MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
VAIDOTAS ŢVIKAS
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKYBINĖS IR KOKYBINĖS SUDĖTIES
BEI ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS OBELŲ
(MALUS DOMESTICA L.) LAPUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas
prof. dr. Vitalis Briedis
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKYBINĖS IR KOKYBINĖS SUDĖTIES
BEI ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS OBELŲ
(MALUS DOMESTICA L.) LAPUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Vaidotas Ţvikas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
1.1 Malus L. genties apibūdinimas ... 10
1.2 Malus L. morfologiniai poţymiai ... 10
1.3 Obelų lapų cheminė sudėtis ... 11
1.4 Flavonoidų reikšmė augalams ... 12
1.5 Flavonoidų panaudojimas medicinos praktikoje ... 13
1.6 Vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakcijos proceso apibūdinimas ir ekstrahavimo metodai ... 14
1.7 Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai... 17
1.8 Antioksidantai. Antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1 Tyrimo objektas ... 24
2.2 Naudoti reagentai ... 24
2.3 Naudota aparatūra ... 24
2.4 Tyrimų metodai ... 25
2.5 Duomenų statistinis įvertinimas ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimas iš obelų lapų augalinės ţaliavos ... 28
3.2 Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymas obelų lapų ėminiuose spektrofotometriniu metodu ... 32
3.3 Biologiškai aktyvių junginių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu ... 35
3.4 Fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymas obelų lapų ėminiuose ESC metodu ... 37
3.5Gautų rezultatų statistinis įvertinimas ... 43
IŠVADOS ... 45
SANTRAUKA
Raktiniai ţodţiai: obelų lapai, fenoliniai junginiai, antioksidantinis aktyvumas
Fenoliniai junginiai yra vieni iš daugelio obelų lapuose sutinkamų junginių. Daţniausiai sutinkami fenoliniai junginiai yra flavonoidai (floridzinas, epikatechinas, katechinas ir kiti) ir fenolinės rūgštys (kavos rūgštis, chlorogeno rūgštis). Fenoliniai junginiai apsaugoaugalus nuo oksidacinės paţaidos ir kitų nepalankių aplinkos sąlygų. Medicinoje vienas iš svarbiausių flavonoidų pritaikymo būdas, paremtas jų antioksidantiniu poveikiu. Jie vartojami maţinant oksidacinį stresą. Kiti naudingi poveikiai: antiuţdegiminis, antivėţinis, antimikrobinis bei teigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai.
Tyrimo tikslas: Lietuvoje auginamų skirtingų veislių obelų lapuose nustatyti bendrą
fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius bei jų antioksidantinį aktyvumą spektrofotometriniu ir ESC metodais.
Metodai:liofilizuoti obelų lapai ekstrahuoti ultragarso vonelėje. Ekstrahentas- 70proc.
etanolis, ekstrakcijos laikas – 40min, ekstrakcijos temperatūra – 60˚C. Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, o rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu (mg/g). Nustatant bendrą flavonoidų kiekį ekstraktuose buvo taikyta reakcija su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu (mg/g).Spektrofotometriniai
metodai (DPPH ir FRAP) naudoti nustatant ekstraktų antioksidantinį aktyvumą, kuris išreikštas trolokso ekvivalentu (TEAC μmol/g). ESC metodas taikytas identifikuoti fenolinius junginius ir nustatyti jų kiekį.
Rezultatai: bendras fenolinių junginių kiekis obelų lapų ekstraktuose svyravo nuo 98,77
mg/g GAE „Auksis“ iki 114,86 mg/g GAE „Lodel“ veislėse. Bendras flavonoidų kiekis svyravo nuo 31,91 mg/g „Ligol" iki 39,6 mg/g in „Lodel“ veislėse. TEAC reikšmės nustatytos DPPH metodu svyravo nuo 142,83 μmol/g „Ligol“ iki 147,94 μmol/g „Lodel“ veislėse. TEAC reikšmės gautos FRAP metodu svyravo nuo 365,45 μmol/g „Ligol“ iki 445,64 μmol/g „Aldas“ veislėse. Didţiausias kiekis kvercetino glikozidų (28,601 mg/g absoliučiai sausos masės) buvo nustatyta „Aldas“ veislėje, maţiausias kiekis (16,954 mg/g) „Ligol“ veislėje. Bendras chlorogeno rūgšties kiekis svyravo nuo0,48mg/g „Aldas“iki1,383mg/g „Auksis“ veislėse. Bendras floridzino kiekis svyravo nuo106,006
mg/g „Aldas“ veislėjeiki114,425 mg/g „Ligol“veislėje. Bendras katechinų kiekis svyravo nuo 0,567 mg/g „Lodel“ veislėje iki0,851 mg/g „Ligol“ veislėje.
SUMMARY
Title:Phenolics qualitative and quantitative composition and antioxidantactivity
identification in apple tree (Malus domestica L.) leaves
Keywords:apple leaves, phenolic compounds, antioxidant activity
Phenolic compounds are commonly found in apple leaves as secondary plant metabolites. Most common phenolic compounds are flavonoids (phloridzin, epicatechin, catechin and others) and phenolic acids (caffeic acid, chlorogenic acid). For plants phenolics act as antioxidants, protective agents against harsh conditions. For human use phenolics are used as natural antioxidants due to their ability to scavenge free radicals, inhibit their formation processes and induce response to oxidative stress. Other beneficial effects are antimicrobial, anti-cancerogenic, anti-inflammatory and cardiovascular protective effect.
The aim of this research was to evaluate total content of phenolic compounds, total
content of flavonoid compounds and antioxidant activity of different apple cultivars (Ligol, Aldas, Lodel, Auksis) using spectrophotometry and HPLC.
Methods: Apple leaf samples were lyophilised and extracted using ultrasonic sound
assisted extraction. 70% ethanol was used as extractant, extraction time was 40 min and temperature – 60˚C. To determine total content of phenolic compounds expressed as gallic acid equivalent (mg/g) for absolutely dried lyophilisate in apple leaf extracts spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used. To identify total content of flavonoids expressed as rutin equivalent (mg/g) for absolutely dried lyophilisate more specific reaction with AlCl3 was used. Two spectrophotometric methods FRAP and
DPPH were used to determine total antioxidant activity expressed as trolox equivalent (TEAC μmol/g) of ethanolic extracts. HPLC was used to identify phenolics and their quantity.
Results: total content of phenolics in apple leaf ethanolic extracts varied from 98,77
mg/g GAE in ‘Auksis’ cultivar to 114,86 mg/g GAE in ‘Lodel’ cultivar. Total content of flavonoids in apple leaf ethanolic extracts varied from 31,91 mg/g in ‘Ligol’ cultivar to 39,6 mg/g in ‘Lodel’ cultivar. TEAC values obtained using DPPH method varied from 142,83 μmol/g in ‘Ligol’ cultivar to 147,94 μmol/g ‘Lodel’ cultivar. TEAC values obtained using FRAP method varied from 365,45 μmol/g in ‘Ligol’ cultivar to 445,64 μmol/g in ‘Aldas’ cultivar. Highest total amount of quercetin glycosides (28601,7μg/g of absolute dry weight) was found in ‘Aldas’ cultivar, lowest amount (16954,4 μg/g) was found in ‘Ligol’ cultivar. Total amount of chlorogenic acid varied from 480,1 μg/g in ‘Aldas’ to 1383,5 μg/g in ‘Auksis’. Total amount of phloridzin varied from 106006,4 μg/g in
‚Aldas‘ to 114425,4 μg/g in ‚Ligol‘ cultivar. Total amount of catechins varied from 567,0 μg/g in ‚Lodel‘ cultivar to 851,4 μg/g in ‚Ligol‘ cultivar.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis);
AMD–geltonosios dėmės degeneracija (angl.age-related macular degeneration)
CuPRAC – vario jonų redukcijos antioksidacinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant
capacity);
DNR – deoksiribonukleorūgštis;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas; ESC–efektyvioji skysčių chromatografija
ET – elektrono pernešimas (angl. Electron transfer)
FRAP – geleţies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power); GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent)
HAT – vandenilio atomo pernešimas (angl. Hydrogen atom transfer)
ORAC –deguonies radikalų absorbcinė geba (angl. oxygen radical absorbance capacity) RNS – reaktyvios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species)
ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species) SOD – superoksido dismutazė
TEAC – trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity); TPTZ–2,4,6-tripiridil-s-triazinasTRAP
ĮVADAS
Augalų cheminės įvairovės tyrimai išlieka aktualūs. Jie vykdomi, norint į medicininę praktiką įdiegti naujas vaistines augalines ţaliavas, ištirti maistui naudojamų vaisių, uogų cheminę sudėtį. Svarbu tirti biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus augalų vegetatyviniuose organuose ir surasti medicinos praktikai svarbius biologiškai aktyvius junginius. Ypač perspektyvios paieškos augalinių ţaliavų, kaupiančių fenolinius junginius, kurie šiuo metu yra daugelio mokslinių tyrimų objektai.
Obelų (Malus L.) genties augalai priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai ir yra vieni plačiausiai auginamų vaismedţių. Obuoliai uţima svarbią vietą mitybos racione.Atlikta daugybė tyrimų, kuriais siekta nustatyti obuolių naudą ţmogui, vartojant juos kasdieniniame racione.Obelų lapai, kuriuose fenolinių junginių yra gerokai daugiau, yra maţai tyrinėjami, todėl svarbu atlikti ir kitų vegetatyvinių organų tyrimus. Lietuvoje auginamų obelų lapai nėra tyrinėti.
Obelų lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas yra reikšmingas, norint įvertinti biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus augalo vegetacijos metu.Tyrimai atlikti siekiant nustatyti kiekybinius fenolinių junginių skirtumus tarp skirtingų obelų lapų veislių. Mokslinėje literatūroje nėra rasta daug duomenų apie obelų lapų cheminę sudėtį, pagrindiniai fenoliniai junginiai yra dihidrochalkonai, katechinai, fenolinės rūgštys ir kvercetino glikozidai.
Obelų lapuose nustatyti fenoliniai junginiai pasiţymi antioksidantiniu poveikiu, geba surišti laisvuosius radikalus, slopina jų gamybą ir skatina antioksidantinių baltymų sintezę, todėl taip pat yra tikslinga įvertinti jų kiekį bei antioksidantinį aktyvumą skirtingais metodais. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas leidţia įvertinti ţaliavos potencialų panaudojimą, siekiant sumaţinti oksidacinį stresą, uţdegiminius procesus, vėţinius susirgimus bei apsaugant širdies ir kraujagyslių sistemą.
Šio tyrimo metu siekta ne tik įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingose obelų veislėse, tačiau ir tam tikrų grupių bei junginių kiekybinę sudėtį.Atlikus tyrimus, pagal nustatytą biologiškai aktyvių junginių kiekybinę sudėtį, galima įvertinti ţaliavos potencialų panaudojimą vaistinių ir kosmetinių preparatų ar maisto papildų, praturtintų obelų lapų ekstraktu, gamybai.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti ir įvertintiLietuvoje auginamų obelų veislių (Malus L.) lapuose
kaupiamų fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai:
1. Optimizuotifenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš obelų lapų ėminių.
2. Nustatyti ir įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimus obelų lapų bandinių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu.
3. Nustatyti obelų lapų ekstraktuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą ir jo įvairavimą DPPH ir FRAP metodais.
4. ESC metodu nustatyti fenolinių junginių kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą skirtingų veislių obelų lapų ėminių ekstraktuose.
5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių kiekio ir flavonoidų kiekio bei ryšius tarp antioksidantinio aktyvumo ir suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Malus L. genties apibūdinimas
Obelų (Malus L.) genties augalai priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai [6]. Įvairių autorių duomenimis ją sudaro 35-50 rūšių augalų [2,30]. Lietuvoje auginama naminė obelis (Malus
domestica Borkh), kurios yra išvesta daug veislių, ir savaime auga miškinė obelis (Malus sylvestris L.)
[6]. Šios genties augalai paplitę vidutinio klimato juostoje, Europoje, Azijoje ir Šiaurės Amerikoje[47].
1.2 Malus L. morfologiniai poţymiai
Obelis- daugiametis, vasarţalis 4-12m. aukščio krūmas arba medis. Šakelės daţniausiai rusvai rudos spalvos. Šaknys pirmiausia auga į šonus, vėliau leidţiasi ţemyn [6]. Pumpurai kiaušiniški, buki, prigludę, rausvai rudi. Ţiedai dvilyčiai, butonuose yra rausvi, o išsiskleidę balti ar baltai rausvi, susitelkę skėtiškose kekėse ir šluotelėse [2]. Taurėlapių ir vainiklapių po 5, kuokelių 18-50. Mezginė apatinė su 3-5 lizdais. Liemenėliai tarpusavyje suaugę. Ţydi ir vaisius nokina priklausomai nuo veislės, išskiriamos anksti, vidutiniškai anksti ir vėlai ţydinčios veislės. Labai maţai yra savidulkių veislių, dauguma obelų yra kryţmadulkės [30].
Vaisių, kaip ir kitų augalo dalių morfologiniai poţymiai labai priklauso nuo obels rūšies ir veislės. Vaisiai rutuliški, rutuliškai kiaušiniški ar kūgiški, prisegti ant 20mm ilgio vaiskočių, miškinės obels vaisiai 2-2,5cm skersmens, geltoni. Kultivuojamų veislių vaisiai pagal dydį skirstomi į smulkius (4,5-6cm), vidutinius (6-7cm), stambius (7-9cm) ir labai stambius (9 ir daugiau cm) [2]. Vaisių spalva priklauso nuo veislės bei tiesioginių saulės spindulių. Pagrindinė odelės spalva paprastai yra šviesesnė (ţalsva, gelsva ar auksinė) ir ji nepriklauso nuo saulės spindulių kiekio, o keičiasi nokstant vaisiui. Antrinė arba dengiamoji spalva priklauso nuo antocianinų, kurie susidaro veikiant tiesioginiams saulės spinduliams [4]. Pagal jų pasiskirstymą dengiamoji spalva gali dengti visą vaisių ar jo dalį ir gali būti įvairių spalvų bei atspalvių. Vaisiai sudaryti iš apyvaisio ir sėklų. Apyvaisis sudarytas iš trijų sluoksnių: išorinio (egzokarpio), minkštimo (mezokarpio) ir vidinio arba sėklalizdţio (endokarpio). Viršutinėje vaisiaus dalyje yra taurėlapių liekanos. Sėklos prisitvirtinusios plonais
plaušeliais prie sėklalizdţio, rudos, pilkšvai rudos ar bronzinės spalvos, ovališkos, buku pagrindu 5-8mm ilgio 3-5mm pločio, daţniausiai vienas šonas išgaubtas, o kitas dvibriaunis [4].
Lapai praţanginiai, paprasti, ištisiniai arba skiautėti su greit nukrentančiais prielapiais. Lapas sudarytas iš dviejų sluoksnių epidermio, tarp kurių yra mezofilio sluoksnis, kuris yra skirstomas į statinį ir purųjį. Viršutinį epidermį dengia storesnė kutikulė, nei apatinį [6]. Apatinėje epidermio pusėje yra ţiotelės. Epidermio plaukeliai yra vienaląsčiai, išaugantys iš vienos ląstelės. Jaunuose lapuose yra gausus kiekis plaukelių abiejose pusėse, o subrendusiuose lapuose plaukeliai aptinkami tik ant apatinio epidermio sluoksnio [30].
1.3 Obelų lapų cheminė sudėtis
Lapų sudėtis priklauso tiek nuo obels veislės, tiek nuo aplinkos sąlygų. Skirtinga cheminės sudėties įvairovė apsprendţia bendrą biologiškai aktyvių junginių poveikį. Vieni iš svarbiausių biologiškai aktyvių junginių yra fenoliniai junginiai. Fenolinių junginių bendras kiekis sausoje ţaliavoje svyruoja nuo 60 iki 130mg/g, išreikštų galo rūgšties ekvivalentu [44]. Didţiausias kiekis iš fenolinių junginių yra floridzino (60-139mg/100g). Didesni kiekiai nustatyti (-)-epikatechino (26-69mg/100g), katechino (30-80mg/100g), chlorogeno rūgšties (30-67mg/100g). Maţesni kiekiai yra 4-p-kumaro rūgšties (11-18mg/100g), kavos rūgšties (21-30mg/100g), ferulo rūgšties (7-24mg/100g), floretino (3-21mg/100g), kvercitrino (4-13mg/100g), rutino (3-11mg/100g). Kiti nustatyti fenoliniai junginiai: hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitino-3-O-ksilozidas, kvercetino-3-O-arabinopiranozidas, avikuliarinas, apigeninas, kemferolis, izoramnetinas, 3-hidroksifloridzinas, mirecetinas, procianidinai B2, B5 ir E-B5[12, 40, 44,45]. Be fenolinių junginių obuolių lapuose taip pat nustatyti triterpenai (ursolo ir oleaninė rūgštys), α- tokoferolis, eteriniai aliejai (eukaliptolis, fitolis ir α-farnesenas)[40], mikroelementai (manganas, cinkas, varis ir geleţis)[58], organinės rūgštys (piruvato, citrato, sukcinato, fumaro ir malato), amino rūgštys (asparto, alanino, serino, histidino ir kitos), krakmolas ir monosachridai (sorbitolis, fruktozė, galaktozė, maltozė, gliukozė ir kiti)[29]. Atliekami įvairūs tyrimai, siekiant įvertinti obelų lapų augalinės ţaliavos kokybinius parametrus ir biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus tam tikrose obelų veislėse skirtingu vegetacijos metu.
1.4 Flavonoidų reikšmė augalams
Flavonoidai padeda prisitaikyti prie nepalankių aplinkos sąlygų. Augalai nėra judrūs
organizmai, todėl turi nemaţai apsauginių mechanizmų nuo nepalankių aplinkos sąlygų. Flavonoidai turi svarbią reikšmę apsauginiuose mechanizmuose nuo šalčio. Pastebėta, jog sumaţėjus temperatūrai, flavonoidai yra pernešami į epidermio vakuoles ir ten kontroliuoja osmosinį slėgį, kuris neleidţia ląstelėms uţšalti ir taip padidina atsparumą ţemai temperatūrai [7]. Osmosinio slėgio reguliavimas taip pat yra svarbus apsaugant augalų organus nuo sausros, ypač tuos organus, kurie nėra padengti storu kutikulės sluoksniu. Reguliuojant osmosinį slėgį, svarbiausi yra flavonoidų glikozidai, nes jie yra geriau tirpūs vandenyje [57].Nustatyta, jog augalai, kuriuose yra didesnis kiekis antocianinų, yra atsparesni sausrai ir geriau sulaiko vandenį savyje. Flavonoidai sugeria UV-B (280-320nm) bangas ir apsaugo augalą nuo jų ţalingo poveikio, taip pat veikia kaip antioksidantai, suriša susidariusius laisvuosius radikalus ir slopina oksidacijos procesus taip apsaugo ląstelėse esančius lipidus ir kitas jautrias molekules [14].Flavonoidai – apsauginės ir signalinės cheminės medţiagos. Šios medţiagos skirstomos į dvi grupes: suformuotos iš anksto ir paskatintos stresinių situacijų. Paţeidus augalą mechaniškai, patekus infekcijos sukėlėjui ar iškilus kitai stresinei situacijai išsiskiria medţiagos vadinamos fitoaleksinais [23]. Kiti flavonoidai ląstelėse sintetinami nuolat. Flavonoidai dalyvauja sąveikoje tarp augalo ir mikroorganizmų. Daugelis augalų palaiko simbiotinius ryšius su azotą fiksuojančiomis bakterijomis, o flavonoidai veikia kaip signalinės molekulės bakterijoms ir grybams, skatina jų genų ekspresiją, inicijuoja azoto fiksaciją ir reikšmingai prisideda prie augalo augimo [57]. Veikia kaip aleochemikalai, išskirti į aplinką, stabdo kitų konkuruojančių augalų augimą [8]. Flavonoidai dalyvauja apsaugant augalus nuo patogeninių mikroorganizmų, stabdo patogenų baltymų formavimąsi, sudaro chelatus su metalais, kurie reikalingi patogeninių mikroorganizmų fermentams ir suformuoja struktūras, kurios sudaro fizinį barjerą, per kurį nepatenka patogenai į ląstelę [23]. Nustatyta, jog didţiausiu priešgrybeliniu poveikiu pasiţymi naringeninas, kemferolis, kvercetinas ir dihidrokvercetinas. Naringeninas taip pat stabdo bakterijų sporų dygimą. Flavonoidai taip pat apsaugo augalus nuo vabzdţių kenkėjų, veikia kaip toksinai [8].
Kitos flavonoidų funkcijos augaluose: skatina sėklų dygimą ir augimą [8], spalvą suteikiantys antocianai privilioja vabzdţius, paukščius ir kitus gyvūnus, kurie padeda augalui daugintis ir plisti[8].
1.5 Flavonoidų panaudojimas medicinos praktikoje
Antioksidantinis poveikis. Labiausiai ţinomas ir plačiausiai pritaikomas medicinoje yra
flavanoidų antioksidantinis poveikis. Flavonoidai skirtingais mechanizmais slopina oksidacinį stresą ląstelėse [23]. Patys dalyvauja tiesiogiai surišant laisvuosius radikalus, slopina jų formavimąsi ir skatina organizmo natūralius antioksidantinius procesus. Antioksidantinis poveikis pritaikomas oksidacinio streso sukeltoms ligoms gydyti [38].
Priešvėţinis poveikis. Šis poveikis yra glaudţiai susijęs su flavonoidų antioksidantiniu
poveikiu [23]. Nustatyta, jog su maistu vartojamas didesnis flavonoidų ir kitų fenolinių junginių kiekis turi įtaką įvairių vėţio formų prevencijai ir slopinimui. Iš įvairių augalų išskirti flavonoidai pasiţymi teigiamu poveikiu slopinant burnos, krūties, ţarnyno, prostatos, leukemijos vėţio ląstelių augimą [38]. Priešvėţiniu poveikiu pasiţymi kempferolis, kvercetinas, resveratrolis, katechinas, epikatechinas, antocianinai ir kiti. Priešvėţinis poveikis patvirtintas tiek in vitro, tiek in vivo tyrimais [61].
Poveikis patogeniniams mikroorganizmams. Flavonoidai pasiţymi grybelius,
bakterijas ir virusus naikinančiomis savybėmis. Pastebėta, jog flavonoidai padeda augalams apsisaugoti nuo patogeninių grybų, todėl vis daugiau atliekama tyrimų siekiant išsiaiškinti galimą jų panaudojimą kovojant su ţmogaus patogenais. Nustatyta, jog flavonoidai pasiţymi teigiamu poveikiu slopinant šių grybelių dauginimąsi:Candida albicans, Aspergillus flavus, Aspergillus tamarii,
Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum ir Penicillium italicum. Stipriausiu poveikiu
pasiţymi flavonoidai, esantys propolyje (ypač galanginas) [18]. Nustatytas teigiamas flavonoidų poveikis in vitro prieš ŢIV-1 virusą. Poveikis siejamas su skirtingų flavonoidų gebėjimu slopinti viruso dauginimąsi ir sumaţėjusiu gebėjimu prisijungti prie receptorių ir taip patekti į ląsteles. Flavonoidai taip pat pasiţymi teigiamu poveikiu slopinant ir kitų virusų dauginimąsi. Rutinas, katechinas, kvercetinas ir kiti veikia Herpes simplex, kvėpavimo sincitinio viruso, paragripo viruso, polioviruso ir kitų dauginimąsi [18]. Nuo seno ţinomas flavonoidų antibakterinis poveikis. Liaudies medicinoje vartojamos flavonoidais praturtintos augalinės ţaliavos. Tyrimais nustatyta, jog antibakteriniu aktyvumu pasiţymi apigeninas, galanginas, naringeninas, kvercitino, kempferolio dariniai, įvairūs flavonai, flavononai, chalkonai ir jų glikozidai. Nustatyta flavonoidų ir kitų antibakterinių medţiagų teigiama tarpusavio sąveika, kovojant su rezistenciškais patogenais. Flavonoidai labiau pasiţymi bakteriostatiniu poveikiu, nors yra nustatytas ir bakteriocidinis poveikis. Išskirti trys flavonoidų veikimo mechanizmai: nukleorūgščių sintezės slopinimas, plazminės membranos funkcijos slopinimas ir energijos apykaitos ciklo slopinimas. Nustatytas teigiamas poveikis slopinant šių bakterijų plitimą:
Flavonoidų panaudojimas akių ligų gydyme. Tyrimais nustatyta, jog flavonoidai gali
būti naudojami įvairių akių ligų gydyme: kataraktos, diabetinės retinopatijos, geltonosios dėmės degeracijos (AMD), glaukomos ir sausų akių sindromo [38]. Teigiamas poveikis šių ligų gydyme siejamas su antioksidantiniu poveikiu, gebėjimu padidinti kraujotaką akyse, šiuo poveikiu stipriausiai pasiţymi hesperetinas ir ginkmedţio ekstraktuose esantys flavonoidai, taip pat flavonoidai maţina kraujagyslių pralaidumą ir taip sumaţinamas skysčio kaupimasis. Kvercitrinas slopina fermentą aldozės reduktazę ir taip neleidţia pakisti osmosiniam slėgiui akyse, sergant cukriniu diabetu bei atitolina kataraktos formavimąsi [38].
Priešuţdegiminis poveikis. Flavonoidų priešuţdegiminis poveikis susijęs su jų
gebėjimu slopinti laisvųjų radikalų poveikį organizme, taip pat flavonoidai slopina azoto oksido sekreciją, kurią sukelia bakterijų endotoksinai ar citokinai. Sumaţėjęs azoto oksido kiekis maţina ląstelių oksidacinius suţeidimus [36]. Flavonoidai inhibuoja fermentų sistemas, kurios yra atsakingos uţ imuninio atsako perdavimą T, B, makrofagų ir kitose ląstelėse. Taip pat inhibuoja ciklooksigenazes ir lipooksigenazes, slopina arachidono rūgšties kiekį ir maţina uţdegimo mediatorių sintezę. Didţiausiu priešuţdegiminiu poveikiu pasiţymi kvercetinas, liuteolinas, galanginas ir morinas [36].
Kiti flavonoidų panaudojimo būdai medicinoje: pasiţymi kraujagysles stiprinančiu ir apsauginiu poveikiu (maţina trombų susidarymo riziką bei maţo tankio lipoproteinų kiekį)[36], tyrimais in vivo nustatyta, jog obelų lapų ekstraktai, kurių pagrindinis veiklusis komponentas yra floridzinas, pasiţymi antidiabetiniu poveikiu, nes slopina gliukozės pasisavinimą ir jos kiekį kraujyje [52].
1.6Vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakcijos proceso apibūdinimas ir ekstrahavimo
metodai
Ekstrahavimas- ištirpusios medţiagos (ekstraktyvo) išgavimas iš ţaliavos. Ekstrakcija gali būti vykdoma sistemose skystis-skystis ir kieta medţiaga-skystis. Pagrindinis ekstrakcijos principas- difuzija, kuomet susidaro skirtingos koncentracijos tarp ekstrahuojamos ţaliavos ląstelių vidaus ir išorės. Ekstrahavimo procesas pasibaigia tuomet, kai tirpalo koncentracija ląstelių viduje susilygina su koncentracija išorėje [1,25]. Išskiriamos trys ekstrakcijos proceso dalys: vidinė molekulinė difuzija iš ląstelės į ribinį sluoksnį, molekulinė difuzija ribiniame sluoksnyje irkonvekcinė difuzija ekstrahento sraute.
Faktoriai, įtakojantys ekstrakcijos procesą, skirstomi į ţaliavos kokybės ir veikiančius masės pernešimą ţaliavoje ir ekstrahente parametrus. Vienas ţaliavos kokybės parametrųyra ţaliavos
dalelių dydis: kuo jis maţesnis, tuo didesnis paviršiaus plotas, su kuriuo sąveikauja ekstrahentas ir tuo greitesnė difuzija. Kitas parametras - drėgmės kiekis: kuo jis didesnis, tuo maţiau veikliųjų medţiagų išekstrahuojama [1]. Faktoriai, įtakojantys masės pernešimą ţaliavos dalelių viduje ir ekstrahente: 1. Temperatūra- didinat ją, didėja difuzijos greitis, veikliųjų medţiagų tirpumas, tačiau maţėja
termolabilių medţiagų kiekis, nes jos suskyla aukštesnėje temperatūroje, išgaruoja eteriniai aliejai bei koaguliuoja baltymai. Ekstrahavimas vyksta greičiau, jei medţiaga prieš tai buvo uţšaldyta, nes ledo kristalai suardo audinių struktūrą ir ekstrahentas lengviau prasiskverbia į ląsteles [42].
2. Maišymas sudaro didesnį koncentracijų skirtumą tarp ląstelės vidaus ir išorės, taip pagreitinama molekulinė difuzija, taip pat greitinama konvekcinė difuzija ekstrahento sraute [42].
3. Ekstrahavimo laikas- kuo trumpesnis ekstrahavimo laikas, tuo greičiau vyksta difuzija, o ilgėjant ekstrahavimo laikui difuzijos greitis maţėja ir procesas tampa neekonomišku. Ilga fenolinių junginių ekstrakcijos trukmė didina jų oksidacijos tikimybę [42].
Prieš ekstrakciją augalinę ţaliavą reikia išdţiovinti, po to susmulkinti į miltelius. Vykdant flavonoidų ekstrakciją yra svarbus tirpiklio parinkimas, nuo kurio priklauso išekstrahuotų junginių kokybiniai ir kiekybiniai parametrai. Naudojant chloroformą ar dietileterį išekstrahuojama maţiau poliniai flavonoidai (izoflavonai, flavononai ar flavonoliai). Labiau poliniai flavonoidų glikozidai išekstrahuojami, naudojant alkoholius ir/ar jų mišinius su vandeniu [46,52].
Pagrindiniai ekstrakcijos metodai yra: maceracija, ekstrakcija soksleto aparate, ekstrakcija ultragarsu, ekstrakcija su mikrobangomis, superkritinių skysčių ekstrakcija, suslėgto karšto vandens ekstrakcija ir fermentinė ekstrakcija.
Maceracija. Tai seniausias tinktūrų ar ekstraktų iš vaistinės augalinės ţaliavos ruošimo
būdas. Tradicinė maceracija trunka 7 paras, augalinė ţaliava uţpilama ekstrahentu ir paliekama šaltai tamsioje vietoje, kartais supurtoma. Laiko prasme, tai ilgas ir neekonomiškas procesas, nes išekstrahuotų veikliųjų medţiagų kiekis būna maţesnis, todėl taikomi modifikuotos maceracijos ar naujesni metodai[25].
Ekstrakcija Soksleto aparate. 1879 m.sukurtas aparatas, kuris daugiau nei šimtmetį
buvo plačiai naudojamas. Jo privalumas yra tas, jog kaskart ţaliavą veikia švarus perdistiliuotas ekstrahentas ir veikliosios medţiagos kartu su ekstrahentu per sifoninį vamzdelį graţinamos į bendrą ekstrahento kiekį. Procesas yra paprastas, nereikia ekstrakto perfiltruoti, tačiau trunka ilgai ir sunaudojamas didelis ekstrahento kiekis, nėra ekologiškas [13]. Šiuolaikiniai Soksleto aparatai yra
automatizuoti, ţaliava yra veikiama ultragarsu ar mikrobangomis, todėl pagreitėja procesas, padidėja jo išeiga ir sunaudojamas maţesnis ekstrahento kiekis [11,25].
Ekstrakcija ultragarsu.Didelės energijos sąnaudos ir CO2 emisija skatina kurti naujus
ekologiškesnius ekstrakcijos metodus. Vienas tokių yra ekstrakcija ultragarso pagalba. Šio metodo privalumai, lyginant su tradiciniais maceracijos ar soksleto metodais, yra sumaţėjusi laiko trukmė, ekstrakcija vykdoma iki 60min., sunaudojamas maţesnis kiekis ekstrahento [16], atliekant ekstrakciją ultragarso vonelėje lengvai galima keisti parametrus (laiką, temperatūrą ir ultragarso stiprumą), didesnė ekstrakcijos išeiga dėl pagerėjusios energijos bei masės pernešimo, nes veikiant ţaliavą ultragarsu pakeičiamos jos fizinės ir cheminės savybės bei suskaidomos ląstelių sienelės [45]. Pigiausias ir paprasčiausias iš šiuolaikinių ekstrakcijos metodų, tačiau sunaudojamas ekstrahento kiekis yra didesnis nei taikant superkritinių skysčių ekstrakciją, taip pat reikalingas filtravimas [25].
Ekstrakcija mikrobangomis - procesas, kurio metu augalinė ţaliava veikiama
0,3-300mHz daţnio bangomis [37]. Mikrobangos prasiskverbia į ląsteles ir veikdamos polinius junginius, generuoja karštį. Keičiant bangos daţnį galima selektyviai paveikti norimų medţiagų išskyrimą. Drėgmė ţaliavoje yra būtinas faktorius sėkmingai ekstrakcijai, nes sausoje ţaliavoje nėra tiek polinių junginių [15]. Ekstrakcija trunka iki 30min, sunaudojamas maţas kiekis ekstrahento, tačiau pats ekstrahentas turi sugerti mikrobangų energiją, taip pat reikalinga filtracija bei sąlyginai brangi aparatūra [37]. Siekiant apsaugoti veikliąsias medţiagas nuo oksidacijos, naudojama suslėgto azoto dujos. Vakuumas pritaikomas kuomet ekstrahuojami termolabilūs junginiai, nes sumaţinamas tirpiklio virimo taškas. Kartu naudojant ultragarsą ţenkliai sumaţinama ekstrakcijos trukmė. Ekstrahuojant eterinius aliejus galima taikyti mikrobangų ekstrakciją be ekstrahento - taip padidinama išeiga[16,25].
Superkritinių skysčių ekstrakcija- ekstrahavimo procesas, kurio metu kaip ekstrahentas
yra naudojami superkritiniai skysčiai, kurie pasiţymi labai geromis tirpiklių savybėmis, geriau prasiskverbia į ląsteles ir greitina ekstrakcijos procesą [31]. Populiariausias ekstrahentas yra CO2, kuris
yra netoksiškas, nedegus, superkritinė būklė yra gana nesunkiai pasiekiama (31,1̊C, Pc72,8 atm).
Keičiant temperatūrą bei slėgį pasiekiamas didelis ekstrahento selektyvumas [11]. Išskirtos medţiagos lengvai atskiriamos nuo ekstrahento, maţinant slėgį ir temperatūrą. Pats procesas atliekamas ţemoje temperatūroje, todėl galima išskirti termolabilias medţiagas. Pagrindinis superkritinio CO2 trūkumas
yra tas, jog jis netinka poliniams junginiams ekstrahuoti. Siekiant padidinti polinių junginių ekstrakcijos išeigą prie superkritinio CO2 galima pridėti acetono, metanolio, etanolio, vandens ar kito
tirpiklio, taip pakeičiant jo savybes. Ekstrakcija trunka iki 60min, sunaudojamas itin maţas ekstrahento kiekis, tačiau pati aparatūra yra brangi [25].
Suslėgto karšto vandens ekstrakcija – ekstrakcijos procesas, kurio metu naudojamas
vanduo,kurio temperatūra yra virš virimo taško (100˚ C), tačiau maţesnė uţ kritinę temperatūrą (374˚ C). Išlaikyti tokios temperatūros vandenį skystoje būsenoje reikia iki 60atm slėgio [56]. Kambario temperatūroje ir atmosferos slėgyje vanduo yra stiprus polinis tirpiklis, jo dielektrinė konstanta ε=80, o prie 250˚ C ir 50atm slėgio ε=27. Normaliomis sąlygomis etanolio ε=24, o metanolio ε=33, tai rodo, jog subkritinis vanduo pasiţymi panašiomis tirpiklio savybėmis kaip etanolis ar metanolis, tačiau geriau prasiskverbia į augalinę ţaliavą, didina ekstrakcijos išeigą ir greitina proceso eigą [56]. Ekstrakcija trunka iki 20min, sunaudojamas nedidelis vandens kiekis, pats procesas yra ekologiškas, nereikia filtracijos, tačiau įranga yra brangi ir, vykdant ekstrakciją, aukštoje temperatūroje suyra termolabilios medţiagos[16].
Fermentinė ekstrakcija –procesas, kurio metu naudojami fermentai: celiulazė,
hemiceliulazė ir pektinazė.Šie fermentai skaido ląstelių sieneles, taip padidindami ekstraktyvų išskyrimą iš augalinės ţaliavos [49]. Norint tinkamai naudoti fermentinę ekstrakciją yra svarbu suprasti, kaip veikia skirtingi fermentai ir kaip jie veikia ekstrahuojamą ţaliavą, bei kokia yra to augalo ląstelės sienelės sudėtis. Fermentų pagalba ekstrakcijos procesaspagreitėja, sumaţinamas reikiamo ekstrahento kiekis. Šis metodas taip pat yra ekologiškas, perspektyvus ir gali būti pritaikomas tiek maisto, tiek farmacijos pramonėje [64].
Fenolinių junginių ekstrakcija iš augalinės ţaliavos priklauso nuo įvairių faktorių. Pačių fenolinių junginių įvairovė daro įtaką ekstrakcijos procesui ir jo salygų parinkimui. Fenoliniai junginiai gali būti laisvi, susijungę su įvairiais angliavandeniais, baltymais ar kitais augalų komponentais, todėl fenolinių junginių ekstraktai visada yra mišinys, sudarytas iš įvairių fenolinių ir nefenolinių junginių. Norint pašalinti tam tikras medţiagas galima taikyti kietafazę ekstraciją arba įvairius frakcionavimo metodus [42].Atlikus ekstrakciją, ir norint įvertinti augalinės ţaliavos kokybę, yra atliekamas ekstraktų filtravimas, gryninimas ir biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimai [25].
1.7 Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai
Fenolinių junginių nustatymas yra svarbus, norint nustatyti augalinių ţaliavų cheminę sudėtį, jos įvairavimą skirtinguose augalo organuose ir siekiant uţtikrinti augalinės ţaliavos kokybės parametrus. Fenolinių junginių kiekiai nustatomi spektrofotometriniu metodu, taikant efektyviąją
skysčių chromatografiją, rečiau naudojami dujų chromatografijos ar kapiliarinės elektroforezės metodai.
Spektrofotometriniai bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodai
Spektrofotometrinis metodas taikomas įvairios sudėties medţiagų analizei. Šis metodas pagrįstas elektromagnetinės spinduliuotės srauto absorbcija. Analizuojamos medţiagos daţniausiai būna tirpaluose, kurie gali būti spalvoti ir nespalvoti, todėl spektrofotometrinis metodas tinka augalinių ţaliavų ekstraktų analizei. Analizė atliekama ultravioletiniame ir regimąjame spektre uţrašant tiriamų medţiagų spektrus ir išmatavus jų absorbciją. Spektrofotometrinė analizė yra pakankamai tiksli [5]. Fenolinių junginių identifikavimas paremtas fenolinės grupės dalyvavimu oksidacijos- reakcijose, jei tos pačios reakcijos metu yra oksiduojama fenolinė grupė ir redukuojamas reagentas, tuomet galimas kiekybinis nustatymas, kuris atliekamas taikant UV spektrofotometriją [9]. Daţniausiai naudojami nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį yra Folin-Ciocalteau ir Berlyno mėlio reagentai ir reakcijos su jais [42]. Skirtingi oksidacijos-redukcijos potencialai ir cheminė struktūra skirtingų polifenolių gali iškraipyti matavimų rezultatus, todėl daţniausiai rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentu (GAE). Norint nustatyti konkrečias funkcines grupes, reikia taikyti specifiškesnius metodus[54].
Folin-Ciocalteau metodas paremtas fenolinių grupių reakcija su fosfomolibdato ir
fosfovolframo rūgščių kompleksu, kuris po reakcijos pereina iš gelsvos į mėlyną spalvą, reakcijos pusiausvyra pasiekiama per 30min [53]. Tirpalo absorbcija išmatuojama apytiksliai ties 760nm bangos ilgiu UV spektrofotometru. Šis metodas nėra selektyvus vien fenoliniams junginiams, todėl gaunami tik apytiksliai rezultatai, nes su šiuo regentu taip pat reaguoja baltymai ir kitos medţiagos, turinčios oksidacinių-redukcinių savybių [54]. Nepaisant šio trūkumo FC metodas yra plačiausiai naudojamas, nes yra ganėtinai tikslus ir lengvai atliekamas[44].
Berlyno mėlio metodas paremtas fenolinių junginių reakcija su kalioheksocianoferoatu ir
geleţies(III) chloridu (1pav.). Fenolinės grupės redukuoja heksocianoferoato geleţies joną iš Fe3+
į Fe2+, susidarant Berlyno mėliui, reakcijos pusiausvyra nusistovi per 20-30min [53]. Tirpalo absorbcija apskaičiuojama apytiksliai ties 720nm bangos ilgiu UV spektrofotometru. Šis metodas taip pat nėra visiškai selektyvus, nes augalinės ţaliavos ekstraktuose be fenolinių yra ir kitų funkcinių grupių, kurios turi oksidacinių-redukcinių savybių[54].
1pav. Reakcija tarp kalioheksocianoferoato ir fenolinių junginių.
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniais ir efektyviosios skysčių chromatografijosmetodais
Nustatant bendrą flavonoidų kiekį augalinės ţaliavos bandiniuose taikomi įvairūs metodai, tarp kurių yra plačiai naudojama UV spektrometrija ir ESC. Pagrindiniai spektrofotometriniai kiekybinės analizės metodai yra reakcija su AlCl3 ir reakcija su 2,4-dihidrofenilhidrazinu.Nustatymas
pagrįstas tais pačiais principais kaip ir atliekant bendrą fenolinių junginių kiekio nustatymą [17]. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodai paremti skirtinga biologiškai aktyvių junginių sulaikymo trukme. Šie metodas leidţia nustatyti ne tik bendrą flavonoidų kiekį, tačiau ir atskirų junginių ar grupių kiekį ekstraktuose iš augalinės ţaliavos.
Reakcija su AlCl3. Yra daug šios reakcijos modifikacijų, pagrindinis principas yra tas, jog rūgščioje aplinkoje AlCl3 suformuoja stabilius kompleksus su C-4 keto grupe ir su C-3 ar C-5
hidroksilo grupe flavonuose ir flavonoliuose [37]po 30min. ir absorbcija matuojama 395-415nm bangų intervale. Išreiškiama pagal rutino, kvercetrino ar apigenino ekvivalentą[17].
Reakcija su 2,4-dihidrofenilhidrazinu yra specifinė reakcija flavononams, kuomet
reagentas sureaguoja su ketonine ar aldehidine grupe ir susiformuoja 2,4-dinitrofenilhidrazonas. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje 50○C temperatūroje 50min. Atvėsus tirpalui, absorbcija matuojama 495nm bangos ilgyje[17].
Efektyvioji skysčių chromatografija- tiksliausias ir daţniausiai naudojamas metodas
tiek kiekybiniam, tiek kokybiniam flavonoidų nustatymui. Daţniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C18 kolonėles. Flavonoidų glikozidai pasiţymi trumpesne sulaikymo trukme ir greičiau pašalinami iš kolonėlės nei aglikonai. C-glikozidai pasišalina greičiau nei O-glikozidai. Gradiento sudarymui naudojami acetonitrilo-vandens ir metanolio-vandens mišiniai. Jonizacijai nuslopinti pridedama rūgščių, kurios duoda tikslesnius rezultatus ir smailes, pagal kurių plotus apskaičiuojami flavonoidų kiekiai. Normalių fazių chromatografija taikoma retai ir tik silpnai poliniams aglikonams atskirti, tačiau tokiu atveju negalima sudaryti tirpiklio gradiento [9].
1.8 Antioksidantai. Antioksidantinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai
Antioksidantai- medţiagos, kurios gali stabdyti oksidacinius procesus ar apsaugoti nuo oksidacijos oksidacijai jautrias medţiagas. Antioksidantaisuriša laisvuosius radikalus, neleidţia jiems susiformuoti ir skatina organizmo apsauginius mechanizmus prieš laisvuosius radikalus, taip sumaţina oksidacinį stresą ląstelėse [19]. Oksidacinis stresas yra disbalansas ląstelėje, kurio metu reaktyvių deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formų atsiranda daugiau, nei vidinių ląstelės antioksidantų. Dėl nuolatinio oksidacinio streso ląstelėje pradedamos oksiduoti įvairios medţiagos (lipidai, baltymai ar DNR). Oksidacinis stresas daro įtaką senėjimo procesuose, širdies ir kraujagyslių ligų bei vėţio atsidradimui ir vystymuisi [27,33]. Tyrimuose in vitro fenoliniai junginiai savo antioksidantiniu poveikiu pasirodė efektyvesni nei vit.C, E ar karotenoidai [19]. Fenoliniai junginiai (F-OH) suriša reaktyvias ROS ir RNS formas, inhibuoja enzimus ir sudaro chelatus su metalais, kurie skatina reaktyvių formų susidarymą. F-OH+ R· → RH+ F-O· fenoliniai junginiai lengvai atiduoda vandenilį laisviesiems radikalams ir sudaro stabilesnius fenolinius radikalus, kurie daug lėčiau dalyvauja grandininėse reakcijose. Taip pat fenoksi radikalai dalyvauja terminacinėse reakcijose. F-O·+R·→F-OR [19]. Flavonoidų struktūroje svarbiausi faktoriai, lemiantys antioksidantinį aktyvumą yra:orto-dihiroksi struktūra B ţiede, kuri pasiţymi geriausiomis elektrono donorinėmis savybėmis ir didina radikalo stabilumą, 2-3 dviguba jungtis C ţiede su 4-okso funkcine grupe dalyvauja elektronų delokalizacijoje iš C ţiedo, 3- ir 5-hidroksi grupės A ţiede yra atsakingos uţ maksimalų radikalų surišimą. 3- glikozilinti flavonoidai yra maţiau aktyvūs antioksidantiniame procese, nei aglikonai[27].
Fenoliniai junginiai su dviguba hidroksi grupe gali sudaryti konjugatus su metalų jonais (Cu+ ir Fe2+), kurie jungdamiesi su vandenilio peroksidu suformuoja hidroksilo radikalus (2pav.).
H2O2 + Cu+/Fe2+ → Cu2+/Fe3+ + OH + OH·
2pav. Konjugatų susidarymas tarp fenolinių junginių ir metalų jonų
Dėl dviejų skirtingų veikimo mechanizmų ţenkliai sumaţėja lipidų, baltymų ar kitų molekulių oksidacija ląstelėse. Svarbu paminėti, jog didesnis sinergistinis efektas pasiekiamas, kai naudojamas dviejų antioksidantų mišinys iš kurių vienas yra fenolinis, o kitas - ne[19].
Prooksidantinis aktyvumas. Verta paminėti, jog tam tikromis sąlygomis fenoliniai
junginiai ir jų radikalai gali elgtis kaip prooksidantai ir patys sukelti ROS ar RNS susidarymą F-O· + O2→ F=O + O2·
Metalų jonai taip pat gali paskatinti fenolinių junginių oksidaciją ir laisvųjų radikalų susidarymą. Cu2+/Fe3+ + F-OH → Cu+/Fe2+ +F-O· +H+
F-O· + R-H → F-OH + R· R· + O2 → ROO·
ROO· + RH → ROOH + R·
ROOH + Cu+/Fe2+ → Cu2+/Fe3+ + RO· + OH-
Esant aukštai pH, didelei metalų jonų ir deguonies koncentracijai, gali vykti fenolinių junginių autooksidacija. Prooksidantiniu poveikiu labiau linkę pasiţymėti yra maţos molekulinės masės fenoliai (galo rūgštis, kvercetinas), nei didesnės molekulinės masės junginiai (taninai)[19,27].
Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai yra skirstomi į dvi dideles grupes:
vandenilio atomo pernešimo (HAT) ir elektrono pernešimo (ET) [11]. HAT metodai paremti tiesioginiu vandenilio atomo pernešimu ir reaktyvaus radikalo slopinimu. A-H+ R· → A· +R-H. HAT reakcijos yra nepriklausomos nuo tirpiklio ir aplinkos pH, trunka nuo kelių sekundţių iki kelių minučių [30]. ET paremti metodai nustato antioksidanto galimybę pernešti vieną elektroną ir redukuoti metalus ar laisvus radikalus. ET reakcijos yra priklausomos nuo pH, lėtos ir ilgai trunka, todėl matuojamas procentinis produkto pokytis, o ne reakcijos kinetika, kaip HAT atveju [48].
Metodai paremti vandenilio atomo pernešimo reakcijomis
ORAC (oxygen radical absorbance capacity) metodu išmatuojamas antioksidanto
gebėjimas slopinti oksidacijos procesus, kuriuos sukėlė peroksilo radikalas [55]. Peroksilo radikalas reaguoja su fluorescuojančia medţiaga, kurią oksiduoja ir ji virsta nefluorescuojančia. Fluorescencija išmatuojama, nustatomas kiekybinis medţiagos pokytis ir reakcijos greitis bei įvertinama antioksidanto galia ir išreiškiama trolokso ekvivalentu [33]. ORAC metodas leidţia įvertinti tiek lipofilinius, tiek hidrofilinius antioksidantus [19]. Metodas automatizuotas, tačiau analizė pakankamai ilga (apie 1val.), fluorescenciniai markeriai yra jautrūs ir jiems nustatyti reikalinga speciali įranga[48].
TRAP (total radical-trapping antioxidant parameter) metodo veikimo mechanizmas yra
toks pat kaip ORAC, matuojamas antioksidantų gebėjimas stabdyti reakciją tarp peroksilo redikalo ir oksiduojamos medţiagos [33]. Oksiduojamos medţiagos pokytis gali būti nustatomas fluorescencijos arba spektrofotometrijos būdu. Vienas iš didţiausių ORAC metodo privalumų yra tai, jog šis metodas yra selektyvus visiem antioksidantams, kurie stabdo radikalų grandinės augimą. Daţniausiai naudojamas matuoti kraujo plazmos antioksidantams, metodas yra sudėtingas ir ilgai trunkantis[48].
β-karoteno ir krocino blukimo metodas paremtas tuo, jog karotenoidai šviesos, karščio ar peroksilo radikalo poveikyje oksiduojasi ir keičia spalvą [33]. Antioksidantai perduodami vandenilio joną stabdo blukimą, kurį galima išmauoti spektrofotometru ties 470nm bangos ilgiu karotenoidų atveju ir ties 443nm bangos ilgiu krocino atveju. Karotenoidai daug jautresni oksidacijai ir gali išblukti greičiau, o krocinas yra oksiduojamas tik radikalų, todėl yra pirmo pasirinkimo reagentas. Metodas yra nesudėtingas, lengvai pritaikomas, tačiau reikia kontroliuoti temperatūrą, be to krocinas yra sunkiai išgaunamas [48].
Metodai paremti elektrono pernešimo reakcijomis
FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) metodas pirmiausiai buvo panaudotas
kraujo plazmos antioksidantinio aktyvumo tyrimas, vėliau pritaikytas ir antioksidantams iš augalų tirti. Reakcijos metu išmatuojama Fe-TPTZ redukcija iš trivalentės formos į dvivalentę iki spalvoto produkto (3pav.) [54]. Reakcijai būtina 3,6 pH terpė, kad būtų išlaikomas geleţies tirpumas.Absorbcija matuojama prie 593nm bangos ilgio [33]. FRAP metodas netinka visiems antioksidantams tirti, nes juo negalima nustatyti, kuomet vyksta vandenilio jono pernešimas, ypač aktualu tiriant tiolius ar baltymus, tačiau lyginant su kitais metodais, skirtais bendram antioksidantiniam aktyvumui nustatyti, yra greitas, lengvai atliekamas ir nereikalauja ypatingos įrangos[48].
3pav. Geležies-TPTZ komplekso redukcija iš trivalentės formos į dvivalentę.
CUPRAC (Copper Reduction Assay) metodas paremtas vario-kurpoino redukcija iš
dvivalentės formos į vienvalentę, absorbcija matuojamas ties 490nm bangos ilgiu [33]. Reakcijai nereikia rūgštinės pH. Laisvas ir komplekso sudėtyje varis turi maţesnį redokso potencialą, nei geleţis, todėl metodas yra selektyvesnis polifenoliniams junginiams, šiuo metodu galima tirti didesnį kiekį
antioksidantų, reakcijos laikas trunka nuo 4 iki 60 min. ir labai priklauso nuo pasirinkto antioksidanto, todėl, tiriant antioksidantų mišinį, yra sudėtinga parinkti tinkamą reakcijos laiką [48].
Metodai paremti vandenilio atomo ir elektrono pernešimo reakcijų mechanizmais
TEAC arba ABTS (2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) yra ABTS·+
radikalo surišimo metodas. Pirmiausiai stabilus ABTS paverčiamas į mėlynai ţalią ABTS·+ radikalą,
kuris reakcijos su antioksidantais metu paverčiamas į bespalvį ABTS junginį [12,55]. Yra daug šio metodo modifikacijų, absorbcijos pokytis po reakcijos matuojamas spektrofotometru ties 415 ar 734nm bangos ilgiais. Matavimai atliekami fiksuotais laiko momentais. Metodas tinkamas hidrofiliniam ir lipofiliniam antioksidantam tirti, yra paprastas, platus tinkamo pH spektras [33,48]. Rezultatai gauti fiksuotu laiko momentu nevisada atspindi pasibaigusią reakciją, nes ji trunka ilgai, todėl gali būti maţesni lyginant su kitais tyrimo metodais.
DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) yra stabilaus DPPH· radikalo surišimo metodas.
DPPH· skirtingai nei ABTS·+ nereikia paruošti prieš tyrimą. Reaguojant radikalui su antioksidantu jis
iš violetinės spalvos pereina į bespalvę, tirpalo absorbcijos pokytis išmatuojamas ties 515nm bangos ilgiu [12,55]. DPPH yra paprastas, greitas metodas, nereikia sudėtingos aparatūros. Netinkamas nustatinėti karotinoidams, nes ties 515nm persidengia spektrai [51].
Antioksidantinio aktyvumo nustatymas leidţia įvertinti antioksidantais praturtintos augalinės ţaliavos kokybės parametrus. Antioksidantinio aktyvumo tyrimais atliekama visų augalinės ţaliavos ekstrakte esančių biologiškai aktyvių junginių analizė. Siekiant nustatyti tam tikrų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą reikia atlikti ekstraktų frakcionavimą.
Apibendrinant mokslinėje literatūroje surastą informaciją galima teigti, jog obelų lapuose esantys biologiškai aktyvūs junginiai pasiţymi stipriu antioksidantiniu poveikiu ir gali būti pritaikomi medicinos praktikoje. Floridzinas yra dominuojantis flavonoidas obelų lapuose. Jis ne tik maţina ROS kiekį ląstelėse, tačiau taip pat didina SOD geno ekspresiją ir SOD baltymo aktyvumą, kurie yra atsakingi uţ laisvųjų radikalų surišimą ląstelėse [62]. Gliukozės kiekio maţinimas taip pat yra potencialiai svarbus floridzino efektas [35,38], todėl obelų lapų ekstraktai, kuriuose didţiausią kiekį flavonoidų sudaro floridzinas gali būti potencialiai naudojami kaip šio junginio šaltinis. Siekiant įvertinti augalinės ţaliavos kokybę yra atliekama ekstrakcija ir gautų ekstraktų analizė instrumentiniais metodais.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tirti liofilizuoti obelų lapų ėminiai sudaryti iš 4 obelų veislių („Aldas“, „Auksis“, „Ligol“ ir „Lodel“). Obelys auginamos Lietuvoje, Kauno r., Babtuose, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centro filiale Sodininkystės ir darţininkystės institute. Tyrimui imti 2012m. sezono lapai iš skirtingų obels lajos vietų, visi lapai buvo surinkti rugsėjo mėnesį.
2.2 Naudoti reagentai
Visi naudoti tirpikliai, standartai ir reagentai yra analitinio švarumo. Acetonitrilas ir acto rūgštis gauti iš Sigma-Aldrich GmbH (Buchs, Šveicarija), etanolis gautas iš AB Stumbras (Kaunas, Lietuva). Hiperozido, rutino, kvercitrino, floridzino, floretino, kavos rūgšties ir chlorogeno rūgšties standartai gauti iš Extrasynthese (Genay, Prancūzija), (+)-katechino ir (–)-epikatechino standartai iš Fluka (Buchs, Šveicarija), avikuliarino ir izokvercitrino standartai iš Chromadex (Santa Ana, JAV). Galo rūgšties monohidratas ir Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas gauti iš Sigma-Aldrich (St. Luis JAV), aliuminio chlorido heksahidratas iš Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija), natrio karbonatas, DPPH ir TPTZ iš Carl Roth (Karlsruhe, Vokietija), heksametiltetraminas gautas iš Lachema (Neratovice, Čekija), geleţies (III) chlorido heksahidratas gautas iš Vaseline-Fabrik Rhenania (Bonn, Vokietija).
2.3 Naudota aparatūra
Obelų lapai liofilizuoti liofilizatoriumi ZIRBUS sublimator 3x4x5/20 (Vokietija), liofilizuoti lapai sumalti, naudojant elektrinį malūną Retsch 200 (Vokietija). Ţaliavos ekstrakcija bei optimalių sąlygų parinkimas atliktas ultragarso vonelėje Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija). Ekstraktų centrifugavimas atliktas su Hermle Z206A centrifuga (JAV). Spektrofotometrinė etanolinių ekstraktų analizė atlikta, naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70“ (JAV). ESC analizei naudota sistema „Waters 2695“ su PDA detektoriumi (JAV). Chromatografiniam skirstymui naudota kolonėlė
YMC-Pack ODS-A (5 µm, C18,250×4.6 mm) su prieškolonėle YMC-Triart (5 µm, C18, 10×3.0 mm)
(Vokietija).
2.4 Tyrimų metodai
Obelų lapų ekstraktų paruošimas. Liofilizuoti obelų lapai susmulkinami į miltelius,
atsveriama 0,25g (tiksli masė) liofilizato, uţpilama 10 ml 70% (v/v) etanoliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 40min 60°C temperatūroje.Ultragarso stipris – 480 W, daţnis – 35000 Hz. Ekstrakcijos parametrai – ekstrakcijos būdas, laikas, temperatūra, ultragarso stipris, ekstrahentas ir jo koncentracija pasirinkti, atsiţvelgiant į ekstrakcijos optimizavimo rezultatus. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 7 min 6000 rpm. Surinktas centrifugatas prieš analizę ESC metodu filtruojamas per 0,22μm dydţio porų membraninį filtrą. Visi rezultatai pateikti absoliučiai sausos ţaliavos masei.
Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymasspektrofotometriniu metodu. Bendras
fenolinių junginių kiekis nustatomas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. 0,2ml gauto ekstrakto praskiedţiama su 5 ml 96% (v/v) etanoliu ir sumaišoma. Praskiestas ekstraktas paveikiamas 5ml 10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir 4ml 5 proc. natrio karbonato tirpalais. Reakcijos mišinys paliekamas 60 min. tamsoje, jog nusistovėtų reakcijos pusiausvyra. Po 60 min išmatuojama absorbcija spektrofotometru (765 nm bangos ilgyje) ir lyginama su tuščiu mėginiu, kuris ruošiamas taip pat kaip tiriamasis, tik vietoj 0,2 ml ekstrakto naudojamas etanolis 96 proc. (v/v). Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/g) pagal kalibracijos kreivę.
y=0.12x+0.0173 R2=0,9988
Galo rūgšties koncentracijų intervalas yra 0-8 mg/ml
Bendro flavonoidų kiekio nustatymasspektrofotometriniu metodu. Bendras
flavonoidų kiekis nustatomas, taikant reakciją su aliuminio chloridu. 0,2 ml ekstrakto praskiedţiama su 2ml 96% (v/v) etanolio, įpilama 0,1ml 30% acto rūgšties, 0,3ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml išgryninto vandens ir 0,4ml 5% heksametilentetramino tirpalo. Reakcijos mišinys laikomas 30 min., absorbcija matuojama spektrofotometru ties 407nm bangos ilgiu ir lyginami gauti rezultatai su tuščiu mėginiu. Tuščias mėginys ruošiamas: 0,2ml ekstrakto praskiedţiama 2ml 96proc. (v/v) etanoliu, įpilama 0,1ml 30% acto rūgšties ir praskiedţiama 2,7ml išgryninto vandens. Bendras flavonoidų kiekis nustatomas pagal rutino kalibracijos kreivę ir išreiškiamas mg/g.
y=1,0269x +0,004 R2=0,999
Rutino koncentracijų intervalas yra 0-0,85 mg/ml
Spektrofotometrinis laisvojo DPPH radikalo surišimo metodas. 10μl ekstrakto
sumaišoma su 3ml standartizuotu (ABS=0,8077) DPPH tirpalu 96,3 proc. etanolyje, laikoma 30min. tamsoje, kol nusistovės reakcijos pusiausvyra. Absorbcijos sumaţėjimas matuojamas spektrofotometru (bangos ilgis 517 nm). Antioksidantinis aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracijos kreivę ir išreiškiamas TEAC (μmol/g).
y=0,0002x +0,003 R2=0,9994
Trolokso koncentracijų intervalas yra 0-6000μM
Spektrofotometrinis FRAP metodas. FRAP reagentas ruošiamas prieš pat darbą iš
natrio acetato buferinio tirpalo (pH=3,6), TPTZ tirpalo vandenilio chlorido rūgštyje ir geleţies chlorido heksahidrato, maišant juos santykiu 10:1:1. Kvarco kiuvetėje sumaišoma 10μl tiriamojo ekstrakto su 3ml FRAP reagento tirpalu. Absorbcijos didėjimas išmatuojamas spektrofotometru ties 593nm bangos ilgiu praėjus 90 minutėms po sumaišymo. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas TEAC (μmol/g) pagal trolokso kalibracijos kreivę:
Y=0,001x +0,0086 R2=0,9996
Trolokso koncentracijų intervalas 0-8000 μM
Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Hiperozido, izokvercitrino, rutino, avikuliarino, kvercitrino, (+)-katechino,
(–)-epicatechino, floridzino, floretino, kavos rūgšties ir chlorogeno rūgščių standartai buvo ištirpinti etanolyje (96.3 proc. v/v). Kalibracijų kreivės sudarytos kiekvienam standartui iš penkių taškų: pradinės koncentracijos bei standartų praskiestų du, keturis, aštuonis ir šešiolika kartų. ESC analizei buvo naudojamas Waters 2695 chromatografas su Waters 2998 PDA detektoriumi (Waters, Milford, USA). ESC proceso stebėjimas, chromatogramų ir duomenų rinkimas atliktas naudojantis kompiuterine programa Empower® v.2.0. (Waters, Milford, JAV). Kolonėlės temperatūra 25°C, injekuotas tiriamojo ekstrakto tūris 10 µL, o eliuento tėkmės greitis 1 mL/min. Taikytas gradientinis eliuavimas, gradientas pateikiamas 1 lentelėje. Mobili faze sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo (tirpiklis A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo (tirpiklis B). Fenolinių junginių identifikavimas atliktas trijuose bangų ilgiuose: 280 nm (dihidrochalkonams ir katechinams), 320 nm (fenolinėms rūgštims), ir 360 nm (flavonoliams). Visas spektras uţrašytas bangų intervale nuo 200 iki
600 nm. Fenoliniai junginiai identifikuoti palyginant jų sulaikymo laikus ir spektrus su standartais. Fenolinių junginių koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal chromatografinių smailių plotus.
1 lentelė. Judrių fazių gradiento kitimas chromatografinio skirstymo metu Laikas, min Tirpiklis A, proc. (v/v) Tirpiklis B, proc. (v/v)
0-30 97-85 3-15
30-45 85-75 15-25
45-50 75-50 25-50
50-55 50-5 50-95
2.5 Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas programomis „MS Exel 2007“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS 20“ statistiniu paketu. Koreliacijos įvertintos pagal Pirsono koreliacijos koeficientą. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant dispersinę analizę (ANOVA). Atskirom grupėm įvertinti taikytas aposteriorinis Tukey kriterijus. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jei p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimasiš obelų lapų augalinės
ţaliavos
Siekiant uţtikrinti ekstrakcijos efektyvumą, svarbu parinkti tinkamą ekstrakcijos metodą ir ekstrahentą. Tikintis išgauti didţiausią kiekį fenolinių junginių iš augalinės ţaliavos, reikia parinkti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas. Tinkamiausios sąlygos priklauso nuo keleto faktorių: ekstrakcijos temperatūros, laiko ir kitų faktorių.
Ekstrahento ir jo koncentracijos parinkimas. Veikliųjų medţiagų ekstrakcijai iš
augalinės ţaliavos buvo pasirinkti trys tirpikliai: acetonas, etanolis ir metanolisbei jų mišiniai su vandeniu. Nustatytasbendrasflavonoidų kiekis su skirtingos koncentracijos tirpikliais. Acetono ir metanolio koncentracijaparinkta nuo 20 iki 100 proc. (v/v), o etanolio nuo 20 iki 96,3 proc. (v/v). Didţiausias bendras flavonoidų kiekis (16,99±1,06 mg/g) ekstrahuojant acetonu nustatytas naudojant 60 proc. (v/v) tirpalą (4 pav.). Ekstrahuojant etanoliu didţiausia išeiga (20,74±1,58 mg/g) gauta naudojant 70 proc. (v/v) tirpalą (5 pav). Ekstrakcijai naudojant metanolį didţiausias flavonoidų kiekis (18,68±1,87 mg/g) nustatytas naudojant 80 proc.(v/v) tirpalą (6 pav).
4 pav. Flavonoidų kiekioįvairavimas naudojant skirtingos koncentracijos acetoną (n=3)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fl avono id ų ki e ki s m g/g Acetono koncentracija
5 pav. Flavonoidų kiekioįvairavimas naudojant skirtingos koncentracijos etanolį (n=3)
6 pav. Flavonoidų kiekioįvairavimas naudojant skirtingos koncentracijos metanolį (n=3)
Tolimesniems tyrimams pasirinkta naudoti 70 proc. (v/v) etanolį, nes nustatytas didţiausias bendras flavonoidųkiekis. Etanolis yra prieinamiausias ir ekonomiškiausias ekstrahentas iš visų pasirinktų. Gauti rezultatai yraskirtingi nei anksčiau atliktų mokslininkų darbuose, kuriuose ekstrahuojant biologiškai aktyvius junginius iš obelų lapų buvo naudojamas 80poc. (v/v) parūgštintas metanolis [45].
Optimaliausio ekstrakcijos proceso ir laiko trukmės nustatymas. Ekstrakcijos
metodas pasirinktas įvertinus gautus rezultatus dviem skirtingais metodais: maceracija ir ekstrakcija ultragarso vonelėje (sonifikacija). Ekstrahentu naudotas 70 proc. (v/v) etanolis. Maceracijos metodu
0 5 10 15 20 25 20 30 40 50 60 70 80 96.3 Etanolio koncentracija F lav on oi d ų k iek is, m g/ g 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Metanolio koncentracija F lavon oaid ų ki e ki s, m g/g
atliekant ekstrakciją tiriamosios augalinės ţaliavos ėminys uţpiltas ekstrahentu ir laikytas tamsoje. Gauti rezultatai išmatuoti kas 5 valandas. Didţiausias(25,34±1,65 mg/g) kiekis flavonoidų nustatytas po 30 val., po toflavonoidų kiekis neţymiai maţėjo (7 pav.). Siekiant nustatyti tinkamiausią ekstrakcijos metodą, pasirinkta ekstrakcija vandens vonelėje ultragarso pagalba, nes šis metodasyra vienas ekonomiškiausių ir prieinamiausių. Ekstrakcijos efektyvumas įvertintas pagal skirtingos laiko trukmės rezultatus, gautus ekstrahuojant obelų lapų bandinius. Ekstrakcijos trukmė pasirinkta nuo 10 min. iki 90 min. didţiausia flavonoidų išeiga (28,66±1,32 mg/g) nustatyta ekstrahuojant 40 min.. Ilginant ekstrakcijos trukmę, nustatytas bendras flavonoidų kiekis maţėjo (8 pav.).
7 pav. Flavonoidų kiekioįvairavimas maceruojant skirtingais laiko intervalais (n=3)
8 pav. Flavonoidų kiekioįvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje skirtingais laiko intervalais (n=3) 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Ekstrakcijos trukmė, min.
Fl av o n o id ų ki eki s, mg /g
Ekstrakcijos trukmė, val. Flavonoidų kiekis, mg/g
Ekstrakcija ultragarso vonelėje yra efektyvesnė, nes. naudojant tą patį ekstrahentą,išekstrahuota daugiau biologiškai aktyvių medţiagų per trumpesnį laiką, todėl tolimesniuose bandymuose buvo naudota ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija), kurios trukmė yra 40 min.
Temperatūros įtakos fenolinių junginių ekstrakcijai.Temperatūra daro svarbią įtaką
ekstrakcijai, nes didėjant temperatūrai didėja ir ekstrakcijos išeiga, tačiau didinant temperatūrą gali skilti flavonoidų glikozidai ir sumaţėti bendras jų kiekis [20]. Temperatūros įtaka vertinta ekstrahuojant augalinę ţaliavą ultragarso vonelėje, esant skirtingai temperatūrai (10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C ir 80°C). Rezultatai pateikti 9 pav.Didţiausias kiekis (33,81±1,96 mg/g) flavonoidų nustatytas ekstrakcijai naudojant 60°C temperatūrą.
9pav. Bendro flavonoidų kiekioįvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje esant skirtingai temperatūrai (n=3)
Didinant temperatūrą, išekstrahuotų veikliųjų medţiagų kiekis maţėjo (11 pav.), todėl tolimesniems bandymams pasirinkta 60°C temperatūra.
Ultragarso įtaka ekstrakcijos efektyvumui. Ultragarsas ekstrakcijos metu naudojamas
suardyti ląstelių sienelėms bei pagerinti biologiškai aktyvių medţiagų perėjimą iš augalinės ţaliavos į tirpiklį. Optimizuojant ekstrakcijos sąlygas tirti ultragarso stipriai yra intervale nuo 48 W iki 480 W. Didţiausia flavonoidų išeiga (33,93±1,75 mg/g) nustatyta esant 480 W stipriui (10pav.). 480 W ultragarso stipris yra maksimalus, kokį galima išgauti su tyrime naudota aparatūra.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 20 30 40 50 60 70 80 Temperatūra, °C Fl avono id ų ki e ki s, m g/g
10 pav. Bendro flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje naudojant skirtingą ultragarso stiprį (n=3)
3.2 Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymasobelų lapų ėminiuose
spektrofotometriniu metodu
3.2.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obelų lapų ėminių ekstraktuose Folin-Ciocalteu metodu
Tyrimo metu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis Lietuvoje auginamų obelų lapų ekstraktuose. Tyrimui atrinkti obelų lapai iš tos pačios augimvietės, tų pačių metų derliaus ir rinkti tuo pačiu metu, todėl galima atmesti augimo ar rinkimo faktorius, kurie galėtų darytį įtaką fenolinių junginių kiekiui ir apţvelgti fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo veislės ar poskiepio. Tyrimui pasirinktas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, kuris yra plačiai naudojamas ir nereikalauja sudėtingos aparatūros. Tyrimo rezultatai pateikti 11 pav. Daugiausiai(114,86±3,26 mg GAE/g)fenolinių junginių nustatyta „Lodel ekologinis I“ auginimo sistemoje, „Aldas ekologinis II“ auginimo sistemojenustatyta (108,24±3,12 mgGAE/g), „Ligol PB4“ poskiepyje (104,44±3,48 mgGAE/g) ir „Auksis PB4“ poskiepyje (98,77±2,96 mgGAE/g)fenolinių junginių. Maţiausi kiekiai fenolinių junginių nustatyti šiuose atskirų veislių poskiepiuose ir auginimo sistemose: „Ligol B369“ (57,62±1,79 mgGAE/g), „Aldas intensyvus II“ (66,72±1,93 mg GAE/g), „Auksis M62“ (72,81±2,13 mgGAE/g) ir „Lodel intensyvus I“ (73,57±2,67 mgGAE/g).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 Fl avono id ų ki e ki s, m g/g Ultragarso stipris, W
11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekinės sudėties tytimas skirtingose Lietuvoje augančių obelų lapų veislėse(n=3)
Palyginimui galima pateikti uţsienio mokslininkų darbuose rastus duomenis apie bendrą fenolinių junginių kiekį obelų lapuose. (Petkovšek et al., 2008) nustatė truputį maţesnį (60.4 - 87.6 mg GAE/g) fenolinių junginių kiekį „Golden delicious“ veislės obelų lapuose. Lyginant obelų lapų ėminių ekstraktuose nustatytą bendrą fenolinių junginių kiekį su kitų Rosaceae šeimos augalų lapų fenolinių junginių kiekiais, įvairių rūšių šermukšnių lapų ėminių metanoliniuose ekstraktuose nustatytas maţesnis bendras fenolinių junginių kiekis 60,6 – 90,9 mg GAE/g [43]. Maţesnis kiekis (68,1 – 83,3 mg GAE/g) nustatytas ir kriaušių lapų ėminių ekstraktuose [28].
3.2.2 Bendro flavonoidų kiekio įvairavimo tyrimas obelų lapų etanolinių ėminių ekstraktuose naudojant reakciją su AlCl3
Tyrimui pasirinktas spektrofotometrinis metodas. Reakcijos su aliuminio chloridu metu susiformuoja stabilus kompleksas su flavonoidais [34], todėl galima išmatuoti bendrą jų kiekį, kuris yra svarbus, siekiant įvertinti augalinės ţaliavos kokybę. Tyrime naudotos tos pačios obelų rūšys ir poskiepiai kaip bendro fenolinių junginių kiekio tyrime. Tyrimo rezultatai pateikti 12 pav. Didţiausias kiekis flavonoidų (39,6±1,23 mg RE/g) nustatytas „Lodel ekologinis I“ auginimo sistemoje. Iš „Aldas“ veislės, didţiausias kiekis (39,04±1,35 mg RE/g) nustatytas „ekologinis II“auginimo sistemoje. „Auksis“ veislėje didţiausiu kiekiu (38,47±1,06 mg RE/g) flavanoidų pasiţymėjo P66 poskiepis, o „Ligol“ veislėje P67 poskiepis, kuriame nustatyta (31,91±1,19 mg RE/g) flavonoidų. Maţiausi kiekiai flavonoidų kiekvienos rūšies obelų lapuose buvo nustatyti „Ligol B396“ (15,73±0,67 mg RE/g),
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 Lodel ekologinis I Aldas ekologinis II
Ligol PB4 Auksis PB4 Lodel intensyvus I Auksis M26 Aldas intensyvus II Ligol B396 B en d ras fe n oli n ių jun gin ių k ieki s, m g/g G AE
