami laisvuosius radikalus [2,3,33,34].

Vidiniai antioksidantai yra superoksido dismutazė (SOD), kuri yra gaminama citoplazmoje ir mitochondrijose. Superoksido dismutazė laisvą superoksido radikalą verčia į vandenilio peroksidą, kuris gali sukelti didelę žalą ląstelėms (1 pav.). Vandenilio peroksidas ląstelėse skaidomas į vandenį veikiant glutationo peroksidazės arba katalazės antioksidantinėms sistemoms [2,22,26,31,35].

1 pav. Laisvųjų radikalų inaktyvavimas veikiant superoksido dismutazei (SOD) [23]

Išorinių antioksidantų šaltiniai yra mitybos racioną papildantys vaisiai, daržovės ir vaistiniai augalai, kurie kaupia įvairius biologiškai aktyvius junginius: fenolinius junginius, flavonoidus, vitaminus ir jų pirmtakus (vit. E, vit. C, vit. A, β-karotenas), antocianus, turinčius stiprų antioksidantinį poveikį [1,2,34,36].

Vaistiniai augalai yra veiksmingi antioksidantų šaltiniai, turintys didelę bioaktyvių junginių įvairovę. Vieni iš jų polifenoliniai junginiai – antioksidantai, kurie gali veikti individualiai ar sinergistiškai, veiksmingai mažinti oksidacinio streso pažeidimus ir prisidėti gydant ligas. Per daugelį metų antioksidantiniu aktyvumu pasižymintys vaistiniai augalai įgijo didelę svarbą medicinoje ir farmacijoje [37,38].

4.3. Fenoliniai junginiai ir jų antioksidacinės savybės

Fenoliniai junginiai - tai antriniai augalų metabolitai, natūralios biologiškai aktyvios medžiagos. Fenoliniai junginiai pagal cheminę struktūrą skistomi į kelias grupes – paprastieji fenoliai, flavonoidai, fenolinės rūgšys, lignanai, stilbenai, taninai ir kumarinai, junginius, kurie turi specifinius fiziologinius ir biologinius aktyvumus [7,10]. Fenolinių junginių struktūra sudaryta iš vieno ar kelių aromatinių žiedų, turinčių vieną arba kelias hidroksilo grupes. Polifenoliniai junginiai turi fenolinio žiedo hidroksilinę grupę, prie kurios lengvai prisijungiantys laisvi elektronai, gali funkcionuoti kaip efektyvūs antioksidantai. Fenoliniai junginiai yra plačiai paplitę augalų karalystėje, todėl randami beveik visuose augaluose ir augaliniame maiste, dėl savo antioksidantinių, antikancerogeninių, antimikrobinių, antialerginių, antimutageninių ir antiuždegiminių savybių jie vaidina svarbų vaidmenį apsauginiuose žmogaus organizmo procesuose [10,34,38,39,40]. Polifenoliai apsaugo organizmą nuo UV spindulių poveikio ir oksidacinio streso, o dėl savo antimikrobinių savybių apsaugo augalus nuo patogenų. Epidemiologiniai tyrimai rodo,

kad ilgalaikis augalų turinčių polifenolinių junginių vartojimas apsaugo nuo tokių lėtinių ligų, kaip diabetas, nutukimas [12,24].

Daugiausia polifenolinių junginių suvartojamų žmogaus mityboje yra gaunama iš augalų arba vaisių [37,38]. Polifenolinių junginių antioksidacinės savybės yra naudingos sveikatai ir gali būti svarbios kaip prevencija įvairių ligų gydyme, susijusiame su oksidaciniu stresu. [1]. Svarbūs junginiai pasižymintys vienu didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu yra fenolinės rūgštys ir flavonoidai [27].

Fenolinės rūgštys augaluose sutinkamos laisvos, esterių arba amidų pavidalu. Fenolinės rūgštys skirstomos į: hidroksicinamono (cinamono, p-kumaro, ferulinė, kavos rūgštis ir kt.) ir hidroksibenzoinės (galo, elago, p-hidroksibenzoinė, vanilino rūgštis ir kt.) rūgšties darinius. Hidroksicinamono rūgštims būdinga C3-C6 struktūra su esančia trijų C atomų šonine grandinėle, o hidroksibenzoinėms - C1-C6 struktūra, šioje aromatinio žiedo esantys grupių pakaitai (OH-, CH3O-), esantys 1,2,3 padėtyse lemia individualius rūgščių skirtumus. Taip pat chlorogeno rūgštis, kuri yra cinamono rūgšties esteris. Visos šios rūgštys yra randamos natūraliuose maisto šaltiniuose, bei sutinkamos daugelyje vaistinių augalų [27,41].

Flavonoidai – biologiškai aktyvūs organiniai junginiai, kurie plačiai paplitę gamtoje (lot. flavus – geltonas), turintys heterociklinę struktūrą. Tai viena iš gausiausių ir svarbiausių polifenolinių junginių grupių, randamų vaisiuose, daržovėse ir augaluose, bei suteikianti jiems spalvas [34,42].

Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai (15 anglies atomų). Flavonoidų struktūros pagrindą (2 pav.) sudaro benzo – γ pirono žiedas (flavanas). Aglikono pagrindas – C6-C3 -C6, kurį sudaro du aromatiniai žiedai (A ir B). Žiedai yra sujungti trimis anglies atomais, kurie suformuoja heterociklinį žiedą (C – pirono žiedas). Pagrindinė flavonoidų struktūra yra aglikonas, tačiau daugiausia junginių sutinkami O-glikozidų forma. Biologinis šių junginių aktyvumas, įskaitant ir antioksidacinį aktyvumą, priklauso nuo struktūrinių skirtumų ir glikozilinimo būdo (pvz. izoflavonų aglikonai dažniausiai randami kaip 7-O-gliukozidai ir 6‘‘-O-malonyl-7-O-gliukozidai). Prie aglikono gali būti prisijungę daugiau kaip 80 skirtingų cukrų, tačiau pagrindiniai yra - gliukozė, ramnozė, arabinozė, galaktozė [43,44].

2 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [43]

Pagal įvarias C žiedo modifikacijas flavonoidai yra skirstomi į flavonus (apigeninas, viteksinas ir kt.), flavonolius (kvercetinas, kempferolis, miricetinas, rutinas ir kt.), flavononus (flavononas, hesperidinas ir kt.), antocianus (cianidas, peoninas ir kt.), izoflavonoidus (genisteinas, biochaninas, formononetinas, daidzeinas ir kt.), chalkonus, auronus [42,43].

Izoflavonai didesniais kiekiais sutinkami sojų pupose ir ankštinių (Leguminosae L.) šeimos augaluose, tačiau remiantis literatūros šaltiniais, raudonieji dobilai sukaupia panašius izoflavonų kiekius lyginant su sojų pupomis [45]. Raudonųjų dobilų žaliavoje izoflavonai sudaro didžiausią kiekį. Pagrindiniai bioaktyvūs junginiai yra biochaninas A ir formononetinas, su mažesnėmis koncentracijomis - daidzeinas ir genisteinas. Šių junginių struktūra yra parodyta 3 pav. [5,6].

3 pav. Flavonoidų aglikono struktūros pagrindas [6]

Flavonoidų aglikono nurodytoje struktūroje (3 pav.) prie R1 ir R2 jungiasi pakaitai, nurodyti 2 lentelėje.

2 lentelė. Trifolium pratense L. Pagrindinių izoflavonų cheminės struktūros [6].

Moksliniai tyrimai patvirtina, jog flavonoidai turi teigiamą poveikį sveikatai, kovojant su vėžiu, neurodegeneraciniais sutrikimais, ateroskleroze, Parkinsono liga, šalinant laisvuosius radikalus ir sujungiant pereinamuosius metalų jonus [34,43,44]. Izoflavonoidai yra natūralūs fitoestrogenai, kurie savo chemine struktūra panašūs į žmogaus estrogenus. Jie neturi steroidinio žiedo, tačiau su ketvirtoje ir septintoje padėtyje esančiomis hidroksilo grupėmis yra tapatūs estradiolio molekulei. Be to T.pratense turi kitų svarbių komponentų, įskaitant fenolines rūgštis ir flavonoidus, kurių kombinacija su izoflavonais teigiamai veikia gimdos veiklą [13,45].

4.4. Fenolinių junginių ekstrakcija ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimo

metodai

Fenolinių junginių ekstrakcija yra svarbus žingsnis norint išgauti biologiškai aktyvias medžiagas iš augalinės žaliavos prieš analizę. Augalinės žaliavos gali būti šviežios, džiovintos ar liofilizuotos. Ekstrakcijos efektyvumui yra svarbu cheminės junginių savybės, ekstrahavimo metodas, kitų medžiagų buvimas, ekstrahento pasirinkimas. Dėl botaninės matricos kompleksiškumo analizuoti individualias medžiagas yra brangu ir sudėtinga, todėl dažnai yra atliekamas suminis biologiškai aktyvių medžiagų įvertinimas [42]. Ekstrakcijos metodai ir ekstrahentai pasirenkami pagal ekstrahuojamų medžiagų charakteristikas. Remiantis literatūros šaltiniais fenolinių junginių ekstrakcijai naudojami įvairūs metodai: maceracija, ektrakcija ultragarsu, skysčių ekstrakcija ir kt [46]. Ekstrahentais dažniausiai pasirenkami – metanolis, etanolis, acetonas ir jų mišiniai su vandeniu. Etanolis yra tinkamiausiais ekstrahentas norint tirti polifenolinius junginius, dėl savo savybių – mažai toksiškas, poliškas, bei priimtinas vartojimui maisto pramonėje. Ekstrakcijai naudojant polinius tirpiklius ir ultragarso metodą (veikimas mikrobangomis), pasiekiamas didžiausias ekstrakcijos efektyvumas [46,47,48].

Nr. Izoflavonai Pakaitai R1 R2 1 Biochaninas A OH CH3 2 Formononetinas H CH3 3 Daidzeinas H H 4 Genisteinas OH H

Tiriant vaistinius augalus, taikomi įvairūs antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai, kurie funkcionuoja skirtingais veikimo mechanizmais (Miguel, 2010) [49]. Reakcijos principu - oksidantas yra inaktyvuojamas, naudojant du veikimo būdus – perduodant elektroną ir (ar) perduodant vandenilio atomą [37]. Plačiausiai moksliniuose tyrimuose antioksidantinio aktyvumo nustatymui taikomi in vitro metodai, pagrįsti laisvųjų radikalų surišimu, naudojant DPPH• (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) ir ABTS•+ _(2,2´ _{-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonas) radikalus, kurie} redokso statuse keičia spalvas. Taip pat Folin-Colcalteu ir FIC metodai, redukcijos antioksidacinio stiprumo nustatymui [21,27,28].

Antioksidantiniai junginiai nustatomi susidarant spalvotiems produktams, reaguojant netiesioginiam antioksidantui su reagentu. Antioksidantinis aktyvumas nustatomas esant atitinkamam šviesos bangos ilgiui, atsižvelgiant į kiekvieno metodo principą [50].

Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas Folin-Ciocalteu (F-C) metodas. Metodas pagrįstas cheminės redukcijos procesu, kurio metu esant fenoliniams junginiams susidaro mėlynos spalvos produktai šarminiame tirpale, esant plačiam absorbcijos spektrui (760-765 nm). Metodas tikslus ir konkretus, pateikiamas moksliniuose šaltiniuose kaip tinkamas naudoti polifenolinių junginių nustatymui [4,10,51].

Bendro flavonoidų kiekio nustatymui naudojamas spektrofotometrinis metodas, kuris pagrįstas aliuminio chlorido kompleksų susidarymu. Tai vienas iš dažniausiai naudojamų nustatymo metodų taikomų flavonoidų kiekio nustatymui. AlCl3 sudaro stabilius kompleksus su C-4 keto grupe ir/arba C-3 ir C-5 hidroksilo grupės flavonais ir flavonoliais. Taip pat aliuminio chloridas yra labilus kompleksams su orto-dihidroksilo grupėmis flavonoidų A ir B žieduose [14,52]. Mišinio absorbcija matuojama po 30 min, esant 407, 510 nm bangos ilgiui, rezultatai išreiškiami mg/g pagal rutino ekvivalentą (RE) [1,40,47].

DPPH. Antiradikalinis aktyvumas nustatomas matuojant nustatomojo bandinio absorbciją, stabilaus 2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH•) prie 515-520 nm bangos (4 pav.) [22]. Šis metodas buvo sukurtas Blois‘o (1958) su tikslu nustatyti antioksidantinį aktyvumą naudojant stabilų laisvąjį radikalą DPPH. Analizė yra pagrįsta antioksidanto sujungimo gebos matavimu [53].

4 pav. DPPH radikalo reakcija su antioksidantu (A-H) [53]

Reakcijos metu DPPH radikalai, dėl radikale esančio azoto atomo nelyginio elektrono, redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčių junginių į geltonos spalvos hidraziną [21,27,50].

ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas. Antiradikaliniam aktyvumo nustatymui naudojamas ABTS radikalo sujungimo metodas, kuriuo nustatomas pradinių junginių ir reakcijos produktų antiradikalinis aktyvumas [49]. ABTS yra mėlynai - žalias radikalinis katijonas(ABTS•+), sugeriantis šviesą. ABTS•+ _{reaguoja beveik į visus antioksidantus. Šis radikalas yra tirpus} vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, todėl galima analizuoti tiek hidrofilinius, tiek lipofilinius junginius. Šiuo metodu tyrimai gali būt atliekami tiek grynam natūraliam junginiui, tiek sudėtingam mišiniui. Regimosios šviesos spektre, spalvotam radikalui, charakteringi absorbcijos maksimumai esant 417, 650, 734 nm bangos ilgiams [21,28,40,54]. ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas yra techniškai paprastas ir dažnai taikomas antioksidantų atrankai [49].

FIC – Fe2+ _{jonų surišimo metodas. Pereinamieji metalai – Fe}2+ _{ir Cu}2+ _{stipriai įtakoja} ligų atsiradimą. Organinių substratų - geležies (II) ir vandenilio peroksido oksidacija vadinama ‘Fentono chemija‘, kurą aprašė H.J.H. Fenton‘as [10,55,56].

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH• (Fentono reakcija)

Dėl per didelės O2 koncentracijos padidėjimo formuojasi superoksido radikalai, kurie sukelia toksiškumą. Superoksido anijonas sparčiai virsta vandenilio peroksidu, toliau sudarydamas hidroksilo radikalus. Šie visi oksidatoriai dalyvaujantys fentono reakcijoje sąlygoja biomolekulių žalą ir vaidina svarbų vaidmenį senėjimo procesuose ir tokiose ligose, kaip vėžys, bei lipidų ir

amino rūgščių oksidacija. Antioksidantinis veikimas pasireiškia kai Fe(II) jonai virsta mažiau reaktyviais Fe(III) jonais [55,56].

Kiekybiniam nustatymui naudojamas ferozinas, kuris su Fe2+ jonais sudaro kompleksus, įgaunančius ryškiai raudoną spalvą. Chelatuojančių medžiagų aktyvumas nustatomas spektrofotometriniu metodu prie 562 nm bangos ilgio. Pagal atliktus tyrimus, chelatuojančios medžiagos linkusios sudaryti ryšius su metalais, kurie turi antioksidantinį poveikį, sumažindami redokso potencialą [10,55].

Naudojant tik vieną antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodą būtų sunku tiksliai įvertinti tiriamojo objekto antioksidantinį aktyvumą žaliavoje. Siekiant detaliau įvertinti augalinių ekstraktų aktyvumą, tyrimus tikslinga vykdyti keletu in vitro metodų, kuriais būtų galima nustatyti žaliavų gebėjimą funkcionuoti keletu antioksidacinio aktyvumo mechanizmų.

5. RAUDONOJO DOBILO (Trifolium pratense L.) BENDROJI

CHARAKTERISTIKA

Trifolium L. (dobilas) yra pupinių (Fabaceae L.) arba ankštinių (Leguminosae L.) šeimos gentis. Ją sudaro apie 250 rūšių [57,58]. Lietuvoje natūraliai augavietėse auga 15 dobilų rūšių. Plačiausiai natūraliai paplitusios dobilų rūšys: Trifolium pratense (raudonasis), Trifolium repens (baltasis) ir Trifolium hybridum (rausvasis) [57]. Trifolium taksonominė grupė yra viena iš svarbiausių pupinių šeimos rūšių. Trifolium pavadinimas kilęs iš lotynų kalbos ir išvertus reiškia - trys lapai (lot. res – trys, folium – lapas) [5,6].

T. pratense yra žinomas kaip raudonasis, šliaužiantis ar gūžinis dobilas, naudojamas jau nuo senų laikų [5,6,10,12]. Augalas natūraliai yra plačiai paplitęs Jungtinėse Amerikos Valstijose, Vidurio ir Pietų Europoje, Šiaurės Afrikoje, taip pat sutinkamas nuo Mažosios Azijos iki Kinijos [6,59]. Lietuvoje šis augalas randamas natūraliose augavietėse, daugiausiai vakarų Lietuvos teritorijoje [19].

Raudonasis dobilas yra daugiametis, 20-60 cm aukščio augalas, turintis storą, išsišakojusią liemeninę šaknį ir 2-9 stiebus. Stiebai kylantys arba prigulę, žalios spalvos. Žiedynas rutuliškas su vainikėliu, šviesiai violetinės ar violetinės spalvos, susitelkę vienoje 2-3 cm pločio rutuliškoje galvutėje, retais atvejais galvutės gali būti porinės. Lapai ovalūs ar elipsės formos, dažniausiai sudaryti iš trijų, rečiau iš keturių lapelių. Sėklos pailgai ovališkos. Žydi birželio – rugsėjo menesį [28,47].

Pagrindinės T. pratense biologiškai aktyvios medžiagos: izoflavonai – biochaninas A, formononetinas (gausiausiai randamas lapuose), daidzeinas ir genisteinas, flavanoliai – kvercetinas ir kempferolis, fenoliniai junginiai – fenolinės rūgštys (salicilo rūgštis, kumaro rūgštis, kofeinas, rozmarino, galo, elago ir chlorogeno rūgštys) ir saponinai, taip pat randama eterinių aliejų [6,9,10,47].Cheminės sudėties skirtumus atskirose augalo dalyse lemia įvairios sąlygos – auginimo, rinkimo laikotarpis, temperatūra, skirtingos veislės [58].

Diploidinė (2n=14) raudonųjų dobilų rūšis yra aukštos kokybės pašarinis ankštinių šeimos augalas [19,20]. Raudonojo dobilo antžeminė dalis kaip pašarinė ir ankštinė žolė naudojama daugelyje pasaulio šalių. Augalas taip pat svarbus dirvožemio derlingumo charakterisikomis, nes ant šaknų susidarę gumbeliai ir ten gyvenančios bakterijos fiksuoja azotą ir taip praturtina dirvožemį [60]. Diploidiniai raudonieji dobilai turi mažesnius lapelius lyginant su tetraploidiniais [20]. Mokslinėje literatūroje nėra aiškesnių duomenų ar diploidinės, ar tetraploidinės dobilų veislės yra vertingesnės. Nuo senesnių laikų yra susiformavusi nuomonė, jog tetraploidiniai dobilai patvaresni ir atsparesni ligoms, tačiau naujausi tyrimai atskleidžia, kad diploidinės veislės nesiskiria nuo tetraploidinių veislių savo jautrumu ligoms ir tam tikrais atvejais, kai kurios veislės turi didesnę išlikimo tikimybę lyginant su tetraploidinėmis. Diploidinių veislių dobilai lenkia tetraploidinius savo didesniu prikultų sėklų skaičiumi, bei lengvesniu bičių apdulkinimu [15,16,17,18].

Raudonasis dobilas yra įrašytas JAV farmakopėjoje, augalo vaistinė žaliava – džiovinti žiedai, o jos kokybę apibūdinantys parametrai reglamentuojami joje yra izoflavonų kiekis [61]. Trifolium pratense yra vaistinis augalas, kurio panaudojimas turi labai ilgą istoriją. Dar nuo senovės laikų raudonojo dobilo žaliavos vartotos kaip skausmą malšinančios ir vėžio simptomus lengvinančios, priešreumatinės ir priešpodagrinės priemonės. Daugiau kaip šimtmetį Europoje ir Amerikoje dobilų preparatai vartojami esant kosuliui, skausmo ir atsikosėjimo mažinimui.

Amerikoje raudonojo dobilo lapai ir žiedai vartojami įvairių ginekologinių ligų gydymui. Šių dienų raudonojo dobilo panaudojimas medicinos srityje yra labai platus. T. pratense biologinis aktyvumas įrodytas moksliniais tyrimais, jo preparatai vartojami gydyti vėžiui, osteoporozei, širdies ir kaujagyslių ligoms, geltai, skausmo malšinimui, menopauzės simptomams, bronchitui, astmai, spazmolitiniam kosuliui ir egzemai. Pagrindinis panaudojimas, kaip alternatyva pakaitinei hormonų terapijai [5,6,8,11,47,62].

Trifolium pratense L. biologiškai aktyvios medžiagos pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Tyrimų duomenimis, pastebimos apsauginės savybės nuo laisvųjų ROS radikalų, UV radiacijos ir oksidacinio DNR pažeidimo in vitro metodais [5,63]. Fenoliniai junginiai - svarbi augalų sudedamoji dalis veikianti kaip žalingų tarpinių junginių „sugerėjai“, tokių kaip: peroksilo ir alkoksilo radikalų, kurie įtakoja miokardo infarktą, aterosklerozę, senėjimo procesus bei vėžį [5].

Raudonojo dobilo rūšyje stebimas polifenolių oksidazės (PPO) aktyvumas pasireiškiantis baltymų degradaciją mažinančiu poveikiu. Tai grupė fermentų apimanti tirozinazes ir katecholo oksidazes ir sutinkama gyvūnuose, ir augaluose. PPO konkrečiai - monofenolazė (tirozinazė) ir O-difenolio oksidazė (katecholio oksidazė), kurios oksiduojasi principu: monofenolazė į O-difenolius ir O-difenoliai virsta O-chinonais. Reaktyvūs chinonai gali polimerizuotis tiek patys tiek su amino rūgštimis ir baltymais. Proteolizė ir lipolizė gali būti inhibuojama polifenolių oksidazių, ko pasekoje stebimas lipidus apsaugantis poveikis [11,17,64,65].

Uždegimas, oksidacinis stresas, trombocitų aktyvacija ir koaguliacijos kaskados yra glaudžiai susietos ir gali sukelti patofiziologinių pasekmių, įskaitant tromboembolijos riziką. Todėl Trifolium genties augalais susidomėta dėl biologiškai aktyvių medžiagų antioksidacinių savybių. Oksidacinis stresas, uždegimas ir pakitusi trombocitų agregacija yra svarbūs širdies ir kraujagyslių ligų patogenezėje. Buvo nustatyta jog, ROS/RNS yra susiję su trombocitų aktyvacija. Peroksinitritas (ONOO•) yra vienas iš pagrindinių aktyviųjų azoto junginių susijusių su širdies ir kraujagyslių sistema, skatinantis trombocitų struktūros (ypatingai baltymų ir lipidų) žalą. Tyrimo metu buvo siekiama įvertinti antioksidacines augalinių ekstraktų savybes. Efektyviausiu pripažintas T. pratense, kurio ekstraktai turėjo teigiamą poveikį mažinant peroksidaciją trombocitų ląstelėse [66].

Viena iš svarbesnių flavonoidų grupės atstovų – izoflavonai. Dėl daugelio atliktų tyrimų, galima spręsti, jog izoflavonai yra biologiškai aktyvūs junginiai, kurie yra svarbūs medicinoje. Dobilai kaupia didelius kiekius izoflavonų, todėl yra perspektyvūs vaistiniai augalai, kuriais gali būti gydoma menopauzė bei jos sukelti simptomai ir kt [10]. Raudonojo dobilo kaupiami

izoflavonai, kitaip dar vadinami – fitoestrogenais, veikia kaip natūralūs ligandai ir veikia estrogenų receptorius [8,9,13,62]. Atliktais moksliniais tyrimais, iš raudonojo dobilo išskirtos medžiagos – farmononetinas ir biochaninas A, gali turėti teigiamą poveikį esant menopauzės sutrikimams - osteoporozei, prostatos lygiųjų raumenų funkcijos gerinimui, širdies ligų rizikos veiksniams ir krūties vėžio gydymui [13].

Atlikti tyrimai su raudonojo dobilo žaliava, kurios panaudojimas svarbus kaip alternatyvus gydymas menopauzės laikotarpiu esančių simptomų palengvinimui (pvz. karščio bangos). Šis poveikis yra prisikiriamas augalo bioaktyvioms medžiagoms. Atliktuose tyrimuos iš T. pratense išskirti izoflavonai buvo lyginami su estradiolio ((17β)-estra-1,3,5(10)-trieno-3,17-diolio)) poveikiu. Šiame tyrime buvo pasirinktos laboratorinės pelės (nėščios), kurioms buvo skiriama 75g/kg raudonojo dobilo ekstrakto ir 0,5 mg estradiolio. Gauti rezultatai parodė, jog ekstraktai pasižymi estrogeniniu poveikiu ir turi pirminį agonistinį aktyvumą lyginant su β-estradioliu [8,13].

Augalo panaudojimas osteoporozės prevencijai labai svarbus siejant su menopauzės laikotarpiu. Pagal daugelį atliktų tyrimų, raudonasis dobilas gali užkirsti kelią kaulinių ląstelių nykimui, pakeliant estrogenų lygį, taip slopinant greitą kaulų medžiagų apykaitą [67].

T. pratense reikšmingas diabeto ligos gydyme. Dėl savo antioksidantinio aktyvumo ir kaupiamų bioaktyvių medžiagų, raudonasis dobilas turi hipoglikeminį potencialą, slopindamas α-amilazės ir α-gliukozidazės, bei kasos lipazę slopinančias savybes. In vitro tyrimuose buvo naudoti raudonųjų dobilų žiedų ekstraktai. Rezultatai atskleidė, jog dėl sukaupiamų reikšmingų flavonoidų kiekių augalas gali slopinti pagrindinius fermentus, kurie dalyvauja angliavandenių skaidyme [12].

6. TYRIMO METODIKA IR METODAI

6.1. Tyrimų objektas

Kultivuotų raudonųjų dobilų (Trifolium pratense L.) diploidinių veislių kolekcijos įrengtos 2012 m. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centre, Žemdirbystės instituto bandymų laukuose. Žaliavos augintos karbonatiniame, vidutinio sunkumo priemolio rudžemyje. Armuo 25-30 cm, pH – 6,5-7,0, humuso 2,0-2,4 %, judriųjų P2O5 50-80 mh/kg-1 ir K2O 100-150 mg/kg-1. Kolekcija buvo pasėta birželio mėnesį, tos pačios veislės ir selekcinė medžiaga buvo pasėta po 4 pakartojimus, 2,5 m2 _{laukeliais – po 2 eilutės, jų ilgis 5 m., atstumai tarp eilučių 0,5 m., atstumai tarp skirtingų} numerių – 0,5 m.

Fenolinių junginių kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumui įvertinti žaliavos buvo auginamos centrinės Lietuvos (55°23′49″N; 23°51′40″E) žemės ūkio institute. Tyrimui naudotos lietuviški raudonųjų dobilų (Trifolium pratense L.) veislių augalai.

Žaliavos nuėmimui herbicidai nebuvo naudojami. Augalų mėginiai buvo renkami masinio žydėjimo metu 2013 – 2014 m. ir krūmijimosi stadijoje 2014 m. 2014 metų antžeminės dalies mėginiai buvo padalinti į dvi dalis. Viena dalis buvo panaudojama antžeminei daliai gauti, o kita išskirstyta į morfologines augalo dalis: stiebus, lapus ir žiedus. Mėginiai buvo kruopščiai nuplauti vandeniu, perplaunami išgrynintu vandeniu ir padedami nudžiūti ant filtrinio popieriaus. Toliau žaliavos buvo smulkinamos, laikomos 15 minučių, 105° laipsnių temperatūroje ir vėliau džiovinamos džiovyklėje esant 651 °C temperatūrai. Žaliavų mėginiai buvo apdoroti tą pačią dieną, kai jie buvo nuskinti.

Raudonojo dobilo žaliavų mėginius sudaro keturios diploidinės veislės – Vyčiai, Kamaniai, Radviliai ir Arimaičiai, kurių kiekvieną sudaro: pirmųjų auginimo metų (2013 m) antžeminė augalo dalis, antrųjų auginimo metų (2014 m) antžeminė augalo dalis ir morfologinės dalys (lapai, stiebai ir žiedai, Vyčių sėklos), bei 2014 m krūmijimosi metu surinkta žaliava, kuri džiovinta įprastai ir liofilizuojant.

6.2. Naudotos medžiagos ir reagentai

Tyrimų metu naudota: išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96 proc įsigytas iš UAB “Stumbras” (Kaunas, Lietuva), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas 2M įsigytas iš Sigma –Aldrich (Šveicarija), natrio karbonatas 99,5-100,5 proc įsigytas iš Sigma – Aldrich (Prancūzija), galo rūgšties monohidratas ≥ 98 proc įsigytas iš Sigma –Aldrich (Kinija), DPPH (2,2-deifenil-1-pikrilhidrazilas) 95 proc įsigytas iš Alfa Aesar (Karlsruhe, Vokietija), rutino hidratas ≥ 94 proc įsigytas iš Sigma – Aldrich (Vokietija), acto rūgštis 100 proc įsigyta iš Carl Roth (Vokietija), aliuminio chlorido heksahidratas ≥ 95 proc įsigytas iš Carl Roth (Vokietija), heksametilentetraminas ≥ 99,5 proc įsigytas iš Sigma – Aldrich (Rusija), ferozinas (ferrozine monosodium salt) ≥ 97 proc įsigytas iš Sigma – Aldrich (JAV), bevandenis geležies (II) chloridas 99,5 proc įsigytas iš Alfa Aesar (Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono)) rūgštis įsigyta iš Sigma-Aldrich (Kanada), kalio persulfatas įsigytas iš SIAL (Kanada).

6.3. Naudota aparatūra

Bandinių ekstrakcijai atlikti naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V) iš Elma Schmidbauer (Vokietija), oribitalinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic (IKA-WERKE, Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudoti spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) ir „Agilent Technologies“ (Cary 60, USA)

6.4. Tyrimų metodai

6.4.1. Diploidinių T. pratense veislių žaliavų ekstraktų paruošimas

Raudonojųjų dobilų (Trifolium pratense L.) etanoliniai ekstraktai ruošiami sverian tikslų kiekį 0,100 g žaliavos, užpilant 10 ml 70 % (V/V) vandens etanoliniu tirpalu (1:100), kiekvienos žaliavos po du mėginius, veikiami ultragarso vonelėje 15 min., 50°C temperatūroje. Ekstraktai

filtruojami naudojant popierinius filtrus, filtruojama į matavimo cilindrą. Žaliava praplaunama 70 % (V/V) etanoliu iki 10 ml. Taip paruošiamos keturių veislių žaliavos, iš viso 58 mėginiai.

6.4.2. Reagentų paruošimas

Kiekvieną dieną ruošiamas šviežias 6 x 10-5 _{DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) tirpalas} ir laikomas tamsaus stiklo butelyje apsaugančiame nuo saulės spindulių. Sveriama 0,00118 g (tikslus kiekis) DPPH reagento ir tirpinamas 50 ml 96 % (V/V) etanolyje.

ABTS tirpalas ruošiamas ABTS miltelius 0,0548 g (tikslus kiekis) tirpinant 50 ml išgryninto vandens ir pridedant 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys laikomas tamsoje, kambarioje temperatūroje 15-16 val, kol pasiekiama reakcijos pusiausvyra. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki darbinio ABTS•+ _{tirpalo, kurio absorbcija 0,800±0,030 prie 734} nm bangos ilgio.

70 proc. (V/V) etanolio tirpalas ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele, 665 ml 96 proc. (V/V) etanolio skiedžiama 335 ml išgrynindo vandens.

0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas matavimo kolboje 10 ml Folin-Ciocalteu (2M) fenolinis reagentas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5 proc. (W/V) Na2CO3 tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio natrio karbonato tirpinant 100 ml išgryninto vandens.

33 proc. acto rūgšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8 proc. ledinę acto rūgštį skiedžiant išgrynintu vandeniu matavimo kolboje iki 100 ml žymos.

10 proc. aliuminio chloride tirpalas ruošiamas 5,0 g aliuminio chlorido tirpinant 50 ml išgryninto vandens.

5 proc. heksametilentetramino tirpalas ruošiamas 2,5 g heksametilentetraminą tirpinant 50 ml išgryninto vandens.

Rutino etanolinis tirpalas ruošiamas 99 proc. grynumo rutino 0,025 g (tikslus kiekis) tirpinant 25 ml 70 proc. (V/V) etanolio tirpalo.

2mM FeCl2 tirpalas ruošiamas 0,0063 g (tikslus kiekis) tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas FeCl2 tirpalas.

5 mM ferozinos tirpalas ruošiamas 0,0616 g (tikslus kiekis) ferozino tirpinant 25 ml išgryninto vandens.

6.5. Diploidinių T. pratense veislių žaliavų ekstraktų spektrofotometrinė analizė

6.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis etanoliniuose ekstraktuose nustatytas analizuojant spektrofotometriniu metodu naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100) ir sumaišoma su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu, po 4 min. įpilama 4 ml 7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalo. Po 60 min. matuojamas optinis tankis, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstrakto mėginys matuojamas mažiausiai po 3 kartus.

6 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE) remiantis kalibracine kreive (6 pav.) naudojant formulę:

GRE (mg/g) = c x V/m;

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V- pagaminto ekstrakto kiekis (ml); m – tikslus žaliavos kiekis (g).

y = 9,3076x + 0,1377 R² = 0,9958 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 A bs o rbci jos dyd is Koncentracija mg/ml

6.5.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų

surišimo metodu

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui taikomas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. Etanolinis tiriamojo ekstrakto (1:100 santykis) kiekis (50 μl) sumaišomas kvarcinėje kiuvetėje su 6 x10-5 M DPPH tirpalo (2 ml). Tuščias bandinys ruošiamas 50 μl (70 % V/V) vandens-etanolio mišinį sumaišant su 6 x10-5 _M DPPH tirpalu. Spektrofotometru išmatuojami mėginių absorbcijos dydžio mažėjimai 515 nm bangos ilgyje kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30 min.)

Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:

DPPH = [(Ab-Aa)/Ab] x 100 %;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (po 30 min.); Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t= 0 min.).

6.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Flavonoidų kiekis nustatomas tiriamąjį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido ir heksametilentetramino tirpalais, acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Ruošiami du tirpalai: tiriamasis ir lyginamasis. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 25 ml matavimo kolbutėje įpilant 1 ml etanolinio ekstrakto (1:100), 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5 % heksametilentetramino tirpalo, visas mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės, gerai sumaišoma. Po 30 min. matuojamos absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant bangos ilgiui (475 nm).

Lyginamasis tirpalas ruošiamas 25 ml matavimo kolbutėje įpilant 1 ml etanolinio ekstrakto (1:100), 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % acto rūgšties tirpalo, visas mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės, gerai sumaišoma. Kiekvienas ekstraktas matuojamas po 3 kartus.

Duomenys vertinami lyginant gautą absorbcijos dydį su etaloniniu rutino tirpalu absorbcijos dydžiu. Etaloninio ir palyginamojo rutino tirpalas ruošiamas 1 ml etaloninio rutino tirpalo pilant vietoje 1 ml etanolinio ekstrakto.

Flavonoidų suminis kiekis skaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g remiantis formule:

X (

𝒈

) =

𝒎ʀ 𝐱 𝐀 𝐱 𝐕

𝐦 𝐱 𝐀ʀ 𝐱 𝐕ʀ

x 1000;

mR – rutino masė g, sunaudota etanoliniam rutino tirpalui ruošti; AR – etanolinio rutino tirpalo absorbcijos dydis;

VR – etanolinio rutino tirpalo tūris, ml;

A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – augalinio ekstrakto tūris, ml;

m – augalinio bandinio masė g, sunaudota ekstraktui paruošti.

6.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe

jonų surišimo

metodu

Chelatinės ekstraktų savybės įvertinamos matuojant Fe (II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą prie 562 nm bangos ilgio. Matuojamas 1 ml etanolinio ekstrakto (1:200), dedama 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo, gerai sumaišoma. Reakcija inicijuojama įdėjus 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo, gerai sumaišoma ir paliekama 10 min., kambario temperatūroje. Mišinys matuojamas spektrofotometru (562 nm ilgio banga). Tuščias bandinys ruošiamas matuojant 1 ml etanolinio ekstrakto (1:200), dedama 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo. Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 3 kartus. Palyginamasis tirpalas – 70 % (V/V) etanolis.

Ekstrakto chelatinės savybės išreiškiamos procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:

Fe2+ _{surišimas = [(A}

b-Aa)/Ab] x 100 %;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis; Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t= 0 min.).

6.5.5. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS

metodu

Antiradikaliniam aktyvumo įvertinimui taikomas 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties radikalo sujungimo metodas. Pirmiausia pagaminamas 2mM motininis ABTS tirpalas: sveriama 0,0548 g (tikslus svėrinys). ABTS reagentas ištirpinamas 50 ml išgryninto vandens, tamsaus stiklo buteliuke, kad apsaugoti nuo šviesos. Motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mM kalio persulfato tirpalu, kruopščiai sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje 15-16 val. Taip yra pagaminamas ABTS•+, su kuriuo reaguoja augalinės žaliavos ekstraktuose esančios BAM, pasižyminčios antiradikaliniu aktyvumu.

Gautas pradinis ABTS•+ tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol gaunama tiksli tirpalo absorbcija (0,800±0,03), esant 734 nm bangos ilgiui (palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo). Raudonųjų dobilų augalinių žaliavių etanolinių ekstraktaų antiradikalinis aktyvumas matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS•+ _{tirpalo įpilant 30 μl tiriamojo ekstrakto. Mišinys laikomas} kambarioje temperatūroje, 60 min. Nustatomas absorbcijos kitimas esant 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba (antiradikalinis ekstraktų aktyvumas) įvertinama išreiškiant trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos:

TE(ABTS) = с x V/m;

c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (μmol/l); V – paruošto ekstrakto tūris, ml;

m – atsvertas žaliavos kiekis, g.

Standartinio antioksidanto trolokso kalibracija sudaroma ruošiant penkių skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Motininis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tikslų (g) trolokso svėrinį ir tirpinant 70 % etanolyje. Iš motininio tirpalo ruošiami 400-8000 μmol/l koncentracijų tirpalai, su kuriais atliekamas ABTS tyrimas. Išmatuojamos skirtingų koncentracijų trolokso tirpalų absorbcijos reikšmės ir sudaroma kalibracinė kreivė (7 pav.)

7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų-katijonų sujungimo metodu (n=3)(p=0.002)

6.6. Duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis vaizdavimas atlikti su „MS Excel 2007“ kompiuterine programa. Parinktas statistinis reikšmingumo lygmuo - 0,05, tai reiškia, kad rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais jei p<0,05. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuota standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir koreliacinių ryšių įvertinimas pagal Pirsono koreliacijos koeficientą. y = 1E-04x + 0,1273 R² = 0,9223 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 A bs o rbci jos dyd is Koncentracija, μmol/l

7. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

7.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Efektyviai bioaktyviųjų junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų yra svarbu parinkti tinkamą ekstrahavimo metodą, parenkant geriausias sąlygas ir ekstrakcijos tirpiklį, atsižvelgiant į jo selektyvumą tiriamosioms medžiagoms. Parinkus atitinkamas sąlygas galima pagaminti kokybiškus ekstraktus su didele išeiga bei stipriu antioksidantiniu aktyvumu [51,68]. Remiantis literatūra ekstrahavimui dažniausiai naudojamas metanolis arba etanolis. Etanolio pasirinkimą lemė tai, kad jis geba maišytis su vandeniu bei ištirpinti daugelį vandenyje netirpių medžiagų. Pagal atliktus tyrimus, daugiausiai biologiškai aktyvių medžiagų išekstrahuojama 96 % etanoliu, tačiau rezultatai labai mažai skiriasi nuo etanolio – vandens mišinio [69]. Pasirinktas vandens-etanolio mišinys yra poliškas, mažai toksiškas sveikatai ir plačiai naudojamas farmacijos pramonėje [51,69]. Ekstrakcijos sąlygos įvertinamos papildomai nustatant ekstrahento poliškumą, laiko ir temperatūros nustatymą.

7.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas

Norint išsiaiškinti tinkamiausią ekstrahentą biologiškai aktyvių medžiagų ekstrakcijai iš diploidinių T. pratense veislių augalinių žaliavų buvo naudojamas paprastosios maceracijos metodas. Augaliniai ekstraktai buvo gaminami ekstrahentu naudojant 40 %, 50 %, 60 %, 70 % (V/V) etanolio koncentracijas. Tyrimams naudota pirmųjų auginimo metų (2013 m.) antžeminė diploidinių raudonojųjų dobilų, Vyčių veislės žaliava. Žaliavos ir ekstrahento santykis buvo 1:100, o ekstraktai ruošiami po devynis mėginius, jog būtų įvertintas rezultatų patikimumas. Žaliava sveriama (tikslus svėrinys 0,100 g), užpilama atitinkamos koncentracijos etanoliu ir 60 min purtoma automatinėje purtyklėje, laikoma 24 val tamsoje ir pakartotinai purtoma 60 min, po ekstrahavimo ekstraktas filtruojamas panaudojant popieriaus filtrus. Gauti rezultatai pateikiami grafike. (8 pav).

8 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas 2n T. pratense Vyčių veislės pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies mėginiuose paprastosios maceracijos metodu. GRE - galo rūgšties

ekvivalentai. (n=3)

Iš grafiko (8 pav.) matome, kad daugiau fenolinių junginių išekstrahuojama su 50% (V/V) vandens-etanolio mišiniu. Lyginant rezultatus, su 50 % (V/V) vandens-etanolio mišiniu (10,320 mg/g) ir su 70 % (V/V) vandens-etanolio mišiniu (9,015 mg/g) ruoštų ekstraktų suminis fenolinių junginių kiekis skiriasi nežymiai. Remiantis literatūra ekstrahentais dažniausiai pasirenkami 50 - 80 % etanolio arba vandens-etanolio mišiniai. Remiantis mokslininkų atilktais tyrimais, dobilų žaliavos ekstrahavimui dažniau naudojami 70 – 80 % alkoholio-vandens mišiniai, kadangi šios koncentracijos alkoholiu išekstrahuojama daugiausiai polifenolinių junginių [68,69,70]. Remiantis rezultatais ir literatūros duomenimis, siekiant įvertinti suminius fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius žaliavose, tolimesnei analizei kaip ekstrahentas pasirenkamas 70 % (V/V) etanolis.

7.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas

Palyginamiesiems ekstrakcijos tyrimams buvo pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas. Buvo tirta pirmųjų auginimo metų (2013) antžeminė diploidinių raudonojųjų dobilų, Vyčių veislės žaliava (1:100) rinkta masinio žydėjimo metu, o ekstrakcijai naudotas 70 % (V/V) etanolis. Bandiniai veikti ultragarsu – 5, 10, 15, 20, 25 min, 30 ± 5 °C temperatūroje. Rezultatų atsikartojimui užtikrinti ruošiama po 9 mėginius kiekvienam laiko intervalui. Rezultatai apibendrinami grafike (9 pav.)

7,740 10,320 7,960 9,015 7 7,6 8,2 8,8 9,4 10 10,6 40% 50% 60% 70%

GRE (mg/g)

9 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas ekstrahuojant 2n T. pratense Vyčių veislės pirmųjų auginimo metų antžeminių augalo dalių mėginius 70 % (V/V) etanoliu (vidurkis ±

standartinė paklaida). Temperatūra – 30 ± 5 °C. GRE- galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)

Tyrimo metu nustatyta, jog vykdant ekstrakciją ultagarsu 15 min išekstrahuojamas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis lyginant su paprastosios maceracijos būdu (9,716 mg/g lyginant su 9,015 mg/g, atitinkamai). Laiko trukmės atžvilgiu, maceracijos metodu žaliavos ekstrahuojamos ilgiau (maceracija – 26 val, ultragarsas 15 min), todėl ekstraktų gamybai tikslingiau pasirinkti ekstrakciją ultragarsu.

7.1.3. Ekstakcijos ultagarsu temperatūros parinkimas

Siekiant optimizuoti temperatūrinį rėžimą efektyviai fenolinių junginių ekstrakcijai ultragarsu buvo tirta pirmųjų auginimo metų (2013) antžeminė diploidinių raudonojųjų dobilų, Vyčių veislės žaliava (1:100), ekstrakcijai naudotas 70 % (V/V) etanolis. Visi bandiniai ultragarsu veikti 15 min., atsižvelgiant į prieš tai gautus rezultatus. Vertinamos skirtingos temperatūros – 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C ± 5°C. Siekiant užtikrinti gautų rezultatų patikimumą ruošiama po 9 mėginius kiekvienai temperatūrai. Rezultatai apibendrinami grafike (10 pav.)

8,840 9,154 9,716 8,509 9,494 8 8,4 8,8 9,2 9,6 10

5min 10min 15min 20min 25min

10 pav. Ekstrakcijos temperatūros įvertinimas ultragarso vonelėje 2n T. pretense Vyčių veisės pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies mėginius ekstrahuojant 70% (V/V) etanoliu (vidurkis ± standartinė paklaida). Laiko intervalas – 15 min. GRE – galo rūgšties ekvivalentai.

(n=3)

Remiantis literatūra ekstrahuoti Trifolium genties žaliavoms naudojamos paprastosios maceracijos arba ultragarsinės ekstrakcijos metodai, naudojant metanolio arba etanolio vandens mišinius, kurių koncentracijos gali būti 50 % arba 70 %, optimizuojant ekstrakcijos temperatūrą ir laiką [45,51,62]. Ekstrakcija ultragarsu yra greitas ir paprastas metodas, kuris yra plačiai taikomas polifenolinių junginių išskyrimui. Ilginant ekstrakcijos laiką ir temperatūrą, didelė dalis fenolinių junginių gali oksiduotis ir hidrolizuotis (pvz. antocianų optimali temperatūra nuo 20 iki 50 °C, nes didesnėje kaip 70 °C temperatūroje įvyksta jų degradacija) [68].

Įvertinus ekstrakcijos sąlygų pasirinkimo rezultatus, tolimesniems tyrimams diploidinių raudonųjų dobilių mėginiai ekstrahuojami su 70 % (V/V) etanoliu, naudojant ultragarso vonelę (laikas – 15 min., temperatūra – 50 ± 5 °C).

7.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas diploidinių T. pratense veislių

žaliavose

Fenolinių junginių kiekis augaliniuose ekstraktuose lemia jų antioksidacinį aktyvumą [68]. Fenoliniai junginiai pasižymi svarbiu farmakologiniu poveikiu – neutralizuojančiu laisvuosius radikalus, apsaugančiu lipidus, antikancerogeniniu ir kita [5]. Dėl visų šių poveikių jų tyrimams yra

9,716 10,036 10,621 8,385 7,303 6 6,8 7,6 8,4 9,2 10 10,8 11,6 30° 40° 50° 60° 70°

GRE (mg/g)

skiriamas didelis dėmesys. Kolodziejczyk-Czepas J. tvirtinimu, Trifolium genties augalai – ateities augalai įvairių ligų gydymui [8].

Bendras fenolinių junginių kiekio įvertinimas atliktas naudojant keturias diploidinių raudonųjų dobilų (T. pratense) veislių (Vyčiai, Radviliai, Kamaniai ir Arimaičiai) žaliavas.

Norint įvertinti suminį fenolinių junginių kiekį galima pasirinkti keletą metodų (Folin-Denis, Folin-Ciocalteu, permenagnatinį titravimą ir kt). Natūralių fenolinių juginių heterogeniškumas ir kitų medžiagų poveikis gali įtakoti oksidaciją. Lyginant su kitais metodais, F-C metodas yra vertesnis norint įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį [4]. T. pratense L. antioksidantinio aktyvumo tyrimas atliktas nustatant suminį fenolinių junginių kiekį veislių žaliavų bandiniuose spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin-Ciocalteu metodą. Tyrimo rezultatai pateikti 11 pav.

11 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis diploidinių T. pratense veislių žaliavose (vidurkis ± standartinė paklaida). 1 metų – pirmųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis; 2 metų – antrųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis; Krūm. (L) – krūmijimosi tarpsnio antžeminė

augalo dalis džiovinta liofilizuojant; Krūm. – krūmijimosi tarpsnio antžeminė augalo dalis džiovinta įprastai. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=2).

Suminis fenolinių kiekis diploidinių raudonųjų dobilų žaliavų veislėse varijavo plačiose ribose: 5,325 mg/g – 34,226 mg/g. Grafike pateikti rezultatai rodo, jog suminis fenolinių junginių kiekis priklauso nuo augalo auginimo metų. Visose veislėse antrųjų auginimo metų antžeminių

2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35

1 metų 2 metų Lapai Žiedai Stiebai Krūm. (L) Krūm.

GRE mg/g

Vyčiai Radviliai Arimaičiai Kamaniai