LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Eglė Rimkutė
Šunų pieno liaukos navikų augimo ant viščiuko chorioalantojinės
membranos ypatumai
Canine mammary gland tumors growth peculiarity on chicken
chorioallantoic membrane
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė Darbo asistentė: Raminta Mozūraitė
2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų pieno liaukos navikų augimo ant viščiuko chorioalantojinės membranos ypatumai“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 4 SANTRUMPOS ... 5 ĮVADAS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 81.1 Viščiuko chorioalantojinės membranos struktūra ir vystymasis ... 8
1.2 Chorioalantojinės membranos kraujagyslių morfologija ir angiogenezė ... 9
1.3 Metodo privalumai ir trūkumai... 10
1.4 Pieno liaukos navikai ... 12
1.5 Navikų tipai ... 14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 15
2.1 Apvaisintų kiaušinių inkubavimas ir jo sąlygos ... 15
2.2 Langelių atidarymas, pasiruošimas sodinti medžiagą ... 16
2.3 Pieno liaukos navikų transplantavimas, inkubavimas, fiksavimas, įliejimas į parafino blokus ... 17
2.4 Dažymas hematoksilino eozino dažais ... 18
2.5 Imunohistocheminis dažymas bei tyrimas ... 20
2.6 Morfometrinė preparatų analizė ... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
3.1 Histologinis ir imunohistocheminis ksenograftinio modelio vertinimas ... 23
3.2 Morfometrinė pakitusios CAM analizė ... 25
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS ... 33
PADĖKA ... 34
4
SANTRAUKA
Šunų pieno liaukos navikų augimo ant viščiuko chorioalantojinės membranos ypatumai Eglė Rimkutė
Magistro baigiamasis darbas
Viščiuko chorioalantojinės membranos modelis tinkamas studijuoti įvairius patologinius procesus. Šiame darbe analizuojami trijų tipų kalių pieno liaukos navikai: karcinomos komplekso, adenokarcinomos bei intralatakinės adenokarcinomos komplekso navikai, jų daroma įtaka viščiuko chorioalantojinei membranai po naviko transplantacijos. Darbe naudojama histologinė analizė, membranos pokyčiai vertinami ją nudažius hematokslinu – eozinu, taip pat imunohistocheminiais žymenimis. Analizuota membranos storio, membranos epitelio storio kitimai bei kraujagyslių skaičiaus kitimas. Gautus rezultatus apibendrinus nustatyta, kad į transplantuotą naviką membrana ir jos epitelis reagavo sustorėjimu. Taip pat suskaičiuotas statistiškai reikšmingas kraujagyslių skaičiaus padidėjimas.
Raktažodžiai: Viščiuko chorioalantojinė membrana; pieno liaukos navikai; imunohistocheminis dažymas.
SUMMARY
Canine mammary gland tumors growth peculiarity on chicken chorioallantoic membrane Eglė Rimkutė
Master‘s Thesis
Chicken chorioallantoic membrane model is suitable to study various pathological processes. This Master‘s Thesis analyzes three types of canine mammary gland tumors: carcinoma-complex type, adenocarcinoma and intratubular adenocarcinoma-carcinoma-complex type tumor, the influence to chick chorioallantoic membrane after tumor transplantation. In this Master‘s Thesis we used histological analysis, membrane changes assessed by staining hematoxylin-eosin, and immunohistochemical markers. Analysis of the thickness of the membrane, the membrane epithelial thickness variations and changes in the number of blood vessels were made. The results showed that transplanted tumor causes membrane and epithelium reaction. Statistical significant changes were set, when counting number of blood vessels, epithelium thickness variation and thickness of the membrane, All structures made statistical significant changes when tumor was transplanted on the CAM.
5
SANTRUMPOS
CAM- viščiuko chorioalantojinė membrana (angl. chick chorioallantoic membrane) YS- trynio maišas (angl. yolk sack)
LAA- kairioji alantojinė arterija (angl. left alantoic artery) RAA- dešinioji alantojinė arterija (angl. right alantoic artery) HE- Hematoksilino-eozino dažymo metodas
6
ĮVADAS
Normalus eukariotinio organizmo audinių augimas - pusiausvyra tarp naujų ląstelių atsinaujinimo ir senųjų žūties. Susidarant navikams, ląstelių atsinaujinimo procesas viršija fiziologinius organizmo poreikius. Hiperplazija yra normali audinių reakcija į kenksmingas sąlygas, tačiau tai yra grįžtamas procesas. Kuomet ląstelių skaičiaus didėjimas tampa lokaliai uždara forma, tuomet sufromuojamas gerybinis navikas. Piktybinis navikas ar vėžys apibrėžiamas, kaip būklė, kurios metu invazinės ląstelės sėkmingai dauginasi sveikuose audiniuose tam tikroje vietoje ar kituose audiniuose ir organuose sukeldamos metastazes. (1)
Navikinių susirgimų skaičius didėja visame pasaulyje, ne tik žmonių, bet ir gyvūnų tarpe. (2) Lyginant su žmonėmis, navikai smulkiems gyvūnams dėl greitesnės medžiagų apykaitos progresuoja greičiau.( http://www.nmvrvi.lt/lt/naujienos/355/žiūrėta 2015-08-16)
Šveicarijos mokslininkų 1955-2008 metais atlikto tyrimo duomenimis, ištyrus 121963 šunis buvo nustatyti 67943 navikai, iš kurių 47,07 proc. buvo piktybiniai. Labiausiai paplitusi naviko lokalizacijos vieta buvo oda (37,05 proc.) ir pieno liauka 25,33 proc. (2)
Šiuolaikinėje medicinoje norint nustatyti audinio atsaką į tam tikrą veiksmą, naudojami žinduolių modeliai, tokie kaip pelės, žiurkės arba šunys dažnai sulaukia kritikos dėl etinių priežasčių, taip pat žinduolių modeliai naudojant laboratorinius gyvūnus yra brangūs, tiek laiko, tiek laboratorinės įrangos prasme. Sunku yra implantuoti įvairias medžiagas į organizmą, tam reikia specialios priežiūros, chirurginių įrankių, laboratorijų. Sunku yra stebėti ir vertinti tiesioginę organizmo ir audinių reakciją į tam tikras medžiagas. (3)
Eksperimentinis viščiuko embriono modelis žinomas gana seniai. Jau 1913 m. J. B. Murphy eksperimentuose su navikais pirmą kartą panaudojo chorioalantojinę viščiuko embriono membraną (CAM). (4) CAM yra geras alternatyvus in vivo modelis leidžiantis studijuoti navikų piktybiškumą ir progresavimą. (5) CAM metodas yra greitas, paprastas ir nebrangus būdas leidžiantis stebėti mėginius tiesiogiai, mėginio patekimą, augimą, reakciją mėginio vietoje.
7 Savo baigiamąjame darbe apžvelgsiu kalių pieno liaukos navikų elgesį, panaudojant viščiuko chorioalantojinės membranos modelį.
Darbo tikslas: Išanalizuoti šunų pieno liaukos navikų augimo ypatumus ant viščiuko chorioalantojinės membranos, atsiradusius membranos pokyčius po navikų transplantacijos.
Uždaviniai:
1. Išanalizuoti literatūrą apie viščiuko chorioalantojinės membranos modelio naudojimą analizuojant šunų pieno liaukos navikus.
2. Atlikti pieno liaukos navikų auginimo ant CAM eksperimentus. 3. Atlikti histologinius ir imunohistocheminius dažymus.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Viščiuko chorioalantojinės membranos struktūra ir vystymasis
Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana (CAM) tai ekstraembrioninė membrana, kuri atsakinga už dujų apykaitą tankiame membranos kapiliarų tinkle.(7,8)
Viščiuko vystymasis iki išsiritimo trunka 21 dieną. (7) Vystymosi laikotarpiu susiformuoja trys ekstraembrioninės membranos: trynio maišo membrana, amnionas, chorioalantojinė membrana. CAM susiformuoja iš choriono ir alantojo ir ją sudaro trys sluoksniai: ektoderma (iš choriono), mezoderma ir endoderma (iš alantojo). (9)
Trečią su puse inkubacijos dieną iš užpakalinės žarnos endodermio ventralinės sienos susiformuoja viščiuko embriono alantojas. Ketvirtą inkubacijos dieną jis išsiverčia iš kūno į ekstraembrioninį celomą. Nuo ketvirtos iki dešimtos inkubacijos dienos alantojinės kraujagyslės labai greitai didėja. Šio proceso metu alantojo mezoderminis sluoksnis susijungia su gretimu choriono mezoderminiu sluoksniu ir tampa CAM. (7)
1 pav. Apvaisinto kiaušinio anatominių struktūrų schematinis vaizdas. (10) CAM pažymėta
raudonai.
9
1.2 Chorioalantojinės membranos kraujagyslių morfologija ir angiogenezė
Angiogenezė- naujų kraujagyslių vystymasis iš senųjų, kurie yra inicijuojami signalinimo keliais, koordinuojami veikiant specifinėms molekulėms, hemodinaminėms jėgoms, endotelinėms ir periendotelinėms ląstelėms. Procesas apima adheziją, migraciją, endotelinių ir periendotelinių ląstelių taikinių išgyvenamumą. Veiksniai, turintys įtakos bet kuriam iš šių procesų taip pat gali daryti įtaką angiogenezei, teigiamai (proangiogenezė) arba neigiamai (antiangiogenezė). Kraujagyslinis dangalas ir CAM yra dvi naudotinos struktūros angiogenezės ir antiangiogenezės tyrimams, kadangi jos yra atsakingos už abudu: tarpkraujagyslinį ir vietinį tikslo pasiekimą, abu šie veiksniai yra sąlyginai greitai ištiriami ir gali būti lengvai pritaikomi nuo angiogenezės priklausomų procesų studijoms, tokioms kaip navikų auginimas. (11)
Pastaruosius kelis metus viščiuko embrionas tapo prieinamas, kaip modelis studijuoti kraujagyslių vystymosi biologiją. Viščiuko embriono sisteminių ir kvėpavimo kraujagyslių reaktyvumas yra labai tyrinėjamas. (12,13,14)
Vystantis embrionui žinduolių placenta dalyvauja, kaip organas, kuriuo cirkuliuoja mitybinės medžiagos, kvėpavimo dujos ir šalinimo produktai tarp motinos ir vaisiaus sistemų, tuo metu paukščių embrionas neturi apribotos placentos, tačiau jis yra aprūpintas dujų apykaitos organu- CAM ir mitybiniu organu- trynio maišo membrana (YS). Įdomu tai, kad šios dvi ekstraembrioninės membranos yra atskirtos dvejomis atskiromis arterinėmis sistemomis. CAM yra aprūpintas dvejomis arterijomis (alantojinės arterijos(LAA ir RAA)) ateinančiomis iš dešiniosios ir kairiosios klubinės arterijų. LAA ir RAA atneša bedeguonį kraują į CAM, kur prisotinimas deguonimi vyksta per lukštą ir alantojinėmis venomis į embrioną grįžta kraujas prisotintas deguonimi. (12,13) YS aprūpina viščiuko ambrioną mitybinėmis medžiagomis, reikalingomis jo augimui. Baltymai, riebalai, angliavandeniai ir mineralai kaupiami vištos kiaušinio trynio maiše būsimam embrionui. (12,15)
Ankstyvoje embriono stadijoje arterijos ir venos morfologiškai nesiskiria iki kol šios kraujagyslės prisijungia preendotelio palaikančiąsias ląsteles. Manoma, jog arterijų ir venų diferenciacijai įtakos turi hemodinaminės jėgos ir šios kraujagyslės formuojasi iš pirminio kraujagyslių tinklo. (11)
10 dieną, prieš pat viščiuko išsiritimą. (16)
CAM yra gausiai vaskuliarizuota, kraujagyslės išsivysto mezoderminiame sluoksnyje, jungiasi su embrionine kraujotaka per alantojo arterijas ir venas. (7) Embriono arterijų schematinis vaizdas pavaizduotas 2 pav.
2 pav. Viščiuko embriono pagrindinių arterijų schematinis vaizdas (13) Art- arterija; CR- kranialinė
inkstų; LDA- kairysis ductus arteriosus; RDA- dešinysis ductus arteriosus, taip pat nurodytos kairioji ir dešinioji alantojinės arterijos; trynio maišo arterija bei kitos arterijos.
1.3 Metodo privalumai ir trūkumai 1.3.1 Privalumai:
Viščiuko chorioalantijinės membranos modelis siūlo daugiau pranašumų lyginant su kitais in
vivo modeliais tinkamais studijuoti angiogenezę ir kraujagyslių biologiją. (17) Patrycja
Nowak-Sliwinska ir kt. autoriai teigia, kad pagrindinis modelio pranašumas, tai prieinamumas ir spartus augimas.
CAM vystosi per trumpą laiką nuo mažos, nevaskuliarizuotos membranos iki struktūros, kuri apima visą vidinį apvalkalo paviršių susidarant tankiam kraujagyslių tinklui. Šio proceso trukmė apima vos 7 dienas (3-10 dienas). (17)
Šis modelis tinkamas studijuoti patologinius procesus, kuriuos sukelia citokinai, hormonai, vaistai, transplantuoti audiniai, izoliuotos ląstelės ar kiti agentai. (17)
11 1.3.2 Trūkumai:
Didžiausiais tyrimo trūkumas yra tas, kad CAM turi gerai išvystytą kraujagyslių tinklą ir galima supainioti atsitiktinę vazodiliataciją dėl atliekamos manipuliacijos nuo tiriamos substancijos daromo efekto. Kitas ribojantis veiksnys tai yra nespecifinė uždegiminė reakcija „skiepo“ vietoje, įskaitant ir antrinį vazoproliferacinį atsaką, galinti daryti įtaką rezultatams. Rūšiai būdingi specifiniai skirtumai ir paukščio specifiniai reagentai (taipogi kaip apibrėžta genominė informacija) gali tapti dideliu trūkumu. (18)
1 Lentelė. Privalumų ir trūkumų palyginimas tarp CAM ir pelės modelių. (19) In vivo
modelis
Privalumai Trūkumai
CAM
Trumpas eksperimentinis laikas (dienomis) Trumpas stebėjimo laikas (dienomis) Nebrangus metodas Negalima įvertinti imuninio atsako į
naviko ląsteles
Lengvai atkuriamas ir yra didelio našumo Staigūs morfologiniai pokyčiai Uždara sistema—galimybė tyrinėti
terapines medžiagas mažais kiekiais
Specialių antikūnų trūkumas
Imunodeficitinė aplinka -
Galima atlikti daug testų ant vienos membranos
Gerai žinoma biologija ir fiziologija Galimas tiesioginis in vivo stebėjimas Gyvūnai neturi būti prislopinti
Gali būti naudojamos pirminės žmonių ląstelių linijos
12 In vivo modelis Privalumai Trūkumai Pelės tyrimas
Gerai žinoma fiziologija ir biologija, tačiau visa tai komplikuota
Ilgas eksperimentinis periodas (mėnesiais ar metais)
Galimas in vivo stebėjimas Brangus metodas
Charakterizuojama genetinė kilmė Imuninė sistema gerai išsivysčiusi
- Atluriamumas yra brangus ir
sudėtingas
Eksperimentui reikalingas didelis gyvūnų kiekis
Gyvūnai turi būti nuraminami
1 lentelės tęsinys. Privalumų ir trūkumų palyginimas tarp CAM ir pelės modelių. (19)
1.4 Pieno liaukos navikai
Pieno liaukos navikai yra bene dažniausiai pasitaikantys vėžiniai susirgimai kalėms, kuri sudaro vieną didelę navikinių susirgimų grupę remiantis naviko morfologija ir biologine elgsena. (18,20)
M
erlo ir kt. autoriai (21) teigia, kad šie navikai sudaro apytiksliai 50 proc. pranešamų atvejų. Dauguma atvejų kalės išlieka kliniškai sveikos, o navikas diagnozuojamas šeimininkams užčiuopus guzelį ar įprastos apžiūros metu veterinarijos klinikoje. (20)Pagrindiniai faktoriai, turintys įtakos pieno liaukų navikiniams procesams yra amžius, veislė, genetinė predispozicija, hormonai, augimo faktoriai, dieta ir kiti faktoriai. (22)
Amžius: dažniausiai serga nekastruotos vidutinio ar vyresnio amžiaus kalės. (22,23)
13 Veislinė predispozicija: Kai kurios veislės kaip bokseriai, Anglų springerspanieliai ir taksai išskiriami, kaip padidintos rizikos veislės. (24) Taip pat statistiškai reikšminga predispozicija sirgti pieno liaukos navikais išskiriama pudeliams, Anglų kokerspanieliams. (25)
„Kaip ir kiekvieno audinio ar organo navikai skiriami į gerybinius ir piktybinius. Šiems navikams būdingas įvairus histomorfologinis vaizdas“. (26) Išskirtinumas tas, kad priešingai nei žmonių pieno liaukos navikams, kalių pieno liaukos navikams būdinga tai, kad savo struktūroje gali būti randamas kremzlinis arba kaulinis audinys. (9)
1974m. Buvo išleista pirmoji publikacija klasifikuojanti kalių pieno liaukos neoplazijas ir displazijas. Jos pakeitimai pateikti 1999m. Ši klasifikacija buvo sudaryta remiantis morfologiniu naviko vaizdu. Šiuo metu pateikiama nauja klasifikacija. (9)
Naviko tipas: Epiteliniai pieno liaukos piktybiniai navikai: karcinoma in situ; paprastoji karcinoma- tubulinė, tubuliopapilinė, cistinė-papilinė, kribriforminė; Mikropapilinė invazinė karcinoma; solidinė karcinoma; komendokarcinoma; anaplastinė karcinoma; karcinoma- kilusi iš adenomos komplekso ar mišraus naviko; karcinoma- kompleksinis tipas- epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis-gerybinis; karcinoma ir piktybinė mioepitelioma- epitelinis ir mioepitelinis komponentai yra piktybiniai; karcinoma- mišrus tipas- epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis-gerybinis ir yra mezenchiminis komponentas- kremzlinis ir kaulinis audiniai; latakinė karcinoma- epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš latakinės adenomos; intralatakinė papilinė karcinoma epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš intralatakinės papilinės adenomos. (9)
Epiteliniai piktybiniai pieno liaukos navikai- specifiniai tipai: plokščialąstelinė karcinoma; adenoplokščialąstelė karcinoma; mucinus gaminanti karcinoma; lipidų turinti karcinoma; šeivinių ląstelių karcinoma; piktybinė mioepitelioma; plokščialąstelinės karcinomos- šeivinių ląstelių variantas; uždegiminė karcinoma. (9)
Piktybiniai mezenchiminiai pieno liaukos navikai: osteosarkoma; chondrosarkoma; fibrosarkoma; hemangiosarkoma; kt sarkomos. (9)
Piktybinis mišrus pieno liaukos navikas: karcinosarkoma. (9)
Gerybiniai pieno liaukos navikai: paprastoji adenoma- intralatakinė papilinė. (9)
Pieno liaukos hiperplazija, displazija: latakų ektazija; skilčių hiperplazija; tolygi hiperplazija (aktyvi, fibrozinė); epiteliozė; papilomatozė; fibroadenominiai pakitimai; ginekomastija.
14
1.5 Navikų tipai
1. Karcinomos komplekso tipas:
Šis naviko tipas susideda iš pyktybino epitelio ir gerybino myoepitelinio komponentų. Navikas charakterizuojamas dviejų ląstelių tipų buvimu, kurios apsuptos jungiamojo audinio stroma. Pirmasis sluoksnis epitelinių ląstelių, kurios yra išsidėstę nereguliariais kanalėliais vienu ar keliais sluoksniais kubiškųjų ar stulpiškųjų ląstelių su nepakankamu ar vidutinišku kiekiu eozinofilinės citoplazmos. Epitelinių ląstelių nekrozė gali būti židininė ar daugiažidininė ir gali būti diferencijuojami raginių ląstelių židiniai. Kitos ląstelės yra verpstės formos ląstelės (myoepitelinės) su jungiamuoju audiniu, išsidėsčiusios netaisyklingais pluoštais su fibriline bazofiline matriksa. Šios ląstelės yra su menkai išreikštomis ribomis, nepakankama ar vidutiniškai išreikšta homogeniška eozinofiline citoplazma, ir apvaliais ar ovaliais branduoliais su smulkiu chromatinu ir branduolėliu. Naviko periferinėje dalyje galima matyti židinėlių susidedančių iš limfocitų ir plazmos ląstelių. Karcinomos komplekso tipo navikai turi būti diferencijuojami nuo adenomos komplekso navikų pagal didesnį ląstelių skaičių bei epitelinio komponento ląstelių skirtumus, didesnio mitotinio indekso, nekrozės židinių ir infiltracinio augimo. (9)
2. Adenokarcinoma:
„Šiam tipui labiau būdinga tai, epitelinės ląstelės dėstosi lakštais, grupėmis, kai kada- pavieniui. Ląstelės apvalios su apvaliais ar ovaliais branduoliais, išsidėsčiusiais ekscentriškai, vidutiniškai gausia bazofiline citoplazma, kurioje gali būti amofiško bazofiliško sereto arba skaidrių vakuolių. Padidėjęs branduolio ir citoplazmos santykis, vidutiniškai ar labai varijuoja branduolio ir ląstelių dydis, branduolių susigrūdimas, dideli, ryškūs, dauginiai, nenormalios formos branduolėliai. Gali būti randamos dvibranduolės, daugiabranduolės ląstelės, mitozės.“ (26)
3. Intralatakinis adenokarcinomos kompleksas:
15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Mėginiai eksperimentui rinkti UAB „Jakovo veterinarijos centras“ (Gerosios Vilties g. 1, Vilnius ir Liepkalnio g. 112, Vilnius) ir UAB „Viverus“ Kėdainių veterinarija (Gegučių g.15-105, Kėdainiai) smulkių gyvūnų veterinarijos klinikose.
Šiame darbe pasirinkau pieno liaukos navikus- karcinomos-kompleksinio tipo, intralatakinės adenokarcinomos komplekso tipo bei adenokarcinomos tipo navikus, kurie buvo užsodinti ant viščiuko chorioalantojinės membranos. Atlikome histologinius ir imunohistocheminius tyrimus, skaičiavome kraujagysles.
Eksperimentas atliktas 2014-2015 metais. Eksperimentai su gyvūnais vykdomi vadovaujantis Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012 m. spalio 31 d. įsakymu Nr. B1-866 „Dėl Gyvūnų, skirtų eksperimentiniams ir kitiems mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“.
2.1 Apvaisintų kiaušinių inkubavimas ir jo sąlygos
Inkubatorius – aparatas, kuriame palaikoma temperatūra, drėgmė, oro judėjimas, vartomi kiaušiniai. Inkubacinis režimas palaikomas automatiškai. Eksperimentui naudojome Maino inkubatorių, kuriame telpa iki 60 kiaušinių. Į inkubatorių dedamų kiaušinių temperatūra turi būti +18 – 20˚C. Šaltų kiaušinių į inkubatorių dėti negalima, nes ant jų kondensuojasi drėgmė, dėl to temperatūra ilgai nepakyla iki normos. Iki normos temperatūra ir drėgmė turi pakilti per 4-5 val. Mūsų naudotame inkubatoriuje palaikoma temperatūra yra +37,7˚C, o santykinis oro drėgnumas – apie 59- 60 proc., su nuolatine ventiliacija ir oro rotacija.
Optimalios temperatūros sutrikimai nevienodai veikia embrionų augimą įvairiose jų vystymosi stadijose. Jei kiaušiniai perkaitinami per pirmąsias 12 perinimo valandų (iki 42˚C), embrionai žūva per pusvalandį. Antrą ir trečią perinimo parą, temperatūrai pasiekus 39˚C, pastebimi įvairūs embrionų galvos išsigimimai, o ketvirtą ir penktą perinimo dieną – vidaus organų pakitimai. Kiaušinių perkaitinimas antrojoje perinimo pusėje pavojingesnis negu pirmojoje. Ant alantojaus ir amnijono sienelių pastebimos vandeningos įvairaus dydžio pūslelės. Dažniausiai prieauglis pradeda ristis anksčiau, pablogėja perinimo rodikliai. (27)
16 eilės yra dedami į inkubatorių: vieną dieną viena dalis ir po kelių dienų kita dalis. Įdėtų į inkubatorių kiaušinių skaičius priklauso nuo turimos eksperimentinės medžiagos kiekio. Kol nėra inkubatoriuje embrionai nesivysto, todėl gali išbūti ilgesnį laiką. Kiaušiniai inkubuojami 7 ar daugiau dienų, kol ant jų sodinama medžiaga. Mūsų atliktam tyrimui kiaušiniai buvo inkubuojami 7 dienas ir tuomet inkubuojama tiriamoji medžiaga ant CAM. (28)
2.2 Langelių atidarymas, pasiruošimas sodinti medžiagą
Trečią inkubacijos dieną kiaušiniai yra atsargiai išimami iš inkubatoriaus sterilizuojami 70 proc. etanolio tirpalu, kad apsaugoti nuo užteršimo. Po sterilizavimo yra nusiurbiama apie 2 - 3 ml baltymo, kad atskirti CAM nuo lukšto ir lengviau atidaryti langelį. Baltymas nusiurbiamas bukajame krašte, maždaug per vidurį darant nedidelę gręžtinę duobutę ir įleidus švirkštą, truputį pakreiptą žemyn. (28) Tokiu būdu embrionas netenka dalies maisto medžiagų, kurios reikalingos vystymuisi, todėl apie 18 inkubacijos dieną vystymasis sustoja, embrionas žūva. Langelis atidaromas nedideliu gręžtuvu, nustatant vidutines apsukas, kad neįskiltų lukštas. Langelio dydis nėra griežtai apibrėžtas, tačiau turi būti nei per mažas (nepatogu sodinti medžiagą), nei per didelis (baltymo ištekėjimo tikimybė), langelio dydis turi būti apie 1.0 cm². Kiaušinių turinys apžiūrimas dėl galimų viščiuko apsigimimų, pakraujavimo galimybės. Neatitikus reikalavimų kiaušiniai nenaudojami eksperimentui. (28) Pasitaiko, kad atidarymo metu, gręžiant lukštą nedidelis lukšto kiekis patenka į vidų, tai embriono nenužudo, tačiau per langelį, o taip pat ir imant medžiagą galima matyti susikristalizavusias nuosėdas, tai yra kalcio kristalai atskilę nuo lukšto. Siekiant užtikrinti, kad neįvyktų dehidracija langeliai uždengiami sterilia maistine permatoma plėvele. Ji prieš tai sterilizuojama, t.y. virinama. (28) Plėvelė uždedama ant atidaryto langelio, o jos kraštai priklijuojami lipnia balta izoliacine juostele. Klijuojama taip, kad plėvelės kraštai liktų prisitvirtinę prie lukšto ir nebūtų tarpo, nes kitaip kiaušinyje esanti drėgmė išgaruos. Lipni izoliacinė juostelė pasirenkama tokia, kad ją nuplėšiant nebūtų pažeidžiamas lukštas. Atidarius langelį, kiaušiniai inkubatoriuje nevartomi, kad neišbėgtų baltymas, nors langelis ir užklijuotas. Po šių procedūrų kiaušiniai patalpinami atgal į inkubatorių ir laikomi tomis pačiomis sąlygomis iki mėginių implantacijos ir po jos.
17
2.3 Pieno liaukos navikų transplantavimas, inkubavimas, fiksavimas, įliejimas į
parafino blokus
Tiriamieji augliai buvo kultivuojami in vivo sąlygomis LSMU MA Histologijos ir Embriologijos katedros tyrimų laboratorijoje. Tiriamieji augliai gauti bendradarbiaujant su smulkiųjų gyvūnų klinikomis Vilniuje ir Kėdainiuose. Atliktos inkubacijos:
1. Pieno liaukos navikas: XXXIX inkubacija, mėginiai nr. 8, 9, 10, 11
2. Pieno liaukos navikas: XLI inkubacija, mėginiai nr. 35, 36, 38- neišgyveno 3. Pieno liaukos navikas: XLVI inkubacija, mėginiai nr. 6, 7
4. Pieno liaukos navikas: XLVI inkubacija, mėginiai nr. 9
Pieno liaukos navikas per kelias valandas (paprastai per valandą laiko) po atliktos mastektomijos turi būti transportuojamas fiziologiniame tirpale užsodinimui ant CAM ir tikintis, kad bus išsaugotas naviko gyvybingumas, jis išlaikys savo fiziologines savybes. Rekomenduojama kuo greičiau jį užsodinti ant CAM, iš kurios jis gaus reikalingas maisto medžiagas ir naviko elgesys bus tapatus, kaip ir esant natūraliai jo aplinkai. Navikas atsargiai padalinamas į maždaug 8 mm³ dydžio gabalėlius. 7 inkubacijos parą plėvelė atsargiai nuimama nuo lukšto ir pro matomą langelį pincetu ant CAM uždedamas gabalėlis tiriamosios medžiagos ant jau susiformavusios CAM. Kiekvienas naviko gabalėlis (1 gabalėlis vienam kiaušiniui) uždedamas šalia didesnių CAM matomų kraujagyslių. (28) Kiaušiniai su tiriamąja medžiaga laikomi inkubatoriuje iki 11 inkubacijos paros tomis pačiomis laikymo sąlygomis.
18
4 pav. Navikas (pažymėtas rodyklėmis) uždėtas ant CAM. R.Mozūraitės nuotrauka
Kitame etape CAM yra plaunama, įliejama į parafino blokelius. Paruošti parafino blokai, šaldomi ant šaldymo plokštelės „pfh cooling plate 4100“, pjaunami mikrotomu „Leica RM 2155“, uždedami ant mikroskopinių stiklelių. Pjūviai tiesinami vandens vonelėje „Leica Hi 1210“, džiovinami ant džiovinimo stalelio „Medax“ ir 24 valandom dedami į termostatą. Tuomet dažomi hematokslino – eozino dažais arba atliekamas imunohistocheminis dažymas. Formalino tirpale fiksuoti ir parafine įlieti mėginiai nuo kiekvienos CAM su pieno liaukos naviko gabalėliu supjaustomi maždaug 0.5x2.5cm dydžio ir 3μm storio gabalėliais.
2.4 Dažymas hematoksilino eozino dažais
Hematoksilino-eozino (HE) dažymo metodas yra plačiausiai paplitęs histologinis audinių tyrimo būdas. Tai paprastas, išsamus, universalus, leidžiantis aiškiai matyti įvairias audinių struktūras. Taikant HE dažymo metodą, hematoksilino dažų komponentas nudažo ląstelių branduolius, t.y. baziniai hematoksilino dažai jungiasi su ląstelių branduoliais ir kitomis bazofilinėmis ląstelių struktūromis, nudažydami jas mėlyna spalva. Tuo tarpu eozino dažai nudažo ląstelių citoplazmą ir įvairiais atspalviais išryškina daugelį jungiamojo audinio skaidulų. Rūgštiniai eozino dažai jungiasi su acidofilinėmis-eozinofilinėmis ląstelių struktūromis, nudažydami jas rožinės-raudonos spalvos atspalviais.
19 Deparafinavimas – parafino, esančio pjūvyje, pašalinimas. Dažniausiai parafinui pašalinti naudojami įvairūs organiniai tirpikliai, mūsų laboratorijoje naudojamas ksilenas. Pjūviai pamerkiami į 3 tokios pačios koncentracijos ksileno tirpalus iš eilės po 5 minutes, vėliau nusausinami tiesiog priliečiant prie sugertuko, kad pašalinti ksileno perteklių ir merkiama į spiritinį 96proc. alkoholio tirpalą tokia pačia eiga, kaip ir į ksileną, tačiau po 2 minutes. Po spiritinių tirpalų pjūviai plaunami po tekančiu krano vandeniu 3 minutes, kad pašalinti audiniuose esantį alkoholį, po to nusausinami ir vėl merkiami į 3 iš eilės alkoholinius tirpalus. Laipsniškas audinių dehidratavimo procesas neleidžia alkoholiniams tirpalams per daug sukietinti audinių, mažinti jų tūrio ir padeda išlaikyti palankią tirpalų skverbimuisi audinio struktūrą. (29)
Dehidratavimas – atvirkštinis pjūvių hidratavimui procesas, kurio metu pjūviai yra laipsniškai panardinami į alkoholinius tirpalus. Galiausiai pjūviai dažomi Mayer hematoksilino dažais, juose pjūviai laikomi 5 minutes. Jeigu trūksta ryškumo pjūviai gali būti melsvinami naudojant tam tikras melsvinančias medžiagas (amonio vandenį, Scott tirpalą). Pjūviai vėl plaunami po tekančiu vandeniu apie 4 minutes, tada merkiama į eozino dažus ir paliekama 3-5 minutėm. Vėliau nuplaunami tekančiu vandentiekio vandeniu tol, kol dings rausva spalva. Po to pjūviai dehidratuojami 3 iš eilės alkoholiniuose (96proc.) tirpaluose po 2 minutes. Pačioje pabaigoje pjūviai skaidrinami juos merkiant į ksileną 3 talpose ir kiekvienoje laikoma 5 minutes. Ties šiuo etapu ir baigiamas HE dažymo metodas. Dažyti mėginiai uždengiami dengiamaisiais stikleliais, naudojant dengiamąją terpę. (29)
5 pav. Pieno liaukos navikas (N) pažymėtas rodyklėmis ant CAM ir dažytas HE dažymo metodu.
Originalus padidinimas 4,0x10. Skalės reikšmė 200µm. N
20
2.5 Imunohistocheminis dažymas bei tyrimas
Imunihistocheminis dažymas (IHC)- „tai tyrimo metodas, kuriame naudojamos chromogeninės medžiagos, jos nuspalvina antigeno-antikūno sąveikos vietą, įvykus joje cheminei reakcijai. Šis metodas leidžia gana patikimai nustatyti piktybinių ir kitų ląstelių kilmę, vėžio diagnostinius ir prognostinius žymenis“. (29)
Prieš dažant IHC dažais mėginiai paruošti atitinkamai, kaip ir dažant su HE dažais. Histologiniai mėginiai (pjūviai) buvo uždėti ant specialaus įelektrinto stiklelio „Super frost“, pjūviai tiesinami vandens vonelėje „Leica Hi 1210“, džiovinami ant džiovinimo stalelio „Medax“, ir 24 valandas laikomi termostate. Prieš dažymą mėginiai palaikomi termostate 56ºC temperatūroje, kad medžiaga geriau prisitvirtintų. Pirminis dažymo etapas yra epitopo išlaisvinimas panaudojant specialų tirpalą (DAKO pH9) specialiame slėgiminiame inde 110ºC temperatūroje laikant 3 minutes. Mėginiai dažyti naudojant „Thermo Shandon coverplate“ sistemą. Vėlesnis etapas peroksidazės blokavimas. Jis atliktas panaudojus specialų peroksidazę blokuojantį tirpalą (DAKO HRP), toliau plaunama panaudojus „Tween 20“ buferinį tirpalą. Toliau pridedamas pirminių antikūnų tirpalas (DAKO, cytokeratinas, klonas 34βE12, didelio molekulinio svorio), vėl plaunama buferiniu tirpalu. Pridedami antriniai antikūnai (DAKO EN Vision), vėliau vėl plaunama buferiniu tirpalu. Kitame žingsnyje pridedama DAB chromogenas ir vėl plaunama buferiniu tirpalu. Stikleliai papildomai dažomi Mayerio hematokslinio tirpalu, uždengiami dengiamaisiais stikliukais. Visam IHC dažymui naudojama DAKO EN Vision sistema. Visas šis dažymas vyksta Shandon Coverplate plokštelėje.
21
6 pav. Pieno liaukos navikas (N) pažymėtas rodyklėmis ant CAM ir dažytas pelės monokloniniu antikūnu prieš citokeratiną (klonas 34βE12). Originalus padidinimas 4,0x10. Skalės reikšmė
200µm.
2.6 Morfometrinė preparatų analizė
Histologiniai preparatai buvo vertinami histologiškai ir morfometriniai CAM ir epitelio storio bei membranos storio pokyčių matavimai buvo atlikti naudojant skaitmeninę OLYMPUS mikroskopo (Olympus XC30) kamerą ir CellSense Dimensions kompiuterinę programą. Nuotraukos gautos ir matavimai skaičiuoti naudojant 4x10 mikroskopo padidinimą. Morfometrinės analizės metu CAM buvo padalinta į tris matymo laukus: pirmasis laukas- centrinė CAM dalis po naviku, antrasis- kairysis matymo laukas nuo centro, trečiasis- dešinysis matymo laukas nuo centro. Visuose matymo laukuose buvo atliktas kraujagyslių skaičiavimas, CAM membranos storio matavimas bei epitelio storio matavimas. Atliekant CAM membranos storio bei epitelio storio skaičiavimus matomas laukas buvo matuotas penkiuose taškuose per visą matomą CAM ilgį, buvo suskaičiuotas vidurkis. Gauti rezultatai lyginami su kontroline CAM membrana.
Statistinė analizė atlikta naudojant SPPS 20 (IBM) statistikos programą. Rezulatati buvo skaičiuojami naudojant Tukey HSD testą. ANOVA. Rezultatai laikomo statistiškai patikimais, kai p < 0,05
Tjukio (Tukey) kriterijus. Tukey’o HSD (Honestly Significant Difference — ganėtinai statistiškai reikšmingo skirtumo) kriterijus — vienas dažniausiai taikomų kriterijų. Tjukio kriterijus yra labai konservatyvus, t.y. labiausiai nelinkęs atmesti nulinės hipotezės — vidurkių skirtumus pripažinti
N
23
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Histologinis ir imunohistocheminis ksenograftinio modelio vertinimas
Pieno liaukos navikų histologiniai tipai:
1. Karcinomos kompleksas, mėginiai nr. 8,9 – XXXIX inkubacija;
2. Intralatakinės adenokarcinomos kompleksas –mėginiai nr. 6,7- XLVI inkubacija; 3. Adenokarcinoma, mėginys nr. 9- XLVI inkubacija.
7 pav. Kontrolinė CAM membrana. Kontrolei naudota viščiuko CAM 11 inkubavimo parą.
Matomos visos membranos struktūros- choriono epitelis (CE), mesoderma (M), alantojo epitelis (AE), kraujagyslė (K). Membrana nudažyta hematoksilino-eozino dažais, padidinimas 4,00x10; skalės vertė 200µm. Membrana visame pjūvyje vienoda.
Histologiniai CAM pakitimai naviko augimo vietoje
24
8 pav. CAM membrana su užsodintu pieno liaukos karcinomos kompleksinio tipo naviku.
Padidinimas 4,0x10; skalės vertė 200 μm; 11 inkubacijos diena, XXXIX.8 inkubacija, dažyta hematoksilino-eozino dažais. Matyti, kad membranos struktūra pakitusi. Matomas sustorėjęs choriono epitelis (E), išvešėjusi mezoderma (M), matomos kraujagyslės. (K)
9 pav. CAM membrana su užsodintu pieno liaukos karcinomos kompleksinio tipo naviku.
Padidinimas 4,0x10; skalės vertė 200 μm; 11 inkubacijos diena, XXXIX.8 inkubacija, imunohistocheminis dažymas citokeratinu klonu 34βE12. Rodyklės nurodo CAM epitelį. (E)
25
10 pav. CAM membrana su užsodintu pieno liaukos naviku- intralatakinė adenokarcinomos
kompleksas. Padidinimas 4,0x10; skalės vertė: 200 μm; 11 inkubacijos diena, XLVI.6 inkubacija,
imunohistocheminis dažymas citokeratinu, klonu 34βE12. Rodyklių vietoje turėtų būti epitelis, bet nuotraukoje matoma, kad chorioalantojinės membranos epitelis visiškai suardytas. Tai rodo naviko prigijimą ir invazyvumą. Naviko ląstelėse stebima intesyvi imunohistocheminė reakcija citokeratinui 34βE12. Ląstelių citoplazma nusidažiusios ruda spalva.
3.2 Morfometrinė pakitusios CAM analizė
Buvo atliktas kraujagyslių kiekio skaičiavimas, chorioalantojinės membranos storio bei epitelio storio vertinimas naviko augimo vietoje, augimo vietą padalijus į tris biofizilogiškai skirtingus laukus. Patikimumui nustatyti naudotas Tukey HSD testas.
Kraujagyslių kiekio kitimas chorioalantojinėje membranoje
26 bet kokio spindžio matomos kraujagyslės. Mažiausias matuotos kraujagyslės skersmuo buvo 10,35 µm, o didžiausias 1781,063µm.
11 pav. Kraujagyslių skaičiaus vidurkių palyginimas tarp regėjimo laukų.
12 pav. Kraujagyslių skaičius pirmąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10; skalės vertė: 200
μm; 11 inkubacijos diena, XLVI.9 inkubacija, HE dažymas.
14,4*
6,6*
6,2*
0
5
10
15
20
1 2 3 Kr au jag ysl ių skai či u s (vn t) Stebėjimo laukaiKraujagyslių skaičiaus vidurkis
27
13 pav. Kraujagyslių skaičius antrąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10; skalės vertė 200
μm; 11 inkubacijos diena, XLVI.9 inkubacija, HE dažymas. Membranos storio vertinimas
Vertinant membranos storį nustatytas staistiškai reikšmingas membranos sustorėjimas, lyginant membranos storį regėjimo lauke esančiame po naviku 437,12 ± 38,48 ir lyginant jį su šalia esančiais regėjimo laukais 286,47 ±25,16 ir 227,38 ± 21,49. Tai rodo, jog membrana reaguoja sustorėjimu į uždėtą naviką. (p < 0,05).
14 pav. Membranos storio vidurkių palyginimas tarp regėjimo laukų.
437,12*
286,47*
227,38*
0
100
200
300
400
500
1 2 3 M e m b ran o s sto ri s (µ m ) Stebėjimo laukaiMembranos storio vidurkis
28
15 pav. CAM storis pirmąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10; skalės vertė 200 μm; 11
inkubacijos diena, XLVI.9 inkubacija, HE dažymas.
16 pav. CAM storis antrąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10;skalės vertė: 200 μm; 11
29 Epitelio storio vertinimas
Manoma, kad epitelio suardymas yra vienas iš naviko piktybiškumo požymių. Kuo invazyvesnis navikas tuo labiau suardomas epitelis. Mūsų vertintais atvejais dviejuose iš penkių membranų epitelis buvo suardytas, tai rodo, kad navikas prigijo prie membranos ir suardė epitelį, taip sukurdamas sau reikalingas sąlygas.
Net ir suardytą epitelį įvertinus 0µm storiu, vis tiek gauname, kad epitelis sustorėjo statistiškai reikšmingai lyginant su šalia esančiais regėjimo laukais. Regėjimo lauke po naviku epitelio storis 42,68 ± 37,52, kai šalia esančiuose regėjimo laukuose 20,89 ± 18,62 ir 22,70 ± 24,09. Tai rodo, kad membranos epitelis reagavo į naviką sustorėjimu, vertintuose regėjimo laukuose epitelio storis yra nepakitęs, o naviko pažeistose vietose epitelis, nors ir suardytas, vis tiek yra storesnis, negu vietose kur navikas nedėtas. (p < 0,05).
17 pav. Epitelio storio vidurkių palyginimas tarp regėjimo laukų.
42,68*
20,89*
22,70*
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 Ep ite lio sto ri s (µ m ) Stebėjimo laukaiEpitelio storio vidurkis
30
18 pav. CAM epitelio storis pirmąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10; skalės vertė: 200 μm;
11 inkubacijos diena, XLVI.9 inkubacija. IHC dažymas, citokeratinas 34βe12 klonas.
19 pav. CAM epitelio storis antrąjame stebėjimo lauke. Padidinimas 4,0x10;skalės vertė: 200 μm;
31
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Pieno liaukos navikai užima antrą vietą iš labiausiai paplitusių navikų gyvūnų tarpe sudarydami 23,55 proc. visų šunims diagnozuojamų navikų. (30) Šiuo metu šunų navikai yra nemažai tyrinėjami ne tik norint sužinoti daugiau apie paties naviko augimą ir vystymąsi, bet ir kuriamos bendros tarpdisciplininės lyginamosios studijos, kurios padeda geriau suprasti navikų epidemiologiją genetiniu ir genominiu lygmeniu. Dirbant su skirtingomis gyvūnų rūšimis nuo žmonių medicinos iki veterinarijos galima sujungti mokslinius atradimus ir geriau suprasti patį naviką, jo augimo specifiką, tai panaudojant naujų vaistų, žymenų ir gydymo schemų plėtojimą tiek žmonių, tiek gyvūnų navikų tyrimuose. (31)
Pieno liaukos navikai apibūdinami „kompleksu“ kuomet turi abiejų, ir sekrecinio tipo ląstelių, ir mioepitelinio tipo ląstelių. Biologiškai šie navikai yra mažiau piktybiški, negu vieno tipo ląstelių augliai. (32)
Viščiuko chorioalantojinės membranos modelis eksperimentams pasirinktas atsižvelgiant į tai, kad šis modelis yra gana paprastas, nebrangus, patikimas ir eksperimentinis laikotarpis yra trumpas. Mūsų atliktas tyrimas panaudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį leido mums tiesiogiai stebėti membranoje vykstančius pokyčius, taip pat įvertinti kraujagyslių skaičiaus, membranos ir epitelio pokyčius.
Atlikus histopataloginius navikų vertinimus pastebėta, jog epitelis buvo suardytas tose mebranose, kur buvo uždėta intralatakinės adenokarcinomos komplekso tipo augliai. Nors visi mūsų pasirinkti pieno liaukos navikai yra klasifikuojami, kaip piktybiniai, tačiau pagal eksperimento rezultatus, galime daryti išvadą, jog intralatakinės adenokarcinomos tipo navikai auga greičiau ir invazyviau (abiejuose atvejuose epitelis buvo suardytas).
A. Ežerskytės ir kt. autorių atliktų histopatologinių tyrimų duomenimis buvo nustatyta, kad dažniausios navikų rūšys buvo karcinoma (46 proc.), karcinomos kompleksas (27 proc.) ir karcinosarkoma (13 proc.) (33)
Anksčiau atliktų tyrimų duomenimis LSMU Histologijos ir embriologijos katedroje, buvo lyginamas gerklų gerybinio papilomos ir piktybinio karcinomos navikų elgesys transplantavus ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos. Eksperimento metu buvo nustatyta, kad membrana reaguoja stipriau į piktybinį gerklų naviką. (34)
33
IŠVADOS
1. Atliktos eksperimentinės inkubacijos: pieno liaukos navikas: XXXIX inkubacija, mėginiai nr. 8, 9, 10, 11- gyvi mėginiai nr. 8, 9; pieno liaukos navikas: XLI inkubacija, mėginiai nr. 35, 36, 38- neišgyveno; pieno liaukos navikas: XLVI inkubacija, mėginiai nr. 6, 7; pieno liaukos navikas: XLVI inkubacija, mėginiai nr. 9.
2. Viščiuko chorioalantojinė membrana į transplantuotą naviką reaguoja membranos sustorėjimu. Palyginus centrinį ir šoninius stebėjimo laukus matyti, kad centrinėje dalyje po naviku (437,12 ± 38,48) sustorėjimas žymiai ryškesnis lyginant jį su šalia esančiais regėjimo laukais 286,47 ±25,16 ir 227,38 ± 21,49.
3. Chorioalantojinės membranos epitelis išryškintas IHC reakcija, kuri parodė kad epitelis į transplantuotą naviką reagavo taip pat sustorėjimu. Pirmąjame stebėjimo lauke (42,68 ± 37,52) sustorėjimas statistiškai reikšmingas lyginant su antruoju (20,89 ± 18,62) ir trečiuoju laukais (22,70 ± 24,09).
34
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos Akademijos, Histologijos ir Embriologijos katedros vedėjai prof. A. Valančiūtei už suteiktą galimybę atlikti inkubavimą ir IHC reakcijas, už pagalbą darbuotojoms, o ypač asistentei, Ramintai Mozūraitei, už galimybę atlikti tyrimus.
Už gautus mėginius eksperimentui nuoširdžiai dėkoju veterinarijos klinikai UAB „Jakovo veterinarijos centras“ ir ypač dėkoju veterinarijos klinikai UAB „Viverus“ Kėdainių veterinarija. Labai dėkoju už bendradarbiavimą veterinarijos gydytojoms Marijai Miliukienei bei Editai Rimkevičiūtei.
35
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Barbara E. Kitchell, Nikolaos G. Dervisis. Cancer management in small animal practice. Pathophysiology and Tumor Cell Growth. Saunders, an imprint of Elsevier, Inc.
; 2010.
2. K. Grüntzig, R. Graf, M. Hässig, M. Welle, D. Meier, G. Lott, D. Erni, N.S. Schenker, F.Guscetti, G. Boo, K. Axhausen, S. Fabrikant, G. Folkers, A. Pospischil. Corrigendum to “The Swiss Canine Cancer Registry: A Retrospective Study on the Occurrence of Tumours in Dogs in Switzerland from 1955 to 2008” J Comp Pathol 152 (2–3) (2015) P. 161–171 3. Valdes T.I., Kreutzer D., Moussy F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo
model for the testing of biomaterials. Center for Biomaterials, University of Connecticut Health Center. (2001) P. 273-284.
4. D. Ribatti “The first evidence of tumor - induced angiogenesis in vivo by using the chorioallantoic membrane assay. Leukemia (2004) 18, P. 1350–1351
5. Manjunathan R, Ragunathan M. „Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 2015 Jun 6;17:10.
6. Vargas A., Zeisser-Labouèbe M., Lange N., Gurny R., Delie F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. (2007) Vol. 59, P. 1162–1176.
7. Domenico Ribatti. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental cell research 328 (2014) P. 314 – 324
8. Patrycja Nowak-Sliwinska, Tatiana Segura, M. Luisa Iruela-Arispe. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis October 2014, Volume 17, Issue 4, P. 779-804
9. M. Goldschmidt, L. Pen˜a, R. Rasotto,V. Zappulli. Classification and Grading of Canine Mammary Tumors. Veterinary Pathology (2011) 48. P.117-131.
36 11. Andrew N. Makanya Ph.D., Beata Styp-Rekowska, Ivanka Dimova, Valentin Djonov. Avian Area Vasculosa and CAM as Rapid In Vivo Pro-angiogenic and Antiangiogenic Models. Vascular Morphogenesis Methods in Molecular Biology Volume 1214, (2015) P. 185-196 12. Riazudin Mohammed, Giacomo Cavallaro, Carolina GA Kessels, Eduardo Villamor.
Functional differences between the arteries perfusing gas exchange and nutritional membranes in the late chicken embryo. Journal of Comparative Physiology B June 2015 13. Dzialowski EM, Sirsat T, van der Sterren S, Villamor E. Prenatal cardiovascular shunts in
amniotic vertebrates. Resp Physiol Neurobiol (2011) 178:66–74
14. Agren P, van der Sterren S, Cogolludo AL, Blanco CE, Villamor E. Developmental changes in the effects of prostaglandin E2 in the chicken ductus arteriosus. J Comp Physiol B (2009) 179:133–143
15. Yadgary L, Kedar O, Adepeju O, Uni Z. Changes in yolk sac membrane absorptive area and fat digestion during chick embryonic development. Poult Sci (2013) 92:1634–1640
16. Domenico Ribatti. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. (2010) P. 17-40
17. Domenico Ribatti. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane Assay. Handbook of Vascular Biology Techniques 2015, P. 141-148.
18. Sorenmo KU, Rasotto R, Zappulli V, Goldschmidt MH. Development, anatomy, histology, lymphatic drainage, clinical features, and cell differentiation markers of canine mammary gland neoplasms. Vet Pathol. (2011); 48(1):85–97.
19. Noor A. Lokman, Alison S. F. Elder, Carmela Ricciardelli and Martin K. Oehler. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences, (2012).
20. Geovanni D. Cassali, Gleidice E. Lavalle, Andrigo B. De Nardi, Enio Ferreira ir kt. Consensus for the Diagnosis, Prognosis and Treatment of Canine Mammary Tumors. Brazil J Vet Pathol, (2011), 4(2), P. 153-180.
37 22. N Sleeckx, H de Rooster, EJB Veldhuis Kroeze, C Van Ginneken and L Van Brantegem.
Canine Mammary Tumours, an Overview. Reprod Dom Anim(2011) 46, P. 1112–1131 23. K. U. Sorenmo , R. Rasotto , V. Zappulli , and M. H. Goldschmidt. Development, Anatomy,
Histology, Lymphatic Drainage, Clinical Features, and Cell Differentiation Markers of Canine Mammary Gland Neoplasms. Veterinary Pathology (2011) 48(1) P. 85-97
24. L. Moe, Population-based incidence of mammary tumours in some dog breeds, J Reprod Fert Suppl 57 (2001), P. 439–443.
25. J. Zatloukal, J. Lorenzová, F. Tich, A. Neâas, H. Kecová, P. Kohout. Breed and Age as Risk Factors for Canine Mammary Tumours. acta vet. Brno (2005) 74: 103-109
26. N. Juodžiukynienė. Citologinis tyrimas. Šunų ir kačių navikų citologija. Kaunas, 2013, P. 70-76.
27. Juškienė V., Tarvydas V. Rekomendacijos gyvulininkystei ir paukštininkystei. Baisogala. 2004. P. 51-53.
28. Virgilijus Uloza, Alina Kuzminienė, Sonata Šalomskaitė-Davalgienė, Jolita Palubinskienė, Ingrida Balnytė, Ingrida Ulozienė, Viktoras Šaferis, Angelija Valančiūtė. Effect of laryngeal squamous cell carcinoma tissue implantation on the chick embryo chorioallantoic membrane – morphometric measurements and vascularity.BioMed Research International Volume 2015 (2015)
29. Laurinavičienė A., Smaliukienė R. Histologinių technologijų vadovas. Vilnius. 2007. P. 56-60.
30. K. Grüntzig, R. Graf, M. Hässig, M. Welle, D. Meier, G. Lott, D. Erni, N.S. Schenker, F. Guscetti, G. Boo, K. Axhausen, S. Fabrikant, G. Folkers, A. Pospischil. The Swiss Canine Cancer Registry: A Retrospective Study on the Occurrence of Tumours in Dogs in Switzerland from 1955 to 2008. Journal of Comparative Pathology (2015).
31. Joshua D. Schiffman, M. B. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philosophical Transactions B (2015).
32. J. F. Hampe and W. Misdorp. Tumours and dysplasias of the mammary gland. Bull World Health Organ. (1974). P. 111–133.
38 34. Kuzmienė A., Šalomskaitė-Davalgienė S., Balnytė I., Palubinskienė J., Valančiūtė A., Ulozas V. Evaluation of the chicken embryo chorioallantoic membrane model for laryngeal tumor transplantation. (2011) P. 229-240.
35. Reji Manjunathan ir Malathi Ragunathan. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma—an experimental approach using SaOS2 cell line. Biological Procedures Online, 2015. DOI: 10.1186/s12575-015-0022-x
