LIETUVOS SVEIKATOS M

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Justė Martinkutė

U-87 GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ SUFORMUOTŲ NAVIKŲ IR NATRIO VALPROATO POVEIKIO ANGIOGENEZEI TYRIMAS VIŠČIUKO EMBRIONO

CHORIOALANTOJINĖJE MEMBRANOJE Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas Prof. Angelija Valančiūtė

2

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Glioblastomos bruožai... 10

1.2. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos histogenezė ir struktūra ... 11

1.3. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos kraujagyslių savybės ... 12

1.4. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelio panaudojimas glioblastomos tyrimuose... 13

1.5. Gliomų sukelta angiogenezė ... 14

1.6. Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio ir kraujagyslių endotelio augimo veiksnio receptoriaus signalinis kelias ... 16

1.7. Natrio valproato poveikis angiogenezei ... 18

2. TYRIMO METODAI IR REAGENTAI ... 20

2.1. Kiaušinių inkubavimas ir paruošimas tyrimams ... 20

2.2. U-87 ląstelių paruošimas ir panaudojimas tyrimuose ... 21

2.3. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos nuėmimas ir mėginių paruošimas histologiniams tyrimams ... 22

2.4. Preparatų dažymas hematoksilinu ir eozinu ... 23

2.5. Preparatų imunohistochemija, naudojant kraujagyslių endotelio augimo veiksnio ir proliferuojančių ląstelių branduolių antikūną ... 24

2.6. Histomorfometrinė analizė ... 25

2.7. Statistinė duomenų analizė ... 26

2.8. Naudoti reagentai ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1. Biomikroskopija in vivo ir fluorescencinė stereomikroskopija ... 28

3.2. Histologinė ir histomorfometrinė analizė ... 32

3.3. Imunohistocheminė viščiukų embrionų chorioalantojinių membranų analizė ... 36

IŠVADOS ... 41

3

SANTRAUKA

Magistro darbo autorius: Justė Martinkutė

Magistro darbo pavadinimas: U-87 GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ SUFORMUOTŲ NAVIKŲ IR NATRIO VALPROATO POVEIKIO ANGIOGENEZEI TYRIMAS VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖJE MEMBRANOJE

4

ABSTRACT

Author of Master Thesis: Justė Martinkutė

Full title of Master Thesis: U-87 GLIOBLASTOMA CELL FORMED TUMORS AND SODIUM

VALPROATE IMPACT ON ANGIOGENESIS RESEARCH IN CHICK EMBRYO

CHORIOALLANTOIC MEMBRANE

5

PADĖKA

Dėkoju savo darbo vadovei, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Histologijos ir embriologijos katedros vedėjai, profesorei Angelijai Valančiūtei už parodytą kelią į histologijos pasaulį, šiltą bendravimą, vertingus patarimus ir pastebėjimus.

Dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Neuromokslų instituto dr. Arūnui Kazlauskui už vertingus patarimus, perteiktas žinias ir pamokas su ląstelių kultūromis.

Dovilei Kavaliauskaitei už bendradarbiavimą, puikius patarimus, vilties įkvėpimą.

6

INTERESŲ KONFLIKTAS

7

SANTRUMPOS

CAM Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana (angl. Chick embryo chorioallantoic membrane)

CNS Centrinė nervų sistema (angl. Central nervous system)

DMEM Dulbecco‘s modifikuota Eagle‘s terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium) ECM Ekstraląsteliniai matrikso baltymai (angl. Extracellular matrix proteins)

EDTA Etileno diamino tetraacto rūgštis (angl. Ethylenediaminetetraacetic acid) eNOS Endotelinė azoto monoksido sintazė (angl. Endothelial nitric oxide synthase) FBS Jaučio vaisiaus serumas (angl. Fetal bovine serume)

FGF Fibroblastų augimo veiksnys (angl. Fibroblast growth factor) GBM Daugiauformė glioblastoma (angl. Glioblastoma multiforme) HDAC Histonų deacetilazės (angl. Histone deacetylases)

HDACIs Histonų deacetilazės slopiklis (angl. Histone deacetylase inhibitors) HIF Hipoksijos indukuojamas veiksnys (angl. Hypoxia-inducible factor) pVHL Von Hippel-Lindau baltymas (angl. The von Hippel-Lindau protein)

RTKi Tirozino kinazės receptorių slopiklis (angl. Receptor tyrosine kinase inhibitor)

TM Tripano mėlis

VEGF Kraujagyslių endotelio augimo veiksnys (angl. Vascular endothelial growth factor)

VEGFR Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio receptorius (angl. Vascular endothelial growth-factor receptors)

8

ĮVADAS

Daugiaformė glioblastoma (GBM) pagal Pasaulio sveikatos organizacijos klasifikavimą priskiriama IV stadijos gliomai (1). Tai bene dažniausiai pasitaikantis neišgydomas centrinės nervų sistemos navikas. Taikant kombinuotą gydymą vidutinė sergančiųjų gyvenimo trukmė išlieka labai trumpa, iki 15 mėnesių nuo diagnozės nustatymo. Glioblastomos navikai yra labai heterogeniški savo biologinėmis, morfologinėmis bei genetinėmis savybėmis. Pagrindiniai daugiaformės glioblastomos bruožai yra ląstelių polimorfizmas, mitotinis aktyvumas, kraujagyslių pakitimai ir dideli nekrozės židiniai.

Priešingai nei daugelis histonų deacetilazės slopiklių, trumpos grandinės riebalų rūgštis natrio valproatas yra organizmų gerai toleruojamas ir saugus vartoti didelėmis dozėmis (2). Natrio valproatas (VPA) jau daugelį metų naudojamas gydant epilepsiją, bipolinius sutrikimus, šizofreniją ir neuropatinį skausmą. 1997 m. išsiaiškinta, kad šis vaistas slopina vėžinių ląstelių proliferaciją in vitro ir in vivo, todėl gali būti naudojamas priešvėžiniams susirgimams gydyti (3). Įrodyta, jog natrio valproatas gali keisti vėžinių ląstelių apoptozę, stabdyti jų augimą bei reguliuoti ląstelių diferenciaciją per histonų deacetilazės slopinimą (4). Taip pat bandymuose su ląstelių linijomis in vivo, tokiomis kaip meduloblastoma, neuroblastoma, prostatos vėžio, storosios žarnos vėžio, parodyta, kad VPA stabdo navikų angiogenezę (5; 6; 7). Osuka tyrėjų grupė nustatė, jog natrio valproatas gali slopinti gliomų angiogenezę tiesiogiai ir netiesiogiai (8). Netiesioginis mechanizmas veikia per gliomos ląstelių kraujagyslių endotelio augimo veiksnio (VEGF) baltymo išskyrimą tiek in vitro, tiek in vivo. Tiesioginio mechanizmo metu, veikiant VPA, sumažėja endotelio ląstelių proliferacija.

Norint atrasti naujus gliomos gydymo būdus, reikalingi modeliai, kurie būtų tinkami navikų sukeltų pokyčių vertinimui. Tyrimai su glioblastomos ląstelėmis ir jų aktyvumo slopinimu dažniausiai atliekami in vitro. Ląstelių kultūrose auginamos vėžinės ląstelės nesuteikia pakankamai informacijos apie vaistų poveikį joms, todėl yra didelis poreikis naudoti gyvūnų modelius (9) Dauguma tyrimų su gyvūnų modeliais atliekami panaudojant graužikus. Pagrindiniai šių modelių trūkumai yra nevienodas navikų susiformavimo greitis ir mažas ląstelių prasiskverbimo dažnis, be to, sunku gauti morfologinius duomenis (10). Mes pasirinkome naudoti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį, nes viščiuko embrionas neturi pilnai susidariusios imuninės sistemos, kas leidžia vėžinėms ląstelėms formuoti navikus. Be to, metodas patogus tuo, jog realiu laiku galima stebėti vėžinių ląstelių ir navikų sukeltą angiogenezę.

9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas:

Ištirti natrio valproato poveikį U-87 glioblastomos ląstelių sukeltai angiogenezei panaudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį.

Uždaviniai:

1. Įvertinti U-87 glioblastomos ląstelių linijos suformuotų navikų sukeltą neoangiogenezę ir eksperimentinio naviko vaskuliarizaciją biomikroskopijos in vivo metodu;

2. Histomorfometrijos metodu įvertinti kokybinius ir kiekybinius pokyčius viščiuko embriono chorioalantojinėje membranoje bei jos vaskuliarizacijoje, susijusius su natrio valproato poveikiu; 3. Imunohistochemiškai įvertinti kraujagyslių endotelio augimo veiksnio raišką;

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Glioblastomos bruožai

Daugiaformė glioblastoma (GBM) pagal Pasaulio sveikatos organizacijos klasifikavimą priskiriama IV stadijos gliomai (1). Tai bene dažniausiai pasitaikantis neišgydomas centrinės nervinės sistemos (CNS) navikas (1). Kasmet Jungtinėse Amerikos Valstijose užregistruojama daugiau kaip 10 000 naujų šios ligos atvejų (11). Nepaisant agresyvių gydymo būdų, tokių kaip chirurginis naviko pašalinimas, radioterapija ar chemoterapija, vidutinė sergančiųjų šia liga gyvenimo trukmė išlieka labai trumpa, tik apie 14–15 mėnesių (12). Dėl glioblastomos ląstelių aukšto invazyvumo laipsnio pagrindinės naviko masės pašalinimas ligos eigos nesustabdo (1). Prasiskverbusios vėžinės ląstelės išlieka smegenų parenchimoje ir sukelia ligos progresavimą ar atsinaujinimą šalia pirminio naviko arba toliau nuo jo (13).

Daugiaformė glioblastoma susideda iš genetiškai ir fenotipiškai tarpusavyje besiskiriančių, t. y. heterogeninių navikų (14). 90 proc. atvejų liga išsivysto de novo iš normalių glijos ląstelių tumorogenezės metu (15). Likę 10 proc. glioblastomos atvejų kyla iš antrinės neoplazmos, progresuojant žemesnio laipsnio navikams (anaplastinėms astrocitomoms) (16). Antrinės gliomos procesas trunka maždaug 4–5 metus, progresuoja lėčiau ir yra siejamas su geresne prognoze (15). Priešingai, daugiaformė glioblastoma, kuri formuojasi de novo, užauga maždaug per 3 mėnesius (17). Nepaisant to, jog tiek genetiškai, tiek molekuliniame lygmenyje pirminės ir antrinės gliomos susiformavimo priežastys skiriasi (14), tarp šių dviejų grupių nebuvo pastebėti morfologiniai skirtumai (18).

Morfologiškai GBM sudaro mažos ląstelės, kurioms būdingas polimorfizmas bei anaplazija, t. y. jos nesugeba pakankamai subręsti ir diferencijuotis, praranda struktūros specifiškumą ir funkcines atitinkamo audinio ypatybes. Be to, šių ląstelių branduoliams taip pat būdingas dydžio ir formos polimorfizmas. GBM ląstelės gali būti tiek daugiakampės, tiek verpstės formos, tačiau tikslios ląstelės ribos dažnai neaiškios, jų citoplazma acidofilinė (15). Ląstelių branduoliai gali būti ovalūs arba pailgi, su daugybe skirtingų branduolėlių (15). Taip pat navikuose gali būti aptinkamos dvibranduolės, daugiabranduolės ir nekrotinės ląstelės, limfocitai, neutrofilai bei makrofagai (19).

11 visiškai nesusiję su astrocitų susijusiais procesais (21). Be to, GBM aptinkami kraujagyslių trombai, kurie lemia endotelinių ląstelių pažeidimus ir proliferaciją (15). Šios kraujagyslių pažaidos lemia eritrocitų išsiliejimą (22).

Nekrozės židiniai yra vienas iš charakteringiausių glioblastomos bruožų. Priklausomai nuo vietos ir nekrozės užimamo ploto yra išskiriami du nekrozės tipai. Pirmąjį tipą sudaro dideli nekrozės plotai centrinėje naviko teritorijoje, kuriuos lemia nepakankamas ląstelių aprūpinimas krauju (15). Šis nekrozės tipas aptinkamas pirminėje glioblastomoje. Antro tipo nekrozė sudaryta iš mažų, netvarkingos formos nekrozinių židinių su pseudopalisadiniais plotais, kuriuos formuoja aplink orientuotos glijos ląstelės (23). Šio tipo nekrozė randama pirminėje ir antrinėje gioblastomoje.

1.2. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos histogenezė ir struktūra

Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis yra vienas iš metodų, naudojamų angiogenezės tyrimuose. Kadangi CAM sudaro tankus kraujagyslių tinklas, ji yra geras paviršius vėžinių ląstelių bei navikų transplantavimui (1 pav.). Palyginus su kitais in vivo modeliais, viščiuko embrionas neturi pilnai susidariusios imuninės sistemos, o tai leidžia tiek vėžinėms ląstelėms formuoti navikus, tiek perkeltiems navikams toliau augti. Be to, metodas patogus tuo, jog realiu metu galima stebėti vėžinių ląstelių ir navikų sukeltą angiogenezę kelių dienų ar valandų bėgyje.

1 pav. Schematinis CAM vaizdas su transplantuotu augliu ant membranos paviršiaus (modifikuota pagal 24)

12 jau trečią inkubacijos dieną (25). Ketvirtą inkubacijos dieną alantojus susilieja su choriono epiteliu, kuris išsivysto iš ektodermos, ir taip susiformuoja chorioalantojus (26).

2 pav. 12-tos paros CAM histologinis pjūvis

Dažyta eozino hematoksilino dažais: CE – choriono epitelis, M – mezenchima, K – kraujagyslė, AE – alantojaus epitelis. Skalė 50 µm.

Iki aštuntos paros primityvios kraujagyslės toliau proliferuoja ir diferencijuojasi į arterioveninę sistemą, taip suformuodamos tankų kapiliarų tinklą, kuris reikalingas dujų apykaitai tarp embriono ir aplinkos (25). Greita kapiliarų proliferacija vyksta iki vienuoliktos inkubacijos paros, po to mitozinis indeksas sumažėja ir kraujagyslių sistema išlieka beveik nepakitusi iki pat viščiuko išsiritimo dienos (27). Taigi, CAM pasižymi tankiu kraujagyslių tinklu, ji yra analogiška žinduolių placentai ir 11-tą viščiuko embriono vystymosi parą pilnai gaubia viščiuko embrioną.

1.3. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos kraujagyslių savybės

Angiogenezė – biologinis procesas, kurio metu iš jau egzistuojančių kraujagyslių formuojasi naujos kraujagyslės (28). Šis fiziologinis reiškinys reikalingas žaizdų gijimui ir audinio augimui (28). Be to, angiogenezė susijusi ir su įvairiomis patalogijomis – vėžiu, naviko augimu, metastazavimu, reumatoidiniu artritu bei žvyneline (29).

13 Ketvirtą viščiuko embriono inkubacijos parą chorioalantojinės membranos kraujagyslės atrodo kaip nediferencijuoti kapiliarai (31). Kraujagyslių sieneles sudaro vienas endotelinių ląstelių sluoksnis, kuriam trūksta pamatinės membranos (27). Aštuntą inkubacijos parą CAM sudaro po choriono epiteliu išsidėstę plonasieniai kapiliarai (skersmuo 10–15 µm), bei mezodermos sluoksnio, 10–115 µm skersmens, kraujagyslės (27). Mezodermos sluoksnio kraujagyslių sienelės turi mezenchiminių ląstelių sluoksnį, kuris supa endotelį ir yra visiškai apgaubtos pamatine membrana (27).

10–12-tą inkubacijos parą kapiliarai būna panašūs į aštuntos paros kapiliarus, taip pat išsidėstę netoli choriono epitelio paviršiaus, o mezodermos sluoksnio kraujagyslės diferencijuotos į arterioles ir venules (31). Arteriolių sieneles (skersmuo 10–85 µm) sudaro endotelis ir mezenchimos ląstelės, kurios išsidėsčiusios 1–2 sluoksniais, bei jungiamasis audinys (31). Venulės (skersmuo 10– 115 µm) yra apsuptos mezenchiminių ląstelių, jų sienelėse taip pat aptinkamos jungiamojo audinio sankaupos (31). Manoma, jog iš mezenchiminių ląstelių formuojasi lygiųjų raumenų ląstelės, o arteriolės pereina į adventiciją su į fibroblastus panašiomis ląstelėmis (27).

Nustatyta, jog kraujagyslių formavimąsi viščiuko embriono chorioalantoinėje membranoje reguliuoja du pagrindiniai veiksniai – kraujagyslių endotelio augimo veiksnys (VEGF) ir fibroblastų augimo veiksnys (FGF) (32). Jie abu gali būti autokrininiai arba parakrininiai angiogenezės reguliatoriai (31).

1.4. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelio panaudojimas

glioblastomos tyrimuose

Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis yra vienas iš populiarių metodų, norint tirti gliomos angiogenezę, augimą, invazivumą ir vaistų poveikį vėžinėms ląstelėms. Tokį pasirinkimą lemia palyginti pigūs tyrimo kaštai, trumpa eksperimento trukmė, paprastas protokolas ir minimalūs etikos normų reikalavimai lyginant su pelių gliomos modeliais (33).

14 Strojnik tyrėjų grupė palygino CAM gliomos modelį su žiurkių gliomos modeliu (36). Abiejų modelių glioblastomose jie analizavo įvairius citologinius bruožus (33). Žiurkių modelyje nustatyta, jog U-87 glioblastomos ląstelių suformuoti navikai smarkiai atsiskyrė nuo naviką supančio smegenų audinio, kai tuo tarpu CAM gliomos modelyje jungiamajame audinyje ir kraujagyslių sienelėse susiformavo mažesnio dydžio navikai (36). Taigi Strojnik tyrėjų grupė pasiūlė CAM gliomos modelį, kaip tinkamesnį naviko invazijai tirti nei žiurkių gliomos modelis.

Martinho tyrėjų grupė panaudojo CAM glioblastomos modelį, norėdami ištirti, kokį poveikį turi tirozino kinazės receptorių slopikliai (RTKi) angiogenezei ir naviko proliferacijai in vivo (37). Jie nustatė, jog RTKi sumažino link naviko nukrypusių kraujagyslių skaičių ir nuslopino tolimesnį naviko augimą (37). Atlikę papildomus in vitro eksperimentus jie nustatė ir papildomus RTKi taikinius (37).

Hagedorn ir kiti tyrė daugiaformės glioblastomos progresavimo modelį, šios rūšies naviką užsodinus ant CAM (38). Jie parodė, jog maždaug per dvi dienas susiformuoja avaskuliniai navikai, kurių augimas progresuoja dėl angiogenezės, priklausomos nuo antro tipo kraujagyslių endotelio augimo veiksnio receptoriaus (VEGFR-2) ir susijusios su hemoragija, nekroze ir edema (39). Su tirozino kinazės slopikliais užblokavus VEGFR-2 ir trombocitų kilmės augimo veiksnio receptorių signalinius kelius buvo sustabdytas naviko tolimesnis vystymasis (39). Taip pat naudojant oligonukleotidų mikrogardeles buvo nustatyti genai, kurie atsakingi už naviko vaskuliarizaciją ir augimą (39).

1.5. Gliomų sukelta angiogenezė

Kai vientisas galvos smegenų navikas pasiekia didesnį nei kritinį dydį (skersmuo 1–2 mm), jo aprūpinimui deguonimi ir maisto medžiagomis reikalingos naujos kraujagyslės, kurios užtikrintų naviko proliferaciją (40). Naujų kraujagyslių formavimasis ir yra pagrindinė priežastis, dėl kurios maža, lokalizuota neoplazma virsta agresyviu naviku (40).

Angiogenezės proceso pradžiai būdingi trys atskiri etapai: 1. Egzistuojančių kraujagyslių pažeidimas;

2. Kraujagyslės pamatinės membranos irimas ir apsupimas ekstraląsteliniais matrikso baltymais (ECM);

15 navikai turi tankų mikrokraujagyslių tinklą, išgyvena trumpiau, nei tie, kurių navikuose mikrokraujagyslių yra mažiau (42). Taigi, aplinkinių kraujagyslių migracija, proliferacija ir angiogenezė yra labai tarpusavyje susiję procesai ir progresuoja kartu su glioma (40).

Angiogenezę lemia proangiogeninių ir antiangiogeninių veiksnių disbalansas. Progresuojant navikui, daugėja ir angiogeninių veiksnių, skatinančių nekontroliuojamą ir neorganizuotą kraujagyslių augimą (40). Šie molekuliniai veiksniai gali būti išskiriami vėžinių, endotelinių, stromos ar kraujo ląstelių bei ekstraląstelinės matricos (43).

Proangiogeninius veiksnius sudaro įvairūs angiogeniniai veiksniai, tokie kaip VEGF, rūgštinis fibroblastų augimo veiksnys, bazinis fibroblastų augimo veiksnys, placentos augimo veiksnys, angiopoetinas-2 ir interleukinai, o angiogeninius veiksnius sudaro angiostatinas, endostatinas, trombospondinas 1 bei endotelio monocitų aktyvavimo polipeptidas 2 (44; 45). Be to, fermentai, tokie kaip serino proteinazės ir mataloproteinazės suardo ekstraląstelinį matriksą, kuris svarbus tiek angiogenezės sužadinimui, tiek jos slopinimui (46). Gliomos mikroaplinkos autokrininiai ir parakrininiai veiksniai ir trombocitų kilmės augimo veiksnys (PDGF) taip pat prisideda prie gliomose vykstančios angiogenezės (47). Endotelinės ląstelės, stimuliuojamos angiogeninių veiksnių, migruoja bei proliferuoja ir tai lemia naujų kraujagyslių formavimąsi (48). Visa tai leidžia vėžinėms ląstelėms plisti.

3 pav. Kraujagyslių ir vėžinių ląstelių sąveika, lemianti naujų kraujagyslių formavimąsi naviko link ( modifikuota pagal 49)

ECM – ekstraląsteliniai matrikso baltymai.

16 (VEGF) ir taip aktyvuoja arti esančias endotelines ląsteles, kurios dėl to formuoja naujas kraujagysles naviko link.

1.6. Kraujagyslių endotelio augimo veiksnio ir kraujagyslių endotelio augimo

veiksnio receptoriaus signalinis kelias

Atsiranda vis daugiau įrodymų, jog kraujagyslių endotelio augimo veiksnio ir kraujagyslių endotelio augimo veiksnio receptoriaus signaliniai keliai yra pagrindiniai angiogenezės reguliatoriai piktybinėse gliomose (40).

VEGF priklauso VEGF – PDGF supergenų šeimai ir pagal egzonų splaisingą yra skirstomas į penkias izoformas: VEGF – A, VEGF – B, VEGF – C, VEGF – D ir VEGF – E. Tikėtina, jog iš visų šių veiksnių VEGF – A yra pagrindinis augimo veiksnys ir pastaruoju metu jis paprasčiausiai vadinamas VEGF (50). VEGF gali reguliuoti angiogenezę įvairiais būdais (4 pav.):

1. Didindamas mikrokraujagyslių pralaidumą plazmos baltymams (51); 2. Sukeldamas endotelinių ląstelių dalijimąsi ir migraciją (52; 53);

3. Trukdydamas endotelinėms ląstelėms sąveikauti su fibroblastų ir tarpląstelinės matricos komponentais, tokiais kaip αvβ3 integrinas, ir taip užkirsdamas kelią jų apoptozei ir senėjimui (54);

4. Sukeldamas stromos degradaciją ir galimai didindamas kraujagyslių fibrino substrato susidarymą, kuris reikalingas endotelinių ir vėžinių ląstelių augimui (55; 56);

17

4 pav. VEGF funkcijos navikuose (modifikuota pagal 58)

Rodyklėmis nurodyti VEGF šaltiniai ir taikiniai.

Pačios vėžinės ląstelės taip pat gali sekretuoti VEGF. Jie sustiprina ląstelių diferenciaciją ir epitelinio fenotipo ląstelių virtimą mezenchiminio fenotipo ląstelėmis (58). VEGF taip pat gali pritraukti reguliacines T (TReg) ląsteles, kurios slopina priešvėžinį imuninį atsaką (58).

Nustatyta, jog glioblastomose yra aktyvuojamas kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A ir jį išskiria kelios ląstelių rūšys, įskaitant vėžines, stromos ir uždegimines (30). VEGF raišką iš esmės reguliuoja šie procesai:

1. Sparčiai didėjant navikui, jo viduje paprastai susidaro hipoksinės sąlygos dėl nepakankamos naviko vaskuliarizacijos. Hipoksijos metu ląstelėse suaktyvėja hipoksijos indukuojamų veiksnių (HIF) sintezė, kurie padidina VEGF mRNR kiekį (40);

2. Nuo HIF nepriklausomu keliu epidermio augimo veiksnio receptoriai skatina VEGF geno raišką (40);

3. Daugiaformėje glioblastomoje aktyvuojamas FoxM1B transkripcijos veiksnys, kuris taip pat skatina VEGF raišką nepriklausomai nuo HIF (40);

4. Žmogaus antigeno R aktyvinimas užtikrina, jog nevyktų posttranskripcinė VEGF-A mRNR degradacija hipoksinėmis sąlygomis, taigi VEGF kiekis toliau didėja (59);

5. Galvos smegenų kilmės neurotrofino veiksnys gali sustiprinti VEGF raišką, didindamas hipoksijos indukuojamo veiksnio-1 raišką (60);

18 Įrodyta, jog gliomose dideliais kiekiais išreikšti du pagrindiniai tirozino kinazės receptoriai – VEGFR-1 ir VEGFR-2 (62). Abu šiuos receptorius aktyvuoja VEGF-A, tačiau jie yra skirtingai susiję su angiogeneze ir gliomų vystymusi in vivo (40). VEGF-A stipriau rišasi prie VEGFR-1 nei prie VEGFR-2, tačiau VEGFR-1 yra kaip tarpininkaujantis receptorius, kontroliuojantis VEGF prieinamumą prie VEGFR-2 (63). VEGFR-2 paprastai yra išreikšti kraujagyslių endotelio ląstelėse, šiais receptoriais tiesiogiai perduodami mitoziniai signalai, lemiantys angiogenezę (40). VEGFR-1 aptinkami ne tik kraujagyslių endotelio ląstelėse, bet ir monocituose, makrofaguose bei kai kuriose vėžinėse ląstelėse (40).

1.7. Natrio valproato poveikis angiogenezei

Valproinė rūgštis (2-propilpentanoinė rūgštis) yra riebalų rūgštis, sudaryta iš aštuonių anglies atomų šakotos grandinės (64). Šis junginys apibūdinamas kaip nuotaikos stabilizatorius, pasižymintis plataus spektro slopinančiomis savybėmis. Įrodytas šio preparato veiksmingumas kontroliuojant dalinius ir bendrus epilepsijos priepuolius, bipolinius sutrikimus, šizofreniją ir neuropatinį skausmą (65). Valproinė rūgštis tirpi vandenyje ir ypač tirpi organiniuose tirpikliuose (64). Organizmams ši medžiaga gali būti lengvai perduodama magnio arba natrio druskų pavidalu.

Natrio valproatas (VPA) pasižymi plačiu slopinamuoju aktyvumu ir pastaruoju metu jis yra siūlomas kaip potencialus adjuvantas vėžio gydymui (66). Nustatyta, jog VPA keičia gama-amino sviesto rūgšties lygį smegenyse, blokuoja nuo įtampos priklausomus natrio, kalio ir kalcio kanalus bei slopina histonų deacetilazes (HDAC) (66 Per didelė histonų deacetilazių aktyvacija gali sukelti neoplaziją, tuo tarpu histonų deacetilinimas lemia chromatino kondensaciją bei kai kurių genų transkripcijos blokavimą (67).

Gerai žinoma, jog VPA yra vienas iš HDAC slopikių (HDACIs). HDACIs gali slopinti įvairių navikų angiogenezę per daugelį mechanizmų. Nustatyta, jog HDACIs paveikia eilę proangiogeninių ir angiogeninių genų (68) Visų pirma, HDACIs gali tiesiogiai ir netiesiogiai slopinti hipoksijos indukuojamo veiksnio-1 alfa (HIF-1α) padidėjusią raišką:

1. Tiesioginis mechanizmas veikia per HIF-1α transkripcinio aktyvumo nuslopinimą bei nuo von Hippel-Lindau baltymo (pVHL) nepriklausomą proteosomos suardymą (69);

2. Netiesioginis mechanizmas veikia per p53 ir pVHL slopinimą (70), p300 acetilinimą, lemiantį jo disociaciją ir HIF-1α degradaciją (71) bei Hsp90 hiperacetilinimą, kuris veda į nesubrendusių HIF-1α / 70 – kDa karščio-šoko baltymų kompleksų susikaupimą (72).

19 trombospondino 1, endotelinės azoto monoksido sintazės (eNOS), angiopoetino-1 ir -2 bei giliausio kraujagyslių sluoksnio endotelio kinazės 2 (73).

Eksperimentais parodyta, kad natrio valproatas mažina kraujagyslių endotelio veiksnio raišką. Buvo atlikti eksperimentai su 6–8 savaičių pelių patinėliais, kuriems buvo suleista žmogaus prostatos vėžio ląstelių linija PC3. Susiformavus navikams gyvūnai 28 paras buvo girdomi 0,4 proc. natrio valproato tirpalu. Rezultatai parodė, kad pelėms, kurios buvo girdytos VPA, susiformavo 70 proc. mažesni navikai palyginus su pelėmis, kurios nebuvo paveiktos VPA (74). Taip pat atlikus polimerazinę grandininę reakciją ir imunohostocheminę analizę parodyta, jog VPA sumažino VEGF raišką ir padidino histono H3 acetilinimo laipsnį. Isenberg tyrėjų grupė parodė, jog VPA paveiktuose mėginiuose buvo mažesnis mikrokraujagyslių tankis (74). Kita tyrėjų grupė įrodė, jog VPA slopina VEGF ir FGF raišką storosios žarnos karcinomoje (75).

Osuka tyrėjų grupė nustatė, jog didelės VPA dozės slopina dviejų gliomos ląstelių linijų in vitro (U251 ir U-87) proliferaciją, dėl ko galima manyti, jog histonų deacetilazės dalyvauja gliomos ląstelių proliferacijos procese (8). Rezultatai parodė, jog VPA slopina gliomos angiogenezę dviem mechanizmais: „tiesioginiu ir netiesioginiu“. Netiesioginis mechanizmas vyksta per gliomos ląstelių VEGF baltymų išskyrimo slopinimą in vitro ir in vivo. VEGF raiškos sumažėjimas in vitro ir in vivo smegenyse yra svarbus angiogenezės slopinimui. Tiesioginio mechanizmo metu, veikiant VPA sumažėja endotelio ląstelių proliferacija.

Pastebėta, jog VPA slopina angiogenezę, endotelinių ląstelių proliferaciją bei sumažina eNOS raišką (74). Be to, VPA svarbus ir HIF-1 indukuojamų navikų angiogenezėje. VPA slopina HDAC1 ir HDAC3, kurios manoma, jog yra teigiami HIF-1α reguliatoriai (69).

20

2. TYRIMO METODAI IR REAGENTAI

2.1. Kiaušinių inkubavimas ir paruošimas tyrimams

Eksperimentiniame darbe buvo naudojami apvaisinti Cobb-500 veislės vištų kiaušiniai, pirkti iš Dovainonių paukštyno. Kiaušiniai horizontaliai dedami į Maino Enrico inkubatorių, kuriame palaikoma 37,7°C temperatūra, 60 proc. santykinė drėgmė ir įjungtas kiaušinių vartymo režimas 1 kartą per valandą. Praėjus 72 val. nuo kiaušinių inkubacijos pradžios inkubatoriuje išjungiamas vartymo režimas ir kiaušinių lukštuose atidaromi langeliai. Kiaušinių lukštai dezinfekuojami 70 proc. etilo alkoholiu. Bukajame kiaušinio gale, kuriame yra oro tarpas, mechaniniu grąžtu išgręžiama skylutė ir steriliu švirkštu nusiurbiama apie 2,5 ml baltymo tam, kad CAM nesiektų kiaušinio lukšto vidinės pusės ir besivystantis embrionas būtų apsaugotas nuo galimų pažeidimų. Po to išgręžiami 1 x 1,5 cm dydžio stačiakampiai langeliai ir pašalinamas kiaušinio lukštas (5 pav. A). Atidarius langelius, įvertinama, ar kiaušiniai apvaisinti ir įvertinamas viščiukų embrionų gyvybingumas. Apvaisintų ir gyvybingų kiaušinių langeliai uždengiami sterilia plastikine plėvele, kuri apsaugo nuo galimo užteršimo, infekcijų bei drėgmės netekimo (5 pav. B). Po šių etapų kiaušiniai su gyvybingais embrionais grąžinami į inkubatorių, o negyvi viščiukų embrionai ir neapvaisinti kiaušiniai eliminuojami iš tyrimo.

21

2.2. U-87 ląstelių paruošimas ir panaudojimas tyrimuose

U-87 ląstelės – glioblastomos, astrocitomos kilmės adherentinės, epitelinės ląstelės, kurios priskiriamos IV stadijai nuo 2007 metų. Ląstelių linija išvesta iš 44 metų baltaodžio vyro smegenų naviko.

Ląstelių kultūros auginamos steriliuose 25 cm2

ar 75 cm2 talpos mėgintuvėliuose. Mėgintuvėliai su ląstelių kultūra laikomi inkubatoriuje 37°C temperatūroje, atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis. Ląstelės auginamos ir dauginamos naudojant DMEM auginimo terpę, papildytą 10 proc. jaučio vaisiaus serumu (FBS), 2 proc. L-glutaminu, penicilinu (100 U/ml), streptomicinu (0,1 mg/ml). Ląstelių kultūrų auginimo terpė keičiama du kartus per savaitę.

Norint persėti ląstelių kultūrą arba panaudoti ląstelių suspensiją tyrimams su kiaušiniais, iš mėgintuvėlio nupilama arba nusiurbiama auginimo terpė. Į mėgintuvėlį pripilama 10 ml tripsino-EDTA tirpalo, priešinga sienele, nei ant kurios auga ląstelių monosluoksnis,. Tripsinuojama apie 5 min. ir invertuotu mikroskopu stebima, ar ląstelės atkibo. Ląstelėms atkibus įpilama 10 ml auginimo terpės tam, kad būtų inaktivuotas tripsino poveikįs. Gauta suspensija perpilama į 50 ml talpos mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1000 rpm greičiu 5 min. 37 °C temperatūroje. Supernatantas nupilamas, o ląstelių nuosėdos suspenduojamos 10 ml auginimo terpės.

Ląstelių kiekiui įvertinti skaičiuojamos ląstelės panaudojant hemocitometrą, o ląstelių gyvybingumui nustatyti naudojamas tripano mėlio dažas (TM). Mėgintuvėlyje sumaišoma 15 µl ląstelių ir 15 µl TM. Mišinys automatine pipete įleidžiamas į hemocitometro kamerą, kuri padengta dengiamuoju stikliuku taip, kad matytųsi Niutono žiedai. Skaičiuojamos tik gyvos, mėlynai nenusidažiusios ląstelės. Ląstelės skaičiuojamos pagal protokolą: suskaičiuojamos ląstelės 25 kvadratuose, jos sumuojamos ir dauginamos iš 2 (skiedimų skaičiaus su TM), toliau dauginama iš 4000 (vieno kvadrato tūrio dalis mililitre) ir dauginama iš 10 (auginimo terpės kiekis, sumaišytas su ląstelių suspensija). Gautas skaičius yra gyvų ląstelių kiekis 10 ml auginimo terpės.

22

6 pav. A – absorbuojanti kempinėlė, B – ant absorbuojančios kempinėlės užlašinta 20 µl U-87 ląstelių suspensijos, C – kempinėlė su ląstelių suspensija uždėta ant CAM, šalia stambiausios

kraujagyslės

2.3. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos nuėmimas ir mėginių

paruošimas histologiniams tyrimams

23 gabalėliais iškerpamos žirklutėmis ir įdedamos į Petri lėkštutes su 4 proc. formaldehido tirpalu. CAM vertinamos OLYMPUS SZX 16 stereomikroskopu ir fotografuojamos OLYMPUS SDF PLFL 0.3X skaitmenine fotokamera Petri lėkštutėse, naudojant ultravioletinę spinduliuotę generuojantį filtrą (X-Cite series 120PC Q, JAV) kartu su žaliai fluorescuojančio proteino filtru prie stereomikroskopo.

Membranos fiksuojamos Petri lėkštutėje 4 proc. formaldehido tirpalu 24 val. Po fiksacijos CAM sudedamos į biopsines kasetes ir 6 val. plaunamos po silpna tekančio vandens srove. Po to CAM dehidratuojama 12 val. 70 proc. etilo alkoholyje bei po 1 val. 80 proc. ir 90 proc. etilo alkoholyje. Išėmus CAM iš 90 proc. etanolio jos yra apkarpomos taip, kad tilptų į parafininį bloką ir suformuotas naviko gabaliukas būtų centre. Tam, kad CAM būtų praskaidrintos, jos po 1 val. laikomos 96 proc. etilo alkoholyje su chloroformu (santykis 1:1) ir chloroforme. CAM impregnuotos parafinu jas laikant 60°C termostate po 1 val. chloroform su parafinu (santykis 1:1), parafinas I ir parafinas II. Po to CAM įlietos į parafininius blokus, kurie atšaldomi ant šaldomojo stalelio ir supjaustomi rotaciniu mikrotomu 3 µm storio pjūviais. Atpjauti pjūviai ištiesinami 37 °C vandens vonelėje ir uždedami ant objektinio stiklelio, kurie palaikomi 3 val. ant kaitinimo plokštelės ir perkeliami į 37 °C temperatūros termostatą.

2.4. Preparatų dažymas hematoksilinu ir eozinu

Hematoksilino ir eozino (H-E) dažymo metodas naudojamas daugiau nei šimtmetį ir yra svarbus įvairių audinių tipų bei morfologinių pakitimų, sudarančių pagrindą šiuolaikinei vėžio diagnozei, aptikimui (76). Dažymo metodas liko nepakitęs daugelį metų, nes gerai veikia naudojant įvairias fiksuojančias medžiagas ir parodo gausią aibę citoplazminių, branduolinių ir ekstraląstelinių matricos bruožų. Hematoksilinas turi tamsiai mėlynai violetinę spalvą ir nudažo nukleino rūgštis dėl sudėtingos, iki šiol nepilnai suprastos reakcijos. Eozinas yra rožinis ir nespecifiškai nudažo baltymus (76). Tipiniame audinyje branduoliai yra nudažomi mėlynai, o citoplazma ir ekstraląstelinė matrica – įvairiais rožiniais atspalviais.

24 Preparatai vertinami šviesiniu mikroskopu OLYMPUS BX40F4 (Olympus Opticae co. LTD., Japonija) ir fotografuojami šviesinio mikroskopo Olympus skaitmenine fotokamera (Olympus U-CMAD3, Filipinai), 4x didinimu.

2.5. Preparatų imunohistochemija, naudojant kraujagyslių endotelio augimo

veiksnio ir proliferuojančių ląstelių branduolių antikūną

Imunohistochemija (IHC) – metodas, naudojamas parodyti tam tikrų baltymų buvimą ir jų lokalizaciją audinių preparatuose.

25 VEGF ir proliferuojančių ląstelių branduolių antikūnu (PCNA) nusidažiusios ląstelės vertinamos šviesiniu mikroskopu OLYMPUS BX40F4, preparatai fotografuojami šviesinio mikroskopo Olympus skaitmenine fotokamera.

Norint įvertinti PCNA teigiamų ląstelių dalį navike, pasirenkami du regėjimo laukai, kuriuose pažymimas 1 mm2

laukas. Lauke suskaičiuojamos PCNA teigiamos ląstelės ir visos navikinės ląstelės, ir išvedama abiejų laukų procentinė PCNA teigiamų ląstelių dalis.

2.6. Histomorfometrinė analizė

Analizuojamų CAM, kontrolinių, su U-87 ląstelių suformuotais navikais, U-87 ląstelės prieš užsodinant ant CAM paveiktos 4 mM ir 8 mM natrio valproatu, išsirinkti pjūviai, dažyti hematokslilinu eozinu, tokie, kur matosi suformuotas navikas (išskyrus kontrolinius atvejus). CAM vertinamos šviesiniu mikroskopu OLYMPUS BX40F4 ir fotografuojamos šviesinio mikroskopo Olympus skaitmenine fotokamera trijuose regėjimo laukuose, naudojant 4x padidinimą. Fotografuota laikantis tokio principo: pirmas regėjimo laukas yra esantis po naviku, antras – į kairę nuo naviko, trečias – į dešinę nuo naviko esantis regėjimo laukas (7 pav.). Kontrolinėse membranose pasirinkti ir nufotografuoti trys atsitiktiniai regėjimo laukai.

7 pav. CAM regėjimo laukai Skalė 200 µm.

26 suformuotais navikais, CAM su U-87 ląstelių maišytų su 4 mM ir 8 mM VPA suformuotais navikais, grupių vidurkiai.

2.7. Statistinė duomenų analizė

Duomenų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Vidurkiai statistiškai palyginti vienfaktorine dispersine analize ANOVA ir Tukey kriterijais naudojant SPSS 20.0 programą. Norint įvertinti PCNA teigiamų ląstelių dalies priklausomybę nuo kraujagyslių ploto ir kraujagyslių skaičiaus CAM buvo atlikta koreliacinė analizė, skaičiuotas Pearson koreliacijos koeficientas, kuris įvertina tiesinio ryšio stiprumą. Skirtumai tarp vidurkių statistiškai patikimi, jei p<0,05. Grafiniam duomenų vaizdavimui naudota kompiuterinė programa Sigma Plot 11.0.

2.8. Naudoti reagentai

2-propanolis Merck

Amonio tirpalas Fisher chemical

Antrinis antikūnas HRP Dako

Antrinis antikūnas mouse (linker) Dako

Chloroformas Merck

DAB chromogenas Dako

DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco

Eozino natrio druska Amresco

Etanolis Stumbras

FBS Gibco

Fluorescuojantis anioninis dekstranas Molecular probes Formalino neutralus buferinis tirpalas 10 proc. Sigma

Histologiniai klijai Roth

Ksilenas Sigma

27

Mayer‘io hematoksilinas Sigma

Natrio citrato buferinis tirpalas Dako

Pelės monokloninis antikūnas prieš žmogaus proliferuojančių ląstelių branduolių antigeną (PCNA)

(klonas PC10) Thermo Scientific

Pelių uodegų kolagenas I Gibco

Penicilinas/streptomicinas Gibco

Peroksidazės blokavimo tirpalas Dako

Plovimo buferis Dako

Substratinis buferis Dako

Tripano mėlis Lonza

Tripsinas-EDTA Gibco

Valproinės rūgšties natrio druska Sigma

28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Biomikroskopija in vivo ir fluorescencinė stereomikroskopija

CAM yra sudaryta iš tankaus kapiliarinio tinklo, todėl plačiai naudojama in vivo tyrimuose tiriant angiogenezę ir antiangiogenezę, kurią sukelia ant CAM užsodintos vėžinės ląstelės, biopsinė medžiaga.7-tą viščiuko embriono vystymosi parą ant CAM buvo uždėta absorbuojanti kempinėlė su 1x106 U-87 ląstelių. 9–12-tą paromis atlikta biomikroskopija in vivo, nes tarp 2-os ir 5-os dienos po ląstelių užsodinimo ant CAM susiformuoja matomas navikas, kuris yra aprūpinamas maistinėmis medžiagomis CAM kraujagyslių. Taip pat nustatyta, kad po poros dienų užsodinti navikai apgaubiami naujai susiformavusiomis kraujagyslėmis ir pradeda sparčiai augti. Vėžinės ląstelės randamos ne tik CAM, bet ir embriono organuose, tokiuose kaip plaučiai, kepenys, smegenys (77; 78).

8 pav. pateiktos kontrolinės CAM biomikroskopijos in vivo nuotraukos 9–12-tą viščiuko embriono vystymosi parą. Nuotraukose matyti, jog kraujagyslių skaičius visas paras išlieka panašus, taip pat jos auga neorientuotai, į visas kryptis.

8 pav. Kontrolinės CAM in vivo biomikroskopija 9–12-tą viščiuko embriono vystymosi parą

A, B, C, D atitinkamai 9, 10, 11, 12 para. Skalė 1 mm.

29

9 pav. Ant CAM užsodintos absorbuojančios kempinėlės su U-87 ląstelėmis in vivo biomikroskopija

9–12-tą viščiuko embriono vystymosi parą. A, B, C, D atitinkamai 9, 10, 11, 12 para. Skalė 1 mm. Prieš užsodinant ląsteles ant CAM, jos buvo paveiktos 4 mM natrio valproato tirpalu ir 9–12 paromis atlikta biomikroskopija in vivo (10 pav.). Nuotraukose matyti, jog kraujagyslės formuoja stipininį ratelį apie naviką kintant paroms. Pats navikas tvirtas, kintant paroms matyti, jog formuoja taisyklingą struktūrą, kraujagyslių navike nestebėta.

10 pav. Ant CAM užsodintos absorbuojančios kempinėlės su U-87 ląstelėmis, kurios buvo paveiktos 4 mM VPA tirpalu, in vivo biomikroskopija 9–12-tą viščiuko embriono vystymosi parą

30 Ląstelės, kurios buvo paveiktos 8 mM VPA tirpalu ir užsodintos ant CAM neturėjo įtakos angiogenezei (11 pav.) Kraujagyslių kiekis, jų orientavimasis kintant paroms nesikeičia. Navikas nesuformuoja tvirtos struktūros, nėra koncentruotas.

11 pav. Ant CAM užsodintos absorbuojančios kempinėlės su U-87 ląstelėmis, kurios buvo paveiktos 8 mM VPA tirpalu, in vivo biomikroskopija 9–12-tą viščiuko embriono vystymosi parą

A, B, C, D atitinkamai 9, 10, 11, 12 para. Skalė 1mm.

31

12 pav. 12-tos paros fluorescencinė stereomikroskopija

A dalyje – CAM, kurioje yra U-87 ląstelių suformuotas navikas. B dalyje – CAM, kurioje yra U-87 ląstelių, kurios paveiktos 4 mM VPA tirpalu, suformuotas navikas. C dalyje – CAM, kurioje buvo U-87

ląstelių, kurios paveiktos 8 mM VPA tirpalu, suformuotas navikas. C dalyje – kvadratu pažymėtas plotas, kurį užėmė suformuotas navikas. A, B, C dalyse ilga rodyklė rodo naviko buvimo vietą. A, B

dalyse trumpos rodyklės rodo stipininį ratelį. Skalė 2 mm.

32

3.2. Histologinė ir histomorfometrinė analizė

Žinoma, jog navikai sukelia CAM sustorėjimą. Atliekant biomikroskopinę in vivo analizę CAM sustorėjimas nebuvo stebėtas, todėl buvo atlikta histologinė analizė ir histomorfometriniai matavimai. Eksperimentų metu buvo tirta, ar U-87 ląstelių ir U-87 ląstelių, kurios buvo paveiktos 4 mM ir 8 mM VPA tirpalu, suformuoti navikai turi poveikį CAM mezenchimai. Taip pat buvo palyginta, ar U-87 ląstelės sukelia statistiškai reikšmingą angiogenezę, palyginus su kontrole ir ar natrio valproatas bei jo skirtingos koncentracijos turėjo įtakos antiangiogenezei.

13 pav. pateiktos eksperimentinės membranos, dažytos hematoksilinu ir eozinu.

13 pav. Eksperimentinės CAM, dažyta hematoksilinu ir eozinu

A dalyje – kontrolinė CAM; B – CAM su U-87 ląstelėmis; C – CAM su 4 mM VPA tirpalu paveiktomis U-87 ląstelėmis; D – 8 mM VPA tirpalu paveiktomis U-87 ląstelėmis. Čia CE – choriono epitelis; AE –

alantojaus epitelis; M – mezenchima; K – kraujagyslė; N – navikas; rodyklėmis pažymėtos susiformavusios kraujagyslės navike. Skalė 200 µm.

33 kontrolę, pvz. 7 pav., 13 pav. B dalyje navikas infiltravo membranos mezenchimos sluoksnį. Taip pat stebimas nemažas šios dalies sustorėjimas. U-87 ląstelių, kurios buvo paveiktos 4 mM VPA tirpalu, suformuotas navikas nesuardė choriono epitelio (13 pav. C). Šiuo atveju mezenchima ne tokia išvešėjusi kaip B atveju, tačiau mezenchimos sluoksnis storesnis palyginus su kontrole (13 pav. C ir A). U-87 ląstelių, kurios buvo paveiktos 8 mM VPA tirpalu, suformuotas navikas nesuardė choriono epitelio ir nesukėlė membranos mezenchimos sustorėjimo (13 pav. D). Norint palyginti CAM sustorėjimą tarp anksčiau minėtų grupių, buvo atlikta histomorfometrinė analizė (14 pav.)

14 pav. Eksperimentinių CAM ploto skirtumai tarp grupių

Tirtos keturios CAM grupės: kontrolė; CAM, ant kurios suformuotas U-87 ląstelių navikas; CAM, ant kurios suformuotas 4 mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas; CAM, ant kurios suformuotas 8

mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas.

*– statistiškai patikimas skirtumas palyginus su kontrole, # – statistiškai patikimas skirtumas palyginus su CAM, ant kurios suformuotas U-87 ląstelių navikas. Čia p< 0,05. Duomenys palyginti su

ANOVA, Tukey kriterijumi. Pateikiami eksperimento vidurkiai (n= 8-10) ± standartinė paklaida. U-87 ląstelių suformuoti navikai sukėlė 53 proc. didesnį CAM sustorėjimą palyginus su kontrole, rezultatas statistiškai patikimas. Eksperimentuose su U-87 ląstelių, kurios paveiktos 4mM VPA tirpalu, suformuoti navikai CAM plotui statistiškai patikimo skirtumo neturėjo palyginus su U-87 ląstelių suformuotais navikais. U-87 ląstelių paveiktų 8 mM VPA tirpalu suformuoti navikai sumažino CAM plotą 46 proc. palyginus su U-87 ląstelių suformuotais navikais, rezultatas statistiškai patikimas, CAM plotas beveik susilygina su kontrolinės membranos plotu.

34 kartus, po 72 val. – 4 kartus, po 120 val. – 5 kartus palyginus su kontrole. Metodas, kaip buvo matuojamas CAM sustorėjimas, nepateiktas. Biomikroskopinės analizės metu nustatyta, kad U-87 ląstelių suformuoti navikai padidino CAM sustorėjimą 6 kartus palyginus su kontrole (38). Autoriai teigia, jog tai galėjo įvykti dėl vėžinių ląstelių sukeliamos edemos, epitelio proliferacijos arba kraujagyslių skaičiaus padidėjimo CAM (82; 38).

35

15 pav. Eksperimentinių CAM kraujagyslių bendro ploto ir kraujagyslių skaičiaus skirtumai tarp grupių (A, B)

Tirtos keturios CAM grupės: kontrolė; CAM, ant kurios suformuotas U-87 ląstelių navikas; CAM, ant kurios suformuotas 4 mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas; CAM, ant kurios suformuotas 8

mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas.

* – statistiškai patikimas skirtumas palyginus su kontrole, # – statistiškai patikimas skirtumas palyginus su CAM, ant kurios suformuotas U-87 ląstelių navikas. Čia p< 0,05. Duomenys palyginti su

36 Nustatyta, jog CAM, ant kurių suformuotas U-87 ląstelių navikas, kraujagyslių bendras plotas padidėjo 55 proc., o kraujagyslių skaičius 56 proc. palyginus su kontrole. CAM, ant kurių suformuotas 4 mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas, kraujagyslių bendras plotas sumažėjo 53 proc., o kraujagyslių skaičius 41 proc. palyginus su CAM, ant kurių suformuotas U-87 ląstelių navikas. Ištyrus 8 mM VPA tirpalo poveikį paaiškėjo, jog kraujagyslių bendras plotas sumažėjo 84 proc., o kraujagyslių skaičius 70 proc. palyginus su CAM ant kurių suformuotas U-87 ląstelių navikas.

Atlikus histologinę ir histomorfometrinę kraujagyslių skaičiaus ir kraujagyslių užimamo ploto analizę pastebėta, jog 4 mM VPA tirpalas slopina angiogenezę, kas nebuvo matoma biomikroskopijos in vivo metu. CAM, ant kurios suformuotas 8 mM VPA tirpalu paveiktų U-87 ląstelių navikas, kraujagyslių skaičius panašus į kontrolinių CAM, o kraujagyslių užimamas plotas 3 kartus mažesnis palyginus su kontrolinėm CAM. Taigi atlikti eksperimentai su U-87 ląstelėmis panaudojant viščiuko embriono CAM modelį patvirtino kitų autorių tyrimų rezultatus, jog VPA mažina angiogenezę.

3.3. Imunohistocheminė viščiukų embrionų chorioalantojinių membranų analizė

37

16 pav. Eksperimentinių CAM kraujagyslių bendro ploto ir kraujagyslių skaičiaus teigiama koreliacija su PCNA teigiamų ląstelių dalimi navikuose (A ir B)

Apskaičiuotas Pearson koreliacijos koeficientas (r), kuris įvertina tiesinio ryšio stiprumą. A dalyje r=0,643; B dalyje r=0,920. Rezultatai statistiškai patikimi. Čia p<0,05.

38 Kiti autoriai pateikia rezultatus apie angiogenezės koreliaciją su navikinių ląstelių proliferacija. Vartanian ir Weidner atliktuose tyrimuose su žmogaus krūties vėžio karcinoma negauta statistiškai teigiama koreliacija tarp angiogenezės ir navikinių ląstelių proliferacijos (83). Kita tyrėjų grupė atlikdama tyrimus su plokščialąsteline plaučių karcinoma nerado ryšio tarp teigiamų navikinių PCNA ląstelių ir naviko kraujagyslių (r = 0.07, p=0.48) (84). Autoriai teigia, jog koreliacijos nebuvimas tarp navikinių ląstelių proliferacijos ir auglyje susiformavusių kraujagyslių galimas dėl to, jog mikrokraujagyslių kiekis ar jų augimas ir navikinių ląstelių proliferacija reguliuojama skirtingais mechanizmais (84). Tipoe tyrėjų grupė atlikdama tyrimus su žmonių patologiniais ir normaliais burnos skruosto pažeidimais gavo panašius rezultatus kaip mes (85). Mokslininkai nustatė, kad PCNA stipriai teigiamai koreliuoja su įvairiais kraujagyslių parametrais (kraujagyslių plotas, kraujagyslių skaičius ploto vienete, kraujagyslių ilgis tūrio vienete, kraujagyslių skerspjūvio ploto vidurkis). Mokslininkai siūlo, kad angiogenezę lemia aktyviai proliferuojančios ir besitransformuojančios burnos epitelio ląstelės. PCNA indeksas ir kraujagyslių parametrai gali būti naudojami kaip diagnostiniai ir prognostiniai rodikliai (85).

39

17 pav. Natrio valproato poveikis VEGF raiškai U-87 ląstelių suformuotuose navikuose

A dalyje – teigiama plonosios žarnos kontrolė; B – CAM su U-87 ląstelėmis; C – CAM su 4 mM VPA tirpalu paveiktomis U-87 ląstelėmis; D – 8 mM VPA tirpalu paveiktomis U-87 ląstelėmis. Čia CE – choriono epitelis; AE – alantojaus epitelis; M – mezenchima; K – kraujagyslė; N – navikas; A dalies

skalė 50 µm; B, C, D skalė 200 µm.

40

18 pav. VEGF raiška naviko kraujagyslėse

A ir B dalyje – U-87 ląstelių suformuotas navikas. Rodyklėmis pažymėtos kraujagyslės, susiformavusios navike. Skalė 50 µm.

18 pav. parodyta VEGF raiška suformuotų navikų kraujagyslių endotelyje, taip pat kraujagyslėse yra eritrocitai su branduoliais.

41

IŠVADOS

1. U-87 glioblastomos ląstelių linijos suformuoti navikai sukėlė ryškią neoangiogenezę viščiuko embriono chorioalantojinėje membranoje, stebimą biomikroskopijos in vivo ir fluorescentinės stereomikroskopijos metodais.

2. Nustatyta, kad U-87 glioblastomos ląstelių linijos suformuotų navikų poveikyje sustorėjo chorioalantojinė membrana, padidėjo kraujagyslių skaičius ir jų plotas. Paveikus U-87 glioblastomos ląsteles 4 mM ir 8 mM natrio valproato tirpalu, patikimai sumažėjo kraujagyslių skaičius ir jų plotas.

3. Ištirta, kad ląsteles paveikus natrio valproato tirpalu, navikinių ląstelių išskiriamo kraujagyslių endotelio augimo veiksnio raiška sumažėjo.

42

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Wilson TA, Karajannis MA, Harter DH. Glioblastoma multiforme: State of the art and future therapeutics. Surgical neurology international 2014; 5: 64.

2. Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nature 2001; 1(3):194-202.

3. Cinatl J, Driever PH, Kotchetkov R, Pouckova P, Kornhuber B ir kt. Sodium valproate inhibits in vivo growth of human neuroblastoma cell. Anticancer drugs 1997; 8(10):958-63.

4. Chavez-Blanco A, Perez-Plasencia C, Perez-Cardenas E, Carrasco-Legleu C, Rangel-Lopez E, Segura-Pacheco B ir kt. Antineoplastic effects of the DNA methylation inhibitor hydralazine and the histone deacetylase inhibitor valproic acid in cancer cell lines. Cancer cell international 2006; 6:2.

5. Dexuan G, Qinghua X, Jiaju L, Hui Z. Chronic administration of valproic acid inhibits PC3 cell growth by suppressing tumor angiogenesis in vivo. Journal of urology 2007; 14(9):838-45.

6. Shu Q, Antalffy B, Su JM, Adesina A, Ou CN, Pietsch T ir kt. Valproic Acid prolongs survival time of severe combined immunodeficient mice bearing intracerebellar orthotopic medulloblastoma xenografts. Clinical cancer research 2006; 12(15):4687-94.

7. Yang Q, Tian Y, Liu S, Zeine R, Chlenski A, Salwen HR ir kt. Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is an effective antiangiogenesis strategy in neuroblastoma. Cancer research 2007; 67(4):1716-24.

8. Osuka S, Takano S, Watanabe S, Ishikawa E, Yamamoto T, Matsumura A. Valproic acid inhibits angiogenesis in vitro and glioma angiogenesis in vivo in the brain. Neurologia medico-chirurgica 2012; 52(4):186-9.

9. Cunha AM, Nascimento FS, Amaral JC, Konig S, Takiya CM, M Neto V ir kt. A murine model of xenotransplantation of human glioblastoma with immunosuppression by orogastric cyclosporin. Arquivos de neuro-psiquiatria 2011; 69(1):112-7.

10. Candolfi M, Curtin JF, Nichols WS, Muhammad AG, King GD, Pluhar GE. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of neuro-oncology 2007; 85(2):133-48.

11. Clarke J, Butowski N, Chang S. Recent advances in therapy for glioblastoma. Archives of neurology 2010; 67:279–83.

43 13. Wainwright DA, Nigam P, Thaci B, Dey M, Lesniak MS. Recent developments on immunotherapy for

brain cancer. Expert opinion on emerging drugs 2012; 17:181–202.

14. Karcher S, Steiner HH, Ahmadi R, Zoubaa S, Vasvari G, Bauer H ir kt. Different angiogenic phenotypes in primary and secondary glioblastomas. International journal of cancer 2006; 118:2182–9. 15. Urbańska K, Sokołowska J, Szmidt M. & Sysa P. Glioblastoma multiforme – an

overview. Contemporary Oncology 2014; 18(5):307–312.

16. Kabat GC, Etgen AM, Rohan TE. Do steroid hormones play a role in the etiology of glioma? Cancer epidemiology biomarkers and prevention 2010; (10):2421-7.

17. Cvetkoivč-Dožič D, Skender-Gazibara M, Dožič S. Morphological and molecular features of diffuse infiltrating astrocytoma. Archive of oncology 2004; 12:38–9.

18. Kleihues P, Ohgaki H. Primary and secondary glioblastomas: from concept to clinical diagnosis. Neuro oncology 1999; 1:44–51.

19. Schultz S, Pinsky GS, Wu NC, Chamberlain MC, Rodrigo AS, Martin SE. Fine needle aspiration diagnosis of extracranial glioblastoma multiforme: Case report and review of the literature. Cytojournal 2005; 2:19.

20. Linkous AG, Yazlovitskaya EM. Angiogenesis in glioblastoma multiforme: navigating the maze. Anti-cancer agents in medicinal chemistry 2011; 11:712–8.

21. Rojiani AM, Dorovini-Zis K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. Journal of neurosurgery 1996; 85:1078–84.

22. Aamir A, Ul-Haque A. Morphological spectrum of vascular changes in glioblastoma multiforme. International journal of experimental pathology 2006; 4:1–5.

23. Kleihues P, Burger PC, Collins VP, Cavenee WK. Pathology and genetics of tumours of the nervous system. Lyon: IARC Press 2000.

24. Shoin K, Yamashita J, Enkaku F, Sasaki T, Tanaka M, Endo Y. Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma. Japanese journal of cancer research 1991; 82(10):1165-70. 25. Ribatti D, Vacca A, Roncali L, Dammacco F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model

for in vivo research on angiogenesis. The international journal of developmental biology 1996; 40: 1189 - 1197.

26. Romanoff AL. The extraembryonic membranes. In: The avian embryo: Structural and functional development. Macmilian 1960; 1039-1141.

27. Ausprunk D, Knighton D, Folkman J. Differentiation of vascular endothelium in the chick chorioallantois: a structural and autoradiographic study. Development biology 1974; 38:237-249. 28. Boller C, Prado MR, Toledo M, Da Lozzo Garbelini MC, Ortolani – Machado CF, Nakashima T ir kt.

44 Chicken Chorioallantoic Membrane ex ovo assay. International journal of current microbiology and applied sciences 2015; 4(8):231- 243.

29. Folkman J. Angiogenesis. Annual review of medicine 2006; 57:1 18.

30. Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86(3):353-64.

31. Ribatti D, Nico B, Vacca A, Roncali L, Burri L, Djonov V. Chorioallantoic membrane capillary bed: A useful target for studying angiogenesis and anti-angiogenesis in vivo. The anatomical record 2001; 264:317–324.

32. Verhoelst E. Structural Analysis of the Angiogenesis in the Chicken Chorioallantoic Membrane 2011. [Žiūrėta: 2016-03-20]. Prieiga per internetą: https://lirias.kuleuven.be/bitstream/123456789/293316/1/. 33. Yuan YJ, Xu K, Wu W, Luo Q, Yu JL. Application of the Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

in Neurosurgery Disease. International journal of medical sciences 2014; 11(12):1275-1281.

34. Hurst EW, Barbara C, McLennan GC. A note on the survival and growth of human and rabbit tissues (normal and neoplastic) on the chorio-allantois of the chick and duck embyo. Australian journal of experimental biology and medical science 1939; Vol. 17 Issue 2, p215-224.

35. Vogel HB, Berry RG. Chorioallantoic membrane heterotransplantation of human brain tumors. International journal of cancer journal international du cancer 1975; 15:401-8.

36. Strojnik T, Kavalar R, Barone TA, Plunkett RJ. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer research 2010; 30:4851-60.

37. Martinho O, Silva-Oliveira R, Miranda-Gonçalves V, Clara C, Almeida JR, Carvalho AL ir kt. In Vitro and In Vivo Analysis of RTK Inhibitor Efficacy and Identification of Its Novel Targets in Glioblastomas. Translational oncology 2013; 6:187-96.

38. Hagedorn M, Javerzat S, Gilges D, Meyre A, De Lafarge B, Eichmann A ir kt. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the national academy of sciences 2005; 102(5):1643–1648.

39. Ribatti D. The chick embryo chorioallantoic membrane in the study of tumor angiogenesis. Romanian journal of morphology and embryology 2008; 49(2):131–135.

40. Cea V, Sala C, Verpelli C. Antiangiogenic Therapy for Glioma. Journal of signal transduction. 2012; 483040.

41. Brem S, Cotran R, Folkman J. Tumor angiogenesis: a quantitative method for histologic grading. Journal of the national cancer institute 1972; 48(2):347-56.

45 43. Tandle A, Blazer DG, Libutti SK. Antiangiogenic gene therapy of cancer: recent developments.

Journal of translational medicine 2004; 2(1):22.

44. Dameron KM, Volpert OV, Tainsky MA, Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994; 265(5178):1582-4.

45. Good DJ, Polverini PJ, Rastinejad F, Le Beau MM, Lemons RS ir kt. A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 1990; 87(17): 6624–6628.

46. Fang J, Shing Y, Wiederschain D, Yan L, Butterfield C, Jackson G ir kt. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the national academy of Sciences of the United States of America 2000; 97(8): 3884–3889.

47. Martens T, Laabs Y, Günther HS. Inhibition of glioblastoma growth in a highly invasive nude mouse model can be achieved by targeting epidermal growth factor receptor but not vascular endothelial growth factor receptor- 2. Clinical cancer research 2008; 14(17):5447-58.

48. Inoue S, Ichikawa T, Kurozumi K, Maruo T, Onishi M, Yoshida K ir kt. Novel animal glioma models that separately exhibit two different invasive and angiogenic phenotypes of human glioblastomas. World neurosurgery 2012; 78(6):670-82.

49. The Jackson Cancer Modeling Group. Quantitative Cancer Research 2011. [Žiūrėta: 2016-03-17]. Prieiga per internetą: http://www.math.lsa.umich.edu/~tjacks/research.html.

50. Gotnik KJ, Verheul HM. Anti-angiogenic tyrosine kinase inhibitors: what is their mechanism of action? Angiogenesis 2010; 13(1):1-14.

51. Dvorak HF, Orenstein NS, Carvalho AC, Churchill WH, Dvorak AM, Galli SJ ir kt. Induction of a fibrin-gel investment: an early event in line 10 hepatocarcinoma growth mediated by tumor-secreted products. Journal of immunology 1979; 122(1):166-74.

52. Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, Dvorak AM. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. American journal of pathology 1995; 146(5):1029-39.

53. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine review 1997; 18(1):4-25.

54. Benjamin LE, Golijanin D, Itin A, Pode D. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal. Journal of clinical investivation 1999; 103(2):159–165.

46 56. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis.

American journal of cell physiology 2001; 280(6):C1358-66.

57. Gupta K, Kshirsagar S, Li W, Gui L, Ramakrishnan S, Gupta P. ir kt. VEGF prevents apoptosis of human microvascular endothelial cells via opposing effects on MAPK/ERK and SAPK/JNK signaling. Experimental cell research 1999; 247(2):495-504.

58. Goel HL, Mercurio AM. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews. Cancer 2013; 13(12):871-82 59. Ido K, Nakagawa T, Sakuma T, Takeuchi H, Sato K, Kubota T. Expression of vascular endothelial

growth factor-A and mRNA stability factor HuR in human astrocytic tumors. Neuropathology 2008; 28(6):604-11.

60. Nakamura K, Martin KC, Jackson JK, Beppu K, Woo CW, Thiele CJ. Brain-derived neurotrophic factor activation of TrkB induces vascular endothelial growth factor expression via hypoxia-inducible factor-1α in neuroblastoma cells. Cancer research 2006; 66(8):4249-55.

61. Tan C, Cruet-Hennequart S, Troussard A, Fazli L, Costello P, Sutton K ir kt. Regulation of tumor angiogenesis by integrin-linked kinase (ILK). Cancer cell 2004; 5(1):79-90.

62. Plate KH, Breier G, Weich HA, Risau W. Vascular endothelial growth factor is a potential tumour angiogenssis factor in human gliomas in vivo. Nature 1992; 359(6398):845-8.

63. Tufan AC, Satiroglu-Tufan NL. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model system for the study of tumor angiogenesis, invasion and development of anti-angiogenic agents. Current cancer drug targets 2005; 5(4):249-66.

64. Balanezhad SZ, Parivar K, Baharara J. The synergistic effects of sodium valproate and extremely low frequency electromagnetic field on angiogenesis. Scientific research and essays 2011; 6(1):1-5.

65. Shawa RN, Arbiserb JK, Offermannoc MK. Valporic acid induces human herpesvirus 8 lytic gene expression in BCBL-1 cells. AIDS 2000; 14(7): 899.

66. Ghodke-Puranik Y, Thorn CF, Lamba JK, Leeder JS, Song W, Birnbaum ir kt. Valproic acid pathway: pharmacokinetics and pharmacodynamics. Pharmacogenet genomics 2013; 23:236–41.

67. Weller M, Gorlia T, Cairncross JG, van den Bent MJ, Mason W, Belanger K ir kt. Prolonged survival with valproic acid use in the EORTC/NCIC temozolomide trial for glioblastoma. Neurology 2011; 77:1156–64.

68. Liu T, Kuljaca S, Tee A, Marshall G.M. Histone deacetylase inhibitors: multifunctional anticancer agents. Cancer treatment reviews 2006; 32:157-165

69. Kim SH, Jeong JW, Park JA, Lee JW, Seo JH ir kt. Regulation of the HIF-1alpha stability by histone deacetylases. Oncology reports 2007; 17:647-651.

47 71. Fath DM, Kong X, Liang D, Lin Z, Chou A, Jiang Y ir kt. Histone deacetylase inhibitors repress the transactivation potential of hypoxia-inducible factors independently of direct acetylation of HIF-alpha. The journal of biological chemistry 2006; 281:13612-13619.

72. Kong X, Lin Z, Liang D, Fath D, Sang N, Caro J. Histone deacetylase inhibitors induce VHL and ubiquitin-independent proteasomal degradation of hypoxia-inducible factor 1alpha. Molecular and cellular biology 2006; 26:2019-2028.

73. Ellis L, Hammers H, Pili R. Targeting tumor angiogenesis with histone deacetylase inhibitors. Cancer letters 2009; 280:145-153.

74. Isenberg JS, Jia Y, Field L, Ridnour LA, Sparatore A, Del Soldato P ir kt. Modulation of angiogenesis by dithiolethione-modified NSAIDs and valproic acid. British journal of pharmacology 2007; 151:63-72.

75. Zgouras D, Becker U, Loitsch S, Stein J. Modulation of angiogenesis-related protein synthesis by valproic acid. Biochemical and biophysical research communications 2004; 316:693-697.

76. Fischer AH, Jacobson KA, Rose J, Zeller R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell section. Cold spring harbour protocol 2008;pdb.prot4986

77. Bobek V, Plachy J, Pinterova D, Kolostova K, Boubelik M, Jiang P, Yang M, Hoffman RM. Development of a green fluorescent protein metastatic-cancer chick-embryo drug-screen mode. Clinical and experimental metastasis 2004; 21(4):347-52.

78. Gordon JR, Quigley JP. Early spontaneous metastasis in the human epidermoid carcinoma Hep3/chick embryo model: Contribution of incidental colonization. International journal of cancer 1986; 38(3):437-44.

79. Turtoi A, Peixoto P, Castronovo V, Bellahcène A. Histone deacetylases and cancer-associated angiogenesis: current understanding of the biology and clinical perspectives. Critical Reviews in Oncogenesis 2015; 20(1-2):119-37.

80. Stiborova M, Eckschlager T, Poljakova J, Hrabeta J, Adam V, Kizek R, Frei E. The synergistic effects of DNA-targeted chemotherapeutics and histone deacetylase inhibitors as therapeutic strategies for cancer treatment. Current medicinal chemistry 2012; 19(25):4218-38.

81. Zhang Y, Zhang N, Dai B, Liu M, Sawaya R, Xie K, Huang S. FoxM1B transcriptionally regulates vascular endothelial growth factor expression and promotes the angiogenesis and growth of glioma cells. Cancer research 2008; 1;68(21):8733-42.

48 83. Vartanian RK, Weidner N. Correlation of Intratumoral Endothelial Cell Proliferation with Microvessel Density (Tumor Angiogenesis) and Tumor Cell Proliferation in Breast Carcinoma. The American journal of pathology 1994; 144(6):1188-94.

84. Mattern J, Koomägi R, Volm M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. British journal of cancer 1996; 73(7):931-4.

85. Tipoe GL, Jin Y, White FH. The relationship between vascularity and cell proliferation in human normal and pathological lesions of the oral cheek epithelium. European journal of cancer 1996; 32B(1):24-31.

86. New M, Olzscha H, La Thangue NB. HDAC inhibitor-based therapies: Can we interpret the code? Molecular oncology 2012; 6(6):637-56.

87. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, ir kt. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 1999; 399(6733):271-5.